Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов в плоских бислойных липидных мембранах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение фотосенсибилизированной инактивации грамицидиновых каналов в плоских бислойных липидных мембранах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

г,' * 7 БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РОКИЦКАЯ ТАТЬЯНА ИВАНОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ ИНАКТИВАЦИИ ГРАМИЦИДИНОВЫХ КАНАЛОВ В ПЛОСКИХ БИСЛОЙНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ.

(03.00.02- биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-199 8

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник

Ю.Н.Антоненко

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Е.А.Котова

доктрр биологических наук, профессор Г.Н.Берестовский доктор биологических наук доцент А.А.Булычев

Ведущая организация:

Институт электрохимии им.Фрумкина РАН.

за

Защита состоится 1998 года в А часов

на заседании диссертационного совета К.058.05.68 по адресу: Москва, 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан &"С&шфс 1998 I

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Ль?

Б.А.Гуляев

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Активные формы кислорода, играющие значительную роль з различных физиологических и патологических процессах, могут вызывать как увеличение неспецифической ионной проводимости (Стожкова и соавт., 1992), так л модификацию специфических ионных токов, протекающих через мембраны ■слеток и их органелл (Starkus et al., 1993). Если первые обусловлены перекисным экислением липидов (Girotti, 1990), то вторые, вероятно,- воздействием на функционирование в мембранах ионных каналов (Holmberg et al., 1991).

Ионные каналы играют существенную роль в жизнедеятельности клеток. Функционирование ионных каналов лежит в основе выполнения клетками важнейших биологических функций, таких как проведение нервного возбуждения, мышечное сокращение, зрительная рецепция, гормональная регуляция. Еще 30 лет назад Пуллер (Pooler, 1968) показал, что активные формы кислорода, образующиеся при воздействии света видимого диапазона на фотосенсибилизатор в присутствии кислорода (при фотодинамическом воздействии), подавляют интегральную Na+ проводимость в гигантских аксонах кальмара. В последние годы появляется все больше работ, демонстрирующих нарушение функционирования ионных каналов при фотодинамическом воздействии (ФДВ) (Duprat et al., 1995; Valenzeno & Tarr, 1991). Во многих работах подчеркивается, что инактивация ионных каналов является первичным результатом ФДВ на клетки (Holmberg et al., 1991). Однако, сложность биологических объектов затрудняет исследование молекулярного механизма реакций и интерпретацию полученных результатов. По этой причине удобным объектом для исследования механизма реакций могут служить ионные каналы в искусственной плоской бислойной липидной мембране (БЛМ).

В настоящее время изучено большое количество пептидов, которые при встраивании в БЛМ образуют ионные каналы (Ивков, Берестовский, 1982). Одним из таких каналообразующих пептидов является пентадекапептид грамицидин А. В работах по изучению воздействия ионизирующего излучения на грамицидиновые

каналы было показано, что повреждение триптофановых остатков грамицидина под действием свободных радикалов, продуктов радиолиза воды, приводит к подавлению проводимости каналов (Stark, 1991). Из литературы известно, что при освещении в присутствии фотосенсибилизатора происходит окисление триптофана в растворе (Ferraudi et al., 1988). Предварительные результаты нашей работы, а также Штрассле и Штарка (Strässle & Stark, 1992) показали, что при освещении бислойной липидной мембраны видимым светом в присутствии фотосенсибилизатора уменьшается проводимость БЛМ, индуцированная грамицидином. Однако механизм этого явления оставался неясным. Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение процесса инактивации грамицидиновых каналов в БЛМ при воздействии видимого света в присутствии фотосенсибилизатора фталоцианиана. В этой связи ставились следующие основные задачи: 1) исследозать воздействие света видимого диапазона на проводимость БЛМ (сформированной из насыщенных и ненасыщенных липидов) в присутствии фталоцианина; 2) изучить воздействие видимого света на проводимость БЛМ, индуцированную грамицидином, в присутствии фталоцианина; 3) выяснить, происходит ли подавление интегральной проводимости, индуцированной грамицидином, при фотодинамическом воздействии за счет падения проводимости одиночного канала или за счет уменьшения количества проводящих каналов; 4) зарегистрировать кинетику спада индуцированной грамицидином проводимости БЛМ после вспышки света в присутствии фталоцианина и изучить ее зависимость от температуры, состава мембраны, наличия тушителей активных форм кислорода; 5) предложить теорию, описывающую процесс уменьшения индуцированной грамицидином проводимости мембраны и его кинетику; 6) исследовать влияние дипольного скачка потенциала мембраны на кинетику спада индуцированной грамицидином проводимости.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований удалось показать, что проводимость БЛМ, индуцированная каналообразующим пептидом грамицидином А, подавляется под действием видимого света в присутствии

