Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль связывания с липидной мембраной в фотодинамическом воздействии металлофталоцианинов на ионные каналы грамицидина A

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль связывания с липидной мембраной в фотодинамическом воздействии металлофталоцианинов на ионные каналы грамицидина A"

0034842 15э

На правах рукописи

Пашковская Алина Андреевна

РОЛЬ СВЯЗЫВАНИЯ С ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНОЙ В ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ МЕТАЛЛОФТАЛОЦИАНИНОВ НА ИОННЫЕ КАНАЛЫ ГРАМИЦИДИНА А

Специальность 03.00.02 - «Биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003484215

Работа выполнена на Факультете Биоинженерии и Биоинформатики и в Научно-исследовательском Институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета имени М.В Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Антоненко Юрий Николаевич кандидат биологических наук Котова Елена Аврамовна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Соловьева Анна Борисовна

доктор биологических наук, профессор Иванов Илья Ильич

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 29 октября 2009 года в 14 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.ВЛомоносова по адресу: 119991, г. Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет, Кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 28 сентября 2009 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.501.001.96, доктор биологических наук, профессор

^дозэвэ^г

Биологический

факультет Москозского государственного шерситета имени М.ЕШом*"®8!»

1 г

-О -И гп О)

м

/£: га г

.ренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фталоциашшы - гетероциклические соединения, содержащие сопряженное кольцо тетраазатетрабензопорфина, структурно родственные порфиринам. Они широко используются как красители, молекулярные полупроводники в различных устройствах микроэлектроники, материалы для жидко-кристаллических дисплеев, катализаторы и т.д. Одной из важных областей применения этих соединений в последние десятилетия стала фотодинамическая терапия, где фталоцианины выполняют роль фотосенсибилизаторов. Для медицинского использования существенным свойством фталоцианинов является водорастворимость ряда их производных, которая достигается присоединением анионных или катионных заместителей. Среди анионных фталоцианинов популярными агентами в фотодинамической терапии стали сульфированные фталоцианины алюминия и цинка. Положительно заряженные производные фталоцианинов оказались эффективными агентами для фотодинамической инактивации бактерий, отрицательно заряженная оболочка которых препятствует проникновению анионных фотосенсибилизаторов.

Диссертационная работа посвящена изучению роли связывания фотосенсибилизаторов с мембраной в процессе фотодинамического повреждения мембранных белков на примере фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов в искусственной бислойной липидной мембране (БЛМ) в присутствии замещенных металлофталоцианинов. Актуальность темы определяется значением мембраны как одной из важнейших мишеней фотодинамического воздействия и необходимостью связывания фотосенсибилизатора с мишенью из-за малого радиуса действия активных форм кислорода, вызывающих фотодинамическое повреждение.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выяснение механизма взаимодействия катионных и анионных металлофталоцианинов с липидной мембраной, ведущего к фотодинамическому повреждению'встроенных в нее пептидов.

В работе планировалось решить следующие задачи:

1. Изучить в модельной системе на примере фотосенсибилизированной инактивации ионных каналов, образованных пентадекапептидом грамицидином А в плоских БЛМ различного липидного состава, фотодинамическую активность металлокомплексов фталоцианинов, несущих различные анионные и катионные заместители.

2. С помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии и измерения электрофоретической подвижности липосом исследовать связывание с мембранами ряда

3

анионных и катионных металлофталоцианинов в зависимости от липидного состава мембран.

3. Сопоставить данные по фотодинамической активности и связыванию фталоцианинов в различных условиях и выяснить природу взаимодействий, определяющих связывание металлофталоцианинов с фосфолипидной мембраной.

Научная новизна и практически значимость работы. В настоящей диссертационной работе впервые представлены обоснованные доказательства того, что связывание фотосенсибилизаторов с мембраной является необходимиым звеном в процессе фотодинамического воздействия на компоненты мембраны. В работе выявлены два основных типа взаимодействий, определяющих фотодинамическую активность и связывание замещенных металлофталоцианинов с мембраной: координационное взаимодействие центрального атома металла с фосфатной группой фосфолипида и электростатическое взаимодействие анионных и катионных заместителей с заряженными головками липидов. Наряду с методом фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов, разработанным в лаборатории Ю.Н. Антоненко, для изучения взаимодействия сенсибилизаторов с мембраной в работе использован метод измерения электрофоретической подвижности липосом, а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS). Этот экспериментальный подход применен для изучения связывания фотосенсибилизаторов впервые. Полученные в работе данные вносят вклад в решение фундаментальной проблемы выяснения механизма взаимодействия фотосенсибилизаторов с биологическими мембранами. Результаты работы продемонстрировали плодотворность использования комбинации биофизических методов для изучения взаимодействия фотодинамических агентов с мембранами и могут стать основой для проведения подобных исследований в других лабораториях.

Публикация и апробация работы. По результатам исследований опубликовано 8 работ, из них: одна в реферируемом научном российском журнале («Биохимия»), две в реферируемом научном зарубежном журнале («Biochimica et Biophysica Acta -Biomembranes») и 5 в тезисах конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты и их обсуждение, Выводы и Список цитируемой литературы из 163 ссылок. В работе содержится 52 рисунка и 5 таблиц.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В Литературном обзоре проанализированы имеющиеся в литературе данные о структуре и свойствах металлофталоцианинов, влиянии этих свойств на взаимодействие металлофталоцианинов с искусственными и природными мембранами, их фотодинамическую активность.

В Экспериментальной части описаны объекты и методы исследования.

Таблица 1. Структура фталоцианинов, использованных в работе

® r3 ул i=г \ X ,/ у—n n-( „^Q^AO-«, R1,R3,R5,R7= S03H r7 L R2,R4,R6,R8= H Тетрасульфированные металлофталоцианины (AlPcS«, ZnPcSi, NiPcS<) M = Al, Zn, Ni

+ R1.R3,R5,R7= CH2N(CH2CH2CH2CH3)3 CI R2.R4.R6,R8= H Тетракис(трибутиламмониометил)гидрокси-фталоцианин алюминия (AlPcN4)

+ R1,R3,R5,R7= —CI R2,R4,R6,R8= H М-тетракис(пиридиниометил)фталоцианин (AlPcPynu, ZnPcPynu) M = Al, Zn

+ R1,R3,R4,R5,R7,R8=—N^ ^ CI R2.R6= H М-гексакис(пиридиниометил)фталоцианин (AlPcPyme) M = Al

+ R1.R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8= —IN^^ CI М-октакис(пиридиниометил)фталоцианин (AlPcPyme, ZnPcPym,) M = Al, Zn

+ <fH3 R1,R2,R3,R4.R5.R6,R7,R8= CH2-N-CH2CH2OH CI CH3 Октакис[Ы-(2-гидрокС1Птил)-Ы,Ь1-диметиламмониометил]фталоцианин цинка (ZnPcCholg)

В работе использованы тетрасульфированные металлофталоцианины, полученные от фирмы «Porphyrin Products» (США), катионный фталоцианин алюминия, синтезированный на кафедре технологии тонкого органического синтеза Ивановского государственного химико-технологического университета, и серия катионных металлофталоцианинов, синтезированных в Научно-исследовательском институте органических полупродуктов и красителей (ГНЦ «НИОПИК»). Все использованные в работе липиды получены от фирмы «Avanti Polar Lipids» (США).

Фотодинамическую активность фталоцианинов измеряли с помощью метода фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов (Антоненко и др.,

2005). Измерения проводили на плоской бислойной липидной мембране, которую формировали по методике Мюллера-Рудина. Для измерения проводимости БЛМ применяли метод фиксации напряжения, в котором на мембрану подавали постоянную разность потенциалов. С одной стороны добавляли фотосенсибилизатор. Освещение производили видимым светом. Измеряли ток, индуцированный грамицидином А.

Для изучения связывания фотосенсибилизаторов был использован метод измерения электрофоретической подвижности липосом, а также метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (РСБ). Суть метода измерения электрофоретической подвижности липосом состоит в том, что сорбция молекул фотосенсибилизатора на поверхности липосом приводит к изменению их заряда и выражается в изменении электрокинетического (£) потенциала. Метод РСБ состоит в измерении флуоресценции от очень малого объема в условиях нахождения в нем небольшого числа флуоресцирующих частиц. Свободные молекулы фотосенсибилизатора в растворе дают лишь короткие всплески флуоресценции малой амплитуды. Добавление липосом приводит к появлению длительных всплесков высокой амплитуды. Для количественной оценки временных характеристик флуоресцентного сигнала вычисляется автокорреляционная функция.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.1 Наличие фосфатной группы в молекуле липнда - необходимое условие для фотодинамической активности металлофталоцианинов в липидных мембранах.

Ранее Рокицкой и соавт. (1993, 1996, 2000) было показано, что облучение БЛМ видимым светом в присутствии сульфированного фталоцианина алюминия приводит к падению тока через мембрану, индуцированного грамицидином А, сформированную из дифитаноилфосфатидилхолина (ОРЬРС). Это явление, опосредованное действием активных форм кислорода, генерируемых при возбуждении молекул фотосенсибилизатора, получило название фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов (Антоненко и др., 2005). Нами проведено сравнительное изучение кинетики фотоинактивации грамицидина в БЛМ, сформированных из ВРЬРС, фосфолипида, несущего два остатка фитановой кислоты, и БЛМ из глицеролмоноолеата -липида, не содержащего фосфатной группы и несущего один остаток олеиновой кислоты.

