Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование динамики кальция в клетках сердечной мышцы на основе электронно-конформационной модели рианодин-чувствительных кальциевых каналов

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование динамики кальция в клетках сердечной мышцы на основе электронно-конформационной модели рианодин-чувствительных кальциевых каналов"

На правах рукописи

Рыбкин Александр Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ КАЛЬЦИЯ В КЛЕТКАХ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ НА ОСНОВЕ ЭЛЕКТРОННО-КОНФОРМАЦИОННОЙ МОДЕЛИ РИАНОДИН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

21 АВГ 2014

Пущино - 2014

005551926

005551926

Работа выполнена в лаборатории математической физиологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук» и в НИИ физики и прикладной математики Института естественных наук Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н.Ельцина».

Научные руководители: доктор физико-математических наук,

профессор

Москвин Александр Сергеевич

доктор физико-математических наук Соловьева Ольга Эдуардовна Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Цатурян Андрей Кимович (в.н.с. НИИ механики МГУ, г. Москва);

доктор физико-математических наук Полежаев Андрей Александрович (в.н.с. ФИАН РАН, г. Москва) Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Защита состоится «24» сентября 2014 г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3; и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.

Автореферат разослан « 04 » (йимщ 2014 г.

Ученый секретарь »

диссертационного совета, ^/йш^ Ланина Н.Ф.

к.ф.-м.н. '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одной из основных причин возникновения хронических заболеваний сердца (аритмия, сердечная недостаточность и пр.) является нарушение внутриклеточной динамики ионов кальция (Беге, 2001). По современным представлениям именно динамика ионов Са2+ является центральным звеном электро-механического сопряжения в рабочих кардиомиоцитах и формирования сердечного ритма в клетках синусно-предсердного узла. Известно, что активность сердечных клеток инициируется повышением концентрации внутриклеточного Са2+ на порядок величины за счет периодического высвобождения из внутриклеточных накопителей (саркоплазматического ретикулума, СР) через специфические ион-активируемые кальциевые каналы, сопряженные с рианодиновыми рецепторами (КуЯ-каналы). Связывание ионов Са2+ с активными центрами рецептора изменяет конформационное (структурное) состояние канала, переводя его в проводящее состояние, в результате этого возникают трансмембранные ионные токи по градиенту концентрации. Эти гигантские биологические нанообъекты являются одним из основных регуляторов динамики ионов кальция в сердечных клетках. Свое название рианодиновый рецептор получил благодаря способности связываться с алкалоидом рианодином, ингибирующим активность канала.

Выяснение и исследование механизмов функционирования ЯуЯ-капало в, определяющих динамику ионов Са2+, является одной из первоочередных задач современной биофизики. Ее успешное решение связывается не только с развитием современных экспериментальных методов исследования наноскопических биосистем, но и, прежде всего, с перспективами математического моделирования. Решение сложнейшей задачи математического моделирования ЯуЯ-канала предполагает выбор биофизически обоснованной модели канала, способной описать совокупность ключевых процессов в наноскопической молекулярной системе.

До сих пор традиционным подходом к описанию динамики ЯуЯ-канала является использование сугубо феноменологических дискретных марковских моделей

(Zahradnikova, BJ, 1996; Fill, PhysiolRev, 2002), которые фактически никак не учитывают реальной структуры наноскопической молекулярной системы, что делает спорным вопрос об их адекватности.

Альтернативой марковским схемам являются непрерывные модели, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках. Примером данного типа моделей являются электронно-конформационные модели стохастической динамики RyR-каналов, разработанные А. С. Москвиным с соавторами (Moskvin, РВМВ, 2006) которые позволили объяснить ряд важнейших особенностей функционирования этого типа белков, однако, при моделировании RyR-каналов в Са2+-высвобождающей системе использовалась простейшая детерминированная схема их динамики без учета случайных переходов.

В данной диссертационной работе электронно-конформационная модель RyR-канала получила дальнейшее развитие и была применена для изучения Са2+-высвобождающей системы в клетках водителя сердечного ритма.

Цель работы. Основной целью диссертационной работы является развитие электронно-конформационной теории наноскопических белковых систем -одиночных RyR-каналов и кластеров RyR-каналов, а также разработка биофизически обоснованной физико-математической модели стохастической динамики Са2+-высвобождающей системы в клетках рабочих кардиомиоцитов и формирования сердечного ритма в клетках водителей сердечного ритма.

Для реализации поставленной цели в данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствовать предложенную ранее (Moskvin, РВМВ, 2006) электронно-конформационную модель RyR-канала введением инактивационного состояния канала и детальным рассмотрением туннельных переходов с целью описания ряда эффектов стохастической динамики данного белка.

2. На основе усовершенствованной модели RyR-канала разработать модель Са высвобождающей единицы и включить ее в интегративную модель динамики кальция в сердечной клетке.

3. Разработать комплекс программ для численного моделирования стохастической динамики одиночных КуЯ-каналов, кластера взаимодействующих каналов и моделирования кальциевой динамики в сердечных клетках.

4. Провести детальный параметрический анализ электронно-конформационной модели стохастической динамики одиночных ЯуК-каналов, исследовать кинетические характеристики и особенности поведения ЯуК-канала при постоянном значении концентрации Са2+ и при включении внешнего стимула.

5. Провести компьютерное моделирование динамики Са2+ в клетках водителей сердечного ритма в рамках интегративной модели Са2+ высвобождающей системы кардиомиоцитов, выявить причины возникновения автоколебательной Са2+-динамики.

6. Исследовать особенности и характеристики автоколебательной динамики Са2+ в кардиомиоцитах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, приложения и списка литературы. Работа изложена на 177 листах, включает 94 рисунка. Список литературы содержит 179 источников. Научная новизна работы.

1. Проведено усовершенствование разработанной ранее электронно-конформационной модели КуЯ-каналов: введено новое инактивационное состояние канала, и подробно рассмотрены механизмы туннельных и электронных переходов между состояниями одиночных ЯуЯ-каналов.

2. Впервые в рамках усовершенствованной электронно-конформационной модели подробно воспроизведена стохастическая динамика ЯуЯ-каналов как при стационарных условиях, так и в условиях динамики ионов Са2+, исследованы такие кинетические характеристики как вероятность пребывания канала в открытом состоянии, среднее время пребывания канала в открытом и закрытом состояниях. Показано, что электронно-конформационная модель дает адекватное описание экспериментальных данных исследования активности изолированных КуЯ-каналов.

3. Проведено обобщение модели стохастической динамики ЯуК-канала для кластера взаимодействующих каналов с учетом различных электронно-конформационных преобразований.

4. Впервые в рамках электронно-конформационной теории предложена модель взаимодействия ионов Са2+ с активационным центром ИуЯ-канала, учитывающая вероятности заполнения мест присоединения активационного центра ионами Са2+.

5. Впервые построена интегративная модель замкнутой Са2+-высвобождающей системы с учетом стохастической динамики кластера ЯуН-каналов.

6. Впервые в рамках объединенной модели Са2+-высвобождающей единицы проведена серия численных экспериментов по изучению кальциевой динамики в клетках водителей сердечного ритма, установлена природа формирования и основные характеристики автоволнового режима динамики Са2+-высвобождающей системы (внутриклеточных Са2+-«часов»).

