Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутримембранные взаимодействия ионных каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Внутримембранные взаимодействия ионных каналов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИЙ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи

БУТЫЛИН Андрей Александрович

УДК 577.352.2

ВНУТРИМВ*БРАННЫЕ ВЗАШОДЕИСТВИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ CI3.00.02 - биофизика.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1991г.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факул! тета Московского государственного университета им.М.В.Ломоносс ва.

Научный руководитель: доктор физико-математических нау! профессор В.А.Твердислов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, вед.н.с.,

Зоров Дмитрий Борисович, кандидат физико-математических наук, н.с Григорьев Павел Александрович.

Ведущая организация: Институт цитологии АН СССР.

Защита состоится " ССЮсИ¥ 1991г. в 'Ал

часов на заседании Специализированного совета * 3 Отделеш физики твердого тела (К 053.05.77) в Московском государствен»: университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Леню с кие горы, МГУ, физический факультет, аул. С^А- .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физически факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^ " у^С*?-

Учаный секретарь Специализированного совета Л 3 ОФГТ кандидат физико-математических наук 1 озло)

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

:туальность. В последнее время проблемы биофизики мембран вызы-1ют значительный интерес в связи с той ролью, которую играют даолекулярные структуры в интеграции и регуляции клеточных тощий. Для биологических мембран весьма характерной чертой яв-штся латеральная гетерогенность и поперечная асимметрия в расселении белков и липидов. Исследования последних лет показа!, что такая гетерогенность, обусловленная их взаимодействием, жет быть связана с различными процессами в клетке: эндо- и 8к-зцитозом, самосборкой вируса, синаптической передачей, некото-ми стадиями иммунного ответа. Таким образом, в настоящее время леется значительное количество экспериментальных данных, свиде-эльствупцих в пользу активно идущих в мембране процессов агре-ации, кластеризации и т.п., обусловленных неравновесным харак-эром функционирования и взаимодействия встроенных в мембрану эмпонентов. Тем не менее, отсутствуют целенаправленные подхода, оторые выявляли бы конкретные молекулярные механизмы, обеспечи-апцие■взаимодействия мевду удаленными друг от друга погруженны-и в липидный бислой ферментами, каналами, рецепторами. Это обу-ловлено как сложностью исследуемого объекта, так и отсутствием азвитнх теоретических моделей и подходов. В связи о этим акту-льной является задача теоретического и практического исследована внутримембранных взаимодействий с использованием модельной истемы.

;ель настоящей работы. Целью настоящей работы явилось экспери-юнтальное и теоретическое исследование проблемы взаимодействия !8жду функционирующими в бислойной лигшдной мембране ионными кагалами, разработка методов, с помощью которых можно было бы выя-дать эти взаимодействия, а ?акже экспериментальная проверка воз-южных их проявлений.

1аучная новизна. На основе гидродинамического подхода проведен шализ поведения мембраны как тонкой пленки вязкой жидкости. По-сззано, что для параметров згой пленки, соответствующих таковым ум биологических и искусственных мембран, на пленке возможно зущвствование возмущений - флуктуаций толщины - волнового типа с сарактерными длинами волн и частотами для каждой из выявленных ед колебаний.'

Впервые на основе рассмотренного подхода предложен кон-

кратный механизм ввутримембранного взаимодействия грамицидиновь ионных каналов, состоящий в распространении ро липидному бислс волн деформаций, возникновение которых обусловлено процессах открывания и закрывания каналов.

На основе предложенной модели проведено систематическс экспериментальное исследование, в результате которого обнаруже! внутримембранное белково-белковое взаимодействие между функцис нирующими в липидаом бислое грамицидшювыми каналами и -показа! наличие элементарных функционирующих единиц, соответствующих I проводимости двум и трем одиночным грамицидиновым каналам. Пол; чены свидетельства в пользу того, что возникновение таких единз обусловлено агрегацией и кластеризацией функционирующих иошв каналов.

С помощью анализа временных рядов флуктуацкй проводимое обнаруиена параметрическая нелинейная концентрационная завис) мость отношения дисперсии трансмембранного тока к его сред» величине, на основании чего был сделан вывод о том, что повед нив системы грамицидиновых каналов является кооперативным. Пок. зано, что поведение отдельных ионных каналов является параметр: чески коррелированным, причем параметрами являются концентрац и трансмембранный потенциал,

Построена количественная вероятностная модель, учитывадц парные взаимодействия, описывающая такое поведение системы ио: ных каналов.

