Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ультраструктурных механизмов долговременной потенциации электротонической проводимости смешанных синапсов Маутнероских нейронов золотой рыбки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование ультраструктурных механизмов долговременной потенциации электротонической проводимости смешанных синапсов Маутнероских нейронов золотой рыбки"

На правах рукописи

МУХТАСИМОВА НУРИЯ ФУАТОВНА

Исследование ультраструктурных механизмов долговременной потенциа-ции электротонической проводимости смешанных синапсов Маутнеров-ских нейронов золотой рыбки

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1998

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона

Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии

наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Мошков Д.А кандидат биологических наук Павлик Л.Л.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук

Виноградова О.С. Косицын Н.С.

Ведущая организация: Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино

Защита состоится « 28 » января 1998 г. в 10. 00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, Московской области, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан « 28 » декабря 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совет

кандидат биологических Н! / /•' П.А. Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования: Долговременная потенциация (ДП), экспериг ментально вызванный памятный след в виде усиления эффективности функционирования синапсов вследствие повторяющихся стимуляций, тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды (Wickcns, 1988; Calvarley, Jor.es, 1990; Stevens, 1996 ). До последнего времени изучение ДП концентрировалось на химических синапсах, в которых передача сигнала опосредуется химическим веществом, медиатором (Bliss, Lomo, 1973; Брагин, Виноградова, 1973; Виноградова, 1975; Мошков, 1985; Pavlik, Moshkov,1992; Gold, Bear, 1994; Stevens, Wang, 1994; Malenka, 1994; Stella et al., 1997; Enger, Bonhoffer, 1997). Кроме химической синаптической передачи в нервной системе животных широко распространена чисто электрическая и смешанная синаптическая передача (Scott et al, 1994; Sur et al., 1994), Еюпочаютцая химические и электрические компоненты (Zottoli, Faber, 1979; Hall et al., 1985). Зависимость проводимости таких синапсов от предшествующей стимуляции и долговременное поддержание их в активированном состоянии до недавнего времени даже не предполагались. Недавно с помощью электрофизиологических методов было показано, что смешанные синапсы Маутнеровских нейронов золотой рыбхи в результате тетагш-ческой стимуляции или аппликации дофамина способны на значительный срок облегчать проведение электротонического сигнала (Yang, et al, 1990;. Yang, Faber, 1991, Pereda et al, 1992, 1994; Pereda, Faber, 1995; 1996). Электронная микроскопия как метод исследования является неотъемлемым звеном в изучении таких следовых явлений, как ДП и другие формы синаптической памяти, внесшим существенный вклад в понимание механизмов, лежащих в основе ДП химических синапсов (Pierce, Lewin, 1994; Мошков, 1985; Pavlik, Moshkov, 1992). Однако структурные механизмы, которые определяют усиление электротонической связи между смешанными синапсами и постсипаптическим нейроном, остаются совершенно неизученными. Неизвестны и элементы синапсов, вовлекаемые в повышение проводимости электротоняческого сигнала. Комплексные морфо-функциональные исследования механизмов ДП электротонической передачи являются необходимыми для понимания роли различных синоптических структур в регуляции эффективности функционирования смешанных синапсов.

Цель и основные задачи исследозания. Целью работы было изучение ультраструктурных признаков, указывающих на возможные механизмы долговременной потенциации электротонической передачи в идентифицированных смешанных синапсах Маутнеровских нейронов (МН) золотых рыбок, проявляющейся после тетанизации афферентных входов в форме увеличения амплитуды экстраклеточного спайка.

Были поставлены следующие задачи. 1) Изучить возможность использования переживающих фрагментов продолговатого мозга золотых рыб, содержащих МН, в качестве объекта для проведения электрофизиологических и электронно-микроскопических экспериментов, связанных с исследованиями ДП. 2) С помощью метода замораживания-скалывания и ультратонких срезов описать и количественно оценить основные контактные структурные элементы смешанных синапсов и их мембран, возможно, вовлекаемые в усиление электротонической передачи. 3) Провести сравнительный количественный анализ ультраструктуры контактов афферентных смешанных синапсов на ультратонких срезах после возникновения ДП электротонической передачи. 4) Исследовать роль актина в электротонической трансмембранной передаче сигналов: в синаптических контактах смешанных синапсов, воздействуя на них цитохалазином D, избирательно депо-лимеризующим актин и в искусственных плоских бислойных фосфолипидных мембранах после включения в них молекул филаментозного актина.

Научная новизна. Впервые разработана и применена для совместного элекгрофизиологического и морфологического исследования МН методика долговременно (до 5 часов ) переживающих фрагментов продолговатого мозга рыб in vitro. Показано, что в таких препаратах на протяжении всего времени эксперимента МН сохраняют вызванную электрическую активность и адекватное состояние ультраструктуры афферентных идентифицированных смешанных синапсов, вовлекаемых в процесс ДП. Впервые продемонстрирована возможность индукции in vitro долговременной потенциации электротонических ответов МН после тетанизацян их главного афферентного источника - задних корешков 8-го нерва, окончания которых идентифицируются как булавовидные синапсы смешанного типа, так называемые club endings (Nakajima, 1974). Ультраструктурными исследованиями установлены количественные признаки потенциирован-' ных смешанных синапсов. Показано, что главным отличием синапсов с возросшей в разной степени электротонической проводимостью от контрольных является коррелятивное пропорциональное увеличение в синаптических контактах размеров десмосомоподобных структур, которые, как было установлено ранее, состоят преимущественно из актина. В то же время оказалось, что структура щелевых контактов, которые являются по установившемуся мнению субстратом электротонической связи между клетками, не меняется ни при переживании, ни после потенциации. В ходе экспериментов установлено, что предварительная аппликация цитохалазина D на МН в область расположения смешанных синапсов препятствует развитию в них после тетанизации афферентного входа долговременной потенциации электротонических ответов. В других экспериментах, проведенных на плоских бислойных фосфолипидных мембранах, показано, что включение в них филаментозного актина примерно на три порядка увеличивает проводимость мембраны. Установлено, что изменение электропроводности бислойных мембран обусловлено появлением в них одиночных постоянно открытых

ионных каналов проводимостью около 1000 р8. Получены абсолютно новые данные о возможности участия десмосомоподобных структур в потенциирова-нии электротонической связи между нейронами, благодаря механизму прямого шунтирования синаптических контактов молекулами филаментозного актина.

Научно- практическая ценность работы.

Проведенное исследование имеет в основном теоретическое значение. Установленные в ходе работы изменения в специализированных контактах смешанных синапсов, имеющие место после развития ДП, а так же роль актина в увеличении электротонической передачи, дают возможность расширить наши представления об адаптивных процессах на уровне одного нейрона.

Данные результаты имеют определенную практическую значимость при разработке подходов к управлению адаптивными процессами через воздействие на состояние актина фармакологическими и физиологически-активными веществами, упорядочивают выбор таких веществ по их реакции с актином, изменению его конформационного и агрегатного состояния. Наши данные дают возможность предположить существование подобных корреляций между состоянием актинсодержащих структур в межклеточных контактах и электротонической связью между клетками в других электровозбудимых и электроневозбудимых тканях, где такие десмосомоподобные структуры описаны. Это предположение может послужить толчком в морфофункциональных исследованиях в оригинальном направлении при изучении не-нейрональных структур и межклеточных взаимодействий.

Результаты работы используются при чтении курса лекций в Пущинском ГУ.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании кафедры экспериментальной и теоретической цитотех-нологии ПущГУ (Пущино, 1995 г), на научной конференции молодых ученных города Пущино (Пущино, 1996 год), Ш-ей международной конференции по функциональной нейроморфологии (С- Петербург, 1997 год), на аттестационном Ученом совете ИТЭБ РАН и на общеинститутской (ИТЭБ РАН) научной конференции в 1997 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, заключения и выводов. Материал изложен на_ страницах, список цитируемой литературы включает _наименований отечественной и зарубежной литературы. Использованные сокращения:

АЗ - активные зоны, БЛМ - бислойная липидная мембрана, ДП - долговременная потенциация, ДПК - десмосомоподобные контакты, МН - маутнеровский нейрон, ЩК - щелевые контакты.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты и методы исследования В качестве объектов исследования были использованы золотые рыбки Carassius auratus, мальки (3 мес , 3 см длиной) и молодые зрелые особи (12 мес, 10 см длиной), всего более двухсот рыб. Содержащие Маутнеровские нейроны (МН) фронтально изолированные срезы продолговатого мозга толщиной 1-2 мм инкубировали при температуре 15"С. Блоки продолговатого мозга готовили при помощи вибротома и помещали в камеру, содержащую модифицированную среду Рингера следующего состава (в мМ): NaCl, 76; KCl, 0,4; CaCl2, 4,0; ИаНСОз, 12,5; MgS04, 2,6; КН2Р04.-1.2; глюкоза, 2,0, среду титровали 10 мМ Трис-НС1 до рН-7,5. Инкубационная проточная камера погружного типа постоянно насыщалась смесью кислорода и углекислого газа (95% и 5% соответственно). Функциональное состояние фрагментов мозга на первых этапах работы оценивали по спонтанной активности кецдентифицировашшх клетох, а в последующем - по регистрации внеклеточных вызванных ответов МН. В электрофизиологических экспериментах, которые выполнялись совместно с П.И. Пахотшшм ( ИБК РАН) in vitro в условиях, описанных выше, экстраклеточные электрические ответы МН записывали непрерывно в процессе инкубации срезов до 5 ч по стандартной методике, описанной ранее для исследования МН рыб in vivo (Furshpan, Furukawa, 1963; Yang et al., 1990). Стимулирующие биполярные вольфрамовые электроды с сопротивлением кончика 0,1 МОм, устанавливали на задние корешки 8-го нерва и раздражали прямоугольными импульсами тока (50-500 мкА, 0,2 мс). Ответ МН регистрировали экстраклеточно вольфрамовым микроэлектродом (1-3 МОм), подведенным вертикально с дорзальной поверхности мозга на расстояние 10-20 мкм от сомы МН. Тетанизацию корешков 8-го нераа провощит током частотой 200-400 имп/с 3 раза по 1с с интервалом 30 с. Для индукции долговременной по-тенциации применяли тетанизацию корешков 8 нерва током двух уровней интенсивности: пороговой и надпороговой. С помощью специальной программы получали суперпозицию 5 ответов МН и усредненные значения амплитуд и латентных периодов. Электронномикроскопические исследования МН проводили после электрофизиологической регистрации их активности. Через 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ч после инкубации срезы переносили в фиксирующий раствор. При оценке ультраструктуры МН в качестве контроля использовали срезы фрагментов продолговатого мозга, фиксированных сразу после изоляции мозга и срезы фрагментов продолговатого мозга через 5-10 мин после их помещения в инкубационную камеру.

Для целей количественной электронной микроскопии использовали раздельно МН со средним (+30-50%) и высоким (100-200%) уровнями потенциации, сохраняющимися как минимум 2 часа, индуцируемыми пороговой и надпороговой те-танизацией соответственно.

Для электронномикроскопического анализа материал фиксировали в течении 16 часов по принятой в лаборатории методике в растворе фиксатора, содержащем формальдегид, диметилсульфоксид и глутаральдегид на 0,1 М какодилат-ном буфере, (рН 7.2), дофиксировали в 2%-ом растворе 0э04 на том же буфере в течение 2 часов, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заключали в Эпон-812 . Готовили срезы толщиной 10 мкм и после идентификации нужных участков, содержащих МН или их дендриты, срезы фотографировали в световом микроскопе Ыи-2Е, переклеивали на чистые эпо-новые блоки и получали ультратонкие срезы на ультратоме ЬКВ-З. После последовательного контрастирования водными растворами уранилацетата и цитрата свинца ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Те51а В8-500 и фотографировали при увеличении ЮОООх.

Для замораживания-скалывания использовали сверхвысоковакуумную установку (Болотов и др., 1985) и разрывное устройство для получения комплементарных реплик с замороженных сколов вибротомных срезов МН (Мавлютов и др. 1996). Скалывание производили в вакууме при температуре -125°С. После разлома поверхности напыляли платиной и углеродом при помощи электроннолучевых испарителей, реплики отмывали в смеси азотной и серной кислот с дву-хромовокислым калием и в дистиллированной воде и монтировали на электронно-микроскопические палладированные медные сеточки с величиной ячейки 50 мкм без пленки-подложки. Часть экспериментов проводили совместно с Ю.С. Тараховским (ИТЭБ РАН).

Для изучения действия цитохалазина Б, деполимеризущего актин, на способность смешанных синапсов потенциироваться, его в объеме 5 мкл при концентрации 4-5 мг/мл в физрастворе, содержащем диметилсульфоксид, вводили микрошприцом под оптическим контролем в область ромбовидной ямки , где расположены МН, по методике разработанной в лаборатории (Тирас, Мошков, 1978). .Контролями в этих экспериментах служили МН из фрагментов интактного продолговатого мозга, инкубированного одновременно с подопытными препаратами, а также МН, на которые апплицировали среду разведения.

Для морфометрического анализа структуры синапсов использовали метод, специально разработанный в нашей лаборатории для целей исследования пластичности синапсов МН (Коган и др. 1981). Все измерения проводили в "слепом" варианте с негативов на приборе «Микрофот» с общим увеличением 90000х. Измеряли протяженность сечения всего синаптического контакта (прилегания смешанного синапса к поверхности дендрита), длину индивидуальных профилей специализированных контактов - активных зон (АЗ), щелевых контактов (ЩК) и десмосомоподобных контактов (ДПК), число и суммарную длину их в пересчете на синапс. Морфометрические данные обрабатывали стандартными статистическими методами.

Для исследования влияния актина на проводимость плоских бислойных ли-пидных мембран (БЛМ) использовали метод измерения тока мембран в режиме фиксации потенциала. Работу проводили совместно с П.А. Григорьевым (ИБК РАН). Мембраны формировали по методу Мюллера (Mueller et. al., 1962) из фосфатидилхолнна из соевых бобов (Sigma). Для формирования мембран готовили раствор липидов в N-гептане (20 мг/мл). Электролитом служил 100 мМ раствор КС1 или 200 мМ NaCl, рН 6.5. Для регистрации тока мембраны применяли электрометрический усилитель (Kethley 301), выход катода был подключен к самописцу Eudin 622.01 (Grigoriev et. al., 1995). Электрофоретически гомогенный F-актин из мышцы кролика, выделенный по методу Spudich, Watt (1971), был любезно предоставлен д.б.н. З.А. Подлубной (ИТЭБ РАН). F-актин в концентрации 0,4-2,0 мг/мл на имидазол-HCl буфере, рН 7,0, добавляли в Цис-юовету.

Результаты и обсуждение.

1. Ультраструктура и электрическая активность МН в переживающем продолговатом мозге золотых рыбок.

Инкубация срезов мозга в солевой среде приводит к изменениям в тонкой структуре ткани, степень изменения зависит от сроков инкубации и регистрируется на светооптическом уровне уже через 0,5 часа. С увеличением сроков инкубации (1-1,5 час)

происходит постепенный переход ядра в неактивное состояние и нарастание деструктивных процессов в цитоплазме МН. В этот период МН не отвечают на раздражение и находятся в латентном состоянии, связанном с травмированием нейронов при изоляции мозга и приготовлении срезов. Эти изменения могут быть весьма значительными. Первоначально они казались нам необратимыми (Мошков и др., 1996). Однако как только МН выходят из латентного состояния и начинают реагировать на стимуляцию, что обычно происходило через 1,5-2 часа, картина преображается. Структура МН в эти сроки и вплоть до 5 ч инкубации срезов мозга приобретает близкие к интактной черты, что соответствует наблюдаемой высокой электрофизиологической активности МН в этот же период (рис. 1 А, а-в).

Анализ электрических ответов МН в процессе инкубации, начиная с момента выхода из латентного состояния и до конца исследования, показывает, что сигнал не исчезает, не ослабевает и не искажается, т.е. сохраняет свой вид на протяжении по крайней мере 3-х часов последующей инкубации. Его величина и форма соответствует экстраклеточным ответам МН, регистрируемым в экспериментах in vivo на живой рыбке (Furshpan, Furukawa, 1963; Eaton, Bombardieri, 1978; Eaton et al., 1988).

Электронномикроскопическое исследование МН во фрагментах продолговатого мозга в этот период инкубации выявляет адекватную сохранность всех типов афферентных синапсов МН. Существенно, что во все изученные сроки инкубации наблюдается полная визуальная сохранность специализированных синапти-

ческих контактов. Это отмечается не только на ультратонких срезах, но также на репликах со сколов вибротомных срезов МН, "получаемых методом заморажива-ния-скалываниия. Сравнение этих двух методов при изучении специализированных структур синаптических контактов, особенно щелевых контактов, показало, что более адекватным в силу своей абсолютной воспроизводимости и одновременно менее трудоемким и более информативным для исследования морфологических коррелятов ДП электротонических ответов МН является метод ультрагонких срезов, который мы и использовали в последующих исследованиях. Таким образом, результаты этой части работы показывают, что структура афферентного синаптического аппарата при инкубации повреждается в меньшей степени, чем структура ядра и цитоплазмы МН. Хорошо сохраняются специализированные контакты, особенно десмосомоподобные структуры и щелевые контакты - морфологический субстрат электротонической передачи. Это послужило основой для последующего адекватного изучения феноменов ДП в смешанных :инапсах МН в условиях in vitro последовательно электрофизиологическими и электронномикроскопическими методами.

2. Морфометрическое изучение влияния длительной инкубации на ультраструктуру специализированных синоптических контактов МН.

В инкубированных в течение 5 часов in vitro и неинкубированных интактных фрагментах продолговатого мозга золотой рыбки сравнивали протяженности профилей специализированных структур афферентных смешанных синапсов VIH.

Морфометрический анализ профилей прилеганий смешанных синапсов к денд-эитам выявил достоверные изменения в их размерах , а также в размерах спе-диализированных контактных структур (табл.1). Видно, что при инкубации лрофиль прилегания уменьшается почти на 25% по сравнению с контролем, вреднее значение профиля отдельного ЩК (их в среднем на синапс насчитывайся больше двух, см. табл.1) также снижается на 10%. Среднее значение профиля отдельного ДПК (таковых в синаптическом прилегании насчитывается боке трех, см. табл.1), уменьшается почти на 43% по сравнению с контрольем, а зеличина профиля сечения отдельной A3 ( их тоже в синапсе более двух) снижайся почти на 20%. Средняя суммарная длина всех ДПК в одном синаптическом трилегании также снижается почти на 44% по сравнению с контрольной величи-юй. В то же время достоверных отличий A3 не обнаружено. Тоследнсе служит важным аргументом в пользу адекватности использования таких переживающих препаратов МН в целом ряде нейробиологических морфо-}>ункциональных экспериментов, где задачей ставится коррелятивное изучение именения проводимости химического или электротонического типа в смешанных синапсах под воздействием различных экспериментальных условий, /меньшение протяженности ДПК происходило за счет снижения размеров их щдивидуальных профилей. В настоящее время известна актиновая природа этих

контактов (Moshkov et al., 1980; Geiger et al.,1985; Тирас и др.,1.990).

Таблица.1 Морфометрическне характеристики смешанных афферентных синапсов

маутнеровских нейронов интактных (контроль) и инкубированных (опыт) in vitro ..(»* _____

Синаптические контакты Активные зоны Десмосомоподоб ные контакты Щелевые контакты

контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт

Длина отдельного профиля, мкм, х 100 316 ± 18 nl =34 241 ± 18а П2 = 26 38 ± 1,5 п = 78 31 ± 0,9В п = 78 30 ± 0,9 п= 118 17 + 0,6а п = 93 32+1 п = 72 29 ± 0,9 п = 63

Суммарная длина всех профилей в синапсе, мкм, хЮО, (п1;п2) 95 ±10 84 ±7 104 + 9 58 ±4В 72 + 8 71 ±6

Число сечений в синапсе, х 10, (п1: пг) 25 ±2 29 ±1 35 + 3 36 ±2 21 ±2 24 ±2

п- число измерений, ар<0,001;6 р<0 ;в р<0

Известно, что актин вовлекается в реакцию клетки на любые воздействия как расходуемый материал, при этом спасая другие структуры от повреждений (Со1Щ>еоп е1 а1., 1993; Павлик и др., 1997). На этом основании мы предполагаем, что в наших опытах изоляция мозга и длительная инкубация фрагментов действительно вызывает стрессовую реакцию МН, сопряженную с известной потерей актина (Янюшина и др., 1990). Нужно иметь в виду, что такая потеря актина не сказывается на электрофизиологических параметрах ортодромного ответа МН, т.е. возможно не затрагивает перестройки мембран.

3. Исследование электрофизиологических ответов МН и качественной ультраструктуры синапсов после тетанизации афферентных входов.

Электрическая активность МН, вызванная при их ортодромной стимуляции, появлялась после выхода нейронов из латентного состояния после 1-2-х часов инкубации и сохранялась в течение всего последующего периода наблюдения (вплоть до 5 ч). Тетанизация корешков 8-го нерва индуцировала в МН длительную потенциацию (ДП) ответа, развивающуюся во времени и достигающую через 30-40 минут стабильного уровня 135-150% от контроля при пороговой тетанизации (рис.1 Б, а-в) и 190-200% при надпороговой тетанизации (рис.1 В, а-в). Она стабильно сохранялась в течение 2-3 часов. ДП характеризовалась увеличением амплитуды электрического ответа (спайка МН, имеющего очень короткую задержку после стимула). В отдельных случаях наблюдали укорочение латент-

ных периодов после тетанизации. Появление ДП свидетельствует о повышении эффективности передачи сигнала в смешанных синапсах (Yang et al., 1990). При электронномикроскопическом качественном исследовании тех же нейронов было установлено, что в смешанных синапсах легко идентифицировались специализированные контакты вплоть до 5 ч инкубации срезов мозга как до , так и после индукции потенциированного состояния.

Таким образом, результаты электрофизиологического и электронномикроско-пического исследования показывают, что МН могут сохранять жизнеспособность в переживающих ш vitro срезах мозга, могут проявлять долговременные пластические свойства.

4. Количественное изучение ультраструктуры афферентных смешанных синапсов МН после потенциации электротонической передачи.

Данные о структуре смешанных синапсов МН с высоким (200%) и низким (135% ) уровнями потенциации и их контрольных пар в нестимулированных препаратах представлены в Таблицах 2 и 3 соответственно. Видно значительное возрастание в 1,2 раза средних размеров синаптического прилегания в потенции-рованных препаратах по сравнению с контрольными. Величина ЩК и их число не затрагивались тетанизацией. В то же время длина индивидуальных ДПК в терминалях, потенциированных на 200% и 135%, была больше, чем в контрольных синапсах в 2 и 1,3 раза соответственно. Поскольку среднее количество индивидуальных ДПК в потенциированном и контрольном синапсах было одинаковым, независимо от типа стимуляции, суммарный размер всех ДПК в сечении потенциированного синаптического контакта с дендритом был также примерно в 2 раза и в 1,4 раза соответственно больше, чем средняя длина всех ДПК в контрольных синапсах и коррелировал с уровнем потенциации ответов МН. Напротив, совокупное значение длины активных зов (A3) в профиле синаптического прилегания потенциированных синапсов МН было приблизительно в два раза меньше, чем в их контрольных парах независимо от типа стимуляции, благодаря двухкратному уменьшению числа индивидуальных A3 в синапсе. Имея в виду, что среднее значение размера профиля прилегания для потенциированных синапсов увеличивалось по сравнению с контролем, пропорция профилей A3 в среднем на прилегание тетанизированных синапсов было приблизительно в 2.5 раза меньше чем контрольных бутонов.

Коррелятивный анализ изменчивости размеров ДПК и A3 в одних и тех же синапсах с очевидностью показывает, что абсолютное увеличение суммарных размеров ДПК в потенциированных синапсах не соответствует снижению суммарных размеров A3 и что эти изменения являются, вероятно, двумя независимыми процессами.

Таблица.2 Морфометрические характеристики смешанных афферентных синапсов маутнеровских нейронов инкубированных (контроль) и потенцнированных (опыт) на 200% in vitro________

Сннаптические контакты Активные зоны Десмосомоподоб ные контакты Щелевые контакты

контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт

Длина отдельного профиля, мкм, х 100 327 ± 19 щ=32 390 ± 16а П2 = 23 29 ± 0, 6 п= 101 28 ± 1,5 п = 35 18 ±0,6 п= 103 35 fi ± 1,8 п = 80 29± 1 п = 69 29 ± 1 п= 57

Суммарная длина всех профилей в синапсе, мкм, х100,(щ;п2) 90 ±5 46 ± 5а 60 ±3 119 ± 10б 68 + 5 72 ±6

Число сечений в синапсе, х 10, (Ш: п2) 32 ±2 16±2а 32+1 36 ±2 23 ±1 25 + 2

п- число измерений; Р<0.05; GP <0.001.

Таблица. 3 Морфометряяеские характеристики смешанных афферентных синапсов маутнеровских нейронов инкубированных (контроль) и потенцнированных (опыт) на 135% in vitro

Синаптические контакты Активные зоны Десмосомонодо бные контакты Щелевые контакты

контр. опыт контр. опыт контр. опыт контр. опыт,

Длина отдельного профиля, мкм, х 100 241 ± 18 щ =26 298 ± 26а П2=28 31 +0,9 п = 78 28+1,5 п = 93 17 + 0,6 п=93 23 + 0,5а п =103 29 ± 0,9 п = 63 29 ± 0,8 п = 65

Суммарная длина всех профилей в синапсе, мкм, х100,(п];п2) 84±7 38±5а 58 ±4 83±6Ь 71 ±6 67 + 6

Число сечений в синапсе, х 10, (п1: п2) 29 ± 1 13±1а 36 ±2 37 ±3 24 + 2 23 ±2

n - число измеренииР <0.001; " Р <0.01

5. Изучение возможной роли актина в трансмембранной передаче электрического сигнала.

а. Предобработка МН цитохалазином £>. Предварительная аппликация цито-халазина Б на МН в область расположения специализированных синапсов, вовлекаемых в процесс потенциации, и последующая инкубация фрагментов

Рис.1. Усредненные электрические ответы МН in vitro после различных экспериментальных воздействий. А: В процессе длительной инкубации в течение 1 часа (а), 3 часов (Ь) и 5 часов (с); В: до (а), сразу (Ь) и через 2 часа (с) после пороговой тетанизации, вызывающей потенциацию низкого (+35%) уровня; С: до (а), сразу (Ь) и через 2 часа (с) после надпороговой тетанизации, вызывающей потенциацию высокого (+100%) уровня; D: после аппликации цитохалазина D и последующей инкубации в течение 1 часа (а), сразу (Ь) и через 30 мин. (с) после надпороговой тетанизации. Пунктиром отмечена базовая линия.

Рис. 2 . Изменение токов через БЛМ при встраивании молекул F-актина (указано стрелкой).

продолговатого мозга in vitro не вносит заметных изменений в ортодромные ответы МН, вызываемые стимуляцией афферентных волокон, (рис 1Г, а). Вместе с тем, ни пороговая,

ни надпороговая тетанизация корешков 8-го нерва в препаратах, предварительно обработанных цитохалазином D, не приводила к потенциации. Более того, часто наблюдали ослабление ответа в начальный период после тетанизации (рис. 1Г, б,в), в результате которой электрическая активность МН возвращалась к исходному контрольному уровню.

б. Исследование взаимодействия мышечного F-актина с плоской БЛМ. Изучение электрических свойств искусственых плоских фосфолипидных мембран показало, что их начальное сопротивление составило около 10 9-10 10 Ом. Рабочая площадь мембраны была около 0,17 мм 2. Эти значения типичны для ли-пидных бислоев, не модифицированных белками или какими-либо иными включениями. Добавление раствора мышечного F-актина с Цис-стороны мембраны в первые минуты не нарушает равновесия. Однако спустя 5-10 мин можно было наблюдать резкое скачкообразное падение сопротивления интегральному току на 3 порядка, которое означает включение в мембрану актиновых нитей и образование поперечного шунта в ее строме. При этом, вероятно, формируются постоянно открытые ионные одиночные каналы, о чем свидетельствует регистрируемое последовательное ступенчатое увеличение трансмембранного тока. Встроенные молекулы F-актина остаются в бислое, приводя к росту тока утечки через мембрану до выхода его на плато через 10-15 мин (рис. 2). Дополнительное включение молекул F-актина в БЛМ делает ее весьма нестабильной, в результате чего она быстро рвется. Измерения показывают, что формируемые одиночные ионные каналы обладают проводимостью порядка 1000 pS. На репликах со сколов липосом со встроенными в их бислои молекулами F-актина можно было видеть крупные внутримембранные частицы, идентичные частицам ДПК смешанных синапсов.

Результаты этой части работы свидетельствуют в пользу того, что актин в синап-тических контактах смешанных синапсов (в форме ДПК, приращиваемых к уже имеющимся вследствие тетанизации ) может играть положительную роль в создании долговременно сохраняющейся облегченной трансмембранной проводи-

мости электротонического сигнала от синапса к МН. Тот факт, что даже в простой системе БЛМ-Р-актин наблюдается формирование одиночных ионных каналов, позволяет предположить, что механизмом повышенной электротонической проводимости синаптических контактов может быть их шунтирование нитями актина.

Заключение

Наща работа была посвящена морфофункционалыюму изучению нового для нейробиологии явления долговременной потенциации электротонической передачи смешанных синапсов, ранее считавшихся непластичными. Обнаруженное в экспериментах in situ на целостном животном (Yang et al., 1990), оно до сих пор изучается преимущественно электрофизиологическими методами с использованием внутриклеточных электродов (Yang, Faber, 1991; Pereda et al., 1992; 1994; 1995; Pereda, Faber 1996). Дальнейший прогресс в этих исследованиях связан с применением комбинации физиологических и электронномикроскопических методов для получения более полной информации о структуре и функции синапсов и механизмах регуляции их проводимости. Однако, такой комплексный подход был затруднен из-за инвазивной регистрации функции синапсов, повреждающей тонкую структуру нейронов. Более того, работа на целостном животном и последующее изучение ультраструктуры глубинно расположенных МН вообще плохо совместимы друг с другом. Для преодоления подобных препятствий в практику нейробиологнческих исследований уже давно вошли работы на переживающих срезах мозга ( Брагин, Виноградова,1973). Вместе с тем , эта прогрессивная методика не находила применения в изучении МН рыб и есть только несколько работ на изолированной ЦНС рыб, приближенных к условиям in situ (Legendre, Korn, 1995, Alford et al .,1995 ). Фактически, для гигантских (сома до 100 мкм) МН молодых и взрослых рыб, традиционно используемых в нейробиологических исследованиях, методика переживающих срезов не применялась. Мы впервые показали, что электрофизиологические и ультраструктурные характеристики МН золотой рыбки можно долговременно (до 5 ч) изучать в переживающих фрагментах продолговатого мозга. Более того, мы установили, что в таких препаратах воспроизводимо индуцируется и длительно (до 3-х ч) сохраняется ДП электро-тоническтх ответов МН, регистрируемая экстраклеточно, без нарушения структурной целостности клеток, что существенно для совместных ультраструктурных и электрофизиологических исследований одних и тех же нейронов. Это позволило нам определить ультраструктурные признаки долговременного повышения проводимости электротонического сигнала в смешанных синапсах МН. Оказалось, что ДП не связана с ЩК, а сопровождается увеличением размеров ДГОС, прямо пропорциональным степени потенциированности синапсов.

Установленная в настоящее время филаментная (F-) актиновая природа ДПК (Moshkov et al., 1980; Geiger et al., 1985, Тирас и др., 1990) и изменчивость по-

следних при потенциации позволяет предположить вовлечение этого цитоске-летного белка в механизмы ДП электротонической передачи. Наши эксперименты с цитохалазином D прямо свидетельствуют о причастности F-актина к созданию и поддержанию ДП в смешанных синапсах МН. Молекулы F-актина в этом типе контакта примыкают к мембранам, но пронизывают ли они их, не было известно. Данные о появлении на сколах липосом с включенным в них F-актином внутримембранных частиц такого же размера, как и на сколах мембран ДПК, позволяют сделать такое предположение . Увеличение размеров ДПК после тета-низации, предположительно, связано с увеличением содержания F-актина в них за счет сдвига ионного равновесия при стимуляции. Таким образом, смешанные синапсы по морфологическим признакам и по способности длительно сохранять ДП электротонической передачи можно .рассматривать как синапсы с регулируемой проводимостью, так же как и шипиковые синапсы химического типа (Вызов, 1994). Каким образом актин участвует в увеличении электротонической проводимости между синапсами и МН? Одним из механизмов может быть прямое шунтирование синаптического контакта актиновыми нитями, которые, как показано, способны проводить электрический сигнал непосредственно с одного своего конца на другой (Lin, Cantiello, 1993), по видимому, благодаря потоку ионов по поверхности актиновой нити (Lange, Brandt, 1996; Tang, Janmey, 1996). Мы показали, что такое проведение электротонического сигнала с одного конца молекулы F-актина на другой может осуществляться, когда молекула F-актина пронизывает билипидную мембрану. Одновременно, полиэлектролитная природа актиновых нитей может облегчить их организацию в пучки (Tang, Janmey, 1996), таким образом создавая основу для формирования ДПК и для увеличения их шунтирующей функции.. Другим, косвенным механизмом может быть вовлечение актина в контроль за упаковкой коннексонов в ЩК и проводимостью ионных каналов на их основе. Как известно, эти два типа контакта находятся в непосредственной близости друг от друга, и актин можно обнаружить в самом ЩК (Павлик и др., 1997, Murray et al., 1997). Так или иначе, актин и ДПК, который он формирует, можно рассматривать как структурный инструмент, меняющий проводимость синапсов смешанного типа. Наши структурные данные показывают, что наиболее вероятным является первый из этих механизмов.

Выводы

1 .Параллельными электронномикроскопическими и электрофизиологическими исследованиями впервые показана возможность изучения Маутнеровских нейронов рыб во фрагментах продолговатого мозга в условиях продолжительного переживания in vitro.

2.Электрофизиологическими исследованиями продемонстрирована возможность индукции и длительного сохранения в таких препаратах долговременной

потенциации электрических ответов Маутиеровских нейронов при тетанизации афферентных входов, иннервирующих нейроны через синапсы смешанного типа.

3.Количественный анализ структуры потенциированных смешанных синапсов Маутиеровских нейронов позволил установить специфические признаки, которые определяют усиление электротонической синаптической связи. Показано, что главным отличием синапсов с возросшей электротонической проводимостью является увеличение размеров десмосомоподобных структур, включающих, как известно, в свой состав филаментозный актин. Таким образом, по-видимому, кроме щелевых контактов в долговременных пластических изменениях электротонической проводимости принимают участие десмосомоподобные структуры.

4.Предобработка Маутиеровских нейронов цитохалазином Б, деполимери-зующим актин, препятствовала индукции в них потенциированого состояния и даже приводила к угнетению электротонической передачи. Встраивание в би-липидн>тр плоскую мембрану молекул филаментозного актина приводило к падению ее сопротивления интегральному току на три порядка и создавало в ней постоянно открытые ионные каналы проводимостью около 1000 рБ. На репликах со сколов липидных мембран со встроенным Р-актином эти ионные каналы выглядели как крупные внутримембранные частицы.

5. Предположено, что десмосомоподобные контакты являются структурным субстратом электротонической связи между клетками. В качестве механизма регуляции такой проводимости выступает нейрональный актин, способный при определенных условиях пронизывать синаптические контакты и шунтировать их, делая более проницаемыми для электротонического трансмембранного сигнала.

Список работ опубликованных по данной теме 1. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Павлик Л.Л, Мухтасимова Н.Ф. Ультраструктура Маут-неровских нейронов в переживающем продолговатом мозге золотых рыбок. Морфология, 1996, т. 110, N4, с 56-59.

2.. Мухтасимова Н.Ф., Павлик JI.JI. Морфофункциональное исследование Маутне-ровских нейронов золотых рыбок in vitro. Тезисы научной конф. молодых ученных. Пущино. 1996 , с 59.

3. Мошков Д.А., Мавлютов Т.А., Савельева Л.Н., Болотов Б.Д., Шодина И.Б., Мухтасимова Н.Ф., Хохлов А.А. Разработка метода и аппаратуры для комплексных морфофункциональных исследований идентифицированных нейронов. Сб. трудов городской научной конф. молодых ученых. Пущино, ПНЦ 1996 , с.425-427.

4. Moshkov А.А., Tiras N.R,. Pavlik- L.L., Mukhtasimova N.F. Ultrastructure of Mauthner cell in the surviving goldfish mesencephalon. Neuroscience and Behavioral Physiology. 1997, vol.27, N5, p 56-59.

5.. Павлик Л.Л., Тирас H.P., Пахотин П.И., Мухтасимова Н.Ф., Мошков Д.А. Индукция и длительное сохранение долговременной потенциации электротонических ответов Маутнеровских нейронов золотой рыбки во фрагментах продолговатого мозга, инкубируемых in vitro. Цитология,1997, т.39, №7, с. 541-545.

6. Мошков Д.А., Мавлютов Т.А., Савельева Л.Н., Бологов Б.Д., Мухтасимова Н.Ф., Хохлов А.А. Исследование Маутнеровских нейронов золотых рыбок методом замораживания-скалывания. Разработка методики. Цитология, 1997, т. 39, №4/5, с. 267272.

7. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Павлик Л.Л., Мухтасимова Н.Ф. Пахотина И.Д. Долговременная потенциация электрических ответов МН в инкубированных фрагментах продолговатого мозга золотых рыб сопровождается ультраструктурными изменениями эфферентных смешанных синапсов. Морфология, 1998, т. 112, №1, с. 00.

8.. Мошков Д.А., Мухтасимова Н.Ф., Павлик Л.Л., Пахотин П..И., Тирас Н.Р. Ультраструктурные исследования механизмов долговременной посттетаниче-ской потенциации электрических ответов МН золотой рыбки, инкубированной in vitro. Тез. доклада 3-ей междун. конф. по функциональной нейроморфологии. " С-Петербург, 1997, с.60

9.. Мошков Д.А., Мухтасимова Н.Ф.,.Павлик Л.Л.,. Тирас Н.Р. Длительная инкубация in vitro фрагментов продолговатого мозга золотой рыбки с Маутнеровскими нейронами сопряжена с изменением размеров специализированных контактов в афферентных смешанных синапсах. Цитология, 1998, т. 40, №1, с 00. 10.. Moshkov D.A.,. Mukhtasimova N.F., Pavlik L.L.,. Tiras N.R and I.D. Pakhotina. In vitro long-term potentiation of electrotonic responses of goldfish Mauthner cells is accompanied by ultrastructural changes at afferent mixed synapses. Neuroscience. 1998 (принята в печать).