фталоцианина. Этот процесс вызван уменьшением числа открытых каналов в БЛМ. Кинетика спада проводимости БЛМ после вспышки света в присутствии фотосенсибилизатора хорошо аппроксимируется моноэкспоненциальной кривой и отражает процесс установления равновесия между мономерами и димерами грамицидина в мембране после нарушения равновесия в результате модификации части молекул грамицидина активными формами кислорода, образуемыми при возбуждении фотосенсибилизатора вспышкой света. Разработана теоретическая модель, позволяющая на основании измерения кинетик фотоинактивации определить константы образования и распада канала грамицидина. Обнаружено, что в некоторых условиях наряду с медленным спадом тока в секундной шкале наблюдается быстрая фаза спада тока после вспышки света, которая связана с переходом димеров грамицидина в непроводящее состояние. Измерено характерное время быстрой фазы фотоинактивации. Показано, что кинетика сенсибилизированной фотоинакгивации грамицидина в мембране изменяется под действием дипольных модификаторов - агентов, изменяющих дипольный скачок потенциала на границе мембрана - водный раствор. Изменения константы скорости диссоциации димеров грамицидина под действием различных дипольных модификаторов коррелируют с изменениями дипольного скачка потенциала. Сделано заключение о том, что процесс распада грамицидинового канала, соответствующий диссоциации димера, чувствителен к дипольному скачку потенциала. Этот вывод подтверждается данными по влиянию дипольных модификаторов на время жизни одиночных каналов грамицидина. Практическая значимость работы. Обнаруженное явление сенсибилизированной фотоинактивации грамицидиновых каналов в мембране легло в основу нового метода определения констант формирования и распада грамицидиновых каналов (димеров грамицидина). Этот метод позволил, в частности, выявить существенную зависимость кинетики грамицидиновых каналов от дипольного потенциала мембраны. Полученные результаты имеют важное значение для понимания механизма фотодинамической модификации мембранных белков.

з

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 6-м (3-8 сентября 1995, UK) конгрессе Европейского Фотобиологического общества, 40-м (17-21 февраля 1996, Baltimore, USA) конгрессе Американского Биофизического общества, 1-ой Всероссийской конференции фотобиологов (20-30 мая 1996, Пущино), 12-м Международном конгрессе по фотобиологии (1-6 сентября 1996, Vienna, Austria), Международном симпозиуме, посвященном памяти академика А.А.Красновского (22-29 мая 1997, Москва) и на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского (1997). Цикл работ по изучению, фотодинамического воздействия на функционирование ионных каналов удостоен премии Европейской Академии наук 1998 г. Публикации. По материалам исследований опубликовано 5 статей. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы в двух главах, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и обсуждения в трех главах, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков, библиографический список содержит 114 наименований.

Экспериментальная часть.

Плоскую бислойную липидную мембрану формировали на отверстии в тефлоновой стенке диаметром 0.5-0.6 мм по методу Мюллера и др. (Mulier et аJ., 1962). В большинстве экспериментов мембранформирующий раствор содержал 20 мг дифитаноилхосфатидилхолина ('Avanti Polar Lipids', США) в 1 мл декана. Каналоформер грамицидин Д ('Sigma', США) добавлялся симметрично в ячейку в виде спиртового раствора. Водные растворы трижды- и четырежды-сульфированного алюмофталоцианина, любезно предоставленные М.Г.Гальперн (НИОПИК, Москва), добавлялись в ячейку с транс- стороны. В работе использовались водные растворы RH421 ('Molecular Probes', США), трийодтиронина('Мегск', Германия) и спиртовой раствор флоретина ('Fluka', Швейцария).

Для регистрации тока через БЛМ использовались Ag-AgCl электроды в 1 М KCl, соединенные с ячейкой агаровыми мостами, или Ag-AgCl электроды из хлорированной серебряной фольги, погружаемые непосредственно в раствор буфера. Измерения тока проводились методом фиксации напряжения.

В качестве источника возбуждающего света использовались: лампа слайдопроектора (плотность мощности 250 мВт/см2, Х>500 нм), He-Ne лазер (плотность мощности 30 мВт/см2, Х=632 нм), ксеноновая лампа- вспышка (энергия д=0.3 Дж) и неодимовый лазер фирмы 'Quantei' (Франция) с удвоением частоты (Х=530 нм, длительность импульса 15 не, энергия - 50 мДж).

