Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм нарушения мембранных и сократительных свойств сердечных клеток в условиях кальциевой перегрузки и возможности их восстановления

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизм нарушения мембранных и сократительных свойств сердечных клеток в условиях кальциевой перегрузки и возможности их восстановления"

ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОШИ АН БССР

На правах рукописи

КОБИШСКИЙ Евгений Максович

УДК: 577.353.4:577.352.465

.МЕХАгйШ НАРУШЕН 1.Е.ШРАННЫХ И СОКРАТИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ СЕРДЕЧНЫХ МЕТОК В УСЛОВИЯХ КАЛЬЦИЕВОЙ ПЕРЕГРУЗКИ II ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ВОССТАНОВЛЕНИЯ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации. на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МИНСК - I 9 8 8

Работа .выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник М.Е.Саксон

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.М.Мажуль

доктор медицинских наук Изаков В.Я.

Ведущая организация:

Институт хирургии

им. А.В.Вишневского АМН СССР

Защита состоится "¿2." <1Э88 г. в /fy

час.

на заседании Специализированного совета Д 006.05.01 по защите кандидатских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АН БССР (220733, г. Минск, ул. Академическая, 27).

С диссертацией могно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН БССР.

Автореферат разослан

"Г "

1988 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.М.Шейко

Институт фотобиологии АН БССР, 1988 г.

¡у.'Х' , - Актуальность. Диссертационная работа посвящена одному из 'актуальных вопросов молекулярной кардиологии - выяснению причин , иЗмейения сократительных свойств клеток сердечной мышцы в условиях, нарушения кальциевого гомеостаза (кальциевая перегрузка) и иташлдг-путей их восстановления. Кальциевой перегрузкой называют стационарное повышение концентрации свободных ионов в цитоплазме Свыше 0,1 мкМ), ведущее к неконтролируемой активации кальций-зависимых систем ионного транспорта, энергетики, метаболизма и, в конечном счете, к гибели клеток.

В сердечной мышце кальциевая перегрузка имеет ряд особенностей, которые создают состояние электро-механяческой нестабильности клеток. Нестабильность проявляется в спонтанном возбуждении и сокращении клеток, активации аритмогенного оспилляторного тока, завершается развитием аритмий и угнетением сократительной способности миокарда. Кальциевая перегрузка "извращает" ритмоинотроп-ные отношения и инотропные эффекты кардиотоников - стимуляторов сократимости миокарда. Причины изменения мембранных и сократительных свойств сердечных клеток в условиях кальциевой перегрузки в настоящее время интенсивно исследуются с привлечением прецизион-- ных методов микрофизиологического анализа (эквариновая люминес- ... ценция, исследования электрических и механических шумов, кальциевой чувствительности сократительных белков). Этими исследованиями установлены кардинальные факты, свидетельствующие о первичной роли процессов высвобождения кальция из саркоплазматического ре-тикулума (СР) в генезе электромеханической дестабилизации сердечных клеток. Однако природа первичного изменения проницаемости мембран саркоплазматического ретикулума и сократительных свойств сердечной мышцы, перегруженной Са2+, остается до конца не раскрытой.

Проанализировав современное состояние проблемы, мы поставили перед собой следующие цели и задачи.

Цель работы: Изучить механизм нарушения мембранных и сократительных свойств сердечных клеток в условиях кальциевой перегрузки и выяснить возможности их восстановления.

Задачи исследования:

1. Используя блокаторы кальциевых каналов терминальных цистерн и продольных тудул, выявить роль этих областей ретикулума в развитии спонтанных сокращений сердечных клеток в условиях кальциевой перегрузки.

2, Выяснить причины толерантности миокарда к инотропным стимулам: высокая частота стимуляции (отрицательная лестница силы,

потенциация сократимости покоем), кофеин, адреналин, оуабаин в условиях кальциевой перегрузки.

3. Провести углубленное исследование механизма действия широкого класса кардаоактивных соединений (рианодан, кофеин, кальциевые агонисты и антагонисты, местные анестетики) с целью выявления эффективных средств восстановления сократительной функции миокарда в условиях кальциевой перегрузки.

4. Предложить модель, позволяющую проводить, скрининг кардаоактивных соединений на определенные отделы сарколлазматического ретикулума (СР).

Научная новизна:!. Предложена и обоснована гипотеза спонтанного Са^-рилиза, альтернативная гипотезе. Са^+-Са2+-рилиза, предложенной А.Фабиато даш объяснения механизма колебаний тонуса мышцы в состоянии кальциевой перегрузки.