Практическое значение работы. Установление неизвестного ран биофизического механизма взаимодействия мембранных компонент создает основу для целенаправленного поиска путей управлен функцией такого взаимодействия. Полученные результаты и постр биные модели вносят вклад в понимание тонких молекулярных мех низмов внутримембранных белково-бежовых взаимодействий , прив дящих к латеральной гетерогенности, которая мокет быть обусло лена самыми разными процессами как на уровне клетки, так .и уровне клеточных популяций и тканей. Результаты могут использ ваться в биоэлэктронике при разработке технологических метод ' конструирования мембранных систем на основе ионных каналов, медицинской биохимии и различных областях биотехнологии, в лв ционных курсах по биофизике.

Апробация работы. Основные результаты работи были долояены ,6-м бее союзном -биохимическом съезде (Киев, 1986)-, 12-м Все сох

ном совещании по транспортным АТФазам (Иркутск, 1987), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран" (Минск, 1988), 4-м Международном Фрумкинском симпозиуме "Биоэ-лектрохямия мембран" (Суздаль, 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), Первой всеарабской конференции по медицинской биофизике (Каир,1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы (194 наименования). Работа изложена на 162 страницах, содержит 20 рисунков.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении обосновывается актуальность исследуемой темы, необходимость разработки теоретических и экспериментальных подходов, -которые выявляли бы физику процессов агрегации и ' кластеризации в биологической мембране, обусловленных неравновесным характером функционирования встроенных в мембрану компонент; кратко излагаются основные результаты работы и их научная новизна.

В первой главе с различных точек зрения - биологической, т.е. функциональной, и физической, т.е. конкретного механизма, осуществляющего функцию, - рассмотрены имеющиеся в литературе данные по мембранным транспортным системам и взаимодействиям меаду ними.

В §1 первой главы излагаются современные представления о структуре и функции основных типов транспорт!Шх систем биологических мембран. Охарактеризованы два основные класса этих систем - каналы(поры) и переносчики - с точки зрения механизма функционирования. Рассмотрены сроыштемтв возможности экспериментального моделирования транспортных систем СиомемОран с применением монослоев, липосом и плоских Сислойных мембран. Охарактеризованы некоторые мэмбраноактивные соединения, применяемые в модельных системах.

■ В 52 первой главы рассмотрены вкутримембрявше взчимспзй-ствия с точки зрения их физической сущности. Показано, что. по -

скольку липидный матрикс биологических мембран представляет собой жидкий кристалл, между встроенными в такой матрикс функционирующими макромолекулами можно ожидать возникновения взаимодействия особого типа, отличного от обычно учитываемых в биологии: ван-дер-ваальсова, кулоновского, дисперсионного и т.д., - динамического взаимодействия. Рассмотрены особености взаимодействия такого рода, связанные с наличием границы раздела фаз. Здесь также приведены данные касающиеся связи мембранных белков с липидами, влияния липидов на структуру и функцию мембранных белков. Показано, что вокруг молекулы белка, внедренной в бислой, всегда существует область искажений структуры бислоя, которая зависит от химии и геометрии белка и липидного состава мембраны, причем различные экспериментальные методы часто дают на одном i том же объекте значительно различающиеся оценки зоны искажений.

В §3 первой главы подробно рассмотрены причины гетерогенности в распределении мембранных компонент, которая возникав! как следствие белково-белковых взаимодействий. Рассмотрены теоретический и экспериментальный аспекты исследования внутримем-бранных белково-белковых взаимодействий. Обосновывается использование модельной мембранной системы - бислойнвя липидная мембрана (ЕЛМ) и грамицидин - для изучения таких взаимодействий.

Общий анализ литературы показывает, таким образом, чтс целый ряд работ свидетельствует в пользу существования в биомеы-бранах динамических взаимодействий, которые приводят ко взаимному сопряжению неравновесных трансмембранных и латеральных процессов (переносов), удаленных друг от друга на значительные i масштабах клетки расстояния.

Вторая глава описывает использовавшиеся материалы и метода исследования. Для получения плоских БМ использовали растворы i н-гептане и н-декане тотального препарата липидов соевых бобов -азолектина фирмы Signa (фосфатидилхолин : фосфатидилэтаноламин: фосфатидилинозит в эквимолярном соотношении). Каналы в БЛЫ формировали путем естественного встраивания молекул грамицидина А, В и С (фирма BoehrInger Mannhein, Hamburg). В некоторых случаю использовали грамицидин А, очищений методом ВЖХ. Для растворо! электролита применяли 0.1 М и 0.2 М KCl, приготовленные из пере-кристаллизовэнной х.ч. соли. Буферизация растворов осуществлялась с помощью буферов Trls-HCl и Tris-Base (Slgma). Опыты про-

- б -

дали при комнатной температуре, рН=7,4. Бислойные мембраны армировали по методу Мпллера на отверстии в тр^яоновой кювете «аметром 0.5 мм, контролируя процесс по величине емкостного то-з.

