Фотодинамическая инактивация микроорганизмов

Страховская, Марина Глебовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотодинамическая инактивация микроорганизмов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотодинамическая инактивация микроорганизмов"

ъЪ

На правах рукописи

4844400

Страховская Марина Глебовна

Фотодинамическая инактивация микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты

03.01.02 - биофизика

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I 7 ппЗ

Москва-2010

4843466

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант:

доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор

Рубин Андрей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Красновский Александр Александрович

Потапенко Александр Яковлевич Прохоренко Изабелла Рувимовна

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится «10» февраля 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992 г, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « » декабря 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, 1

доктор биологических наук, профессор

ренделева Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем фотобиологии и биофизики является выявление фундаментальных основ чувствительности организмов к оптическому излучению различных диапазонов и интенсивности, в том числе к повреждающему действию света. В зависимости от спектрального состава свет может индуцировать протекание прямых и/или сенсибилизированных деструктивных процессов. Высокая биологическая активность коротковолнового (УФС, 200-290 нм) и средневолнового (УФВ, 290-320 нм) ультрафиолета определяется прямым поглощением квантов излучения этих диапазонов важнейшими клеточными компонентами, в первую очередь молекулами ДНК. Повреждающее действие длинноволнового ультрафиолетового (УФА, 320-380 нм) и видимого (380-750 нм) света на живые организмы обусловлено протеканием сенсибилизированных, главным образом кислородзависимых фотодинамических реакций. При этом в качестве фотосенсибилизаторов могут выступать как эндогенные природные клеточные метаболиты (например, НАДН, флавины, порфирины), так и различные экзогенные красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, * лекарственные препараты и др. Генерируемые фотосенсибилизаторами активные формы кислорода (АФК) инициируют окислительные деструктивные реакции в биомолекулах и биоструктурах [Halliwell and Gutteridge, 1984; Ере et al., 1993; Davies, 2004. Girotti and Rriska. 2004], а также опосредуют сигнальные пути стрессовых воздействий на клеточную стенку [Levin, 2005]. Кроме того, АФК могут влиять на экспрессию генов, включая защитные механизмы в ответ на окислительный стресс' [Storz et al., 1990; Gasch et al., 2000; Ziegelhoffer and Donohue, 2009].

В фотодинамических реакциях, относящихся к процессам II типа, первичным является взаимодействие возбужденных молекул фотосенсибилизаторов с кислородом [Foote, 1991]. Наибольший вклад в этот тип фотоокислительных реакций вносит синглетный кислород ('02), который образуется в результате фотофизической активации [Красновский мл., 2007] путем переноса энергии с гриплетного возбужденного состояния фотосенсибилизатора на молекулярный кислород. Фотодинамические реакции все шире применяются в медицинской практике: лежат в основе противоопухолевой фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty et al., 1998], фотодинамического обеззараживания препаратов крови от вирусных контаминации [Wainwrigh, 1998]. В последние годы все большее внимание привлекают исследования по фотодинамической инактивации бактерий и грибов [Hamblin and Hasan, 2003], которые имеют выраженную практическую направленность. Это обусловлено ростом устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционной химиотерапии и необходимостью разработки альтернативных способов их инактивации.

В отличие от противоопухолевой ФДТ, основанной преимущественно на использовании тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (порфирины, хлорины,

фталоцианины), в антимикробной ФДТ до недавнего времени основной упор делался на сравнительно низкомолекулярные красители - фенотиазины [Usacheva et al., 2001] и акридины [Wainwright et al., 1997]. Несмотря на то, что фенотиазины (метиленовый синий, толуидиновый синий) обладают широким спектром антимикробного действия, их применение в целях ФДТ имеет ряд недостатков. В первую очередь, это недостаточная активность в отношении бактерий и грибов и необходимость применения высоких (до 200 мкМ на моделях in vivo [Zolfaghari et al., 2009]) токсичных для животных концентраций. Одно из основных преимуществ антимикробной ФДТ перед антибиотикотерапией заключается в множественном характере окислительной деструкции микробных клеток-мишеней, что затрудняет выработку устойчивости к последующим циклам фотодинамических воздействий [Jon and Brown, 2004]. Однако в отношении фенотиазинов это преимущество может быть поставлено под сомнение, поскольку мутанты бактерий с повышенным уровнем экспрессии белков-помп, обусловливающих множественную лекарственную резистентность, проявляют более высокую устойчивость к фотосенсибилизации фенотиазинами по сравнению с дикими штаммами [Tegos and Hamblin, 2006]. Применение акридинов может сдерживаться наличием у этой группы красителей мутагенных свойств [Gase and Sicard, 1978]. В этой связи несомненный интерес представляет изучение антимикробной активности других типов фотосенсибилизаторов, в том числе на основе тетрапиррольных структур.

Эффективное применение красителей в медицинских целях невозможно без глубокого понимания механизмов фотосенсибилизации биологических объектов различного уровня организации. В этой области исследований существуют две основные группы проблем. Первая связана с изучением природы действующих фотосенсибилизаторов, механизмов их взаимодействия с клетками и субклеточными структурами; вторая - с исследованием фотоиндуцированных повреждений клеточных мишеней, приводящих к развитию сенсибилизированных поражений. Направленная доставка фотосенсибилизиторов к таким мишеням, например, к ядру раковой клетки [Sobolev, 2008], позволяет на порядки увеличить эффективность фотоинактивации.

В фундаментальном аспекте одной из основных задач при изучении механизмов фотосенсибилизации бактерий является установление причин низкой чувствительности объектов, относящихся к грамотрицательным видам. Важнейшей структурой, отвечающей за общую устойчивость грамотрицательных бактерий к различным внешним агентам (антибиотикам, детергентам, красителям), является наружная мембрана, входящая в состав клеточной оболочки. Перспективным подходом к повышению чувствительности грамотрицательных бактерий является их обработка с помощью заряженных поликатионных структур. Под воздействием поликатионов происходит высвобождение отрицательно заряженных

липополисахаридов наружной мембраны и ее дезинтеграция. Поликатионы могут быть также использованы как наноносители фотосенсибилизаторов, повышающие избирательность их действия за счет электростатического взаимодействия с клеточной стенкой бактерий. В то же время и сами молекулы красителей могут выступать в качестве носителей положительно заряженных групп, повышающих эффективность их взаимодействия с бактериальной клеткой, и представляют значительный интерес в качестве фотосенсибилизаторов для антимикробной фотодинамической терапии. Однако практическое использование фотосенсибилизаторов в этом направлении требует разработки систем скрининга красителей, изучения закономерностей проявления активности красителей в зависимости от знака заряда и количества заряженных заместителей в молекулах, определения спектров антимикробного действия.

Механизмы фотодинамической инактивации дрожжевых грибов изучены недостаточно, на ограниченном круге красителей. Мало внимания уделялось исследованию процессов взаимодействия красителей с клеточной стенкой и плазматической мембраной, целостность которых играет важнейшую роль в жизнеспособности дрожжей.

Исходная внутриклеточная локализация и отсутствие необходимости преодолевать клеточные барьеры проницаемости составляют важное преимущество эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. У микроорганизмов деструктивные реакции, сенсибилизированные эндогенными порфиринами, изучались, в первую очередь, на объектах бактериальной природы. Результаты фундаментальных исследований в этой области нашли практическое применение. Так, препараты на основе низкомолекулярного предшественника эндогенных порфиринов - 5'-аминолевулиновой кислоты (АЛК), в настоящее время успешно применяются для лечения бактериальных кожных инфекций. На грибах деструктивное действие видимого света, опосредованное эндогенными порфиринами, изучалось крайне мало. В основном, работы касались исследований фоточувствительности клеток и фотоингибирования митохондриального дыхания дрожжей Яасскаготусеъ cerevisiae, мутантных по различным стадиям биосинтеза гема. Однако, как было показано Фрайкиным с соавт. [1986-1991], свет видимого диапазона способен оказывать летальное действие и на клетки диких штаммов дрожжей. Особенностью эффектов инактивации видимым светом является сильная кислородная зависимость, что свидетельствует о фотодинамическом характере наблюдаемых эффектов. Структура спектра действия фотоинактивации позволила предположить, что процесс опосредуется эндогенными соединениями порфириновой природы. Несмотря на возможное участие эндогенных порфиринов в летальных эффектах видимого света у дрожжей, способов, направленных на создание их повышенной внутриклеточной концентрации, аналогично действию АЛК у бактерий, не разработано.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании фотодинамической активности эндогенных и экзогенных тетрапиррольных соединений при действии видимого света на дрожжевые грибы и бактерии. Основным направлением работы было изучение факторов, способствующих увеличению локальной концентрации фотосенсибилизаторов в микробных клетках-мишенях и достижению высокой эффективности фотоинактивации, для расширения сферы применения фотосенсибилизаторов, развития методов фотодинамической терапии локальных микробных заражений и фотообеззараживания.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи.

1. Выявить эндогенные порфириновые фотосенсибилизаторы, определяющие чувствительность дрожжей к видимому свету.

2. Разработать способы модификации метаболизма митохондриальных порфиринов у дрожжей с целью повышения их локальной внутриклеточной концентрации.

3. Изучить механизмы фотоинактивации клеток дрожжей в условиях накопления эндогенных порфиринов.

4. Определить типы внутриклеточных повреждений при фотодинамической инактивации дрожжей, опосредованной хлоринами и фталоцианинами.

5. Исследовать связывание замещенных катионных металлофталоцианинов с клетками энтеробактерий как представителей группы грамотрицательных видов и определить влияние этого процесса на эффективность фотосенсибилизации.

6. Разработать лабораторную бактериальную тест-систему для отбора перспективных красителей, обладающих фотобактерицидной активностью.

7. Оценить спектр антимикробного действия наиболее перспективного фотосенсибилизатора в системах in vitro на различных видах микроорганизмов, в том числе антибиотикоустойчивых штаммах, а также испытать его эффективность itt vivo на животной модели.

Научная новизна. Разработан способ индукции «протопорфирии» у дрожжей и повышения фоточувствительности клеток за счет увеличения внутриклеточного содержания фотоактивного предшественника гема - протопорфирина в результате нарушения биосинтеза гема при введении хелатора железа 2,2'-дипиридила.

Установлено, что увеличение содержания эндогенного протопорфирина в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей приводит к интенсификации в этих структурах фотоокислительных деструктивных процессов.

Впервые выявлена высокая фотосенсибилизирующая активность хлоринов в отношении дрожжевых грибов, при действии которых наблюдается высокая степень везикуляризации и потеря барьерных функций плазматическими мембранами клеток.

Обнаружена фотофунгицидная активность катионных фталоцианинов, проявляющаяся как на клеточных культурах, так и на животной модели (кератомикоз

кроликов). Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлено нарушение структурной организации фотосенсибилизированных катионными фталоцианинами дрожжевых клеток, проявляющееся в потере ригидности клеточных стенок.

С использованием бактериальной биолюминесцентной тест-системы доказано увеличение бактерицидной активности фотосенсибилизаторов при переходе от анионных к катионным красителям, а также при возрастании в молекулах количества положительно заряженных заместителей.

Обнаружено, что наличие и количество положительно заряженных заместителей в молекулах фталоцианинов определяет эффективность их связывания с клетками грамотрицательных бактерий и фотобактерицидную активность. Для изучения связывания красителей с бактериальными клетками впервые применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Показано, что внутриклеточная концентрация эндогенных порфириновых соединений является важнейшим фактором, определяющим чувствительность дрожжей к оптическому излучению видимого диапазона спектра.

Получены данные о структурно-функциональных повреждениях в клетках дрожжей при действии эндогенного протопорфирина, а также экзогенных фотосенсибилизаторов - хлоринов и фталоцианинов.

Обосновано применение бактериальной биолюминесцентной тест-системы на основе генно-инженерного штамма Escherichia coli рХеп7 для скрининга красителей на фотобактерицидную активность. С использованием этой тест-системы исследован широкий круга сенсибилизаторов - фенотиазинов, порфиринов, хлоринов и фталоцианинов с зарядом молекул от (-8) до (+16).

Высокая эффективность и широкий спектр действия октакатионного фталоцианина цинка подтверждены на типовых и клинических штаммах микроорганизмов, в том числе устойчивых к антибиотикотерапии.

Разработаны новые методы фотодинамической инактивации микроорганизмов, включая патогенные бактерии, дрожжевые грибы рода Candida и вирус «птичьего гриппа» подтипа H5N1.

Разработана система, включающая фотосенсибилизатор из ряда катионных металлофталоцианинов и светодиодный источник красного излучения с соответствующими спектральными характеристиками, которая позволяет эффективно инактивировать широкий спектр патогенных микроорганизмов и может использоваться в фотодинамической терапии грибковых и бактериальных заболеваний.

Научные положения, обоснованные в работе, используются в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедр биофизики и биоинженерии биологического факультета МГУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Инактивация дрожжевых грибов видимым светом опосредуется эндогенным порфириновым фотосенсибилизатором(ами). Воздействия, приводящие к внутриклеточному накоплению эндогенного протопорфирина IX, повышают фоточувствительность дрожжевых клеток.

2. У дрожжевых грибов с высоким уровнем содержания эндогенного протопорфирина IX наблюдаются множественные морфологические, а также функциональные нарушения, затрагивающие митохондриальный и генетический аппараты клеток, барьеры клеточной проницаемости.

3. Дрожжевые грибы, включая эталонный и клинические штаммы Candida albicans, представляют собой новые объекты, чувствительные к фотосенсибилизации с хлоринами и поликатионными замещенными фталоцианинами.

4. Бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе генно-инженерного штамма E.coli рХеп7 является эффективным инструментом для качественного анализа фотобактерицидных свойств красителей.

5. Наибольшей фотобактерицидной активностью обладают красители, молекулы которых несут положительный заряд. Эффективность фотодинамической инактивации грамотрицательных бактерий возрастает с увеличением количества положительно заряженных заместителей в молекулах красителей.

6. Эффективность фотодинамической инактивации грамотрицательных бактерий поликатионными замещенными фталоцианинами возрастает с увеличением количества связанного клетками красителя.

7. Поликатионные замещенные металлофталоцианины обладают широким спектром антимикробной активности и являются перспективными соединениями для фотодинамической терапии и фотообеззараживания.

конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры», Москва (Россия), 2007; Научно-практической конференции «Лазерные технологии в оториноларингологологии», Тула (Россия), 2007; б-ой Научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии», Москва (Россия), 2008; 5-м Съезде фотобиологов России, Пущино (России), 2008; 5-ой Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (ICCP-5), Москва (Россия), 2008; 1-ой Междунар. Рабочей Встрече «Применение редокс-технологий в окружающей среде», Стамбул (Турция), 2009; 5-м, 8-м, 10-м, 12-м и 13-м Конгрессах Европейского общества фотобиологоз (ESP): Марбург (Германия), 1993, Гранада (Испания), 1999, Вена (Австрия), 2003; Бат (Англия), 2007; Вроцлав (Польша), 2009; 15-м Международном конгрессе по фотобиологии, Дюссельдорф (ФРГ), 2009; XXIII сессии Европейской группы по изучению Helicobacter, Роттердам (Нидерланды), 2010.

Основные результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 печатная работа, в том числе 17 статей в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 22 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций; получено 8 патентов Российской Федерации на изобретение, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 285 страницах, содержит 73 рисунка и 14 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов (5 глав), заключения, выводов, приложения, в котором дается описание объектов и методов исследования, и списка цитируемой литературы, насчитывающего 449 наименований, в том числе 48 отечественных и 401 зарубежных источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава I. Роль эндогенных порфиринов в сенсибилизации дрожжей к видимому свету

Для спектров флуоресценции суспензий целых клеток дрожжей характерно наличие ряда максимумов (табл. 1), сходных с таковыми у бактерий и отражающих наличие эндогенных порфириновых соединений.

В области 580-610 нм расположены главные максимумы флуоресценции металлосодержащих порфиринов [Csatorday et al., 1981; Johnsson et ql., 1987; Szocs et al., 2001]. Свободные порфирины флуоресцируют при 615-635 нм [Nitzan et al., 2004; Askenazi et al., 2003; Ramstad et al., 2005], вторые, менее интенсивные полосы их флуоресценции лежат в области 680-700 нм.

Таблица 1. Флуоресцирующие эндогенные порфирины в клетках бактерий (по литературным данным) и дрожжей

Эндогенные порфирины Максимумы Максимумы

флуоресценции флуоресценции

в клетках бактерий, нм в клетках дрожжей, нм

Zn-содержащие порфирины 580-592 585

Mg-содержащие порфирины 587-597 604

Уро- и копропорфирин 615-622 622

Протопорфирин IX 630-635 630-633

При исследовании природы фоточувствительности дрожжей необходимо было определить тип(ы) эндогенных порфиринов, опосредующих эффекты видимого света, локализацию фотосенсибилизаторов в клетке, а также зарегистрировать фотосенсибшшзированные эндогенными порфиринами морфологические и функциональные нарушения в клетках и субклеточных структурах. С этой целью проведены спектральный и хроматографический анализ экстрактов из целых клеток и фракций субклеточных структур - митохондрий, ядер и плазматических мембран.

Протопорфирин IX является наиболее эффективным фотосенсибилизатором среди эндогенных порфиринов, накапливающихся в дефицитных по биосинтезу гема клетках дрожжей [Zoladek et al., 1996]. В экстрактах из клеток диких штаммов дрожжей нами обнаружен протопорфирин IX в количестве около 3 пмоль/мг белка у Saccharomyces cerevisiae rad+/rad+ и 2 пмоль/мг белка у Candida guilliermondii. Содержание протопорфирина у дрожжей оказалось значительно меньше по сравнению с животными клетками [Hua et al., 1995]. Это может быть связано с высокой специфической активностью [Hunter et al., 2008] дрожжевой феррохелатазы (катализирует включение двухвалентного железа в протопорфирин IX), в 6-10 раз большей по сравнению с соответствующим ферментом из клеток млекопитающих.

Конечная стадия образования протопорфирина IX из протопорфириногена проходит во внутренней митохондриальной мембране [Gora et al., 1996]. Во фракции изолированных митохондрий относительное содержание протопорфирина IX было значительно выше, чем в других компонентах клетки: 80 пмоль/мг белка у S. cerevisiae rad+/rad+ и 45 пмоль/мг белка у С. guilliermondii.

Локализация протопорфирина IX в митохондриях обусловливала фотоингибирование потребления кислорода клетками обоих штаммов (рис. 1), эффективность которого была значительно выше у S. cerevisiae, очевидно вследствие более высокого содержания фотосенсибилизатора.

Известно, что при накоплении эндогенного протопорфирина IX в животных клетках может происходить его перераспределение из митохондриальных в плазматическую [Gaullier et al., 1995] и ядерную мембраны [Krammer and Uberriegler,

1996]. Во фракции плазматических мембран, изолированных из дрожжей S. cerevisiae, нами также был обнаружен протопорфирин IX, однако в количестве в 5 раз ниже чем в митохондриях (17 + 3 пмоль/мг белка), в то время как в ядерной фракции дрожжевых клеток порфириновые соединения отсутствовали.

В облученных видимым светом и обработанных флуоресцирующим красителем примулином суспензиях дрожжей при визуальном подсчете в камере Горяева наблюдалось увеличение количества клеток, цитоплазма которых прокрашивалась примулином (рис.1). Возможность визуализации мертвых дрожжевых клеток на основании генерализованной прокрашиваемое™ примулином [Meissel et al., 1961] связывают с нарушением барьерных свойств плазматических мембран [Graham and Caiger, 1969; Streiblova et al., 1984], приводящим к появлению их проницаемости для флуорофора. В жизнеспособных клетках дрожжей примулин связан со структурными компонентами клеточных стенок кнаружи от плазматической мембраны.

100

Рис. 1.

Дозовые зависимости выживаемости дрожжей (1), интенсивности митохондриального дыхания - потребления кислорода суспензиями клеток (2) и прокрашивания клеток флуорохромом примулином (3) при облучении суспензий клеток видимым светом 400-600 нм.

10 20 30 40

Доза видимого света, Дж/см2

Несмотря на большее относительное содержание протопорфирина в изолированных митохондриях по сравнению с плазматическими мембранами

дрожжей, накопление ТБК-активных продуктов (см табл. 2 в главе 2), отражающее протекание процессов перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ), протекало в них менее интенсивно. Это может быть связано с высокой активностью локализующихся в митохондриях антиоксидантных систем, что необходимо учитывать при анализе вклада фотоповреждений различных клеточных структур в летальный эффект. Так, интенсивность ПФОЛ в плазматических мембранах в составе интактных дрожжевых клеток может быть существенно снижена по сравнению с изолированными плазматическими мембранами за счет активности цитоплазматических антиоксидантов.

Для морфологической картины (рис. 2) облученных видимым светом клеток дрожжей наиболее характерно изменение структуры митохондрий (потеря формы, набухание, нарушение параллельности крист). В отдельных случаях наблюдалось отслоение протопласта от плазматической мембраны, уменьшение электронной плотности клеточной стенки. В ядрах клеток видимые морфологические изменения выявлены не были.

... ,

швшщ

Рис. 2. Электронная микрофотография контрольных и облученных видимым светом в дозе 22 Дж/см2 клеток Saccharomyces cerevisiae rad+/rad+.

Индуцированные активными формами кислорода повреждения ДНК дрожжей включают апуриновые/апиримидиновые участки и разрывы цепи [Swanson et al., 1999; Vance et al., 2001], возникающие в ходе эксцизионной репарации окисленных оснований [Girard and Boiteux, 1997]. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК у дрожжей осуществляется путем негомологичной и гомологичной рекомбинации [Shrivastav et al., 2008]. Последняя представляет ЯАВ52-зависимый тип репарации [Symington, 2002] и функционирует, например, при повреждении дрожжевых клеток экзогенной перекисью водорода [Ragu et al., 2007]. Однако в наших экспериментах, клетки мутантного штамма S. cerevisiae rad52, дефицитные по пострепликативной рекомбинационной репарации и чувствительные к образованию разрывов ДНК, инактивировались видимым светом с той же эффективностью, что и дикий штамм. Это указывает на отсутствие или малый вклад повреждений ДНК в летальный

фотодинамический эффект и согласуется с тем фактом, что в ядерной фракции порфирины обнаружены не были. Фотосенсибилизированная инактивация дрожжей видимым светом принципиально отличается, таким образом, от таковой на длинноволновом ультрафиолете (УФА) с участием другого эндогенного фотосенсибилизатора - НАДН [Фрайкин с соавт., 1987; 1991]. Ядерная локализация НАДН определяет высокую чувствительность штамма Л", сегычи'ае га<152 к УФА диапазону.

Порфириновое производное П675. В отличие от 5. сегеушае, в плазматических мембранах С. guilliermondii протопорфирин IX обнаружен не был, однако найдено эндогенное порфириновое производное (по нашей оценке в количестве около 100 пмоль/мг белка), условно обозначенное П675. Это производное обладало сдвинутым в длинноволновую область максимумом флуоресценции (683 нм в составе мембран и 675 нм в экстрактах, рис. 3), что отличало его от протопорфирина IX (630-635 нм).

Рис. 3. Спектры возбуждения флуоресценции (-) и

флуоресценции (---)

этилацетатного экстракта из изолированных плазматических мембран дрожжей С. guiШermondii.

с;

400

700

500 600

Длина волны, нм

Форма с близкими спектральными характеристиками была зарегистрирована нами также в процессе фотовыцветания эндогенного протопорфирина IX у дрожжей 5. cerevisiae (см главу II). У животных клеток аналогичная форма была идентифицирована [Bagdonas et al., 2000] как фотопротопорфирин - окисленная форма протопорфирина хлоринового типа.

На клеточном уровне у облученных дрожжей С. guilliermondii наблюдали как появление проницаемости для флуорохромом примулином, так и увеличение микровязкости плазматических мембран протопластов (рис. 1 и 4). При этом увеличение степени эксимеризации зонда пирена в облученных протопластах дрожжей наблюдалось при двух длинах волн возбуждающего света (к возб 323 нм и 285 нм) (рис. 4), что связывают [Владимиров и Добрецов, 1980; Орлов с соавт, 1981] с фотоиндуцированным увеличением микровязкости в липидном бислое и области липид-белковых контактов.

Рис. 4. Дозовые зависимости фотоиндуцированного увеличения микровязкости плазматических мембран протопластов дрожжей С. guilliermondii, измеренной по отношению интенсивности флуоресценции эксимеров и мономеров зонда пирена (1фл 450 нм / 1фл 373 нм) при X возб 285 нм (кривая 1) или 323 нм (кривая 2).

0 4 8 12

Два400600Hrç Дк/ол

Эффективность ПФОЛ, что видно по накоплению ТБК-активных продуктов в плазматических мембранах С. guilliermondii, снижалась в присутствии азида натрия, имеющего максимальную из всех известных соединений константу тушения синглетного кислорода - порядок 10® М"'сек', и повышалась в D20, где время жизни синглетного кислорода увеличивается более чем на порядок (рис. 5). То есть, в соответствии с имеющимися в литературе представлениями, эндогенный П675 аналогично протопорфирину IX индуцировал фотодинамические реакции второго типа с участием синглетного кислорода.

Рис. 5. Влияниие D20 и азида натрия (NaN3,10 мМ) на перекисное фотоокисление липидов в изолированных плазматических мембранах С. guilliermondii.

Доза 400-600 нм, Дж/см

Таким образом, инактивация дрожжей видимым светом является результатом протекания окислительных деструктивных процессов в важнейших мембранных

структурах клеток. Чувствительность дрожжей к солнечному свету видимого диапазона спектра в естественных условиях невелика. Это может быть обусловлено низким содержанием эндогенного протопорфирина IX и его производных, при котором соблюдается баланс между интенсивностью образования окислительных фотоповреждений субклеточных структур и активностью антиоксидантных защитных систем [Гесслер с соавт, 2007]. При увеличении содержания эндогенного протопорфирина IX следовало ожидать возрастания фоточувствительности клеток. Нами была предпринята попытка смоделировать подобную ситуацию, индуцируя в дрожжевых клетках аналог «протопорфирии».