Результаты и обсуждение. Глава I. Исследование воздействия видимого света на электрическую проводимость плоской бислойной липндной мембраны, сенсибилизированной фталоцнанином.

Известно, что освещение клеточной мембраны видимым светом в присутствии фотосенсибилизатора может вызывать как перекисное окисление липидов, так и модификацию белков. В нашей работе эти процессы были смоделированы на БЛМ. Было изучено ФДВ на плоскую бислойную липиднуто мембрану и встроенный в нее каналоформер грамицидин А.

Освешение мембраны в присутствии 1 мкМ фталоцианина (Фц) лампой слайдопроектора приводило к появлению флуктуаций проводимости, а затем разрыву мембраны приблизительно через 10 минут (рис.1А). Увеличение проводимости и разрушение мембраны наблюдалось для БЛМ, сформированных из азолеетика (рис.1 А), и не наблюдалось для БЛМ из дифитаноилфосфатадилхолина (не содержащего двойных связей в углеводородных цепях) (рис.1 В). Следует отметить, что при ФДВ на мембрану, сформированную из азолектина (рис.1 А), с момента начала освещения наблюдается незначительный рост проводимости

(<5-10" См/см ) и лишь через 2.5 минуты начинается основная фаза роста проводимости мембраны.

Ранее в работе Стожковой и соавт. (1992) было показано, что яри освещении 6ЛМ видимым светом в присутствии гематопорфирина проводимость

мембраны увеличивается, а затем мембрана разрушается в случае мембранформирующих липидов,

содержащих двойные связи в углеводородных цепях. Разрыв мембраны авторы связывали с фотодинамическим перекисным окислением липида, а именно, двойных связей в углеводородных цепях. Поэтому нами было сделано заключение, что разрушение мембраны, сформированной из азолектина, при освещении в присутствия фталоцианина происходит из-за перекисного окисления липида. В случае дифитаноилфосфатидилхолина рост проводимости не наблюдался, что связано с отсутствием двойных связей в его углеводородных цепях.

Далее в работе изучалось ФДВ на встроенный в бислойную липидную мембрану пептид грамицидин А. Во избежание воздействия на липидный компонент мембраны БЛМ формировались из дифитаноилфосфатидилхолина. Как видно из рис.2А, после встраивания грамицидина А в БЛМ индуцированная проводимость резко уменьшалась при осеещениии мембраны Не-Ме лазером в присутствии фталоцианина. .Эксперименты, выполненные на уровне одиночных каналов, показали, что освещение в присутствии фталоцианина приводит

б

Рис. 1 Действие видимого света на проводимость БЛМ из фосфатидилхолина соевых бобов (А) и дифитаноилфосфатидилхолина (В) в присутствии 1 мкМ фталоцианина.

грамицидиновый канал в состояние с нулевой проводимостью (рис.2В). Таким образом, можно говорить о том, что наблюдаемое при ФДВ уменьшение проводимости, индуцированной грамицидином (рис.2А), происходит из-за уменьшения числа открытых каналов, а не из-за уменьшения проводимости одиночного канала.

Уменьшение концентрации кислорода з

среде путем пропускания аргона через

водный раствор приводило к значительному

подавлению фотосенсибилизированной

инактивации каналов. Этот результат

показывает, что инактивация каналов

происходит под действием активных форм

кислорода. Изменение рН среды огЗ до 10

не влияло на скорость падения

проводимости БЛМ, что свидетельствует

против участия НО*2 радикалов в процессе

фотодинамической инактивации

грамицидина. Основываясь на полученных

„ „ _ „ результатах, можно предположить, что

Рис.2 Действие видимого света на

индуцированную грамицидином индуцированная фталоцианином

проводимость БЛМ а присутствии

фталоцианина (А- 4-Ю"12 М ннактиваШ1Я грамицидина осуществляется

грамицидина, В- 2-10 13 М)._ ПрИ участии синглетного кислорода. Эффект

фотодинамической инактивации ионных каналов, по-видимому, объясняется фотодеструкцией входящих в состав грамицидина триптофановых остатков под действием синглетного кислорода, генерируемого фталоцианином при возбуждении видимым светом. Алюмофталоцианин известен как эффективный сенсибилизатор генерации синглетного кислорода, который способен вызывать окисление триптофана в растворе. В то же время, возможность подавления индуцированной грамицидином ионной проводимости БЛМ посредством

фотохимической реакции 1-го типа (с участием радикалов) не может быть полностью исключена.