7. Исследованы различные режимы поведения Са2+-«часов» в широком диапазоне параметров модели. Обнаружен новый эффект внезапной остановки изолированного внутриклеточного кальциевого осциллятора.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанная электронно-конформационная модель предназначена для описания динамики супрамолекулярных комплексов ЯуЯ-каналов в сердечных клетках и может быть объединена с моделями, описывающими электромеханическое сопряжение в клетках рабочего миокарда и электрическую активность клеток водителей сердечного ритма.

Модель позволяет на молекулярном уровне выявить роль ЯуЯ-каналов в процессах кальциевой динамики, ответственных за нарушение электрической и механической активности в сердечных клетках. Предсказания модели позволяют сформулировать программу дальнейших экспериментальных исследований, направленных на научно-обоснованный поиск внутриклеточных мишеней для терапевтического воздействия при патологии сердца.

Разработанная модель электронно-конформационной динамики молекулярных нанокластеров может найти широкое применение при решении задач фазовых переходов и стохастической динамики применительно к разнообразным биологическим и физическим объектам, способным менять свою структуру, конформационное состояние и физические свойства вследствие внешнего воздействия, а также квантовых или термофлуктуаций. В частности, представленная в данной диссертационной работе, электронно-конформационная модель ЯуЯ-канала уже была использована при исследовании хаотического и устойчивого поведения нелинейных двухкомпонентных систем (Коньков и др., Нел. Дин., 2008).

Разработанный комплекс программ для реализации модели стохастической динамики 11у1*-канала и модели Са2+-динамики в сердечной клетке имеет практическую ценность для решения более широкого круга физических задач для наноскопических объектов с индуцированными структурными переходами (например, двухуровневых электронных центров с учетом электронно-решеточного взаимодействия) и может быть использован в учебных и исследовательских целях. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усовершенствование электронно-конформационной модели КуЯ-канала, заключающееся во введении инактивационного состояния и уточнении механизма электронных переходов в терминах вероятности присоединения ионов к активным центрам канала, позволило объяснить ряд важных эффектов, связанных с активацией каналов ионами Са2+: экстремальный вид зависимости вероятности пребывания канала в открытом состоянии от концентрации Са2+ с внешней стороны канала и эффект адаптации 11у11-канала к продолжительной стимуляции.

2. Электронно-конформационная модель динамики кластера взаимодействующих ЯуЯ-каналов, интегрированная в модель Са2+-динамики внутри клеток водителя сердечного ритма, позволяет на субмолекулярном уровне описать поведение Са2+-высвобождающей единицы как самоподдерживающегося Са2+-осциллятора, обеспечивающего авторитмическую активнось клетки в целом.

3. В численных экспериментах обнаружен и исследован эффект спонтанной остановки внутриклеточного кальциевого осциллятора, который наблюдается в отсутствие внешнего стимула при усиленном взаимодействии между ЯуК-каналами в кластере в высвобождающей единице и при малой скорости высвобождения Са2+ из внутриклеточных накопителей.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на 52-ом съезде Американского биофизического общества (Лонг Бич, США, 2008), конференции «Новые горизонты в кальциевой сигнализации», (Пекин, КНР, 2010), международной конференции Европейского общества по молекулярной биологии «РЬуБСеП: От клетки к органу», (Примоштень, Хорватия, 2009), ежегодном симпозиуме теоретического отдела Института Макса Планка коллоидов и поверхностей (Потсдам, ФРГ, 2006), 13й Международной зимней школе физиков-теоретиков "Коуровка", (Новоуральск, 2010), ежегодной межвузовской научной конференции по проблемам информатики «СПИСОК-2009» (Екатеринбург, 2009), российской школе-конференции молодых ученых (с международным участием) «Физиология и биофизика миокарда», памяти проф. В. Я. Изакова (Екатеринбург,

2011), всероссийской научной конференции студентов физиков и молодых ученых (Екатеринбург, 2005, 2012), . 6-ом, 8-ом, 13-ом Семинаре по проблемам физики конденсированного состояния (Екатеринбург, 2005, 2007, 2012), 3-я международная школа «Молекулярное переключение и функциональные материалы» и 5-й международный симпозиум по молекулярным материалам: «Электроника, фотоника, спинтроника» (Ренн, Франция, 2009), международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальная и прикладная наука» (Пущино,

2012).

Публикации. Результаты, представленные в диссертации, опубликованы в 19 работах. В их числе три статьи в ведущих рецензируемых российских научных журналах, рекомендованных ВАК, 16 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях.

Благодарности: д. ф.-м. н., проф. Москвину A.C.; д. ф.-м. н. Соловьевой О.Э.; д.б.н., чл.-кор. РАН, проф. Мархасину B.C.

Исследования, проведенные в рамках диссертационной работы, поддержаны грантами РФФИ, грантами молодых ученых УрО РАН, грантом целевой программы Президиума УрО РАН, грантом молодых учёных РФФИ, трэвел-грантами РФФИ и Американского биофизического общества.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении описана актуальность темы исследований, сформулирована цель диссертационной работы, представлена и обоснована ее научная новизна, а также теоретическая и практическая значимость.

Первая глава посвящена обзору литературы, в ней изложены современные представления об электромеханическом сопряжении в кардиомиоцитах, экспериментальные данные по исследованию динамики ионов Са2+ в сердечных клетках. Представлены сведения о структуре и свойствах основных объектов диссертационного исследования - рианодиновых (RyR) каналов, являющихся одним из основных регуляторов динамики ионов кальция в сердечных клетках.

Эти гигантские макромолекулярные наноскопические комплексы, имеют форму четырехлистника со стороной 30 нм (рис. 1) и с молекулярной массой субъединицы более 567 кДа. Внутренняя сторона канала, соответствующая люмену CP называется trans, а внешняя сторона - cis-часть. В обзоре литературы представлены результаты наиболее значимых экспериментов по изучению стохастической динамики RyR-каналов, описаны тонкие эффекты активации каналов и указано на необходимость учета кооперативного взаимодействия RyR-каналов при моделировании высвобождающей единицы.

Подробно описаны основные подходы к моделированию динамики RyR-каналов, отмечено, что современные модели, являясь феноменологическими, основываются на модели марковских цепей с ограниченным набором основных состояний канала, при этом переходы между различными состояниями имеют случайный характер, однако вероятности переходов не имеют биофизического

обоснования, а подбираются из сравнения результатов моделирования с результатами экспериментов.

Са,

Диффузия Са"' ./¿iff

Са'" "накачка"

Са„

Высвобожден! ®

■ ¥j.

Сеть CP

"nSR Внутренняя

лпффучий Са 'бСР

Рис. 1. Схема Са2+ потоков между внутриклеточными отделами кардиомиоцитов. i - цитозоль клетки; nSR (sarcoplasmic reticulum network) - сеть CP; jSR (junctional SR) терминальные цистерны (люмен) CP;

SS (subspace) - диадное пространство.

У, - потоки Са2+ между отделами высвобождающей единицы. RyR-каналы

образуют почти квадратный кластер на мембране CP, состоящий из более сотни каналов, обеспечивающих высвобождение Са2+ из СР.

В данной главе дан краткий обзор современных теорий, описывающих динамику Са2+ в сердечных клетках, в частности, модели Мальцева-Лакатты (Maltsev, Lakatta, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009) для клеток водителя сердечного ритма. Эта модель объясняет автоматик» данного типа клеток существованием внутриклеточных кальциевых осцилляторов (Са2+-«часов»), роль которых играет Са2+ высвобождающая единица (BE) (рис. 1). Общим недостатком интегративных макроскопических моделей является то, что они не учитывают ни биофизических особенностей одиночных RyR-каналов, ни самосогласованной динамики кластера RyR-каналов в обобщенной высвобождающей единице.