Экспериментальная установка по исследованию флуктуаций то-а через БЛМ была сконструирована и собрана автором. Для наложена потенциала и отведения сигнала с мембраны использовали двух-лектродный метод с применением хлорсеребрянных электродов, луктуации мембранной проводимости изучали при наложении на мем-рану (через делитель) постоянных потенциалов в диапазоне 0,1-40мВ от гальванического элемента. В качестве предусилителя ис-гальзовали усилитель постоянного тока Kelthley-427 (пределы ко-кййяциента усиления IQ4 В/А - 10мВ/А) или усилитель тока на ба~ ie отечественной микросхемы К140УД8А (Ю'°В/А). Верхняя частота ;реза фильтра в разных опытах составляла 30 или 100Гц. Для появления 50-герцовых наводок применяли заградительный активный Е&льтр на 40 дБ. Лабораторный усилитель использовали для согласования аналогового тракта со входом А1Щ. Визуальный контроль за &луктуациями тока осуществляли по осциллографу. Отслеживание низкочастотных изменений среднего уровня тока (трендов) производили при помощи самописца.

Для получения гистограмм флуктуаций ионных токов использовали АИ-1024 - 1024-канзльный анализатор импульсов, который использовали в режиме анализа непрерывных сигналов. Частоту оцифровки определяли, меняя частоту сгробирущих импульсов, подаваемых дополнительно с генератора импульсов Г5-54, в диапазоне, от 7Гц до 10кГц. Полученные гистограммы анализировали визуально на экране встроенного монитора, в том. числе и в реальном масштабе времени, либо выводя их на самописец, либо выводя их на алфавитно-цифровое печатающее устройство.

Для записи рядов с высоким временным разрешением установка была состыкована с IBM-совместимой персональной ЭВМ Роботрон СМ 1910 (тактовая частота 4 МГц, объем ОЗУ 512 К). Оцифровка сигнала, снимаемого с лабораторного усилителя, осуществлялась. 9-разрядным АЦП Ф7077/2 (собственное время преобразования 3 мкс) с симметричным входом IB. Для уменьшения методических ошибок, связанных с некоторой нестабильностью последнего разряда АЦП, в ЭВМ вводили только старшие 8 разрядов (один из которых - знаковый) через параллельный порт типа Centronics. Максимальна возможная

частота считывания данных с АЦП лимитировалась скоростью обращения микропроцессора к параллельному порту (через интерфейс Intel 8255) и составила 17кГц. Максимальная длина ряда, который мог быть введен в ЭВМ в режиме непрерывной, равномерной по времени оцифровки определялась свободным пространством ОЗУ и составляла немногим более 4 Ю5 точек. В реальных экспериментах использовали частоты оцифровки до 1кГц и длины рядов от 60 до 200 тысяч точек.

Характерные емкости исследуемых мембран составляли 0,8-1,1нФ, что соответствует площади бислойной части О,10-0,15мм2. Времена жизни БЛМ, с которых производили автоматизированную запись токовых шумов, составляли от 2 до 7 часов.

Показано, что ток через одиночный канал, образованный грамицидином А, при 50мВ составляет 1пА. Близкими величинами характеризуются каналы из грамицидинов В и С. Меняя концентрацию добавляемого раствора грамицидина, добивались величин среднего тока через БЛМ в диапазоне 3 IQ1 - 3 Ю6 пА (при 50мВ), что соответствует 30-3 I06 одновременно'открытых каналов. Если предположить, что случайные процессы открывания-закрывания каналов слабо зависимы, то средняя амплитуда токовых флуктуаций должна быть пропорциональна Vn, где. п - среднее число одновременно открытых каналов. Для случая п = 3 Ю6 амплитуда токовых флуктуаций составит 1.7 10эпА или 0.06Ж от среднего значения. Разрешение подобных шумов осуществляли сдвигом среднего значения напря-кешя, снимаемого с фильтра, до нулевой величины после достижения стационарности процесса флуктуаций проводимости и последующим усилением напряжения с помощью лабораторного усилителя до максимального использования входного диапазона АЦП. В результате из 256 градаций входного сигнала, допускаемых АЦП, удавалось использовать около 200 (приблизительно симметрично относительно нуля).

Специальные меры были приняты для демпфирования, системы от механических колебаний лабораторного стола и оборудования.

В третьей главе представлены результаты и их обсуждение,

В §1 проведен краткий анализ экспериментальной аппаратуры

с точки зрения ее пригодности для решения поставленной задачи. Приведены вольт-амперные характеристики БЛМ, использовавшихся в

эксперименте, с разными растворителями, ' кратко рассматриваются

- ? -

лияние спирта (основного растворителя грамицидина) на проводи-;ость БЛМ и эффект перемешивания в примембранном слое как возмо-ные источники ошибок. Показано/ что в условиях эксперимента |Тими факторами можно пренебречь.