Глава II. Метод измерения констант формирования н распада канала грамицидина, основанный на измерении релаксации тока после вспышки света в присутствии фотосенсибилизатора.

При использовании непрерывного освещения невозможно исследовать кинетику фотосенсибилизированной инактивации грамицидина. Поэтому для изучения временных характеристик нарушения функционирования канала в дальнейших экспериментах в качестве источника возбуждающего света использовалась ксеноновая лампа, дающая одиночные вспышки света длительностью 2 мс.

Исследование кинетики спада тока, индуцированного грамицидином, после вспышки света. На рис.3 представлена зависимость тока через БЛМ от времени после однократной вспышки видимого света. Освещение мембраны вспышкой в присутствии фталоцианина приводит к уменьшению тока, индуцированного грамицидином. Экспериментальная зависимость тока от времени хорошо аппроксимируется моноэкспоненциальной кривой

где /о - ток через мембрану в начальный момент (до вспышки), - ток через мембрану после установления стационарного значения, т - коэффициент показателя экспоненты (далее именуется характерное время). На вставке к рис.3 видно небольшое уменьшение тока на временах, сравнимых с длительностью вспышки; этот процесс будет исследован ниже. Уменьшение проводимости БЛМ не наблюдалось при освещении мембраны в отсутствие фотосенсибилизатора (как и в опытах с постоянным светом). Величина г, равная 1 с в условиях как на рис.3, на несколько порядков превышает время жизни синглетного кислорода и кислородсодержащих радикалов в липидных мембранах. Характерное время

Д 10*А 9.9

9.6 9.3 9.0

8.7

9.5 9.0

1.0 1.5 2.С

'4, с

Рис.3 А) Кинетика спада индуцированного грамицидином А тока через БЛМ после вспышки света в присутствии I мкМ фталоцианина при ^26°С. На вставке те же данные в другой временной шкале. Б) Те же данные представлены в координатах от времени (1). Стрелкой показан момеят вспышки сзета._.

уменьшения тока оказалось близким к значению времени жизни открытого состояния грамицидинового какала.

В этой связи было предположено, что характерное время фотосенсибилизированной инактивации грамицидина не зависит от кинетики взаимодействия грамицидина с активными формами кислорода, образующимися с участием фотосенсибилизатора, а определяется процессом формирования - распада самого канала. В этом случае кинетика фотоинактивации будет зависеть от изменений параметров грамицидинового канала. Действительно, величина т не изменяется существенно при уменьшении энергии вспышки, так же как и при

изменении концентрации фталоцианина. Относительная амплитуда, « = ———,

Л

светоиндуцированного уменьшения тока растет с увеличением как интенсивности света, так и концентрации фотосенсибилизатора.

Результаты экспериментов с тушителями активных форм кислорода также согласуются с предположением о том, что характерное время не зависит от факторов, влияющих на концентрацию активных форм кислорода. Так, а уменьшается при увеличении концентрации азида натрия в водном растворе. При этом характерное время фотоинактивации существенно не меняется, г не меняется

также при добавлении в мембранформирующий раствор 0.5% а-токоферола, амплитуда фотоинактивации в этих условиях значительно уменьшается. Кроме того, добавление супероксидцисмутазы в водный раствор никак не влияло на временную зависимость светоиндуцированного уменьшения тока.

Было предположено, что скорость фотоинактивации будет меняться с изменением времени жизни канала. Известно, что время жизни открытого состояния канала грамицидина А уменьшается с увеличением температуры. В наших экспериментах характерное время фотоинактивации также уменьшалось при повышении температуры. Нами было показано, что при использовании сквалана в качестве растворителя вместо декана х увеличивается, а при введении холестерина в мембран-формирующий раствор - т уменьшается. Эти данные также подтверждают наличие корреляции характерного времени кинетики фотоинактивации грамицидина А и времени жизни канала, свидетельствуя о том, что характерное время инактивации отражает кинетические свойства грамицидина А.