В заключении главы сформулированы цели и задачи диссертационного исследования.

Вторая глава посвящена развитию электронно-конформационной модели одиночного RyR-канала, кластера взаимодействующих RyR-каналов и модели кальциевой динамики в клетках водителя сердечного ритма. Электронно-конформационная модель RyR-канала

02667416

Электронное взаимодействие (присоединение) ионов Са2+ с активными центрами RyR-канала приводит к изменению его структуры, то есть к конформации, обеспечивающей проводящее состояние канала. Для описания такого электронно-конформационного преобразования в гигантском наноскопическом белке в работе (Москвин и др., ДАН, 2005) была предложена относительно простая электронно-конформационная (ЭК) модель, основанная на адаптации известной теории фотоиндуцированных структурных фазовых переходов (Nagaosa, Ogawa, Phys. Rev. В, 1989). Согласно этой теории, поведение системы двухуровневых электронных центров в решетке описывается электронно-колебательным гамильтонианом с классической конфигурационной (конформационной) координатой, имеющей смысл локального смещения атомов. По аналогии с этими представлениями RyR-канал рассматривается как молекулярный нанокластер, огромное число степеней свободы которого сводится всего к двум - быстро изменяющейся (условно называемой «электронной») и медленной (конформационной). Для описания конформационной степени свободы вводится непрерывная координата Q, которая характеризует степень «открытости» канала, и дискретная электронная координата £, с помощью которой описывается результат взаимодействия ионов Са2+ с активными центрами RyR-канала.

Одним из основных достоинств ЭК модели является использование энергетического подхода к описанию состояний RyR-канала и введение модельного гамильтониана (энергии) канала:

различие энергий двух электронных состояний канала («открытого» и

«закрытого» второе слагаемое описывает эффекты смешивания

(взаимодействия) этих состояний. Третий член описывает эффекты конформационного воздействия на канал со стороны внешних сил, которые условно

Н = -As,-hsx - pQ + aQsz +~Q2>

К

О)

матрицы Паули. Первое слагаемое описывает

можно назвать эффективным давлением {р - параметр «эффективного давления»). Четвертый член характеризует электронно-конформационное взаимодействие в канале, а - постоянная взаимодействия. Последнее слагаемое - упругая (конформационная) энергия канала с константой упругости К. Собственные значения гамильтониана (1):

определяют две ветви (Е+ - верхняя ветвь, Е - нижняя ветвь потенциала (рис. 2)) адиабатического конфор.мационного потенциала (КП) и характеризуют энергию двух электронных состояний канала в зависимости от конформационной координаты 2-

Принципиальной особенностью КП является наличие бистабильности - двух локальных минимумов энергии, соответствующих полностью (т.е. электронно- и конформационно) закрытым и открытым состояниями канала (оО, сС на рис. 2).

В простейшем случае, при Н = О, Л = О, КП записывается следующим образом:

(3)

и описывает диабатический потенциал, представляющий собой две пересекающиеся параболы (рис. 2) (£=0 — электронно закрытое, - электронно открытое

состояния)

Рис 2. Частный случай конформационного потенциала ЯуК-канала при й = 0, Д=0 (диабатический режим), сплошными стрелками обозначены электронные, штрихованными - конформационные переходы. Параметры потенциала: а=5, К= 12, р=-0.86. На графике приведены основные состояния канала: сС -электронно и конформационно закрытое, оО -электронно и конформационно открытое, оС -электронно открытое и конформационно закрытое, сО - электронно закрытое и конформационно открытое состояния.

Изменение конформационной координаты канала £) описывается с помощью уравнения Ланжевена:

Мй = -^Е((2,г;)-МГй-71итр, (4)

где М - эффективная масса ЯуЯ-канала (ниже принято М= 1); Г - константа конформационного «трения» (параметр диссипации); г]!етр - сила случайных

температурных флуктуаций в конформационной динамике ЯуК-канала.

Эффективное конформационное давление является одним из важнейших параметров, влияющих на форму КП и устойчивость того или иного состояния ЯуЯ-канала. Этот параметр определяет взаимосогласованность ЭК-модели ЯуЯ-каналов в кластере и Са2+-динамики между отделами ВЕ. Важным предположением модели

является типично "хилловская" зависимость «эффективного давления» р от

концентрации Ся]8К ионов Са2+ в люмене СР:

р = 2_^1--1 (5)

(СатУ+К"Са

где п - коэффициент Хилла, КСа - полумаксимум зависимости р(Са]5К), значение р лежит в интервале ре(-1;1). «Эффективное давление» определяет стабильность того или иного состояния канала. При р < 0 (Са.БК < КСа, низкий уровень

заполнения люмена кальцием) глобальным является минимум КП, соответствующий закрытому состоянию (сС, рис. 2), а при р> 0 > КСа,

высокий уровень заполнения люмена кальцием) глобальным является минимум, соответствующий открытому состоянию канала (оО).

Электронные переходы между ветвями КП (сплошные стрелки на рис. 2) -результат взаимодействия ионов Са2+ с активными центрами, предполагаются "франк-кондоновскими", то есть идущими без изменения координаты (). В общем случае вероятность перехода Ре1ес1 может зависеть от концентрации ионов Са2+ с внешней стороны канала (а$[Са]) и быть аппроксимирована спектральной функцией Лоренца:

/>е1ес1(£, Д) = Яс[саШСа])^+^_Е)2, (6)

где Е - энергия ионов Са2+, А = \Е+-Е_\ - энергия перехода (разность энергий двух ветвей КП), у - полуширина резонансного пика. Лк« = = Рс\са(Е = д) ~~ пиковая вероятность перехода, зависящая от концентрации ионов Са2+ со внешней стороны канала:

з ( ■ ¡г л\ ™[Са] ГГ, _£и[Со] V п\

Лека{си[Са]) = Ск . 1--. , (7)

^сг«[Са]шах) ^ С15[Са]„^)

где г - число секторов активного центра канала, к - число ионов, необходимое для

электронного перехода канала, С]. - биномиальный коэффициент.

С целью описания взаимодействия ионов Са2+ с так называемыми инактивационными центрами КуЯ-канала в данной работе впервые в ЭК-модели введено дополнительное электронное инактиваиионное состояние (/) (рис. 3). Вероятность электронного перехода в инактивационное состояние и скорость релаксации (Р^,) предполагаются достаточно малыми. В работе предполагается, что для стимулирования инактивационного центра необходимо присоединение большего количества ионов Са2+ (к=6-8 ионов), чем для активационного центра (к=4-5 ионов).

На рисунке 3 приведена одна из типичных энергетических схем ЯуЯ-канала при стационарных условиях. Наряду с электронными переходами и конформационной динамикой в ЭК-модели рассматривается возможность квантовых туннельных "не-франк-кондоновских" переходов через энергетический барьер между различными электронными состояниями с одинаковой энергией (рис. 3, двойная стрелка).

Вероятность туннельных переходов через потенциальный барьер шириной Ц(2) и высотой ЛЕ(<2) определяется как:

(8)

где А,ип - безразмерный параметр, определяющий степень нелинейности Ршп{0), Ашп - максимальная вероятность туннелирования.

Рис. 3. Схема энергетических уровней ЯуК-канала, стрелками обозначены туннельные и электронные переходы.