" 2. Методами фармакологического анализа установлено, что рианодан является эффективным индуктором высвобождения Са2+ из СР. Этот вывод имеет принципиальное значение для мышечной физиологии, широко использующей рианодан для оценки вклада ретикулума в сократительный ответ скелетных и сердечных мышц. Наш вывод противоречит общепринятому мнению о рианодине как блокаторе высвобождения Са^+ из СР. Ошибка, с нашей точки зрения, состоит в том, что физиологические эффекты рианодина на одиночных кардаомиоцитах и фрагментах сердечной мышцы трактуются на основании результатов де* ствия высоких концентраций рианодина на изолированном ретикулуме (З^ко, У/1Х1ег80п, 1980).

3, Результаты работы указывают, что рианодан стимулирует два типа кальциевых каналов ретикулума: а) кальциевые каналы терминальных цистерн, высвобождающие Са2+ в миоплазму при возбуждении клетки и б) контактные кальциевые каналы, обеспечивающие, как предполагается, прямой отток Са2+ из ретикулума во внеклеточное пространство в период диастолы. Последний эффект обеспечивает "разгрузку" ретикулума и восстановление нормальных сократительных свойств миокарда в условиях кальциевой перегрузки.

4. Выявлено новое внутриклеточное действие дигидропирпдиново-го кальциевого агониста ССР 28392 в миокарде крысы. Эффект аналогичен действию рианодина, 'вероятно, связан с активированием оттока Са^+ из СР в период диастолы через контактные кальциевые каналь

. Практическая ценность. I. Модель двух типов спонтанных сокращений может быть полезной тест-системой в процедуре биологического скрининга кардаоактивных соединений дая детализации их внутриклеточного действия на аппарат СР.

2. Возможность повышения чувствительности сердечной мышцы к кардаотоникам указывает на перспективность использования в арсе-2

нале терапевтических средств лекарств, стимулирующих обмен Са2+ и разгрузку саркоплазматического ретикулутла (рианодиноподобные препараты).

Апробация работы. Результаты работы были доложены на:

1. 3-ей Всесоязной школе "Физиология и биофизика миокарда", Свердловск, IS84,

2. 5-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц, Тбилиси, 1985.

3. 2-0i\! Международном симпозиуме по сравнительной кардиологии, Сыктывкар, 1986.

4. Конференция молодых ученых Р1БФ АН СССР, г. Пущино, 1986.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста; содержит 70 рисунков и 3 таблицы. Состоит из введения и пяти глаз (включая обзор литературы), выводов и списка литературы, содержащего 259 наименований,

П. МЕТОДША ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполняли на папиллярных мышцах правого желудочка сердца крыс, кроликов, морских свинок (диаметр - 0,5-0,9 мм; длина 1,5-4 мл). Препарат фиксировали в проточной камере и перфорировали оксигенированным раствором Тироде следующего состава: 130 КаС1,-4 KCl, 2,5 СаС12, 1,0 UgClg, 10 КаНСО^, 0,3 EaHgPO^.IO ГЛЮКОЗЫ (в d.l). Раствор насыщали газовой смесью 96$ 02+4^ С02, рН-7,4 t=35°+I°. Внутриклеточный потенциал отводили стеклянными микроэлектродами, заполненными 2,5 М KCl (сопротивлейие порядка 10-20 мОм). Препарат стимулировали короткими импульсами тока (длительность 5 мсек, амплитуда в два раза выше порога), через хлор-серебряные электрода. Изометрическое напряжение регистрировали с помощью механотрона 6Мх2 В. Сократительную способность миокарда оценивали по изменению кривой частота-сила и амплитуде первых сокращений после различных интервалов покоя и реакции на инотропные агенты.

Опыты по фиксации потенциала выполнены на трабекулах предсердия лягушки методом двойного сахарозного моста. Методика одновременной регистрации ионных токов и сокращения была описана ранее (Pilippov и Porotikov, 1983]. Измеряли натриевые, кальциевые и калиевые токи. Помимо абсолютных величин токов рассчитывали кинетические параметры (переменную стационарной активации и инактивации кальциевого тока). Сокращение регистрировали оптическим методом (Филиппов и др., 1984). Выполнено 100 экспериментов на миокарде крысы и 30 экспериментов с предсердием лягушки.

Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ

К ПРИРОДЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ

ШОКАРДШЬНЫХ КЛЕТОК В СОСТОЯНИИ КАЛЬЦИЕВОЙ ПЕРЕГРУЗКИ

МЕХАНИЗМ СВДШШШХ СОКРАЩЕНИЙ

I. Гипотеза "Са-Са ршшза"

Появление спонтанных сокращений (постсокращений) отмечено при любых воздействиях, способствующих аккуьуляции в сарко-плазыатическом ретикулуые миокардиальных клеток (повышение часто^ ты стимуляции, воздействие сердечных гликозидов, снижение конценг рации ионов натрия, калия и повышение кальция в растворе). Постсокращения зарегистрированы на всех уровнях организации миокарда - спикированные волокна, одиночные кардиомиоциты и целое сердце. Спонтанные сокращения отражает циклическое изменение свободной концентрации Са**+ в ыиоплазме (в пределах 4-10 мкМ Orchard и др. 1983; Allen и др., 1984; Wier и др.» 1984; Lakatta и др., 1983; 1984; 1985). Дня объяснения осцияляций внутриклеточной концентрации Са2+ А.Фабиато была предложена гипотеза "Са-Са рилиза", согласно которой цитоплазыатический взаимодействует с кальциевым рецептором на цитоплазматической поверхности ретикулума и индуцирует регенеративный выход кальция из терминальных цистерн. Сократительные белки реагируют на выход Са^+ спонтанным сокраще-iniea ( Fab i at о , 1973; 1983; 1985). В гипотезе А.Фабиато, принятой в настоящее время всеми исследователями, есть три уязвимых поло-гения:

1. Гипотеза постулирует каскад событий, индуцируемых ионами Са2+, но не выявляет причину первичного высвобождения Са^+ из CP в период диастолы.

2. Гипотеза ограничивает источник "сократительного" Са^+ для постсокращений терминальными цистернами CP и не учитывает роль продольных тубул основного депо реаккуцуляции Са .

3. Гипотеза не согласуется с собственными наблюдениями А.йа-биато, показавшим, что рутениевый красный, наиболее эффективный блокатор кальциевых каналов терминальных цистерн, не устраняет спонтанные сокращения в скинированных кардиомиоцитах крысы, перегруженных Са2+ ( Pabiato, 1974).

Таким образом, гипотеза"Са-Са ршшза" не может удовлетворительно объяснить причины первичного повышения проницаемости мембран саркоплазматического ретикулума перегруженного кальцием и 4 "

требует пересмотра с позиций новых данных о свойствах функционально-гетерогенных популяций ретикулума, выявленных в биохимических работах последних лет.

2. Мембранные и фармакологические свойства терминальных цистерн и продольных тубул ретикулума

Саркоплазматический ретикулум - сложная система цистерн и трубочек, выполняющая роль регулятора концентрации ионов в кьиечноы волокне. С функциональной и морфологической точек зрения, аппарат CP мояко разделить на две области: терминальные цистерны, участвуйте в квечном сокращении высвобоадая ионы под действием электрического сигнала, и продольные тубулы, реак-кумулирующие ионы и обеспечивающие релаксацию. Реаккумуля-ция ионов происходит против электрохимического градиента за счет работы Са-йТФазы, утилизирующей энергию AIS (Бендолл,1970). В настоящее время механизм высвобождения кальция, мембранные и фармакологические свойства двух областей ретикулума интенсивно изучаются. Предполагается, что высвобождение кальция происходит через кальциевые каналы терминальных цистерн, управляемых электрическими и химическими стимулами. Классическим стимулятором кальциевых каналов терминальных цистерн считается кофеин (Endo , 1977); блокирующее действие на этот тип каналов оказывают рутене-евый красный, дантролен, тетракаин (Antoniu в др., 1985; Danko и др., 1935; chlouи др., 1975). Встраивание везикул терминальных цистерн в бислойные лкпидные мембраны выявило каналы с высокой одиночной проводимостью, порядка 170-200 пС, "чувствительные* к рутениевому красно^, Еонаы 1%2+ и Ш> (Smith и др., 1985; НИ gema пп и Др., 1986; Orcozo и др., 1985).

В изолированной фракции продольных тубул выявлены кальциевые каналы с низкой одиночной проводимостью ( ~ 10 пС), не чувствительные к химическим агентам - кофеин, рианодин, рутенеевый красный (Orcozo и др., 1985). Каналы продольных тубул активируются при перегрузке везикулярных препаратов ионами Ca , так называемый "спонтанный Са-рилиз" ( Mitchell и др., 1983; Palade и др., 1984). Блокирующее действие на спонтанное высвобождение Ca + из продольных тубул оказывают анестетики лидокаин и SKF -525А (Volpe и др., 1983). При ötom, лидокаин не влияет на выход Сег+ из терминальных цистерн (Bianachi , 196?). Схематическое представление двух популяций кальциевых каналов терминальных цистерн и продольных тубул и их специфических модуляторов показано на рис. I.