Рис.1. Кинетика фотоинактивации грамицидиновых каналов в БЛМ из ОРЬРС или глицеролмоноолеата после освещения мембраны фотовспышкой: кривая 1 -в присутствии 1 мкМ А1Рс$4, кривая 2 - в присутствии 1 мкМ бенгальского розового, кривые 1 и 2 - на мембране из глицеролмоноолеата, кривая 3 - в присутствии 6 мкМ А1Рс$4 на мембране из ОРЬРС .

На Рис.1 представлены кинетики подавления тока через мембрану,

сформированную из

глицеролмоноолеата (кривые 1 и 2) или ОРЬРС (кривая 3). С транс-стороны мембраны добавляли фотосенсибилизатор А1Рс54 (кривые 1 и 3) или бенгальский розовый (кривая 2). После этого в начальный момент регистрации тока производилась вспышка

света. Как можно видеть, в случае, когда мембрану формировали из ОРЬРС,

вспышка света в присутствии АШсБ« приводила к подавлению тока на 15% (Рис.1, кривая 3). В случае добавления /\lPcS4 к мембране из глицеролмоноолеата подавления тока после вспышки света не наблюдалось (Рис.1, кривая 1). В присутствии бенгальского розового, напротив, наблюдалось существенное уменьшение тока (на 50%) после вспышки света.

На Рис. 2 освещение мембраны осуществлялось в течение 20 с помощью источника постоянного света. Добавление 1 мкМ А1Рс84 к БЛМ из ОРЬРС приводило к повреждению грамицидиновых каналов на А=50 % (Рис.2, кривая 2). Величина А, называемая амплитудой фотоинактивации, отражает долю поврежденных каналов А=((1о-1)1о)-1О0 %. В отсутствие фотосенсибилизатора освещение не приводило к фотоинактивации грамицидиновых каналов (Рис.2, кривая 1).

100

25

Действие видимого света

А, °/с

20

40

время, с

80

100

Рнс.2. Кинетика фотоинактивации грамицидиновых каналов в БЛМ из DPhPC при освещении источником постоянного света. Кривая 1 - в отсутствие фотосенсибилизатора, кривая 2 - в присутствии 1 мкМ AIPcSí, кривая 3 - в присутствии 1 мкМ AIPcSí и 1 мМ KF. Буферный раствор содержал 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН 7.

Рис.3. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации AlPcS4. Кривая 1 — буферный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН=7. Кривая 2 — буферный раствор содержал 100 мМ КН2Р04, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.

концентраций по отношению к таковой в буфере,

Отсутствие фотодинамической активности AlPcSi в мембране из глицеролмоноолеата, в

совокупности с данными Рокицкой и соавт. (2000) о необходимости связывания

фотосенсибилизаторов с

липидной мембраной для эффективного фотодинамического воздействия на встроенные в мембрану молекулы грамицидина,

позволяет нам предположить, что связывание алюмофталоцианина с фосфолипидной мембраной опосредовано фосфатной группой фосфолипида.

Это предположение было проверено в опытах по влиянию добавления фосфата калия в среду на фотодинамическую активность AIPCS4. Замена 100 мМ KCl в буферном растворе на 100 мМ КН2РО4 приводила к существенному ослаблению фотоинактивации грамицидиновых каналов в мембране из DPhPC в присутствии AlPcSi (Рис.3, кривые 1 и 2). Зависимость амплитуды фотоинактивации от концентрации AIPCS4 в фосфатном буфере сместилась на 2 порядка в сторону больших содержащем KCl. Таким образом,

полученные данные подтвердили нашу гипотезу о важной роли, которую в процессе связывания красителей с фосфолипидной мембраной играет взаимодействие центрального атома металла фталоцианинов с фосфатными группами фосфолипидов. 1.2 Зависимость эффективности фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в присутствии металлофталоцианинов от природы центрального атома металла.

В настоящей работе были изучены тетрасульфированные фталоцианины, содержащие в качестве центрального атома металла атомы алюминия, цинка и никеля. Кроме того, был исследован также положительно-заряженный фталоцианин алюминия, а именно тетра(трибутиламмонийметил)гидрокси-фталоцианин алюминия (Д1РсЫ4). На Рис.4 представлены зависимости амплитуды фотоинактивации грамицидиновых каналов

На Рис.4 видно, что из исследованных фотосенсибилизаторов катионный фталоцианин

алюминия, А1РсЫ4, проявлял наибольшую фотодинамическую активность в данной системе, т.е. вызывал подавление активности грамицидиновых каналов при наиболее низких концентрациях (Рис.4, кривая 1). №Рс84 фотоинактивацию

грамицидина не вызывал (Рис.4, кривая 4). Если сравнивать фотодинамическое действие гпРс84 и А1Рс84, то цинкфталоцианин является более эффективным

фотосенсибилизатором в данной системе, чем алюмофталоцианин (Рис.4, кривые 2 и 3).

Различия в фотодинамической активности ряда фталоцианинов могут быть

обусловлены различиями в 1) квантовом выходе генерации синглетного кислорода (Фа) и

2) связывании с мембраной. Согласно результатам наших измерений (по кинетике

светозависимого падения флуоресценции 9,10-диметилантрацена), Фд для

9

от концентрации A1PcN4, A1PcS4, ZnPcS4 и NiPcS4.

С. M

Рис.4. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 -AlPcKt, кривая 2 - ZnPcS4, кривая 3 - AlPcS4, кривая 4 -N1PCS4. Буферный раствор содержал 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН 7.

тетракатионного фталоцианина алюминия, растворенного в DM.SC), несколько меньше Фд для 7,пРс8д в тех же условиях (Таблица 2). Эти данные не соответствуют различиям в фотодинамической активности А1РсЫ4 и 7.пРс84 (Рис.4).

Таблица 2. Квантовый выход генерации синглетного кислорода (Фд) различными металлофталоцианинами

Фд

ZnPcS4 0,68

A1PcN4 0,6

A1PcS4 0,1

NÍPcS4 0

AIPcN4+KF 0,63

1.3 Связывание с липидной мембраной ряда металлофталоцианииов в сравнении с фотодинамическим воздействием этих сенсибилизаторов на грамицидиновые каналы.

На Рис.5 представлена зависимость ¡¡-потенциала

липосом из яичного

фосфатидилхолина от

концентрации фотосенсибилизаторов. Видно, что добавление А1РсМ4 (кривая 1) приводит к более значительному росту абсолютной величины электрокинетического потенциала, чем добавление тетрасульфированных фталоцианинов цинка и алюминия (кривые 2 и 3). Это показывает, что А1РсН4 эффективнее связывается с липосомами из фосфатидилхолина, чем Л1Рс84 и 7пРс54. В случае добавления №Рс84 электрофоретическая подвижность липосом не изменялась (кривая 4), т.е. этот краситель не сорбировался на поверхности липосом.

с. мкм

Рис.5. Зависимость Ç-потенциала липосом из яичного фосфатидилхолина от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 - A1PcN4, кривая 2 -ZnPcS4, кривая 3 - AIPCS4, кривая 4 - NiPcS4. Буферный раствор содержал 10 мМ КС1, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, рН 7.

Таким образом, данные по злектрофоретической подвижности липосом в присутствии заряженных фталоцианинов коррелируют с измерениями их фотодинамической активности, позволяя сделать вывод о том, что именно различия в связывании с липидом являются причиной различий в фотодинамическом действии.

В силу важности полученной корреляции были проведены опыты по измерению связывания фталоцианинов с мембраной другим методом, а именно методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии (РСБ). Экспериментальная установка представляет собой микрофлуориметр, регистрирующий флуоресценцию Р лишь от малого объема, по порядку величины составляющего 10"15 литра. Для возбуждения флуоресценции применяли Не-Ые лазер с длиной волны 633 нм. Для количественной обработки флуктуирующего сигнала Р(1) производится вычисление автокорреляционной функции:

С(г)

{SF{t)SF{t + v))

(1)

где (f(i)) - средняя интенсивность флуоресценции, а /■'(/)-{/•"(<)) - отклонение от среднего значения. Для случая трехмерной диффузии частиц функция G(t) имеет вид:

(2),

( ^ / \

1 1 1

N I + -L

1 ^J И - °-rJ

где N - среднее число флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме, го -геометрические характеристики конфокального объема, Та - среднее время нахождения в конфокальном объеме, которое определяется размером частиц.

На Рис.6 представлены данные по связыванию А1Рс54 (правая панель) и А!РеN4 (левая панель) с мембранами липосом, приготовленных из яичного фосфатидилхолина. Приведены типичные сигналы флуоресценции фотосенсибилизаторов, которые в данной шкале имеют вид прямой линии (панели А и В, кривые 1). Ниже приведены автокорреляционные функции двух красителей, характерное время корреляции которых составляет около 100 мкс (панели Б и Г). Средний ряд графиков соответствует добавлению липосом (панели А и В, кривые 2 и 3). Видно, что в случае АИ'с^ в записи флуоресценции появляются длительные пики высокой амплитуды (Рис.6, панель А, кривая 2) и происходит сдвиг автокорреляционной функции в область более

продолжительных времен (Рис.6, панель Б, кривая 2). Оба наблюдения свидетельствуют о связывании красителя с мембранами липосом.