Глава II. Фотосенсибилизация дрожжей в условиях индуцированного накопления эндогенных порфиринов

Исходным материалом для биосинтеза тетрапиррольных соединений являются сукцинил-СоА и глицин, из которых образуется 5'-аминолевулиновая кислота (АЛК), и далее - порфобилиноген и исходный тетрапиррол - уропорфириноген. Последующие интермедиаты (копро- и протопорфириноген, протопорфирин) становятся все более гидрофобными, непосредственный предшественник гема протопорфирин IX имеет высокое сродство к мембранным липидам и локализуется во внутренних митохондриальных мембранах, где феррохелатаза катализирует включение в него двухвалентного железа.

Накопления эндогенных порфиринов можно ожидать при нарушении регуляторных механизмов биосинтеза гема. Хотя такая регуляция у дрожжей изучена недостаточно, отдельные данные указывали на способность конечного продукта (гема) влиять на активность АЛК-синтазы по принципу отрицательной обратной связи, как это имеет место в большинстве животных клеток. Для индукции накопления протопорфирина у животных наиболее известен прием введения АЛК извне, лежащий в основе фотодинамической терапии с участием эндогенного протопорфирина [Peng et al., 1998]. В то же время, в отличие от животных клеток, у дрожжей стадия образования АЛК из глицина и сукцинил-КоА может не являться лимитирующей вследствие высокого исходного содержания эндогенной АЛК (до 1,5 мМ у S. cerevisiae) [Labbe-Bois and Labbe, 1990]. Действительно, выращивание культур дрожжей в присутствии АЛК (до 2 мМ) не влияло на содержание в них протопорфирина и фоточувствительность клеток.

Эффективным способом индукции накопления протопорфирина у дрожжей оказалось ингибирование заключительной стадии его превращения в фотодинамически неактивный гем. На лабораторных культурах дрожжей это было достигнуто путем выращивания S. cerevisiae в присутствии 0,2 мМ 2,2'-дипиридила, а С. guilliermondii - при сочетанном воздействии 2,2'-дипиридила и 0,2 мМ АЛК. Потребление кислорода такими клетками было вдвое ниже по сравнению с контрольными, что свидетельствует об ингибировании митохондриального дыхания.

Показано, что при дефиците железа у дрожжей S. cerevisiae среди генов, кодирующих ферменты цепи биосинтеза гема, репрессируется только ген hem\S (феррохелатазы) [Hausmann et al., 2007]. Этим объясняется тот факт, что при выращивании дрожжей в присутствии 2,2'-дипиридила протопорфирин (субстрат феррохелатазы) оказался доминирующим флуоресцирующим порфирином в клетках (рис. 6).

350 400 450 500 550 600 650

• 10 мкМ КП

- 5 мкМ ПП IX

- 30 мкМ Zn ПП

1.0 мкМ КП 0.5 мкМ ПП IX 0.5 мкМ Zn ПП IX

700 350 400 450 500 550 600 650

Длина волны, нм

Рис. 6. Спектры флуоресценции и поглощения этилацетатных экстрактов из клеток дрожжей, выращенных с 0,2 мМ 2,2'-дипиридила (5. сеге\ч$1ае) или 2,2'-дипиридила и 0,2 мМ 5-аминолевулиновой кислоты (С. ПИегтопйиа также некоторых порфиринов в этилацетате, КП - копропорфирин, ПП IX - протопорфирин IX, Хп ПП IX - 2п-содержащий комплекс протопорфирина IX.

У сегеушае 2,2'-дипиридил индуцировал увеличение содержания эндогенного протопорфирина в 6 раз, до 18 пмоль/мг белка. Это приводило к 7-кратному увеличению фоточувствительности клеток, Д37 снижалась с 20 до 3 Дж/см2. Необходимость дополнительного введения АЛЬС для достижения высокого уровня накопления протопорфирина и фотоинактивации у С. guilliermondii может отражать снижение эндогенной активности АЛК-синтазы в присутствии хелатора 2,2'-дипиридила. При дефиците железа у дрожжей включается СЛШ-зависимый регуляторный механизм, направленный на деградацию мРНК, кодирующих белки, в том числе АЛК-синтазу, участвующие в железо-зависимых метаболических процессах [Ршё е1 а1., 2005; 2008].

Индуцированное 2,2'-дипиридилом накопление эндогенного протопорфирина IX у сегеу'тае наиболее интенсивно протекало в митохондриях, где его уровень повышался более чем в 4 раза, тогда как в плазматических мембранах - в 1,8 раза (табл. 2).

Таблица 2. Влияние 0,2 мМ 2,2'-дипиридила на содержание протопорфирина IX и процессы перекисного фотоокисления липидов в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей 5. се/еушае гасП/гасГ при облучении видимым светом в дозе 7,2 Дж/см2 (р<0,05; п=3)

Условия выращивания клеток Протопорфирин IX, нмоль/мг белка ТБК-активные продукты, нмоль/мг белка

митохондр. плазм, мембраны митохондр. плазм, мембраны

Без добавок 0,080± 0,015 0,017 ±0,003 0,20+ 0,05 0,50+0,10

+ 0,2 мМ дипиридила 0,340+0,035 0,030+ 0,005 2,00+0,25 1,10+0,15

Поскольку двухвалентное железо является ингибитором Zn-хелатазной активности феррохелатазы [Camadro and Labbe, 1982], его недостаток может приводить к накоплению Zn-содержащего протопорфирина. В спектрах флуоресценции хлороформных экстрактов из митохондрий дрожжей S. cerevisiae, выращенных в присутствии 2,2'-дипиридила, нами зарегистрировано 10-кратное увеличение интенсивности флуоресценции при 585 нм, характерной для Zn-протопорфирина [Csatorday et al., 1981] (рис. 7).

В отличие от митохондрий, в плазматических мембранах Zn-протопорфирин практически не накапливался. Это свидетельствует о низкой способности Zn-протопорфирина к перераспределению из митохондрий в другие мембранные клеточные структуры. В ряде работ отмечается малая фотодинамическая активность Zn-протопорфирина [Scott et al., 1990; Ladan et al., 1993]. Мы индуцировали переход

протопорфирина IX в 2п-протопорфирин введением ацетата цинка в растущую с 2,2'-дипиридилом культуру дрожжей (рис. 8). Такие клетки действительно оказались более устойчивыми к видимому свету по сравнению с выращенными только с с 2,2'-дипиридилом, Д37 - 15 Дж/см2.

550

600

650

700

а £

750

с;

•е-!Ё

Длина волны, нм

600 650 700

Длина волны, нм

Рис. 7. Спектры флуоресценции (А. возб Рис. 8. Разностные (опыт - контроль) 405 нм) хлороформных экстрактов из спектры флуоресценции (А, возб. 405 нм) митохондрий дрожжей 5. сегеу/я'ае, клеток 5. сегеушае. Контрольные и выращенных без (1) или с 0,2 мМ 2,2'- опытные культуры выращивали 5 ч в дипиридила (2). присутствии 0,2 мМ 2,2'-дипиридила, к

опытным за 1 ч до окончания выращивания добавляли 1 мМ ацетата цинка (1) или сульфата магния (2).

В плазматических мембранах дрожжей под воздействием 2,2'-дипиридила содержание протопорфирина IX повышалось в 1,76 раза, а фотоиндуцированное накопление ТБК-активных продуктов - в 2,2 раза (табл. 2).

У клеток с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX: 1) возрастала фоточувствительность; 2) повышался уровень перекисного фотоокисления липидов в субклеточных структурах - митохондриях и плазматических мембранах (табл. 2); 3) усиливались функциональные нарушения (рис. 9) -ингибирование потребления кислорода, деструкция барьеров проницаемости плазматических мембран, которую детектировали по появлению прокрашивания цитоплазмы клеток флуорохромом примулином.

Клетки дикого и мутантных по репарации ДНК штаммов дрожжей в присутствии 0,2 мМ 2,2'-дипиридила накапливали примерно одинаковое количество протопорфирина IX. Однако, дефицитные по пострепликативной рекомбинационной репарации дрожжи (штамм гас! 52) оказались при этом чувствительнее (более, чем в 3 раза) к повреждающему действию видимого света по сравнению с диким штаммом (см рис. 13, гл. III). Клетки тех же штаммов дрожжей без индуцированного накопления протопорфирина проявляли близкую фоточувствительность (см гл. I). Это свидетельствует о том, что при индуцированном накоплении протопорфирина IX в фотоинактивацию мутанта гас! 52 определенный вклад вносят двухцепочечные разрывы ДНК, индуцированные активными формами кислорода.

Доза 400-600 Дж/см2 Рис. 9. Фотоиндуцированные инактивация потребления кислорода и увеличение проницаемости к флуорохрому примулину у дрожжей Я. сегеу1зше гас!+/гасН- без и с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX

(ПП1Х).

Для морфологической картины облученных клеток дрожжей с высоким уровнем эндогенного протопорфирина IX наиболее характерно образование везикул плазматической мембраны и фрагментация вакуолей (рис. 10). В отсутствие облучения фрагментацию вакуоли наблюдали у клеток штамма 5. сегегшае бос11Д, дефицитного по Си,2п-супсроксиддисмутазс 1 [Соазоп й а1., 1999]. Предполагается, что окислительный стресс играет решающую роль в индукции этого процесса.

Совокупность полученных данных позволяет считать, что фотодинамический летальный эффект у клеток дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX является результатом взаимодействия деструктивных реакций, протекающих в разных компартментах клетки и затрагивающих различные молекулярные структуры. Рост фоточувствительности плазматических мембран и

проявление повреждений генетического аппарата при избыточном накоплении эндогенного протопорфирина может указывать на частичное перераспределение протопорфирина IX из митохондрий в другие субклеточные структуры.

Рис. 10. Морфология клеток S. cerevisiae rad+/rad+ с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX: слева - контроль (К), без облучения; справа -облучение видимым светом в дозе 3 Дж/см2 (КОЕ - 34%, потребление кислорода - 9%

от контроля).

Перераспределение эндогенного протопорфирина может происходить, во-первых, в процессе накопления фотосенсибилизатора до облучения. На это указывают наши данные об индуцированном 2,2'-дипиридилом увеличении содержания протопорфирина не только в митохондриях, но и плазматических мембранах клеток дрожжей. Во-вторых, как показано для животных клеток [Rossi et al., 1996; Moan et al., 1997], релокализация протопорфирина может иметь место в процессе облучения при фотоиндуцированной деструкции митохондрий.

Хотя наибольшей цитотоксичностью обладает необесцвеченный краситель [Bezdetnaya et al., 1996], фотопродукты, образующиеся в процессе фотовыцветания протопорфирина, также могут вносить определенный вклад в фотосенсибилизированное повреждение различных субклеточных структур. Так, при образовании фотопротопорфирина - фотопродукта протопорфирина хлоринового типа, который обычно детектируют по характерной флуоресценции при 675 нм, происходит сенсибилизация клеточных мембран раковых клеток [Ma et al., 2001]. В

процессе фотовыцветания AJIK-индуцированного протопорфирина в дрожжевых клетках S. serevisiae мы также наблюдали появление нового максимума флуоресценции при 675 нм (рис. 11), что указывает на возможное образование фотопродукта протопорфирина хлоринового типа. Известно, что этот фотопродукт, как и исходное соединение, обладает фотосенсибилизирующей активностью [Bagdonas et al., 2000], которая может, по-видимому, определять гибель популяции дрожжевых клеток при тех дозах видимого света, когда практически весь пул эндогенного протопорфирина уже обесцвечен. На одну из возможных внутриклеточных локализаций окисленных продуктов протопорфирина хлоринового типа указывает то, что порфириновое производное со сходными физико-химическими свойствами обнаружено нами в плазматических мембранах дрожжей (см гл. I).

550 600 650 700 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

Длина волны, нм Доза 400-600 нм, Дж/см2

Рис. 11. Индуцированное видимым светом 400-600 нм (6 мВт/см2) выцветание флуоресценции (Адозб. 405 нм) эндогенного протопорфирина IX в суспензиях клеток дрожжей 5. ^егеушае гаё+/гаё+. На рисунках приведены результаты характерного

эксперимента.

Фотодинамическая активность локализованного в плазматической мембране эндогенного производного протопорфирина хлоринового типа позволила предположить наличие фотосенсибилизирующего потенциала и у экзогенных красителей этого класса. Ранее сенсибилизация дрожжевых грибов хлоринами не изучалась.

Глава III. Фотодеструктивные процессы в клетках дрожжей, опосредованные экзогенными хлориновыми фотосенсибилизаторами

Хлориновые фотосенсибилизаторы (хлорин еб, препарат фотодитазин, хлорин рб, З-формил-З-девинилхлорин рб) эффективно инактивировали дрожжевые клетки, Дз7 составляла менее 1 Дж/см2.

Эксперименты с тушителем синглетного кислорода азидом натрия и антиоксидантом, ингибитором процессов перекисного окисления липидов пропилгаллатом, показали, что оба соединения эффективно защищают дрожжи от сенсибилизированной хлоринами фотоинактивации. Это свидетельствует о фотодинамическом характере индукции процессов перекисного окисления липидов при облучении дрожжей видимым светом в присутствии хлоринов.

При фотосенсибилизации хлоринами дрожжевых клеток наблюдалась высокая степень везикуляризации плазматической мембраны (рис. 12), сопровождающаяся появлением проницаемости для флуорохрома примулина.

Рис. 12. Морфология клеток 5. сетадае, обработанных 7 мкМ хлорина еб и облученных видимым светом. А: КОЕ - 33%, потребление кислорода - 65% от контроля;

Б и В: КОЕ - 10%, потребление кислорода - 37% от контроля.

Образование отдельных везикул плазматической мембраны дрожжей наблюдали ранее в ответ на окислительный стресс, индуцированный перекисью водорода [Madeo et al., 1999]. Морфологическая картина клеток при фотодинамических воздействиях имела сходство с таковой при действии такого химического окислителя, как перекись водорода, которая в низких концентрациях (3-5 мМ) индуцирует апоптический, а в высоких (180 мМ) - некротический тип гибели дрожжей [Madeo et al., 1999; Phillips et al., 2006]. Как и в случае действия перекиси водорода, фотосенсибилизированная хлоринами гибель дрожжей предотвращалась при предварительном ингибировании биосинтеза белка циклогексимидом, что в литературе рассматривается как свидетельство в пользу активного апоптического пути гибели клеток, для которого необходим синтез белков de novo.

Известно, что под воздействием синглетного кислорода происходит окислительная деструкция такого важнейшего компонента плазматических мембран дрожжей, как эргостерол. Накопление окисленных полярных продуктов эргостерола приводит к изменению физических свойств мембран, способствует увеличению их проницаемости [Bocking et al., 2000]. Снижение содержания эргостерола [Sokol-Anderson et al., 1988] или увеличение содержания насыщенных стеролов [Casey and Parks, 1989] приводит к повышению устойчивости дрожжевых грибов к окислительному стрессу. Дефицитные по железу дрожжевые клетки характеризуются низким уровнем содержания эргостерола и увеличением содержания насыщенных жирнокислотных остатков липидов в плазматических мембранах [Ferreira et al., 2004; Hausmann et al., 2008], что влияет на свойства и функционирование клеточных мембран [Shakoury-Elizeh et al., 2010]. В наших экспериментах дрожжи, в которых дефицит железа создавался хелатором железа 2,2'-дипиридилом, теряли чувствительность к фотосенсибилизации хлоринами. Это указывает на возможность выработки адаптации дрожжевых грибов к фотодеструктивному действию, опосредованному хлориновыми фотосенсибилизаторами.

В отличие от клеток с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX, при обработке хлоринами фоточувствительность штаммов, дефицитных по репарации ДНК, практически не отличалась от дикого (рис. 13).

Рис. 13. Чувствительность к видимому свету (400-600 нм) дикого (S. cerevisiae rad+/rad+) и дефицитных по эксцизионной репарации нуклеотидов (rad3) или пострепликативной рекомбинационной репарации (rad52) штаммов дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX (ПП1Х) или экзогенным хлорином еб.

Дикий штамм rad3 rad52

Однако, несмотря на отсутствие повышенной чувствительности мутантных штаммов дрожжей, полностью исключать образование фотосенсибилизированных хлоринами повреждений ДНК нельзя. В пользу возможности образования таких повреждений свидетельствуют сходные закономерности остановки деления клеток при фотосенсибилизации хлоринами и при обработке дрожжей менадионом [Flatteiy-O'Brien and Dawes, 1998]. Менадион является генератором супероксидных анион радикалов кислорода и индуцирует остановку деления клеток за счет повреждений ДНК. В обоих случаях имела место остановка деления в фазе Gl клеточного цикла (у дрожжей идентифицируется как клетки без почек [Shapira et al., 2004]).

Данные, полученные при исследовании нарушений морфологии клетки, функциональной активности плазматической мембраны, митохондриального и генетического аппаратов при фотосенсибилизации дрожжей экзогенными хлоринами (хлорин еб, препарат фотодитазин, хлорин рб, З-формил-З-девинилхлорин рб), позволяют считать плазматическую мембрану дрожжевых клеток одной из важнейших мишеней при действии анионных хлориновых фотосенсибилизаторов.

Глава IV. Антимикробная активность катиоиных тетрапиррольных фотосенсибилизаторов

Среди анионных тетрапиррольных красителей определенной способностью связываться с клетками грамотрицательных бактерий и индуцировать их фотоинактивацию обладает дейтеропорфирин [Nitzan et al., 1994], а также хлорины еб и рб (см ниже табл. 3). Более высокомолекулярные анионные красители, например, фотофрин (М.в. 1135) [Maisch et al., 2007], не проникают через наружную мембрану и

1,8-^ 1,6

о а

а >. я-о f-

о ©

контроль

0.002 шМ хлорин еб ] 0.002 тМэнд.ПГПХ

не сенсибилизируют клетки грамотрицательных бактерий Е. coli, но активны в отношении грамположительных S. aureus.

Фенотиазины и акридины, проникающие в бактериальные клетки, индуцируют в них фотоповреждения ДНК [Epe et al., 1993; Bhatti et al., 1998]. При фотосенсибилизации как анионным гематопорфирином, так и тетракатионным фталоцианином цинка фотоповреждения в ДНК наблюдаются только при длительных временах (больших дозах) облучения, когда уже имеют место нарушения в клеточных барьерах проницаемости и агрегация цитоплазматических макромолекул [Bertoloni et al., 2000; Spesia et al., 2009]. Однако, помимо индукции прямых летальных повреждений, окислительный стресс может опосредованно модулировать фоточувствительность микроорганизмов путем активации факторов транскрипции и экспрессии антиоксидантных систем [Rodrigues-Pousada et al., 2004; Ziegelhoffer and Donohue, 2009]. Предполагается, что эти процессы активируются низкими уровнями повреждения ДНК активными формами кислорода [Rowe et al., 2008]. У бактерий Rhodobacter sphaeroides синглетный кислород активирует экспрессию генов, в том числе cfaS, продукт которого, циклопропан синтаза жирных кислот, участвует в поддержании целостности липидного бислоя мембран и минимизирует чувствительность мембран к окислительной деструкции [Ziegelhoffer and Donohue, 2009].

Условием эффективной прямой фотодинамической инактивации является тесная ассоциация фотосенсибилизатора с биологической мишенью, что следует из малого (10-50 нм) диффузионного радиуса '02 в биологической среде [Красновский, 1997; Ochsner, 1997]. Цитоплазматическая мембрана бактерий отделена от внешней среды клеточной стенкой толщиной от 10 до 80 нм в зависимости от видовой принадлежности. По имеющимся в литературе представлениям [Minnock et al., 1996; Jon and Brown, 2004], в том числе развиваемым в рамках настоящей работы, отрицательный заряд клеточных стенок грамотрицательных бактерий обусловливает связывание с ними катонных красителей. Справедливость этих представлений была доказана нами на красителях раличных классов: фенотиазинах, порфиринах, хлоринах и фталоцианинах. В этих исследованиях впервые была использована бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе генно-инженерного штамма E.coli рХеп7 [Манухов с соавт., 1999].

Возможность применения данной тест-системы для скрининга красителей основана на установленной нами прямой пропорциональной зависимости между фотосенсибилизированным тушением биолюминесценции культуры Е. coli рХеп7 и уменьшением в ней количества колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис. 14).

Рис. 14. Зависимость интенсивности биолюминесции от выживаемости клеток Е. coli TGI (рХеп7), преинкуби-рованных 25 мин с 7 мкМ фотодитазина и облученных видимым светом в дозах 10-45 кДж/м2. Облучение видимым светом до 45 кДж/м2 не влияло на выживаемость и интенсивность биолюминесценции контрольных, не обработанных фотодитазином, клеток.

Разработанная биолюминесцентная бактериальная тест-система позволила в рамках настоящей работы оценить закономерности фотодинамической инактивации в присутствии красителей, относящихся к разным классам соединений и имеющих различные физико-химические свойства. В целом наблюдалось хорошее соответствие данных о фоточувствительности типового штамма Е. coli, полученных стандартным методом определения КОЕ, и Е. coli рХеп7 по тесту тушению биолюминесценции (табл. 3).

Таблица 3. Фоточувствительность бактерий Е.соИ к различным тетрапиррольным фотосенсибилизаторам по тесту тушения биолюминесценции штамма Е.соИ рХеп7 и по колониеобразующей способности типового штамма Е.соИ АТСС 25922

Фотосенсибилизаторы Фоточувствительность бактерий (1/Дя, см2/Дж)

по тесту биолюминесценции E.coli рХеп7 по колониеобразующей способности Е.соИ АТСС 25922

Эндогенный протопорфирин IX 0,12±0,032 0,07±0,024

Фотогем, 20 мкМ 0,02±0,003 0,02±0,004

Хлорин рб, 20 мкМ 0,10±0,01 0,11±0,015

Хлорин еб, 20 мкМ 0,19±0,020 0,22±0,028

Гидразид циклоимид бактериохлорина, 10 мкМ 0,48±0,050 0,52±0,040

Тетрайодид тетракис 5,10,15,20-(4-три метиламинофенил)порфирин, ЮмкМ 0,67±0,080 0,72±0,075

Биолюминесценция £ coli рХеп7, %

Первичной и критической стадией антимикробного действия поликатионных фталоцианинов, аналогично катионным антимикробным пептидам, может являться электростатическое взаимодействие с липополисахаридами клеточных стенок грамотрицательных бактерий. При ассоциации катионных красителей акридинового оранжевого и сафранина О с изолированными липополисахаридами происходит тушение флуоресценции красителей [Panda and Chakraborty, 1997]. При исследовании связывания фталоцианинов с бактериальными клетками (табл. 4), а также изолированными липополисахаридами Е. coli мы также наблюдали падение сигнала флуоресценции у катионных соединений.

Таблица 4. Тушение флуоресценции ((F0 -F)/F0) красителей клетками Е. coli рХеп7 (3 х I07 КОЕ/мл в Н2Одист) и фотоинактивация бактерий белым светом в дозе 6 Дж/см2 по тесту подавления биолюминесценции ((В0 - В)/В0) в присутствии фталоцианинов с различными ионными заместителями и квантовыми выходами генерации синглетного кислорода (Фа)- Измерения интенсивности флуоресценции и биолюминесценции проводили через 10 мин после добавления 1 мкМ красителей и инкубации при 20-22°С.

Фталоцианины (Фд|* (Fo-F)fFo,, % (B0~ B)/B0, %

AlPc3" (0,38) 2,8±0,4 0

AlPcPym4+ (0,20) 47,0±3,0 17±2,0

AlPcPym8+ (0,37) 80,0±6,0 52±5,0

ZnPc8" (0,57) 4,3±0,5 2±1,0

ZnPcPym4+ (0,10) 20,5±1,5 29±3,0

ZnPcPym8+ (0,45) 77,0±5,0 63±5,0

ZnPcChol8+ (0,65) 98,0±2,0 87±6,0

* Значения Фл приведены по данным Н.А.Кузнецовой с соавторами [Кузнецова с соавт., 2002; Kuznetsova et al., 2003; Makarov et al., 2007]

Для анализа процессов связывания красителей с бактериями в настоящей работе впервые применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволяющий следить за изменением подвижности объектов, размер которых меньше размеров конфокального объема (несколько фемтолитров), определять яркость частиц и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии [Перевощикова с соавт., 2009]. Данный метод успешно используется для исследования взаимодействий лиганд-рецептор [Briddon and Hill, 2007], связывания флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, процессов агрегации, функционального состояния митохондрий.

Измерение методом ФКС автокорреляционной функции G(t) - параметра, отражающего количество флуоресцирующих частиц - N (прокрашенных клеток) в

конфокальном объеме (G(r-»0) = —), показало, что в случае анионного красителя

добавление бактерий не приводит к изменениям С(т), т.е. А1Рс3" практически не взаимодействует с клетками (рис. 15). Напротив, в случае А1РушРс4+и AIPymPcs+ при добавлении бактерий амплитуда функции С(т) существенно возрастала. Полученные

практически не связывают

Рис. 15. Характерные автокорреляционные функции G(t) для суспензии клеток Е. coli рХеп7 (3,3 х 107 КОЕ/мл) в присутствии 1 мкМ красителей (1-3), а также контрольные кривые для красителей в отсутствие бактериальных клеток (4-6):

1,4-А1Рс3";

2, 5 - AlPymPc4+;

3, 6 - AlPymPc8+

Количество прокрашенных клеток N было примерно на 50% выше для окта- по сравнению с тетракатионным фталоцианином алюминия, и в 5 раз - для окта- и тетракатионных фталоцианинов цинка (рис. 16). Это в целом соответствует данным по тушению флуоресценции этих красителей бактериями Е. coli рХеп7 (см табл. 4), которое, как мы предполагаем, обусловлено именно связыванием красителей с клетками. Эффективность тушения была в 1,7 раза выше для окта- по сравнению с тетракатионным фталоцианином алюминия, и в 3,8 раза для окта- и тетракатионных фталоцианинов цинка.