С __|

Электронно-конформационная модель кластера взаимодействующих ИуК-каналов

КуЯ-каналы сгруппированы в почти квадратный кластер на мембране СР (порядка 100 каналов в группе) (рис.1). Для описания кооперативной динамики ЯуЯ-каналов в кластерах взаимодействующих каналов на мембране СР учитывалось

конформационное взаимодействие ЯуЯ-каналов: Е^^^^Кт^т-^),,)2. В

¿■тл

данной работе вводилось ограничение приближением взаимодействия только ближайших соседних каналов с «упругой» константой взаимодействия к. С учетом этих условий КП т-го канала (при Д = 0, к = 0) может быть представлен в виде:

£±(0,) = у Й ~Рйт ±\айт + "0„)2 • (9)

Моделирование динамики ионов Са2+ в клетках водителя сердечного ритма

В данном разделе диссертационной работы представлена модель авторитмической динамики внутриклеточного кальция (Са2+-«часов»), основанная на ЭК модели ЯуЯ-каналов.

Модель Са2+-высвобождающей единицы. Рабочая модель ВЕ основана на широко известной модели структуры клетки, состоящей из четырех основных компонентов: диадного пространства, цитозоля, сети СР и просвета терминальных цистерн (люмена) СР (рис. 1). Особенностью данного представления является рассмотрение огромного количества ВЕ в клетке в виде единой обобщенной ВЕ.

Для описания неоднородной динамики Са2+ в клетке вводятся четыре кальциевых потока между отделами клетки:

1. Поток заполнения люмена /гсГ1|| = ккт (Сап5К - Са]5К), где £геШ1 - константа скорости заполнения.

2. Поток высвобождения Са2+ из люмена Угс|, величина которого зависит от числа открытых ЯуЯ-каналов Ыореп в кластере ВЕ и от величины потока Са2+ через одиночный открытый канал у'гс|: 7ге1 = ■ угс,. Поток Са2+ через одиночный канал определяется формулой: уге1 = £ге1(Са^к -Са58), где £ге1 - константа скорости высвобождения,

3. Диффузионный поток между диадным пространством и цитозолем: = кш (СаВ5 - Са[), где кт - константа скорости диффузии.

4. Поток накачки сети СР Jup. Процесс накачки СР кальцием против градиента

концентрации требует энергетических затрат (фосфорилляция молекул АТФ), значение потока зависит от концентрации Са2+ в цитозоле и от параметров Са2+-насоса: кир (скорость накачки) и Кир (чувствительность насоса):

Кальциевые потоки в модели сердечной клетки (рис. 1) описываются с помощью системы дифференциальных уравнений (Кига1а е1 а1. А1Р, 2002):

к'р - константы отношений объемов а и ¡3 отделов клетки ,

Методы численной реализации модели. Электронно-конформационное состояние КуЯ-канала описывается стохастическим дифференциальным уравнением

Уир=£ираг;/(А:ир+Са;).

(Ю)

~ТГ ББ ге1 ■'сШ'

Л

ир'

(4) со случайным изменением правой части и с переключением вследствие электронных и туннельных переходов (6, 8).

В формулах (3, 4) переменная £ электронного состояния является дискретной, принимая два значения: 0 (электронно закрытое) и 1 (электронно отрытое состояние). Слагаемое T]t¿mp в уравнении (4) отвечает за аддитивные шумы в виде

случайного винеровского процесса. В работе использовались численные методы интегрирования стохастических дифференциальных уравнений (метод Эйлера-Маруямы (Кушнер, Стохастическая устойчивость и управление)), а для электронных и туннельных переходов - реализации марковских процессов (метод Монте-Карло). Система уравнений (10), описывающая динамику кальция, решалась методом Эйлера. Для численного решения дифференциальных уравнений и проведения компьютерных экспериментов по изучению стохастической динамики RyR-канала разработан многозадачный комплекс программ в среде Borland С++ Builder.

В третьей главе представлены результаты моделирования динамики одиночного RyR-канала, а также результаты параметрического анализа модели. При проведении компьютерных экспериментов моделировалось поведение статистического ансамбля независимых каналов, при одинаковых условиях, далее при анализе кинетических характеристик функционирования каналов проводилось усреднение по статистическому ансамблю. Проводилось сравнение результатов численного моделирования по изучению процессов открытия/закрытия RyR-каналов с экспериментальными данными по исследованию изолированных RyR-каналов, представленными в литературе.

С помощью математического моделирования воспроизведены процессы открытия/закрытия RyR-канала (рис. 4 а) в стационарных условиях при различных значениях cis[Ca]. Проведен анализ полученных кинетических характеристик динамики канала.

Так, например, численные эксперименты показали, что при повышении уровня cis[Ca] до 50 мкМ происходит увеличение вероятности пребывания канала в открытом состоянии (Роре„), при дальнейшем увеличении cis[Ca] (от 100 до 1000

и |i il П iliniiii liiiiiti iiiiiijiilitlljiiillitli ^'~

Mfillllds[ca1"5 mkm

jJ^jj. cis|Ca)=15 mkM

Д ШПШ I Uiil.Hiiliii.iJ

Рис. 4. Активность RyR-каналов при стационарных условиях, а. Результаты численных экспериментов по исследованию процессов открытия/закрытия RyR-канала при различных значениях cis[Ca], б. Результаты экспериментов (Zahradnikova et al., Biophys Jour, 1995) по исследованию токов ионов Са2+ через RyR-канал в липидных бислоях. Наличие тока показывает положение канала в открытом состоянии, отсутствие - в закрытом.

мкМ) происходит понижение Рореп (рис. 5 а). Эти данные хорошо согласуются с результатами экспериментов (рис. 5 б).

1 10 100 1000

WO|V0J| IWII\I¥I

cisfCa], гжМ

Рис. 5. Зависимость вероятности Рорт пребывания RyR-канала в открытом состоянии от цитозольной концентрации кальция (ск[Ся]). а. Данные численных экспериментов на ЭК-модели RyR-канала в отсутствие ионов Mg2+ и с учетом Mg2+ (3 мМ). б. Экспериментальная зависимость Р (cisfCa]) (Gyorke et al., Biophys. J., 1998).

Наличие максимума в зависимости вероятности пребывания канала в

открытом состоянии объясняется в рамках ЭК-модели наличием инактивационного

состояния, вероятность перехода в которое увеличивается с ростом cisfCa]. Ионы

Mg2+ конкурируют с ионами Са2+, занимая вакантные места на активных центрах

RyR-каналов, однако их взаимодействие с каналом не приводит к активации канала.

Учет ионов Mg2+ в модели приводит к изменению зависимости /leiM(cis[Ca]) в

(7). Как видно из рисунка 5, при учете влияния ионов Mg2+ на RyR-канал, максимум

зависимости Ро;)е„(с15[Са]) достигается при больших значениях с18[Са], а величина самого максимума уменьшается.

В рамках ЭК модели удалось воспроизвести и объяснить результаты экспериментов по изучению отклика ЯуЯ-каналов на продолжительную стимуляцию ионами Са2+ со стороны ав-части. В ходе проведения модельных экспериментов исследовалась зависимость пребывания канала в открытом состоянии от времени после резкого повышения уровня с15[Са] (рис. 6). На графике зависимости Рореп (г) можно выделить три характерных участка.

На первом из них (0<г<100 мс) происходит активация каналов в ансамбле, то есть резкое повышение Рорт до 0.4 с постоянной времени гореп = 2.5 мс.