А В

Рис.6. Связывание AlPcNi (левая часть, панели А, Б) и AIPCS4 (правая часть, панели В, Г) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Записи сигнала флуоресценции (панели А, В) и автокорреляционные функции (панели Б, Г). Кривые 1 -контроли, измеренные в отсутствие липосом, в присутствии 300 нМ AIPCN4 (левая часть) и 300 нМ AlPcSi (правая часть); кривые 2 - в присутствии 0,0067 мг/мл липосом; кривые 3 - в присутствии 0,67 мг/мл липосом. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель Б, кривая 1 -0,103 мс; кривая 2 - 0,20 мс (14 %) и 11 мс (86 %); кривая 3 - 0,126 мс (18 %) и 9,2 мс (82 %); панель Г, кривая 1 - 0,066 мс; кривая 2 - 0,072 мс; кривая 3 - 0,076 мс (72 %) и 9,6 мс (28 %).

1.3 Сравнение действия фторид-иона иа фотоннактнвацию грамицидиновых каналов, сенсибилизированную положительно и отрицательно заряженными металлофталоцианинами.

Ранее было показано, что добавление фторид-ионов приводит к подавлению фотоинактивации грамицидиновых каналов в присутствии сульфированных фталоцианинов алюминия и десорбции этих фотосенсибилизаторов с поверхности нейтральных липидных мембран (Кокцзкауа е1 а1., 2000). Этот результат трактовался как следствие возрастания отрицательного заряда красителя при присоединении аниона фторида к центральному атому алюминия в молекуле алюмофталоцианина. Такая трактовка предполагала, что добавление фторид-ионов должно вызывать возрастание сорбции Л1РсЫ4 на поверхности липосом вследствие уменьшения общего положительного заряда молекулы при связывании аниона фторида, приводящего к повышению липофильности молекулы. Однако поставленные нами опыты не подтвердили данного

Как видно на Рис.2 (кривая 3), добавление 1 мМ КИ приводит к почти полному снятию действия света на грамицидиновые каналы в присутствии Л1Рс84, в соответствии с данными, полученными Рокицкой и соавт. (2000). На Рис.7 представлена зависимость нормированной

амплитуды фотоинактивации

грамицидиновых каналов от концентрации фторид-анионов для ряда фотосенсибилизаторов: гпРс34, А1Рс54 и А1РсЬГ4.

Согласно полученным

данным, фторид калия подавляет фотоинактивацию грамицидиновых каналов в нейтральных мембранах в присутствии А1РсК4 (Рис.7, кривая 2), так же как и в присутствии А1Рс84 (Рис.7, кривая 3) и не действует на фотодинамическую активность 7пРс84 (Рис.7, кривая 1).

KF, мМ

Рис.7. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации фторида калия. Кривая 1 - ZnPcS4, кривая 2 - A1PcN4, кривая 3 - A1PcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН 7.

1.4 Сравнение влияния фторид-иона на связывание с мембраной положительно я отрицательно зараженных металлофталоциавинов.

13

А

Б

о

10' 10г 10" 1С 10' 10"

10'

10> 10' 105

т, МКС

Т, МКС

Рис.8 Действие KF на связывание AIPcN4 (А) и AIPCS4 (Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривые 1 - автокорреляционные функции без липосом, в присутствии 300 нМ A1PcN4 (А) и A1PcS4 (Б); кривые 2 - в присутствии 0,67 мг/мл липосом; кривые 3 - после добавления 1 мМ KF; кривая 4 - после добавления 10 мМ KF. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами: панель А, кривая 1-0,1 мс; кривая 2-0,1 мс (22 %) и 7,3 мс (78 %); кривая 3-0,14 мс (77 %) и 10,6 мс (23 %); кривая 4-0,15 мс. панель Б, кривая 1 - 0,09 мс; кривая 2 - 0,07 мс (69 %) и 6,3 мс (31 %); кривая 3 - 0,08 мс.

На Рис.8 показано влияние фторид-аниона на связывание A1PcN4 и AlPcS4 с

мембранами липосом из яичного фосфатидилхолина, измеренное методом FCS. В случае A1PcN4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции (Рис.8, панель А, кривая 2). Добавление KF вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель А, кривая 4). В случае AiPcS4 добавление липосом приводит к появлению плеча на автокорреляционной функции, но это не так ярко выражено, как в случае катионного алюмофталоцианина (Рис.8, панель Б, кривая 2). Добавление фторида калия к липосомам с тетрасульфированным алюмофталоцианином вызывает исчезновение этого плеча (Рис.8, панель Б, кривая 3). При сравнении кривой 2 (панель А) в отсутствие KF и кривой 4 (панель А) в присутствии 10 мМ KF видно, что как и в случае AlPcS4 (Рис.8, панель Б, кривые 2 и 3), фторид-ион вызывает десорбцию AlPcN4 с поверхности мембран липосом.

Таким образом, данные по фотоинактивации грамицидиновых каналов коррелируют с данными, полученными методом FCS, о том, что фторид-анион вызывает десорбцию A1PcN4 с поверхности мембраны.

1.5 Действие анионов фторида и фосфата на спектры флуоресценции металлофталоцианинов.

При измерении спектров флуоресценции выявлен коротковолновый сдвиг положения максимума в спектре флуоресценции AlPcN4 в этаноле под действием фторид-

ионов (Рис. 9), аналогичный сдвигу для А1Рс$4, что свидетельствует об образовании комплекса фторида-иона с фталоцианином алюминия. Подобный сдвиг наблюдался в наших экспериментах и под действием фосфат-иона.

Рис. 9. Спектры флуоресценции А1РсЫ4 (а) и А1Рс84 (б) в этаноле в отсутствие (сплошные линии) и в присутствии 1 мМ КИ (штриховые линии).

На основании полученных данных нами выдвинута гипотеза о важной роли координационного взаимодействия центрального атома металла фталоцианина с фосфатной группой липида в связывании металлофталоцианинов с фосфатидилхолиновой мембраной. Кроме того, мы предполагаем, что на эффективность координационного взаимодействия центрального атома металла фталоцианинов с фосфатной группой липида значительное влияние оказывает электрическое поле, которое создают заряды, расположенные на периферии молекулы фталоцианина. Четыре отрицательных заряда в случае А1Рс54 существенно препятствуют взаимодействию красителя с фосфатной группой липида, в то время как четыре положительных заряда в случае А1РсЫ4 такое взаимодействие облегчают (Рис.10).

Эффект фторид-ионов хорошо объясняется в рамках предположения о том, что связывание А1РсМ4 с фосфолипидной мембраной, так же как и в случае сульфированных металлофталоцианинов, определяется координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида, которая может быть вытеснена из

А Ме / - -

О О -к 0 1

Б Аш / +

+ . +

Л 1 0 1

Рис.10. Схема взаимодействия А1РсБ4 (А) и А1РсИ4 (Б) с фосфатными группами липидов.

координационной сферы алюминия вследствие конкурентного замещения фторид-ионом (Рис.11).

Рис.11. Схема комплексообразования КР с А1Рс8д, которое приводят к десорбции А1Рс8д с поверхности мембраны.

2.1 Влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов.

Для изучения влияния заряда мембраны на эффективность связывания были поставлены опыты с отрицательно заряженными липосомами (из фосфатидилсерина мозга быка) и положительно заряженными липосомами (с добавлением цетилтриметиламмония, СТАВ).

А

Б

1.05

л 1.04 о

1.03

1.01

1.02

Л

1.00

10' 102 10J 10* 10* 10е т, МКС

10' да ю> 10* ю' ю" I. мкс

Рнс.12. Влияние СТАВ на связывание AlPcNj (панель А) и A1PcS4 (панель Б) с фосфатидилхолиновыми липосомами, измеренное методом FCS. Кривая 1 автокорреляционная функция в отсутствие липосом, в присутствии 300 нМ AIPcN4; кривая 2 - в присутствии 0,67 мг/мл липосом; кривая 3 - после добавления 200 мкМ СТАВ. Экспериментальные данные хорошо аппроксимируются теоретической кривой (2) со следующими параметрами ru: панель А (AIPCN4) кривая 1-114 мкс; кривая 2-116 мкс (19 %), 6900 мкс (81 %); кривая 3 - 100 мкс (87 %), 6200 мкс (13 %); панель Б (A)PcSj) кривая 1 - 66 мкс; кривая 2-74 мкс (85 %), 7700 мкс (15 %); кривая 3 - 6600 мкс.

На Рис.12 представлены данные, полученные методом FCS, по влиянию положительно заряженного амфифильного вещества СТАВ на связывание AIPCN4 (панель А) и A1PcS4 (панель Б) с липосомами, приготовленными из яичного фосфатидилхолина. В случае AlPcNi добавление липосом вызывает сдвиг автокорреляционной функции в сторону больших времен (Рис.12, панель А, кривая 2). Добавление СТАВ приводит к практически полному возвращению автокорреляционной функции к контролю (Рис.12, панель А, кривая 3). В случае AIPCS4, в согласии с ранее описанными данными, добавление липосом не вызывает значительных изменений автокорреляционной функции (Рис.12, панель Б, кривая 2), тогда как добавление СТАВ к липосомам из фосфатидилхолина в присутствии AlPcSi приводит к значительным изменениям (Рис.12, панель Б, кривая 3). Автокорреляционная функция при этом сдвигается вправо, т.е. введение положительного заряда на поверхность нейтральных липосом увеличивает связывание анионного алюмофталоцианина.

Мы также изучили влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных фталоцианинов другим способом, а именно: методом измерения ^-потенциала липосом. На Рис.13 представлена зависимость ¡^-потенциала отрицательно заряженных липосом, приготовленных из липида E.coli, от концентрации фотосенсибилизаторов. Добавление катионного фотосенсибилизатора AIPCN4 к таким липосомам приводило к резкому изменению электрофоретической подвижности (Рис.13, кривая 1), что выражалось в

изменении знака ¡^-потенциала. В случае анионных фотосенсибилизаторов электрофоретическая подвижность липосом изменялась слабо. Можно заключить, что анионные фталоцианины не сорбировались на поверхности отрицательно заряженных липосом (Рис. 13, кривые 2, 3, 4).

