Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктурные признаки измененного функционального состояния синаптической передачи

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктурные признаки измененного функционального состояния синаптической передачи"

На правах рукописи

Павлик Любовь Леоновна

Ультраструктурные признаки измененного функционального состояния синаптической передачи

03.00.02. Биофизика 03.00.13. Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино 2004

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Д.А. Мошков

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, доктор

биологических наук, профессор Н.С. Косицын

доктор биологических наук, профессор В.Г. Скребицкий

доктор биологических наук В.И. Попов

Ведущая организация: Институт Цитологии РАН, г.Санкт-Петербург

Защита состоится Л9» 2004г. в А^ часов на заседании

Диссертационного Совета Д 002 093 01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН. Автореферат разослан 19 апреля 2004г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат физико-математических наук

Н.Ф.Панина

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Синаптическая пластичность относится к процессам, с помощью которых нейроны меняют свою структуру и функцию в ответ на целый ряд событий (Котляр, 1990). Эта фундаментальная характеристика нейронов может быть главным механизмом, с помощью которого животные обучаются и адаптируются к окружающим условиям существования (Deller, Froetsher, 1997). События, которые приводят к изменениям в ЦНС, могут быть вызваны экспериментально или измененными естественными условиями окружения, формируя одинаковый каскад морфофункциональных изменений в ответ на раздражающий стимул через набор универсальных механизмов в синапсах. Поэтому для расшифровки механизмов памяти используют целый ряд экспериментальных моделей, существенно упрощающих задачу. С момента открытия явления длительной потенциации (ДП) (Bliss.Lomo, 1973; Брагин, Виноградова, 1973) эта модель становится наиболее популярной для изучения физиологических механизмов, связанных с изменением поведения, наблюдаемым в процессе обучения. Она, как полагают, тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды (Wickens, 1988; Calverley, Jones, 1990; Stevens, 1996). До последнего времени изучение ДП концентрировалось на синапсах, в которых передача сигнала опосредуется химическим веществом, медиатором (Bliss, Lomo, 1973; Брагин, Виноградова, 1973; Виноградова, 1975; Мошков, 1985; Pavlik, Moshkov, 1992; Gold, Bear, 1994; Stevens, Wang, 1994; Malenka, 1994; Stella et al., 1997; Enger, Bonhoffer, 1997). Кроме химической передачи в нервной системе животных широко распространены чисто электрический и смешанный типы синаптической передачи (Bennett, 2000). Последний тип передачи включает химический и электрический компоненты (Zottoli, 2000). Зависимость проводимости таких синапсов от предшествующей стимуляции и долговременное поддержание их в активированном состоянии до недавнего времени даже не предполагались. Однако относительно недавно с помощью электрофизиологических методов было показано, что смешанные синапсы Маутнерозских нейронов золотой рыбки в результате тетанической стимуляции или аппликации дофамина также способны облегчать проведение электротонического сигнала на значительный срок (Yang et al., 1990; Yang, Faber, 1992; Pereda et al., 1992,1994; Pereda, Faber, 1995,1996).

Электронная микроскопия как метод исследования является неотъемлемым звеном в изучении ДП и других экспериментальных форм синаптической памяти. Она внесла существенный вклад в понимание механизмов, лежащих в основе ДП химических синапсов (Yuste, Bonhoffer, 2001 ; Fiala et a!., 2002; Capani et al., 2002; Matus, 2003). Однако, структурные механизмы, которые определяют усиление электротонической связи между смешанными синапсами и постсинаптическим нейроном, остаются совершенно неизученными. Неизвестны и элементы синапсов, вовлекаемые в повышение проводимости электротонического сигнала. Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции эффективности функционирования смешанных синапсов необходимы комплексные морфофункциональные исследования механизмов ДП.

Одним из возможных подходов к исследованию структурных проявлений пластичности нейронов на клеточном уровне является проведение экспериментов на относительно просто организованных нейрональных системах с известной функцией и хорошо изученной морфологией. Таким критериям отвечают идентифицированные нейроны беспозвоночных и позвоночных животных.

Преимуществом для проведения исследований на идентифицированных нейронах является наибольшая адекватность применения электронно-микроскопических методов (Мошков, 1985). В случае с ДП электротонической передачи, впервые открытой именно на простой нейрональной системе, логика подсказывала начать морфологические исследования на этом же объекте. Представленные в данной работе результаты полцчены при изучении

ультраструктуры двух относительно простых нейрональных систем: Маутнеровских нейронов низших позвоночных и нейронов гиппокампа млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в комплексном исследовании ультраструктурных механизмов, лежащих в основе долговременных модификаций функции нейронов в мозге низших и высших позвоночных, которые могут служить основой пластичности мозга. Центральными были вопросы, какие из структурных звеньев синапсов обусловливают специфические изменения эффективности синаптической передачи и каковы способы управления ими. Особое внимание уделяли участию актинового цитоскелета в этих процессах.

Были поставлены задачи:

1) изучить в условиях in vivo вовлечение актина в пластические перестройки Маутнеровских нейронов (МН) золотых рыбок при изменениях их функции.

2) разработать методику исследования механизмов пластичности смешанных синапсов МН на фрагментах продолговатого мозга золотых рыбок in vitro.

3) исследовать участие актинового цитоскелета в длительной потенциации химических шипиковых синапсов гиппокампа и смешанных синапсов МН.

4) провести сравнительный анализ ультра структуры специализированных контактов афферентных смешанных синапсов МН после возникновения в них ДП электротонической передачи.

5) изучить взаимосвязь между агрегатным состоянием актинового цитоскелета и электротонической проводимостью смешанных синапсов МН, используя для этого физиологически активные вещества, избирательно взаимодействующие с актином и модулирующие проводимость щелевых контактов.

6) использовать иммуноцитохимические метки для визуализации актина в специализированных синаптических контактах.

7) провести биофизические и ультраструктурные эксперименты на искусственных билипидных мембранах в условиях фиксации потенциала и на липосомах при взаимодействии с ними актина для изучения участия Ф-актина в трансмембранной электротонической проводимости.

8) изучить распределение ионов кальция в МН и смешанных синапсах после изменения их функционального состояния и после действия модуляторов проводимости щелевых контактов.

Научная новизна.

1. Впервые разработан и применен для совместного морфофункционального исследования МН метод работы на переживающих длительное время (до 7ч) срезах продолговатого мозга рыбок с экстра - и внутриклеточной регистрацией ответа нейрона. Показано, что в таких препаратах на протяжении всего времени эксперимента нейроны сохраняют вызванную электрическую активность и адекватное состояние структуры афферентных смешанных синапсов, вовлекаемых в процесс ДП.

2. Показана возможность в условиях in vitro индуцировать в смешанных синапсах долговременную потенциацию электротонического ответа тетанизацией задних корешков 8-го нерва, главного афферентного входа МН.

3. Показано, что десмосомоподобные контакты (ДПК) смешанных синапсов МН отличаются от ДПК химических синапсов наличием в щели фибриллярных структур, мостиков, в состав которых входит актин. Пироантимонатным методом выявления ионов кальция показано, что в состоянии повышенной электротонической проводимости смешанного синапса щелевые контакты блокируются. При этом мостики проявляют кабельные электрические свойства транссинаптического шунта. Таким образом, впервые обнаружен новый тип межклеточных органоидов, ДПК коммуникационного типа.

4. Показано, что искусственные фосфолипидные мембраны при взаимодействии с Ф-актином изменяют свою проводимость на три порядка за счет появления в них одиночных ионных каналов, имеющих ярко выраженную катионную проводимость. Таким образом, впервые

определено, что актиновая нить может служить молекулярным субстратом трансмембранной электротонической передачи.

5.Показано, что под действием физиологически активных веществ изменение электропроводности и проницаемости щелевых контактов обусловлено не только изменением коннексонов, входящих в состав щелевого контакта, но также взаимодействием с актином.

Научно-практическое значение. Важным цитологическим результатом работы является свидетельство того, что ДПК, общепризнанные межклеточные адгезионные соединения, могут выполнять электротоническую коммуникативную функцию 8 условиях длительной потенциации смешанных синапсов и адаптации МН благодаря входящему в их состав филаментному актину. Это позволяет по-новому взглянуть на развитие в мозгу когнитивных процессов, а также ментальных болезней и нарушений.

Практическим результатом работы может быть применение полученных данных об изменениях в синаптических структурах, основанных на нейрональном актине, в диагностике патологических состояний нервной ткани. Эти данные могут быть полезными при разработке новых и применении известных фармакологических препаратов и физиологически активных веществ цитоскелетного действия для лечения нервных болезней. Они могут быть также использованы при разработке способов профилактики нервных дисбалансов и коррекции возникших нарушений.

Апробация работы. Материалы диссертации частично были представлены на 111 Симпозиуме The Cytoskeleton" (Weimar, 1990), на международном симпозиуме по

биологической подвижности «Modem methods for studying.....»(Пущино, 1998), на 2-ом съезде

биофизиков России (Москва, 1999), на конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, 2000), на 18 съезде физиологического общества (Казань, 2001), на международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-Дон, 2002), на 4-ой и 5-ой международных конференциях по функциональной морфологии (Колосовские чтения-1997, 2002, Санкт-Петербург), на 2-ом Международном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Карадаг, 2003), на 8-ом международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Донецк, 2003).

Материалы опубликованы в печати виде тезисов докладов.