Метод измерения констант формирования и распада канала грамицидина, основанный на фотодинамической инактивации грамицидина. Принято считать, что грамицидиновый канал в БЛМ представляет собой трансмембранный димер и величина электрического тока, протекающего через БЛМ, содержащую грамицидин, прямо пропорциональна концентрации димеров грамицидина в мембране. Принимая во внимание то, что в наших экспериментах на уровне одиночных каналов фотоинактивация не приводила к появлению промежуточных уровней проводимости одиночных каналов, можно считать, что кинетика изменений тока при фотоинактивации отражает кинетику изменений концентрации димеров грамицидина. В рамках димерной модели канала предполагается, что в мембране устанавливается равновесие между мономерами и димерами грамицидина. Инактивация как мономеров, так и димеров грамицидина в результате их взаимодействия с активными формами кислорода, генерируемыми при возбуждении фотосенсибшшзатора, означает отклонение системы от

равновесия. Инактивация димеров должна проявляться в быстром падении тока (с характерным временем, отражающим время перехода канала в непроводящее состояние при взаимодействии с активными формами кислорода), за которым следует переход системы в новое состояние равновесия димер-мономер. В случае инактивации мономеров кинетика изменений тока отражает лишь процесс установления равновесия между мономерами и димерами. В общем случае кинетика изменений тока может содержать как быстрый, так и медленный компонент.

*«

Рассматривая обратимую реакцию димеризации грамицидина: А + А АА, по

аналогии с работой Bamberg & Läuger, 1973, мы получили, что установление равновесия после вспышки наблюдается по релаксации тока

где 1 = kD + 4 ktN? =к0+ 4 (2)

г V NaA

kR , kD - соответственно константы формирования и распада канала грамицидина,

Na -число Авогадро, Л - проводимость одиночного канала грамицидина, Xю -

проводимость БЛМ после установления равновесия в системе. Таким образом,

измерив зависимость т от Xх, мы можем рассчитать константы прямой и обратной

реакции димеризации грамицидина.

На рис.4 приведены зависимости т от Х°° для двух температур: 18°С и 26°С. Согласно формуле (2), построив зависимость 1/т от мы вычислили константы формирования и распада и константу равновесия реакции димеризации грамицидина (таблица 1). Таблица!.

Температура, °С ко, с'1 кя, с моль' см К, моль' см

18 0.3 5.6-Ю'2 1.9-1013

26 0.48 4.6' 1013 9.5-1013

п

4

О

Рис. 4 Зависимость характерного

времени (т) спада индуцированного грамицидином тока через БЛМ после вспышки света в присутствии I мкМ фталоцианина от стационарной

проводимости БЛМ (X"): при рН=3.0, (=18°С (закрытые кружки) и рН-7.0,

г=260С (открытые кружки).На вставке те же данные представлены в координатах

1/т от А".

о

о.оо

0.05

0.10

0.15 0.20

X, Ом~'см'г

Полученные величины констант хорошо согласуются с приведенными в литературе. Таким образом, нами предложен новый метод определения констант реакции димеризации грамицидина.

Наблюдаемый процесс спада тока, индуцированного грамицидином, после вспышки света в присутствии фотосенсибилизатора хорошо объясняется в рамках модели об установлении равновесия в системе, состоящей из мономеров и димеров грамицидина. Предполагается, что молекулы фталоцианина, поглощая свет, индуцируют образование синглетного кислорода и, возможно, кислородсодержащих радикалов, которые в свою очередь окисляют тригггофановые остатки грамицидина А (рис.5), тем самым лишая молекулы грамицидина способности образовывать проводящее состояние.

Быстрая фаза фотоинактивации грамицидина. На рис.3, кроме медленной фазы фотоинактивации с характерным временем ~1 с, виден незначительный быстрый спад проводимости на временах порядка длительности вспышки. В некоторых условиях (например, при использовании сквалана в качестве растворителя) быстрая фаза фотоинактивации может составлять половину и более

hv >

^ 1o.

g*»»-.

hv

/

^ 1o2

Рис.5 Схема, иллюстрирующая процесс фотоинактивации грамицидина А.

от амплитуды уменьшения тока. Для того, чтобы улучшить временное разрешение в экспериментах по сенсибилизированной фотоинактивации грамицидина, мы провели измерения с использованием наносекундного лазера. На рис.6 показаны результаты измерений кинетики спада индуцированного грамицидином А тока через БЛМ после возбуждения лазерным импульсом в присутствии фотосенсибилизатора, бенгальского розового. В кинетике спада тока видны, по крайней мере, две фазы: медленная фаза в секундном диапазоне и быстрая фаза с ' характерным временем около 1.5 мс. Эта фаза, по-видимому, отражает кинетику перехода грамицидиновых каналов в непроводящее состояние в результате модификации димеров активными формами кислорода. Возможно, димеры претерпевают при этом конформационные изменения. Следует заметить, что в кинетике спада тока после возбуждения лазерным импульсом длительностью 15 не имеется также слабо разрешимый компонент с характерным временем < 100 мкс. Сходная фаза была ранее зарегистрирована при изучении кинетики прямой фотоинактивации грамицидиновых каналов вспышками ультрафиолета (Busath & Hayon, 1988).