Из данных по измерению ¡^-потенциала следует, что A1PcN4 наиболее эффективно из изученного ряда

фотосенсибилизаторов связывается как с отрицательно заряженными липосомами из липида Е. coli (Рис.13), так и с нейтральными липосомами из фосфатидилхолина (Рис.5).

2.2 Значение электростатического взаимодействия с липидпон мембраной для фотодинамической активности металлофталоцианинов.

На Рис.14 представлены зависимости амплитуды фотоинактивации грамицидиновых каналов в присутствии А1РсМ4, А1Рс84 и 2пРс$4 для мембран, содержащих кислые липиды. Ранее (Рис.4) аналогичные данные были показаны для мембраны из нейтрального липида (ОРЬРС). Сравнение этих двух рисунков показывает существенно большую разницу в активности изученных фотосенсибилизаторов на отрицательно заряженных мембранах, приготовленных из смеси БРЬРС и анионного липида дифитаноилфосфатидилглицерола (ПРИРв), чем на нейтральных мембранах.

Рис.13. Зависимость ¡^-потенциала липосом, приготовленных из липида E.coli, от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 - AIPCN4, кривая 2 -ZnPcS4, кривая 3 - A1PcS4, кривая 4 - NiPcS«. Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, pH 7.

Данные по

фотоинактивации грамицидиновых каналов хорошо коррелируют с результатами измерений С,-потенциала. Учитывая

данные по квантовому выходу генерации

синглетного кислорода для гпРс54, А1Рс84 и А1РсЫ4 (Таблица 2), можно заключить, что

существенные различия в фотодинамической активности положительно и отрицательно заряженных фталоцианинов на липидных мембранах, и в особенности на тех, которые содержат анионные липиды, объясняются различиями в связывании фталоцианинов. Эти результаты свидетельствуют о значительном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания заряженных фталоцианинов с мембраной.

Мы провели систематическое исследование фотодинамической активности (по фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов) и связывания с фосфолипидной мембраной (по изменению электрофоретической подвижности липосом) целого ряда тетра-, гекса- и октакатионных металлофталоцианинов, полученных из НИОПИК, в сравнении с тетрасульфированными металлофталоцианинами.

Оказалось, что на нейтральной мембране из ОРЬРС эффективнее действуют тетрасульфированные фталоцианины цинка и алюминия (Рис. 15, кривые 1 и 2), чем октакатионные металлофталоцианины (Рис. 15, кривые 3, 4 и 5).

Рис.14. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из смеси DPhPC/DPhPG (70/30%) от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 - A1PcN4, кривая 2 - ZnPcS4, кривая 3 - A1PcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН 7.

100x10 е 1x10е 10x10" 100x10-' 1x10» 10x10» 100x10»

С, мМ

Рис. 15. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из DPhPC от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 - ZnPcS4, кривая 1 -AlPcS4, кривая 3 - ZnPcPymg, кривая 4 - AIPcPymg, кривая 5 - ZnPcCholg. Буферный раствор содержал 100 мМ KCl, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, pH 7.

На отрицательно

заряженной мембране

наблюдаются более

значительные различия в фотодинамической активности катионных и анионных фото сенсибилизаторов, причем катионные

фталоцианины действуют при гораздо меньших

концентрациях (Рис. 16,

кривые 1, 2 и 3), чем анионные фталоцианины (Рис.16, кривые 4 и 5).

Рис.16. Зависимость амплитуды фотоинактивации грамицидина А в мембране из смеси DPhPC/DPhPG (70/30%) от концентрации фотосенсибилизаторов. Кривая 1 - ZnPcCholg, кривая 2 -AIPcPymg, кривая 3 - ZnPcPymg, кривая 4 -AIPCS4, кривая 5 - ZnPcS4. Буферный раствор содержал 100 мМ КС1, 10 мМ MES, 10 мМ Tris, рН 7.

Рис.17. Зависимость Ç-потенциала липосом, приготовленных из липида E.coli, от концентрации фталоцианинов. Кривая 1 -AIPcPymg, кривая 2 - ZnPcPymg, кривая 3 -AIPCS4, кривая 4 - ZnPcS4. Буферный раствор содержал 10 мМ KCl, 5 мМ MES, 5 мМ Tris, pH 7.

На Рис.17 видно, что добавление А1РсРут8 и 7пРсРуш* вызывает значительно больший рост абсолютной величины электрокинетического потенциала в случае липосом,

образованных из липида E.coli (кривые 1 и 2), чем добавление тетрасульфированных алюмо- и цинкфталоцианинов (кривые 3 и 4). Следовательно, ЛН'сРут» и ZnPcPym8 эффективнее связываются с липосомамн из E.coli, чем AlPcSi и ZnPcS,|.

Эти данные позволяют нам заключить, что значительно большая эффективность октакатионных фталоцианинов по сравнению с анионными фталоцианинами в фотоинактивации грамицидиновых каналов в отрицательно заряженной мембране связана с различным сродством этих фотосенсибилизаторов к мембране.

Одним из основных результатов настоящей работы явилось доказательство корреляции между связыванием фталоцианинов с мембраной и эффективностью их фотодинамического воздействия. Эта корреляция, уже отмеченная ранее (Rokitskaya et al., 2000), находится в соответствии с локальным характером действия генерируемых сенсибилизатором активных форм кислорода. Другим значительным результатом работы стало выявление нового фактора, определяющего процесс связывания металлофталоцианинов с мембранами, а именно координационной связи центрального атома металла с фосфатной группой фосфолипида. Особенно важным этот вид взаимодействия становится в случае многозарядных гидрофильных фталоцианинов, которые нашли применение как при фотодинамической терапии рака (сульфированные фталоцианины), так и в качестве антибактериальных агентов (поликатионные фталоцианины). Ранее в литературе было показано, что для связывания некоторых ионов металлов с липидными мембранами необходимо наличие на их поверхности фосфатных групп (Ермаков и др., 1992). Однако, большое значение координационного взаимодействия с фосфатными группами фосфолипидов в случае металлофталоцианинов было установлено впервые. Из литературы было также известно, что связывание с мембранами заряженных молекул существенно зависит от поверхностного потенциала мембраны (McLaughlin, 1989). Однако не было данных об электростатическом взаимодействии фталоцианинов с мембранами, имеющими различный поверхностный заряд. В настоящей работе не только изучено такое взаимодействие, но и продемонстрирована его значительная роль в фотодинамическом действии фталоцианинов.

ВЫВОДЫ:

1. Фотодинамическая активность металлокомплексов фталоцианинов, несущих различные анионные и катионные заместители, изучена в модельной системе на примере фотодинамической инактивации грамици липовых каналов в плоских бислойных мембранах различного липидного состава. Показано, что фталоцианины алюминия и цинка, имеющие от 4 до 8 положительно заряженных заместителей, так же как и сульфированные фталоцианины с такими же центральными атомами, проявляют высокую активность в данной системе.

2. Продемонстрировано ингибирующее влияние фторид-анионов на фотодккамическую активность как анионных, так и катионкых фталоцианинов алюминия.

3. С помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, а также измерения электрофоретической подвижности липосом исследовано связывание замещенных металлофталоцианинов с бислойными липидными мембранами. Полученные концентрациоонные зависимости связывания изученных фталоцианинов коррелируют с соответствующими зависимостями их активности, измеренной по фотоинактивации грамицидиновых каналов.

4. Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что связывание замещенных металлофталоцианинов с фосфолипидной мембраной определяется в значительной степени координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида.

5. Обнаружена существенная зависимость фотодинамической активности замещенных фталоцианинов цинка и алюминия от заряда липидной мембраны. Качественные различия в этой зависимости для фталоцианинов с катионными и анионными заместителями свидетельствуют о значительном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания металлофталоцианинов с мембраной.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Pashkovskaya А.А., Sokolenko Е.А., Sokolov V.S., Kotova E.A., Antonenko Y.N., Photodynamic activity and binding of sulfonated metallophthalocyanines to phospholipid membranes: contribution of metal-phosphate coordination. Biochim. Biophys. Acta -Biomembranes 1768 (10), 2459-2465,2007.

2. Pashkovskaya A.A., Maizlish V.E., Shaposhnikov G.P., Kotova E.A., Antonenko Y.N. Role of electrostatics in the binding of charged metallophthalocyanines to neutral and charged phospholipid membranes. Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes 1778 (2), 541-548,2008.

3. Пашковская A.A., Перевощикова И.В., Майзлиш B.E., Шапошников Г.П., Котова Е.А., Антоненко Ю.Н. Взаимодействие тетразамещенного катионного фталоцианина алюминия с искусственными и природными мембранами. Биохимия, 74 (9), 1252-1259,2009.

4. Пашковская А.А., Котова Е.А., Дурантини Э.Н., Антоненко Ю.Н. Сравнение фотосенсибилизирующего действия отрицательно и положительно заряженных фталоцианинов в модельной мембранной системе. IV Съезд фотобиологов России, 2005, С. 155.

5. Pashkovskaya А.А., Sokolenko Е.А., Sokolov V.S., Kotova E.A., Antonenko Y.N. Metal-phosphate coordination determines the adsorption and photodynamic activity of sulfonated metallophthalocyanines on phospholipid membranes. XII Congress of the European Society for Photobiology, 2007, P. 150.