помин у .....<ЩМ>ЛТОРЦ_^."С РЕГРVзкл

VJitVoV.: SKF525-A

WW «идо«« им

Рис. I. Различие фармакологических свойств кальциевые каналов терминальных цистерн (TCP) и продольных тубул (ПСР). Выброс из терминальных цистерн юдацирует кофеин, блокирует дантролен, тетракаин; каналы TCP не чувствительны к лидокаину. Спонтанный выход Са^+ из продольных тубул активирует кальциевая перегрузка.

3. Сравнительные фармакологические свойства двух типов спонтанных сокращений. Эффекты анестетиков

- 2-,

Как указано выше, высвобождение Ca из терминальных- цистерн можно индуцировать химическими стимулами, например,' кофеином (Endo , 1977; Fabiato , 1985). В наших экспериментах на целой шшце кофеин активировал спонтанные сокращения на фазе релаксации, затягивая тем самым процесс мышечного сокращения. На рис.2 и 3 показан типичный пример "кофеиновых" сокращений, активированных добавлением в раствор 0,5 ыМ кофеина.- Высокая частота электрической стимуляции мышца (2 Гц) облегчала их развитие. Внешне отличная картина ^спонтанных сокращений отмечена в условиях кальциевой перегрузки'.' В этом случае спонтанные сокращения развиваются в период диастолы, после завершения релаксации, получив название "постсокращения" (рис. 2 и 3). Существенные различия выявлены также при анализе фармакологических свойств двух типов спонтанных сокращений, в частности, при анализе эффектов дантролена к лидокаина. Так, дантр.олен устранял "кофеиновые" сокращения (30 икМ, 30 мин), не оказывая влияния на "постсокращения" в концентрации до I мМ (рис. 2). Угнетение "кофеиновых" колебаний дантро-лэном сопровождалось ускорением релаксации шшцы (рис. 2,2). Обратный эффект - блокирование "постсокращений", но отсутствие аффекта ва "кофеиновые" сокращения и релаксацию отмечено в присутствии лидокаина (рис. 3).

Анестетик SKF 525-А вызывал преимущественное блокирование

постсокращений при повышении концентрации анестетика до 60-80 мкЫ отмечено блокирование "кофеиновых" ответов и ускорение процесса релаксации мышцы.

КОФЕИН

КАЛЬЦИЕВАЯ ПЕРЕГРУЗКА

/

V\

Г\ i v i » i v

2

2мН^ I

V

0 Г\

г\

I \

ДАНТРОЛЕН

/

— 50 мс

Рис.2. Лднтролен (40 мкМ, 30 мин) не влияет (3,4) на спонтанные сокращения при кальциевой петзегвузке сердечной мипцы крнсн (Са2+ = 5 , но эффективно блокирует спонтанные сокращения, вызванные кофеином (0,5 мМ). Частота электрической стимуляции мышцы - 2 1ц.

КОФЕИН

КАЛЬЦИЕВАЯ ПЕРЕГРУЗКА

\ .

2 мн

Л

ЛИДОКЛИН

Рис.З,

• 2 Л

1 * л Л

!

■sí '' — 50мс

Лидокаин (40 мкЫ) блокирует спонтанные сокращения, вызванные кальциевой перегрузкой (3,4), но не влияет на "коаеиновне" сокращения (1,2). Миокард крысы (Са2+ = 5 til). Частота электрической стимуляции - 2 Бд.

4. Мембранные эффекты анестетиков

Лля выяснения природа выявленных различий в эффектах анестетиков исследовано влияние дантролена и ЗИ"525А на ионные токи трабекул предсердия лягушки. В исследованных концентрациях (5080 мкП) дантролен достоверно не изменял величину натриевых и кальциевых токов;зк?525А (50 мкЫ), угнетал на 13,0+6,1$ максимальную амплитуду натрпс-ного тока, не оказывая влияния на кальциевый ток. Ллдокапн (2-1С~'--10~^г/к1), как было показано ранее, не изш-•ллл величины тока, но блокировал натриевый ток депо-

лярлооваяЕ»: = :":: г.р-здсердия лягушки! на 5СЙ, Чихарев и др.,

v

1

1981).