данные свидетельствуют, что бактериальные клетки анионный краситель, но прокрашиваются катионными.

Рис. 16. Зависимость количества прокрашенных клеток Е. coli рХеп7 (флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме, N) от заряда молекул поли-катионных замещенных фталоцианинов алюминия или цинка.

В суспензии клеток с постоянной плотностью с увеличением общей концентрации октакатионного красителя до 1 мкМ наблюдался практически линейный рост интенсивности флуоресценции отдельных частиц (прокрашенных клеток), что может отражать заполнение красителем месг связывания на бактериальной клетке. По нашим расчетам, одна бактериальная клетка Е. coli может связать около миллиона молекул октакатионного фталоцианина.

Присутствие в среде солей магния или кальция вызывало уменьшение фотодинамического подавления биолюминесценции, т.е. защиту бактерий от инактивации (рис. 17). Это может быть связано, с одной стороны, с прямым конкурентным взаимодействием поликатионов фталоцианинов и бивалентных катионов с центрами связывания на поверхности бактериальной клетки (например, отрицательно заряженными группами ЛПС), а с другой - с повышенной проницаемостью клеточной стенки для красителей в отсутствие стабилизирующих катионов Mg2+ и Са2+.

Электростатическое связывание с липополисахаридами наружной мембраны грамотрицательных бактерий является первичной стадией антимикробного действия различных катионных соединений, в том числе антимикробных пептидов [Glukhov et al., 2005]. Однако, с применением JlAJI-теста (Лизат Амебоцитов Лимулюс тест) нами показано, что в отличие от действия антимикробных пептидов, поликатионные фталоцианины не вызывали высвобождения липополисахаридов или их нейтрализацию. Фотодинамическая обработка также не приводила к выбросу липополисахаридов из клеточных стенок инактивированных бактерий и не влияла на нативность этих бактериальных эндотоксинов в бесклеточной среде, а также в составе клеток.

Рис. 17. Защитное действие солей на фотоинактивацию (ФИ) Е. coli рХеп7по тесту подавления биолюминесценции. Соли вносили в суспензию бактерий за 5 мин до добавления 0,5 мкМ ZnPcChol8+, инкубировали 10 мин и облучали белым светом в дозе 6 Дж/см2. За единицу принят эффект защиты в

дистиллированной воде.

Известно, что у грамположительных бактерий клеточная стенка более просто устроена по сравнению с грамотрицательными видами. Экзогенные красители, которые не активны в отношении грамотрицательных бактерий, фотосенсибилизируют грамположительные [Jori and Brown, 2004]. В то же время тейхоевые и липотейхоевые кислоты создают на клеточных стенках грамположительных бактерий определенную плотность отрицательных зарядов, и, следовательно, могут служить центрами связывания катионных красителей аналогично липополисахаридам грамотрицательных бактерий. Действительно, как показано нами с применением модифицированного латекс-теста, октакатионный фталоцианин цинка опосредует фотосенсибилизацию локализованных в клеточной стенке факторов патогенности золотистого стафилококка, белка А и клампинг фактора В (связанной коагулазы). В то же время анионный краситель такой активностью не обладает (рис. 18).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что фотоинактивация бактерий, особенно грамотрицательных видов, в первую очередь определяется эффективностью связывания молекул фотосенсибилизаторов с клетками-мишенями. Фталоцианины с анионными заместителями (например, октакарбоксифталоцианин цинка), являются эффективными генераторами синглетного кислорода, однако практически не связываются с грамотрицательными бактериями и обладают слабой фотосенсибилизирующей активностью. Фотобактерицидная активность замещенных металлофталоцианинов определяется наличием катионных заместителей на периферии молекул. Высокое сродство катионных фталоцианинов к клеткам грамотрицательных бактерий, наиболее вероятно, обусловлено отрицательным зарядом липополисахаридов - основного компонента клеточных оболочек.

Рис. 18. Результаты агглютинационного PASTOREX STAPH-PLUS теста на связанную коагулазу (ClfB) и белок А

S. aureus (109 КОЕ/мл):

1 - контроль;

2 - инкубация 10 мин с 1 мкМ А1Рс3" и облучение в дозе 9 Дж/см2;

3 -инкубация 10 мин с 1 мкМ ZnPcChol8+ и облучение белым светом в дозе 6 Дж/см2;

4 -то же и облучение в дозе 9 Дж/см2.

f * *

3 4

Сродство фталоцианинов к бактериям позволяет качественно прогнозировать наличие у них фотобактерицидной активности. Иными словами, только тот краситель, который связался с бактериальной клеткой, обладает способностью ее инактивировать.

Клеточная стенка грибов рассматривается как одна из важнейших мишеней при действии фунгицидов [Carrillo-Munoz et al., 2006]. На ряде катионных соединений показано, что их активность определяется способностью связываться с полифосфатами [Иванов с соавт, 1996] и фосфоманнанами [Harris et ai., 2009], несущими отрицательно заряженные остатки фосфорной кислоты, и зависит от их содержания в клеточной стенке дрожжей. С использованием анионных и катионных замещенных металлофталоцианинов нами было установлено, что фотофунгицидная активность зависит от заряда молекул этих фотосенсибилизаторов. Фотодинамическая инактивация дрожжевых грибов наблюдалась только в присутствии тех металлофталоцианинов, молекулы которых несут положительно заряженные заместители. Потеря ригидности клеточных стенок является характерным для фотосенсибилизации дрожжей катионными металлофталоцианинами морфологическим изменением (рис. 19). В отличие от действия хлориновых

фотосенсибилизаторов образование везикул плазматической мембраны не наблюдается.

Рис. 19. Морфология клеток С. ¿иППегтопсШ, обработанных 2 мкМ 7пРсСЬо18+. А: без облучения, КОЕ - 95%; Б: облучение видимым светом, КОЕ - 50%; В: облучение видимым светом, КОЕ - 10%.

Глава V. Фотосенсибилизаторы для антимикробной фотодинамической терапии и фотообеззараживания

В последние годы большое значение придается разработке новых способов борьбы с патогенными микроорганизмами, что обусловлено увеличением количества штаммов, устойчивых к действию традиционных антимикробных препаратов [Cunha, 1998; Yoshikawa, 2002]. Одним из таких способов может стать фотодинамическая терапия (ФДТ), которая до недавнего времени применялась для деструкции опухолей.

Учитывая высокую активность поликатионных красителей на бактериальной биолюминесцентной тест-системе, а также фотофунгицидную активность хлоринов на лабораторных штаммах дрожжей, представляло интерес оценить возможности практического использования этих групп красителей в антимикробной ФДТ.

Фотодинамическая активность одного из наиболее перспективных соединений -октакатионного замещенного металлофталоцианина (октакис(холинил)-фталоцианина цинка) была подтверждена на 20 эталонных и клинических штаммах бактерий. Однако была обнаружена значительная гетерогенность эффективности фотодинамической инактивации (рис. 20), которая наблюдалась как между штаммами одного вида (эталонный штамм АТСС 25922 и клинический изолят Е. coli), так и между различными видами.

с о ш о

Q. IX

10,

H <

м -У

О О

(КОЕКОНТр/

Рис. 20.

Эффективность

фотодинамической

инактивации по тесту

уменьшения

колониеобразующей

способности

/ К(ЗР0ПЫТ] различных штаммов энтеробактерий после Ю мин инкубации суспензий с исходной плотностью 10* КОЕ/мл в 0,9% ЫаС1 с 1 мкМ гпРсСЬо18+ и облучения белым светом в дозе 9 Дж/см2

Среди энтеробактерий имеется значительная гетерогенность строения олигосахаридов липида А и кора ЛПС [Кабанов и Прохоренко, 2010]. Модификация ЛПС является одним из важных механизмов выработки устойчивости грамотрицательных бактерий к катионным антимикробным пептидам [Weise et al., 1998; Fresno et al., 2006]. Бактерии P. mirabilis проявляют высокую устойчивость к полимиксину В и протегринам, что связывают с присутствием в ЛПС положительно заряженных молекул аминоарабинозы [МасСоу et al., 2001]. Сходная закономерность наблюдается и в отношении устойчивости этих энтеробактерий к фотодинамической инактивации. Среди 4-х клинических изолятов из группы энтеробактерий наиболее устойчивыми к фотодинамической инактивации оказались P. mirabilis. Эффективность фотоинактивации Е. coli и 5. enteritidis была на порядок, a S. marcescens на 2 порядка выше. При этом клетки P. mirabilis связывали ZnPcChol8+ в гораздо меньшей степени по сравнению с Е. coli и S. enteritidis (рис. 21). Полученные данные свидетельствуют, что видовая принадлежность бактерий является важнейшим фактором, определяющим эффективность фотодинамической инактивации.

Рис. 21. Связывание октакис-(холинил)фталоцианина цинка клетками энтеробактерий (108 КОЕ/мл в 0,9% NaCl). Количество связанного красителя [ZnPcCholg] связ рассчитано по разнице поглощения красителя (£«3= 190000 М-1'см"1) в фильтратах его бесклеточных растворов - [ZnPcCholg] общ и клеточных суспензий после 10 мин инкубации - [ZnPcCholg] сво6.

Практическое использование фотодинамической инактивации микроорганизмов невозможно без разработки эффективных и недорогих источников излучения. Совместно с НПО «Астрофизика» нами создан образец светодиодного источника (JET680-1) с максимумом испускания при 684 нм, что практически совпадает с длинноволновой полосой поглощения октакис-(холинил)фталоцианина цинка (рис. 22), шириной спектральной полосы 25 нм и интенсивностью около 19 мВт/см2 на расстоянии 5 см от линзы излучателя.

Светодиодный источник был успешно испытан в целях инактивации широкого круга грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе метициллин устойчивого штамма 5. aureus - 664 MRSA. Исследования по фотодинамической инактивации бактерий легли в основу новых способов лечения гнойных заболеваний лор-органов, разработанных в лабораториях A.B. Решетникова (патент РФ № 2228775) и A.C. Лапченко (патенты РФ № 2282647 и 2361633).

Фотосенсибилизация грибов ранее преимущественно изучалась с применением фенотиазинов (метиленовый синий, толуидиновый синий), отдельных порфиринов и фталоцианинов [Ito and Ito, 1984; Bertoloni et al., 1992]. В настоящей работе впервые выявлена высокая фотофунгицидная активность амфифильных хлориновых фотосенсибилизаторов, а также поликатионных фталоцианинов.

Большое практическое значение имеет обнаруженная высокая эффективность хлориновых фотосенсибилизаторов в инактивации одного из основных возбудителей кандидозов - С. albicans, как эталонного, так и клинических штаммов. На основании этих исследований разработан новый способ фотоинактивации патогенных грибов (патент РФ №2230110).

0,8-,

Спектр поглощения ZnPcHols

Спектр испускания светодиодного источника

0.7-

Рис. 22. Спектры поглощения 1 мкМ октакис-(холинил)фталоцианина цинка 2пРсНо18 и испускания

светодиодного источника

0.0- .

600

650

750

800

Среди исследованных хлориновых фотосенсибилизаторов особый интерес представляют соединения, имеющие длинноволновые максимумы поглощения в области высокой оптической проницаемости биологической среды, например, у 3-формил-3-девинилхлорин рб - в дальней красной области спектра при 691 нм. Этот фотосенсибилизатор (в концентрации 10 мкМ) в сочетании с источником на основе светодиода IDL-50-M-690 при интенсивности излучения на уровне образца 20 мВт/см2 проявлял высокую эффективность в фотоинактивации плотных культур дрожжевых грибов, вплоть до концентрации 5х108 КОЕ/мл. В практическом отношении системы на основе красителей с длинноволновыми максимумами поглощения и соответствующих источников излучения могут быть перспективны для фотоинактивации культур микроорганизмов с высокой плотностью клеток, а также биопленок.

Эффективность применения катионных фталоцианинов в качестве фотофунгицидов показана на клеточных культурах и, совместно с Институтом глазных болезней РАМН (С.Э. Аветисов с соавторами), в системе in vivo на специально разработанной для этих целей животной модели кератомикоза кроликов (патент РФ № 2346338). Актуальность разработки и использования этой животной модели определяется тем, что в последние годы заметно возросла частота грибковых поражений роговицы. Кератиты данной этиологии вызываются грибами, обитающими в конъюнктиве, слезных путях, в контактных линзах, а также попадающими в глаз при его травме. В случаях кератомикозов наиболее часто выделяются дрожжевые грибы рода Candida. Кератит легкой и средней степени тяжести, т.е. поверхностные язвы роговицы, формировали у кроликов с помощью мягких контактных линз,

предварительно инфицированных дрожжевыми грибами С. '¿иНИеппомШ. В отсутствие лечения у животных в результате ношения инфицированных мягких контактных линз в течение 5 суток развивался эндофтальмит, сопровождающийся расплавлением роговицы, некротическим поражением стромы и потерей глаза. Применение фотодинамической терапии (обработка поверхности роговицы гелем, содержащим 2 мг/мл Холосенса, и облучение с помощью лазерной установки для ФДТ ЛФТ-630/675-01 «Биоспек») приводило к полному выздоровлению животных и по всем показателям (срокам исчезновения гнойного отделяемого, эпителизации и др.) на 10-40% превосходило консервативную противогрибковую терапию с амфотерицином (патент РФ № 2352367).

Фотодинамическая инактивация может быть использована не только в терапевтических целях, но и для фотообеззараживания различных предметов, сред от патогенных микроорганизмов, в том числе вирусной этиологии. Так, использование данного способа с применением катионных фотосенсибилизаторов позволяет надежно обеззараживать жидкости с высокими титрами вируса гриппа А птиц подтипа Н5М1 (патент РФ № 2361633).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В клетках различного происхождения функционируют многочисленные защитные системы, которые играют существенную роль в обеспечении устойчивости к повреждающему действию оптического излучения солнца. Хорошо известны антиоксидантные системы (глутатионпероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза, а-токоферол, Р-каротин и др.), которые тушат активные формы кислорода и возбужденные состояния макромолекул. Пигменты поверхностных слоев клеток, такие как флавоноиды и меланины, экранируют лежащие в глубине ткани от фотоповреждений. Ферменты темновой репарации и фотореактивации устраняют образовавшиеся фотоповреждения ДНК.

Накопление в клетках эндогенных фотосенсибилизаторов приводит к развитию потенциально летальных фотоокислительных процессов. Очевидно, что регуляция биосинтеза эндогенных порфиринов также может рассматриваться в качестве механизма, позволяющего уменьшать эффективность повреждающего действия оптического излучения видимого и, частично, длинноволнового ультрафиолетового диапазонов спектра путем снижения содержания этих фотоактивных соединений. Существование такой регуляции в клетках различного происхождения (от бактериальных, дрожжевых до животных) указывает на важную роль этого процесса в обеспечении безопасного существования организмов в условиях солнечной инсоляции.

Для оценки биологической роли таких процессов необходимо детальное исследование факторов, вызывающих нарушение регуляции на различных стадиях

цепи биосинтеза и приводящих к изменению внутриклеточной концентрации и локализации тех или иных порфиринов с различными физико-химическими свойствами и сенсибилизирующей активностью. К ним относятся различные факторы, в том числе генетические, которые ответственны за недостаточность отдельных ферментов в цепи биосинтеза порфиринов. Сюда относится и естественный или искусственно индуцированный хелаторами дефицит такого важнейшего фактора минерального питания как железо, избыток предшественника порфиринов 5'-аминолевулиновой кислоты. 2,2'-Дипиридил относится к хелаторам фенантролинового ряда, которые ранее использовались в качестве фотогербицидов [Rebeiz et al., 1990]. Наши данные свидетельствуют, что накопление эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов при действии хелаторов железа носит более общий характер и имеет место в клетках различного биологического происхождения, что необходимо учитывать при практическом применении такого рода соединений. Аналогичная проблема поднята в последние годы группой J. Moan [Juzeniene et al., 2007], обнаружившей увеличение содержания эндогенных порфиринов в клетках кожи при местном применении ряда хелаторов железа, которые входят в состав косметических препаратов, используемых для предотвращения старения кожи под действием солнечного УФ.

В то же время наличие и глубокое понимание механизмов регуляции биосинтеза порфиринов позволяет, направленно увеличивая фоточувствительность клеток, использовать фотосенсибилизированные ими процессы в целях инактивации нежелательных образований. Так, к настоящему времени получила развитие фотодинамическая терапия рака, поверхностных бактериальных заражений и ряда других заболеваний, основанная на индуцированном 5'-аминолевулиновой кислотой биосинтезе эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. Нами разработан новый метод фотодинамической инактивации дрожжей, в том числе Saccharomyces и Candida, в условиях повышенного содержания в клетках эндогенного протопорфирина IX, стимулированного 5'-аминолевулиновой кислотой и/или хелатором 2,2'-дипиридилом. Дрожжевые клетки с искусственно индуцированной «порфирией» представляют собой удобную модель для исследования локализации и возможного перераспределения порфиринов по субклеточным структурам, а также чувствительных к фотосенсибилизации клеточных мишеней. Тот факт, что митохондрии дрожжей являются мишенью деструктивного действия видимого света особенно ярко проявляется в условиях индуцированного накопления эндогенного протопорфирина IX.

бактерий до 100-250 мкм у дрожжей, т.е. равна или превышает пробег синглетного кислорода в биологической среде. Компоненты клеточных стенок (липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, фоефоманнаны и полифосфаты дрожжей) несут отрицательный заряд. Это препятствует связыванию с микробными клетками липофильных или гидрофильных анионных красителей, что суживает круг фотосенсибилизаторов с потенциальной антимикробной активностью. Как показано в настоящей работе, широким спектром антимикробного действия и наибольшей эффективностью обладают те фотосенсибилизаторы, молекулы которых несут положительно заряженные группы. Наиболее вероятным механизмом, обеспечивающим связывание катионных фотосенсибилизаторов микробными клетками, является электростатическое взаимодействие положительно заряженных заместителей в молекулах фотосенсибилизатора с отрицательно заряженными центрами связывания на клеточных стенках.

Работы по изучению фотосенсибилизирующего потенциала синтетических красителей на клетках различного происхождения, как правило, связаны с решением практических задач. Однако, и в данной области, учитывая разнообразие синтезируемых соединений, исследования фундаментальных механизмов взаимодействия красителей с клетками и клеточной гибели в значительной мере способствуют целенаправленному выявлению эффективных препаратов. Таким образом, исследования сложных и многогранных фотосенсибилизированных процессов в биологических объектах представляют собой пример тесного переплетения фундаментальных и прикладных аспектов.

Автор выражает благодарность Правительству г. Москвы, Российскому фонду фундаментальных исследований и Фонду содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере за финансовую поддержку настоящей работы.

Автор выражает глубокую благодарность А.П. Зарубиной и Т.С. Калебиной (Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова), В.Г. Жуховицкому (ГКБ им. Боткина), М.В. Будзинской (ГУ НИИ глазных болезней РАМН), М.М. Зубаирову (ВНИИ ВВиМ), а также сотрудникам ФГУП ГНЦ «НИОПИК» и ГУП «МНКЦ «Интермедбиофизхим» за плодотворное сотрудничество и помощь в проведении экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены эндогенные порфириновые фотосенсибилизаторы, опосредующие деструктивное действие видимого света на дрожжевые грибы. Протопорфирин IX опосредует морфологические нарушения в митохондриях и фотоингибирование потребления кислорода клетками, а также, наряду с производным протопорфирина, фотоиндуцированное увеличение микровязкости плазматических мембран.

2. Для повышения фоточувствительносги дрожжей разработан способ индуцированного биосинтеза эндогенного протопорфирина IX. У клеток дрожжей с индуцированной «протопорфирией» имеет место множественный характер повреждений в результате частичного перераспределения протопорфирина IX из центров первичной локализации - митохондрий, в другие субклеточные структуры. Увеличение содержания протопорфирина IX в плазматических мембранах приводит к интенсификации перекисного фотоокисления липидов и проявлению функциональных нарушений (потеря барьеров проницаемости).

3. Выявлена высокая фотофунгицидная активность хлоринов (препараты на основе хлорина еб, хлорин рб, З-формил-З-девинилхлорин рб) и поликатионных замещенных металлофталоцианинов (октакатионные фталоцианин цинка и алюминия). Эффективность этих типов фотосенсибилизаторов в фотодинамической инактивации дрожжевых грибов показана на эталонном штамме и клинических изолятов Candida albicans, а также, для октакатионного фталоцианина цинка - на разработанной животной модели кератомикоза кроликов, что расширяет спектр фотосенсибилизаторов, перспективных для фотодинамической инактивации грибковых заражений.

4. Разработан экспресс метод определения фотобактерицидной активности красителей на основе бактериальной биолюминесцентной тест-системы с генно-инженерным штаммом E.coli рХеп7. Способ основан на пропорциональном уменьшении интенсивности биолюминесценции и количества колониеобразующих единиц при фотосенсибилизирующих воздействиях.

5. Для проявления фотобактерицидной активности поликатионных замещенных металлофталоцианинов принципиальное значение имеет наличие положительно заряженных заместителей в молекулах. Эффективность фотосенсибилизации возрастает при увеличении количества положительно заряженных заместителей от четырех до восьми.

6. Фотодинамическая инактивация грамотрицательных бактерий поликатионными замещенными фталоцианинами опосредована связанными с клетками молекулами красителей. На примере представителей группы энтеробактерий (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens и Proteus mirabilis) показана видовая специфичность связывания клетками октакатионного красителя (октакис-(холинил)фталоцианина цинка) и чувствительности бактерий к фотодинамической инактивации.

7. Отобранный с помощью бактериальной биолюминесцентной тест-системы поликатионный фотосенсибилизатор октакис(холинил)-фталоцианин цинка проявляет высокую эффективность в фотодинамической инактивации типовых и клинических антибиотико-устойчивых штаммов грамотрицательных бактерий. Октакис(холинил)-фталоцианин цинка имеет широкий спектр антимикробной активности, включая грамположительные и грамотрицательные бактерии (около 20 видов), дрожжевые грибы и вирус «птичьего гриппа» H5N1.

ПРИЛОЖЕНИЕ

В работе использовали реактивы фирмы Sigma (Сент-Луис, США), а также фотосенсибилизаторы на основе хлорина е6 и его глюкозаминовой соли (фотодитазина) ЗАО "Вета" (Москва); хлорина р6, З-формил-З-девинилхлорин р6, гидразид циклоимид бактериохлорина, синтезированные в МИТХТ им. М. В. Ломоносова; фенотиазины, акридины и фталоцианины, синтезированные в ФГУП ГНЦ «НИОПИК».

ZiiPc8" R = S03Na, n-3. М = Л10Н. -Л1Рс>";

, М = Л1С1. - AlPcPvm'*;

OCI м-Zn, -ZnPcPym4';

n"ch2"> М Л1С1. - AlPcPvm8*;

M-Zn, - ZnPcP\ms":

CH, CI"

R = HOCH2CH,-N-CH2- , n - 8. M = Z.I1, - ZnPcChols+ CH3

Структуры и обозначения фталоцианинов приведены по [Страховская с соавт., 2009].

Объект и методы исследования. Объектами исследования служили: эталонные штаммы грамположительных бактерий Staphylococcus aureus АТСС 25923 и Streptococcus pyogenes 151 БГСА, а также грамотрицательных бактерий Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Campylobacter jejuni NCTC 11635, Helicobacter pylori NCTC 11639, Salmonella enteritidis 1742; клинические изоляты 20 видов бактерий (выделены В.Г.Жуховицким в ГКБ им. С.П.Боткина), среди которых имелись возбудители инфекций кожи и слизистых и раневых инфекций (S. aureus, S. pyogenes, Е. coli, P. aeruginosa); виды, вызывающие поражения слизистых желудочно-кишечного тракта (С. jejuni, Н. pylori, S. enteritidis, Е. coli, Serratia marcescens, Proteus mirabilis) и др. патогены. Для культивирования бактерий применяли соответствующие среды: Columbia Agar с добавлением 5% (об/об) или 10% (об/об) бараньей крови, Columbia Agar с добавлением 7% (об/об) лизированной лошадиной крови и Trypcase Soya Agar ("bioMerieux", Франция). Бактерии выращивали в течение суток в термостате при 37°С. Микроаэрофильные штаммы С. jejuni и Н. pylori выращивали в анаэростатах в среде с 5% кислорода в течение 4-х суток при 37°С. Материал агаровых культур суспендировали в растворе для инфузий, содержащем 0,9% хлорида натрия, до показателя мутности 1,0 McF с

использованием денситометра "Densimat" ("bioMerieux", Франция). Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в контрольных и опытных образцах определяли стандартным способом множественных разведений;

штаммы дрожжей Saccharomyces (S. cerevisiae XII, rad+/rad+, rad 3-1, rad 50-1, любезно предоставлены И. П. Арман, Институт молекулярной генетики РАН), Candida (С. utilis, С. guilliermondii, С. maltosa, С. rugosa, С. tropicalis, получены во ВНИИсинтезбелок, Москва; С. albicans АТСС 24433, а также 8 штаммов С. albicans, свежевыделенных из клинического материала В.Г.Жуховицким в ГКБ им. С.П.Боткина). Культуры дрожжей S. cerevisiae и Candida sps. выращивали по стандартной схеме в течение суток на скошенном сусло-агаре (30°С) и 8 ч в качалочных колбах на жидкой питательной среде при 32°. Выделение культур С. albicans из клинического материала осуществлялось на агаре Sabouraud ("bioMeriux", Франция) при 28°С в течение 72 ч. Культуры дрожжей Cr. albidus выращивали на скошенном сусло-агаре в термостате при 25°С в течение 5 суток. Выживаемость дрожжей определяли методами микро- и макро-колоний. Фоточувствительность клеток (I/D37) рассчитывали как величину, обратную дозе света (D37 в Дж/см2), необходимой для достижения 37% уровня выживаемости. Динамику размножения снимали путем прямого подсчета количества клеток в камере Горяева под микроскопом.