6. Sokolenko E.A., Pashkovskaya A.A., Kotova E.A., Sokolov V.S., Antonenko Y.N. Interaction of sulfonated metallophthalocyanines with bilayer lipid membranes: photochemical activity versus adsorption on the membrane surface. 51st Biophysical Society Annual Meeting, 2007, P.239a.

7. Пашковская A.A., Котова E.A., Майзлиш B.E., Антоненко Ю.Н. Фотосенсибилизированное повреждение ионных каналов грамицидина А в бислойной липидной мембране в присутствии катионных металлофталоцианинов: роль связывания фотосенсибилизатора с мембраной. V Съезд Российского фотобиологического общества, 2008, С. 173.

8. Pashkovskaya A., Kotova Е., Strakhovskaya М., Kireev V., Kuznetsova N., Yuzhakova О., Antonenko Y. Impact of electrostatic interactions with membranes on photodynamic activity of cationic phthalocyanines. V International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines, 2008, P. 508.

Подписано в печать 24.09.09 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 842 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Пашковская, Алина Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1.1.1 Введение

1.2 Фотосенсибилизированные реакции в биологических системах

1.3 Фотосенсибилизаторы

1.3.1 Порфирины

1.3.2 Фталоцианины

1.3.2.1 Металлосодержащие фталоцианины

1.3.2.2 Анионные металлосодержащие фталоцианины

1.3.2.3 Катионные металлосодержащие фталоцианины

1.3.2.4 Эффекты координации фталоцианинов и порфиринов

1.3.2.5 Стерические эффекты координации фталоцианинов

1.4 Взаимодействие фотосенсибилизаторов с мембранами 24 1.4.1 Локализация фотосенсибилизаторов по отношению к мембране

1.5 Состав биологических мембран 25 1.5.1 Липидные компоненты мембран

1.5.1.1 Фосфатидилглицерины

1.5.1.2 Глицеролмоноолеат

1.6 Фотодинамическое воздействие фотосенсибилизаторов на липидные компоненты мембран

1.7 Фотодинамическое воздействие фотосенсибилизаторов на белковые компоненты мембран

1.8 Фотодинамическая инактивация микроорганизмов

1.9 Фото динамическая инактивация митохондрий 38 2 Фотодинамическая терапия

2.0.1 Направленное фотодинамическое действие

3.0 Фото динамическая инактивация грамицидиновых каналов в искусственной липидной мембране

3.0.1 Структура грамицидина 45 3.0.2 Механизм фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов

3.0.3 Кинетика фотоинактивации грамицидиновых каналов

3.0.4 Значение связывания с мембраной для фото динамической активности металлофталоцианинов на примере фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов

4 Материалы и методы

4.1 Используемые материалы

4.1.1 Липиды

4.1.2 Фотосенсибилизаторы

4.1.3 Каналоформер

4.1.4 Поверхностно активные вещества

4.1.5 Буферные растворы

4.2 Ячейки и электроды

4.3 Формирование мембран

4.4 Источники света

4.5 Измерение проводимости мембраны при постоянном потенциале

4.6.1 Метод сенсибилизированной фотоинактивации

4.6.2 Метод измерения электрофоретической подвижности

4.6.3 Метод определения квантового выхода

4.6.4 Метод флуоресцентной конфокальной спектроскопии

5 Результаты 64 5.1 Значение координационного взаимодействия между центральным атомом металла в металлокомплексах фталоцианинов и фосфатной группой фосфолипидов мембраны для фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов

5.1.1 Наличие фосфатной группы в молекуле липида - необходимое условие для фотодинамической активности металлофталоцианинов в липидных мембранах. Ослабление фотодинамического воздействия металлофталоцианинов на грамицидиновые каналы при добавлении фосфата в омывающий мембрану раствор

5.1.2 Зависимость эффективности фото динамического подавления работы грамицидиновых каналов в присутствии металлофталоцианинов от природы центрального атома металла

5.1.3 Сравнение эффекта фторид - иона на связывание с мембраной положительно и отрицательно заряженных металлофталоцианинов, измеренное методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии, и его влияния на фотодинамическое воздействие этих фотосенсибилизаторов на грамицидиновые каналы

5.1.4 Действие анионов фторида и фосфата на спектры флуоресценции металлофталоцианинов

5.2 Значение электростатического взаимодействия с липидной мембраной для фотодинамической активности металлофталоцианинов

5.2.1 Влияние заряда мембраны на связывание катионных и анионных металлофталоцианинов, измеренное методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии

5.2.2 Сравнение фото динамической инактивации грамицидиновых каналов, сенсибилизированной катионными и анионными металлофталоцианинами, в мембранах, имеющих различный поверхностный заряд

5.2.3 Влияние ионной силы раствора на фото динамическую активность катионных фталоцианинов в отрицательно заряженной мембране

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль связывания с липидной мембраной в фотодинамическом воздействии металлофталоцианинов на ионные каналы грамицидина A"

Фталоцианины — гетероциклические соединения, содержащие цикл тетраазатетрабензопорфина, структурно родственные порфиринам. Они широко используются как красители, молекулярные полупроводники в различных устройствах микроэлектроники, • материалы для жидко-кристаллических дисплеев, катализаторы и т.д. Одной из важных областей применения этих соединений в последние десятилетия стала фотодинамическая терапия, где фталоцианины выполняют роль фотосенсибилизаторов [1-3]. Для медицинского использования существенным свойством фталоцианинов является водорастворимость ряда их производных, которая достигается присоединением анионных или катионных заместителей [4]. Среди анионных фталоцианинов популярными соединениями в фотодинамической терапии стали, сульфированные фталоцианины алюминия- и цинка [5]. Положительно заряженные производные фталоцианинов оказались эффективными агентами для фото динамической инактивации бактерий [6, 7], отрицательно заряженная оболочка которых препятствует проникновению анионных фотосенсибилизаторов.

Согласно результатам многих исследований, биологические мембраны являются одной из основных мишеней фотодинамического воздействия [8, 9], поэтому актуальной задачей становится выяснение механизма взаимодействия фталоцианинов с мембранами. Показано, что фталоцианины, содержащие диамагнитный центральный атом, обладают способностью с высоким квантовым выходом генерировать синглетный кислород [10], который, как известно, является высокоактивным цитотоксическим агентом. Исходя из ограниченности сферы действия синглетного кислорода в биологических средах расстояниями порядка толщины мембраны [11], можно заключить, что для эффективного фотодинамического воздействия на компоненты мембраны необходимо связывание фотосенсибилизаторов с мембраной. В работе Рокицкой и соавторов [12] проблема взаимосвязи фотодинамической активности сенсибилизаторов с их связыванием с мембраной была изучена в модельной системе на примере фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в присутствии ряда сульфированных фталоцианинов алюминия. Полученные результаты свидетельствовали о корреляции способности фталоцианинов фотоинактивировать грамицидиновые каналы со сродством к липидному бислою, однако механизм связывания фталоцианинов с мембранами оставался неясен. Нам представлялось чрезвычайно актуальным детально изучить процесс связывания с липидными мембранами и его значение для фотодинамической активности фталоцианинов, в частности, для фотосенсибилизированного повреждения мембранных белков.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пашковская, Алина Андреевна

7 Выводы:

1. Фотодинамическая активность металлокомплексов фталоцианинов, несущих различные анионные и катионные заместители, изучена в модельной системе на примере фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в плоских бислойных мембранах различного липидного состава. Показано, что фталоцианины алюминия и цинка, имеющие от 4 до 8 положительно заряженных заместителей, так же как и сульфированные фталоцианины с такими же центральными атомами, проявляют высокую активность в данной системе.

2. Продемонстрировано ингибирующее влияние фторид-анионов на фотодинамическую активность как анионных, так и катионных фталоцианинов алюминия.

3. С помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии, а также измерения элекгрофоретической подвижности липосом исследовано связывание замещенных металлофталоцианинов с бислойными липидными мембранами. Полученные концентрациоонные зависимости связывания изученных фталоцианинов коррелируют с соответствующими зависимостями их активности, измеренной по фотоинактивации грамицидиновых каналов.

4. Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что связывание замещенных металлофталоцианинов с фосфолипидной мембраной определяется в значительной степени координационным взаимодействием центрального атома металла с фосфатной группой липида.

5. Обнаружена существенная зависимость фото динамической активности замещенных фталоцианинов цинка и алюминия от заряда липидной мембраны. Качественные различия в этой зависимости для фталоцианинов с катионными и анионными заместителями свидетельствуют о значительном вкладе электростатического взаимодействия в процесс связывания металлофталоцианинов с мембраной.