Структура диссертации. Диссертация изложена на __страницах, включает_рисунков,

_таблиц. Список литературы содержит_ссылок.

Материалы и основные методы исследования.

Объекты. Основная работа проведена на Маутнеровских нейронах мальков (Змее, возраста, длиной Зсм) и молодых зрелых особях (12 мес. возраста, длиной 10 см) золотых рыбок Carassius auratus породы шубункин и вакин, и на шипиковых синапсах поля САЗ гиппокампа морских свинок, классических объектах нейробиологии.

Электрофизиологические методы. Электрофизиологические эксперименты на МН проводили совместно с П.И.Пахотиным (ИБК РАН). В условиях in vitro фронтальные 700мкм срезы продолговатого мозга золотых рыбок помещали в инкубационную камеру с модифицированной средой Рингера-Кребса, содержащей (в мМ): NaCI 76; KCl 0,4; CaCb 4,0; NaHC0312,5; MgSC>4 2,6; КН2РО41,2; глюкоза 2.0, pH 7,5.

В опытах с аппликацией фаллоидина на МН использовали парную стимуляцию (парные прямоугольные импульсы 10ОмкА, 0.2 мс) с интервалом между импульсами 10-30мс.

Тетанизацию МН для индукции ДП проводили током частотой 200-400 имп/ сек, 3 раза по 1с с интервалом в 30с. Использовали тетанизацию двух уровней: подпороговую и надпороговую.

Электрофизиологические эксперименты на гиппокампе проводили совместно с А.Г.Брагиным и НАОтмаховым в лаборатории проф. О.С.Виноградовой (ИТЭБ РАН). Для электрофизиологического тестирования и индукции ДП в гиппокампе использовали стандартные процедуры (Брагин и др., 1977; Отмахов и Брагин, 1982).

Поведенческие эксперименты. В работе с золотыми рыбками функциональную активность МН оценивали косвенно по поведению рыбок в кольцевой камере (Мошков и др., 1982), адекватно отражающему уровень электрической активности МН, измеряемой микроэлектродной техникой (Тирас и др., 2002).

Аппликацию физиологически активных веществ проводили по методу, специально

разработанному в лаборатории (Тирас, Мошков, 1980). Хроматографически чистый фаллоидин (Sigma, USA) разводили в дистиллированной воде до концентрации 10 мг/мл. В мозг контрольных рыбок вводили равные объемы дистиллированной воды. Мозг для дальнейшей обработки и подготовки к электронной микроскопии выделяли через 5ч после аппликации фаллоидина. Хроматографически чистый цитохалазин D (Calbiochem, USA) растворяли до конечной концентрации 4 мкг/мл разведением в физиологическом растворе с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО). Мозг выделяли примерно через 20 час после инъекций. Хроматографически чистый дофамин (Sigma) использовали в конечной концентрации 10мМ в 130мМ NaCI и 10мМ HEPES (рН 7,2). Время проявления эффекта 1ч. Хроматографически чистый 20-гидроксиэкдизон (Sigma) использовали в конечной концентрации 4хЮ-®М в 0.6%-ном физиологическом растворе. Время проявления эффекта 20ч Хроматографически чистый гидрохлорид хлорпромазина (Sigma) применяли в концентрации 2,5x10ЛМ в 0,6%-ном физиологическом растворе. Время проявления эффекта 4ч.

Электронно-микроскопические методы. После проведения электрофизиологических экспериментов или аппликации физиологически активных веществ фрагменты мозга рыбок фиксировали и заключали в эпоксидную смолу эпон-812 по принятой в лаборатории методике (Мошков, 1985).

Срезы гиппокампа фиксировали 2%-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М какодилатном буфере рН 7,4 или на среде инкубации и готовили к электронной микроскопии по методам, принятым в лаборатории (Мошков, 1985).

Гистологические Юмкм срезы для последующего прицельного исследования ультраструктуры необходимых участков нейронов готовили на пирамитоме LKB, просматривали под световым микроскопом NU-2E. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM 100B и Tesla BS-500.

Морфометрия. Для морфометрического анализа смешанных синапсов и их специализированных контактов использовали полные их срезы. Все измерения проводили или прямо с фотографий при конечном увеличении 65000, или же на экране монитора с использованием компьютерной морфометрической программы «Морфология». Ультраструктуру синаптических контактов анализировали с использованием стереологических процедур, разработанных и принятых в нашей лаборатории специально для МН (Коган и др., 1988).

Достоверность различий средних значений оценивали по t-критерию Стьюдента, а в некоторых случаях по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Для идентификации актинового цитоскелета применяли кроличьи антитела к актину, меченные флуоресцеином или пероксидазой (Sternberger, 1979) или комплекс фаллоидин -коллоидное золото. Кроме того, использовали субфрагмент-1 миозина(3-1) (Ishikawa et al., 1969) и соответствующий для этого протокол (Le Beux, Willemot, 1975), в собственной модификации.

Выявление актина в МН комплексом фаллоидин-коллоидное золото осуществляли по методу, описанному ранее (Lachapelle, Aldrich, 1988J. Пироантимонатный метод вьпвления кальция применяли в модификации В.В. Петруняки

(1987).

Искусственные билипидные мембраны (БЛМ). Эта часть экспериментов выполнена совместно с ПА Григорьевым (ИБК РАН), а также с Ю.С. Тараховским и С.Н. Удальцовым (ИТЭБ РАН). Для проведения экспериментов использовали коммерческие фосфолилиды

соевых бобов (azolectin, Type Il-S, Sigma). БЛМ формировали по методу Mueller et al., (1962J. Площадь поверхности БлМ в экспериментах составила около 0,12ммг. Электролитом служил 100 мМ раствор KCI или 200 мМ раствор NaCI, pH 6,5. Для регистрации тока мембраны в условиях фиксации потенциала использовали электрометрический усилитель (Kethley 301) и самописец Eudin 622,01. Электрофоретически гомогенный мышечный кроличий Ф-актин в концентрации 0,4-5,6 мг/мл добавляли во внешнюю кювету и перемешивали в течение 2 мин. Конечная концентрация белка в кювете, когда проявлялся эффект изменения электропроводности мембраны, достигала примерно 12 мкг/мл. Эксперименты проводили при комнатной температуре.

Липосомы готовили стандартным методом. Ф-актин добавляли к суспензии липосом в соотношении белок/липид 1:2, и после инкубациии при +4°С и центрифугирования осадок изучали методом замораживания • скалывания.

Результаты и обсуждение.

Определение вовлеченности и места актина в адаптации и памяти на нейрональном уровне.

Визуализаций актина в Маутнеровскихнейронахзолотой рыбки в условияхнормы, утомления и адаптации кнему.

С помощью методов иммунофлюоресцентной микроскопии, иммуноцитохимии и обработки субфрагментсм-1 миозина (S-1) актин был локализован преимущественно в соматической части клетки, особенно в области вокруг ядра, вплоть до цитоппазматической мембраны, в самом ядре (рис.1 А, Б). В проксимальных и дистальных участках главных вентральных и латеральных дендритов актин не обнаруживался. Похожее

распределение актина показано также с помощью антител, меченых пероксидазой.

При изучении картины распределения актина на ультраструктурном уровне после его обработки S-1 заметны характерные для этого метода утолщенные в результате обработки актиновые волокна. Они встречались по всей цитоплазме нейрона в виде отдельно лежащих нитей, пересекающихся друг с другом и образующих неплотную сеть. В постсинаптической цитоплазме актиновые волокна обнаруживались под плазматической мембраной. В зоне контакта цитоплазматической мембраны с синаптическими окончаниями смешанного типа утолщенные фибриллы идентифицировались в десмосомоподобных структурах (ДПК), в цитоплазме пресинаптического бутона актиновые волокон практически не встречались.

Таким образом, методами иммуноцитохимии нами впервые локализован актин в МН золотых рыбок и показано характерное повсеместное распределение актиновых волокон в цитоплазме.

Рис.1. Структура МН в 10 мкм срезе при стандартных способах обработки (А) и после выявление актина флюоресцентными антителами (Б) (об-х50, ок-х5).

После длительной стимуляции в МН обнаруживались все типичные признаки повреждения нейронов: уплотнение цитоплазмы самого нейрона и глиальных отростков вблизи его поверхности, набухание митохондрий, гипертрофия комплекса Гольджи, запустевание и вакуолизация цитоплазмы бутонов, появление миелиновых фигур. Обращало на себя внимание на этом фоне отсутствие в цитоплазме актиновых филаментов или пучков волокон. В удлинившемся ядре они вытягивались в направлении продольной оси, а также появлялись в глиальных отростках.

Таким образом, длительная стимуляция МН вызывала не только существенную перестройку структуры нейрона, но и изменение в состоянии нейронального актина, его реструктурирование в ядрах, глиапьных отростках и полное его исчезновение в цитоплазме.

Известно, что после длительной естественной стимуляции МН по данным микрогельэлектрофореза состава белков этого нейрона в полиакриламидном геле, содержание в них некоторых глазных белков, в том числе актина, существенно снижается (Янюшина и др., 1990). Это согласуется с результатами нашего ультраструктурного анализа. По имеющимся данным к изменению белкового состава МН приводила также длительная электрическая стимуляция, о чем свидетельствовало интенсивное включение в МН меченых аминокислот продолжительное время спустя после окончания стимуляции (Eugenin, Alvarez,

1995). Таким образом, выявленное нами временное отсутствие актиновых филаментов в цитоплазме МН после стимуляции косвенно подтверждается и данными прижизненной радиоавтографии.