В качестве биосенсора использовали генно-инженерный штамм грамотрицательньтх бактерий Е. coli TGI (рХеп7) тест-системы «Эколюм», биолюминесценция которого обусловлена клонированным полным lux-опероном из светящихся почвенных энтомопатогенных бактерий Photorhabdus luminescens ZM1 [Манухов с соавт., 1999]. Измерения интенсивности биолюминесценции проводили с использованием люминометра Биотокс-б (Москва).

Источниками излучения служили бактерицидная лампа БУВ-30 (254 нм, 2 Вт/м2); ртутная лампа высокого давления ДРШ-1000 с комбинациями светофильтров УФС-2+ЖС-3 (средневолновый УФ: 290-320 нм 0,5 мВт/см2), БС-5+УФС-6 (длинноволновой УФ: 320-400 нм 1,5 мВт/см2), ЖС-10+СЗС-21 (видимый свет: 400600 нм 6,0 мВт/см2); БС-8 (>290 нм 8,5 мВт/см2); источник холодного белого света ЭКОМП (50 мВт/см2); специально сконструированные для возбуждения отдельных фотосенсибилизаторов светодиодные источники красного света и светодиодные матрицы с максимумами испускания 630, 684 и 690 нм и интенсивностью излучения на уровне образца 15-20 мВт/см2.

Для исследования клеток дрожжей с помощью трансмиссионной электронной микроскопии использовали метод, описанный в [Rainina et al., 1979] с некоторыми модификациями. Клетки префиксировали 5% глутаровым альдегидом в присутствии 5% диметилсульфоксида с последующей фиксацией 1% OsO . Далее клетки

обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-4800 (Швеция), контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [Reynolds, 1963] в течение 40 мин и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011 при инструментальном увеличении 8000-50000х и ускоряющем напряжении 80 кВ. Исследования проводили совместно с Т.С.Калебиной (кафедра молекулярной биологии биологического факультета МГУ).

При изучении фотоиндуцированных изменений функциональной активности митохондрий измеряли потребление кислорода клетками, используя полярограф EZ-7 (Чехословакия) с платиновым электродом и термостатируемой ячейкой, а также определяли изменение проницаемости плазматических мембран дрожжевых клеток микрофлуориметрическим методом с использованием флуорохрома примулина [Meissel et al., 1961] и микровязкости с помощью флуоресцентного зонда пирена [Владимиров и Добрецов, 1980].

Митохондрии из клеток S. cerevisiae были выделены совместно с O.A. Колесниковой на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ согласно методике [Mattoon and Balcavage, 1967]. Плазматические мембраны выделяли по модифицированному методу [Bussey et al., 1979] с использованием 1% лиофилизированного улиточного фермента, полученного из желудочного сока виноградных улиток Helix pomatia, что позволяло достичь практически 100%-го выхода сферопластов дрожжей.

Спекгрофлуориметрический анализ эндогенных порфиринов и регистрацию их фотоиндуцированного выцветания проводили с использованием густых суспензий дрожжевых клеток в треугольной кварцевой кювете. Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции снимали на спектрофлуориметре Hitachi-850.

Экстракцию эндогенных порфиринов проводили согласно методике, описанной в работе Кокс и Чарльз [Сох and Charles, 1973]. К навеске плазматических мембран, митохондрий или отмытых целых клеток добавлялась смесь этилацетат-ледяная уксусная кислота (3:1 по объему) из расчета 10 мл смеси на 1 г навески. Экстракцию проводили на мешалке при 4°С в течение 5 ч. После центрифугирования (15 мин, 650 g) этилацетатный слой отделяли в делительной воронке, промывали дважды дистиллированной водой для удаления уксусной кислоты и встряхивали с равным объемом 3 M HCl. После разделения смеси на два слоя нижний слой HCl отделяли. Оставшийся этилацетатный слой еще раз экстрагировали равным объемом 3 M HCl. Эта процедура позволяет перевести порфирины из этилацетата в соляную кислоту и провести их дальнейший спектрофлуориметрический анализ согласно [Sandberg and Romslo, 1981]. Далее кислотную фракцию экстрагировали 2,5 мл диэтилового эфира. В результате порфирины переходят в эфирную фракцию. Диэтилэфирную фракцию промывали дважды ледяной дистиллированной водой и экстрагировали 0,3 M и 1,2М

HCl, что переводит в эти фракции копро- и протопорфирин, соответственно. Хлороформные экстракты эндогенного протопорфирина IX получали встряхиванием клеток (100 мг), плазматических мембран (10 мг белка) или митохондрий (15 мг белка) с 9 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) при 4° в течение 30 мин в делительной воронке с последующим отделением нижней хлороформной фракции. Концентрацию протопорфирина IX в экстрактах определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония). Калибровочную кривую строили с использованием стандартных растворов протопорфирина IX в хлороформе, коэффициент молярной экстинкции составлял с405 = 189 мМ '-см"1. Полученные значения концентрации протопорфирина IX пересчитывали на количество и объем клеток. Объем клеток рассчитывали по их геометрическим размерам (средние значения 8,5x6x6 мкм). Количество клеток, из которых проводили экстракцию, подсчитывали в камере Горяева после ресуспендирования соответствующей аликвоты биомассы.

Идентификацию протопорбирина IX в экстрактах проводили методом тонкослойной хроматографии путем сравнения его хроматографической подвижности с таковой для свидетеля после разделения в системе бензол/этилацетат/этанол (8:2:2 по объему) на пластинах Silufol UV-254, «Kavalier», Чехословакия. После элюирования с мест локализации этилацетатом проводили спектрофлуориметрический анализ.

Количество красителей, связавшихся в процессе инкубации с бактериальными клетками, рассчитывали спектрофотометрически по разнице поглощения фильтратов растворов красителей в 0,9% NaCl без или с бактериями (фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, "Sarstedt", Австрия).

Связывание красителей с клетками бактерий изучали с помощью прибора для флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС) [Pashkovskaya et al., 2008] совместно с Ю.Н.Антоненко. Флуоресценция регистрировалась от конфокального объема, расположенного в 50 мкм над тонким стеклом, на которое наносилось 60 мкл суспензии клеток.

Для количественной оценки среднего числа флуоресцирующих частиц использовали значение величины G(x) в пределе малых т [Magde et ai., 1974]:

0(г->0)'где

N - среднее число флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме;

G(t) - автокорреляционная функция: (5F(t).ÖF(t + T))

<яо>2 '

где {Fit)) - средняя интенсивность флуоресценции, a SF(t) = F(t)-{F(t)) -отклонение от среднего значения.

Продукты перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ) определяли калориметрическим методом [Girotti and Deziel, 1983], измеряя поглощение комплекса одного из продуктов ПФОЛ малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой.

Содержание белка определяли по микрометоду Лоури (процедура №690, инструментарий и реактивы "Sigma", США).

Фотодинамическую инактивацию факторов вирулентности S. aureus наблюдали с использованием специально модифицированного для этой цели латекс-теста PASTOREX STAPH-PLUS (Bio-Rad). Тест основан на визуальном проявлении реакции агглютинации S. aureus на поверхности латексных частиц, сенсибилизированных к двум факторам вирулентности: фибриногеном к ClfB -клампинг фактору В (связанной коагулазе) и IgG - иммуноглобулином G к белку А.

Нативчость бактериальных эндотоксинов определяли с применением Лизат Амебоцитов Лимулюс теста (ЛАЛ-тест, Associates of Cape Cod Inc.).

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Иванова Э.В., Поспелов М.Е., Страховская М.Г., Фрайкин Г.Я. (1982) Конкурентное действие ультрафиолетовых лучей разной длины волны на выживаемость Saccharomyces cerevisiae. Микробиология. Т. 51. № 5. С. 761-764.

2. Страховская М.Г., Фрайкин Г.Я., Гончаренко E.H. (1982) Влияние экзогенного серотонина на выживаемость клеток Candida guilliermondii, облученных коротковолновым ультрафиолетовым свтом. Известия АН СССР. Сер. биол. № 5. С. 767-770.

3. Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Пиняскина Е.В. (1995) О локализации порфиринового соединения в плазматических мембранах дрожжей и его участие в фотосенсибилизации перекисного окисления липидов. Биохимия. Т. 60. Вып.7. С. 1155-1160.

4. Fraikin G.Ya., Strakhovskaya M.G., Rubin A.B. (1996) The role of membrane-bound porphyrin-type compound as endogenous sensitizer in photodynamic damage to yeast plasma membranes. J. Photochem. Photobiol. B:Biol. V. 34. P. 129-135.

5. Страховская, М.Г., Шумарина, А.О., Фрайкин, Г.Я., Рубин А.Б. (1998) Индуцированный 5-аминолевулиновой кислотой синтез протопорфирина IX в клетках дрожжей в присутствии 2,2'-дипиридила. Биохимия. Т.63. Вып. 6. С. 859863.

6. Страховская М.Г., Власова Е.В., Фрайкин Г.Я. (1998) Исследование флуоресценции изолированных плазматических мембран дрожжей в видимой области спектра. Биофизика. Т. 43. № 3. С. 447-452.

7. Страховская М.Г., Шумарина А.О, Иванова Э.В., Фрайкин Г.Я. (1998) Инактивация дрожжей Candida guilliermondii видимым светом при

индуцированном синтезе эндогенных порфиринов. Микробиология. Т. 67. № 3. С. 360-363.

8. Strakhovskaya M.G., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (1998) Yeast photosensitization due to the induced synthesis of endogenous porphyrins. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. V. 14. P. 205.

9. Страховская M.Г., Иванова Э.В., Колесникова O.A., Фрайкин Г.Я. (1999) Влияние 2,2'-дипиридила на накопление протопорфирина IX и его производных в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей. Биохимия. Т.64. Вып. 2. С. 262-266.

10. Strakhovskaya M.G., Shumarina A.O., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (1999) Endogenous porphyrin accumulation and photosensitization in the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of 2,2'- dipyridyl. J. Photochem. Photobiol. B:Biology. 1999. V. 49. P. 1822.

11. Страховская М.Г., Зарубина А.П., Румбаль Я.В., Данилов B.C., Странадко Е.Ф. Генно-инженерные светящиеся бактерии как новый инструмент для оценки антимикробной эффективности фотосенсибилизаторов. В: Лазерные и информационные технологии в медицине XXI века. ЛИТМ. С-П.:2001. С.267-268.

12. Страховская М.Г., Пархоменко И.М., Зарубина А.П., Румбаль Я.В., Данилов B.C., Странадко Е.Ф. (2002) Фотоиндуцированное подавление свечения генно-инженерного штамма бактерии Escherichia coli TGl(pXen7) в присутствии фотодитазина. Микробиология. Т. 71. № 3. С. 345-348.

13. Страховская М. Г., Беленикина Н. С., Иванова Э. В., Чемерис Ю. К., Странадко Е.Ф. (2002) Фотодинамическая инактивация дрожжей Candida guilliermondii в присутствии фотодитазина. Микробиология. Т. 71. № 3. с. 349-353.

14. Страховская М.Г., Жуховицкий В.Г., Миронов А.Ф., Серегин A.M., Странадко Е.Ф., Рубин А.Б. (2002) Фунгицидная активность хлориновых фотосенсибилизаторов. Доклады РАН. Т. 384. С. 155-158.

15. Страховская М.Г., Шумарина А.О., Фрайкин Г.Я., Рубин А.Б. (2002) Фотовыцветание флуоресценции эндогенного протопорфирина IX. Биофизика. Т. 47. № 5. С. 852-857.

16. Шумарина А.О., Страховская М.Г., Туровецкий В.Б., Фрайкин Г.Я. (2003) Фотодинамическое повреждение субклеточных структур дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина. Микробиология. Т.72. №4.С.488-492.

17. Страховская М.Г., Зарубина А.П., Жуховицкий В.Г., Миронов А.Ф., Рубин А.Б. Биолюминесцентные генно-инженерные бактерии как новый эффективный инструмент исследования активности фотосенсибилизаторов. Доклады РАН, 2004, Т. 396. №4. С. 177-180.

18. Степаненко И.Ю., Страховская M.Г., Беленикина Н.С., Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Ревина A.A., Эль-Регистан Г.И. (2004) Защита Saccharomyces cerevisiae алкилоксибензолами от окислительного и радиационного поражения. Микробиология. Т. 73. №2.С.204-210.

19. Макаров, Д.А., Кузнецова, H.A., Южакова, O.A., Савина, Л.П., Калия, О.Л., Лукьянец, Е.А., Негримовский, В.М., Страховская, М.Г. (2009) Поликатионные фталоцианины цинка и алюминия: синтез, влияние степени замещения на физико-химические свойства и фотодинамическую активность в водной среде. Журнал физической химии. Т. 83 № 6. С. 1183-1190.

20. Страховская М.Г., Антоненко Ю.Н., Пашковская A.A., Котова Е.А., Киреев В., Жуховицкий В.Г., Кузнецова H.A., Южакова O.A., Негримовский В.М., Рубин А.Б. (2009) Электростатическое связывание замещенных металло-фталоцианинов с клетками энтеробактерий: роль в фотодинамической инактивации. Биохимия. Т. 74. Вып. 12. С. 1603-1614.

Патенты РФ

21. Наседкин А.Н., Решетников A.B., Грачев C.B., Залевский И.Д., Зенгер В.Г., Кемов Ю.В., Селин В.Н., Абакумова О.Ю., Исаев В.М., Неугодова Н.П., Тюкин В.Ю., Решетников Е.В., Ашуров З.М., Гончаров С.Е., Страховская М.Г. (2004) Способ фотодинамического лечения острого и хронического гнойного гайморита. Патент РФ на изобретение № 2228775.

22. Страховская М.Г., Рубин А.Б., Миронов А.Ф., Серегин A.M., Синайский В.В. (2004) Способ инактивации патогенных грибов. Патент РФ на изобретение № 2230110.

23. Ворожцов Г.Н., Калия О.Л., Кузнецова H.A., Кузьмин С.Г., Кучеров А.Г., Лапченко A.C., Лужков Ю.М., Лукьянец Е.А., Негримовский В.М., Сливка Л.К., Страховская М.Г., Южакова O.A., Якубовская Р.И. (2006) Фотосенсибилизаторы для антимикробной фотодинамической терапии. Патент РФ на изобретение № 2282647.

24. Аветисов С. Э., Балаян М.Л., Будзинская М. В., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Лощенов В.Б., Мамиконян В. Р., Страховская М.Г., Федоров A.A., Шевчик С.А. (2009) Способ моделирования грибкового кератита у кроликов. Патент РФ на изобретение № 2346338.

25. Аветисов С. Э., Балаян М.Л., Будзинская М. В., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Лощенов В.Б., Лукьянец Е.А., Мамиконян В. Р., Негримовский В.М., Страховская М.Г., Федоров A.A., Шевчик С.А., Южакова O.A. (2009) Способ лечения инфекционных кератитов. Патент РФ на изобретение № 2352367.

26. Аветисов С. Э., Балаян М.Л., Будзинская М. В., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Лощенов В.Б., Мамиконян В. Р., Страховская М.Г., Федоров A.A., Шевчик С.А.

(2009) Способ флуоресцентной диагностики поражений роговицы. Патент РФ на изобретение № 2355285.

27. Ворожцов Г.Н., Зубаиров М.М., Калия O.JL, Кузнецова H.A., Кузьмин С.Г., Лужков Ю.М., Лукьянец Е.А., Негримовский В.М., Рубин А.Б., Селянинов Ю.О., Страховская М.Г., Южакова O.A. (2009) Способ фотоинактивации вируса гриппа А птиц подтипа H5N1. Патент РФ на изобретение № 2357770.

28. Лапченко A.C., Мальченко О.В., Кучеров А.Г., Лапченко A.A., Гуров A.B., Ворожцов Г.Н., Кузьмин С.Г., Лукьянец Е.А., Негримовский В.М., Страховская М.Г., Южакова O.A. (2009) Способ антимикробной фотодинамической терапии гнойных заболеваний гортани. Патент РФ на изобретение № 2361633.

29. Южакова O.A., H.A. Кузнецова, И.А. Сергеева, М.Г. Страховская, Т.З. Артемова, Е.К. Дипп, О.Л. Калия, В.М. Негримовский, И.В. Горбунова (2010) Гетерогенный сенсибилизатор и способ фотообеззараживания воды. Заявка на Патент РФ на изобретение № 2010144870 от 03.11.2010.

Тезисы международных и отечественных конференций

30. Strakhovskaya M.G., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (1997) Yeast cell photosensitivity depends on the type of 5-aminoIevuIinic acid-induced porphyrins. Materials of the 2nd European Biophysics Congress, EBSA 97, Orléans, France. In: Eur.Biophys. J. with Biophys. Letters. V.26. P.92.

31. Strakhovskaya M.G., Shumarina A.O., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (1998) Yeast cells photosensitization by 2,2'-dipyridil and ALA-induced protoporphyrin IX. Book of Abstracts. 8th International conference on spectroscopy and chemistry of porphyrins and their analogs. Minsk. P.71.

32. Страховская М.Г., Рубин А.Б. (1999) Механизмы фотодинамических процессов с участием эндогенных порфиринов. Тезисы докладов 2-го Съезда биофизиков России, Москва. Т. 3. С. 1078.

33. Шумарина А.О., Страховская М.Г., Фрайкин Г.Я. (1999) Спектрофлуориметрический анализ порфириновых фотосенсибилизаторов в клеточных структурах. Тезисы докладов 2-го Съезда биофизиков России, Москва. Т. 3. С.1087.

34. Strakhovskaya M.G., Shumarina А.О., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (1999) The enhanced yeast photosensitivity due to the induced synthesis of endogenous porphyrins. Book of abstracts 8th Congress of European society for photobiology, Granada, Spain. P. 121.

35. Strakhovskaya M.G., Shumarina A.O., Fraikin G.Ya., Rubin A.B. (2000) The in vivo fluorescence analysis of induced endogenous porphyrins in yeast. Materials of the 3rd European Biophysics Congress, EBSA 2000, Munich, Germany. In: Eur.Biophys.J. with Biophys.Letters. V. 29. P. 145.

36. Страховская M.Г., Жуховицкий В.Г., Миронов А.Ф., Странадко Е.Ф., Рубин А.Б. (2002) Фунгицидная активность эндогенных и экзогенных фотосенсибилизаторов

порфириновой природы. В сб.: «Современная микология в России. 1-ый съезд микологов России. Тезисы докладов». Москва. С. 243-244.

37. Strakhovskaya M.G., Zarubina А.Р., Danilov V.S., Zhukhovitsky V.G., Rubin A.B. (2003) Determination of antimicrobial activity of photosensitizers using genetically engineered luminescent bacteria. Book of abstracts 10th Congress of European society for photobiology, Vienna, Austria. P.80.

38. Strakhovskaya M.G., Shumarina A.O., Zhukhovitsky V.G., Fraikin G.Y., Rubin A.B. (2003) Photosensitization of yeast Candida and Saccharomyces with chlorines. Book of abstracts 10th Congress of European society for photobiology, Vienna, Austria. P. 106.

39. Страховская M.Г., Жуховицкий В.Г., Рубин А.Б. (2003) Антимикробная фотодинамическая терапия: основы и возможные области применения. В сб.: «Успехи медицинской микологии. Материалы первого Всероссийского конгресса по медицинской микологии». Москва, Национальная Академия микологии. Т. 1. С. 113-114.

40. Лапченко А.С., Кучеров А.Г., Страховская М.Г. (2004) Опыт фотодинамической терапии тяжелых гнойных осложнений воспалительных заболеваний ЛОР-органов. Материалы Российской конференции оториноларингологов. В: Вестник оториноларингологии (приложение). №5. С. 7-9.

41. Страховская М.Г., Шумарина А.О., Негримовский В.М., Кузьмин С.Г. (2006) Фотофунгицидная активность катионных фталоцианинов. В сб.: «Успехи медицинской микологии. Материалы четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии». Москва, Национальная Академия микологии. Т.7. С. 153-154.

42. Мамиконян В.Р., Балаян М.Л., Будзинская М.В., Кузьмин С.Г., Негримовский В.М., Сахарова Н.А., Страховская М.Г. (2007) Эффективность фотодинамической терапии кератомикоза в эксперименте. В сб.: «Успехи медицинской микологии. Материалы пятого Всероссийского конгресса по медицинской микологии». Москва, Национальная Академия микологии. Т. 10. С. 127-128.

43. Mamikonyan V., Balayan M. , Budzinskaya M. , Fedorov F. , Strakhovskaya M., Shevchik S., Loschenov V., Kuzmin S., Vorozhtsov G. (2007) Photodynamic Therapy with Cationic Photosensitiser in A Rabbit Model of Keratomycosis. Abstracts of 11 th World Congress of the International Photodynamic Association (IPA), Shanghai. P. 180.

44. Kuznetsova N.A., Shumarina A.O., Strakhovskaya M.G., Yuzhakova O.A., Lukyanets E.A., Kaliya O.L., Vorozhtsov G.N. (2007) Factors Influencing Antimicrobial Photodynamic Effect in Aqueous Media. Abstracts of 11th World Congress of the International Photodynamic Association (IPA), Shanghai. P. 201.

45. Negrimovsky V., V. Mamikonyan, M. Balayan, M. Budzinskaya, F. Fedorov, M. Strakhovskaya, S. Shevchik, V. Loschenov, S. Kuzmin, G. Vorozhtsov (2007)

Antibacterial effect of PDT using the cationic photosensitiser. Book of abstracts 12th Congress of European society for photobiology, Bath, England. P. 149.

46. Pashkovskaya A., Kotova E., Strakhovskaya M., Kireev V., Kuznetsova N., Yuzhakova O., Antonenko Y. (2008) Impact of electrostatic interactions with membranes on photodynamic activity of cationic phthalocyanines. Book of abstracts Fifth International Conference on Porphyrins and Phthalocyaines, ICPP-5, Moscow, Russia. P. 508.

47. Шумарина А., Беленикина H., Страховская M., Фрайкин Г. (2008) Фотодинамическая инактивация дрожжевых клеток с участием эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов. Тезисы докладов V Съезда Российского фотобиологического общества, Пущино. С. 178.

48. Kuznetsova N., Kaliya О., Strakhovskaya М., Zubairov М. (2009) Photodynamic inactivation of avian influenza virus in aqueous nedia. Materials of "First Int. Workshop on Application of Redox Technologies in the Environment". Istambul, Turkiye. P. 145147.

49. Kotova E.A., Y.N. Antonenko, A.A.Pashkovskaya, M.G. Strakhovskaya, N.A. Kuznetsova, O.A. Yuzhakova (2009) Interaction of cationic phthalocyanines with E. coli lipopolysaccharides. Book of abstracts 13th Congress of the European Society for Photobiology and the 2nd Conference of the European platform for photodynamic medicine, ESP2009, Wroclaw, Poland. P. 142.

50. Shumarina A., Strakhovskaya M., Fraikin G. (2009) Two fractions of endogenous photosensitizer protoporphyrin IX in Saccharomyces cerevisiae cells as revealed by its fluorescence photobleaching studies. Book of abstracts 15th International Congress on Photobiology, ICP 2009, Dusseldorf, Germany. P.208.

51. Strakhovskaya M.G., Plieva Z.S., Zhukhovitsky V.G. (2010) In vitro susceptibility of H. pylori to cationic photosensitisers. Book of abstracts XXIIIrd International Workshop on Helicobacter and related bacteria in chronic digestive inflammation and gastric cancer, Rotterdam, The Netherlands. P. 332.

Формат 60x90/16. Заказ 974. Тираж 150 экз. Подписано в печать 22.11.2010 г.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Страховская, Марина Глебовна

Введение

Обзор литературы

I. Фотодеструктивные сенсибилизированные процессы в биологических системах

1.1. Генерация активных форм кислорода в клетках

I. 2. Фотосенсибилизированная деструкция биомолекул

1.3. Репарация фотоокислительных повреждений ДНК

1.4. Фотосенсибилизированная деструкция белков с участием 1 АФК ! 1.5. Перекисное фотоокисление липидов 32 г

И. Процессы защиты клеток от фотоокислительных 1 1 повреждении ! III. Фотосенсибилизаторы с антимикробной активностью 41 !

IV. Фундаментальное различие в чувствительности грамположительных и грамотрицательных бактерий к фосенсибилизации

Результаты исследования и их обсуждение

Глава I. Роль эндогенных порфиринов в сенсибилизации дрожжей к видимому свету

1.1. Эндогенный протопорфирин IX

1.2. Эндогенные порфириновые производные

Глава И. Фотосенсибилизация дрожжей в условиях индуцированного накопления эндогенных порфиринов

II. 1. Влияние 5-аминолевулиновой кислоты на накопление эндогенных порфиринов в клетках дрожжей

II.2. Индуцированная хелатором 2,2'-дипиридилом «протопорфирия» в клетках дрожжей.

II.3. Фотодинамическое повреждение субклеточных структур дрожжей с индуцированным накоплением протопорфирина IX

II.4. Фотолабильность эндогенного протопорфирина IX

Глава IV. Антимикробная активность катионных тетрапиррольных фотосенсибилизаторов

IV. 1. Бактериальная биолюминесцентная тест-система для анализа фотобактерицидной активности красителей

IV.2. Исследование связывания красителей с бактериальными клетками-мишенями

IV.3. Факторы, влияющие на эффективность фотодинамической инактивации бактерий.