5. Гипотеза спонтанного"Са рилиза", альтернативная гипотезе Са-индуцированного Са2+ рилиза

Таким образом, избирательность действия анестетиков на два типа спонтанных сокращений нельзя объяснить с точки зрения их мембранного действия на натриевые и кальциевые каналы и дает основание предположить наличие у анестетиков дополнительного внутриклеточного действия.

Обнаруженные различия, хорошо коррелируют с ранее упомянутым избирательным действием этих соединений на высвобождение Са^+ из терминальных цистерн (дантролен) и спонтанный "рилкз" Са2+ из продольных тубул (лвдокаин, SKP 525-А). Суммируя все имеющиеся данные можно предположить, -„что в основе спонтанных сокращений лежит "спонтанный Са^+ рилиз" из переполненных продольных тубул - основного аппарата секвестраций Ca

К ПРИРОДЕ ПОТЕЩШШР СОКРАТИМОСТИ ПОКОЕМ, ОТРИЦАТЕЛЬНОЙ

ЛЕСТНИЦЫ СИЛЫ И ТОЛЕРАНТНОСТИ СЕРДЕЧНОЙ ШИЦЦ К КАРДКОТО-

НИКАМ В У(Ш0Е1Ж;тВДЕВ0Й ПЕРЕГРУЗКИ

I. Потенциацйй сократимости покоем мышцы

Амплитуда первого сокращения после электрического молчания сердечной мышцы зависит от содержания Са^+ в терминальных цистернах CP и считается относительной мерой внутриклеточного Са^+. В период покоя мышцы, Са2+ покидает ретикулум и первое сокращение после покоя имеет низкую амплитуду и замедленную активацию (так называемый медленный ответ мышцы ( Wood и др., 1975; Allen и др., 1976; Beresewlez и Reuter , 1977; Reiter И др., 1984; Кома! и Ruöy , 1982)). В миокарде большинства теплокровных оцустовение CP а связанный с ним медленный ответ мышцы развивается через 1-5 мин Покоя. В миокарде* перегруженным Ca, медленный ответ нельзя зарегистрировать даже после длительною покоя ткани (более I часа). Более того, после коротких периодов покоя (десятки сек.) амплитуда первого соггращения возрастает (на 2.0%) относительно предшествующего стационарного уровня - феномен потенциацйй покоем. Типичный пример потенциации сократимости миокарда крысы, перфорируемого раствором с высоким содержанием Са^+ С 5 i:li), после 30 сек покоя показан на рис. 4.

Рис. 4. Потенциация сократимости папиллярной мышцы крысы покоем (I) и устранение потенциации рианрдшом U-IQ-'M) и кальциевым агонистом сср 28392 (5«I0-°k). (2) Стрелки показывают первое сокращение после 30 сек покоя. Частота стимуляции препарата - I Гц. Са^+ =! 5 кМ.

Из представленных на рис. 4,1 данных следует, что в миокарде, перегруженным Са^+, нарушен механизм опустошения СР в период покоя. В таком случае представляло интерес воздействовать на этот процесс агентами, модифицирующими функцию СР. С этой целью были использованы рианодин, считающийся блокатороы кальциевых каналов терминальных цистерн ( Sutko и др., 1980; 1985) и кофеин - классический ицщгктор высвобождения Ca (Endo , 1977) и местные анестетики.

2. Различие эффектов рианодина и кофеина

Результаты исследования оказались в полном противоречии с ожидаемыми: рианодин (10~^-10"^Ы) ускорял спад сократимости после коротких периодов покоя (менее I мин) (рис. 4,3), кофеин вызывал заметное угнетение сократимости лишь после длительных интервалов покоя (10 мин, рис. 5, кривая 2). Пример влияния рианодина на амплитуду первого сокращения показан на рис. 4,3. Видно, что через 30 сек покоя амплитуда первого сокращения падает более чем на 80^ (стрелка показывает падение), по сравнению со стационарным уровнем сокращения. Угнетение сократимости не сопровождалось изменением тонуса сердечной мышцы в покое. Кофеин, напротив, вызывал повышение тонической компоненты сокращения в покое и более выраженное на фоне ритмической стимуляции препарата.

Отсутствие изменений тонуса шшцы в покое и падение сократимости после коротких интервалов покоя дают основание для двух предположений: I. рианодин опустошает терминальные цистерны в короткие периода покоя мышцы; 2. рианодин увеличивает отток из СР в экстраклеточное пространство, минуя цитоплазму.

Ни од!тн из известных блокаторов кальциевых каналов СР - тет-ракакн, дантроден, лидохаин,skp 525-А, ТМБ-8 не оказывал замет-

заметного влияния на феномен потенциации сокращения покоем.