При ультраструктурном анализе в цитоплазме МН при адаптации, приобретенной в результате тренировок (резистентности) МН к утомительной стимуляции (рис.2), появлялись многочисленные отдельные волокна, локализованные вблизи ядерной мембраны и в глубине цитоплазмы. Помимо одиночных волокон были видны пучки из нескольких коротких и длинных извитых осмиофильных нитей. Эти пучки становятся характерным признаком адаптированных МН.

Идентификация актина с помощью обработки S-1 выявила в адаптированных МН отдельные нити актина и пучки нитей различной протяженности.

В настоящее время стало понятно, что цитоскелет играет важную роль в поддержании стабильного состояния клетки при действии различных повреждающих факторов, к которым относится и длительная стимуляция. Стабилизация проявляется в поддержании формы клетки, сохранении нормальной локализации внутриклеточных компонентов и тех функций и метаболических процессов, которые ими выполняются (Белоус, Землянских, 1994).

Полученные результаты показали, что при повреждении цитоскелета МН, вызванном длительной стимуляцией, нарушения на клеточном уровне не обнаруживались: форма МН не изменялась. По-видимому, нейрофиламенты и микрофиламенты, основные составляющие цитоскелета МН в соме и дендритах, сохраняющиеся после стимуляции (Санталова, Мошков,

1996), достаточно надежно поддерживают формунейрональныхотростков (Brady, 1993;Xu et а!., 1993) и сомы. Возможно Ф-актин, частично оставшийся в ядрах и появляющийся в

глиальных отростках, также участвует в поддержании стабильной формы МН. Однако потеря актина в цитоплазме МН приводит к повреждениям на субклеточном уровне: к набуханию митохондрий, цистерн комплекса Гольджи, эндоллазматического ретикулума, нарушению целостности органоидов. Наконец, в этом случае, по-видимому, происходят повреждения на молекулярном уровне, о которых косвенно свидетельствует угнетение функции МН после их длительной стимуляции. Оно может быть связано с инактивацией NMDA-рецепторов -главных постсинаптических рецепторов МН (Yang, Faber, 1991).

Таким образом, обнаруженные многочисленные морфофункциональные повреждения МН, вызванные их длительной стимуляцией, можно объяснить потерей цитоплазматического актина, приводящей к нарушениям как структурной, так и, по-видимому, функциональной взаимосвязи клеточных органоидов и рецепторов. Функциональная резистентность МН к утомлению, адаптация, характеризуется, наоборот, укреплением актинового цитоскелета, которое выражается в формировании стресс волокон - пучков. Этот факт подтвержден также

опытами на невозбудимых клетках-моделях (Korichneva, 1999). О неизменности состава актина в адаптированных МН даже после утомительной стимуляции свидетельствуют также данные микрогельэлектрофореза (Янюшина и др., 1990). Все это подтверждает стабилизирующую роль актинового цитоскелета в жизнедеятельности нейрона.

Определение поэффектуцитохалазина D вовлеченностиактиновогоцитоскелета в функциональные перестройки МН.

Эффект цитохалазина D, вещества, которое дестабилизирует актин и в конечном своем действии приводит к его деполимеризации, при его аппликации на МН адаптированных рыбок проявляется в разрушении выработанного адаптивного состояния (рис.2). На структурном уровне в цитоплазме МН после действия цитохалазина протяженные пучки актиновых волокон, обнаруженные в адаптированных клетках, исчезали. Это подтверждало наше предположение о том, что механизмы, лежащие в основе устойчивости МН к экстремальным нагрузкам, включают полимеризацию цитоскелетного актина и укрепление цитоскелета в целом.

Однотипная структурная реакция при длительной стимуляции и действии цитохализина D, выражающаяся в потере полимерного актина в цитоплазме, указывает на единый механизм утомления МН и свидетельствует об участии актина в простейшей форме пластичности нейронов, утомлении, одного из центральных функциональных состояний МН (Eaton, 1977) и нервной системы в целом.

Рис.2. Действие цитохалазина D на двигательную активность рыбок.

И - интактные, АД - адаптация, АД+цD - адаптация+ цитохалазин D; темные столбики до, светлые - после тест-стимуляции. N = 20 для каждого случая. * - р<0,05

Определение поэффектуфаллоидина участия актинового цитоскелета мн в резистентности к утомительной стимуляции.

Известно, что обработка МН фаллоидином in vivo существенно повышает их функциональную резистентность к длительной стимуляции и предохраняет от повреждения их ультраструктуру (Мошков, 1985).

В наших экспериментах выявление актина декорацией S-1 показало, что в результате воздействия фаллоидина на МН в их цитоплазме формировались мощные протяженные пучки волокон, которые по их ассоциации с S-1 идентифицировались как пучки актиновых нитей. Они пронизывали всю цитоплазму вдоль длинной оси клетки, были составлены из прямых, расположенных строго параллельно нитей и часто соприкасались с другими органоидами. Подобные, но менее выраженные, пучки были обнаружены нами и в цитоплазме МН адаптированных рыбок. Можно предположить, что структурные превращения цитоскелета, пучки, являются результатом действия фаллоидина и образуются вследствие дополнительной полимеризации актина в цитоплазме.

Действие фаллоидина приводило к изменениям и в структуре афферентных синапсов МН. В бутонах, богатых мономерным актином (Fath, Lasek, 1988), выявлялись отдельные актиновые волокна, в норме отсутствующие, что свидетельствовало о низком содержании филаментного актина в синапсах по сравнению с цитоплазмой. В некоторых бутонах

встречались ленты или нити, ассоциированные с везикулами. Похожая ленточная упаковка везикул обнаружена на актиновых нитях и пучках в синаптических окончаниях нервных клеток коры мозжечка крыс при глубоком травлении (Gottow et al., 1991). Бусоподобные ленты везикул были описаны и в синапсах мотонейронов рака (Bosch, 1990). Подобные структуры внутри синаптических бутонов могут прояснить еще во многом неизвестные механизмы синаптической организации и функции, в частности, процессы транспортировки синаптических везикул в бутоне перед их слиянием в момент экзоцитоза с плазматической мембраной в области активной зоны.

Обработка актина S-1 в МН после действия фаллоидина позволяет выявить более отчетливо десмосомоподобные контакты смешанных синапсов МН и щелевые контакты, открытые еще в 1963 г. Робертсоном (Robertson, 1963). Это может означать участие актина не только 8 регуляции размеров и функции десмосомоподобных контактов, но и щелевых контактов. Они сейчас интенсивно изучаются, но о содержании в них актина или о взаимодействии их с актином пока известно очень мало.

Важно отметить, что пучки волокон обнаруживаются в цитоплазме как при действии фаллоидина, так и при адаптации. Они, по-видимому, являются защитной реакцией клетки на воздействие, о чем свидетельствует функциональный анализ активности МН, а также ряд других фактов. Действительно, согласно ультраструктурным данным последующая длительная обработка нефиксированных МН глицерином после воздействия фаллоидина также не нарушала их структуру. Все это позволяет предположить, что воздействие или обработка фаллоидином делает нейрон более устойчивым к повреждающим факторам благодаря дополнительной полимеризации актина. Недавно подобная связь повышения жизнеспособности клетки с полимерным состоянием актина подтверждена работами на культуре клеток (Korichneva, 1999).

При адаптации цитоплазматические пучки актина также повышали устойчивость структуры и функции МН не только к длительной стимуляции, но даже к токсическому действию каиновой кислоты, апплицируемой на МН (Тирас и др., 1990).

Таким образом, структурная реакция ядра и цитоплазмы, одинаковая при адаптации и при действии фаллоидина, свидетельствует о важном и, по-видимому, едином, основанном на полимеризации актина, механизме защиты структуры и функции МН от неблагоприятных воздействий, в том числе длительной стимуляции. На возможность существования такого механизма защиты клетки путем повышения степени полимеризации нейронального актина с образованием пучков волокон указывают и опыты in vitro. Сравнительно простое усиление поперечных связей в актиновом геле меняет его механические свойства от состояния вискозоэластичной жидкости (связывание альфа-актинином) до твердого тела (связывание биотин-авидином) (Wachsstock et a!., 1994). Большое количество актин связывающих белков внутри живой клетки (Southwick, Punch, 1994) и их возможное вовлечение в реорганизацию нейронального актина при разных воздействиях или ситуациях, в разной последовательности или комбинациях, могут определять достаточно широкий спектр механохимических состояний актинового геля цитоплазмы и статуса клетки. Эти данные о локализации и превращениях актина согласуются с результатами работы, в которой показано, что цитоскелетные элементы нейронов, в частности актин, вовлекаются в стрессовые ситуации и могут играть ключевую роль в ответе на внешние стимулы (Gourgeon et al., 1993).

Выявление роли актина в индукции и сохранении длительной потенциации как модельной формы памяти.

Настоящая глава посвящена исследованию участия актина в длительной постстетанической потенциации (ДП), модельной форме памяти на клеточном уровне, усилении проводимости, или эффективности двух видов синапсов: гигантских шипиковых синапсов гиппокампа высших позвоночных, в которых осуществляется химическая передача, и смешанных синапсов низших позвоночных, где существует смешанный, химический и электротонический типы передачи импульса.