1V.4. Изучение взаимодействия фотодинамической инактивации и антибиотикотерапии

IV.5. Фотофунгицидная активность катионных фталоцианинов

Глава V. Фотосенсибилизаторы для антимикробной фотодинамической терапии и фотообеззараживания

V.l. Определение спектра антимикробного и противовирусного действия октакатионного фотосенсибилизатора октакис-(холинил)фталоцианина цинка У. 2. Гетерогенность бактерий в отношении чувствительности к фотодинамической инактивации и связывания | фотосенсибилизатора октакис-(холинил)фталоцианина цинка

У.З. Фотодинамическая инактивация вируса гриппа А птиц ' подтипа Н5Ы1 в водной среде

У.4. Изучение эффективности применения антимикробной ФДТ на животных моделях

У.5. Светодиодные источники излучения для проведения антимикробной ФДТ и фотообеззараживания 202 :

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотодинамическая инактивация микроорганизмов"

Одной из центральных проблем фотобиологии и биофизики является выявление фундаментальных основ чувствительности организмов к оптическому излучению различных диапазонов и интенсивности, в том числе к повреждающему действию света. В зависимости от спектрального состава свет может индуцировать протекание прямых и/или сенсибилизированных деструктивных процессов. Высокая биологическая активность УФС (200-290 нм) и УФВ (290-320 нм) определяется прямым поглощением квантов излучения этих диапазонов важнейшими клеточными компонентами, в первую очередь, нуклеиновыми кислотами.

Кванты УФА (320-380 нм) и видимого (380-750 нм) света этими биомолекулами непосредственно не поглощаются, и их повреждающее действие на живые организмы обусловлено протеканием сенсибилизированных процессов. В качестве фотосенсибилизаторов могут выступать как эндогенные природные клеточные метаболиты (НАД(Ф)Н, флавины, порфирины и др.), так и различные экзогенные красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, лекарственные препараты и др. Помимо индукции прямых окислительных процессов, приводящих к деструкции биомолекул и биоструктур, генерируемые фотосенсибилизаторами активные формы кислорода опосредуют сигнальные пути стрессовых воздействий на клеточную стенку, влияют на экспрессию генов, активируя защитные механизмы в ответ на окислительный стресс.

В норме, в отсутствие экзогенных фотосенсибилизаторов, эффективность повреждающего действия излучения УФА и видимого диапазона невелика. Однако имеется ряд нарушений метаболизма, приводящих к избыточному накоплению потенциальных эндогенных фотосенсибилизаторов, что сопровождается ростом фоточувствительности клеток. Характерным примером являются порфирии. Эта группа заболеваний человека связана с нарушениями биосинтеза гема и накоплением его непосредственного фотоактивного предшественника протопорфирина IX или других побочных продуктов порфириновой природы (уро- и копропорфиринов). Накопление порфиринов в кожном покрове, помимо непосредственного увеличения фоточувствительности, может служить толчком к развитию канцерогенеза.

Необходимо также учитывать то обстоятельство, что в природных условиях живые организмы подвергаются воздействию светом всего спектрального диапазона. При этом может происходить взаимоусиление прямых и фотосенсибилизированных деструктивных процессов (фотосинергизм) и возрастание роли сублетальных фотоповреждений.

Интерес к изучению фотосенсибилизированных процессов в значительной мере обусловлен их применением в медицинской практике. Деструктивные реакции с участием экзогенных или эндогенных фотосенсибилизаторов лежат в основе ряда терапевтических методов, таких как ПУФА-терапия и фотодинамическая терапия. В качестве фотосенсибилизаторов используются различные группы красителей: фурокумарины, фенотиазины, порфирины, хлорины, фталоцианины и др. В фотодинамических реакциях, относящихся к процессам II типа, первичным является взаимодействие возбужденных молекул фотосенсибилизаторов с кислородом. Наибольший вклад в этот тип фотоокислительных реакций вносит синглетный кислород ('02), который образуется в результате фотофизической активации путем переноса энергии с триплетного возбужденного состояния фотосенсибилизатора на молекулярный кислород. Фотодинамические реакции все шире применяются в медицинской практике: лежат в основе противоопухолевой фотодинамической терапии (ФДТ), фотодинамического обеззараживания препаратов крови от вирусных контаминаций. В последние годы все большее внимание привлекают исследования по фотодинамической инактивации бактерий и грибов, которые имеют выраженную практическую направленность. Это обусловлено ростом устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционной химиотерапии и необходимостью разработки альтернативных способов их инактивации.

В отличие от противоопухолевой ФДТ, основанной преимущественно на использовании тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (порфирины, хлорины, фталоцианины), в антимикробной ФДТ до недавнего времени основной упор делался на сравнительно низкомолекулярные красители - фенотиазины и акридины. Несмотря на то, что фенотиазины (метиленовый синий, толуидиновый синий) обладают широким спектром антимикробного действия, их применение в целях ФДТ имеет ряд недостатков. В первую очередь, это недостаточная активность в отношении бактерий и грибов и необходимость применения высоких (до 200 мкМ на моделях in vivo) токсичных для животных концентраций. Одно из основных преимуществ антимикробной ФДТ перед антибиотикотерапией заключается во множественном характере окислительной деструкции микробных клеток-мишеней, что затрудняет выработку устойчивости к последующим циклам фотодинамических воздействий. Однако в отношении фенотиазинов это преимущество может быть поставлено под сомнение, поскольку мутанты бактерий с повышенным уровнем экспрессии белков-помп, обусловливающих множественную лекарственную устойчивость, проявляют более высокую устойчивость к фотосенсибилизации фенотиазинами по сравнению с дикими штаммами. Применение акридинов может сдерживаться наличием у этой группы красителей мутагенных свойств. В этой связи несомненный интерес представляет изучение антимикробной активности других типов фотосенсибилизаторов, в том числе на основе тетрапиррольных структур. Эффективное применение красителей в медицинских целях невозможно без глубокого понимания механизмов фотосенсибилизации биологических объектов различного уровня организации. В этой области исследований существуют две основные группы проблем. Первая связана с изучением природы действующих фотосенсибилизаторов, механизмов их взаимодействия с клетками и субклеточными структурами; вторая - с исследованием фотоиндуцированных повреждений клеточных мишеней, приводящих к развитию сенсибилизированных поражений. Направленная доставка фотосенсибилизиторов к таким мишеням, например, к ядру раковой клетки, позволяет на порядки увеличить эффективность фотоинактивации.

Порфирины и родственные тетрапиррольные красители являются известными сенсибилизаторами живых организмов при действии видимого света. Эти соединения широко используются в фотодинамической терапии (ФДТ) рака, а в последние годы находят применение при лечении микробных поражений. Фототоксичность порфиринов основана на способности генерировать активные формы кислорода (главным образом, синглетный кислород), которые, реагируя с биологически важными макромолекулами, вызывают их фотоокисление и нарушение функциональных свойств. Такие процессы, включающие три компонента — свет, сенсибилизатор и кислород, относят к фотодинамическим. В длинной цепи событий от поглощения кванта света молекулой фотосенсибилизатора до проявления биологических последствий наиболее изучены первичные фотофизические и фотохимические стадии. Механизмы же клеточной гибели исследованы в меньшей степени, в основном, на животных объектах.

Явление фотодинамической инактивации микроорганизмов открыто более ста лет назад. Однако активное развитие исследования по фотосенсибилизации микроорганизмов получили лишь в 1980-е - 90-е годы. Работы в этой области приобрели выраженную практическую направленность, что обусловлено ростом устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционной химиотерапии и необходимостью разработки альтернативных способов их инактивации.

В фундаментальном аспекте одной из основных задач при изучении механизмов фотосенсибилизации бактерий является установление причин низкой чувствительности объектов, относящихся к грамотрицательным видам. Учитывая, что значительное число трудноизлечимых микробных инфекций ассоциировано именно с грамотрицательными бактериями (синегнойная палочка, кишечная палочка, хеликобактер, сальмонелла и др.), это в значительной степени сдерживает и практическое внедрение антимикробной ФДТ.

Общепринято, что важнейшей структурой, отвечающей за общую устойчивость грамотрицательных бактерий к различным внешним агентам (антибиотикам, детергентам, красителям), является наружная мембрана, входящая в состав клеточной стенки. В основе наружной мембраны лежит бислойная ассиметричная структура, внешний слой которой содержит большое количество (до 75%) отрицательно заряженных липополисахаридов.

Перспективным подходом к повышению чувствительности грамотрицательных бактерий является их дополнительная обработка с помощью заряженных поликатионных структур. Под воздействием поликатионов происходит высвобождение липополисахаридов, дезинтеграция наружной мембраны и увеличение ее проницаемости для красителей. Поликатион может быть также использован как наионоситель антибактериальных препаратов, повышающий избирательность их действия за счет электростатического взаимодействия с клеточной стенкой бактерий. Подобный подход лежит в основе сенсибилизации бактерий с помощью полимиксина, а также использования конъюгатов анионных красителей с полилизином для повышения их фотобактерицидной активности. В то же время и сами молекулы красителей могут выступать в качестве носителей положительно заряженных групп, повышающих эффективность их взаимодействия с бактериальной клеткой, и представляют значительный интерес в качестве фотосеисибилизаторов для антимикробной фотодинамической терапии. Однако практическое использование фотосенсибилизаторов в этом направлении требует разработки систем скрининга красителей, изучения закономерностей проявления активности красителей в зависимости от знака заряда и количества заряженных заместителей в молекулах, определения спектров антимикробного действия.

Механизмы фотодинамической инактивации дрожжевых грибов изучены недостаточно. Мало внимания уделялось исследованию фотоповреждений субклеточных структур, их вкладу в фото динамический летальный эффект. На тетрапиррольных соединениях работы проводились преимущественно с использованием порфиринов (гематопорфирина).

При отборе красителей для настоящей работы мы учитывали важнейшую роль, которую имеет целостность плазматической мембраны и клеточной стенки для жизнеспособности дрожжевой клетки. Особый интерес представляли фотосенсибилизаторы с потенциальной тропностью к данным клеточным структурам. В качестве таковых были отобраны красители хлориновой природы и замещенные катионные металлофталоцианины; Ряд производных хлоринов с одной; стороны являются водорастворимыми соединениями, а с другой - способны встраиваться в липидные структуры. Электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными группами аминокислотных остатков белков и; фосфоманнанов, компонентов клеточной стенки грибов, может иметь значение для проявления; фотофунгицидной активности катионных металлофталоцианинов.

На грибах деструктивное действие видимого света, опосредованное эндогенными порфиринами, изучалось крайне мало. В основном работы касались исследований фоточувствительности клеток и фотоингибирования митохондриального дыхания дрожжей Басскаготусез сегеУ1я1ае, мутантных по различным стадиям биосинтеза гема. Свет видимого диапазона способен оказывать летальное действие и на клетки диких штаммов дрожжей. Особенностью эффектов инактивации видимым светом является сильная кислородная зависимость, что свидетельствует о фотодинамическом характере наблюдаемых эффектов. Структура спектра действия фотоинактивации позволяет предположить, что процесс опосредуется эндогенными соединениями порфириновой природы. Однако, несмотря на возможное участие эндогенных порфиринов в летальных эффектах видимого света у дрожжей, способов, направленных на создание их повышенной внутриклеточной концентрации, аналогично действию АЛК у бактерий, не разработано.

Регуляция метаболизма порфириновых соединений может являться важнейшим фактором, определяющим устойчивость дрожжей к оптическому излучению видимого диапазона спектра. В этой связи большое значение для понимания связи клеточного метаболизма с фоточувствительностью имеет изучение механизмов фотодинамической инактивации дрожжей в естественных условиях и при индуцированном накоплении эндогенного протопорфирина IX.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи.

3. Изучить механизмы фотоинактивации клеток дрожжей в условиях накопления эндогенных порфиринов.

Научная новизна. Разработан способ индукции «протопорфирии» у дрожжей и повышения фоточувствительности клеток за счет увеличения внутриклеточного содержания фотоактивного предшественника гема -протопорфирина в результате нарушения биосинтеза гема при введении хелатора железа 2,2'-дипиридила.

Обнаружена фотофунгицидпая активность катионных фталоцианинов, проявляющаяся как на клеточных культурах, так и на животной модели (кератомикоз кроликов). Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлено нарушение структурной организации фотосенсибилизированных катионными фталоцианинами дрожжевых клеток, проявляющееся в потере ригидности клеточных стенок.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 12-м Международном конгрессе по фотобиологии, Вена (Австрия), 1996; 3-м Съезде по радиационным исследованиям, Пущино (Россия), 1997; Междунар. симпозиуме "Проблемы и направления фотобиохимии", Москва (Россия), 1997; 2-ой Междунар. биофизической конференции; Каир (Египет), 1998; 8-ой Междунар: конференции по спектроскопии и химии порфиринов и их аналогов, Минск (Беларусь), 1998; 2-м и 3-м Съездах биофизиков России, Москва (Россия), 1999 и Воронеж (Россия), 2004; 2-м и 3-м Европейских биофизических конгрессах: Орлеан (Франция), 1997 и Мюнхен (ФРГ), 2000; 1-м, 4-м и 5-м Всероссийских конгрессах по медицинской микологии, Москва (Россия), 2003, 2006, 2007; 11-м Всемирном конгрессе Международной фотодинамической ассоциации (1РА), Шанхай (Китай), 2007; Научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры», Москва (Россия), 2007; Научно-практической конференции «Лазерные технологии в оториноларингологологии», Тула (Россия), 2007; 6-ой Научно-практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии», Москва (Россия), 2008; 5-м. Съезде фотобиологов России, Пущино (России), 2008; 5-ой Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (1ССР-5), Москва (Россия), 2008; 1-ой Междунар. Рабочей Встрече «Применение редокстехнологий в окружающей среде», Стамбул (Турция), 2009; 5-м, 8-м, 10-м, 12-м и 13-м Конгрессах Европейского общества фотобиологов (ESP): Марбург (Германия), 1993, Гранада (Испания), 1999, Вена (Австрия), 2003; Бат (Англия), 2007; Вроцлав (Польша), 2009; 15-м Международном конгрессе по фотобиологии, Дюссельдорф (ФРГ), 2009; XXIII сессии Европейской группы по изучению Helicobacter, Роттердам (Нидерланды), 2010.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 51 печатная работа, в том числе 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 22 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций; получено 8 патентов Российской Федерации на изобретение, подана 1 заявка на патент РФ на изобретение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Оптическое излучение экологического диапазона является важнейшим фактором окружающей среды, постоянно оказывающим воздействие на организмы. Действие света многообразно и может быть как полезным, так и вредным. Полезное действие света осуществляется с помощью биологических молекул, способных улавливать кванты света и трансформировать его энергию в форму, доступную для клетки (например, хлорофилл в фотосинтезе, родопсин в зрительной рецепции, фитохром в фоторегуляторных процессах, фотореактивирующий фермент и др.). Вредное действие оптического излучения реализуется вследствие протекания деструктивных фотохимических реакций в различных компонентах клеток, в первую очередь, в нуклеиновых кислотах и мембранных структурах. К фотодеструктивным процессам, протекающим в биологических системах, относятся индуцируемые светом фотохимические реакции в различных субклеточных структурах, которые сопровождаются нарушением или, полной потерей их функциональных свойств, и, в конечном счете, обусловливают проявление повреждающих эффектов на клеточном и организменном уровнях [Рубин и Фрайкин, 1987].

Большинство природных хромофоров, имеющих полосы поглощения в видимом диапазоне спектра, в зависимости от их химической структуры можно отнести к трем большим группам [Hellinwerf et al., 1996]: тетрапирролы, циклические или линейные, полиены и ароматические соединения. Для представителей всех трех классов характерно наличие системы сопряженных двойных связей. Первичная фотохимическая реакция возбужденных молекул хромофоров может заключаться в фотоизомеризации (родопсин, фитохром) [Rayer et al., 1990], передаче электрона (флавины) [Sanear, 1994 а, Ь] или передаче энергии возбуждения (порфирины) [Moan, 1986].

Ключевыми параметрами, характеризующими действующий свет и определяющими эффективность и молекулярный механизм фотодеструктивных процессов, являются длина волны и интенсивность излучения. Солнечное оптическое излучение можно подразделить на несколько диапазонов: коротковолновый УФ (УФС), обычно не доходящий до поверхности Земли, средневолновый УФ (УФВ), длинноволновый УФ (УФА) и видимый свет.

Фоточувствительность биологических объектов сильно различается в зависимости от диапазона длин волн действующего света [Peak et al., 1984; Black et al., 1997]. Наиболее эффективно фотодеструктивные реакции индуцируются в клетках различного происхождения УФС-излучением [Swenson, 1976; Rothman and Setlow, 1979;.Zolzer and Kiefer, 1983] искусственных источников света. Среди экологических диапазонов оптического излучения солнца наибольшую активность в фотодеструкции проявляет УФВ, достигающий поверхности Земли после поглощения более коротковолновых компонент озоновым слоем атмосферы. На долю УФВ приходится около 5% суммарного УФ-излучения. Значение этого экологического фактора особенно возросло в последнее время в связи с частичным антропогенным разрушением озонового слоя [Kerr, 1993; Van der Leun, 1998]. По некоторым прогнозам повышенные значения интенсивности УФВ в биосфере сохранятся до 2065 г. [Madronich et al., 1998].

Кванты УФА (320-380 нм) и видимого (380-750 *нм) света важнейшими биомолекулами непосредственно не поглощаются, и их повреждающее действие на живые организмы обусловлено протеканием сенсибилизированных процессов. В качестве фотосенсибилизаторов могут выступать не только эндогенные природные клеточные метаболиты (НАДН, флавины, порфирины и др.) [Фрайкин, 1987; Kennedy and Pottier, 1992; Lu et al., 1999], но и различные красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, лекарственные препараты и др. Фотовозбужденные молекулы фототоксикантов могут вступать в ряд хорошо известных первичных реакций с биомолекулами и кислородом [Kochevar, 1987]. Биологические эффекты включают клеточную гибель, мутагенез и канцерогенез, аллергические реакции при повреждении ДНК, ферментов репарации и компонентов мембран. К фототоксикантам относятся многие лекарственные препараты, в частности, антибиотики -хлорамфеникол [de Vries et al., 1984] и флуорохинолоны [Reavy et al., 1997; Martinez et al., 1998], диуретики - фуросемид [Zanocco et al., 1998], антималярийные - хинин [Motten et al., 1999] и антивирусные -фенотиазин [Wagner et al., 1998] препараты, генерирующие в фотовозбужденном состоянии синглетный кислород; антидепрессанты -трициклические дибензоциклогептадиены [Epling et al., 1988], относящиеся к фотосенсибилизаторам I типа; контрацептивные стероиды [Beijersbergen van Henegouwen, 1991], противовоспалительные нестероидные препараты - индометацин, напроксен [Moore et al., 1998], претерпевающие фотодеградацию с образованием токсичных фотопродуктов и др. Побочные эффекты при применении этих соединений во многом связаны именно с их фототоксичностью. Аналогичная ситуация складывается и с косметическими средствами, которые нередко вызывают аллергические реакции и дерматиты, особенно при нанесении на открытые участки кожи [Beijersbergen van Henegouwen, 1991]. Следует отметить, что даже косметические средства с фотозащитными свойствами, оптические свойства которых тщательно исследованы, могут в ряде случаев становиться фототоксикантами [Allen et al., 1996;Gasparro et al., 1998].

I. Фотодеструктивные сенсибилизированные процессы в биологических системах При протекании деструктивных реакций, индуцируемых высокоэнергетическими УФС и УФВ-излучениями, имеет место прямая фотохимия, т.е. совпадение хромофора и мишени фотоинактивации в виде компонентов важнейших макромолекул, а наибольшее биологическое значение имеют фотоповреждения ДНК димерной природы. В отличие от УФС и УФВ-излучений, УФА индуцирует образование в ДНК повреждений, более характерных для ионизирующей радиации, - разрывы цепи ДНК и сшивок ДНК-белок. Частичное замещение УФВ на равноэквивалентную канцерогенную дозу УФА приводит к уменьшению образования тиминовых димеров, свидетельствующее о различных механизмах фототоксичности этих диапазонов [Berg et al., 1995], хотя и в том и другом случае мишеныо является генетический аппарат клетки. Это предполагает образование фотоповреждений ДНК при действии УФА не за счет прямого поглощения света, а путем фотосенсибилизации [Tyrrell, 1991]. Подтверждением этому служит и тот факт, что эффективность деструктивного действия УФА и видимого света существенно повышается при нарушениях клеточного метаболизма, сопровождающихся накоплением фотосенсибилизаторов [Kennedy et al., 1990], а также в присутствии1 экзогенных сенсибилизаторов и фотоактивных ксенобиотиков [Spikes, 1989; Beijersbergen van Ilenegouwen, 1991; Fernandez et al., 1997; Bosca and Miranda, 1998].

Несмотря на то, что УФА также индуцирует деструктивные реакции в ДНК, квантовый выход образования этих фотоповреждений очень мал и летальные эффекты имеют место только при высоких интенсивностях и дозах облучения. В спектрах действия соответствующих эффектов наблюдается резкий спад (на 4-6 порядков) при переходе от 290 к 330 нм и еще на порядок при дальнейшем увеличении длины волны [Фрайкин, 1987; Black et al., 1997]. Близкой к УФА малой фотодеструктивной активностью обладает и свет видимой области спектра. В то же время, квантовая эффективность УФА-индуцированного мутагенеза и инактивации заметно больше, чем можно было- бы ожидать исходя из спектра поглощения ДНК. Спектры действия фотоинактивации, фотоиндуцированного мутагенеза и канцерогенеза, совпадающие в УФС и УФВ-областях со спектрами поглощения ДНК и образования ЦПД, имеют плато при длинах волн более 340 нм [Peak et al., 1984; Enninga et al., 1986], где ДНК непосредственно не поглощает.

Фототоксичное действие УФА и видимого света связывают, в основном, с индукцией окислительного стресса [Tyrrell, 1991; Kielbassa et al., 1997]. Так, сильная зависимость от кислорода выхода основных фотопродуктов ДНК, образующихся при действии УФА, одноцепочечных разрывов, указывает на участие АФК в этом процессе [Peak et al., 1981; Peak and Peak, 1982].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Страховская, Марина Глебовна

ВЫВОДЫ

1. Выявлены эндогенные порфирнновые фотосенсибилизаторы, опосредующие деструктивное действие видимого света на дрожжевые грибы. Протопорфирин IX опосредует морфологические нарушения в митохондриях и фотоингибирование потребления кислорода клетками, а также, наряду с производным протопорфирина, фотоиндуцированное увеличение микровязкости плазматических мембран.

2. Для повышения фоточувствительности дрожжей разработан способ индуцированного биосинтеза эндогенного протопорфирина IX. У клеток дрожжей с индуцированной «протопорфирией» имеет место множественный характер повреждений в результате частичного перераспределения протопорфирина IX из центров первичной локализации - митохондрий в другие субклеточные структуры. Увеличение содержания протопорфирина IX в плазматических мембранах приводит к интенсификации перекисного фотоокисления липидов и проявлению функциональных нарушений (потеря барьеров проницаемости).

3. Выявлена высокая фотофунгицидная активность хлоринов (препараты на основе хлорина еб, хлорин рб, З-формил-З-девинилхлорин рб) и поликатионных замещенных металлофталоцианинов (октакатионные фталоцианин цинка и< алюминия). Эффективность этих типов фотосенсибилизаторов в фотодинамической инактивации дрожжевых грибов показана на эталонном штамме и клинических изолятов Candida albicans, а также, для октакатионного фталоцианина цинка, на разработанной животной модели кератомикоза кроликов, что расширяет спектр фотосенсибилизаторов, перспективных для фотодинамической инактивации грибковых заражений.

6. Фото динамическая инактивация грамотрицательных бактерий поликатионными замещенными ' фталоцианинами опосредована связанными с клетками молекулами красителей. На примере представителей группы энтеробактерий (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens и Proteus mirabilis) показана видовая специфичность связывания клетками октакатионного красителя (октакис-(холинил)фталоцианина цинка) и чувствительности бактерий к фотодинамической инактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В клетках различного происхождения функционируют многочисленные защитные системы, которые играют существенную роль в обеспечении устойчивости к повреждающему действию оптического излучения солнца. Хорошо известны антиоксидантные системы (глутатионпероксидаза, каталаза, супероксид- дисмутаза, а-токоферол, каротин и др.), которые тушат активные формы кислорода и возбужденные состояния макромолекул. Пигменты поверхностных слоев клеток, такие как флавоноиды и меланины, экранируют лежащие в глубине ткани от фотоповреждений. Ферменты темновой репарацииI и фотореактивации устраняют образовавшиеся фотоповреждения ДНК.