3. мкА

1.02 0.99 0.96 0.93

6000

12000 18000 Г, мс

В экспериментах с применением лазерного возбуждения использовался краситель бенгальский розовый в качестве фотосенсибилизатора, так как фталоцианин обладает очень слабым поглощением при 530 нм (¿.„¡„5=532 нм в

Рас. 6 Кинетика спада индуцированного грамицидином А тока (I) через БЛМ после лазерного импульса (отмечен стрелкой) в присутствии 2 мкМ бенгальского розового при 1=18°С. Пунктирной линией показана моноэкспоненциальная кривая с показателем экспоненты 1.35 мс.

данных экспериментах). В полученных кинетических кривых (рис.6) обращает на себя внимание значительное увеличение характерного времени медленной фазы спада тока в присутствии бенгальсхого розового по сравнению с кинетиками, зарегистрированными в присутствии фталоцианина. Оказалось, что замедление кинетики усиливается с ростом концентрации бенгальского розового. Мы предположили, что адсорбция бенгальского розового на границе мембрана - водный раствор приводит к изменению дипольного скачка потенциала, который оказывает влияние на процесс установления равновесия между мономерами и димерами грамицидина в силу наличия у молекулы грамицидина нескольких диполей, располагающихся вблизи границы мембрана -раствор (БеоЬ & ВиэаЛ, 1995). Эксперименты по влиянию бенгальского розового на проводимость БЛМ, опосредованную ионофорами, подтвердили наше предположение. Оказалось, что бенгальский розовый уменьшает проводимость БЛМ для липофильных анионов и увеличивает индуцированную валиномицином проводимость БЛМ для катионов, подобно классическому дипольному модификатору флоретину.

Глава III. Влияние дипольных модификаторов на кинетику сенсибилизированной фотоинактивации грамицидиновых каналов в бислойнмх липидных мембранах.

Гракишииновый канал представляет собой трансмембранный димер, стабилизируемый взаимодействием триптофановых остатков с полярными группировками на границе мембрана-вода (Коерре & Andersen, 1996). В литературе было высказано предположение о том, что диполи тригггофановых остатков грамицидина могут взаимодействовать с диполями липидов или с молекулами иммобилизованной воды на границе раздела липид - вода (Seoh & Busath, 1995). В связи с этим нами было изучено влияние дипольных модификаторов (агентов, изменяющих дипольный скачок потенциала) на кинетику формирования и распада грамицидиновых каналов.

На рис.7 показана кинетика уменьшения индуцируемого грамицидином электрического тока через мембрану, наблюдаемого после вспышки света в присутствии фотосенсибилизатора, фталоцианина. Видно, что добавление флоретина в водные растворы, омывающие мембрану с двух сторон, вызывает значительное замедление спада тока, тогда как добавление стирилового красителя RH421 приводит к ускорению спада. Аналогичное ускорение наблюдается также, если в мембране присутствует 6-кетохолестанол. Известно, что флоретин обладает способностью уменьшать, a RH421 и бткетохолестанол - увеличивать дипольный ' скачок потенциала. Кинетика спада тока во всех трех случаях хорошо аппроксимируется моноэкспоненциальной кривой (см. вставку).

На рис.8 приведены зависимости характерного времени фото инактивации (т) от стационарной проводимости БЛМ (Я°°), индуцированной грамицидином, в координатах от позволяющих определить константы скорости

формирования (кr) и распада (к0) димеров грамицидина согласно формуле (2). Из таблицы 2, в которой представлены результаты вычислений, видно, что к0 уменьшается после добавления флоретина и увеличивается после добавления RH421 или 6-кетохолестанола.

%

Х'^Ом-^см-'

Рис.7 Влияние флоретина(10 мкМ, кривая 2), №421 (1 мкМ, кривая 3) и 6-кетохолестанола (кривая 4) на кинетику спада индуцированного грамицидином тока через БЛМ после вспышки света в присутствии 1 мкМ фталоцианина (кривая 1 -контроль). Начальна* величина тока (.Го) составляет приблизительно 3 мкА. На вставке те же данные представлены в координатах 1п(Мм)/(.1о-.1») от времени. Стрелкой показан момент вспышки света.

Рис.8 Зависимость характерного времени (т) спада индуцированного грамицидином тока через БЛМ после вспышки света от стационарной проводимости БЛМ (Xю), представленная в координатах 1/тотХ. Кривая 1-контроль, кривая 2-в присутствии ¡0 мкМ флоретина, кривая 3- в присутствии I мкМ КН421.

Таблица 2.

Условия к0, с'1 кц, с"'моль"'см2 К, моль"'смг

контроль 0.31+0.03 (6±1)-1012 (1.9+0.5) Ю13

10 мкМ флоретина 0.043+0.014 (2.3+0.8) -1013 (54+26) -1013

1 мкМ ЯН421 0.71+0.05 (4.3+0.4)-1013 (6±1)-1013

6- кетохолестанол 0.73+0.09 (2.5+1.2>1013 <3.4±1.9)-Ю13

На рис.9 показаны записи тока через БЛМ, сделанные при низких концентрациях грамицидина, когда регистрируются флуктуации тока, соответствующие одиночным каналам. Видно, что добавление флоретина приводит к значительному увеличению времени жизни открытого состояния канала: среднее время жизни возрастает с 2,1 ±0,4 с до 20±3 с. Действие №421 оказалось более сложным: наряду с короткоживущими каналами, длительность которых составляет 0,67+0,15 с, наблюдаются каналы с временем жизни, большим чем у контрольных. Средняя проводимость одиночного канала грамицидина в наших экспериментах составила 16 пС в контроле, 21 пС в присутствии 20 мкМ флоретина и 11 пС в присутствии 1 мкМ 1Ш421. Результаты наших экспериментов по влиянию флоретина на проводимость одиночных каналов грамицидина согласуются с

Полученные нами данные показывают, что диггольные модификаторы оказывают значительное влияние на кинетику

сенсибилизированной фотоинактивации грамицидина, изменяя константы скорости образования и распада грамицидиновых димеров в мембране. ' Изменения константы диссоциации (ко), которая представляет собой величину, обратную времени жизни открытого состояния канала, коррелируют с изменениями дипольного скачка потенциала. Так, к0 уменьшается при понижении дипольного скачка потенциала под действием флоретина а

данными Андерсена (Andersen, 1978).

LJy

Флорстин

~ППГ

rr^lij

RH421

Рис.9 Индуцированные грамицидином флуктуации тока через БЛМ в контроле, в присутствии 20 мкМ флоретина и I мкМ ЯН421.

увеличивается при его повышении под действием RH421 или 6-кетохолестанола. С этими результатами хорошо согласуются данные об увеличении времени жизни открытого состояния грамицидиновых каналов под действием флоретина, полученные при регистрации одиночных каналов. Сложная картина записи одиночных каналов грамицидина в присутствии RH421, по-видимому, отражает наличие прямого взаимодействия красителя с антибиотиком наряду с сокращением времени жизни каналов при повышении дштольного скачка потенциала под действием RH421. Небольшие изменения проводимости одиночных каналов под действием дипольных модификаторов хорошо объясняются теоретическими расчетами ослабления электрического поля диполей внутри канала, выполненными в литературе (Jordan, 1983).

В отличие от изменений kD, в изменениях кл, вызванных добавлением дипольных модификаторов, не наблюдается корреляции с соответствующими изменениями дипольного скачка потенциала: при добавлении RH421 или 6-кетохолестанола кц увеличивается еще больше, чем при добавлении флоретина (табл.2). По-видимому, процесс формирования канала в большей степени чувствителен не к дипольному скачку потенциала, а к каким-то другим свойствам мембр'аны. Рассматривая механизм влияния дипольного скачка потенциала на время жизни канала, следует сказать, что процесс формирования и диссоциации димеров грамицидина, вероятно, включает перемещение диполей триптофановых остатков вблизи границы раздела мембрана - водный раствор, которое регулируется дипольным потенциалом.

Регуляция дипольным потенциалом была обнаружена ранее не только для электрогенного, но и для неэлектрогенного ионного транспорта, опосредованного переносчиком. Было показано, что потоки ионов, индуцируемые нигерицином, чувствительны к изменениям дипольного скачка потенциала (Antonenko & Bulychev, 1991). Эта чувствительность, вероятно, обусловлена тем, чгго при транспорте электронейтрального комплекса переносчика с катионом происходит движение диполей через границу раздела мембрана - водный раствор.

Выводы.

1. Показано, что освещение БЛМ светом видимого диапазона в присутствии фталоцианина вызывает рост проводимости, приводящий к разрыву мембраны в случае липидов, содержащих двойные связи в углеводородных цепях.