Исследование участия актина в созданиидлительной потенциациишипиковыхсинапсовполя САЗгиппокампа морскихсвинок.

Являясь одной из форм синаптической памяти, ДП может влиять на информационные процессы и контролировать их в различных отделах нервной системы, в том числе и гиппокампе (Воронин, 1993; Виноградова, 2000), чем привлекает внимание нейробиологов. В наших экспериментах при гистологическом и ультраструктурном анализе переживающих срезов гиппокампа было установлено, что пирамидные нейроны, с которыми можно было работать, хорошо сохраняются только на глубине примерно 100 мкм (1/3 от толщины среза) (Пахотин, Павлик и др., 1998). При выявлении актина на светооптическом уровне иммунофлуоресцентной меткой (рис.3) или комплексом фаллоидин-коллоидное золото актин обнаруживался в основном в местах расположения синаптических окончаний, но не в телах пирамидных нейронов.

Дальнейшей задачей этой части работы было, используя метки на актин, изучить актиновый цитоскелет синапсов поля САЗ гиппокампа в переживающих срезах после ортодромной выскочастотной стимуляции, приводящей к возникновению долговременной потенциации синаптической

передачи (рис. 4). На ультраструктурном

Рис.3. Структура участка поля САЗ гиппокампа в 10мкм срезе после стандартной обработки (А) и после обработки флюоресцентными антителами (Б).

о " £ 1 {

Ч^Н-;

Рис.4. Электрофизиологические проявления длительной потенциации в поле САЗ гиллокампа: а - др, б - через 10 мин. после тетанизации, в-через 1ч., г-через 2ч., д-через Зч, е-через 5ч.

уровне актин,

невидимый после обработок обычными способами (рис. 6,А), с применением меченых антител визуализировался в строме шипика и в области активных зон, в постсинаптических уплотнениях (рис. 5).

В дальнейшем мы отказались от использования этого метода для решения поставленной задачи из-за неопределенности локализации актина и его структуризации в отдельных локусах.

Выявление филаментного актина с помощью Б-1 наглядно показало, что в шипиковых синапсах контрольных препаратов он расположен в виде рыхлой актиновой сети (рисб.Б). Под шипиком обнаруживался плотный клубок актиновых нитей, связанный с микротубулярным цитоскелетом дендрита (рис 6.В). В ножке шипика и вне активных зон контакт актиновых нитей с мембранами не прослеживался. В дальнейшей работе мы становились на этом методе выявления актина, так как он нам показался более приемлемым для решения поставленных задач.

.чг:*®

Рис.5. Ультраструктура шипикового синапса после выявления актина антителами.

Рис.6. Ультраструктура шиликовых синапсов в контроле при стандартной обработке (А) и после выявления актина (Б,В) с помощью 5-1. АВ-актиновые волокна. Ув. А.Б-40000, В-30000

Тетанизация мшистых волокон, а также раздельно обработка срезов раствором с повышенным содержанием кальция, индуцирующими длительную потенциацию, приводила к качественному изменению структуры шипика, формированию в его строме пучков актина (рис. 7). Они проходили через весь шипик и его ножку и ответвлениями соединялись с актиновым цитоскелетом шипика и цистернами шипикового аппарата, а также с постсинаптическими мембранами активных зон. При этом электронная плотность пре- и постсинаптической актиновой сети увеличивалась.

При стимуляции синапсов в качестве контроля редкими стимулами, не приводящими к потенциации, таких перестроек актинового цитоскелета в шипиках не наблюдали. Образование внутри шипиков стержневидной структуры, состоящей из актина, по-видимому, может объяснить ряд описанных изменений формы и размеров синаптических структур. Впервые гипотеза о шипике как о ресничкоподобном выросте хеморецептивной мембраны была высказана Батуевым и Бабминдрой (1984).

Имеющиеся многочисленные данные коллег и наши собственные исследования шипиковых синапсов показали, что неспецифические воздействия повреждающих факторов, таких как инкубация, стимуляция, глицеринизация, фиксация и другие, существенно не затрагивали структурной организации шипиковых синапсов. Они сохраняли стабильность размеров и формы и функциональные характеристики. Корреляция между морфофункциональной резистентностью шипиковых синапсов и выявленной нами актиновой природой постсинаптического цитоскелета приводит к предположению, что одной из важных функций актина в шипиковых синапсах является сохранение их структуры в широко изменяющихся условиях

функционирования. Это свидетельствует о первичной функции цитоскелета шипиков как их внутренней опоры, которая

определяет топографию шипика на дендрите, его конфигурацию, местоположение активной зоны в контакте, а также форму и размеры самого шипика и активной зоны. Кроме опорной функции с помощью цитоскелета осуществляется подвижность шипиков. Известно, что зрелые нейроны и их отростки in situ в изучаемые временные интервалы неподвижны (Purves, Hardley, 1985). Тем не менее, актиновая природа шипикового

V.» »(.»Л

Рис.7. Изменение актинового цитоскелета шипика при потенциации, вызванной тетанизацией (А) и повышенной концентрацией Са2+ (Б). Обработка 5-1. П - пучок волокон. Масштаб 0.1 мкм

цитоскелета предполагает наличие у него механохимических свойств, которые обеспечивают различные движения с участием актина (Kuznetsov et al., 1992; Dayhoff et al., 1994; Bearer, Reese, 1999; Hata, Takai, 1999; Matus 2000; Васим, 2003) в присутствии миозина (Fifkova, 1985). Движение может генерироваться также при переходе актина из полимерной формы в мономерную и наоборот (Wiesner et al., 2003; Pollard, Borisiy, 2003; Carlier et al., 2003л что создает тянущее или толкающее усилие. По имеющимся представлениям (Батуев, Бабминдра, 1984; Fifkova, 1985) подвижность актиновой сети в шипиках, где актин проявляет обычную функцию немышечной подвижности, обусловливает изменение формы, объема шипиков, а также диаметра ножек шипиков после тетанизации и возникновения ДП. Это существенным образом должно влиять на электрические и некоторые трофические свойства постсинаптических элементов синапса (Horwitz, 1984). Однако, как показано при наблюдениях в реальном масштабе времени с помощью конфокальной микроскопии, шилик может «дышать», изменять свои размеры до 30% без изменения своих электрических свойств (Fischer et al., 1998). При ДП изменяется также ширина постсиналтических уплотнений, производных цитоскелета (Kelly, Cotman, 1978; Gulley, Reese, 1981), увеличивается кривизна синаптического контакта с активной зоной (Wesa et al., 1982; Мошков, Павлик, 1983, Desmond, Levy, 1983,1986а, 1986Ь; Weeks et al., 2000; Matus et al., 2000). По нашим представлениям пучок актина, который формируется при ДП, является вектором распространения продольной силы при взаимодействии пучка актина с миозином. Это может объяснить все известные до сих пор структурные изменения в шипиковых синапсах при потенциации, не объяснимые без учета трансформации актина в пучки.

Рассматривая формирование пучков актиновых волокон как структурный специфический признак потенциированных синапсов, можно, изучая мозг обученного животного, попытаться ответить на важнейший вопрос нейробиологии - об отношении модельной формы памяти и естественной памяти (Stevens, 1999).

Для более полного понимания глубинных механизмов, которые приводят к возникновению и поддержанию ДП шипиковых синапсов, требуются исследования и на других объектах. Новые перспективы для расшифровки механизмов ДП в гиппокампе открылись после того, как это явление обнаружили в смешанных синапсах МН золотых рыбок (Yang et al., 1990; Yang, Faber, 1991; Pereda et al., 1992,1995). Эти синапсы расположены прямо на стволе дендрита, имеют более простую организацию, крупные размеры, четкую и строгую локализацию на определенном, дистальном участке латерального дендрита МН. Это делает их более адекватными для прицельного изучения их микроэлектродной техникой и электронной микроскопией.

Исследование вовлеченности актина в индукцию идлительное сохранение потенциации смешанныхсинапсов МН.

Из-за глубинного расположения МН в мозгу комплексные морфофункциональные исследования весьма затруднены, и, вероятно, поэтому малочисленны. К настоящему времени кроме работ нашей лаборатории на МН проведена единственная морфофункциональная работа в условиях in vivo (Pereda et al., 2003). Для расширения экспериментальных возможностей при решении этой проблемы мы реализовали подход к морфофункциональному исследованию МН на переживающих 0,7-1,0мм срезах продолговатого мозга золотой рыбки. Этот метод позволяет совместить микроэлектродную регистрацию биопотенциалов, естественные стимуляции с целью выработки в МН нового функционального состояния, аппликации на МН физиологически активных веществ и электронно-микроскопическое изучение одних и тех же нейронов и групп синапсов, невозможную комбинацию несовместимых методов при проведении таких исследований in vivo.

Возможность индукции идлительного сохранения потенциации в МНIn vitro.

Результаты серии экспериментов, проведенных нами в последние годы, впервые убедительно показали, что электрофизиологические и ультраструктурные характеристики МН золотой рыбки можно изучать в течение длительного времени в переживающих in vitro срезах продолговатого мозга, содержащих МН. Более того, в таких препаратах можно индуцировать и длительную посттетаническую потенциацию

МН. А в

Электрическая активность МН, вызванная при i t

их ортодромной стимуляцией, сохранялась в 1нас|1 , ft f-^ д° течение всего периода инкубации до 5-7 ч (рис.