Для оценки биологической роли таких процессов необходимо детальное исследование факторов, вызывающих нарушение регуляции на различных стадиях цепи биосинтеза и приводящих к изменению внутриклеточной концентрации и локализации тех или иных порфиринов с различными физико-химическими свойствами и сенсибилизирующей активностью. К ним относятся различные факторы, в том числе генетические, которые ответственны за недостаточность отдельных ферментов в цепи биосинтеза порфиринов. Сюда относится и естественный или искусственно индуцированный хелаторами дефицит такого важнейшего фактора минерального питания как железо, избыток предшественника порфиринов 5'-аминолевулиновой кислоты. 2,2'-Дипиридил относится к хелаторам фенантролинового ряда, которые ранее использовались в качестве фотогербицидов [Rebeiz et al., 1990]. Наши данные свидетельствуют, что накопление эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов при действии хелаторов железа носит более общий характер и имеет место в клетках различного биологического происхождения, что необходимо учитывать при- практическом применении такого рода соединений. Аналогичная проблема поднята в последние годы группой J. Moan - [Juzeniene et al., 2007], обнаружившей увеличение содержания эндогенных порфиринов в клетках кожи- при местном применении ряда хелаторов железа, которые входят в состав косметических препаратов, используемых для предотвращения старения кожи.под действием солнечного УФ;

В то же время наличие1 и. глубокое понимание механизмов регуляции биосинтезам порфиринов-. позволяет, направленно- увеличивая фоточувствительность клеток, использовать фотосенсибилизированные ими процессы в целях инактивации нежелательных образований: Так, к настоящему времени получила развитие фото динамическая терапия рака, поверхностных бактериальных заражений' и ряда других заболеваний, основанная, на, индуцированном 5'-аминолевулиновой кислотой биосинтезе эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. Нами разработан новый метод фотодинамической инактивации дрожжей, в том числе Saccharomyces и Candida, в условиях повышенного содержания в клетках эндогенного протопорфирина IX, стимулированного 5'-аминолевулиновой кислотой и/или хелатором 2,2'-дипиридилом. Дрожжевые клетки с искусственно индуцированной «порфирией» представляют собой удобную модель, для исследования локализации и возможного перераспределения. порфиринов по субклеточным структурам, а также чувствительных к фотосенсибилизации клеточных мишеней. Тот факт, что митохондрии дрожжей являются мишенью деструктивного действия видимого света особенно ярко проявляется в условиях индуцированного накопления эндогенного протопорфирина IX.

Связывание фотосенсибилизаторов с микробными клетками-мишенями имеет определяющее значение при фотоинактивации, опосредованной экзогенными красителями. Особенностью строения микроорганизмов является наличие у них клеточной стенки, толщина которой составляет от 10-15 нм у грамотрицательных бактерий до 100-250 мкм у дрожжей, т.е. равна или превышает пробег синглетного кислорода в биологической среде. Компоненты клеточных стенок (липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, фосфоманнаны и полифосфаты дрожжей) несут отрицательный заряд. Это препятствует связыванию с микробными клетками липофильных или гидрофильных анионных красителей, что суживает круг фотосенсибилизаторов с потенциальной антимикробной активностью. Как показано в настоящей работе, широким спектром антимикробного действия и наибольшей эффективностью обладают те фотосенсибилизаторы, молекулы которых несут положительно заряженные группы. Наиболее вероятным механизмом, обеспечивающим связывание катионных фотосенсибилизаторов микробными клетками, является электростатическое взаимодействие положительно заряженных заместителей в молекулах фотосенсибилизатора с отрицательно заряженными центрами связывания на клеточных стенках.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Страховская, Марина Глебовна, Москва

1. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашев В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. (1993) Тирозол -ауторегуляторный фактор dl дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Микробиология, 62, 633-638.

2. Березин Б.Д., Ениколопян Н.С. 1988. Меташюпорфирины. М.: Наука, 145 с.

3. Бутов Ю.С., Мошнина З.И., Кягова A.A., Потапенко А.Я. (2007а) Лечение атопического дерматита методом ПУВА-терапии с аммифурином. Российский журнал кожных и венерических болезней, 3, 22-25.

4. Бутов Ю.С., Ахтямов С.Н., Демина О.М., Каримова Л.Н., Кузьмин С.Г., Лощенов В.Б. (20076) Фотодинамическая терапия угревой болезни. Российский журнал кожных и венерических болезней, 3, 64-68.

5. Быховский В.Я., Зайцева Н.И., Полулях О.В. (1985) Микробиологический синтез порфиринов. Обзорная информация. Серия У. Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов, ВНИИСЭНТИ, Москва.

6. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. (1980) Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М: Наука., 320 с.

7. Ганшин В.М., Данилов B.C. (1997) Клеточные'сенсоры на основе бактериальной биолюминесценции. Сенсорные системы, 11, 245-255.

8. Гесслер H.H., Аверьянов A.A. Белозерская Т.А. (2007) Активные формы кислорода в регуляции развития грибов. Биохимия, 72, 1342-1364.

9. Данилов B.C., Ганшин В.М. (1998) Бактериальные биосенсоры с биолюминесцентным выводом информации. Сенсорные системы, 12, 5668.

10. Дерябин Д.Г. (2009) Бактериальная биолюминесценция: ,фундаментальные и прикладные аспекты. М: Наука, 246 с.

11. Запрометов М.Н. (1987) Светорегуляция вторичного метаболизма растений. Физиология растений, 34, 698-711.

12. Зубова C.B., Иванов А.Ю., Прохоренко И.Р. (2008) Влияние состава кора липополисахаридов Escherichia coli К-12 на поверхностные свойства клеток. Микробиология, 77, 336-341.

13. Кабанов Д.С. и Прохоренко И.Р. (2010) Структурный анализ липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Биохимия, 75, 469-491.

14. Кнорре Д.А., Смирнова Е.А., Северин Ф.Ф. (2005) Естественные условия для запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия, 70, 323-326.

15. Корогодин В.И. (1966) Проблемы пострадиационного восстановления. М: Атомиздат, 391 с.

16. Красновский A.A., мл. (1988) Механизм образования и роль сингл етного кислорода в фотобиологических процессах. В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (ред. А.Б.Рубин). М: Наука, 23-41.

17. Красновский A.A., мл. (1990) Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. Итоги науки и техники. Современные проблемы лазерной физики. М.: ВИНИТИ, т. 3, 63-135.

18. Красновский A.A., мл. (1994) Синглетный молекулярный кислород: Механизмы образования и пути дезактивации в фотосинтетических системах. Биофизика, 39, 236-250.

19. Красновский A.A., мл. (1998) Флуоресцентный анализ синглетного молекулярного кислорода в фотобиохимических системах. Биол. мембраны, 15, 530-548.

20. Красновский A.A., мл. (2004) Фотодинамическое действие и синглетный кислород. Биофизика, 49, 305-321.

21. Красновский A.A., мл. (2007) Первичные механизмы фотоактивации молекулярного кислорода. История развития и современное состояние исследований. Биохимия, 72, 1311-1331.

22. Крицкий М.С., Чернышева Е.К. (1988) Некоторые проблемы рецепции коротковолнового видимого света. В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (ред. А .Б .Рубин). М: Наука, 198-212.

23. Майчук Ю.Ф. (1999) Язва роговицы. Окулист, № 4, 9-14.

24. Манухов И.В., Завильгельский Г.Б., Данилов B.C., Ерошников Г.Е., Зарубина А.П. (1999) Клонирование lux-AB генов термостабильной люциферазы Photorhabdus luminiscence zml в Escherichia coli К12. Биотехнология, 1,40-43.

25. Мошнин M.B. и Яковлев А.Б. (2007) Фунгицидный эффект фурокумаринов, активированных ультрафиолетовым излучением спектра А. Тезисы 2 Всероссийского конгресса дерматовенерологов. С-Пб.

26. Мулюкин A.JL, Дуста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. (1996) Образование покоящихся форм Dacillus cereus и Micrococcus luteus II. Микробиология, 65, 782—789.

27. Неверов К.В., Визе С., Хебер У. (1999) Фотоиндуцированное повреждение фотосинтетического аппарата> в листьях растений, обработанных 5-аминолевулиновой кислотой и 2,2'-дипиридилом. II Съезд биофизиков России, Москва, Тезисы докладов, т. III, с. 1058.

28. Нонхибел Д., Уолтон Дж. (1977) Химия свободных радикалов. Структура и механизм реакции. М.: Мир, 608 с.

29. Орлов СЛ., Гулак П.В., Карагодина З.В., Постнов Ю.В. (1981) Особенности структурного состояния мембраны эритроцитов крыс со спонтанной генетической гипертензией. Кардиология, 21, 108-112.

30. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Капрельянц A.C., Помазанов В.В. (1985) О химической природе ауторегуляторного фактора dl Pseudomonas carboxydoflava II. Микробиология, 54, 184-190.

31. Потапенко А. Я. и Кягова А. А. (1998) Применение антиоксидантов для исследования и оптимизации фотохимиотерапиию Биол. Мембраны, 15, 213-220.

32. Потапенко А.Я., Бутов Ю.С., Левинзон Е.С., Андина Е.С., Юрикова H.A., Неклюкова М.Б., Мамедов И.С., Лысенко Е.П., Бездетная* Л.Н., Кягова A.A. (1999) Фотоокислительные реакции псораленов и их роль в терапии дерматозов. Вестник РАМН,* 2, 32-38.

33. Потапенко А.Я., Малахов М.В., Кягова A.A. (2004) Фотобиофизика фурокумаринов. Биофизика, 49, 322-338.

34. Потапенко А.Я., Беличенко И.В., Мамедов М.С., Журавель H.H., Кягова A.A., Г.М.Дж. Бейерсберген ван Хенегоувен, Х.Де Вриз (2007) Фотогемолиз, сенсибилизированный псораленом: зависимость от pH. Биофизика, 52, 510-514.

35. Рогинский В.А. (1988) Фенольные антиоксиданты: реакционная активность и эффективность. М.: Наука, 247 с.

36. Рубин А.Б., Фрайкин Г.Я. (1987) Первичные молекулярные механизмы фотобиологических процессов и деструктивное действие оптического излучения. Успехи совр. биол., 103, 323-339.

37. Скулачев В.П. (2009) Новые сведения о биохимическом механизме запрограммированного старения организма и антиоксидантной защите митохондрий. Биохимия, 74, 1718-1721.

38. Странадко Е.Ф. и Иванов А.В. (2004) Современное состояние проблемы фотодинамической терапии рака и неопухолевых заболеваний. Биофизика, 49, 380-383.

39. Странадко Е.Ф., Корабоев У.М., Толстых М.П. (2000) Фотодинамическая терапия при гнойных заболеваниях мягких тканей. Хирургия, 9, 67-70.

40. Фомичев А.Ю., Зорин В.П., Зорина Т.Е., Черенкевич С.Н. (1991) Фотоповреждение грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток в присутствии производных хлорина е6. Микробиология, 60, 507-511.

41. Фрайкин Г.Я., Поспелов М.Е., Бурчуладзе Т.Г., Рубин Л.Б. (1987) Изучение механизма летального действия видимого света на клетки дрожжей Candida guilliermondii. Изв. АН СССР, Сер. биол., 5, 783-786.

42. Фрайкин Г.Я. (1987) Некоторые проблемы современной ультрафиолетовой фотобиологии. Физиология растений, 34, 712-719.

43. Фрайкин Г.Я. (1988) Механизмы УФ-индуцированных деструктивных" и фотомодифицирующих реакций у микроорганизмов. В кн.: Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения (ред. А.Б.Рубин). М: Наука, 154-165.

44. Чиссов В.И., Скобелкин O.K., Миронов А.Ф. (1994) Фотодинамическая терапия и флюоресцентная диагностика злокачественных опухолей препаратом фотогем. Хирургия, 12, 3-6.

45. Abe Н., Ikebuchi К., Wagner S.J. et al. (1997) Potential involvement of both Type I and Type II mechanisms in M13 virus inactivation by methylene blue photosensitization. Photochem. Photobiol., 66, 204-208.

46. Abeck D. and Mempel M. (1998) Staphylococcus aureus colonization in atopic dermatitis and its therapeutic implications. Br. J. Dermatol., 139 Suppl. 53, 13-16.

47. Agon V.V., Bubb W.A., Wright A., Hawkins C.L., Davies MJ. (2006) Sensitizer-mediated photooxidation of histidine residues: evidence for the formation of reactive side-chain peroxides. Free Radic Biol Med., 40, 698-710.

48. Ahmad N., Kalka K., Mukhtar H. (2001) In vitro and in vivo inhibition of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase pathway by photodynamic therapy. Oncogene, 20, 2314-2317.

49. Albro P.W., Corbett J.T., Schroeder, J.L. (1994) Doubly ally lie hydroperoxide formed in the reaction between sterol 5,7-dienes and singlet oxygen. Photochem. Photobiol., 60, 310-315.

50. Allen J.M., Gossett C.J., Allen S.K. (1996) Photochemical formation of singlet molecular oxygen (!02) in illuminated aqueous solutions of p-aminobenzoic acid (PABA). J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 32, 33-38.

51. Amstad P., Peskin A., Shah G. et al. (1991) The balance between Cu,Zn-superoxide dismutase and catalase affects the sensitivity of mouse epidermal cells to oxidative stress. Biochemistry, 30, 9305-9313.

52. Anderson L.E. (1986) Light/dark modulation of enzyme activity in plants. Adv. Bot. Res., 12, 1-46.

53. Andrew T.L., Riley P.G., Dailey H.A. (1990) Regulation of heme biosynthesis in higher animals. In: Biosynthesis of heme and chlorophylls (H.A. Dailey, ed.). McGrow-Hill Publishing Co., N.-Y., 163-200.

54. Araujo L.S., Lombardo M.E., Batlle A.M. (1994) Inhibition of porphobilinogenase by porphyrins in Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Biochem., 26, 1377-1381.

55. Araujo L.S., Lombardo M.E., Del C., Batlle A.M. (1998) Regulatory role of ALAS and ALA-D in a haem-deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae. Cell Mol. Biol., 44, 591-595.

56. Ashkenazi H., Malik Z., Harth Y., Nitzan Y. (2003) Eradication of Propionibacterium acnes by its endogenous porphyrins after illumination with high intensity blue light. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 35, 17-24.

57. Averbeck D. (1989) Recent advances in psoralen phototoxicity mechanism. Photochem. Photobiol., 50, 859-882.

58. Babilas P., Landthaler M., Szeimies R.-M. (2006) Photodynamic therapy in dermatology. Eur. J. Dermatol., 16, 340-348

59. Bagdonas S., Ma L.W., Iani V., Rotomskis R., Juzenas P., Moan J. (2000) Phototransformations of 5-aminolevuIinic acid-induced protoporphyrin IX in vitro: a spectroscopic study. Photochem Photobiol., 72, 186-192.

60. Bailis A. M., Maines S., Negritto M.T. The essential helicase gene rad3 supresses short-sequence recombination in Saccharomyces cerevisiae. (1995) Mol. Cell Biol., 15, 3998-4008.

61. Baker A., Kanofsky J.R. (1992) Quenching of singlet oxygen by biomolecules from L1210 cells. Photochem Photobiol., 55, 523-528.

62. Ball D.J., Mayhew S., Wood S.R., Griffiths J., Vernon D.I., Brown S.B. (1999) A comparative study of the cellular uptake and photodynamic efficacy of three novel zinc phthalocyanines of differing charge. Photochem Photobiol., 69, 390-396.

63. Bassel J., Hambright P., Mortimer R., Bearden A J. (1975) Mutant of the Yeast Saccharomycopsis lipolytica that, accumulates and excretes protoporphyrin IX. J. Bacteriology, 123, 118-122

64. Bech O., Phillips D., Moan J. and MacRobert A.J. (1997) A hydroxypyridinone (CP94) enhances protoporphyrin IX formation in 5-aminolaevulinic acid treated cells. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 41, 136144.

65. Beijersbergen van Henegouwen G.M.J. (1991) (Systemic) phototoxicity of drugs and other xenobiotics. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 10, 183-210.

66. Bejarano E.R., Avalos J., Lipson E.D., Cerda-Olmedo E. (1988) Photoinduced accumulation of carotene in Phycomyces. Planta, 183, 1-9.

67. Ben Amor T., Bortolotto L., Jori G. (1998, b) Porphyrins and related compounds as photoactivatable insecticides. II. Phototoxic activity of meso-substituted porphyrins. Photochem. Photobiol., 68, 314-318.

68. Ben-Hur E. and Horowitz B. (1995) Advances in photochemical approaches for blood sterilization. Photochem. Photobiol., 62, 383-388.

69. Ben-Hur E. Hoeben R.C., Van Ormondt H., Dubbelman T.M., Van Steveninck J. (1992) Photodynamic inactivation of retroviruses by phthalocyanines: the effects of sulphonation, metal ligand and fluoride. J. Photochem. Photobiol. B, 13, 145-152.

70. Berg K. and Moan J. (1994) Lysosomes as photochemical targets. Int. J. Cancer, 59, 814-822.

71. Bertoloni G., Reddi E., Gatta M., Burlini C., Jori G. (1989) Factors influencing the haematoporphyrin-sensitized photoinactivation of Candida albicans. J. Gen. Microbiol., 135, 957-966.

72. Bertoloni G., Rossi F., Valduga G., Jori G., van Lier J. (1990) Photosensitizing activity of water- and lipid-soluble phthalocyanines on Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett., 59, 149-155.

73. Bertoloni G., Lauro F.M., Cortella G., Merchat M. (2000) Photosensitizing activity of hematoporphyrin on Staphylococcus aureus cells. Biochim. Biophys. Acta, 1475, 169-174.

74. Bezdetnaya L., Zeghari N., Belitchenko I., Barberi-Heyob M., Merlin J.L., Potapenko A., Guillemin F. (1996) Spectroscopic and biological testing of photobleaching of porphyrins in solutions. Photochem. Photobiol., 64, 382-386.

75. Bhatti M., MacRobert A., Meghji S. et al. (1997) Effect of dosimetric and physiological factors on the lethal photosensitization of Porphyromonas gingivalis in vitro. Photochem. Photobiol., 65, 1026-1031.

76. Black H.S., deGruijl F.R., Forbes P.D., Cleaver J.E. et al. (1997) Photocarcinogenesis: an overview. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 40, 2947.

77. Boecking T., Barrow K.D., Netting A.G., Chilcott T.C., Coster H.G., Hofer M. (2000) Effects of singlet oxygen on membrane sterols in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur. J. Biochem., 267, 1607-1618.

78. Bosca F., Miranda. M.A. (1998) Photosensitizing drugs containing the benzophenone chromophore. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 43, 1-26.

79. Boucher H.W., Corey G.R. (2008) Epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin. Infect. Dis., 46, 344—349.

80. Bowler P.G., Duerden B.r., Armstrong D.G. (2001) Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev., 14, 244-269.

81. Brandt W.W., Dwyer F.P. and Gyarfas E. (1954) Helate complexes of 1,10-phenanthroline and related compounds. Chemical Reviews, 54, 959-1017.

82. Brun A. and Sandberg S. (1991) Mechanisms of photosensitivity in porphyric patients with special emphasis on erythropoietic protoporphyria. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 10, 285-302.

83. Budde RJ.A. and Randall D.D. (1990) Pea leaf mitochondrial pyruvate dehydrogenase complex is inactivated in vivo in a light-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 673-676.

84. Bussey M., Saville D.s, Chevallier M.R., Rank G.H. (1979) Yeast plasma membrane ghosts. BBA, 553, 185-196.

85. Calin M.A. and Parasca S.V (2009) Light sources for photodynamic inactivation of bacteria. Lasers Med. Sci., 24, 453-460.

86. Caminos D.A., Spesia M.B., Durantini E.N. (2006) Photodynamic inactivation of Escherichia coli by novel meso-substituted porphyrins by 4-(3-N,N,N-trimethylammoniumpropoxy)phenyl and 4-(trifluoromethyl)phenyl groups. Photochem. Photobiol. Sci., 5, 56-65.

87. Carré V., Jayat C., Granet R., Krausz P., Guilloton M. (1999) Chronology of the apoptotic events induced in. the K562 cell line by photodynamic treatment with hematoporphyrin and monoglucosylporphyrin. Photochem. Photobiol., 69, 55-60.

88. Casey W.M., Parks L.W. (1989) A role for sterols in the pophyrin mediated photosensitization of yeast. Photochem. Photobiol., 50, 553-556.

89. Chang J., Ossoff S. F., Lobe D.C., DorfmanM.H., Dumais C.M., Quails R.G., Johnson J.D. (1985) UV inactivation of pathogenic and indicator microorganisms. Applied and Enviromental Microbiology, 49, 1361-1365.

90. Conn P.F., Schalch W., Truscott T.G. (1991) The singlet oxygen and carotenoidánteraction. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 11, 41-47.

91. Corrochano L.M., Gallando P., Lipson E.D., Cerda-Olmedo-E. (1988) Photomorphogenesis in Phycomyces: fluence-response curves, and action spectra. Planta, 174, 315-320.

92. Cox R. and Charles H.P. (1973) Porphyrin-accumulating mutants of Escherichia coli. J.Bacteriol., 113, 122-132.

93. Csatorday K., MacColl R., Berns D.S. (1981) Accumulation of protoporphyrin and Zn-porphyrin in Cyanidium caldarium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1700-1702.

94. Curnow A. and Pye A. (2007) Biochemical manipulation via iron chelation to enhance porphyrin production from porphyrin precursors. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., 26, 89-103.

95. Czochralska B., Bojarska E., Pawlicki K., Shugar D. (1990) Photochemical and enzymatic redox transformations of reduced forms of coenzyme NADP+. Photochem. Photobiol., 51, 401-410.

96. Dasgupta S., Nath R.K., Biswas S., Mitra A., Panda A.K. (2009) Interactions of bacterial polysaccharides with cationic dyes: physicochemical studies. Indian J. Biochem. Biophys., 46, 192-197.

97. Daub M.E., Herrero S., Chung K.R. (2005) Photoactivated perylenequinone toxins in fungal1 pathogenesis of plants. FEMS Microbiol. Lett., 252, 197-206.

98. Davidson J.F., Whyte B., Bissinger P.H., Schiestl R.H. (1996) Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 93; 5116-5121.

99. Davies M.J. (2001) Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimie, 83, 301-310.

100. Davies M.J. (2003) Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequences. Biochem. Biophys. Res. Commun., 305, 761-770.

101. Davies M.J. (2004) Reactive species, formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochem. Photobiol. Sci., 3, 17-25.

102. Davies M.J. (2005) The oxidative environment and protein damage. Biochim Biophys Acta, 1703, 93-109.

103. Dean R.T., Fu S., Stacker R„ Davies M.J. (1997) Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem J., 324, 1-18.

104. Dellinger M. (1996) Apoptosis or necrosis following Photofrin photosensitization: influence of the incubation protocol. Photochem. Photobiol., 64, 182-187.

105. Dietel W., Bolsen K., Dickson E., Fritsch C., Pottier R., Wendenburg R. (1996) Formation of water-soluble porphyrins and protoporphyrin IX in 5-aminolevulinic-acid-incubated carcinoma cells. J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 33, 225-231.

106. DiMascio P., Kaiser S., Sies H. (1989) Lycopene as the most effident biological carotenoid singlet oxygen quencher. Arch. Biochem. Biophys., 274, 532-538.

107. Djavadi F.H., Moradi M., Etemad-Pour F., Djavadi-Ohaniance.L. (1977) Inhibition of the yeast respiratory system by Zn-protoporphyrin and5 effect of photolysis of this substance. Biochimie.i 59, 805-811;.

108. Doetsch,P.W., Morey,N.J.;, Swanson,R.L. and Jinks-Robertson,S. (2001) Yeast base excision repair: interconnections and networks. Prog. Nucleic Acids; Res. Mol. Biol., 68, 29-39.

109. Dolphin D. (1994) Photomedicine and photodynamic therapy. Can; J. Chem., 72, 1005-1013.

110. Dubbelman T.M. and Hoeben R.C. (1999) Photodynamic treatment of adenoviral vectors with visible light: an easy and convenient method for viral inactivation. Gene Therapy, 6, 873-88 U

111. Dupouy E.A., Lazzeri D., Durantini E.N. (2004) Photodynamic activity of cationic and non-charged Zn(II) tetrapyridinoporphyrazine derivatives: biological consequences in human erythrocytes and Escherichia coli. Photochem. Photobiol. Sci., 3, 992-998.

112. Edge R., McGarrey D.J., Truscott T.G. (1997) The carotenoids as antioxidants a review. J. Photochem. Photobiol:.B: Biol., 41, 189-200.

113. Eiferman R.A., Snyder J.W., Barbee J.V. Jr. (1983) Corneal chromomycosis. Am J Ophthalmol., 95, 255-256.

114. Engelmann F.M., Mayer I., Gabrielli D.S., Toma H.E., Kowaltowski A.J., et al. (2007) Interaction of cationic meso-porphyrins with liposomes, mitochondria and erythrocytes. J. Bioenerg. Biomembr., 39, 175-185.

115. Enninga I.C., Groenendijk R.T.L., Filon A.R., van Zeeland A.A., Simons J.W. (1986) The wavelength dependence of u.v.-induced pyrimidine dimer formation, cell killing and mutation induction in human diploid skin fibroblasts. Carcinogenesis, 7, 1829-1836.

116. Epling G.A., Sibley M.T., Chou T.T., Kumar A. (1988) Photofragmentation of phototoxic dibenzocycloheptadien antidepressants. Photochem. Photobiol., 47, 491-495.

117. Fabrizio P., Battistella L., Vardavas R., Gattazzo C., Liou L.L., Diaspro A., Dossen J.W., Gralla E.B., Longo V.D. (2004) Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol., 166, 1055-1067.

118. Feierabend J. and Engel S. (1986) Photoinactivation of catalase in vitro and in leaves. Arch. Biochem. Biophys., 251, 567-576.

119. Fernandez J.M., Bilgin M.D., Grossweiner L.I. (1997) Singlet oxygen generation by photodynamic agents. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 37, 131140.

120. Ferreira G.C. and Gong J. (1995) 5-Aminolevulinate synthase and the first step of heme biosynthesis. J. Bioenerg. Biomembr., 27, 151-159.

121. Ferreira T, Regnacq M., Alimardani P., Moreau-Vauzelle C., Berges T. (2004) Lipid dynamics in yeast under haem-induced unsaturated fatty acid and/or sterol depletion. Biochem J. 378, 899-908.

122. Floyd R.A. (2009) Serendipitous Findings While Researching Oxygen Free Radicals. Free Radic. Biol. Med., 46, 1004-1013.

123. Foote C.S. (1991) Definition of type I and type II photosensitized oxidation. Photochem Photobiol., 54, 659.

124. Fox M.A. (1990) Photoinduced electron transfer. Photochem. Photobiol., 52, 617-627.

125. Fresno S., Jimenez N., Izquierdo L., Merino S., Corsaro M.M., De Castro C., Parrilli M., Naldi T., Regue M., and Toma J. M. (2006) Microbiology, 152, 1807-1818.