В §2 представлены результаты амплитудного анализа тока че->ез КЛМ, модифицированной коммерческим препаратом грамицидина [смесь грамицидинов А,В и С)(рис.1). По гистограмме на рис.1 южно судить о числе различных типов образующихся каналов и о шстоте встречаемости (площадь под пиками). Данные других авто-эов (Andersen 'et al., 1988) и наши позволяют считать доказанной зозможность существования гибридных грамицидиновых каналов в

злм. *

В §3 третьей главы посвящен изложению гипотезы о роли механических колебаний мембран в ее динамической организации. - Согласно этой гипотезе, биомембраны являются двумерными распределенными неравновесными системами, обеспечивающими сопряженное функционирование молекулярных преобразователей энергии и информации с помощью механических колебаний. Трансмембранные потоки вещества и энергии возбуждают в мембранах колебательные мода, определяющие пространственно-временную организацию мембран, характерную для дассипативных структур (рис.2). С помощью полученных ранее соотношений (Maldarelli et al.,1980) были рассчитаны критические (с точки зрения гидродинамической устойчивости) для симметричной и антисимметричной мод (СМ и АМ):

*.см= 28км vCM= 100Гц

Хам=520нм vaM= 5300Гц

Получены энергетические характеристики колебательных мод в мембране: плотность энергии изгиба в расчета на длину волны в пред-положении нулевой спонтанной кривизны может быть представлена в

виде :

Fx= 32%4DB2/X4

(£ - модуль изгиба, В - амплитуда). Для устойчивой мода СМ F-^=13kT, что сравнимо с энергией единичных актов преобразования энергии в клетке (гидролиз АТФ, 25kT).

В этом ке параграфе обсуждается возможность экспериментального -обнаружения рассмотренных мод колебаний.. Показано, что применение обычных усилителей постоянного тока общего назначения не позволяет достичь желаемой точности регистрлпии сигнала при

10000

1000

100

10 Ттттт

I. А

ло ме И 33 ив

Рис Л. Типичные распределения проводимости ~БЛМ, модифицированные смесью грамицидинов А, В, и С; малые концентрации. Полимодальность обусловлена существованием в мембране гибридных грамициди-новых каналов (А-В, В-С, А-С). Данные с амплитудного анализатор! АИ-1024: частота стробирования 100Гц, время записи 15 мин. Напряжение на мембране 40мВ.

Рис.2. Гидродинамически устойчивые мода механических колебагаС мембраны, а - симметричная (СМ), б - антисимметричная (АЫ).

эответствупцей частоте среза, чем объясняются трудности экспе иментальнаго обнаружения мод. Результаты одной из работ (Ring t al.,1986), выполненной в соответствии с изложенными технический требованиями, допускают удобную их трактовку с позиций из-оженной гипотезы.

54 третьей главы посвящен детальному рассмотрению вероят-остного и энергетического аспектов функционирования системы рамицядиновых каналов в БЛМ с точки зрения возможности сущест-ювания на мембране мод механических колебаний.

В Первой части формулируются и обсувдаются модельные пред-юложения: предполагается, что интересующие нас флуктуации грансмембранного тока являются следствием случайного открывания I закрывания идентичных ионных каналов, т.е. флуктуации тока со-зтветствуют флуктуациям числа ионных каналов, открытых или -закрытых при соответствующих условиях.

Во второй части рассмотрены физический и математический аспекты понятия независимости функционирования канала. При увеличении объемной концентрации белка число каналов в мембране возрастает, среднее расстояние между соседями уменьшается, что и отражается на взаимодействии между отдельными димерами. В зависимости от симметрии молекулы белка степень разупорядоченности в окружающем бяслое (зависимость ее от г - расстояния от данной точки до молекулы бежа) может быть обратно пропорциональна различным степеням г - от г'6 до логарифмических зависимостей (На-миот,1984), причем размер поля искажений в сильной степени-опре-деляется липидным составом мембраны (см., напр. Haines, 1978). Основой распространения и взаимодействия полей искажений могут служить конформационные переходы, осуществляемые мембранными белками. Такие переходы носят неравновесный характер (Блюмен-фельд,1977) и приводят в большинстве случаев к значительным изменениям геометрии белка и окружающего бислоя. В силу особенностей организации бислоя, расстояния, на которые могут распространяться возмущения динамического, надмолекулярного типа, существенно отличаются от таковых при статических возмущениях. Грами-цидиновнй канал, который при открывании и закрывании претерпевает значительные конформационные перестройки, может служить удобной экспериментальной моделью такой системы.