2. Обнаружено, что проводимость БЛМ, индуцированная каналообразующим пептидом грамицидином А, подавляется под действием видимого' света в присутствии фталоцианина. Полученные данные свидетельствуют о том, что фотосенсибилизированная инактивация грамицидиновых каналов связана со взаимодействием молекул пептида с активными формами кислорода, образуемыми при возбуждении фотосенсибилизатора. На уровне регистрации тока одиночных каналов показано, что повреждение грамицидина при фотодинамическом воздействии не приводит к появлению каналов с промежуточной проводимостью.

3. Показано, что кинетика спада индуцированной грамицидином проводимости БЛМ после вспышки света в присутствии фталоцианина хорошо аппроксимируется моноэкспоненциальной кривой с показателем экспоненты, близким к значению времени жизни грамицидиновых каналов.

4. Зависимость характерного времени фотоинактивации от стационарной проводимости БЛМ хорошо объясняется теорией, описывающей процесс установления равновесия между мономерами и димерами грамицидина в мембране после его нарушения в результате модификации части молекул грамицидина. Такой ■ механизм предполагает, что величина, обратная характерному времени фотоинактивации, линейно зависит от квадратного корня из стационарной проводимости мембраны. Предложен метод определения констант формирования и распада канала грамицидина в мембране на основе фотосенсибилизированной инактивации пептида. Рассчитанные константы реакции димеризации грамицидина хорошо согласуются с приведенными в литературе.

5. В определенных условиях наряду с медленным спадом тока в секундной шкале наблюдается быстрая фаза спада тока после вспышки света. Измерено

характерное время быстой фазы; предполагается, что она связана с переходом димера грамицидина в непроводящее состояние.

6. Обнаружено, что кинетика сенсибилизированной фотоинактивации грамицидина в мембране изменяется под действием модификаторов дипольного потенциала. Изменения константы скорости диссоциации димеров грамицидина под действием различных модификаторов дипольного потенциала коррелируют с изменениями скачка дипольного потенциала мембраны.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N., and Kotova E.A. The interaction of phthalocyanine with planar lipid bilayers: photodynamic inactivation of gramicidin channels. FEBS Letters, 329, 332-335, 1993.

2. Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N., and Kotova E.A. Photodynamic inactivation of gramicidin channels: a flash-photolysis study. Biochim. Biophys. Acta, 1275, 221-226, 1996.

3. Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N., and Kotova E.A. Effect of the dipole potential of a bilayer lipid membrane on gramicidin channel dissociation kinetics. Biophys. J. 73, 850854, 1997.

4. Антоненко Ю.Н., Рокицкая Т.И. и Котова E.A. Влияние дипольных модификаторов на кинетику сенсибилизированной фотоинактивации грамицидиновых каналов в бислойных липидных мембранах. Биол. мембраны, т, 15, 1998 (принята к печати).

5. Котова Е.А., Рокицкая Т.И. и Антоненко Ю.Н. Две фазы фотоинактивации грамицидина в бислойной липидной мембране в присутствии фотосенсибилизатора. Биол. мембраны, т. 15, 1998 (принята к печати).

6. Kotova Е.А., Rokitskaya T.I., and Antonenko Yu.N. Photodynamic inactivation of ionic channels formed by gramicidin A in planar lipid bilayers in the presence of phthalocyanine. Vlth Congress of the European Society for Photobiology, University of Cambridge, United Kingdom, September 3-8, 1995, Abstracts, number V[-lp/03.

7. Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N., and Kotova E.A. Photodynamic inactivation of gramicidin channels. Biophys. J. 70, 175a, 1996.

8. Рокицкая Т.И., Актоненко Ю.Н., Котова E.A. Исследование фотодинамической инактивации грамицидиновых каналов в бислойных липидных мембранах. I Всероссийская конференция фотобиологов, Пущино, 2S-30 мая 1996 г., Тезисы докладов.

9. Rokitskaya T.I., Antonenko Yu.N., and Kotova E.A. The kinetics of sensitized photoinactivation of gramicidin channels. Xllth International Congress on Photobiology, Vienna, Austria, September 1-6, 1996, Abstracts, number PI58.

10. Kotova E.A., Rokitskaya T.I., and Antonenko Yu.N. Membrane modulates the sensitivity of gramicidin channels to reactive oxygen species in the course of sensitized photoinactivation. The International Symposium Dedicated to the Memory of Academician A.A.Rrasnovsky "Problems and Trends of Biochemistry", Moscow, Russia, May 22-29, 1997, Abstracts, p. 36

Подписано а печать 09. 1998 года. Заказ N5 <3£ . Формат 60 х 90/,е. Усл. печ. л. Тираж 6& экз. Отпечатано на ризографе. Отпечатано в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.