Тетанизация вызывала в МН длительную потенциацию (ДП), развивающуюся во времени и достигающую стабильного уровня через 30-40 мин. ДП характеризовалась увеличением на 30150 % амплитуды электрического и химического ответов, которое сохранялось в течение 3 ч (рис. 8, Б). Индукция ДП указывает на повышение эффективности передачи сигнала в смешанных синапсах. При качественном предварительном электронномикрокопическом исследовании тех же нейронов в состоянии потенциации в структуре синапсов не выявлено заметных изменений по сравнению с контролем.

ермул

чсрмЗчк!

Рис.8. Электрические ответы МН при инкубации (А) и после тетанизаиии (Б).

Изучение ультраструктурныхпризнаков длительной потенциации смешанных синапсов МН in vitro.

При морфометрическом анализе (рис. 9) смешанных синапсов показано, что длина индивидуального профиля десмосомоподобного контакта (ДПК) в потенциированных терминалях была почти в 2 раза больше по сравнению с не стимулированными контрольными синапсами. Так как количество индивидуальных ДПК в среднем в потенциированных и контрольных синапсах не различалось, суммарный размер всех ДПК в сечении потенциированного синаптического контакта с дендритом был примерно в 2 раза, больше, чем в не стимулированных контрольных

синапсах. Важно отметить, что количественные изменения ДПК

хорошо коррелировали со степенью потенциации. При 2-х-кратном росте уровня потенциации размеры ДПК росли примерно вдвое, а при росте уровня потенциации в 1,35 раза они увеличивались примерно в 1,4 раза.

Рис.9. Размеры специализированных контактов смешанных синапсов при разных уровнях потенциации по сравнению с контролем.

К - контроль (100%), А3 - длина отдельной активной зоны, ДПК • длина десмосомоподобного контакта, ЩК - длина щелевого контакта после ДП.' р<0.05

Суммарная длина всех активных зон (A3) в пересчете на потенциированный смешанный синапс сокращалась по сравнению с контролем.

Раздельный ультраструктурный анализ химических синапсов в МН, смешанные синапсы которых потенциировались, тоже обнаружил небольшое, но достоверное увеличение в них размеров ДПК (Moshkov, Pavlik et al., 1998). Последнее может служить структурным-признаком длительной депрессии этих синапсов (Bailey, Chen, 1983; Тирас и др., 2002), хотя соответствующие волокна, окончания которых формируют химические синапсы (Zottoli, Faber, 1979), стимуляции не подвергались.

Неожиданным было то, что и в контрольных, и в потенциированных смешанных синапсах размеры щелевых контактов (ЩК) оставались неизменными. Не изменялась и тонкая структура ЩК в ультратонких срезах.

Обнаруженная стабильность ЩК при потенциации, структур, осуществляющих по имеющимся представлениям электротоническое проведение между клетками (Bruzzone et al., 1996) и которые при изменении электротонической коммуникации по теоретическим расчетам должны морфологически изменяться (Chen, Meng, 1995), и, с другой стороны, коррелятивное изменение размеров ДПК, которое было пропорционально уровню проводимости смешанных синапсов, привлекло наше внимание как важная особенность потенциированных синапсов. Это дало нам основание предположить, что наряду со щелевыми контактами в создании и поддержании потенциации электротонической передачи в смешанных синапсах, вероятно, участвуют ДПК, которые по общепринятому мнению построены из актина (Lieberman, Spacek, 1999). Значит, в механизмы ДП может вовлекаться цитоскелетный белок, входящий в состав ДПК. Каким образом? Одним из путей может быть прямое шунтирование синаптического контакта актиновыми нитями. Было известно, что в воде нити актина способны проводить по своей поверхности электрический катионный сигнал (Lin, Cantiello, 1993). Высказывалось предположение, что молекулы актина, будучи встроенными или, пронизывая мембрану, будут также участвовать в передаче электротонического сигнала, вероятно, в виде потока катионов (К*, Са^) (Lange, Brandt, 1996; Tang, Janmey, 1996) по поверхности актиновой нити, перенося их внутрь клетки. Таким образом, наши предположения о дополнительном формировании ДПК из актина и увеличении их шунтирующей функции при потенциации не были лишены основания. Другим, косвенным, механизмом может быть вовлечение актина в контроль над расположением коннексонов в ЩК и проводимостью ионных каналов на их основе. Как известно, эти два типа контакта находятся в непосредственной близости друг от друга и актин также можно обнаружить в самом ЩК (Павлик и др., 1997). Так или иначе, актин и ДПК, в состав которого может, как предполагают, входить актин, гипотетически можно рассматривать как структурный молекулярный инструмент, благодаря которому меняется проводимость синапсов смешанного типа То, что актин способен переносить через мембрану катионный ток, продемонстрировано нами в специально поставленных опытах.

В модельных экспериментах мы получили прямые свидетельства увеличения электротонической проводимости искусственных мембран при взаимодействии их с актином. При этом был использован не мономерный актин, который не изменяет электрических свойств мембран (Гурьнев и др., 2003), а Ф-актин.

Исследование взаимодействия филаментного актина с искусственными

фосфолипидными мембранами.

Нами впервые показано, что молекулы Ф-актина в условиях фиксации потенциала индуцируют в плоской бислойной липидной мембране (БЛМ) скачки тока 2,0-3,5 пА, свидетельствующие об образовании одиночных ионных каналов проводимостью 30-40 пС (рис.10). Они проникают через липидный слой, и таким образом могут служить субстратом для трансмембранного переноса электрического сигнала. Каналы имели ярко выраженную катионную (Рс/а=26) проводимость (рис.11). Катионную проводимость одиночного канала, образуемого молекулой актина, могут создавать в наших экспериментах ионы натрия и калия

WOuU IU2

(ftiWi

(см. также Lin, Cantiello, 1993). Возможно также участие в этом процессе ионов кальция (Талд, Janmey, 1996; Lange, Brandt, 1996; Janmey, 1998).

Кроме этого, наблюдали спорадические шумообразные

флуктуации тока около 14 пА. Это соответствовало средней мембранной проводимости 160 пС и, вероятно, означало одновременное открывание 3-4 переключающихся одиночных ионных каналов меньшей

проводимости, по 3(М0 пС каждый. Пики проводимости БЛМ в наших экспериментах достигали 1000 пС, что напоминало по величине проводимость актиновой молекулы в воде (Lin, Cantiello, 1993).

При электронномикроскопическом Рис. 10. Канальная активность Ф-актина при его изучении реплик сколов липосом с встраивании в искусственные мембраны, формируемая в

ж«- растворе NaCt (А) и KCI (Б).

гидрофобной поверхностью до и после

добавления актина продемонстрировано, что нити актина сильно деформируют бислой, вдавливаясь в него своей поверхностью. Кроме того, встречались нитевидные структуры, расположенные под углом к плоскости скола. Эти картины, по имеющимся литературным данным (Lindblom, Rilfors, 1989) и по нашим представлениям, свидетельствуют о пронизывании гидрофобной области мембраны нитью Ф-актина в поперечном или тангенциальном направлениях.

Обнаруженные структурные изменения бислоя могут служить основой изменения электрической проводимости искусственной мембраны в присутствии молекул Ф-актина.

Следующим шагом, который продвинул наши представления об актине как материальном субстрате для

транссинагттического переноса заряда, инициирующим электротоническую

проводимость, стал поиск ультраструктурных доказательств в пользу такого предположения. Вопрос о проводящей функции десмосомоподобных контактов

(ДПК) до нас в литературе не ставился. По-видимому, представлялось, что один раз обнаруженный и описанный принцип организации ДПК, аппарата межклеточной адгезии во множестве тканей, распространяется на абсолютно все подобные контакты в любых клетках (Geiger et al., 1985; Lieberman, Spacek.1999).

S

a

С

1 I e у L

1 i rf* • * (Г

t ¿Г W ——■ •V —

/

/ ¡¡r

• i.'f

•М -» -20 -10 в К»егвп» иеВад* (тУ>

Рис.11. Вольтамперная характеристика мембран со встроенным F-актином для симметричных (А) и асимметричных (Б) условий.

20

Изучение структурных различий между десмосомоподобными контактамиафферентных химических и смешанных синапсов МН.

Поводом для постановки этой задачи послужил факт коррелятивного изменения структуры ДПК смешанных синапсов и уровня ДП, и обнаружение электрических свойств Ф-актина, которые входят в состав ДПК. Поэтому был проведен сравнительный анализ двух типов ДПК в аферентных синапсах МН золотой рыбки: синапсов химического типа (взятых в качестве

контроля) и смешанного типа. Химические синапсы, как ранее было показано, не участвуют 8 передаче электротонического сигнала на МЫ (Zottoli, Faber, 1979). Изучение тонкой структуры ДПК химических синапсов МН выявило типичное для них строение, характерное как для синаптических, так и для несинаптических ненервных межклеточных контактов этого типа, полностью соответствующее общепризнанному представлению об этих контактах, как адгезионных структурах. В ДПК химических синапсов щель вне зависимости от воздействий была аморфной бесструктурной, разъединяющей противоположные мембраны контакта (рис. 12А).