а. б. Рис. 6. Зависимости вероятности Р

open

2й0-I 1

5 ¿и

2.6 с

-■<#--------

2 3 i, с

пребывания канала в открытом 05Р состоянии при ступенчатом изменении °pen cis[Ca] от времени, а. Результаты численного эксперимента, б. Экспе-

_ , о риментальные данные, адапти-рованные

0,5 ] ся^мкМ) из работы (Gyorke, Science, 1993).

Затем при 100 мс < t < 2.5 с наблюдается медленный спад Рореп, до

стационарного значения Рореп =0.1 (участок II), в дальнейшем система переходит в

динамическое равновесие (участок III). Ранее явление такого медленного понижения активности канала при длительном стимуле было обнаружено экспериментально (Gyorke S., Fill М„ Science, 1993) и получило название адаптации RyR-канала к продолжительной стимуляции. Результаты численных экспериментов, проведенных в данной работе, с хорошей степенью точности согласуются с этими экспериментальными данными.

Введенное впервые теоретически в рамках ЭК-модели инактивационное состояние RyR-канала позволяет объяснить эффект адаптации. В работе показано, что вследствие малости вероятности этих переходов они проявляются только на больших интервалах времени (/>1 с).

В четвертой главе представлены результаты моделирования внутриклеточных Са2+-осцилляторов. В программном комплексе, разработанном на базе рассматриваемой модели, исследовалась динамика ионов Са2+ в ВЕ, включающей в себя кластер 9x9=81 ЯуЯ-каналов. Как уже отмечалось, процессы открытия/закрытия каналов в течение кальциевого цикла носят стохастический характер, и вероятность их открытия зависит от концентраций Са2+ в люмене СР и диадном пространстве. Из этого следует, что активность ЯуЯ-каналов должна меняться в течение Са2+-цикла в клетке.

В работе проведена серия численных экспериментов по исследованию осцилляцион-ной динамики концентрации внутриклеточного Са2+, то есть внутренних Са2+-«ча-сов», и получены временные зависимости таких величин, как концентрация Са2+ в люмене параметр

эффективного давления

(р(У)), концентрация Са2+ в диадном пространстве

(Са88(0), концентрация Са2+ в цитозоле клетки (Сах (/)) и число открытых каналов в кластере (/^„(г)).

На рисунке 7а представлены результаты численных экспериментов по исследованию Са2+-«часов». На первом этапе моделирование проводилось без учета внешнего стимула и конформационного взаимодействия между ЯуЯ-каналами в решетке (¿ = 0). Видно, что в определенном диапазоне параметров концентрация

б.

Рис. 7. Динамика Са2+-«часов». а. Зависимости Cass(f)> Сй;(0 и CajSR(f)H p(t) в процессе заполнения/высвобождения CP при включении процесса КВВК. б. Динамика решетки 9x9 RyR-каналов в процессе заполнения/высвобождения. Темными квадратами обозначены закрытые, светлыми - открытые каналы.

меняется периодически, то есть ВЕ действительно ведет себя как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор.

В начальный момент времени все каналы решетки закрыты (рис. 76 (1)), при этом заполненяется люмен СР, затем при увеличении параметра р выше нулевого уровня происходит туннелирование каналов в открытое состояние (рис. 76 (2)). Открытие относительно небольшого числа каналов (2-5%) приводит к повышению концентрации Са2+ в диадном пространстве (Са35), что инициирует процесс вторичного, более значительного высвобождения. При достижении величины Са55 критического уровня (Са55сг)1-0.25 мкМ) наблюдается резкое увеличение вероятности электронной активации каналов (рис. 76 (3)), что усиливает процесс высвобождения. Это интенсивное высвобождение, в свою очередь, резко понижает концентрацию Са2+ в люмене, что стимулирует перезагрузку системы и закрытие каналов (рис. 76 (4, 5)). Высвобожденный кальций диффундирует сначала в цитозоль, затем поступает обратно в сеть ретикулума, после этого в процессе заполнения Са2+ попадет обратно в люмен, и процесс высвобождения повторяется.

Зависимость Са55(0 представляла собой последовательность отдельных сигналов несинусоидальной формы с практически постоянной амплитудой (0.5±0.075 мкМ). На основании этого можно сделать вывод, что ВЕ при данном значении параметров модели ведет себя как устойчивый релаксационный осциллятор.

В ходе моделирования исследовано влияние параметра &ге{ш и коэффициента кооперативной динамики ЯуК-каналов к на динамику ВЕ. Были установлены и проанализированы различные моды поведения внутренних Са2+-часов в зависимости от коэффициентов к и /сгеГШ:

Мода 0: статическое равновесие.

Мода 1: релаксационные осцилляции, (рис. 86 (1)).

Мода 2: гармонические высокочастотные осцилляции, (рис. 86 (2)).

Мода 3: динамическое квазиравновесие, (рис. 86 (3)).

Мода 4: динамическое равновесие, (рис. 86 (4)).

19

На рисунке 86 представлены зависимости концентрации Са2+ в диадном пространстве от времени при различных значениях параметра скорости заполнения люмена в различных модах.

а.

б.

Д [\ 1\ ДА V (Ш

1 141 N/VnvYVV^MMAVW

4К„=500с-; k=1

Кет, с" " t, с

Рис. 8. Моды поведения Са2+-«часов». а. Фазовая (к — ккШ) диаграмма, совмещенная графиком плотности со шкалой частоты осцилляций для различных мод 0-4. б. Типичны-графики зависимости Cass(t) в различных модах динамики BE.

При увеличении ккт происходит рост амплитуды концентрации высвободившегося Са2+. Следует отметить, что в моде 1 (физиологический режим) наблюдается эффект увеличения амплитуды концентрации высвобождающегося Са2+ с ростом частоты осцилляций. Если учесть прямую связь силы сокращений кардиомиоцитов с концентрацией высвободившегося Са2+ (Tsien et al., J. Exp. Biol., 1979), то данный факт на молекулярном уровне объясняет давно известный принцип Боудича работы клеток водителей ритма: «чаще-сильнее». Другими словами, внутренний СР-осциллятор в ЭК-модели может работать автономно как устойчивый источник сердечного ритма.

Временные зависимости концентрации высвободившегося кальция (Cass) при различных значениях £гс1 без учета и с учетом взаимодействия между RyR-каналами представлены на рисунке 9.

к=0

к=1

к, .=50 с' к»=10с'

I --« 1с

I 1С 1

Рис. 9. Зависимость высвобождающегося Са2+ от времени в отсутствие взаимодействия между каналами (а) и при учете взаимодействия (б).

Показано, что при учете ИуЫ-ЯуЯ взаимодействия при достаточно больших кгс] (>50 с"1) наблюдаются устойчивые релаксационные колебания Са2+-«часов», в то время как при отсутствии взаимодействия гармонические колебания чередуются с высокочастотными стохастическими осцилляциями с малой амплитудой вблизи определенного среднего значения Са55 (-0.2 мкМ) (рис. 9а).

При ненулевом значении коэффициента к уменьшение параметра скорости высвобождения Са2+ из люмена через одиночный канал кге1 приводит к спонтанным переходам осциллятора в стационарное состояние (рис. 96), то есть к постоянному току, или утечке Са2+ из СР, сопровождаемому остановкой Са2+-«часов».

Таким образом, в численных экспериментах, проведенных в данной работе, впервые обнаружен новый эффект случайной остановки Са2*-осциллятора. Он заключается в появлении в процессе высвобождения/заполнения устойчивого кластера открытых каналов (2x2, 3x2 и проч.), через который и осуществляется стационарное высвобождение (утечка) ионов Са2+ в диадное пространство.