Третья часть посвящена рассмотрению модели, описывающей поведение системы грамишдиновнх каналов в БЛМ при малых объем-

цых концентрациях.

Пусть И- полное число каналов в мембране, I- ток чере: один канал при данном напряжении на мембране и. Введем величин] которая может принимать следующие значения характеризует состояние канала):

£ = 1 (канал открыт, вероятность состояния р); (1а)

5 = 0 (канал закрыт, вероятность состояния ч)., (16)

При атом, разумеется, q = 1-р, а вероятности рассматриваются I данный момент времени. Вероятность соответствующих состояний мь понимаем в следующем смысле. Пусть в мембрану встроен толькс один канал и ничего более. Будем наблюдать за ним большой промежуток времени, настолько большой, что канал успевает перейти иг одного состояния в другое много раз. Тогда естественно определить вероятность открытого состояния как отношение полного времени пребывания в открытом состоянии к полному времени наблюдения. (Аналогично - для закрытого,состояния). Тогда в случае независимых каналов:

В(1) К 12рд

Ц = 1(1-р), ■ (2)

где ОСТ) - дисперсия тока, 1Ср- средний за время измерения тон .через мембрану. Таким образом, если при данной- концентрации соотношение (2) не постоянно, то, в соответствии с моделью, меняется либо I, либо р.

На рис.3 представлена типичные зависимости этого соотношения от концентрации при разных напряжениях на мембране в качестве параметра, которые находятся в удовлетворительном согласии с моделью (2). Однако, при повышении концентрации грамицидина в объеме наблюдаются отклонения от линейного характера зависимости В(1)/1Ср, имеющие достаточно сложный.характер (рис.4).

• Поэтому четвертая часть §4 посвящена описанию системы функционируяцих-грамицидиновых каналов на основе представления о возможности существования на мембране мод механических колебаний. Исходя из рис.4, мы должны отвергнуть гипотезу о независимости каналов. Без этого предположения выражение для дисперсии тока (суммы случайных переменных £{).будет иметь более общий вид

0(1)/<1>

10 мв

[С],у.е. 20 мв 30 мв

40 мв

10

0(!)/<1>

0.1

0.1

■ во ыв

1

- эо мв

100 Мб

10

Рас.З. Проверка соотношения 1(1-р), гда ГСр- средний

за вромя измерения ток чераз мембранудисперсия токе, (ток одроз один канал, р- вероятность открытого состояния, а),б) разные молйраиы при расных напряжениях; малые концентрации грамицидина ([(?]).

\

10 мв -+-.20 м8 -*- 30 мв ' -е- 40 мв

10 100 1000 10000 100000

[с],у...

-*- 60 мв —30 МВ 100 ив

Рис.4 Проверка соотношения Ь(1)/1Ср= 1(1-р), где 1Ср- средний за время измерения ток через мембрану," 0(1)- дисперсия тока, I-ток через один канал, р- вероятность открытого состояния, а),б) разные мембраны при разных .напряжениях; большие концентрации грамицидина (1С)).

D( 2 í.) = S Di + 2 cov(t.;t,), (3)

t ¿

где второе слагаемое в правой части - ковариация соответствующих таременных:

cau(tt;(j) « m^ij) ~ *(tj) (4)

Получим теперь выражение для ковариации:

■ Е i.í.PdV, *(i,) - MfS J = Р. (б) 1 ^ сост. * ^

где Р(11) - (по определению) вероятность события, которое состоит в том, что одновременно открыты оба канала (т.е. В противном случае (£{=0 или 5^=0) соответствующее слагаемое пропадает.-

Ыы, таким образом, с чисто формальной стороны подошли к предположению о парном характере гипотетических взаимодействий, приводящих к нелинейности экспериментальных зависимостей.

Рассмотрим вполне возможный вариант такого взаимодействия. Размер грамицидинового канала по оси составляет 26 %, тогда как толщина мембраны - 40- 60 8. С энергетической точки зрения закрытое состояние является более выгодным, чем открытое. Это обусловлено, тем, что при закрывании канала прилегающий к нему вислой испытывает значительные искажения - образуется вогнутость, уменьшается радиус кривизны и т.п. В некоторой окрестности канала мембрана будет иметь меньшую толщину, будет как бы локально "поджата". И если в зоне таких искажений окажется другой закрн-тый грамицидиновый канал, то для его открывания энергетический барьер будет понижен (рис.5). Произойдет локальная "сшивка" би-слоя. При этом второй канал закроется не сразу, а спустя время, необходимое для распространения волны деформаций бислоя от первого канала (закрытого в данный момент). Надо отметить, что второй канал закроется, разумеется, с некоторой вероятностью, зависящей от первого канала, т.е. с условной вероятностью.

Рассмотрим следующее вероятностное описание этой ситуации. Как и ранее,

Р(1) = р, Р(0) = f-p = q ■ (6)

(для независимого канала (уединенного)). Но теперь мы должны

ввести еще и условные вероятности пробывашш одного из каналов i некотором состоянии в зависимости от состояния другого:

Р(111) = р + а, Р(ОЮ) = 1 - р + 7 (7а)

Р(ОП) = 1 - р - a, P(1i0) = р - 7 (76)

где а и 7 отражают изменения вероятностей соответствующих состояний и зависят от расстояния между каналами:

ч

а = afrtJJ) = a(r)>0, j = 7fr;>0 (8)

По форлуле для вероятности совместного события имеем:

PfOOM (1 -р)( 1,-р^у) Р(01) = р(1-р-а) (9а)

Р(10) = (1-p)(p-D Р(11)=р(р+а) (90)

Условие нормировки выполнено. Поскольку каналы идентичны,

Р(01) = PfiOJ, (10)

или a/7 (1-р)/р. (II)

Соотношение (9) имеет следующий физический смысл: вероятности состояний для каждого канала должны измениться, но так, чтобы на суша была равна единице, т.е. мы фактически имеем не два параметра, а один - а.

Предположим, что каналы расп/ределены в плоскости мембрань равномерно, и что данный канал может взаимодействовать не сс всеми сразу, а лишь с теми, расстояние до которых не превышает некоторую величину а (эффективный радиус взаимного влияния каналов), a«R, (Я - радиус мембраны). Перейдя от суммирования к интегрированию (показано, что ошибка в этом случае составит незначительную величину a/R по отношению к R), получим выражение (12)

. D( Z ) = Np(t-p) + 2p(N/R)2 / а(г) г dг, (12).

г0

- дисперсия тока в системе каналов с парными взаимодействиями, причем второе слагаемое в правой части ответственно именно за эти взаимодействия, физика которых заключена в a (г.).

Каков физический смысл в afrj? Поскольку среднее время гк-зш! канала при прочих равных условиях зависит от толщины мембраны, а среднее время пребывания канала в каждом из состояний экс-

»

зненциально зависит от разности энергий этих состояний, из пра-¿дущего следует, что

а = Е/(Ег + 1) - Е/(Е1 + (13)

дв ехр[- АСГЛ^/йГ] ш Е1 й ехр 1-№(П-г)/ЬТ] * Ег, а отра-

ают изменение анергии системы при распространении по мембрана олны деформации, сопровождающееся изменением ее толщины (Ь-г)'. ля оценки а воспользуемся тем обстоятельством, что

р/(1-р) = р/д = ^открытое 7 Закрытое • (14)

'ДО Открытое и Закрытое " ^Д®19 вРемэна соответствующих юстояний на достаточно большом промежутке времени наблюдения. )даако, даже в случав малых концентраций, у нас нет уверенности, (то одиночные открывания и закрывания относятся к одному и тому ге каналу. Поэтому для оценки р мы воспользуемся приведенным в здной из работ (Ермишкин с соавт.,1982) коэффициентом распрвде-яения белка между объемной фазой и мембраной и данными рис.4. Рогда р ыоето оценить следующим образом:

число "димерных" мономеров

р » —---— * ехр[-Аб/кТ] (15)

полное чиоло мономеров

Пусть закрытое и ' открытое состояния канала представимы следующей энергетической диаграммой (рис.б(в)), где АО - разность уровней закрытого и открытого состояний, которая и определяет время пребывания канала в том или ином состоянии. Будем полагать

" ^открытое" ^закрытое *

Зная р, можно оценить изменение энергии в случав, например, минимальной концентрации, когда взаимодействие начинает проявляться: АС * 5,ТкТ. Это значение АС является, как минимум, суммой двух слагаемых: энергии, выделившейся при образовании б водородных связей, и энергии деформации мембраны, вызванной вновь образовавшимся каналом. Таким образом, для а из (13) получена некоторая оценка величины £,/(? + Здесь мы можем лишь предполагать, каков энергетический вклад каждого из слагаемых. Зная полный ток через мембрану и проводимость одиночного канала, оценить среднее расстояние между функционирующими каналами, т.д. дилерами.

& и

ко о

«а

\ \ 1,,

N ч

\

и *

а *

О «

«к

и &

ь

л

о <

\

<Ь

<3

г©

Рис.6. Изменение энергетических уровней открытого и закрытогс состояний грамицидинового канала, обусловленные искажение» бислоя в его окрестности (см. рис. 5, объяснения в тексте); ЮЬ концвнтрация грамицидина.

Окончательный результат представлен на рис.6(а,б), где оказана зависимость изменения расстояния мевду функционирующими аналами в.мембрана от концентрации белка в растворе и связанное этим изменение свободной энергии системы. Как видно из рис.6, ри концентрациях около 10эу.е. расстояние меаду каналами стано-ится порядка длины волны анисимметричной моды. Поэтому мы, в финципа, ухе не имеем права пренебрегать волновыми эффектами, ¡озникает вопрос: откуда берется различие в энергиях ^зато.~ 1Сне завис ? ^ что с повышением концентрации величина ДС,

шределящая вреш} пребывания канала в том или ином состоянии, вменяется. Когда канал закрыт, он может оставаться в таком состоянии довольно долго. Когда so он открыт-, то имеет место "кон-<уренция" между двумя указанными выше слагаемыми, которая носит io термодинамический, а кинетический характер, т.к. ситуация неравновесна, исход ее в каждый момент времени решает конкретная "расстановка сил". Поэтому если к энергии деформированной мембраны добавляется энергия деформации, вызванной деформациями вне рассматриваемого локального участка мембраны с каналом, то это и может привести к закрыванию канала. Величину этой добавки кы оценили (см.рис.6); Она составляет L(LG) * 5 kT. ' ! Таким образом, предположив положительную косперативность в рассматриваемой модели, 'мы пришли к противоречию: величина а (см. (13)), являвшаяся гипотетической добавкой к вероятности открытого состояния, оказалась меньше нуля. Теперь легко трактовать результаты работы, упомянутой.выше (Ring et al.,1986): наблюдались только состояния закрывания канала и практически отсутствовали открывания.

Следовательно, с повышением концентрации белка вероятность пребывания грамициданового канала в открытом состоянии не увеличивается, как мы предполагали, а падает. При этом энергия дополнительной деформации мембраны практически совпадает по величине с энергией деформации, создаваемой антисимметричной модой.

§5 третьей главы посвящен анализу возможности "агрегации грамицйдановых каналов. Встроенных в БЛМ. Сдвиг триптофановой флуоресценции позволил предположить (Cavatorta et al.,1986), что в бислойных везикулах существуют парные димеры грамицидина (т.е. тетрамвры). Там также высказывалось предположение о существовании гексамеров (проводящих тримеров). Нам удалось в конкретной экспериментальной системе проверить это предположение на основе

уже имеющейся простой модели (Bamberg et al.,19T3). Пусть в мем бране имеется равновесие между мономерами и дилерами:

А + А J А., (17)

кп d

где kR и kD - константы переходов соответственно слева направо наоборот. Если при подаче напряжения константы изменятся, то

Л k$ «г bR

—УГр- -й- = к= —— = -— (18)

(*°,>2 4 <*,> 2 h

где "ноль" означает исходное состояние; в правой части - коне танты, соответствующие бесконечному промежутку времени, прошед шему с момента подачи напряжения. Из (18) можно получить легк решаемое дифференциальное уравнение, из которого, в предположе нии, что полное число молекул в мембране за время эксперимент не меняется, следует выражение

fSIj2

erf

А/(ХА), ■ . (1Э)

используя которое получаем значения проводимости одиночного ка нала.

Гистограммы проводимости, апроксимированные нормальны распределением, представлены на рис.7. Видно, что в диапазон исследованных напряжений, величины проводимостей группируютс около определенных средних значений: 7-8 пС, 18 пС и 27 пС. Зт значения по порядку величины совпадают с полученными ранее зна чениями проводимости одиночных каналов если считать, что сущест вуют двойные проводящие каналы, а также тройные. По-видимому этот результат можно считать подтверждением о возможности су шествования двойных и тройных каналов грамицидина в бислойно липидной мембране. Отметим здесь несколько странную ("скачкооб разную") зависимость возникновения парных и т.д. состояний о прикладываемого к мембране напряжения: парше т.д. каналы (есл это они) возникают начиная примерно с 70 мв с. интервалом окол 40 мв.

В §6 третьей главы обсуждается' возможная роль механически колебаний мембран.~5"тй~волны могут влиять на процессы, связанны с межмомЗршшыми взаимодействиями, а также латеральными внутри

Рао.Б. Сзюматаческоа кзобрагэвка двух соовднзх грешщиднновнх каналов в кембренэ (к расчету условной вероятности открытого И закрытого состояний, см. ршс.б.).

Рно.7. Поланодальше рвспрвдэлэкая значанкЗ тока чврэа каибрану, кодг^зцирозаннуо грамицидином А пря калиг концентрациях (оданочт зягэ канала), рассчитанные ез эксдаркйвнтальных данных а ооотвэт-отвш с шдальв <1Э) (по даспэрзии а срэдаему соху) по гоалэдо-ватвльшэ« участкам збписи. тска. рвотворитэлз: I- декан, 2-4 -гвотвз;.Н- число каналов.

мембранными взаимодействиями белков и липидов: при деформациях внутренние напряжения сникают энергетические барьеры переходов, связанных со взаимным перемещением молекул и их частей - конфор-мационные переходы могут ускоряться при "размораживании" выделенных степеней свободы (Бутягин с соавт.,1974).

Такие колебания не могут быть вызваны тепловыми флуктуаци-ями толщины и требуют подкачки энергии. Учитывая, что в нормальных условиях из энергии в^25кТ, соответствующей гидролизу одной молекулы АТФ, примерно 1ЬкТ затрачивается на отбор и перенос ио-. нов, остаток в ЮйГ может, в принципе, затрачиваться на возбуждение механических колебательных степеней свободы в мембране прежде, чем диссипирует в тепло. Получена формула для энергии радиЗльно-симмэтричной деформации бислоя волнового типа:

гг яп*\/г ' 1&В?соагЬ(г-Пп) г Лг Ло

АС - О / 0 / -5-3-5-0-7-75-, (20)

о Яд 1НЬгВ?а1п2к(г-110))1/г

где г,ф - полярные координаты, Х.-длина волны, В- амплитуда, Я0-радиус молекулы белка. Для значений А., полученных в §3 третьей главы, получим ДС = 7 кТ, что соответствует оценке, приведенной выше.

ВЫВОДЫ

1. Проведено систематическое экспериментальное исследование, в результате которого обнаружено внутримембранное межмолекулярное взаимодействие между функционирующими в липидаом бислое грамици-диновыми каналами.

2. На основе гидродинамического подхода проведен анализ поведения мембраны как тонкой пленки вязкой жидкости. Показано, что на такой пленке, возможно существование возмущений - флуктуация толщины - волнового типа с характерными длинами волн к частотами для каждой из соответствующих мод колебаний:

Ясм= 28нм; усм= 100Гц _ (для симметричной моды); '

Я.ам=520нм; г>ам= 6300Гц (для антисимметричной мода). Получе1ш энергетические характеристики колебательных мод в мембране .

3. Предложен механизм внутримембранного взаимодействия грамици-дановых каналов, состоящий в распространении по липидному бислов гидродинамически устойчивых волн деформаций, возникновение кото-

рых обусловлено процессами открывания и закрывания каналов.

4. Разработана модель, на основе которой проведен анализ временных рядов флуктуаций проводимости. Обнаружена параметрическая нелинейная зависимость отношения дисперсии трансмембранного тока к его средней величина, что позволяет оценить отосительное изменение энергии закрытого состояния: AG * 5 kT, совпадающее по величине с энергией деформации, создаваемой симметричной модой колебаний. Характерный радиус взаимодействия - г * 500 нм - соответствует по величине антисимметричной моде колебаний.

5. В мембране со встроенными ионными каналами обнаружено наличие элементарных функционирующих единиц, соответствующих по проводимости двум и трем одиночным грамицидиновым каналам, возникновение которых может быть объяснено кластеризацией функционирующих грамицидиновых каналов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Бутылин A.A., Полонский C.B., Михайлов A.C., Яковенко Л.В., Твердислов В.А.. Тезисы докладов Всесоюзно^ конференции "Структурная динамика биологических мембран", 31 мая - I июня 1988 г., Институт фотобиологии АМН БССР, Минск, с.26.

2. Яковенко Л.В., Бутылин A.A., Твердислов В.А. "Механические колебания и динамическая .организация биомембран","Биофизика", 1987, т. 32, с.273-279.

3. Яковенко Л.В., Бутылин A.A., Твердислов В.А. Тезисы докладов 12-го Всесоюзного совещания по АТФазам. Иркутск, 14-17 июля 1987 г., с.71.

4. Бутылин A.A., Ритов В.Б. "Прохождение адвнозинтрифосфата через аламэтнцшювые каналы в бимолекулярной липидно мембране", доклада АН СССР, 1990, Т.310, » 3, C.73I-734.

5. Яковенко Л.В., Бутылин A.A., Твердислов'В.А. Тезисы докладов мездународного симпозиума "Молекулярная организация биологических структур". 19 - 24 июня 1989г., Москва, с.72.

: 6. Бутылин A.A. Физические основы самоорганизации биологических мембран. Тезисы докладов всесоюзного совещания-семинара "Wh--женерно-физическив проблемы новой техники". Звенигород, 23-29 сентября 1990г,- Изд-во МГТУ, 1990, стр.146-147,

7. Butylln, A.A., Ivanov, P.S. Antiviral drugB/llpid membrane .Interactions. In: Abstracts of The Firet Arab Conference On Medical Biophysics Cairo Univ. 15-17 January, 1991, p 28.