126. Fritsch C., Abels C., Goetz A.E. et al. (1997a) Porphyrins preferentially accumulate in a melanoma following intravenous injection of 5-aminolevulinic acid. Biol. Chem., 378, 51-57.

127. Fritsch C., Batz J., Bolsen K et al. (1997b) Ex vivo application of 8-aminolevulinic acid induces high and specific porphyrin levels in human skin tumors: possible basis for selective photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 66, 114-118.

128. Fukasawa K. (2000) Singlet oxygen scavenging in phospholipid membrane. Meth.Enzymol., 319, 101-110.

129. Garbo G.M. (1996) Purpurins and benzochlorins as sensitizers for photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 34, 109-116.

130. Gasparro F.P., Mitchnick M., Nash J.F. (1998) A review of sunscreen safety and efficacy. Photochem. Photobiol., 68, 243-256.

131. Gederaas O.A., Schonberg S.A., Ramstad S., Berg K., Johnsson A., Krokan H.E. (2005) Cell specific effects of polyunsaturated fatty acids on 5-aminolevulinic acid based photosensitization. Photochem. Photobiol. Sci., 4, 383-389.

132. Gibson S.L., Cheekier T.L., Bryant T.G., Hilf R. (1989) Effects of laser7 iphotodynamic therapy on tumor phosphate levels and pH assessed by P-NMR spectroscopy. Cancer Biochem. Biophys., 10, 319-328.

133. Gibson S.L., Cupriks D.J., Havens J J., Nguyen M.L., Hilf R. (1998) A regulatory role for porphobilinogen deaminase (PBGD) in delta-aminolaevulinic acid (delta-ALA)-induced photosensitization? Br. J. Cancer, 77, 235-243.

134. Gilardy A., Djavardi-Ohaniance L., Labbe P., Chaix P. (1971) Effet de l'accumulation de Zn-propoporphyrine par la cellule de levure sur la synthese et le fonctionnement de son systeme respiratoire. BBA, 234, 446-457.

135. Gil M. L., Casanova M., Martinez J. P., Sentadreu R. (1991) Antigenic cell wall mannoproteins in Candida albicans isolates and in other Candida species. Journal of General Microbiology, 137, 1053-1061.

136. Girard P.M., Boiteux S. (1997) Repair of oxidized DNA bases in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochimie, 79, 559-566.

137. Girotti A.W. (1990) Photodynamic lipid peroxidation in biological systems. Photochem. Photobiol., 51, 497-509.

138. Girotti A.W. (1992) Photosensitized oxidation of cholesterol in biological systems: reaction pathways, cycotoxic effects and defense mechanisms. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 13, 105-118.

139. Girotti AW. (1998) Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. J Lipid Res. 39:1529-1542.

140. Girotti A.W. (2001) Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms. J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 63, 103-113.

141. Girotti A.W., Deziel M.R. (1983) Photodynamic action of protoporphyrin on resealed erythrocyte membranes: mechanisms of release of trapped markers. Adv. Exp. Med. Biol., 160, 213-225.

142. Girotti A.W. and Kriska T. (2004) Role of lipid hydroperoxides in photo-oxidative stress signaling. Antioxid. Redox Signal., 6, 301-310.

143. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H. et al. (1996) Life with 6000 genes. Science, 274, 546-567.

144. Goldenberg R.L. and Nelson K. (1975) Dermatitis from neutral red therapy of herpes genitalis. Obstet Gynecol., 46, 359-360.

145. Gora M., Grzybowska E., Rytka J., Labbe-Bois R. (1996) Probing the active-site residues in Saccharomyces cerevisiae ferrochelatase by directedmutagenesis. In vivo and in vitro analyses. J. Biol. Chem., 271, 11810-11816.i

146. Gracanin M., Hawkins C.L., Pattison D.I., Davies M.J. (2009) Singlet-oxygen-mediated amino acid and protein oxidation: formation of tryptophan peroxides and decomposition products. Free Radic Biol Med., 47, 92-102.

147. Graham R.K., Caiger P.H. (1969) Fluorescence Staining for the Determination of Cell Viability. Applied Microbiology, 17, 489-490.

148. Granville D.J., Garthy C.M., Jiang H., Shore G.C., McManus B.M., Hunt D.W. (1998) Rapid cytochrome c release, activation of caspases 3, 6, 7 and 8 followed by Bap31 cleavage in HeLa cells treated with photodynamic therapy. FEBS Lett., 437, 5-10.

149. Grishko V.I., Driggers W.J., LeDoux S.P., Wilson G.L. (1997) Repair of oxidative damage in nuclear DNA sequences with different transcriptional activities. Mutat. Res., 384, 73-80.

150. Grune T., Klotz L.O., Gieche J., Rudeck M., Sies H. (2001) Protein oxidation' and proteolysisby the nonradical oxidants singlet oxygen or peroxynitrite. Free Radic. Biol. Med., 30, 1243-1253.

151. Grune T., Merker K., Sandig G., Davies K.J. (2003) Selective degradation of oxidatively modified protein substrates by the proteasome. Biochem. Biophys. Res. Commun., 305, 709-718.

152. Gudgin Dickson E.F. and' Pottier R.H. (1995) On the role of protoporphyrin IX photoproducts in photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 29, 91-93.

153. Guilloton M. (1999) Fungicidal properties of meso-arylglycosylporphyrins: influence of sugar substituents on photoinduced damage in the yeast. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 48, 57-62.

154. Gutteridge J.M., Smith A. (1988) Antioxidant protection by haemopexin of haem-stimulated lipid peroxidation. Biochem. J., 256, 861-865.

155. Halliwell B. and Guttridge J.M.C. (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease. An overview. Methods Enzymology, 186, 1-85.

156. Hamblin M.R. and Hasan T. (2004) Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem. Photobiol. Sei., 3, 436-450.

157. Hausmann A., Samans B., Lill R., Mühlenhoff U. (2008) Cellular and mitochondrial remodeling upon defects in iron-sulfur protein biogenesis. J Biol Chem., 283, 8318-8330.

158. Hazen K. C., Wu J. G., Masuoka J. (2001) Comparison of the Hydrophobic Properties of Candida albicans and Candida dubliniensis. Infection and Immunity, 69, 779-786.

159. Helene C. and Charlier M. (1971) Photosensitixed reactions in nucleic acids. Photosensitized formation and splitting of pyrimidine dimers. Biochimie, 53, 1175-1180.

160. Hellingwerf K.J., Hoff W.D., Crielaard W. (1996) Photobiology of microorganisms: how photosensors catch a photon to initialize signalling. Molecular microbiology, 21, 683-693.

161. Henle E.S., Luo Y., Gassmann W., Linn S. (1996) Oxidative damage to DNA constituents by iron-mediated Fenton reactions. J. Biol. Chemistry, 271, 21177-21186.

162. Hilf R., Havens J.J., Gibson S.L. (1999) Effect of 5-aminolevulinic acid on protoporphyrin IX accumulation in tumor cells trasfected with plasmids containing porphobilinogen deaminase DNA. Photochem. Photobiol., 70, 334340.

163. Hoeijmakers J.H.J. (1993) Nucleotide excision repair II: from yeast to mammals. Trends genet., 9, 211-217.

164. Horowitz B., Williams B., Rywkin S, Prince A.M., Pascual D., Geacintov N., Valinsky J. (1991) Inactivation of viruses in blood with aluminum phthalocynine derivatives. Transfusion, 31, 102-108.

165. Hunter G.A., Sampson M.P., Ferreira G.C. (2008) Metal ion substrate inhibition of ferrochelatase. J Biol Chem., 283, 23685-23691.

166. Jacobs J.M, Sinclair P.R., Sinclair J.F. et al. (1998) Formation of zinc protoporphyrin in cultured hepatocytes: effects of ferrochelatase inhibition, iron chelation or lead. Toxicology, 6, 95-105.

167. Jahn D, Hungerer C, Troup B. (1996) Unusual pathways and environmentally regulated genes of bacterial heme biosynthesis. Naturwissenschaften, 83, 389-400.

168. Johnsson A., Kjeldstad B., Melo T.B. (1987) Fluorescence from pilosebaceous follicles. Arch. Dermatol. Res, 279, 190-193.

169. Jordan B.R. (1996) The effects of ultraviolet-B radiation on plants: a molecular perspective. In: Advancess in Botanical Research incorporating

170. Advancess in Plant Pathology (Callow, J.A., ed.), v. 22, Academic Press: London, UK, 97-162.

171. Jori J. (2006) Photodynamic Therapy of Microbial Infections: State of the Art and Perspectives. J. Environ. Path. Toxcol. Oncol., 25, 505-519.

172. Jori G. and Brown S.B. (2004) Photosensitized inactivation of microorganisms. Photochem Photobiol Sci, 3, 403-405.

173. Jori G., Fabris C., Soncin M.5 Ferro S., Coppellotti O., Dei D., Fantetti L., Chiti G., Roncucci G. (2006) Photodynamic therapy in the treatment of microbial infections: basic principles and perspective applications. Lasers Surg. Med., 38, 468-481.

174. Josefsen L.B. and Boyle R.W. (2008) Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Met. Based Drugs, 276109.

175. Jucker B.A., Harms H., Zehnder A.J. (1996) Adhesion of the positively charged bacterium Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia 70401 to glass and Teflon. J. Bacteriol., 178, 5472-5479.

176. Juzeniene A., Juzenas P., Iani V., Moan J. (2007) Topical applications of iron chelators in photosensitization. Photochem. Photobiol. Sci., 6, 1268-1274.

177. Kamiya H. (2003) Mutagenic potentials of damaged nucleic acidsproduced by reactive oxygen/nitrogen species: approaches using synthetic oligonucleotides and nucleotides Nucleic Acids Research, 31, 517-531.

178. Kamiya H, Kasai H. (2000) 2-Hydroxy-dATP is incorporated opposite G by Escherichia coli DNA polymerase III resulting in high mutagenicity. Nucleic Acids Res., 28, 1640-1646.

179. Karioti A. and Bilia A.R. (2010) Hypericins as potential leads for new therapeutics. Int. J. Mol. Sci., 11, 562-594.

180. Kemp G.D., Dickinson F.M., Ratledge C. (1990) Light sensitivity of the n-alkane-induced fatty alcohol oxidase from Candida tropicalis and Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 32, 461-464.

181. Keng T., Richard C., Larocque R. (1992) Structure and regulation of yeast HEM3, the gene for porphobilinogen deaminase. Mol. Gen. Genet., 234, 233-243.

182. Kennedy J.C. and Pottier R.H. (1992) Endogenous protoporphyrin IX, a clinically useful photosensitizer for photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 14, 275-292.

183. Kennedy J.C., Pottier R.H., Pross D.C. (1990) Photodynamic therapy with endogenous protoporphyrin IX: basic principles and present clinical experience. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 6, 143-148.

184. Kerr R.A. (1993) The ozone hole reaches a new low. Science, 262, 501505.

185. Kessel D. and Luo Yu. (1998) Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 42, 89-95.

186. Kielbassa C., Roza L., Epe B. (1997) Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis, 18, 811-816.

187. Killig F. and Stark G. (2002) Photodynamic activation of ion transport through lipid membranes and its correlation with an increased dielectric constant of the membrane. Biochim; Biophys. Acta, 1564, 207-21'3.

188. Kjeldstad B., Johnsson A. and Sanberg S. (1984) Influence of pH on> porphyrin production'in Propionibacterium acnes. Arch.Dermatol. Res., 276, 396-400.

189. Kobayashi S., Hirota Y., Sayato-Suzuki J. et al. (1994) The possible role of metallothionein in the cellular defence mechanism- against UVR irradiation in human neonatal skin fibroblasts. Photochem. Photobiol., 59, 650-656.

190. Kochevar I.E. (1987) Mechanism of drug photosensitization. Photochem. Photobiol., 45; 891-895.

191. Kollias N., Sayre R.M., Zeise L., Chedeckel M.R. (1991) Photoprotection by melanin. J.Photochem.Photobiol. B: Biol., 9, 135-160.

192. Krammer B., Uberriegler K. (1996) In-vitro investigation of ALA-induced protoporphyrin IX. J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 36, 121-126.

193. Krasnovsky A.A., Jr. (1998) Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IR phosphorescence studies. Membr. Cell Biol., 12, 665-660.

194. Krasnovsky A.A., Jr. (2008) Luminescence and photochemical studies of singlet oxygen photonics. J.Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 196, 210218.

195. Krasnovsky A.A., jr., Kagan V.E., Minin A.A. (1983) Quenching of singlet oxygen luminescence by fatty acids and lipids. Contribution of physical and chemical mechanisms. FEBS Letters, 155, 233-236.

196. Ma L., Bagdonas S., Moan J. (2001) The photosensitizing effect of the photoproduct of protoporphyrin IX. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 60, 108113.

197. Maeda K. and Naganuma M. Topical trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid prevents ultraviolet radiation-induced pigmentation. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 47, 136-141.

198. Madeo F., Fröhlich E., Fröhlich K.U. (1997) A yeast mutant showing diagnostic markers of early and late apoptosis. J. Cell Biol., 139, 729-734.

199. Madeo F., Fröhlich E., Ligr M., Grey M., Sigrist S.J., Wolf D.H., Fröhlich K.U. (1999) Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast. J. Cell Biol., 145, 747 -757.

200. Madronich S., McKenzie R.L., Björn L.O., Caldwell M.M. (1998) Changes in biologically active ultraviolet radiation reaching the Earth's surface. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 46, 5-19.

201. Magde D., Elson E.L., Webb W.W. (1974) Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers, 13, 29-61.

202. Maisch T. (2007) Anti-microbial photodynamic therapy: useful in the future? Lasers Med. Sei., 22, 83-91.

203. Maisch T. (2009) A new- strategy to destroy antibiotic resistant microorganisms: antimicrobial photodynamic treatment. Mini Rev. Med. Chem., 9, 974-983.

204. Maisch T., Bosl C., Szeimies R.M., Lehn N., Abels C. (2005) Photodynamic Effects of Novel XF Porphyrin Derivatives on Prokaryotic and Eukaryotic Cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, 1542-1552.

205. Maisch T., Baier J., Franz B., Maier M. et al. (2007) The role of singlet oxygen and oxygen concentration in photodynamic inactivation of bacteria. PNAS, 104, 7223-7228.

206. Makimura Y., Asai Y., Sugiyama A., Ogawa T. (2007) Chemical structure and immunobiological activity of lipid A from Serratia marcescens LPS. Journal of Medical Microbiology, 56, 1440-1446.

207. Malik Z., Hanania J., Nitzan Y. (1990) New trends in photobiology (invited review). Bactericidal effects of photoactivated porphyrins an alternative approach to antimicrobial drugs. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 5, 281-293.

208. Malik Z., Kostenich G., Roitman L., Ehrenberg B., Orenstein A. (1995) Topical application of 5-aminolevulinic acid, DMSO and EDTA: protoporphyrin IX accumulation in skin and tumours of mice. J. Photochem. Photobiol. B:Biol„ 28, 213-218.

209. Manderfeld M.M., Schafer H.W., Davidson P.M., Zottola E.A. (1997) Isolation and identification of antimicrobial furocoumarins from parsley. J Food Prot., 60, 72-77.

210. Marnett L.J. (2002) Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology, 181-182, 219-222.

211. Marti C., Nonell S., Nicolau M„ Torres T. (2000) Photophysical properties of neutral and cationic tetrapyridinoporphyrazines. Photochem. Photobiol., 71, 53-59.

212. Martinez L.J., ' Sik R.H., Chignell C.F. (1998) Fluoroquinolone antimicrobials: singlet oxugen, superoxide and phototoxicity. Photochem. Photobiol., 67, 399-403.

213. Matthews J.L., Newman J.T., Sogandares-Bernal F. et al. (1988) Photodynamic therapy of viral contaminants with potential for blood banking applications. Transfusion, 28, 81-83.

214. Mattoon J. and Balcavage W.X. (1967) Yeast mitochondria and submitochondrial particles. In: Methods in Enzymology (R.W. Estabrook and M.E. Pullman, eds.), v. 10, Academic Press, New York, pp. 135-142.

215. McCoy A.J., Liu H., Falla T.J., Gunn J.S. (2001) Identification of Proteus mirabilis mutants with increased sensitivity to antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother., 45, 2030-2037.

216. Meissel M.N, Medvedeva G.A, Alekseeva V.M. (1961) Discrimination of living, injured and dead microorganisms. Microbiology, 30, 699-704.

217. Meló T.B. and Johnsson M. (1982) In vivo porphyrin fluorescence for Propionibacterium acnes. A characterization of the fluorescing pigments. Dermatológica, 164, 167-174.

218. Meng T.C, Fukada T, Tonks N.K. (2002) Reversible oxidation and inactivation of protein tyrosine phosphatases in vivo. Mol. Cell, 9, 387-399.

219. Menter J.M, Patta A.M., Hollins T.D, Moore C.L, Willis I. (1998) Photoprotection of mammalian acid-soluble collagen by cuttlefish sepia melanin in vitro. Photochem. Photobiol, 68, 532-537.

220. Michaeli A. and Feitelson J. (1994) Reactivity of singlet oxygen toward amino acids and peptides. Photochem. Photobiol, 59, 284-289.

221. Millson C.E, Wilson M, Macrobert A J, Bedwell J, Bown S.G. (1996) J. Med. Microbiol, 44, 245-252.

222. Millson C.E, Wilson M, MacRobert A.J, Bown S.G. (1996) Ex-vivo treatment of gastric Helicobacter infection by photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 32, 59-66.

223. Minnock D.I, Vernon J, Schofield J, Griffiths J.H, Parish, Brown S.B. (2000) Mechanism of uptake of a cationic water-soluble pyridinium zinc phthalocyanine across the outer membrane of Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother, 44, 522-527.

224. Mizake S. and Sugimura T. (1968) Coproporphyrinogenase in a respiration-deficient mutant of yeast lacking all cytochromes and accumulating coproporphyria J. Bacteriol., 96, 1997-2003.

225. Moan J. (1986) Porphyrin photosensitization and phototherapy. Photochem. Photobiol., 43, 681-690.

226. Moan J. and Berg K. (1991) The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the life time of singlet oxygen. Photochem. Photobiol., 53, 549-553.

227. Moan J. and Berg K. (1992) Photochemotherapy of cancer: Experimental research. Photochem. Photobiol., 55, 931-948.

228. Moan J., Streckyte G., Bagdonas S., Bech O. and Berg K. (1997) Photobleaching of protoporphyrin IX in cells incubated with 5-aminolevulinic acid. Int. J. Cancer, 70, 90-97.

229. Mondon P. and Shahin M.M. (1992) Comparative studies on the lethal, mutagenic, and recombinogenic effects of ultraviolet -A, -B, -C, and visible light with and without 8-methoxypsoralen in Saccharomyces cerevisiae. Photochem. Photobiol., 55, 713-721.

230. Montesinos M.C., Ubeda A., Terencio M.C., Paya M., Alcaraz M.J. Antioxidant profile of mono- and dihydroxylated flavone derivatives in free radical generating systems. (1995) Z. Naturforsch., 50c, 552-560.

231. Moor A.C.E. (2000) Signaling pathways in cell death and survival after photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 57, 1-13.

232. Moore C., Wallis C., Melnick J.L., Kuns M.D. (1972) Photodynamic treatment of herpes keratitis. Infect. Immun., 5, 169-171.

233. Moore D.E., Ghebremeskel K.A., Chen B., .Wong E. (1998) Electron transfer processes in the reactivity of nonsteroidal anti-inflammatory drugs in the ground and excited states. Photochem. Photobiol., 68, 685-691.

234. Morgan P.E., Dean. R.T., Davies M.J. (2004). Protective mechanisms against peptide and protein peroxides generated by singlet oxygen. Free Radie. Biol. Med., 36, 484-496.

235. Morrison H., Mohammad T., Kurukulasuriya R. (1997) Photobiological properties of methylene violet. Photochem. Photobiol., 66, 245-252.

236. Morrison H., Mohammad'T., Kurukulasuriya R. (1997) Photobiological properties of methylene violet. Photochem. Photobiol., 66, 245-252.

237. Mortensen A. and Skibsted L.H. (1998) Reactivity of p-carotene towards peroxyl radicals studied by laser flash and steady-state photolysis. FEBS Letters, 426, 392-396.

238. Motten A.G., Martinez L.J., Holt N. et al. (1999) Photophysical studies on antimalarial drugs. Photochem: Photobiol., 69, 282-287.

239. Navarre W.W. and Schneewind G. (1999) Surface proteins of gramr positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol. Mol: Biol. Rev., 63, 174-229.

240. Nitzan Y. and Kauffman M. (1999) Endogenous porphyrin production in bacteria by 8-amiholevulinic acid and subsequent bacterial photoeradication, Lasers Med. Sci., 14,269-277. . .

241. Nitzan Y., Gozhansky S., Malik Z. (1985) Effect of photoactivated hematoporphyrin derivative on the viability of Staphylococcus aureus. Current Microbiology, 8, 279-284.

242. Nitzan Y., ,Gutterman M., Malik Z., Ehrenberg B. (1992) Inactivation of gram-negative bacteria by photosensitized;porphyrins. Photochem. Photobiol., 55, 89-96:

243. Nitzan Y, Wexler HM, Finegold SM. (1994) Inactivation of anaerobic bacteria by various photosensitized porphyrins or. by hemin. Curr Microbiol., 29, 125-131.

244. Nitzan Y., Dror R., Ladan H., Malik Z., Kimel S., Gottfried V, (1995) Structure-activity relationship of porphines for photoinactivation of bacteria. Photochem. Photobiol!, 62, 342-347.

245. Nitzan Y., Malik Z., Kauffman M;, Ehrenberg B. (1997) Induction of endogenous porphyrin production in bacteria and subsequence photoinactivation by various light sources. In: Photochemotherapy:

246. Photodynamic Therapy and other modalities III, ed. K. Berg, B. Ehrenberg, Z. Malik and J. Moan, pp. 89-94.

247. Nitzan Y., Salmon-Divon M., Shporen E., Malik Z. (2004) ALA induced photodynamic effects on gram positive and negative bacteria. Photochem Photobiol Sci. 3. 430-435.

248. Njus D. and Kelley P.M. (1991) Vitamins C and E donate single hydrogen atoms in vivo. FEBS Letters, 284, 147-151.

249. Noodt B.B., Berg K., Stokke T„ Peng Q., Nesland J.M. (1996) Apoptosis and necrosis induced with light and 5-aminolaevulinic acid-derived protoporphyrin IX. Br. J. Cancer, 74, 22-29.

250. Norbury C.J. and Hickson I.D. (2001) Cellular responses to DNA damage. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 41, 367-401:

251. Nunez M.T., Cole E.S., Glass J. (1983) The reticulocyte plasma membrane pathway of iron uptake as determined by the mechanism of alpha, alpha'-dipyridyl inhibition. J. Biol. Chem., 258, 1146-1151.

252. Ohyama T., Sasagawa A., Terui N., Mita H., Yamamoto Y. (2003) Study on interaction of a cationic porphyrin with DNA. Nucleic Acids Research Supplement, 3, 189-190.

253. Oleinick N.L., Evans H.H. (1998) The photobiology of photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms. Radiat. Res., 150 S., 146-156.

254. Oleinick N.L., Morris R.L., Belichenko T. (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how. Photochem. Photobiol. Sci., 1, 1-21.

255. Ochsner M. (1997) Photophysical and photobiological-processes in the photodynamic therapy of tumours. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 39, 118.

256. Oriel-Si, Nitzan Y. (2010) Photoinactivation of Candida albicans by its own endogenous porphyrins. Curr. Microbiol., 60, 117-123.

257. Paardekooper M., De Bruijne A.W., Van Steveninck J., Van den Broek, P.J.A. (1993) Inhibition of transport systems in yeast by photodynamic treatment with toluidine blue. Biochim. Biophys. Acta, 1151, 143-148.

258. Paardekooper M., De Bruijne A.W., Van Steveninck J., Van den Broek, P.J-.A. (1995) Intracellular 'damage in yeast cells caused by photodynamic treatment with toluidine blue. Photochem. Photobiol., 61, 84-89.

259. Panek H., O'Brian M.R. (2002) A whole genome view of prokaryotic haem biosynthesis. Microbiology, 148(Pt 8), 2273-2282.

260. Pashkovskaya A.A., Maizlish-V.E., Shaposhnikov G.P., Kotova E.A., Antonenko Y.N. (2008) Role of electrostatics in the binding of charged metallophthalocyanines to neutral and charged phospholipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1778, 541-548.

261. Pati D., Keller C., Groudine M., Plon S.E. (1997) Reconstitution of a MEC1-independent checkpoint in yeast by expression of a novel human fork head cDNA. Mol Cell Biol., 17, 3037-3046.

262. Pazos M.C. and Nader H.B. (2007) Effect of photodynamic therapy on the extracellular matrix and associated components. Brazilian J. of Med. and Biol. Res., 40, 1025-1035.

263. Peak J.G., Foote C.S., Peak M.J. (1981) Protection by DAB CO against inactivation of transforming DNA by near-ultraviolet light: action spectra and, implications for involvement of singlet oxygen. Photochem. Photobiol., 34, 4549.

264. Peak'M.J. and Peak J.G. (1982) Single-strand breaks induced in Bacillus subtilis DNA by ultraviolet light: action spectrum and properties. Photochem. Photobiol., 35, 675-680.

265. Peak M.J., Peak J.G., Moering M.P., Webb R.B. (1984) Ultraviolet action specta for DNA dimer induction, lethality and mutagenesis in

266. Escherichia coli with emphasis on the UVB region. Photochem. Photobiol., 40}. 613-620.

267. Pence B.C., Delver E., Dunn D.M. (1994) Effects of dietary selenium on UVB-induced skin carcinogenesis and epidermal antioxidant status. J. Invest. Dermatol, 102,759-761.