20' 100

"»" I 1 1-ГТ—г

1 2 3 4 5 6 7

I

Рис. 10. Процесс формирования устойчивого кластера открытых каналов в процессе динамики ВЕ при достаточно сильном взаимодействии между каналами и малом значении параметра скорости высвобождения кге].

На рисунке 10 приведен пример зависимости Мореп(0, иллюстрирующий данный переход в состояние стационарного высвобождения и показан вид решетки

ЯуЯ-каналов при переходе в данное состояние (светлыми квадратами обозначены открытые, темными - закрытые каналы). Влияние внешнего стимула на Са2+-«часы»

При исследовании эффекта случайной остановки Са2+-«часов» в данной работе также рассматривалось влияние внешнего стимула со стороны Ь-каналов на поведение системы. Данный стимул моделировался кратковременным повышением уровня Са35 в определенные моменты времени после остановки «часов».

Показано, что кратковременная стимуляция выводит Са2+-«часы» из стационарного режима в авторитмический, однако, через некоторое время (0.6-г1.7 с) осцилляции вновь спонтанно прекращаются. Из данных наблюдений следует, что внешние периодические стимулы со стороны мембраны способствует формированию стабильной автоволновой динамики всей клетки в целом. В заключении обобщены результаты исследования и сформулированы следующие выводы:

1. Электронно-конформационная модель, являясь универсальным инструментом, способна описывать поведение различных макромолекулярных структур, изменение конформации которых происходит вследствие взаимодействия с тем или иным субстратом.

2. В рамках модифицированной электронно-конформационной модели одиночного ИуК-канала сердечной клетки удалось описать основные экспериментально наблюдаемые особенности функционирования как одиночного ЯуЯ-канала, так и кластера сопряженных каналов на мембране саркоплазматического ретикулума в клетке.

3. Для одиночного ЯуИ-канала показана важная роль туннелирования как важнейшего механизма переходов из метастабильного состояния в состояние глобального минимума энергии системы.

4. Изолированная от мембранного осциллятора, внутриклеточная Са2+-высвобождающая система в определенном диапазоне параметров может вести себя как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор. При увеличении частоты

осцилляций увеличивается амплитуда концентрации высвобождающегося Са2+, что объясняет на молекулярном уровне феномен Боудича «чаще-сильнее».

5. В определенном диапазоне параметров динамики ионов Са2+ между компартментами высвобождающей единицы наблюдается нарушение стабильности работы Са2+ часов, заключающееся в спонтанных переходах в квазистационарное состояние. Показано, что учет конформационного взаимодействия между RyR-каналами в кластере высвобождающей единицы приводит к стабилизации осцилляций по амплитуде и частоте.

6. Выявлено, что при достаточно сильном взаимодействии между RyR-каналами возникает эффект случайной остановки внутриклеточных Са2+-«часов», заключающийся в формировании устойчивого кластера открытых каналов. Показано, что Са2+-высвобождающая система может выйти из данного стационарного состояния только при стимуляции ионами Са2+ со стороны мембраны, что также подтверждает тот факт, что именно самосогласованное взаимодействие внутренних Са2+-«часов» и мембранного осциллятора обеспечивает стабильность работы клеток синоатриального узла.

Основные публикации по теме диссертации

Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях:

1. Рыбкин А.М. Электронно-конформационная теория функционирования рианодиновых каналов в клетках водителей сердечного ритма // Вестник уральской медицинской академической науки, 2013. - №2. - С. 54-58.

2. Рыбкин A.M., Москвин A.C., Соловьева О.Э., Мархасин B.C. Моделирование автоволновой кальциевой динамики в кар-диомиоцитах в рамках электронно-конформационной теории // Доклады Академии Наук, 2012. - Т. 444, №5. - С. 572579.

3. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solovyova O.E., Markhasin V.S.Electron-Conformational Transformations in Nanoscopic RyR Channels Governing Both the Heart's Contraction and Beating // Письма в ЖЭТФ, 2011. - Vol. 93 (7). - P. 446-452.

Материалы конференций:

4. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Role of the Inter-RyR Coupling in Cardiac Intracellular Calcium "Clock" // Biophysical Journal. - 2014. -T. 106. - №. 2. - C. 318a-319a.

5. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Electron-Conformational Model of SR-Based Ca2+ Clock Mode // Biophysical Journal, 2010. - Vol. 98(3). - P. 336a.

6. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E. Analysis of the RyR-Channel Stochastic Dynamics in the Electron-Con-formational Model // Proceedings of The Physiological Society, 2009. - Vol. 15. P. Dl.

7. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Stochastic Dynamics of Release Unit in a Cardiac Cell in Electron-Con-formational Model // Biophysical Journal, 2009. - Vol. 96(3) - P. 518a.

8. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solovyova O.E., Markhasin V.S., Kohl P. Spark Generating Stochastic Dynamics of Release Unit in a Cardiac Cell // Biophysical Journal, 2008. - Vol. 94 (2) - P. 312a.

9. Рыбкин A.M., Зорин H.M., Москвин A.C. Моделирование динамики ионных каналов в кардиомиоците в рамках электронно-конформационной теории // Х1П Всероссийская школа-семинар по проблемам физики конденсированного состояния вещества: тезисы докладов. - Екатеринбург, 2012. - С. 256.

10. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Modelling the Autooscillatory Calcium Dynamics in Sinoatrial Node Cell in the Framework of Electron-Conformational Model // "Biological Motility - Fundamental and Applied Science": Abstracts. - Puschino, 2012. - P. 172-174.

11. Рыбкин A.M., Москвин A.C. Электронно-конформационная модель молекулярных нанокластеров // 13я Международная зимняя школа физиков-теоретиков "Коуровка": сборник тезисов. - Екатеринбург, 2010. - С. 87.

12. Рывкин A.M., Москвин А.С. Моделирование автоволновой динамики клеток сердечного ритма // 17я Всероссийская научная конференция студентов-физиков и молодых ученых: сборник тезисов. - Екатеринбург, 2011. - С. 407.

13. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Electron-Conformational Model of SR-based Ca2+ Clock Mode in Sinoatrial Cells // «New Horizons in Calcium Signaling»: Abstracts. - Beijing, China, 2010. - P. 175.

14. Ryvkin A.M., Moskvin A.S., Solovyova O.E., Markhasin V.S. RyR-Channel Stochastic Dynamics in the Electron-Conformational Model. Kinetic Parameters // International Conference "PhysCell 2009 - From the edge to the heart": Abstract Book. -Primoshten, Croatia, 2009. - P. 222.

15. Ryvkin A.M., Moskvin A.S. Electron-Conformational Model of the Ryanodine Channel in a Cardiac Cell. Kinetic Properties // International Conference on Interdisciplinary Mathematical and Statistical Techniques: Abstract book. - Plzen, Czech Republic, 2009. - P. 68.

16. Рывкин A.M., Москвин A.C., Соловьева О.Э. Анализ результатов моделирования стохастической динамики ионных каналов в кардиомиоците в рамках электронно-конформационной теории // Межвузовская конференция "СПИСОК-2009", УрГУ: тезисы докладов. - Екатеринбург, 2009. - С. 93-96.

17. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Modelling the Gating of the Cardiac Ryanodine Channel // Conference "Mathematics. Computing. Education": Abstract book. - Pushchino, 2009. - P. 116.

18. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Korolev A.V. Electron-Conformational Model of Molecular Nanoclusters // 3rd International Advanced School: Molecular

Switching and Functional Materials & 5th International Symposium on Molecular Materials: Electronics, Photonics and Spintronics: Abstract book. - Universite de Rennes, France, 2009. - P. 96.

19. Moskvin A.S., Ryvkin A.M., Solovyova O.E., Markhasin V.S. Novel Stochastic Model for Calcium Release Unit in Cardiomyocite // Biological Motility. Achievements and Perspectives: Abstracts. - Pushchino, 2008. - P. 176.

Подписано в печать 25.06.2014. Формат 60x84 % Гарнитура Times New Roman. Печать цифровая. Бумага ВХИ. Усл. печ. листов 7. Тираж 100. Заказ 121.

Отпечатано в типографии «GetCard» г. Екатеринбург, ул. Комсомольская, 41

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Рывкин, Александр Михайлович, Пущино

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ И ФИЗИОЛОГИИ Уральского отделения Российской академии наук Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина

На правах рукописи

04201460595

Рыбкин Александр Михайлович

Исследование динамики кальция в клетках сердечной мышцы на основе электронно-конформационной модели рианодин-чувствительных

кальциевых каналов

03.01.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научные руководители:

д. ф.-м. н. Москвин Александр Сергеевич

д. ф.-м. н. Соловьева Ольга Эдуардовна

Пущино - 2014

Содержание

Содержание...................................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. Обзор литературы.....................................................................................................11

1.1 Структура кардиомиоцита и его электрическая и механическая функция.....................11

1.2 Рианодиновый рецептор - основной элемент управления динамикой ионов кальция в клетке.......................................................................................................................................14

1.3 Эксперименты по изучению изолированных ЯуЯ-каналов.............................................16

1.4 Локальные высвобождения Са2+ в кардиомиоцитах........................................................22

1.5 Модели функционирования ЯуЯ-каналов........................................................................23

1.5.1 Марковские модели динамики ЯуЯ-канала...............................................................23

1.5.2. Стохастическая динамика и электронно-конформационные взаимодействия в

белках...................................................................................................................................26

1.5.2. Описание динамики ЯуЯ-канала в рамках электронно-конформационной моделиЗО

1.6 Модели «общего пула».....................................................................................................31

1.7. Теория локального контроля............................................................................................33

1.8 Моделирование активности клеток водителя сердечного ритма....................................35

1.8.1 Современные представления об авторитмической активности клеток водителя сердечного ритма.................................................................................................................37

1.8.2 Концепция внутренних Са2+-«часов»........................................................................38

1.8.3 Модель Мальцева-Лакатты........................................................................................38

ГЛАВА 2. Электронно-конформационная модель ЯуЯ-канала и Са2+-высвобождающей единицы.......................................................................................................................................42

2.1 Электронно-конформационная модель ЯуЯ-канала........................................................42

2.1.1 Гамильтониан канала..................................................................................................46

2.1.2. Конформационный потенциал..................................................................................47

2.1.3 Влияние уровня 1гаш[Са] на форму конформационного потенциала ЯуЯ-канала.. 48 2.1.4. Структурные изменения канала в электронно-конформационной модели.............50

2.1.5 Динамика конформационной координаты................................................................52

2.1.6 Динамика электронной степени свободы..................................................................52

2.1.7 Инактивационое состояние ЯуЯ-канала....................................................................53

2.1.8. Зависимость вероятности электронных переходов от концентрации Са2+ в аз-части.....................................................................................................................................55

2.1.9 Эффекты туннелирования..........................................................................................59

2.1.10 Проницаемость ЯуЯ-канала.....................................................................................62

2.2 Математическая модель Са2+ высвобождающей единицы..............................................63

2.2.1 Электронно-конформационная модель решетки ЯуЯ-каналов................................64

2.2.2 Схема динамики ЯуЯ-каналов в решетке высвобождающей единицы....................65

2.2.3 Сопряжение динамики ЯуЯ-каналов с динамикой кальция в отделах высвобождающей единицы.................................................................................................67

2.2.4 Модель Са2+-высвобождающей единицы..................................................................68

2.3 Методы численной реализации модели...........................................................................70

2.3.1 Метод Эйлера-Марайамы...........................................................................................71

2.3.2 Реализация электронных и туннельных переходов. Метод Монте-Карло...............72

2.3.3 Численная схема для ЭК-модели ЯуЯ-канала...........................................................75

2.4 Описание программного комплекса.................................................................................77

2.5 Заключение к главе 2.........................................................................................................80

ГЛАВА 3. Результаты численного моделирования. Активность одиночного ЯуЯ-канала при стационарных условиях..............................................................................................................82

3.1 Анализ временных зависимостей конформационной координаты <3.............................83

3.2 Медленная конформационная динамика ЯуЯ-канала.....................................................86

3.2.1 Параметр эффективного трения Г. Конформационная динамика RyR-канала........86

3.2.2 Влияние коэффициента упругости канала К на форму конформационного потенциала...........................................................................................................................88

3.2.3 Зависимость конформационного потенциала от параметра электронно-конформационного взаимодействия а................................................................................90

3.3 Стохастическая динамика RyR-канала. Быстрые переходы............................................92

3.3.1 Кинетические характеристики динамики RyR-канала..............................................95

3.3.2 Зависимость вероятности электронных переходов от cis[Ca]..................................99

3.4 Активация одиночного канала........................................................................................101

3.5 Исследование процесса закрытия RyR-канала...............................................................104

3.6 Процесс адаптации RyR-каналов к продолжительной стимуляции..............................107

3.7 Динамика одиночного RyR-канала при установившемся уровне cis[Ca].....................112

3.7.1 Зависимость активности RyR-канала от времени...................................................112

3.7.2 Зависимость активности RyR-канала от уровня cis[Ca]..........................................114

3.7.3 Влияние ионов Mg2+ на динамику одиночного RyR-канала...................................118

3.8 Заключение к главе 3.......................................................................................................122

ГЛАВА 4. Моделирование динамики ионов Са2+ между отделами кардиомиоцита.............124

4.1 Анализ модели высвобождающей единицы...................................................................124

4.1.1 Процессы открытия и закрытия каналов в высвобождающих единицах...............124

4.1.2 Анализ кооперативной динамики RyR-каналов в кластере....................................126

4.1.3 Эффект задержки туннелирования в процессе динамики Са2+...............................129

4.1.4 Анализ модели динамики ионов Са2+ между компартментами клетки..................132

4.2 Результаты моделирования Са2+ высвобождающей единицы.......................................137

4.2.1 Высвобождающая единица как самоподдерживающийся кальциевый осциллятор ............................................................................................................................................137

4.2.2 Моды динамики Са2+-«часов»..................................................................................140

4.2.3 Влияние взаимодействия между RyR-каналами на стабильность осцилляций

системы..............................................................................................................................144

4.2.3 Эффект случайной остановки автоколебаний.........................................................147

4.3 Заключение к главе 4.......................................................................................................155

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................................157

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................161

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ..................................................180

Список сокращений..................................................................................................................183

Природа — сфинкс. И тем она верней Своим искусом губит человека, Что, может статься, никакой от века Загадки нет и не было у ней.

Ф. И. Тютчев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Деятельность сердца включает в себя сложнейшие биологические, химические и физические процессы. Их изучение требует совместных усилий специалистов из различных областей науки - биологов, физиков, химиков, математиков.

Современные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что одной из основных причин возникновения хронических заболеваний сердца (аритмия, сердечная недостаточность и пр.) является нарушение внутриклеточной динамики ионов кальция [43]. По современным представлениям именно динамика ионов Са2+ является центральным звеном электро-механического сопряжения в рабочих кардиомиоцитах и формирования сердечного ритма в клетках синусно-предсердного узла. Известно, что активность сердечных клеток инициируется повышением концентрации внутриклеточного Са2+ на порядок величины за счет периодического высвобождения из внутриклеточных накопителей (cap ко плазматического ретикулума, CP) через специфические ион-активируемые кальциевые каналы, сопряженные с рианодиновыми рецепторами (RyR-каналы). Связывание ионов Са с активными центрами рецептора изменяет конформационное (структурное) состояние канала, переводя его в проводящее состояние, в результате этого возникают трансмембранные ионные токи по градиенту концентрации. Эти гигантские биологические нанообъекты являются одним из основных регуляторов динамики ионов кальция в сердечных клетках. Свое название рианодиновый рецептор получил благодаря способности связываться с алкалоидом рианодином, ингибирующим активность канала.

Выяснение и исследование механизмов функционирования КуЯ-каналов, определяющих динамику ионов Са2+, является одной из первоочередных задач современной биофизики. Ее успешное решение связывается не только с развитием современных экспериментальных методов исследования наноскопических биосистем, но и, прежде всего, с перспективами математического моделирования.

Решение сложнейшей задачи математического моделирования ЯуЯ-канала предполагает выбор биофизически обоснованной модели канала, способной описать совокупность ключевых процессов в наноскопической молекулярной системе. Разработанная теория должна включать адекватный математический аппарат и компьютерную модель, обеспечивающие достоверное описание как биофизической модели, так и экспериментальных данных, и имеющих предсказательный потенциал.

До сих пор традиционным подходом к описанию динамики КуЯ-канала является использование сугубо феноменологических дискретных марковских моделей [68, 145, 169, 173], которые фактически никак не учитывают реальной структуры наноскопической молекулярной системы, что делает спорным вопрос об их адекватности.

Альтернативой марковским схемам являются непрерывные модели, которые основаны на принципах электронных и конформационных взаимодействий в белках. Примером данного типа моделей являются электронно-конформационные модели стохастической динамики ЯуЯ-каналов, разработанные Москвиным с соавторами [121-123], которые позволили объяснить ряд важнейших особенностей функционирования этого типа белков, однако, при моделировании ЯуЯ-каналов в Са высвобождающей системе использовалась простейшая детерминированная схема их динамики без учета случайных переходов.

В данной диссертационной работе электронно-конформационная модель ЯуЯ-канала получила дальнейшее развитие и была применена для изучения Са высвобождающей системы в клетках водителя сердечного ритма.

Цель работы. Основной целью диссертационной работы является развитие электронно-конформационной теории наноскопических белковых систем - одиночных ИуЯ-каналов и кластеров КуЛ-каналов, а также разработка биофизически обоснованной физико-математической модели стохастической

9-1-

динамики Са высвобождающей системы в рабочих кардиомиоцитах и в клетках водителей сердечного ритма.

Для реализации поставленной цели в данной работе были сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствовать предложенную ранее [121-123] электронно-конформационную модель ИуЯ-канала введением инактивационного состояния канала и детальным рассмотрением туннельных переходов с целью описания ряда эффектов стохастической динамики данного белка.

2. На основе усовершенствованной модели ИуЯ-канала разработать модель Са высвобождающей единицы и включить ее в интегративную модель динамики кальция в сердечной клетке.

3. Разработать комплекс программ для численного моделирования стохастической динамики одиночных КуЯ-каналов, кластера взаимодействующих каналов и моделирования кальциевой динамики в сердечных клетках.

4. Провести детальный параметрический анализ электронно-конформационной модели стохастической динамики одиночных ЯуЯ-

каналов, исследовать кинетические характеристики и особенности

2+

поведения 11у11-канала при постоянном значении концентрации Са и при включении внешнего стимула.

5. Провести компьютерное моделирование динамики Са2+ в клетках водителей сердечного ритма в рамках интегративной модели Са2+ высвобождающей системы кардиомиоцитов, выявить причины возникновения автоколебательной Са2+-динамики.

6. Исследовать особенности и характеристики

автоколебательной динамики Са2+ в кардиомиоцитах.

Научная новизна работы.

1. Проведено усовершенствование разработанной ранее электронно-конформационной модели ЯуЯ-каналов: введено новое инактивационное состояние канала, и подробно рассмотрены особенности туннельных и электронных переходов между состояниями одиночных ЯуЯ-каналов.

2. Впервые в рамках электронно-конформационной теории предложена модель взаимодействия ионов Са2+ с активными центрами ЯуЯ-канала, учитывающая вероятности заполнения мест присоединения

гл 2+

активационного центра ионами Са .

3. Впервые в рамках усовершенствованной электронно-конформационной модели воспроизведена стохастическая динамика ЯуЯ-каналов как при стационарных условиях, так и в условиях динамики ионов Са2+, исследованы такие кинетические характеристики как вероятность пребывания канала в открытом состоянии, среднее время пребывания канала в открытом и закрытом состояниях. Показано, что электронно-конформационная модель дает адекватное описание экспериментальных данных об активности изолированных ЯуЯ-каналов.

4. Проведено обобщение модели стохастической динамики ЯуЯ-канала для кластера взаимодействующих каналов с учетом различных электронно-конформационных преобразований.

5. Впервые построена интегративная модель замкнутой Са2+-высвобождающей системы кардиомиоцита с учетом стохастической динамики кластера ЯуЯ-каналов.

2+

6. Впервые в рамках объединенной модели Са -высвобождающей единицы проведена серия численных экспериментов по изучению кальциевой динамики в клетках водителей сердечного ритма, установлена природа формирования и основные характеристики

автоколебательного режима динамики Са2+-высвобождающей системы (внутриклеточных Са2+-«часов»).

7. Исследованы различные режимы поведения Са2+-«часов» в широком диапазоне параметров модели. Обнаружен новый эффект внезапной остановки изолированного внутриклеточного кальциевого осциллятора.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанная электронно-конформационная модель предназначена для описания динамики супрамолекулярных комплексов ЯуЯ-каналов в сердечных клетках и может быть объединена с моделями, описывающими электромеханическое сопряжение в клетках рабочего миокарда и электрическую активность клеток водителей сердечного ритма.

Модель позволяет на молекулярном уровне выявить роль ЯуЯ-каналов в процессах кальциевой динамики, ответственных за нарушение электрической и механической активности в сердечных клетках. Предсказания модели позволяют сформулировать программу дальнейших экспериментальных исследований, направленных на научно-обоснованный поиск внутриклеточных мишеней для терапевтического воздействия при патологии сердца.

Разработанная модель электронно-конформационной динамики молекулярных нанокластеров может найти широкое применение при решении задач фазовых переходов и стохастической динамики применительно к разнообразным биологическим и физическим объектам, способным менять свою структуру, конформационное состояние и физические свойства вследствие внешнего воздействия, а также квантовых или термофлуктуаций. В частности, электронно-конформационная модель ЯуК-канала была использована при исследовании хаотического и устойчивого поведения нелинейных двухкомпонентных систем [17].

Разработанный комплекс программ для реализации модели стохастической динамики КуЯ-канала и модели Са -динамики в сердечной

клетке имеет практическую ценность для решения более широкого круга физических задач для объектов с индуцированными структурными переходами (например, двухуровневых электронных центров с учетом электронно -решеточного взаимодействия) и может быть использован в учебных и исследовательских целях.

Основные по