Нами исследован широкий класс химических соединений - гормоны катехоламины, кальциевые блокаторы и активаторы, с целью поиска агентов, способных ускорять обмен Са^+ в СР. Такое свойство обнаружил кальциевый агонист ССР 28392 (ССР), производное известного дигидропиридинового блокатора кальциевых каналов нифедипина ( Erne * др., 1984; Truoge и др., 1984). В отличие от рианодина, эффект ССР развивался медленно (в течение 2-3 часов) и в большей концентрации ( 5«Ю~%).

3. Рианодиноподобное действие кальциевого агониста ССР 28392 (ССР)

Суммарный инотропный эффект ССР в миокарде крысы (в максимально эффективной концентрации 5«КГ^Ю имел двухфазный вид: первичный быстрый рост амплитуды сокращения (30±5% ) и последующее падение (более чем на 80%) в течение 3 часов перфузии. Двухфазный эффект ССР был зарегистрирован при низкой ритмической активности препарата и не был связан с ухудшением его функционального состояния (рис. 6,а). Параллельная регистрация трансмембранных по-„ тенциалов выявила монофазное продление плато потенциала действия на 2056 в течение длительного воздействия агониста.

Положительный инотропный эффект агониста, связанный со сти-цгляцией трансыембранного входа Са^+ через потенциал-зависимые кальциевые каналы сердечных клеток, хорошо известен для соединений этого класса (BAY K8644;+S 202-791). В основе эффекта лежит увеличение времени открытого состояния одиночных кальциевых каналов сарколеммы (Незз и др., 1984;Brown и др., 1984; Reuter и др., 1984). Очевидно, что задержанное кардиодепрессив-ное действие ССР не согласуется с традиционным эффектом агониста на кальциевый ток. Более того, в фазу кардиодепрессии ССР обнаружил рианодиноподобное действие, которое по внешним признакам, противоположно его первичноцу мембранному действию. Так, подобно рианодину, ССР устранял феномен потенциации сокращения покоем (рис. 4,2). В присутствии рианодина и ССР отмечено восстановление нормальных ритмо-инотропных отношений, измененных в условиях кальциевой перегрузки миокарда. Эффекты рианодина и ССР отражены на рис. 5 и 6. Если в контроле, при увеличении частоты стимуляции (0,2-2 Гц) амплитуда сокращений уменьшалась (отрицательная лестница силы - рис. 5в, кривая I; рис. 6с, кривая I), то в присутствии рианодина и ССР амплитуда сокращений возрастала в ответ на повышение частоты стш^уляции (положительная лестница силы, рис.5в, 10

0.6

2 гч

Рис. 5. Различие эффектов рианодина и кофеуша на ритмо-инотроп-ные отношения в миокарде крысы. Са2+ = 5 мМ. а. Влияние на зависимость сократимости от интервалов покоя мышцы. Показана амплитуда первого сокращения в процентах относительно величины сокращения до покоя. После каждой паузы амплитуду сокращения восстанавливали до контрольной величины.

1 -^контроль;' 2 - кофеин' (10 мМ,- 30- мин); 3 -риаонодин, 10-°М, 20 мин. Представлены средние значения и дисперсия среднего по- результатам 9--ти опытов.

в. Зависимость частота-сила. I- контроль; 2 - кофеин

2 мМ, 10 мин;- 3 - рианодин (Ю""° Ы,- 1о мин). По оси ор-данат - амплитуда сокращения в % относительно максимальной величины на частоте 0,2 Гц. По оси абсЦйсб - частота стимуляции; масштаб- логарифглгаеский,-

1 / \ э- г.\

1001---- ------- - т

<й>| \ 60"

• \ \

го1. 01-о— го

10 30 90 159

Рис. 6. Рианодиноподобное действие кальциевого агониста ССР28392 в миокарде крысы; Са2+ = 5 мМ. <•

а. Двухфазный инотропный эффект ССР (4*10 М, 150 мин). Частота стт.уляции - 0,2 Гц.

в. Ускорение спада сократимости после покоя мышцы. Эффект зарегистрирован после 3-х часов перфузии агониста. с. Зависимость частота-сила; I - контроль, отрицательная лестница сила; 2 - после 3-х часов воздействия ССР28392, положительная лестница.

кривая 3; рис. 6с, кривая 2). Кофеин не изменял отрицательные рит-моинотропные отношения (рис. 5в, кривая 2).

4. Повышение чувствительности к кардиотоникам

Действие рианодина и ССР 28392 на миокард перегруженный Са^+ восстанавливало его чувствительность к стимуляторам сократимости - сердечным гликозвдам, кофеину, катехоламинам. Известно, что в условиях кальциевой перегрузки сттуляционный эффект кардиотони-ков - оуабаина, кофеина сменяется кардиодепрессивным, падет эффективность катехоламинов. Эти эффекты зарегитрированы как в волокнах рабочего миокарда, так и волокнах Пуркинье ( Lanier, 1978; riaaderson и др., 1974; Vassalle! и др., 1980; Вгеппап' и др., 1979). Примерды толерантности к кардиотоникам могут служить отрицательные инотропные эффекты кофеина (I чМ кофеина снижает амплитуду сокращения 30±3,5%), I мкЫ оуабаина (8,0±2,4$)и слабый положительный инотропный эффект 5• 10"^М адреналина 10,0+1,6а'в миокарде крысы, перфузируемым повышенной концентрацией Са^+ (рис. 7,а). Те же агенты оказывали выраженный стюуляционный эффект (в пределах 200-250%) после воздействия кальциевого агониста (рис. 7,с). Аналогичное повышение чувствительности миокарда к кардиотоникам отмечено в присутствии рианодина ( Sutko и v/illei-aon ,

1986; Saxon , 1986).

10 ' 30 60 ' ' 90 10 30 120 180 10 30 SO 80 100

Рис. 7. Кальциевый агонист ССР 28392 повышает чувствительность миокарда крысы к кардиотоникам^ Показаны эффекты I мМ кофеина, 10-Ь оуабаина и 5-10~'И адреналина на сократимость миокарда крысы до (а) и после (с) 3-х часовой перфузии агониста. Частота стимуляции - 0,2 Гц.

5. К природе внутриклеточного действия рианодина и ССР 28392 на CP

После работы Sutко и Willerson (1980) утвердилось мнение о рианодине. Использовав высокую концентрацию рианодина (300 мкМ), авторы показали его способность увеличивать аккумуляцию Са2+ в тяжелой фракции СР. Результаты данного исследования позволяют считать, что в низких концентрациях (10~^-10~®М) рианодин является эффективным индуктором высвобождения Са2+ из CP (Саксон и Кобршский, 1985; Кобринский и Саксон, 1985).

Наш постулат, основанный на непрямых тестах, нашел надежное подтверждение в последних биохимических исследованиях, выявивших способность рианодина в низких концентрациях стимулировать высвобождение Са2+ из терминальных цистерн ретикулума сердечных мышц ( Meissner , 1986; Lattanzio и др., 1987). В этом качестве рианодин более эффективен, чем кофеин, освобождающий Са2+ из CP в ш^ромолярных концентрациях ( Nagasaki и Kasai, 1983).

На рис. 8 кальциевые каналы терминальных цистерн представлены как общая мишень внутриклеточного эффекта обоих соединений. Однако, различие в инотропии рианодина и кофеина, выявленные на целой мышце (рис. 5), позволяют предположить наличие у рианодина — дополнительного действия на СР» Согласно гипотезе Хильгемана ( Hilgenarm, 1982; 1983; 1986), рианодин увеличивает диастоличес-кий отток Са2+ из CP через контактные кальциевые каналы, локализованные в участках сопряжения мембран ретикулума и сарколеммы. Кофеин таким действием не обладает. Представление о стимулирующем эффекте рианодина на два типа кальциевых каналов саркоплазыати-ческого ретикулума, схематизированное на рис. 8, позволяет объяснить весь комплекс инотропных эффектов рианодина, зарегистрированных в интактных и перегруженных Са2* сердечных клетках: угнетение спонтанных сокращений, механического щума, осцшшггорного трансмембранного тока сократимости ( Sut ко и др., 1983; 1986; Eisner и Др.. 1985; 1986; Wier и др., 1984; 1985; Lakatta и др., 1983; 1984; 1985; Богданов и др., 1985), восстановление инотропных реакций кардиотоников ( Saxon , 1986).

Феноменологическое сходство инотропных эффектов рианодина и ССР предполагает наличие общего звена в механизме внутриклеточного действия обоих соединений. Таким звеном могут быть гипотетические, контактные кальциевые каналы, обеспечивающие разгрузку CP в покое (рис. 8). В рамках схемы, представленной на рис. 8 такие эффекты ССР, как устранение потенциации покоем и восстановление положительной инотропной реакции кардиотоников, трактуются как

следствие разгрузки терминальных цистерн.

С этой точки зрения двухфазный инотропный эффект ССР 28392 в миокарде крысы следует рассматривать как наложение противоположных и отставленных во времени процессов: первичной стимуляции трансмембранного входа Са^+ и медленно-развивающейся стимуляции диастолического выхода Са^+ и разгрузки СР в покое. Природа медленного развития внутриклеточного действия кальциевого агониста требует дальнейшего изучения.

Рис.8 схематизирует наш представления о механизме внутриклеточного действия рианодина и дагидропиридинового кальциевого агониста ССР 28392 в миокарде крысы. Согласно последним биохимическим данным, в контактном ретикулумс сердечной мышцы выявлены высокоаффинные участки связывания дигидропиридиновых соединений (Brandt et al., 1986 ) . что может служить одним из подтверждений предложенного механизма внутриклеточного действия ССР 28392.

CGP2S392

КОНТАКТНЫЕ КАИ ТшР^ШШ^^^К/,. ШьцИЕЬий

РИАНОДИН

Рис.8. Схематическое представление внутриклеточного действия рианодина и кальциевого агониста ССР 28392 в миокар-диальных клетках сердца крысы.

1. Кальциевые каналы терминальных цистерн - общая мишень действия рианодина, кофеина (стимуляторы), рутениевого красного, дантролена, тетракаина (блокаторы). Активация каналов запускается деполяризацией клетки.

2. Контактные кальциевые каналы - общая мишень внутриклеточного действия рианодина и дигидропиридинового кальциевого агониста ССР 28392. Каналы обеспечивают диастолический выход Са^+ из ретикулума в экстраклеточное пространство в покое.

вывода

1. Механические колебания вызванные кальциевой перегрузкой миокарда связаны с выходом кальция из продольного ретикулума.

2. Механизм выхода кальция, по-видимому, имеет спонтанную природу, вследствие повышения проницаемости мембран продольных тубул, перегруженных кальцием.,

3. Рианодин является высокоэффективным индуктором высвобождения кальция из саркоплазматического ретикулума (CP). Предполагается наличие двух мишеней внутриклеточного действия риа-нодина: I) кальциевые каналы терминальных цистерн, активируемые при деполяризации, 2) контактные кальциевые каналы, обеспечивающие отток кальция из CP в покое.

4. Дигидропиридиновый кальциевый активатор ССР 28392 помимо традиционного мембранного действия (стимуляция кальциевых каналов сарколеммы) обладает внутриклеточным рианодиноподобным действием на СР.

5. Опустошай ретикулум рианодин и дигидропиридиновый кальциевый активатор восстанавливают чувствительность миокарда к инотропным агентам.

6. Предложена тест-система для выявления внутриклеточного действия кардооактквннх соединений и для детализации этого действия на определенные отделы ретикулума. Тест-система основана на анализе: I) фармакологических свойств двух типов механических колебаний; 2) зависимости спада сократимости мышцы от периода покоя.

Список .работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Саксон М.Е., Кобринский Е.Ы. К природе инотропных эффектов рнанодина и кофеина в миокарде крысы. 5 Всесоюзная контерен-ция по биохимии мышц. Тбилиси, 1985, Тезисы докладов, с. 87-88.

2. Кобринский Е.М., Саксон М.Е. Фармакологические свойства спонтанных механических осцилляции в сердце крысы при кальциевой перегрузке. 5 Всесоюзная конференция по биохимии мышц. Тбилиси, 1985, Тезисы докладов, с. 147.

3. Саксон ¡.I.E., Кобринский E.I.I. Механизм аномальной механической активности миокарда крысы и ее коррекция кальциевым аго-нистом. 5 Всесоюзная конференция по биохимии мышц. Тбилиси, 1985, Дезисы докладов, с. 167-168.

4. Саксон 1Л.Е., Кобринский E.L'l. Сравнительная роль внешних

и внутренних источников кальция в обеспечении сердечных сокращений в эволюционном ряду. Сб.: Достижения сравнительной электрокардиологии. Сыктывкар, 1985, с. 13-14.

5. Saxon 1.1.Е., Kobrinski Е.Ы. Two types of spontaneous contractions in rat myocardium and their possible relation different sites for Сз-release. Eur. J, Pharmacology, 1986, v. 131, pp. 135-139.

6. Kobrinsky E.H., Saxon Ы.Е. Biphasic inotropic effects of Ca channel activator CCP 28392 in rat myocardium: possible relation to intracellular Ca release. - British J. Pharmacology, 1987, v. 92, pp. 499-504.

о