В то же время внутри щели ДПК в смешанных синапсах на фоне равномерного матрикса мы обнаружили фибриллярные осмиофильные структуры, мостики, диаметром не менее Юнм, соединяющие две мембраны (рис. 12, Б). Они прямолинейны, чаще

пересекают щель под некоторым углом и, безусловно, не являются артефактом резки или результатом оптической аберрации, что убедительно продемонстрировано в

«слепых» экспериментах. В некоторых случаях

расфокусировка микроскопа позволяла более четко видеть контуры одного мостика за счет ухудшения видимости другого. Иногда в одном и том же ДПК имелось несколько мостиков, но из-за того, что они все расположены на разной глубине, их вид иллюстрирует вышесказанное. Мостики можно было наблюдать как в интактных препаратах МН, так и после утомительной стимуляции, аппликации физраствора, реабилитации от утомления, длительной инкубации срезов продолговатого мозга, содержащих МН. При последнем виде воздействия структура ДПК повреждалась, часть фибриллярного примембранного материала исчезала, но это не влияло на электрическую проводимость самих синапсов (Мошков и др., 1998) и, как теперь очевидно, на структуру мостиков в щели ДПК.

Таким образом, в результате проведенного анализа показано, что ДПК смешанных синапсов по структуре отличаются от ДПК химических синапсов наличием в своей щели фибриллярных мостиков. Мы высказали предположение, что мостики, шунтирующие контакт ДПК смешанных синапсов, могут служить структурным субстратом для выполнения коммуникационной функции в этих синапсах. Предположение о такой их функции было высказано нами ранее на основании полученных электрофизиологических и биофизических данных. Однако участвует ли в построении мостиков Ф-актин оставалось неизвестным.

Анализ вовлеченияактина в построение фибриллярныхмостиков по функциональномуэффекту на МНвеществ, изменяющихсостояниеактина.

Для проверки этого предположения было изучено влияние цитохалазина D (ингибитора полимеризации актина) и фаллоидина (полимеризующего актин) на электротоническую проводимость смешанных синапсов МН и на их структуру.

Аппликация цитохалазина D на МН и последующая инкубация срезов мозга не вносила заметных изменений в ортодромные ответы МН по сравнению с контролем. Тем не менее,

Рис.12. Структурные различия между ДПК химических синапсов (А) и ДПК смешанных синапсов ((Б). Стрелками указаны мостики в щели. Масштаб 0,1 мкм

_

2мс

Рис.13. Электрические отвееты МН на фоне аппликации цитохалазина О.

А - тетанизация, Б - тетанизация + цитохалахзин D, а - сразу после тетанизации, б - через 20 мин., в - через 2 часа. Э • злектротонический компонент ответа, хим. - химический.

индуцировать тетанизацией усиление электротонической передачи в смешанных синапсах на фоне действия цитохалазина Э оказалось невозможным. Более того, часто наблюдали долговременную депрессию ответа после • в ■

тетанизации (рис. 13,Б). В контрольных МН после аппликации физраствора и тетанизации развивалась типичная ДП (рис. 13, А).

При ультраструктурном анализе смешанных синапсов выяснилось, что тетанизация, проведенная после аппликации цитохалазина Э, приводила к их изменениям.

Наиболее заметным качественным признаком структуры смешанных синапсов в состоянии длительной депрессии, вызванной тетанизацией на фоне действия цитохалазина, было нарушение типичной структуры десмосомоподобных контактов и появление асимметричных «полудесмосом». При этом размер щели в области ДПК становился неоднородным: от почти сходящихся мембран до образования широких лакун в месте их расхождения. Оценка числа фибриллярных мостиков в синаптической щели полностью сохранившихся ДПК не выявила различий между контрольными и опытными препаратами. В щели образовавшихся «полудесмосом» подсчитать такие мостики не удалось из-за невозможности их идентификации. Можно предположить, что именно разрушение фибриллярных мостиков в щели ДПК приводило к набуханию щели, обнаруженному нами в большинстве препаратов.

Результаты морфометрического анализа

ультраструктуры смешанных синапсов подтвердили эти качественные данные (рис.14).

За счет снижения числа контактов суммарная протяженность ДПК уменьшалась после воздействий цитохалазина и тетанизации почти в 2 раза по сравнению с контролем, а протяженность всех ЩК уменьшалась более чем в 3 раза. Уровень депрессии смешанных синапсов при тетанизации на фоне цитохалазина Э из-за сильного повреждения ДПК, затрудняющего анализ их размеров, не строго, но соответствовал изменениям размерности ДПК В то же время уровень депрессии совсем не коррелировал с изменением структуры ЩК.

Следующим шагом в этом направлении было исследование влияния фаллоидина на электротоническую проводимость и ультраструктуру смешанных синапсов МН. Было показано, что при надпороговой стимуляции регистрируется, усиление ответа на второй стимул в среднем не более чем на 10% от амплитуды ответа на первый стимул (рис. 15,А), тогда как на подпороговые парные стимулы МН не реагировали.

После аппликации фаллоидина (рис.15,Б) МН начинали реагировать на второй стимул формированием полного ответа уже при подпороговой стимуляции. В среднем, учитывая

Рис.14. Дествие цитохалазина Э на структуру смешанных синапсов. К -размеры контактов в контрольных препаратах (100%), А3 - размер активной зоны, ДПК - размер десмо-сомоподобного контакта, Щ К - размер щелевого контакта после действия препарата. * • р< 0,05

. Б .

! мс

Рис.15. Ответы МН на парную стимуляцию на фоне аппликации фаллоидина. А - контрольный препарат, Б - препарат, обработанный фаллоидином. Точкой показано начало стимула.

результаты всех опытов, усиление ответа на второй стимул после аппликации фаллоидина составило около 80%. Эти результаты мы рассматриваем как факт усиления электротонической проводимости смешанных синапсов, вызванного специфическим и избирательным воздействием дополнительной полимеризации актина.

Аппликация фаллоидина на МН вызывала изменения структуры как ДПК, так и ЩК. Примембранные уплотнения в ДПК становились более однородными по ширине. Большая часть ЩК была опушена волокнистым материалом, вероятно, актином, поскольку эта опушенность была продолжением - фибриллярного материала соседствующих с ним ДПК. После обработки фаллоидином число мостиков в щели возрастало. В ряде случаев можно было видеть большое число часто расположенных мостиков.

Результаты морфометрического анализа показали (рис. 16), что аппликация фаллоидина вызывала достоверное увеличение суммарной длины и числа ЩК (в среднем на 27% и 24% соответственно). Сходство абсолютных величин говорит в пользу того, что общая протяженность ЩК в синапсе растет за счет увеличения их числа. Росла также суммарная протяженность и число ДПК (в среднем на 35% и 16%) по сравнению с контролем. Последнее свидетельствует о том, что растет не только число, но и длина индивидуальных сечений. То есть, она приращивается с полимеризацией актина, что соответствует нашему предположению об актиновой природе ДПК, которые с целью идентификации состава ранее не исследовались. Коррелятивно увеличению электропроводности увеличивалось также число мостиков в щели ДПК примерно в 2 раза (рис.16).

Рис. 16. Изменение размеров щелевых контактов (ЩК), десмосомоло-добных контактов (ДПК) и мостиков в зависимости от функционального состояния.

К - контроль (100%), ДП -длительная потенциация, Ф- фаллоидин. *р<0.01

Цитохимическое

исследованиелокализацииактина в областиДПК химическихи смешанныхсинапсов МН.

Чтобы прямо ответить на вопрос, входит ли актин в состав ДПК смешанных синапсов и какова природа мостиков в щели, нами были проведены специальные цитохимические исследования. С помощью маркера фаллоидин-коллоидное золото для выявления Ф-актина в ультратонких срезах МН мы показали, что филаментный актин локализован в примембранных уплотнениях ДПК как химического синапса, актиновая природа которого установлена (Star et al., 2001)(рис. 17.А), так и смешанного (рис.17,Б). В ДПК смешанных синапсов метка

Рис.17. Выявлениет Ф-акгина комплексом фаллоидин - золото в химическом (А) и смешанном (Б) синапсах. Стрелкой отмечена метка в щели ДПК.

обнаруживалась не только в примембранных уплотнениях, но также в синаптической щели в месте расположения мостиков, что являлось существенным для нашего исследования. Результаты наглядно и убедительно свидетельствовали о том, что примембранные уплотнения и мостики в щели десмосомоподобных контактов смешанных синапсов МН содержат актин.

Изучение динамики изменения фибриллярныхмостиков в щели ДПК смешанныхсинапсов приДП.

Целью следующих наших экспериментов стало сравнительное изучение структуры мостиков в щели ДПК смешанных синапсов МН в норме и после тетанической стимуляции, приводящей к долговременной потенциации электротонической проводимости этих синапсов. Было показано, что структура и характер распределения мостиков в пределах щели ДПК при длительной инкубации (контроль) не отличались от тех, что мы наблюдали в интактных синапсах. После тетанизации структура мостиков несколько менялась. Часто встречались сдвоенные мостики, общая ширина которых превышала толщину мембраны в два и более раза. Важным результатом этого исследования было то, что, во-первых, количество мостиков увеличивалось после возникновения ДП по сравнению с контролем, и, во-вторых, изменение числа мостиков хорошо коррелировало с увеличением электротонической проводимости синапсов. С ростом уровня ДП с 74% до 90% число мостиков в щели ДПК возрастало соответственно в 2 и 3 раз по сравнению с контролем (рис. 18).

На основании комплексного анализа результатов, полученных при изучении числа мостиков в щели ДПК в условиях увеличении электротонической проводимости смешанных синапсов, индуцированном фаллоидином или тетанизацией, а также с учетом того, что в состав мостиков входит актин, мы высказали следующее предположение. По-видимому, формирование мостиков как после аппликации фаллоидина, так и после тетанизации, связано с дополнительной полимеризацией актина Представляет ли мостик отдельную фибриллу актина (одиночную или сдвоенную) или канал, в котором актин расположен как в нанотрубочках (Wilson-Kubalek et al., 1998) или в плазмодесмах (Ding, 1997), пока остается неизвестным.

Цитохимическоеисследованиераспределенияионов кальция

в смешанныхсинапсахМН: а)в норме и б) при модификацияхфункции, вызванныхестественными стимуляциями или аппликацией веществ, изменяющихпроводимость ЩК.

Перестройка структуры ДПК при изменении электротонической проводимости смешанных синапсов МН послужили основанием для предположения, что ДПК совместно со ЩК в определенных условиях могут реципрокно выполнять функцию электротонической межнейронной связи. Она может осуществляться с помощью мостиков, своеобразных электротонических шунтов в этих типах межклеточных контактов. Поэтому логичным было проверить существование такого дублирования функции ЩК другим контактом, расположенным рядом в том же синапсе и анатомически связанным с ним. Мы использовали возможность активации или, наоборот, блокады ЩК в МН с помощью воздействия соответствующих веществ и изучения последствий эффектов на ультраструктуру синапсов.

К АД X ДП1ДП2

Рис.18. Изменение числа мостиков в в пересчете на длину отдельной ДПК в условиях повышения электротонической проводимости смешанного синапса: К-контроль, АД-адаптация, ДП1-лотенциация 74%, ДП2 -потенциация 90%. *-р<0.01

Изучение воздействий модуляторов проводимости ЩК на ультраструктуру смешанных синапсов позволили 8 определенной мере прояснить этот вопрос. Были изучены эффекты дофамина, экдизонз и хлорпромазина, известных препаратов, изменяющих функцию ЩК (Berdan, Caveney, 1985; Pereda et al., 1992) на ультраструктуру смешанных синапсов.

Аппликация дофамина на МН, по электрофизиологическим данным усиливающего электропроводность смешанных синапсов (Pereda et al., 1992; 2003), приводила к заметному изменению структуры ДПК. Они приобретали выраженно волокнистую структуру, а мостики в щели ДПК становились обязательным компонентом большинства таких структур. ЩК тоже изменялись благодаря опушенности фибриллярным материалом.

Морфометрический анализ показал, что длина отдельного профиля ДПК возрастала на 24% по сравнению с контролем (рис 19.А), длина ЩК оставалась неизменной, а длина A3 увеличивалась почти на 59%.

Аппликация экдизона, который тоже, по литературным данным, увеличивает проницаемость и электропроводность щелевых контактов, не влияла на структуру ДПК и ЩК по сравнению с контролем. Морфометрический анализ длин сечений специализированных контактов после действия экдизона на смешанные синапсы МН выявил увеличение размеров индивидуальных профилей ЩК на 27% по сравнению с контролем, в то время как протяженность профилей ДПК от действия этого препарата не менялась (рис. 19.Б).

Аппликация хлорпромазина, по литературным данным снижающего электропроводность ЩК, приводила к потере осмиофильности ДПК за счет исчезновения волокнистого материала, а изменения в структуре ЩК по сравнению с контролем были практически незаметны.

Количественный анализ выявил увеличение длины индивидуальных ДПК после действия хлорпромазина на 21% и увеличение протяженности индивидуальных сечений ЩК на 27% по сравнению с контролем, что было неожиданным (рис.19,Б).

Опушенный вид ДПК и ЩК, напоминающий эффект аппликации фаллоидина, при воздействии дофамина, но не после действия экдизона (хотя оба препарата увеличивают проводимость ЩК), дало основание предположить вовлечение актина в такое структурообразование. Для проверки этого мы провели эксперименты по взаимодействию дофамина, экдизона и хлопромазина с выделенным хроматографически гомогенным актином.

Полученные в этих экспериментах In vitro результаты полностью согласуются с данными, полученными при действии этих веществ на смешанные синапсы In vivo. Так, экдизон практически не полимеризовал Г-актин. Хлорпромззин предотвращал полимеризацию Г-актина даже в присутствии 100мМ KCI в течение Зч инкубации. Взаимодействие дофамина с мономерным актином в условиях, исключающих самопроизвольную полимеризацию Г-актина, приводило к потной трансформации глобулярного актина в фибриллы, по своей структуре не отличающиеся от полимерного актина, образованного взаимодействием с фаллоидином или высокой концентрацией KCI.

Рис.19. Эффект действия дофамина (А) и экдизона, хлорлромазина (Б) на размеры специализированных контактов смешанных синапсов по отношению к контролю (100%). К-контроль, ДПК-десмосомоподобные контакты (п=117), ЩК-щелевые контакты (п=84), А3 • активные зоны (п=66). *-р<0.05, гимсло измеренных параметров

Рис.20. Осадок пироантимоната кальция в щелевом контакте смешанного синапса при даптации.Ув.75000

Таким образом, эффект веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов, обусловлен не только их влиянием на коннексоны, но и на филаментный актин десмосомоподобных контактов. Результаты показывают, что при воздействии дофамина и хлопромазина актин также вовлекается в функцию синапсов, а при действии экдизона усиливается проводимость только через ЩК без участия актина.

Цель дальнейших экспериментов состояла в изучении ультраструктурной локализации ионов кальция в смешанных синапсах МН на разном уровне их функциональной активности. Мы предположили, что этот тест наиболее адекватно по ультраструктурным критериям может свидетельствовать об злектротонической коммуникации через ЩК.

При изучении ультраструктуры смешанных синапсов в интактных препаратах после обработки МН пироантимонатом калия ионы кальция не выявлялись. Такой же результат был получен при использовании разных условий контрастирования препарата.

После длительной стимуляции, приводящей к утомлению МН, наблюдали появление отчетливой контрастной осмиофильной полоски преципитата в щели ЩК. Это свидетельствовало о значительном повышении концентрации ионов кальция в этой узкой, ограниченной двумя мембранами, области.

В смешанных синапсах адаптированных МН интенсивный преципитат непрерывным слоем выстилал щели всех ЩК, попадающих в плоскость среза (рис. 20).

В зависимости от функционального состояния МН изменялся также контраст мостиков в щели ДПК смешанных синапсов. В интактном состоянии на фибриллярных мостиках осадок отсутствовал.

При утомлении росла гетерогенность контраста щели ДПК полностью электронно-прозрачных (Афонин, Павлик 1990), пироантимоната не контрастировались.

В смешанных синапсах адаптированных МН ширина мостиков и их контраст возрастали (рис. 21), что можно было объяснить окрашиванием фибриллярного материала мостика зернами преципитата. Помимо полностью окрашенных зернами осадка, встречались неконтрастированные мостики.

На наш взгляд представляется существенным наличие интенсивного осадка по всей протяженности щели ЩК при утомлении и адаптации. Вполне вероятно, что локальная концентрация ионов кальция при этом достигает значений 200 мкМ, при которой блокируется электротоническое проведение (Baux, Simonneau, 1978; Zhang et al., 1998). Одновременно усиливается контраст мостиков в щели ДПК ионами кальция. Согласно ультраструктурным данным, представленным в нашей работе, окрашивание мостиков в щели ДПК смешанных синапсов МН осадком пироантимоната кальция означает, что мостики проявляли кабельные электротонические свойства, то есть мостики (шунты) закорачивали контакт.

Полученные данные позволяют предположить, что в экстремальных условиях, связанных с угнетением синаптической функции в результате повторяющихся интенсивных активаций

в интактном состоянии но мостики осадком

Рис.21. Осадок пироантимоната кальция в щели ДПК на мостиках (стрелка) при адаптации.

сенсорных входов, когда невозможно проведение сигнала через ЩК, эту функцию могут выполнять мостики ДПК. Тем самым поддерживается гомеостаз возбуждения МН через смешанные синапсы, что дает возможность осуществлять в экстремальных условиях жизненно важные поведенческие реакции. С другой стороны этот факт дал возможность предположить, что ДПК смешанных синапсов ломимо адгезивной функции могут выполнять и коммуникационную функцию - передавать электротонический сигнал, как и ЩК. В определенных условиях эти два вида контактов могут сообща отвечать за электротоническую проницаемость. Например, в адаптированных и стимулированных МН присутствуют признаки электрокоммуникации и через некоторые ЩК и через некоторые (не все) мостики. То есть, видны признаки реципрокности функционирования тех и других.

О проницаемости ЩК и ДПК для электротонического сигнала можно судить также по распределению осадка пироантимоната в них после воздействия модуляторов проницаемости ЩК.

.Лл

' ЧУ« ■ ■ «. -г V1 *

Шт*т

V ^

Г'- у

'""^кз«-

Рис.22. Упьтраструкгура щелевых контактов

смешанных синапсов при выявлении ионов кальция: А-в контрольном препарате, Б-после действия эедизона (осадок с постсинаптической стороны контакта) и В - после действия хлорпромазина (осадок в щели и с обеих сторон контакта). Ц- цитоплазмами, С - пресинаптическая часть.