268. Peng Q, Berg K, Moan J, Kongshaug M, Nesland J.M. (1997) 5-Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principles and experimental research. Photochem. Photobiol. 65, 235-251.

269. Phillips A.J, Crowe J.D, Ramsdale M. (2006) Ras pathway signaling accelerates programmed cell death in the pathogenic fungus Candida-albicans. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 726-731. • ' "

270. Piette J. (1991) Biological consequences associated with DNA oxidation mediated by singlet oxygen. J. of Photochcm. Photobiol. B: Bioli, 11, 241-260.

271. Polo L, Segal la A, Bertoloni G, Jori G, Schaffner K„ ReddiE. (2000) Polylysine-porphycene conjugates as efficient photosensitizers for the inactivation of microbial pathogens. J. Photochcm. Photobiol, B: Biol, 59, 152-158:

272. Potapenko A.Ya. (1991) Mechanisms of photodynamic effects of furocoumarins. J. of Photochem. Photobiol : B: Biol, 9, 1-3 3.

273. Pourzand C, Reelfs O, Kvam E, Tyrrell: R.M. (1999) The iron regulatory protein can determine the effectiveness of 5-aminolevulinic acid in inducing protoporphyrin IX in human primary skin fibroblasts. J. Invest. Dermatol, 112,419-425.

274. Pretlow T. and F. Sherman. (1968) Porphyrins andi zinc porphyrins in normal and mutant strains of yeast. Biochim. Biophys. Acta; 148, 629-644.

275. Prokhorenko I.R, Zubova S.V, Ivanov A.Y, Grachev S.V. (2009) Interaction of Gram-negative bacteria with cationic proteins: Dependence on the surface characteristics of the,bacterial cell: int. J. Gen. Med, 2, 33-38.

276. Raab O. (1900) Ueber die Wirkung fluorizierender Stoffe auf Infusorien. Z. Biol. 39, 524-546.

277. Raetz C.R, Ulevitch R.J., Wright S.D, Sibley C.H, Ding A., Nathan C.F. (1991) Gram-negative endotoxin: an extraordinary lipid with profound effects on eukaryotic signal transduction. FASEB J, 5, 2652-2660.

278. Raetz C.R, Reynolds C.M, Trent M.S., Bishop R.E. (2007) Lipid A modification systems in gram-negative bacteria. Annu. Rev. Biochem, 76, 295-329.

279. Ragas X, Agut M, Nonell S. (2010) Singlet oxygen in Escherichia coli: New insights for antimicrobial photodynamic therapy. Free Radic. Biol. Med, 49, 770-776.

280. Ragu S, G. Faye, I. Iraqui, A. Masurel-Hcneman, R. D. Kolodner, Huang M.-E. (2007) Oxygen metabolism and reactive oxygen species cause chromosomal rearrangements and cell death. PNAS, 104, 9747-9752.

281. Rainina E.I, Zubatov A.S, Buchwalow I.B, Luzikov V.N. (1979) A cytochemical study of the localization of acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae at different growth phases. Histochem.J, 11, 299-310.

282. Ramstad S, Le Anh-Vu N, Johnsson A. (2006) The temperature dependence of porphyrin production in Propionibacterium acnes after incubation with 5-aminolevulinic acid (ALA) and its methyl ester (m-ALA). Photochem. Photobiol. Sci, 5, 66-72.

283. Ramstad S, Anh-Vu N. Le, Johnsson A. (2006) The temperature dependence of porphyrin production in Propionibacterium acnes after incubation with 5-aminolevulinic acid (ALA) and its methyl ester (m-ALA). Photochem. Photobiol. Sci, 5, 66-72.

284. Rayer B, Naynert M, Stieve H. (1990) Phototransduction: different mechanisms in vertebrates and invertebrates. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol, 7, 107-148.

285. Reavy H.J, Traynor N.J, Gibbs N.K. (1997) Photogenotoxicity of skin phototumorigenic fluoroquinolone antibiotics detected using the comet assay. Photochem. Photobiol, 66, 368-373.

286. Rebeiz C.A., Mattheis J.R., Smith B.B., Rebeiz C.C., Dayton D.F. (1975) Biosynthesis and accumulation of Mg-protoporphyrin IX monoester and longer wavelength metalloporphyrins by greening'cotyledons. Arch. Biochem. Biophys. 166. 446-465.

287. Rebeiz C.A., Reddy K.N., Nandihally U.B., Velu J. (1990) Tetrapyrrole-dependent photodynamic herbicides. Photochem. Photobiol., 52, 1099-1117.

288. Rebeiz N., Rebeiz C.C., Arkins S., Kelley K.W., Rebeiz C.A. (1992) Photodestruction of tumor cells by induction of endogenous accumulation of protoporphyrin IX: enhancement by 1,10-phenanthroline. Photochem. Photobiol., 55, 431-435.

289. Rebeiz N., Arkins S., Rebeiz C.A., Simon J., Zachary J.F., Kelley K.W. (1996b) Induction of tumor necrosis by delta-aminolevulinic acid and 1,10-phenanthroline photodynamic therapy. Cancer Res., 56, 339-344.

290. Reuber S., Bornman J.F., Weissenbock G. (1996) A flavonoid mutant of barley {Hordeum Vulgare L.) exhibits increased sensitivity to UVB radiation in the primary leaf. Plant Cell Environ., 19, 593-601.

291. Revich G.G., Beattie K.L. (1986) Utilization of l,N6-etheno-2'-deoxy adenosine 5'-triphosphate during DNA synthesis on natural templates,catalyzed by DNA polymerase I of Escherichia coli. Carcinogenesis, 7, 1569-1576.

292. Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J.Cell Biol., 17, 208-212.

293. Ricchelli F. (1995) Photophysical properties of porphyrins in biological membranes. J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 29, 109-118.

294. Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A.J., Zähringer U., Seydel U., Di Padova F. (1994) Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB J., 8, 217-225.

295. O'Riordan T.C., Buckley D., Ogurtsov V., O'Connor R., Papkovsky D.B. (2000) A cell viability assay based on monitoring respiration by optical oxygen sensing. Anal. Biochem., 278, 221-227.

296. Rodgers M.AJ. (1985) Activated oxygen. In: Primary photo-processes in biology and medicine (R.V.Bensasson, G. Jori, E.J. Land, T.G. Truscott, eds.). Plenum: New York, pp. 181-195.

297. Rodica-Mariana I. (2003) Synthetic metallo-porphyrins and selection criteria forPDT. Oftalmología, 56, 83-88.

298. Rodrigues-Pousada CA, Nevitt T, Menezes R, Azevedo D, Pereira J, Amaral C. Yeast activator proteins and stress response: an overview. FEBS Lett. 2004 Jun l;567(l):80-5.

299. Rosenthal I. (1991) Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol., 53, 859-870.

300. Rothman R.H., Setlow R.B. (1979) An action spectrum for cell killing and pyrimidine dimer formation in Chinese Hamster V-79 cells. Photochem. Photobiol., 29, 57-61.

301. Rotomskis R., Bagdonas S., Streckyte G. (1996) Spectroscopic studies of photobleaching and' photoproduct formation of porphyrins used in tumour therapy. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 33, 61-67.

302. Rouch D.A., Cram D.S., DiBerardino D., Littlejohn T.G., Skurray R.A. (1990) Efflux-mediated antiseptic resistance gene qacA from Staphylococcus aureus: common ancestry with tetracycline- and sugar-transport proteins. Mol. Microbiol., 4, 2051-2062.

303. Rovaldi C.R., Pievsky A., Sole N.A., Friden P.M., Rothstein D.M., Spacciapoli P. (2000) Photoactive porphyrin derivative with broad-spectrumactivity against oral pathogens in vitro. Antimicrob. Agents Chemother.,, 44, 3364-3367.

304. Rowe L.A., Degtyareva N., Doetsch P.W. (2008) DNA damage-induced reactive oxygen species (ROS) stress response in Saccharomyces cerevisiae. Free Radic. Biol. Med., 45; 1167-1177.

305. Ryan K.G., Markham K.R., Bloor S.J., Bradley J.M., Mitchell K.A., Jordan B.R. (1998) UVB radiation induced increase in quercetinrkaempferol ratio in wild-type and transgenic lines of Petunia. Photochem. Photobiol., 68, 323-330.

306. Sailer R., Strauss W.S.L., Konig K., Ruck A., Steiner R. (1997) Correlation between porphyrin biosynthesis and photodynamic inactivation of Pseudomonas aeruginosa after incubation with 5-aminolaevulinic acid. J.

307. Photochem. Photobiol. B:Biol., 39, 236-242.

308. Salet; 0. and Moreno G; (1990) Photosensitization; of mitochondria. Molecular and cellular aspects: J. Photochem: Photobiol: B: Biol., 5, 133-150;

309. Salmon-Divon M.:, Nitzan Y., Malik Z. (2004); Mechanistic; aspects of Escherichia coli photodynamic inactivation; by cationic, tetrawe^o(iV-methylpyridyl)porphine. Photochem. Photobiol. Sci., 3, 423^424.

310. Sancar A. (1994; a) Mechanisms of DNA excision repair. Science, 266, 1954-1956.

311. Sancar A. (1994; b) Structure; and function of DNA photolyase. Biochemistry, 33, 2-9:

312. Sandberg S: and Romslo II. (1981) Phototoxicity of protoporphyrin as related to^ its subcellularlocalization'in mice,livers after short-term feeding with griseofulvin. Biochem J., 198, 67-74. '

313. Sarna T. (1992) Properties and function of the ocular melanin A photobiophysical view. J; Photochem. Photobiol: B: Biol., 12, 215-258.

314. Sastry S. (1997) Isolation and partial characterization of a novel psoralen-tyrosine photoconjugate from a photoreaction of psoralen with a natural protein; Photochem;,Photobiol., 65, 937-944.

315. Savitsky K., Sfez S., Tagle D.A., Ziv Y., Sartiel A., Collins F.S., Shiloh Y., Rotman G. ( 1995) The complete sequence of the coding region of the ATMgene reveals similarity to cell cycle regulators in different species. Hum Mol Genet, 4, 2025-2032.

316. Schagen F.H, Moor A.C, Cheong S.C, Cramer S.J, van Ormondt H, van der Eb A.J, Dubbelman T.M, Hoeben R.C. (1999) Photodynamic treatment of adenoviral vectors with visible light: an easy and convenient method for viral inactivation. Gene Ther, 6, 873-881.

317. Scott J, Quirke J, Vreman H, Stevenson D, Downum K. (1990) Metalloporphyrin phototoxicity. J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 7, 149-157.

318. Scully A.D., Ostler R.B, MacRobert A.J. et al, (1998) Laser line-scanning confocal fluorescence imaging of the photodynamic action of aluminum and zinc phthalocyanines in V79-4 Chinese hamster fibroblasts. Photochem. Photobiol, 68, 199-204.

319. Segalla A, Borsarelli C.D, Braslavsky S.E, Spikes J.D, et al. (2002) Photophysical, photochemical and antibacterial photosensitizing properties of a novel octacationic Zn(II)-phthalocyanine. Photochem. Photobiol. Sei, 1, 641648.

320. Shakoury-Elizeh M, Protchenko O, Berger A, Cox J, Gable K, Dunn T.M, Prinz W.A, Bard M, Philpott C.C. (2010) Metabolic response to iron deficiency in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 285, 14823-14833.

321. Shapira M, Segal E, Botstein D. (2004) Disruption of yeast forkhead-associated cell cycle transcription by oxidative stress. Mol Biol Cell, 15, 56595669.

322. Shindo Y. and Hashimoto T. (1995) Antioxidant defence mechanism of the skin against UV irradiation: study of the role of catalase using acatalasaemia fibroblasts. Arch. Dermatol. Res, 287, 747-753.

323. Shindo Y, Witt E„ Han D, Packer L. (1994) Dose-response effects of acute ultraviolet irradiation on antioxidants and molecular markers of oxidation in murine epidermis. J. Invest. Dermatol, 104, 470-475.

324. Shrivastav M., De Haro L.P., Nickoloff J.A. (2008) Regulation of DNA•double-strand break repair pathway choice. Cell Res., 18, 134-147.

325. Shulok J.R., Klaunig J.E., Selman S.H. et al. (1986) Cellular effects of hematoporphyrin derivative photodynamic therapy on normal and neoplastic rat bladder cells. Am. J. Pathol., 122, 277-281.

326. Sieber F., O'Brien J.M., Gaffney D.K. (1992) Merocyanine-sensitized photoinactivation of enveloped viruses. Blood Cells, 18, 117-127.

327. Siede W. (1995) Cell cycle arrest in response to DNA damage: lessons from yeast. Mutat. Res., 337, 73-84.

328. Skripchenko A.D., Robinette A.D., Wagner S.J. (1997) Comparison of methylene blue and methylene violet for photoinactivation of intracellular and extracellular virus in red cell suspensions. Photochem. Photobiol., 65, 451-455.

329. Skulachev V.P. (2002) Programmed death in yeast as adaptation? FEBS Lett., 528, 23-26.

330. Smetana Z., Ben-Hur E., Mendelson E. Salzberg S, Wagner P, Malik Z. (1998) Herpes simplex virus proteins are damaged following photodynamic inactivation with phthalocyanines. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 44, 7784.

331. Song J.M., Montelone B.A., Siede W., Friedberg E.C. (4990) Effects of multiple yeast rad3 mutant alleles on UV sensitivity, mutability, and mitotic recombination. J Bacteriol., 172, 6620-6630.

332. Soukos N. S., Hamblin M. R., T. Hasan. (1997) The effect of charge on cellular uptake and phototoxicity of poly lysine chlorin e6 conjugates. Photochem. Photobiol., 65, 723-729.

333. Soukos N.S., Ximenez-Fyvie L.A., Hamblin M.R., Socransky S.S., Hasan T. (1998) Targeted antimicrobial photochemotherapy. Antimicrob. Agents Chemother., 42, 2595-2601.

334. Specht S., Leffak M., Darrow R.M., Organisciak D.T. (1999) Damage to rat retinal DNA induced in vivo by visible light. Photochem. Photobiol., 69, 9198.

335. Spesia M.B., Rovera M., Durantini E.N. (2010) Photodynamic inactivation of Escherichia coli and Streptococcus mitis by cationic zinc(II) phthalocyanines in media with blood derivatives. Eur.J.Med.Chem., 45, 198205.

336. Spikes J.D. (1989) Photosensitization. In: The Science of Photobiology (K.C.Smith, ed.). Plenum: N-Y, pp. 79-110.

337. Spikes J.D. (1990) Chlorins as photosensitizers in biology and medicine. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 6, 259-274.

338. Spikes J.D. and Jori G. (1986) Photodynamic therapy of tumours and other diseases using porphyrins. Lasers Med. Sei., 2 (3), 3-15.

339. Spikes J.D. and Straight R.C. (1987) Biochemistry of photodynamic action. In: Light-Activated Pesticides (J.R. Heitz and K.R. Downum, eds.). American Chemical Society: Washington DC, 98-108.

340. Squier T.C. (2001) Oxidative stress and protein aggregation during biological aging. Exp Gerontol., 36, 1539-155*0.

341. Stadtman E.R. (1993) Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalysed reactions. Annu. Rev. Biochem., 62, 797-821.

342. Steenvoorden D.P.T. and Beijersbergen van Henegouwen G.M.J. (1997) The use of endogenous antioxidants to improve photoprotection. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 41, 1-10.

343. Steinberg S.M., Poziomek L.G., Engelmann W.H., Rogers K.R. (1995) A review of enviromental applications of bioluminescence measurements. Chemosphere, 30, 2155-2197.

344. Stenstrom A.G., Moan J., Brunborg G., Eklund T. (1980) Photodynamic inactivation of yeast cells sensitized by hematoporphyrin. Photochem. Photobiol., 32, 349-352.

345. Stocker R., Yamamoto Y., McDonagh A.F. Glaser A.N., Ames B.N. (1987) Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance. Science, 235, 1043-1046.

346. Straight R.C. and Spikes J.D. (1985) Photosensitized oxidation of biomolecules. In: Singlet Oxygen, V. IV (A.A.Frimer, ed.). CRC Press, Boca Raton: FL, 91-143.

347. Straka J.G., Rank J.M., Bloomer J.R. (1990) Porphyria and porphyrin metabolism. Annu. Rev. Med., 41, 457-469.

348. Strauss W.S.L., Sailer R., Schneckenburger H. et al. (1997) Photodynamic efficacy of naturally occurring porphyrins in endothelial cells in vitro and microvasculature in vivo. J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 39, 176-184.

349. Streiblovä E., Hasek J., Jelke E. (1984) Septum pattern in ts mutants of Schizosaccharomyces pombe defective in genes cdc3, cdc4, cdc8 and cdcl2. J Cell Sei., 69, 47-65.

350. Suerbaum S., Michetti P. (2002) Helicobacter pylori infection. N. Engl. J. Med., 347, 1175-1186.

351. Swenson P.A. (1976) Physiological responses of Escherichia coli to far-ultraviolet radiation. In: Photochem. Photobiol. Reviews (K.C.Smith, ed.). Plenum Press: N-Y. V. 1, 269-387.

352. Symington L.S. (2002) Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair. Microbiol Mol Biol Rev., 66, 630-670.

353. Szeimies R.M., Calzavara-Pinton P., Karrer S. et al. (1996) Topical photodynamic therapy in dermatology. J. of Photochem. Photobiol. B: Biol., 36, 213-219.

354. Szocs K, Gabor F, Csik G, Fidy J. (1999) 5-Aminolaevulinic acid-induced porphyrin synthesis and photodynamic inactivation of Escherichia coli B. J. Photochem. Photobiol. B:Biol, 50, 8-17.

355. Szocs K, Csik G, Kaposi A.D., Fidy J. (2001) In situ-detection of ALA-stimulated porphyrin metabolic products in Escherichia coli B by fluorescence line narrowing spectroscopy BBA, 1541, 170-178.

356. Tegos G.P. and Hamblin M.R. (2006) Phenothiazinium antimicrobial photosensitizers are substrates of bacterial multidrug resistance pumps. Antimicrob. Agents Chemother, 50, 196-203.

357. Terleth C, van Sluis C.A, van de Putte P. (1989) Differential repair of UV damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res, 17, 4433-4439.

358. Tijssen J.P.F, Beekes H.W, Van Steveninck, J. (1981) Localization of polyphosphates at the outside of the yeast cell plasma membrane. Biochim. Biophys. Acta, 649, 529-532.

359. Tudek B, Winczura A, Janik J, Siomek A, Foksinski M, Olinski R. (2010) Involvement of oxidatively damaged DNA and repair in cancer development and aging. Am. J. Transl. Res, 2, 254-284.

360. Tyrrell R.M. (1991) UVA (320-380 nm) radiation as an oxidative stress. In: Oxidative stress. Oxidants and'antioxidants (H. Sies, ed.). Academic Press: London, 559-583.

361. Tyrrell R.M, Keyse S.M, Moraes E.C. (1991) Cellular defence against UVA (320-380 nm) and' UVB (290-320 nm) radiations. In: Photobiology (E. Piklis, ed.). Plenum Press: New York, pp. 861-871.

362. Uchida K. and Stadtman E.R-. (1992) Modification of histidine residues in i proteins by reaction* with 4-hydroxynonenal. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89,4544-4548.

363. Valenzeno D.P. (1987) Photomodification of biological membranes, with emphasis on singlet oxygen mechanisms. Photochem. Photobiol, 46, 147160.

364. Valduga G, Breda B, Giacometti G.M, Jori G„ Reddi E. (1999) Photosensitization of wild and mutant strains of Escherichia coli by meso-tetra (N-methyl-4-pyridyl)porphine. Biochem. Biophys. Res.Commun, 256, 84-88.

365. Vance J.R, Wilson T.E. (2001) Repair of DNA strand breaks by the overlapping functions of lesion-specific and non-lesion-specific DNA 3' phosphatases. Mol Cell Biol, 21, 7191-7198.

366. Van den Bergh H. (1986) Light and porphyrins in cancer therapy. Chem. Br, 22, 430-439.

367. Van der Leun J.C. (1998) Photobiology and the ozone layer. J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 44, 165-168.

368. Van der Meulen F.W, Ibrahim K, Sterenborg H.J.C.M, Alphen L.V, Maikoe A, Dankert J. (1997) Photodynamic destruction of Haemophilus parainfluenzae by endogenously produced porphyrins. J. Photochem. Photobiol. B: Biol, 40, 204-208.

369. Van Lier J.E. (1991) Photosensitization: reaction pathways. In: Photobiological Techniques (D.P. Valenzeno, R.H. Pottier, P. Mathis, R.H. Douglas, eds.). Plenum: New York, pp. 85-98.

370. Vile G.F, Basu-Modak S, Walltner C, Tyrrell R.M. (1994) Haem oxygenase 1 mediates an adaptive response to oxidative stress in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 2607-2610.

371. Von Tappeiner H. (1904) Zur Kenntnis der lichtwirkenden (fluoreszierenden) Stoffe. Dtsch. Med. Wochenschr, 1, 579-580.

372. Wagner S.J. and Skripchenko A. (2003) Investigation of photosensitizing dyes for pathogen reduction in red cell suspensions. Biotechnic and Histochemistry, 78, 171-177.

373. Wagner S.J., Skripchenko A., Robinette D., Foley J.W., Cincotta L. (1998) Factors affecting virus photoinactivation by a series of phenothiazine dyes. Photochem. Photobiol., 67, 343-349.

374. Wagnieres G.A., Star W.M., Wilson B.C. (1998) In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications. Photochem. Photobiol., 68, 603-632.

375. Wainwright M. (1998) Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J. Antimicrob. Chemother., 42, 13-28.

376. Wainwright M. (2001) Acridine a neglected antibacterial chromophore. J Antimicrob. Chemother., 47, 1-13.

377. Wainwright M. (2002) Pathogen inactivation in blood products. Curr. Med. Chem., 9, 127-143.

378. Walker S.L., Hill J.E., Redman J.A., Elimelech M. (2005) Influence of growth phase on adhesion kinetics of Escherichia coli D21g. Appl. Environ. Microbiology, 71, 3093-3099.

379. Wallace S.S. (1988) AP endonucleases and DNA glycosylases that recognize oxidative DNAdamage. Environ. Mol. Mutagen., 12, 431-477.

380. Wilkinson F., Brummer J.G. (1981) Rate constants for the decay and reactions of the lowest electronically excited singlet state of molecular oxygen in solution. J. Phys. Chem. Ref. Data, 10, 809-999.

381. Wilson M. and Mia N. (1993) Sensitisation of Candida albicans to killing by low-power laser light. J. Oral Pathol. Med., 22, 354-357.

382. Wong T.W., Tracy E., Oseroff A.R., Baumann H. (2003) Photodynamic therapy mediates immediate loss of cellular responsiveness to cytokines and growth factors. Cancer Res., 63, 3812-3818.

383. Wright A., Bubb W.A., Hawkins C.L., Davies M.J. (2002) Singlet oxygen-mediated protein oxidation: evidence for the formation of reactive side chain peroxides on tyrosine residues. Photochem. Photobiol., 76, 35-46.

384. Wyld L., Reed M.W., Brown N.J. (1998) The influence of hypoxia and pH on aminolaevulinic acid-induced photodynamic therapy in bladder cancer cells in vitro. Br. J. Cancer, 10, 1621-1627.

385. Xue L.Y., Chiu S.M., Fiebig A., Andrews D.W., Oleinick N.L. (2003) Photodamage to multiple Bcl-xL isoforms by photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc 4. Oncogene, 22, 9197-9204.

386. Zanocco A.L., Gunther G.S., Lemp E.M., de la Fuente J.R., Pizarro N.U. (1998) Kinetics and mechanism of the photosensitizes oxidation of furosemide. Photochem. Photobiol., 68, 487-493.

387. Zeina B., Greenman J., PurcelL W.M., Das B. (2001) Killing of cutaneous microbial species by photodynamic therapy. Br. J. Dermatol., 144, 274-278.

388. Zhuang S., Ouedraogo G.D., Kochevar I.E. (2003) Downregulation of epidermal growth factor receptor signaling by singlet oxygen through activation of caspase-3 and protein phosphatases. Oncogene, 22,4413-4424.

389. Ziegelhoffer E.C. and Donohue T.J. (2009) Bacterial responses to photo-oxidative stress. Nat. Rev. Microbiol., 7, 856-863.

390. Zoladec T., Nhi NiB*., Rytka J. (1996)* Saccharomyces cerevisiae mutants defective in heme biosynthesis as a tool for studing the mechanism of phototoxity of porphyrins Photochem. Photobiol., 64, 957-962.

391. Zoladec T., Nhi N.B., Jagiello I., Graczyk A., Rytka J. (1997) Diamino acid derivatives of porphyrins penetrate into, yeast cells, induce photodamage but have no mutagenic effect. Photochem. Photobiol., 66, 252-259:

392. Zolfaghari'P.S., Packer S., Singer M., Nair S.P., Bennett J., Street C., Wilson M. (2009) In vivo killing of Staphylococcus aureus using a light-activated antimicrobial agent. BMC Microbiol., 9, 27-34.

393. Zolzer F., Kiefer J. (1983) Wavelength dependence of inactivation and mutagenesis in haploid yeast cells of different sensitivities. Photochem. Photobiol., 37, 39-48.

Информация о работе

Страховская, Марина Глебовна
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Фотодинамическая инактивация микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Фотодинамическая инактивация микроорганизмов ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотодинамическая инактивация микроорганизмов"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Страховская, Марина Глебовна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотодинамическая инактивация микроорганизмов"

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Страховская, Марина Глебовна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Страховская, Марина Глебовна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотодинамическая инактивация микроорганизмов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика