Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретическое исследование кинетических характеристик взаимодействующих ионных каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Теоретическое исследование кинетических характеристик взаимодействующих ионных каналов"

МОСКОВСКИМ ордена ЛЕНИНА, ордена ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ и ордена ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК: 577.3

Кадочникова Виктория Викторовна

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ ИОННЫХ

КАНАЛОВ

(специальность 03.00.02. - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор физико-математических наук профессор В .А. Твердислов кандидат физико-математических наук с.н.с. Л.В. Яковенко Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.Н. Каданцев доктор физико-математических наук, вед.н.с. В.Н. Буравцев

Ведущая организация: Институт электрохимии РАН.

Защита диссертации состоится года в

часов на заседании специализированного совета №3 ОФТТ (К 053.05.77) в Московском государственном университете им М..В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносов а, физический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "94 года

Ученый секретарь специализированного

совета №3 ОФТТ к.ф.-м. н. Т.М. Козлова

1. Общая характеристика работы.

Актуальность_темы. Развитые в настоящее время

электрофизиологические методы исследования одиночных каналов позволяют определять кинетические характеристики ионного канала непосредственно из экспериментальных данных. Существуют экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что между ионными каналами, функционирующими в мембране, имеется взаимодействие. Физические принципы взаимодействия каналов в мембране объяснены в теории, определяющей его как взаимодействие макромолекул, погруженных в жидкий кристалл. Экспериментальное и теоретическое исследование функционирования ансамблей каналов обнаружило способность каналов к образованию кластеров вследствие взаимодействия их друг с другом. Однако в настоящее время остается открытым вопрос о том, является ли конкретная запись флуктуации тока продуктом функционирования нескольких независимых каналов, взаимодействующих каналов или одного канала с различными подсостояниями проводимости. Особый интерес вызывает тот факт, что совпадение экспериментальных амплитудных гистограмм с биномиальным распределением вовсе не означает независимого функционирования каналов, поскольку не исключается возможность присутствия в мембране неидентичных взаимодействующих каналов. Актуальными в этой связи представляются теоретическое изучение качественного отличия кинетических характеристик зависимых и независимых каналов. Решению этой задачи и посвящена предлагаемая работа.

Цель работы: Целью настоящей работы является детальное теоретическое исследование особенностей функционирования ионных каналов в мембране, включающих изменения кинетических характеристик системы при переходе к ансамблю независимых каналов и при взаимодействии каналов посредством положительной кооперативности. Выполнение работы было связано с решением ряда конкретных проблем и задач:

-моделирование тока изолированного активного элемента без конкретизации констант скорости перехода, что физически соответствует функционированию одиночного ионного канала в бнслое.

-моделирование суперпозиции токов нескольких независимых активных элементов и исследование качественного изменения кинетических и статистических характеристик ансамбля относительно характеристик одиночного канала.

исследование особенностей функционирования зависимых и независимых каналов, обладающих различными вероятностными свойствами. Действительно ли отклонение экспериментальных гистограмм от биномиального распределения может быть объяснено присутствием неидентичных ионных каналов.

- исследование изменения среднестатистических характеристик, таких как время жизни канала в закрытом состоянии, от различных факторов: энергии взаимодействия каналов, уровня пороговой энергии, неоходимой для перехода канала из закрытого состояния в открытое, параметров исходного шумового сигнала.

Научная новизна работы.Основные результаты работы представляются нам новыми. Предложена оригинальная теоретическая модель, представляющая функционирование ионного канала как клеточного автомата. В ходе предварительного исследования определено, что взаимодействие между каналами в ансамбле приводит к возникновению когерентных состояний проводимости системы. Предложен механизм внутримембранного взаимодействия ионных каналов, основанный на зависимости вероятностных свойств канала от уровня пороговой энергии, необходимой для перехода канала из одного состояния в другое. С помощью флуктуационного анализа модельных шумов получена качественная картина зависимости среднего времени жизни канала от его вероятностных свойств. Впервые определены характерные отличия корреляционных функций, гистограмм полного времени, проведенного системой на каждом уровне тока, и распределений времен жизни зависимых и независимых ионных каналов. Установлено, что увеличение среднего времени жизни канала в открытом состоянии свидетельствует о наличии взаимодействия между каналами в ансамбле. Определено, что неэкпоненциальный характер распределений времен жизни и отклонение амплитудных гистограмм от биномиального распределения является следствием только кооперативного действия каналов, как идентичных, так и обладающих различными вероятностными свойствами. Исследовано изменение характеристик взаимодействующих и невзаимодействующих ионных каналов в звисимости от формы шумового сигнала с заданной корреляционной функцией, что дает возможность судить о характере энергетических процессов, происходящих в системе.

Практическое значение. Полученные результаты вносят вклад в понимание особенностей взаимодействия ионных каналов в мембране и закономерностей кинетики неидентичных каналов. Результаты работы могут

быть использованы при решении сугубо практических задач идентификации экспериментальных данных кинетики ансамбля каналов, позволяют связать наблюдаемые в эксперименте величины с внутренними характеристиками исследуемой системы. Использованные численные алгоритмы, реализованные на ЭВМ в виде отлаженных программных модулей, применимы для выполнения новых экспериментальных и теретических исследований. Сравнительный анализ статистических характеристик совместного функционирования в ансамбле ионных каналов может использоваться при изучении кинетики каналов и биофизики мембран вообще. Результаты работы могут использоваться в теоретической и практической вирусологии при изучении вопроса о самосборке вирусных белков на мембране инфицированной клетки, при исследовании кооперативного действия ионных каналов и др.

Апробапия работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, докладывались на научных семинарах кафедры биофизики физического факультета МГУ, на международной конференции, посвященной памяти А.Г. Гурвича, сентябрь 1994 г., г. Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано -Ц печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах, содержит 41 рисунок, 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 150 наименований.

2. Содержание работы.

Во введении дается общая характеристика работы, обосновывается актуальность исследуемой темы, формулируются основные задачи и цели исследования, излагается научная новизна результатов.

Первая глава представляет собой обзор литературы по теме диссертационной работы. Излагаются данные по кинетике единичных каналов в аспекте основных способов описания ионных токов. Отмечены основные трудности экспериментального изучения кинетики, связанные с фильтрованием очень коротких (<100 мс) времен жизни канала при записях и способы решения этой проблемы, предложенные различными авторами. Приводятся экспериментальные и теоретические данные по изучению белок -белковых взаимодействий и агрегации белков в мембране. Отдельно уделено внимание теории, описывающей взаимодействия белковых молекул в мембране как в жидком кристалле с учетом влияния раздела фаз. Приводятся

к

характеристики и анализ других существующих в настоящее время теоретических способов описания таких взаимодействий. Кроме того, дан обзор и сравнительное описание основных теоретических моделей ионных каналов: марковской, диффузионной и фрактальной. Отмечены достоинства и недостатки каждой из них. Проанализированы разработанные на данный момент модели агрегации белков в мембране, В конце первой главы перечислены основные нерешенные вопросы и проблемы, которые исследовались в представленной работе.

Вторая глава содержит исследование особенностей коллективного поведения системы 450 идентичных ионных каналов.Обосновывается возможность представления единичного ионного канала как отдельного элемента клеточного автомата. Вся система каналов моделируется плоской решеткой , в узлах которой находятся идеализированные элементы, могущие находится в двух состояниях и описываемые переменной А^. Предполагается, что переменная А^, характеризующая состояние элемента клеточного автомата в данный момент времени, может принимать только два значения: канал открыт, А,=0, канал закрыт. Переход канала из открытого состояния в закрытое происходит с вероятностью V/ . Средний период переходов канала равен Т=1/л* +1 /ук . Средние значения времен жизни закрытого и открытого состояний равны соответственно: То=1/™ Т1=1/\у" Вероятности найти канал в открытом и закрытом состоянии равны, соответственно: Р1=« и ). Поскольку мембрана

обладает упругими свойствами, то естественно предположить, что при конформационных изменениях ионного канала в ней возникают упругие деформации, которые оказывают влияние на вероятность переходов канала между открытым и закрытым состояниями. Для определенности мы считаем, что влияние сказывается только на вероятности перехода из открытого состояния в закрытое -и» . Суммарное поле упругих напряжений на ц-элементе, создаваемое остальными элементами системы, можно считать линейной суперпозицией их полей.

(1)

Таким образом, если канал находится в точке с упругим напряжением О ^ и открыт, то вероятность его перехода в закрытое состояние к следующему моменту дискретного времени равна =\У0+{(ст;]), где ЦО-) - некоторая монотонно возрастающая функция. Мы предполагаем, что вероятности

перехода в закрытое состояние \у должна более или менее резко возрастать от одного практически постоянного уровня до другого в узком диапазоне значений <У вблизи некоторого критического значения. Такой выбор вида лу основывается на данных о том, что время жизни канала в определенной устойчивой конформации значительно больше времени информационного перехода. Поэтому переход можно считать триггерным и утверждать, что вероятность такого перехода имеет пороговый характер. Мы полагаем, что функцию можно выбрать в виде: Г(сг)=с/(1+ехр{(Ь-СТ)/а}). Ь

определяет положение скачка, а - его пологость, с соответствует уровню {(С) при С>—»<*>. Если элемент находился в п-й момент времени в состоянии покоя (А;рО), то в следующий момент времени п+1 он перейдет в активное состояние (А=1) с постоянной вероятностью V,-"1" вне зависимости от состояния других элементов ансамбля. Непосредственное моделирование на компьютере показывает, что в зависимости от значений параметров а,Ь и система может демонстрировать существенно различные режимы функционирования. Параметры с и для простоты вычислений полагались равными 1 и 0 соответственно. Поскольку поведение системы слабо зависит от начальных условий, при проведении численных экспериментов предполагалось, что в начальный момент времени п=0 все элементы находятся в состоянии покоя. Расчет производился с учетом периодических граничных условий, так что поверхность решетки представляла собой тор и расположение активных элементов на ней было подобно расположению ионных каналов в мембране перехвата Ранвье. В каждый момент времени

расчитывалась величина , равная доле открытых каналов в

системе. Ее можно интерпретировать как проводимость фрагмента мембраны со встроенными в него каналами. Для системы независимых каналов при N —>°о Сп является величиной почти постоянной и равной вероятности найти отдельный канал в открытом состоянии Для конечных

ансамблей Сп флуктуирует около величины, даваемой этим выражением,

причем амплитуда флтатуший имеет порядок —■==. При функционировании

ансамбля взаимодействующих каналов наблюдалось несколько качественно различных типов поведения активности системы со временем.

1. Отсутствие синхронизации (рис. 1а). С течением времени средняя проводимость быстро возрастает, а затем испытывает лишь незначительные

е

случайные отклонения от некоторого среднего значения. Амплитуда

флуктуаций определяется значением параметра а. Величина среднего значения + „

зависит от параметра \у : за короткий начальный промежуток времени система скачкообразно изменяет свою активность до значения , что соответствует 100**у+% открытых каналов, а затем релаксирует к среднему значению. Дисперсия флуктуаций О=0.05 превышает значение, ожидаемое для дисперсии системы полностью независимых каналов С=0.01. Таким образом, взаимодействия между каналами приводят к относительному увеличению статистических флуктуаций. Вид корреляционной функции свидетельствует о некоррелированности переходов отдельных каналов (рис. 1б). 2. При соответствующем наборе параметров наблюдались синхронные колебания полной активности ансамбля с течением времени (рис. 2а). Проводимость системы почти периодически изменялась между высоко и низко проводящими состояниями. Период колебаний зависит от параметров и обратно пропорционально связан с амплитудой. При любом наборе параметров модели, приводящим к коллетивному способу переходов, в среднем 20 % каналов остаются несинхронизованными.. Таким образом, взаимодействие между дискретными элементами, осуществляющими вероятностные переходы между состояниями может приводить к синхронизации индивидуальных переходов этих элементов. Кооперативное^ в поведении ансамбля выражается в том, что практически 80% каналов одновременно изменяют свое состояние. Уменьшение параметра влечет за собой сихронизацию через три точки. Автокорреляционная функция изображена на рис. 26. 3. При некотором наборе параметров поведение ансамбля сочетало в себе синхронизацию и хаос (рис. За). Максимальная амплитуда синхронных переходов составляла 0.12. Это означает, что синхронизованными оказывались лишь 6% всех каналов. Автокорреляционная функция отражает одновременное присутствие этих режимов и характеризуется двумя временами корреляции: Х)=0.2 и Т2=5.4 (рис. Зб). %2 характеризует полуширину дополнительного пика корреляционной функции и отражает наличие синхронных переходов каналов. На фоне синхронных переходов происходят хаотические колебания активности ансамбля. Их максимальная амплитуда не превышает 10% амплитуды коллективных переходов. Т] мало и характеризует быстрый спад взаимного влияния значений суммарной активности, разделенных промежутком времени. Наличие у корреляционной функции дополнительных слабых пиков большой ширины, очевидно, связано с тем, что сами синхронные переходы происходят на фоне колебаний с большим периодом и с малой амплитудой огибающей.

'> с.20 ■

3

о.ю

\ V

0.00 ID.DO 20.00 30.00 < СО 50.00

time

?охо з: с: ю.оо so.do бо.оо

Рис. 1а. Зависимость полной активности ансамбля каналов от времени. Колебания около среднего значения, значения параметров : а=0.05, Ь=0.3, «'+=0.7. Рис.1б. -соответствующая АКФ.

time time

Рис. 2а. Зависимость полной активности ансамбля каналов от времени. Режим синхронизации. Значения параметров : а=0.05, Ь=0.5, «,+=0.6. рис.2б. Соответствующая АКФ.

. сои 1U.DC го.оо ¿и ии эи.с^ и^ или ти.ци ¿и.ш .зи.ис «ил. зи.^й ьи.ио

Су Ггте ^ 1)лпе

Рис. За. Зависимость полной активности ансамбля каналов от времени. Хаотические колебания. Значения параметров : а=0.05, Ь=0.06, «,+=0.7. Рис.3б. Соответствующая АКФ.

ох:- ю.оо 20.00 за.ос <о.ос see: е.;. с, о.оо ю.оо 2о.оо зо.ос «о.о: 5G.C0 бо.оо ¿У time ¿9. time

Рис. 4a. Зависимость полной активности ансамбля каналов от времени. Режим затухающих биений. Значения параметров :a=0.0t, b=0.56, w4=0.3 Рис.4б. Соответствующая АКФ.

Таким образом, в рамках кооперативного поведения системы взаимосвязанных ионных каналов могут происходить некорелированные переходы отдельных ее элементов. 4. При определенном наборе параметров наблюдались затухающие биения (рис. 4а) и биения с постоянной амплитудой огибающей (¿"^.Синхронизованными оказываются не более 30% каналов. Полуширина огибающей корреляционной функции соответствует полупериоду биений и равна 7 ед. времени для затухающих биений (рис. 46) и 15 ед. времени для биений суммарной активности с постоянной максимальной амплитудой (рис. 5б). Дополнительные пики корреляционной функции свидетельствуют о том, что в пределах пачки колебания отдельных элементов

хорошо синхронизованы. Таким образом, проведенное исследование показывает, что система каналов в целом обладает коллективными свойствами, которые выходят за пределы свойств ее отдельных субъединиц.

Глава 3 посвящена решению обратной задачи: восстановления правил перехода отдельного элемента с помощью анализа общих характеристик системы. Предлагается модель 2 и обосновывается ее применимость к изучению кинетических характеристик ионных каналов в мембране.

Рис. За. Зависимость полной активности ансамбля каналов от времени. Режим биений. Значения параметров :а=0.09, Ъ=0.59, ■п,4"=0.3

Рис.5б. Соответствующая АКФ.

Физическая модель. Энергия системы "мембрана+раствор+внешнее поле" меняется непрерывно во времени и представляет собой случайный шумовой сигнал с определенным спектром, корреляционной функцией и распределением. При значениях энергии системы, превышающих некоторое пороговое значение Ед, происходит акт открытия канала. Причем Ед > Ео , где Ео - энергия открытого состояния. Таким образом, величина энергетического барьера, который необходимо преодолеть каналу при переходе из закрытого состояния в открытое превышает разницу энергий открытого и закрытого состояний ДЕ]=Ед>Ео-Ез- При значениях энергии системы, меньших Ео, произойдет акт закрытия канала. Причем величина барьера ДЕ2=ДЕо-Ез<ДЕ]. В течении некоторого времени Д1 значение энергии системы оказывается меньшим Ед, но большим Ед. Если канал был закрыт, то Дц представляет собой длительность конформационного перехода канала из закрытого состояния в открытое. А если канал был открыт, то Д(2 - длительность обратного перехода. В соответствии с многочисленными

экспериментальными данными мы предполагаем, что время жизни каждого из проводящих состояний много больше времен релаксации канала и считаем Atj и At2 бесконечно малыми величинами. Система каналов может состоять как из идентичных, так и из неидентичных субъединиц. В случае, если ионные каналы неидентичны, уровни Ед; и Ед2 пороговой энергии, необходимой для перехода в открытое состояние для них различны.

Взаимодействие каналов. Полагаем, что пороговая энергия ДЕ, необходимая для того, чтобы закрытый в момент времени t канал открылся в следующий момент времени, оказывается ниже, если соседний с ним ионный канал уже открыт. Это означает, что моделируемые каналы обладают свойством положительной кооперативности, в отличие от отрицательной, описанной в (I-wasa et al. 1986). Для генерирования последовательности псевдослучайных чисел, представляющих собой значения энергии системы в дискретные моменты времени использовался метод спектрального преобразования.

В главе 4 приводится описание и анализ результатов расчета статистических и кинетических характеристик ионных каналов, полученных с помощью предложенной модели.

В §.1 главы 4 приведены результаты необходимой проверки модели на предмет сеточных эффектов. Результаты проверки дают возможность утверждать, что сеточные эффекты в данной модели отсутствуют и полученные характерные особенности поведения системы каналов не являются артефактами.

В § 2 главы 4 получены распределения времен жизни единичного канала и системы взаимодействующих каналов в открытом и закрытом состояниях. Распределение времен жизни одиночного канала в открытом состоянии дает информацию о скорости перехода в закрытое

состояние. Гистограмма построена с шириной бина 0.01 мс. Время корреляции исходного шумового сигнала tcor=0.1. На время корреляции приходится не менее 10 временных шагов. Дисперсия распределения мала О =0.004. Функция плотности вероятности (далее ФПВ) для распределения времен жизни одиночного канала в открытом состоянии, расчитанная с помощью модели 2, представляет собой экспоненциально убывающую кривую (рис.6), что находится в согласии с многочисленными экспериментальными данными (Colquhoun D.,Sakmann В., 1981; Hamil O.P.,Sakmann В., 1981; Cull-Candy S.G., Parker J., 1982). Для получения кривой, которую можно было бы совместить с частотной гистограммой, ФПВ умножалась на общее

число событий, в данном случае 3564. ФПВ распределения времен жизни одиночного канала в открытом состоянии представляет собой сумму двух экспонент: "быстрой" и "медленной". f(t)=48822exp(-t/0.073)+488exp(-t/7.3). Показатель степени "быстрой" экспоненты соответствует среднему времени жизни 1fast =0.073 мс. Среднее время жизни истинных открываний канала характеризует "медленную" экспоненту и равно Ts]ow=7.3 мс. Как видно, показатели "быстрой" и "медленной" экспонент отличаются на два порядка. Аналогичное соотношение TSJ0W и Tfasj было получено при экспериментальном изучении кинетики каналов ацетилхолинового рецептора (Jackson М.В., Brendan S. et al., 1983). Поскольку модель 2 предполагает, что канал обладает только одним открытым состоянием (подсостояния проводимости отсутствуют), наличие дополнительной "быстрой" компоненты в кинетике закрытия канала может интерпретироваться двояко: либо как открытие канала, который только что закрылся, либо как самостоятельные открытия канала очень малой длительности. События кратковременного открывания канала, возникшие по каждой из этих причин, входят в статистику, поскольку при обработке модельного шума фиксируются открывания канала любой длительности, в том числе находящиеся на грани разрешения современных технических средств, используемых при экспериментальном изучении. Распределение времен жизни одиночного канала в закрытом состоянии дает информацию о скорости перехода канала в открытое состояние. Дисперсия распределения С=0.06, число событий равно 3554. В гистограмму включены как длительности неполных кратковременных закрываний каналов, так и длительность истинных закрываний с переходом на нулевой уровень. Аппроксимация производилась двухэкпоненциальной функцией f(t)=16154exp(-t/0.22)+162exp(-t/22). "Быстрая " и "медленная" компоненты кинетики характеризуют средние времена жизни в закрытом состоянии Tfast=0.22 мс и "sIow=22 мс соответственно. ФПВ распределений времен жизни системы двух независимых каналов в закрытом состоянии и состояниях средней и максимальной проводимости представляют собой также экспоненциально убывающие' кривые. Расчетные данные по кинетике для удобства сведены в таблицу 1 ( N - число событий, О - дисперсия распределения). Соответственно ФПВ распределений могут бьггь найдены по общей формуле с использованием данных таблицы 1. f(t)=Bf exp(-t/Tf)+Bs exP(-t/Ts)

Таблица 1.

Чае» N с

ир 0.06 ТПБ 6 ПК 1874 0.003

МЮЬЕ 0.056го8 5.6 те 2358 0.01

ОСЖЫ 0.11 Ш5 11.2 ГП5 1741 0.05

Распределение времен жизни системы независимых каналов в максимальном проводящем состоянии в пределах ошибки равно суперпозиции распределений времен жизни двух одиночных каналов в открытом состоянии, если каналы обладают одинаковыми вероятностными свойствами. Соответственно, ФПВ системы независимых идентичных каналов равна ФПВ одиночного канала с удвоенной амплитудой. Этот результат представляется вполне очевидным, так как полный ток от двух некоррелированных источников будет равен простой суперпозиции токов от каждого из них. Моделирование функционирования каналов, связанных посредством положительной кооперативности обнаруживает ряд характерных особенностей. 1. Только ФПВ распределения времен жизни в состоянии со средней проводимостью имеет экспоненциальный характер и аппроксимируется формулой = 107181ехр(-1/0.022) + 1072ехр(-1/2.2). 2. Гистограммы распределений времен жизни системы каналов в закрытом состоянии и в состоянии с максимальной проводимостью (рис. 7) нельзя аппроксимировать экспоненциальными кривыми. Модель 2 позволяет расчитывать средние времена жизни непосредственно из кинетики, без использования методов подгонки. Расчет показывает, что взаимодействие между каналами влечет за собой увеличение среднего времени жизни системы каналов в открытом состоянии. При этом среднее время жизни в состоянии со средней проводимостью уменьшается. ' Это означает, что синхронные переходы обоих каналов в проводящее состояние оказываются предпочтительнее самостоятельных переходов каждого из них. Для удобства сравнения данные по кинетике ансамбля независимых и взаимодействующих каналов сведены в таблицу 2.

Таблица 2.

"^пшсЛе ^ио

независимые 11.2 пи 5.6 тз 6 ПК

зависимые 16.2 тэ 2.2 та 33.6 гш

Взаимодействие между каналами приводит к росту относительных флуктуации, дисперсия увеличивается по отношению к дисперсии распределений для независимых каналов. Примечательно, что и модель 1 дает

гот же результат (см. Главу 2). Таблица 3 содержит значения дисперсий распределений для системы зависимых и независимых каналов. Таблица 3.

О ¿0^71 С пнсПе О ир

независимые 0.003 0.01 0.05

зависимые 0.06 0.08 0.2

В заключении подытожим полученные результаты:

1. То, что распределения времен жизни в закрытом и полностью открытом состоянии имееюг неэкспоненциальный характер, означает, что между каналами имеется взаимодействие. 2. Взаимозависимое функционирование каналов выражается также в увеличении среднего времени жизни в состоянии с максимальной проводимостью, что означает синхронизацию переходов в открытое состояние каждого из каналов. 3. Взаимодействие каналов приводит к увеличению дисперсии относительных флуктуаций. 4. Взаимная корреляция источников приводит к отклонению от

закона суперпозиции токов.

юс: .--,-—--

МО У

4 - -

Рис. 6. Распределение времени жизни Рис. 7. Распределение времени жизни в в открытом состоянии одиночного открытом состоянии системы

канала. взаимодействующих каналов.

В § 3 главы 4 проводится анализ ансамбля ионных каналов с использованием гистограмм полного времени пребывания системы на определенном уровне тока. Обоснована целесообразность применения этого метода для обнаружения связи между каналами, обладающими различными вероятностными свойствами.

Пусть мы имеем ансамбль из N независимых и идентичных каналов. Тогда, вероятность того, что I каналов открыты, описывается биномиальным распределением:

(2)

Р0- вероятность перехода канала в открытое состяние. При измерениях длительностью Б ожидаемая величина: В(1)=Б Ь(1), Традиционный тест на идентичность и независимость каналов состоит в сравнении теоретического распределения В(0 с измеряемым (в нашем случае расчетным) М(0 -распределением полного времени, проведенного на уровне 1 ( т.е, когда 1 каналов открыты). Параметры Б и РО могут быть расчитаны по следующим уравнениям:

РО^Х*МО>}.8=£М(5)} (3)

ЫЧ ¡=о .-о

Для проверки метода произведен расчет гистограммы полного времени, проведенного системой на каждом уровне тока для ансамбля независимых каналов и обнаружено естественное совпадение в пределах ошибки (ЗОмс) с биномиальным распределением (рис. 8а). Расчеты полного времени жизни системы на определенном уровне тока для случая идентичных взаимодействующих ионных каналов обнаруживают несовпадение расчетных гистограмм с биномиальным распределением (рис. 8б). Интервал допустимого отклонения составляет ¿73 мс для каждого уровня. При этом обнаруживается рост вероятности перехода канала в открытое состояние для связанных каналов (Р0=0.67), против ее значения для независимых каналов

(Р0=0.25).

Для случая каналов, обладающих различными вероятностными свойствами, было обнаружено, что отклонение расчетных гистограмм от биномиального распределения не может быть вызвано независимым функционированием подобных каналов, как предполагалось в (МатУалпап й а!., 1992). Пусть каналы независимы и подобны. Предположим, что (Ь!-М) каналов имеют вероятность перехода в открытое состояние Р1, а остальные М - вероятность Р2. Тогда вероятность того, что из (1^-М) каналов, обладающих вероятностью перехода Р1 , открыты к каналов и из оставшихся М, обладающих вероятностью перехода Р2, открыты (п-к) каналов,

определяется формулой:

Ь(Р1,Р2)=Х 2 Ь((1Ч-М),к,Р1) Ь(М,(п-к),Р2) (4)

п-0 к«0

тогда за время Б ожидаемая величина:

В(Р1,Р2,к,(п-к),5)=5 Ь(Р1,Р2,к,(п-к)) (5)

Параметры Р1 и Р2 могут быть расчитаны с помощью формул (3), так как модель позволяет получить значения полного времени пребывания на каждом уровне тока для каналов различного вида. Исследование модельной системы неидентичных каналов показывает, что гистограмма полного времени пребывания на каждом уровне тока при их независимом функционировании практически совпадает с гистограммой, расчитанной по формуле (5) (рис. 9а). Интервал допустимого отклонения составляет ¿75 мс. При атом значения вероятностей нахождения каналов в открытом состоянии равны Р1=0.28, Р2=0.69. Небольшое отклонение гистограммы полного времени пребывания системы на каждом уровне тока от биномиального распределения (5) наблюдается только при условии взаимодействия каналов (рис. 9б). Интервал допустимого отклонения составляет ±100 мс. Причем наличие положительной кооперативности увеличивает вероятности нахождения каналов в открытом состоянии до Р1=0.83 и Р2=0.87. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что неидентичность каналов не является достаточным условием отклонения экспериментальных гистограмм от биномиального распределения (Маш%'аппап й а]., 1992). Несовпадение может быть вызвано только взамосвязанным функционированием каналов в мембране как для идентичных, так и для неидентичных каналов. Необходимо отметить, что в случае подобных каналов отклонение от биномиального распределения является незначительным. Несовпадение теоретических и расчетных гистограмм в пределах интервала допустимого отклонения обнаруживается только для значения полного времени пребывания на уровне с одним открытым каналом, В условиях реального эксперимента ошибки измерений могут привести к практически полному совпадению теоретических и экспериментальных гистограмм. Это может привести к ошибочной

интерпретации экспериментальных данных. Таким образом, проблема

Число открытых коиалов

а)

6)

число открыты* имлм

Рис. 8. Гистограмма полного времени пребывания системы независимых а) и зависимых б) идентичных каналов на каждом уровне тока. Первая колонка -расчетные значения, вторая - биномиальное распределение.

а)

Число открытых «вшло«

Число открытых каналов

б)

Рис. 9. Гистограмма полного времени пребывания системы независимых а) и зависимых 6) подобных каналов на каждом уровне тока. Первая колонка -

расчетные значения, вторая - биномиальное распределение._

экспериментальных амплитудных гистограмм (Машуаппап е1 а1., 1992) может быть решена с помощью предлагаемой модели при условии проверки каналов на идентичность. Если оказывается, что в пэтче присутствуют подобные каналы, обнаружение связи между ними требует дополнительных методов.

В §4 главы 4 проводится исследование системы каналов с помощью анализа поведения автокорреляционной функции суммарного сигнала. Пусть 1(1) — случайное значение тока через одиночный канал, зависящее от времени. Среднее значение тока равно

ц(0=< Ю) >=^¿1(0(11 » 1.0

Статистическую связь между величинами флуктуации тока в моменты времени ^и характеризует автоковариационная функция (будем называть ее в дальнейшем "корреляционная функция" - сокращенно КФ)

С(ч,12)=4КчЖч)] [I(t2)-H(t2)] >

КФ может быть записана в виде

C(tt,t2)=< l(ti)l(t2) > -H(q)^(t2)

и может служить мерой статистической зависимости, существующей между значениями флуктуации тока, разделенных промежутком времени. Таким образом, зная зависимость корреляционной функции суммарного сигнала, полученного от ансамбля каналов, от времени, мы можем судить о степени взаимодействия каналов. Дисперсия флуктуаций О является величиной также зависящей от времени и выражается через корреляционную функцию следующим образом: o(t)=C(t,t). Корреляционная функция сигнала, расчитанная для одиночного канала, имеет вид экспоненциально затухающей кривой, что находится в согласии с терегическими предположениями ("Мембраны: ионные каналы",1982). Модель 2, фактически, описывает

простую обратимую схему кинетики одиночного канала: Ср<=>°Ю

Предположим, что в начальный момент времени t=0 канал находился в состоянии С. Тогда среднее значение тока через канал: n(t)=cc exp(-(a+p)t) и КФ: C(tl,t2)=f(q)5(tl-t2)+ai exp(-(a+P)|tl-t2|)+a2 exp(-(a+P)(tl+t2)) где f(ti)=a/(a+p)[2p+(a-p)exp(-(a+p)ti)] , af= -ар, a2 =oc2

Определим разность t=t2-tj. Тогда стационарная КФ в пределе больших t'i+t2 выражается формулой (Crouzy S.C., Sigworth F.J., 1994): C(t)=ap/(a+p)[25(t)-(0c+p)exp(-(a+p)|t|] (6) Значения СХ и Р равны, очевидно, обратным величинам среднего времени жизни в открытом и закрытом состоянии соответственно (см. Таблицу 1). Оценка ошибки аппроксимации производилась по методу Значение для КФ одиночного канала равно 0.9. Его величина показывает, что КФ одиночного канала достаточно хорошо аппроксимируется формулой. Нормированная КФ суммарного сигнала двух несвязанных идентичных каналов также может аппроксимирована функцией (6) в силу статистической независимости каждого из сигналов. Ошибка аппроксимации, произведенная по методу равна 1.3. Полагаем, что сравнительно высокое значение yj-обуславливается наличием добавочных слабых пиков (рис. 10) и хорошая аппроксимация корреляционной функции, достигается по формуле (6) только в окрестности основного пика. Объяснить присутствие добавочных слабых пиков КФ можно следующим образом: сигнал, отражающий функционирование канала, имеет случайный характер и характеризуется

средними временами открытого и закрытого состояний. На протяжении выборки Topen +Telóse определяют средний период Т. Поэтому функционирование системы независимых каналов, представляет собой квазипериодический процесс, а дополнительные пики в корреляционной функции определяются средним периодом Т и являются результатом случайной фазировки нескольких независимых сигналов.

Рисунок 10а отображает качественное отличие корреляционных функций системы независимых каналов и каналов, взаимосвязанных друг с другом. В силу того, что вероятность перехода кождого канала зависит от состояния соседнего, формула (6) не может применяться для построения аппроксимирующей кривой КФ в этом случае. Переход к ансамлю каналов, которые взаимодействуют по способу положительной кооперативности, сопровождается качественным изменением корреляционной функции суммарного сигнала (рис. 10а (-)- кривая). Появление добавочных пиков высотой не менее 0.4 высоты основного пика означает возникновение взаимной корреляции между каналами. Максимальная амплитуда добавочных пиков составляет 0.7 амплитуды основного пика. Отметим, что аналогичный результат для КФ был получен при исследовании коллективного поведения ансамбля из 450 каналов в случае функционирования системы в режиме синхронизации (см. Глава 2, рис. 2б). Таким образом, модель 1 и модель 2 позволяют сделать вывод о том, что взаимосвязь каналов приводит к синхронизации индивидуальных переходов каналов между состояниями и проявляется в возникновении добавочных пиков КФ суммарного сигнала.

1.20:

0.80:

LjLLLÁJ

ш

i' i

-о.ео -и-

'tóiiMilf

-0.« ]

о.оа i.oo 2.00 из <.со s.oo e.c: изо i.oo 2.00 3.00 4.00 5.00 б.ов

£

time

Рис. 10. КФ сигналов идентичных зависимых (-) и независимых (*) каналов, a). tcor=0.1, б). tcor=0.02.

а

Рис. И. а), юог =0.4. б). Зависимость среднего вр. ж. в открытом состоянии от времени корреляции исходного сигнала.

В п.1 §4 главы 4 приведены результаты численного моделирования влияния параметров исходного шумового сигнала на кинетику ионных каналов. Определению подлежит связь между параметрами случайного процесса - зависимости энергии от времени - и случайного сигнала -величины тока через мембрану. Первая характеризуется временем корреляции и отношением среднего значения энергии к пороговому для открытия канала. Второй, в соответствии с общепринятым подходом, характеризуется двумя временами - временем закрытого и открытого состояний. Таким образом, имея в своем распоряжении экспериментальную информацию о временах жизни канала в открытом и закрытом состояниях, можно высказать некоторые общие суждения о характере происходящих в системе энергетических процессах, приводящих в конечном итоге к определенной зависимости тока через мембрану от времени.

В п.2 §4 главы 4 приведены результаты исследования зависимости КФ от времени корреляции исходного сигнала, оюнаружено, что время корреляции исходного шумового сигнала определяет средний период возникновения взаимной корреляции функционирования двух каналов. Для системы каналов он оказывается порядка среднего времени жизни в состоянии с одним открытым каналом. Физически это означает, что за время, в течение которого открыт канал, возмущение в мембране, вызванное

его переходом в открытое состояние, успевает распостраниться по мембране, достичь соседнего канала и индуцировать изменение вероятностных свойств последнего (рис. 10а, 10б, 11а). Среднее время, по истечении которого каналы начинают "чувствовать" присутствие друг друга Тдля различных 1сог исходного шумового сигнала равно соответственно: 1=2.5 мс для гсог=0.4, Т =1.5 мс для Ьсог=0.1, Т=1.3 мс для 1СОГ=0.02. Расчет показывает, что увеличение времени корреляции исходного шумового сигнала определяет рост среднего времени жизни канала в проводящем состоянии (рис.Иб). Поскольку при этом полное время пребывания на каждом уровне проводимости практически не изменяется, значит сокращается число переходов между уровнями. На основании этих результатов можно предположить, что шумовой сигнал с большим временем корреляции должен определять функционирование более "медленных" каналов с большими средними временами жизни и маленькими скоростями переходов между состояниями.

В п.2 §4 главы 4 приводятся результаты исследования зависимости КФ от степени взаимосвязи каналов. Расчет показывает, что увеличение энергии взаимодействия каналов сокращает средний период фазировки двух случайных процессов: 1=3.2 мс для ДЕ=1.76 кТ, Т=1.5 мс для ДЕ=2.56 кТ, ?=1.0 мс для ДЕ=4.1 кТ (рис.12а). Увеличение степени взаимосвязи между каналами никак не отражается на средних временах жизни независимых каналов, что вполне понятно. При наличии положительной кооперативноств в ансамбле среднее время жизни в поводящем состоянии растет с увеличением энергии взаимодействия каналов, а среднее время жизни в закрытом состоянии остается неизменным (рис. 12б). Это происходит потому, что увеличивается число переходов системы на уровень с проводимостью 1тах-1, а число переходов на непроводящий уровень остается практически неизменным. Таким образом можно заключить, что положительная кооперативность проявляется в том, что оба канала изменяют свое состояние почти синхронно. Энергия взаимодействия оценивалась из простых соображений. Так как действие одного канала на другой выражается в том, что изменяются вероятностные свойств последнего, правомерно предположить, что эффект положительной кооперативности можно выразить как мультипликативную добавку к вероятности пребывания в открытом состоянии первого канала. Согласно определению условной вероятности:

Р(1,1)=Р(1) ехр(ДЕ/кТ),

где стационарные вероятности того, что открыты оба канала Р(1,1) и

и

открыт хотя бы один канал Р(1) определяются как отношение полного времени, проведенного системой на соответствующем уровне тока к полному времени изучения системы.

В п.З §.4. главы 4 приводятся результаты расчетов зависимости КФ от величины пороговой энергии канала для перехода в открытое состояние. Соответственно, чем больше пороговая энергия, необходимая для перехода канала в открытое состояние, тем меньше вероятность его перехода в это состояние и тем больше среднее время, в течение которого канал закрьгг. Поэтому на рисунках 13а, 13б, 14а расстояние между пиками (сплошная линия), означающими возникновение взаимной корреляции' между каналами увеличивается с увеличением порогового значения Епгор- Т=2.5 мс для ЕПОр=3 кТ, Т=1.3 мс для Ет,ор=5.8 кТ, Т=1.0 мс для Еп0р=6.9 кТ. Таким образом, кооперативное^ каналов с малой вероятностью перехода в открытое состояние не влечет за собой увеличение среднего времени жизни в проводящем состоянии (рис.14б).

Мы полагаем, что только анализ автокорреляционной функции экспериментальных данных тока через каналы может дать убедительные свидетельства в пользу (или против) кооперативного действия каналов в ансамбле. Некоторые экспериментальные исследования показывают, что хотя амплитудные гистограммы совпадают с биномиальным распределением, нельзя сказать, что каналы независимы. Это может означать, как мы показали выше, просто неидентичность фтакционирующих каналов(Глава 4, § 2).

1 о*

0.И1

г

\ "«L

'"hJmj

\ №

-1.СС | 5

з.оо time

О.'О

dL

С .50 0.60 0.70

Рис. 12. а). Зависимость КФ от степени взаимосвязи каналов. (*)-слабая, (-)-сильная. б). Зависимость ср.вр. ж. в О состоянии от степени взаимодействия.

. осо 1.оо :.оо з.с: *.со 5.оо ш

О-) х^

3.00 4.с: 5.00 £.00

Уте

Рис. 13а). Зависимость КФ от уровня пороговой энергии Епор^- >б)-Е-пор2<Ьпор1-_

3

i

0.35 | 3

0.30 1

- 0.20 4 3 3

0.15 "з 5

0.10 3

0.05 5

0.30 О 4С и

л 0.С0 1.К> 2.00 ¡.Ц 4.00 50: 6.00 'чЧ003 0,0

су. '¡те Д)-

Рис. 14 а). ЕПОрЗ<ЕПОр2. 6). Зависимость среднего вр. ж. в О состоянии от Епор.

Но, поскольку идентичность каналов очень трудно проверить, а кооперативное действие каналов в ансамбле не всегда характеризуется увеличением среднего времени жизни канкала в открытом состоянии, мы считаем целесообразным привлекать аппарат корреляционных функций для обнаружения взаимодействия между каналами.

2Ъ

Основные выводы.

1. Построена математическая модель, пригодная для описания кооперативного поведения ионных каналов как дискретных активных элементов в мембране. Обоснована возможность передачи взаимодействия между каналами посредством поля упругих напряжений, возникающим в процессе функционирования. Показано, что в зависимости от параметров модели, ансамбль каналов может демонстрировать сложные режимы поведения: близкое к хаосу, синхронное, биения. Проведенное исследование показывает, что система каналов в целом обладает коллективными свойствами, которые выходят за пределы свойств ее отдельных субъединиц. Взаимодействие дискретных элементов, осуществляющих вероятностные переходы между состояниями, приводит к синхронизации индивидуальных переходов этих элементов и к росту статистических флуктуации в системе.

2. Построена модель одиночного канала в мембране, основанная на зависимости вероятностных свойств канала от уровня пороговой энергии, необходимой для перехода канала из одного состояния в другое. Предложеннный конкретный механизм внутримембранного взаимодействия ионных каналов отражает особенности явления положительной кооперативности. Изложены экспериментальные обоснования возможности клеточно-автоматного представления ионного канала. Предложен новый подход к выявлению взаимодействия между • каналами в ансамбле. На основании схемы взаимодействия обнаружены качественные отличия различных характеристик, присущие кинетике только взаимосвязанных каналов.

3. При помощи модели 1 обнаружено, что независимое функционирование системы каналов характеризуется экспоненциальной формой ФПВ распределений времен жизни канала в любом состоянии. Показано, что "медленная" компонента кинетики канала отвечает за истинное среднее время жизни канала в открытом состоянии, а "быстрая" характеризует время жизни кратковременных неполных открываний. Если два канала идентичны и независимы, то их ФПВ распределения времен жизни в состоянии с максимальной проводимостью равна ФПВ распределения времен жизни одиночного канала в открытом состоянии с удвоенной амплитудой.

4. То, что распределения времен жизни в закрытом и полностью открытом состоянии имееют неэкспоненциальный характер, означает, что между каналами имеется взаимодействие. Показано, что взаимозависимое функционирование каналов выражается также в увеличении среднего времени жизни в состоянии с максимальной проводимостью, что означает

синхронизацию переходов в открытое состояние индивидуальных переходов каждого из каналов ("[¡пс]=6 мс, Т[]ер=33.6 мс). При этом происходит увеличение дисперсии статистических флуктуации по отношению к дисперсии для ансамбля полностью независимых каналов. Показано также, что взаимная корреляция источников приводит к отклонению от закона суперпозиции токов.

5. При помощи анализа гистограмм полного времени, проведенного системой на каждом уровне тока, получены следующие результаты:

а). В случае идентичных каналов отклонение гистограмм полного времени, проведенного системой на каждом уровне тока (или, что равносильно, амплитудных гистограмм), от биномиального распределения является следствием взаимосвязанного функционирования каналов. При этом происходит увеличение вероятности перехода канала в открытое состояние (Р0=0.67), против ее значения для независимых каналов (Р0=0.25). Для неидентичных каналов: Р1=0.28, Р2=0.69 (независимые каналы), Р1=0.85 и Р2=0.87 (зависимые каналы).

б). Неидентичность каналов не является достаточным условием отклонения гистограмм от биномиального распределения. Гистограммы полного времени, проведенного системой на каждом уровне тока, для подобных независимых каналов дают хорошее совпадение в пределах ошибки ( - 75 мс) с теоретическими.

в). В случае подобных каналов отклонение от биномиального распределения является незначительным. Поэтому в реальных условиях совпадение экспериментальных гистограмм с биномиальным распределением может быть продуктом функционирования взаимодействующих неидентичных каналов в ансамбле.

6. С помощью флуктуационного анализа модельных шумов получена качественная картина зависимости среднего времени жизни канала от его вероятностных свойств. Определены характерные отличия корреляционных функций и распределений времен жизни зависимых и независимых ионных каналов. Исследовано изменение характеристик взаимодействующих и невзаимодействующих ионных каналов в звисимости от формы шумового сигнала с заданной корреляционной функцией, что дает возможность судить о характере энергетических процессов, происходящих в системе. По результатам расчетов сделаны следующие выводы:

а). Взаимодействие меииу каналами проявляется в возникновении дополнительных пиков высотой не менее 0.4 КФ суммарного сигнала.

2 а

б). Время корреляции исходного шумового сигнала определяет средний период возникновения взаимной корреляции функционирования двух каналов. Средний период корреляции варьирует в пределе 1 мс - 3 мс в зависимости от условий и является величиной одного порядка со средним временем жизни системы каналов в состоянии с одним открытым каналом.

в). Увеличение энергии взаимодействия влечет рост среднего времени жизни системы каналов в состоянии с максимальной проводимостью. Обнаружено, что при росте степени взаимодействия каналов в ансамбле возрастает взаимная коррелированность событий одновременного открытия каналов. Взаимодействие каналов, обладающих большой пороговой энергией перехода в открытое состояние, не вызывает увеличения среднего времени жизни в этом состоянии.

7. Предложенная модель позволяет по совокупности кинетических характеристик - распределений времен жизни, гистограмм полного времени жизни, проведенного на каждом уровне тока (или амплитудным гистограммам) и автокорреляционной функции флуктуации тока - полностью охарактеризовать функционирующие каналы аспекте наличия взаимосвязи и проверки на идентичность.

Полученные в диссертации результаты изложены в публикациях:

1. В.В. Кадочникова, Л.В. Якозенко. "Модель коллективного поведения дискретных активных элементов в мембране", Препринт физ. фак.-та МГУ, 1994 г.

2. В.В. Кадочникова, В.А. Тверднслов, Л.В. Яковенко. "Теоретическое ^следование характеристик взаимодействия идентичных и неидентичных юнных каналов", Препринт физ. фак.-та МГУ, 1994 г.

3. В.В. Кадочникова. Л.В. Яковенко. "Режимы функционирования 1нсамбля дискретных активных элементов в мембране", "Биофизика, 1994 г., : печати.

4. Yakovenko L.V. Kadochnikova Y.V. Tverdislov V.A. "Oscillatory rocesses and self-organization at the non-equilibrium phase boundaries",-тезисы оклада на межд. конф. Non-equilibrium and coherent systems in biophysics, iology and biotechnology. 28сентября-2 октября, Москва, 1994г.