6 Заключение

Одним из основных результатов настоящей работы явилось доказательство корреляции между связыванием фталоцианинов с мембраной и эффективностью их фотодинамического воздействия. Эта корреляция, уже отмеченная ранее [12], находится в соответствии с локальным характером действия генерируемых сенсибилизатором активных форм кислорода. Другим значительным результатом работы стало выявление нового фактора, определяющего процесс связывания металлофталоцианинов с мембранами, а именно координационной связи центрального атома металла с фосфатной группой фосфолипида. Особенно важным этот вид взаимодействия становится в случае многозарядных гидрофильных фталоцианинов, которые нашли применение как при фотодинамической терапии рака (сульфированные фталоцианины), так и в качестве антибактериальных агентов (поликатионные фталоцианины). Ранее в литературе было показано, что для связывания некоторых ионов металлов с липидными мембранами необходимо наличие на их поверхности фосфатных групп [162]. Однако, большое значение координационного взаимодействия с фосфатными группами фосфолипидов в случае металлофталоцианинов было установлено впервые. Из литературы было также известно, что связывание с мембранами заряженных молекул существенно зависит от поверхностного потенциала мембраны [163]. Однако не было данных

06 электростатическом взаимодействии фталоцианинов с мембранами, имеющими различный поверхностный заряд. В настоящей работе не только изучено такое взаимодействие, но и продемонстрирована его значительная роль в фотодинамическом действии фталоцианинов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Пашковская, Алина Андреевна, Москва

1. Spikes J.D., 1986, Phthaloeyanines as photosensitizers in biological systems and for the photodynamic therapy of tumor. Photochem. Photobiol. 43, 691-699

2. Lukyanets E.A., 1999, Phthaloeyanines as photosensitizers in the photodynamic therapy of cancer, J. Porphyrins Phthaloeyanines 3, 424-432

3. Ogura S., Tabata K., Fukushima K., Kamachi Т., Okura I., 2006, Development of phthaloeyanines for photodynamic therapy, J. Porphyrins Phthaloeyanines 10, 11161124

4. Ali H., van Lier J.E., 1999, Metal complexes as photo- and radiosensitizers, Chem. Rev. 99, 2379-2450

5. Josefsen L.B., Boyle R.W., 2008, Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers Metal-Based Drugs, 276109

6. Jori G., Brown S.B., 2004, Photosensitized inactivation of microorganisms Photochem Photobiol Sci. 3, 403-405

7. Hamblin M.R. and Hasan, Т., 2004, Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem. Photobiol. Sci. 3, 436-450.

8. Cauchon N., Nader M., Bkaily G., van Lier J.E., Hunting D. 2006, Photodynamic activity of substituted zinc trisulfophthalocyanines: role of plasma membrane damage, Photochem. Photobiol. 82, 1712-1720

9. Thorpe W.P., Toner M., Ezzell R.M., Tompkins R.G., Yarmush M.L., 1995, Dynamics of photoinduced cell plasma membrane injury, Biophys. J. 68, 2198-2206

10. Nyokong Т., 2007, Effects of substituents on the photochemical and photophysical properties of main group metal phthaloeyanines, Coord. Chem. Rev. 251, 1707-1722

11. Krasnovsky A.A., Jr., 1998, Singlet molecular oxygen in photobiochemical systems: IRphosphorescence studies. Membr. Cell Biol. 12, 665-690

12. Rokitskaya T.I., Block M., Antonenko Y.N., Kotova E.A., Pohl P., 2000, Photosensitizer binding to lipid bilayers as a precondition for the photoinactivation of membrane channels, Biophys. J. 78, 2572-2580

13. Foote C.S., 1976, Photosensitized oxidation and singlet oxygen: consequences in biological system. In Free Radicals in Biology (Edited by Pryor W.A.), Academic Press, New York, vol. 2, 85-134

14. Bonnett R., 1995, Photosensitizers of the porphyrin and phthalocyanine series for photodynamic therapy. Chemical Society Reviews 24, 19-33

15. Березин Б.Д., 1978, Координационные соединения, порфиринов и фталоцианина, Москва, Наука, 280 с.

16. Dougherty TJ, 1985- Photodynamic therapy. In: Photodynamic Therapy of Tumors and Other Deseases. Edizioni Libreria, Padova. PP. 267-279

17. Ferraudi G., Arguello G.A., Ali H., van Eier J:E., 1988, Types 1 and II sensitized photooxidation of aminoacid by phthalocyanines: a flash photochemical study. Photochem. Photobiol. 47, 657-660

18. Milanesio, M.E., Moran, M.S., Yslas, E.I., Alvarez, M.G., Rivarola, V., Durantini E.N:, 2001, Synthesis and, biological evolution of methpxyphenyl porphyrins derivatives as potentialphotodynamic agents. Bioorg. Med. Chem. 9, 1943-1949

19. Sholto A., Lee S. Hoffman B.M., Barrett A. G. M., Elirenberg В. 2008, Photochem. Photobiol. 84, 764-773

20. Bonnett, R. 1999, Photodynamic therapy in historical perspective. Rev. Contempt. Pharmacother. 10, 1-17

21. Kasuga, K. Tsutsui, M., 1980, Some new developments in the chemistry of metallophthalocyanines. Coord. Chem. Rev. 32, 67-95

22. Жуховицкий. В .Б., Хидекель M.JI., Дюмаев К.М., 1985, Проводящие соединения на основе производных фталоцианинового ряда, Успехи химии; Том 54. №2. 239-252

23. Сульман Э.М;, Романовский Б.В., 1996, Каталитические свойства фталоцианинов металлов в реакциях с участием; водорода. Успехи химии, т. 65, №7,659-668

24. Майзлиш В.Е., Кудрик Е.В:,: Шапошников Т.П., Стучинская Т.Л., Кундо H.H., 1999, Синтез и исследование новых гомогенных катализаторов процесса сероочистки., Журн. прикл. химии, т. 72, Вып. 11, 1827-1832

25. Harutyunyan A.R., Kuznctsov A. A., Kuznetsov O.A., Kaliya O.L., 1999, Metal-organic magnetic materials based on cobalt phthalocyanine and possibilities of their application in medicine. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 194, 16-21

26. Калашникова И.П. Нефедов C.E., Томилова Л.Г., Зефиров Н.С., 2007, Синтез m спектральные характеристики циклогексилметоксизамещенных фталоцианиновредкоземельных элементов: Изв. АН. Сер. хим., 2343-2349

27. Лебедева PLIII., 2004, Агрегационные свойства водорастворимых металлофталоцианинов: зависимость от ионной; силы; раствора. Известия АН, Серия химии., № 12, 2564-2572

28. Allen С.М;, Sharman W.M: and van Lier J.E., 2001, Current status of phthalocyanines in the photodynamic therapy of cancer. J. Porphyrins Phthalocyanines 5, 161-169 . ; f ,

29. Kobayashi Т., 1996, J-Aggregates, World Scientific, Singapore

30. Spillcr W., Kliesch H., Wolirle D., Hackbarth S., Roder В., Schnurpfeil G., 1998, Singlet oxygen quantum yield; of different photosensitizers in polar solvents and: micellar solutions. J. Porphyrins Phthalocyanines 2j 145-158

31. Darwent J.R., Douglas P., Harriman A., Porter G., Richoux M.C., 1982, Metal phthaloeyanines and porphyrins as photosensitizers for reduction of water to hydrogen. Coord. Chem. Rev. 44, 83-126

32. Rosenthal J., Krishna C.M., Riesz P., Ben-Hur E., 1986, The role of molecular oxygen in the photodynamic effect of phthaloeyanines. Radial. Res. 107, 136-142

33. Fernandez J.M., Bilgin M.D., Grossweiner L.I., 1997, Singlet oxygen generation by photodynamic agents. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 37, 131-140

34. Kuznetsova N.A., Gretsova N.S., Derkacheva V.M., Luk'yanets E.A., 2002, Generation of singlet oxygen with anionic aluminum phthalocianines in water. J. General Chemistry 72, 300-306

35. Лукьянец E.A., 1998, Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии, Российский химический журнал, Т. XLII, № 5, 9-16

36. Langlois R., Ali Н., Brasseur N., Wagner J.R., van Lier J.E., 1986, Biological activities of phthaloeyanines-IV. Type 2 sensitized photooxidation of L-tryptophan and cholesterol by sulfonated metallophthalocyanines. Photochem. Photobiol. 47, 117123

37. Sonoda M., Krishna C.M., Rieszt P., 1987, The role of singlet oxygen in the photohemolysis of red blood cells sensitized by phthalocyanine sulfonates. Photochem. Photobiol. 46, 625-631

38. Minnock A., Vernon D.I., Schofield J., Griffiths J., Parish J.H., Brown S.B., 2000, Mechanism of uptake of a cationic water-soluble pyridinium zinc phthalocyanine across the outer membrane of Escherichia coli. Antimicrob. Agent Chemother. 44, 522-527

39. Lacey J.A., Phillips D., 2001, The photosensitization of Escherichia coli using disulphonated aluminium phthaloeyanines. J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 142, 145-150

40. Scalise I., Durantini E.N., 2005, Synthesis, properties, and photodynamic inactivation of Escherichia coli using a cationic and noncharged Zn (II) pyriyloxyphthalocyanine derivatives, Bioorg. Med. Chem. 13, 3037-3045

41. Kuznetsova N.A., Makarov D.A., Kaliya O.L., Vorozhtsov G.N., 2007, Photosensitized oxidation by dioxygen as the base for drinking water disinfection. J. Hazardous Materials 146,487-491

42. Makarov D.A., Yuzhakova O.A., Slivka L.K., Kuznetsova N.A., Negrimovsky V.M., Kaliya O.L., Lukyanets E.A., 2007, Cationic Zn and A1 phthalocyanines: synthesis, spectroscopy and photosensitizing properties. J. Porphyrins Phthalocyanines 11, 586-595

43. Вудворд P., 1962, Журнал ВХО им. Д.И. Менделеева, 7, 384

44. Березин Б.Д., 1968, Изв. Вузов. Химия и химические технологии 11, 537

45. Березин Б.Д., Сенникова Г.В., 1964, ДАН СССР 159, 117

46. Скопенко В.В., Цивадзе А.Ю, Савранский Л.И., Гарновский А.Д. 2007, Координационная химия. Москва, ИКЦ "Академкнига", 91с

47. Pooler J.P., Valenzeno D.P., 1979, The role of singlet oxygen in sensitized photomodification of excitable membranes, Photochem. Photobiol. 30, 581-584

48. Grossweiner L.I., 1977, Application of diffusion theory to photodynamic damage in large targets, Photochem. Photobiol. 26, 309-311

49. Lindig B.A., Rodgers M.A.J., 1981, Rate parameters for the quenching of singlet oxygen by water-soluble and lipid-soluble substrates in aqueous and micellar systems, Photochem. Photobiol. 33, 627-634

50. Красновский A.A., 2004, Фотодинамическое действие и синглетный кислород, Биофизика, т. 49, вып. 2, 305-321

51. Lindig В.A, Rodgers M.A.J., 1979, Laser photolysis studies of singlet molecular oxygen in aqueous micellar dispersions, J. Phys. Chem. 83, 1683-1688

52. Rodgers M.A.J., Snowden P.T., 1982, Lifetime of 02 in liquid water as determined by time-resolved infrared luminescence measurement, J. Am. Chem. Soc. 104,5541-5543

53. Parker J.G, Stanbro W.D., 1984, Dependence of photosensitized singlet oxygen production on porphyrin structure and solvent, in: Porphyrin Localization and Treatment of Tumors, Doiron, D. R. and Gomer, C. J., Eds., Alan R. Liss, New York, 259

54. Kuimova M.K., Yahioglu G., Ogilby P.R., 2008, Singlet Oxygen in a Cell: Spatially Dependent Lifetimes and Quenching Rate Constants. J. Am. Chem. Soc. 131 (1), 332-340

55. Lavi A., Weitman H., Holmes R.T., Smith K.M., Ehrenberg B., 2002, The depth of porphyrin in a membrane and the membrane's physical properties affect the photosensitizing efficiency. Biophys. J. 82, 2101-2110

56. Sandberg S., Romslo I., 1981, Porphyrin-induced photodamage at the cellular and the subcellular level as related to the solubility of the porphyrin, Clin. Chim. Acta 109, 193-201

57. Kepczynski M., Pandian R.P., Smith K.M., Ehrenberg B., 2002, Do liposome-binding constants of porphyrins correlate with their measured and predicted partitioning between octanol and water? Photochem. Photobiol. 76, 127-134.

58. Voszka I., Budai M., Szabo Z., Maillard P., Csik G., Grof P., 2007, Interaction of photosensitizers with liposomes containing unsaturated lipid. Chem. Phys. Lipids, 145, 63-71

59. Maman N., Dhami S., Phillips D., Brault D., 1999, Kinetic and equilibrium studies of incorporation, of di- sulfonated aluminum phthalocyanine into unilamellar vesicles. Biochim. Biophys. Acta 1420, 168-178

60. Кантор Ч., Шиммел П., 1984, Биофизическая химия, Т. I, Москва, "Мир", 336 с

61. Takagaki Y., Radhakrishnam R., Wirtz K.W.A., Khorana H.G., 1983, The membranembedded segment of Cytoxrome b5 as studied by cross-linking with photoactivatable phospholipids: II The non-transformable form, J. Biol. Chem. 258, 9136-9142

62. Kouyama Т., Kouyama A.N., Ikegami A., 1987, Bacteriorhodopsin is a powerful light-driven proton pump. Biophys. J. 51, 839-841

63. Рубин А. Б., 2000, Биофизика,Биофизика клеточных процессов., Москва, т. <2., 464 с78.' Gelles J., Blair D.F., Chan S.I., 1987, The proton-pumping site of cytochrome с oxidase. A model of its structure and mechanism, Biochim. Biophys. Acta 853, 205236

64. Марри P., Греннер Д:, Мейес П., Родуэлл В., 1993, Биохимия человека, Изд. "МИР", т. 1-2, 384 с

65. Ghernyshev A., Armstrong К.М., Cukierman S., 2003, Proton transfer in gramicidin channels is modulated by the thickness of monoglyceride bilayers. Biophys. J; 84, 238-250

66. Li S.J., Yamashita Y., Yamazaki M.; 2001, Effect of electrostatic interactions on phase stability of cubic phases of membranes of monoolein/dioleylphosphatidic acid mixtures. Biophys. J. 81, 983-993

67. Crawford G.E, Earnshaw J.C., 1986, Phase transitions in monoglyceride bilayers. A light scattering study. Biophys. J. 49 (4), 869-889

68. Qiu H., Caffrey M., 2000, The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials 21, 3, 223-234

69. Valenzeno D.P., 1987, Photomodification of biological membranes with emphasis on singlet oxygen mechanisms, Photochem. Photobiol. 46, 147-160

70. Salet C., Moreno G., 1990, New trends in photobiology photosensitization of mitochondria. Molecular and cellular aspects. J. Photochem. Photobiol. B: Biology 5, 133-150

71. Владимиров Ю.А., 1998, Свободные радикалы в первичных фотобиологических процессах. Биол. мембраны. Т. 15, вып. 5, 517-529

72. Fox L.S., Kozik М., Winkler J.R., Gray Н.В., 1990, Gaussian Free-Energy Dependence of Electron-Transfer Rates in Iridium Complexes. Science 247 (4946), 1069-1071

73. Girotti A.W., 1990, Photodynamic lipid peroxidation in biological systems, Photochem. Photobiol. 51,497-509

74. Vladimirov Y.A., Roshchupkin D.I., Fesenko E.E., 1970, Photochemical reactions in amino acid residues and inactivation of enzymes during UV-irradiation. Photochem. Photobiol. 11 (4), 227-246

75. Straight R., Spikes J.D., 1985, Photosensitized oxidation of biomolecules. In: Frimer A.A. (ed.) Singlet oxygen, Vol. IV. CRC Press, Boca Raton, pp 91-143

76. Hu W., Cross T.A., 1995, Tryptophan hydrogen bonding and electric dipole moments: functional roles in the gramicidin channel and implication for membrane proteins. Biochemistry, 34, 14147-14155

77. Stadtman E.R., 1993, Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions. Annu. Rev. Biochem. 62, 797821

78. Uchida K., Stadtman E.R., 1992, Modification of histidine residues in proteins by reaction with 4-hydroxynonenal. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 89 (10), 4544-4548

79. Lee Y., Shacter E., 1995, Role of carbohydrates in oxidative modification of fibrinogen and other plasma proteins. Arch. Biochem. Biophys. 321 (1), 175-181

80. Dean R.T., Fu S., Stocker R., Davies M.J., 1997, Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation. Biochem. J. 324, 1-18

81. Davies M.J., 2004, Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.Photochem. Photobiol. Sci. 3, 17-25

82. Van der Meulen D.L., Judy M.M., 2005, Photooxidative changes of lysozyme with 337.1 nm laser radiation. Radiation and Environtmental Biophysics 27, 307-316

83. Feierabend J., Engel S., 1986, Photoinactivation of catalase in vitro and in leaves. Arch. Biochem. Biophys. 251, 567-576

84. Budde R.J.A., Randall D.D., 1990, Pea leaf mitochondria pyruvate dehydrogenase complex is inactivated in vivo in a light-dependent manner. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 673-676

85. Kemp G.D., Dickinson F.M., Ratledge C., 1990, Light sensitivity of the n-alkane-induced fatty alcohol oxidase from Candida tropicalis and Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol. 32, 461-464

86. Paardekooper M., De Bruijne A.W., Van Steveninck J., Van den Broek P.J., 1993, Inhibition of transport systems in yeast by photodynamic treatment with toluidine blue. Biochim. Biophys. Acta 1151 (2), 143-148

87. Malik Z., Ladan H., Nitzan Y., Ehrenberg B., 1990, The bactericidal activity of deuteroporphyrin-hemin mixture on Gram-positive bacteria. A microbiological and spectroscopic study. J. Photochem. Photobiol., B. Biol. 6, 419-430

88. Nitzan Y., Gutterman M., Malik Z., Ehrenberg B., 1992, Inactivation of gramnegative bacteria by photosensitized porphyrins, Photochem. Photobiol. 55 (1), 89-96

89. Nikaido H., Vaara M., 1985, Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev. 49, 1-32

90. Bertoloni G., Rossi F., Valduga G., Jori G., van Lier, 1990, Photosensitizing activity of water and lipid-soluble phthalocyanines on Escherichia coli, FEMS Microbiology Letters 71, 149-156.

91. Vaara M., Vaara T., 1983, Polycations sensitize enteric bacteria to antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 24 (1), 107-113

92. Maisch T., Szeimies R.M., Jori G., Abels C., 2004, Antibacterial photodynamic therapy in dermatology. Photochem. Photobiol. Sci. 3 (10), 907-917

93. Henderson B.W., Dougherty T.J. 1992, How does photodynamic therapy work? Photochem. Photobiol. 55, 145-157

94. Roding J., Naujok A., Zimmermann H.W., 1986, Effect of ethidium bromide, tetramethylenthidium bromide and betain B on the ultrastructure of HeLa cell mitochondria in situ, Histochemistry 85, 215-222

95. Ricchelli F., Nikolov P., Gobbo S., Jori G., Moreno G., Salet C., 1994, Interaction of phthalocyanines with lipid membranes: a spectroscopic and functional study on isolated rat liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1196, 165-171

96. Johnson L.V., Walsh M.L., Bockus B.J., Chen L.B., 1981, Monitoring of relative mitochondrial membrane potential in living cells by fluorescence microscopy, J. Cell Biol. 88, 526-535

97. Dummin H., Cernay Th., Zimmermann H.W., 1997, Selective photosensitization of mitochondria in HeLa cells by cationic Zn (Il)phthalocyanines with lipophilic side-chains. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 37, 219-229

98. Weizman E., Rothmann C., Greenbaum L., Shainberg A., Adamek M., Ehrenberg B., Malik Z., 2000, Mitochondrial localization and photodamage during photodynamic therapy wiyh tetraphenylporphines. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 59, 92-102

99. Cui S., Verrous P.J., Moestrup S. K., Christensen E.I., 1996, Megalin/gp330 mediates uptake of albumin in renal proximal tubule. Am. J. Physiol. 271, F900-F907

100. Kessel D., Thompson, P., Saatio, S., Nantwi, K.D., 1987, Tumor localization and photosensitization by sulfonated derivatives of tetraphenylporphine. Photochem. Photobiol. 45, 787-790

101. Bachor R., Scholz M., Shea C. R., Hasan T., 1991, Photosensitized description of human bladder carcinoma cellstreated with chlorine e6-conjugated microspheres. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1580-1584

102. Bachor R., Scholz M., Shea С. R., Hasan Т., 1991, Mechanism of photosensitization by microsphere- bound chlorine e6 in human bladder carcinoma cells. Cancer Res. 51, 4410-4414

103. Allemann E., Brasseur N., Benrezzak O., Rousseau J., Kudrevich S.V., Boyle R.W., 1995, PEG-coated poly (lactic acid) nanoparticles for the delivery of hexadecafluoro zinc phthalocyanine to emt-6 mouse mammary tumors. J. Pharm. Pharmacol. 47, 382-387

104. Morgan J., Lottman, H., Abbou, C.C., Chopin, D.K., 1994, A comparison of direct and liposomal antibody conjugates of sulfonated aluminum phthalocyanines for selective photoimmunotherapy of human bladder carcinoma. Photochem. Photobiol. 60, 486-496

105. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Ахлынина Т.В., 2004, Направленный внутриклеточный транспорт фотосенсибилизаторов. Росс. хим. журнал, Т.42, 84-88

106. Lanford R.E., Butel J.S., 1984, Construction and characterization of an SV40 mutant defective in nuclear transport of T antigen. Cell 37, 801-813 ,

107. Kessel D., Yu Luo, 1998, Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis, J. Photochem. Photobiol. B: Biology 42, 89-95

108. Hoff E.I., oude Egbrink M.G., Heijnen V.V., Steinbusch H.W., van Oostenbrugge R.J., 2005, In vivo visualization of vascular leakage in photochemically induced cortical infarction. J. Neurosci. Methods 141, 135-141

109. Gollnick S.O., Owczarczak В., Maier P., 2006, Photodynamic therapy and antitumor immunity. Lasers Surg. Med., 38 (5), 509-515

110. Thong P.S., Olivo M., Kho K.W., Bhuvaneswari R., Chin W.W., Ong K.W., Soo K.C., 2008, Immune response against angiosarcoma following lower fluence rate clinical photodynamic therapy. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 27 (1), 35-42

111. Sarges R., Witkop В., 1965, Gramicidin A. The structure of valine- and isoleucine-gramicidin A. J. Am. Chem. Soc. 87, 2011-2020

112. Urry D. W., 1971, The gramicidin A transmembrane channel: a proposed pLD helix. Proc. Natl. Acad. Sci USA 68(3), 672-676

113. Арсеньев A.C., Овчинников Ю.А., Барсуков И.Л., Быстров В.Ф., 1986, Трансмембранный канал грамицидина А. Реконструкция пространственной структуры по данным ЯМР спектроскопии и оптимизация конформационной энергии. Биол. мембраны 3, 1077-1103

114. Pierce D.W., Boxer S.G., 1995, Stark effect spectroscopy of tryptophan. Biophys. J. 68 (4), 1583-1591

115. Cotton M., Tian C., Busath D.D., Shirts R.B., Cross T.A. 1999, Modulating dipoles for structure -function correlation in the gramicidin A channel, Biochemistry 38 (29), 9185-9197

116. Galla H.J., Hartmann W., Theilen U., Sackmann E., 1979, On two-dimentional passive random walk in lipid bilayers and fluid pathway in biomembranes. J. Membrane Biol. 48, 215-236

117. Hladky S.B., Haydon D.A., 1972, Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. Studies of the unit conductance channel. Biochim. Biophys. Acta 274(2), 294-312

118. Bamberg E., Noda K., Gross E., Lauger P., 1976, Single-channel parameters of gramicidin А, В and C. Biochim. Biophys. Acta 419 (2), 223-228

119. Busath D., Hayon E., 1988, Ultraviolet flash photolysis of gramicidin-doped lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta 944 (1), 73-78

120. Stark G., 1991, The effect of ionizing radiation on lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta 1071 (2), 103-122

121. Straessle M., Stark G., 1992, Photodynamic inactivation of an ion channel: gramicidin A. Photochem. Photobiol. 55, 461—463

122. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A., 1993, The interaction of phthalocyanine with planar lipid bilayers photodynamic inactivation of gramicidin channels. FEBS Lett. 329, 332-335

123. Rokitskaya T.I., Antonenko Y.N., Kotova E.A., 1996, Photodynamic inactivation of gramicidin channels: a flash-photolysis study. Biochim. Biophys. Acta 1275, 221-226

124. Jones D., Hayon E., Busath D., 1986, Tryptophan photolysis is responsible for gramicidin-channel inactivation by ultraviolet light. Biochim. Biophys. Acta 861, 6266

125. Kunz L„ Zeidler U., Haegele K., Przybylski M., Stark G., 1995, Photodynamic and radiolytic inactivation of ion channels formed by gramicidin A: oxidation and fragmentation. Biochemistry 34 (37), 11895-11903

126. Sobko A.A., Vigasina M.A, Rokitskaya T.I., Kotova E.A., Cramer W.A., Antonenko Y.N., 2004, Chemical and photochemical modification of colicin El and gramicidin A in bilayer lipid membranes. J. Membr. Biol. 199, 51-62

127. Strassle M., Stark G., Wilhelm M., Daumas P., Heitz F., Lazaro R., 1989, Radiolysis and photolysis of ion channels formed by analogues of gramicidin A with a varying number of tryptophan residues. Biochim. Biophys. Acta 980 (3), 305-314

128. Asquith R.S., Rivett D.E., 1971, Studies on the photooxidation of tryptophan. Biochim. Biophys. Acta 252, 111-116

129. Антоненко Ю.Н., Котова E.A., Рокицкая Т.И., 2005, Фотодинамическое воздействие как основа релаксационного метода изучения грамицидиновых каналов. Биол. мембраны, т. 22, 275-289

130. Engelmann F.M., Mayer I., Gabrielli D.S., Toma H.E., Kowaltowski A.J., Araki K., Baptista M.S., 2007, Interaction of cationic weso-porphyrins with liposomes, mitochondria and erythrocytes. J Bioenerg Biomembr. 39, 175-185

131. Pavani C., Uchoa A.F., Oliveira C.S., Iamamoto Y., Baptista M.S., 2009, Effect of zinc insertion and hydrophobicity on the membrane interaction and PDT activity of porphyrin photosensitizers. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 233-240

132. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C., 1963, Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution, J. Phys. Chem. 67,534-535

133. Kuznetsova N.A., Gretsova N.S., Derkacheva V.M., Kaliya O.L., Lukyanets E.A., 2003, Sulfonated phthalocyanines: aggregation and singlet oxygen quantum yield in aqueous solutions. J. Porphyrins Phthalocyanines 7, 147-154

134. Magde D., Elson E.L., Webb W.W., 1974, Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization, Biopolymers 13, 29-61.

135. Murray D., Arbuzova A., Hangyas-Mihalyne G., Gambhir A., Ben-Tal N., Honig В., McLaughlin S., 1999, Electrostatic properties of membranes containing acidic lipids and adsorbed basic peptides: theory and experiment. Biophys. J. 77, 31763188

136. Chludzinska L., Ananicz E., Jarosawska A., Komorowska M., 2005, Near-infrared radiation protects the red cell membrane against oxidation, Blood Cells, Molecules and Diseases 35, 74-79

137. DiNitto J.P., Cronin T.C., Lambright D.G., 2003, Membrane recognition and targeting by lipid-binding domains, Sci. STKE; 213:rel6. Review.

138. Перевощикова И.В., Сорочкина А.И., Зоров Д.Б., Антонешсо Ю.Н., 2009, Сафранин О как флуоресцентный индикатор мембранного потенциала митохондрий: исследование на уровне суспензии отдельных митохондрий, Биохимия, том 74, вып. 6, 814 824

139. Kimura J., A. Ikegami А., 1985, Local dielectric properties around polar region of lipid bilayer membranes, J. Membrane Biol. 85, 225-231

140. Pohl P., Saparov S.M., Pohl E.E., Evtodienko V.Y., Agapov I.I., Tonevitsky A.G., 1998, Dehydration of model membranes induced by lectins from Ricinus communis and Viscum album, Biophys. J. 75, 2868-2876

141. Tang W., Xu H., Kopelman R., Philbert M.A., 2005, Photodynamic Characterization and In Vitro Application of Methylene Blue-containing Nanoparticle Platforms, Photochem. Photobiol. 81, 242-249

142. Ermakov Y.A., Cherny V.V., Sokolov V.S., 1992, Adsorption of beryllium on neutral and charged lipid membranes, Biol. Membrany 9, 201-213

143. McLaughlin S., 1989, The electrostatic properties of membranes. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 18, 113-136