Исследование локализации пироантимоната кальция в смешанных синапсах МН после аппликации на них веществ, изменяющих эффективность ЩК, показало, что 8 контроле в щели ЩК осадок пироантимоната кальция не обнаруживался (рис. 22, А).

Действие экдизона, повышающего проницаемость ЩК, выражалось в значительном усилении контраста постсинаптической области ЩК, что делало контакты асимметричными (рис. 22,Б). После действия хлорпромазина, препарата, который снижает проницаемость ЩК, преципитаты интенсивно выстилают щель ЩК, а также обе его поверхности со стороны пре- и постсинаптической цитоплазмы (рис 22.В). Во всех вышеописанных случаях отмечалось неспецифическое усиление преципитации в щели ДПК, но не на мостиках. Оно было вызвано, по нашим данным, только влиянием физраствора, растворителя этих препаратов.

Таким образом, комплексные морфофункциональные и цитохимические исследования механизмов пластичности смешанных синапсов МН показывают, что усиление электротонической передачи через ДПК, опосредованное актином, сопряжено с одновременной блокадой проводимости ЩК из-за повышения концентрации ионов кальция в их щели. Наши данные свидетельствуют о существовании реципрокности изменений функции этих двух видов специализированных синаптических контактов.

Исследование участия длительной потенциации смешанных синапсов в естественной модификации функции МН.

Вопрос о соотношении модельной и естественной памяти - важнейший в нейробиологии (Stevens, 1999). Его нерешенность до сих пор показывает сложность проблемы, если учесть огромное количество работ, посвященных раздельному изучению этих форм нейрональной памяти.

Следующая серия экспериментов была направлена на изучение смешанных синапсов МН в условиях адаптации, естественно выработанной модификации функции, которая проявлялась в поведении рыбок как резистентность к утомительной стимуляции (рис.2). Цель состояла в обнаружении в синапсах специфических ультраструктурных признаков, характерных для модельной формы синаптической памяти - лосттетанической потенциации. Хотя ультраструктура

специализированных контактов химических

синапсов интактных и адаптированных МН

достаточно подробно описана ранее (Мошков, 1985), структура

специализированных контактов смешанных

синапсов с этих позиций до сих пор не была изучена.

Тонкая структура

смешанных синапсов в норме и при адаптации в основном была сходной. Правда, смешанные синапсы

интактных и адаптированных МН отличались лучшей сохранностью контактов и симметричностью плотного фибриллярного материала с пре - и лостсинаптических сторон ДПК и мостиков в их щели (рис. 23) по сравнению с синапсами МН, которые подвергались длительной инкубации. В ДПК смешанных синапсов адаптированных МН иногда встречались сдвоенные мостики, и их диаметр в этом случае, как и при ДП, увеличивался вдвое по сравнению с контролем. Число мостиков в смешанных синапсах адаптированных МН, как показывает морфометрический анализ, росло в два раза по сравнению с контролем (в интактных препаратах 1-2 мостика на один ДПК). Существенно, что значения этих параметров смешанных синапсов МН при адаптации и потенциации совпадают.

Таким образом, по ультраструктурным данным смешанные синапсы адаптированных МН идентичны потенциированным.

Одновременная оценка ультраструктуры химических синапсов МН при адаптации выявила уменьшение размеров активных зон и реципрокное увеличение протяженности ДПК в 1,5 раза. Как известно эта перестройка является структурным признаком адаптации (Мошков, 1985), поэтому может служить структурным показателем того, что изучаемые нами нейроны находились в адаптированном состоянии. С другой стороны, уменьшение размеров A3 является признаком депрессии химической передачи в этих синапсах (Bailey, Chen, 1983; Тирас и др., 2002). Сравнивая поведение синапсов в разных опытах, можно заметить, что потенциация смешанных синапсов одновременно сопровождается структурными признаками депрессии в других синапсах. С другой стороны, адаптация, центральным механизмом которой определена длительная депрессия химических синапсов (Мошков, 1985; Тирас и др.,

Рис.23. Мостики (стрелки) в щели ДПК смешанных синапсов при потенциации (А) и адаптации (Б). Масштаб 0.1 мкм

2002), одновременно характеризуется признаком длительной потенциации в смешанных синапсах. Такая же картина недавно продемонстрирована с помощью электрофизиологических методов в ограниченном объеме нервной ткани коры (Royer, Pare,

2003). Наблюдаемая реципрокность перестройки двух разных входов на одном и том же нейроне, лежит, по нашему мнению, в основе сохранения устойчивости нейронов в широко изменяющихся условиях окружающей среды. При этом нейроны сохраняют способность к дальнейшему приспособлению и проявлению пластичности. Такая взаимная регуляция, имеющая в своей основе одинаковую изменчивость ДПК, актинсодержащих контактов, но в зависимости от синапса противоположную по значимости, предполагает, что нейрональный актиновый цитоскелет способен к интеграции разных по модальности входов. Эта интеграция направлена на стабилизацию нейрональной функции и предохранение ее от патологии, неизбежной при существовании только одной из форм пластичности, усилении или ослаблении функции синапсов (Abbot, Nelson, 2003).

Заключение

Наши многолетние исследования ультраструктурных аспектов адаптации и памяти, результаты которых описаны в настоящей работе, позволяют ответить на ряд важнейших вопросов нейробиологии.

1. Возникновение памятного следа в нервной системе обязательно сопровождается специфическими структурными изменениями в нейронах и синапсах, которые позволяют достаточно надежно диагностировать некоторые функциональные и патологические изменения, происходящие в мозге. Так, нами установлены структурные следы памяти в виде наиболее известных ее форм - длительной потенциации, некоторых видов депрессии, а также утомления. Важнейшим выводом работы является то, что основой этих перестроек и их исполнительным элементом является нейрональный актин. Этот белок, наиболее представленный из всех белков нейрона (до 10-15% сухого веса), обладает важными свойствами. Он легко полимеризуется и трудно деполимеризуется под воздействием различных ионов, кардинально меняя при этом свои свойства. Поэтому благодаря простой реакции полимеризации-деполимеризации актин может управлять определенными процессами в строго ограниченных локусах клетки и выполнять, таким образом, роль элементарного памятного следа, субстратом которого служит полимерная трудно растворимая молекула. Образование совокупности таких полимерных молекул под воздействием факторов внешней или внутренней среды может комплексно и уже более заметно влиять на функциональное состояние клетки в целом. Такие ансамбли уже можно визуализировать и идентифицировать под микроскопом, в то время как мономерный актин невидим. По этому признаку можно диагностировать измененное состояние клетки. Это наглядно продемонстрировано в нашей работе.

2. Естественная модификация функции мозга, которую можно рассматривать как возникающий вследствие обучения (тренировок) памятный след, сопровождается такими же структурными изменениями в инициирующих эту модификацию нейронах, как и модельная форма памяти, вызванная экспериментальным путем.

3. Становятся понятными трудности в обнаружении следов модельных форм памяти в естественной модификации поведения. По нашим данным одновременное усиление проводимости в одних синапсах, обусловленное возникновением естественной памяти (в результате тренировок) или модельной ее формы (в результате тетанической стимуляции), в других синапсах того же нейрона сопровождается снижением проводимости. И наоборот, индукция снижения проводимости одних синапсов вызывает усиление проводимости в других. Это свойство афферентных синапсов, по-видимому, помогает нейронам сохранять гомеостаз возбуждения и оставаться стабильными в широко изменяющихся условиях окружения. В то же время это позволяет нейронам приобретать новую информацию и сохранять полученную.

4. Нами показано, какой из клеточных органоидов нейрона является исполнительным и одновременно интегрирующим звеном, который модулирует влияние внешней стимуляции на разные синапсы одного и того же нейрона, приводя одни синапсы в потенциированное, а другие - в депрессированное состояние, чтобы сохранить функцию нейрона стабильной независимо от условий среды. Такую функцию выполняет цитоскелет, и по нашим данным, его актиновый компонент. Реакция его на воздействия, сопряженная или проявляющаяся в виде изменений в различных синапсах, по видимому, отражает его общее изменение в объеме всего нейрона. Она одинакова с точки зрения изменения ДПК, производных актинового цитоскелета в синаптических контактах. В принципе актин или полимеризуется или деполимеризуется под воздействием повторяющихся стимуляций. Но в зависимости от структурной организации синапса последствия полимеризации актина в районе ДПК в одних случаях проявляются как депрессия (химические синапсы), а в других - ках потенциация (смешанные синапсы).

5. Пути целенаправленного воздействия на процессы адаптации и памяти с помощью физиологически активных веществ могут включать избирательное действие на нейрональный цитоскелет, а через него на производные цитоскелета в виде контактных специализированных структур. Дофамин, известный медиатор, недостаточность которого в мозге вызывает целый ряд нейрональных болезней, как оказалось, способен изменять состояние нейронального актина, стабилизировать функцию нейронов благодаря полимеризации. Скрининг препаратов, уже применяемых в медицине, с целью обнаружения среди них таких, которые могут прямо взаимодействовать с актином, поиск новых веществ цитоскелетного действия и применение их в медицинской практике поможет в профилактике и лечении нейрональных болезней, коррекции уже возникших нарушений. В комплексе с уже зарекомендовавшими себя подходами это расширит возможности диагностики и лечения ментальных болезней.

Все вкратце вышесказанное показывает, что понимание некоторых процессов саморегуляции функции в мозге при адаптации, обучении и памяти, открывает новые исследовательские направления, перспективные для дальнейшей разработки.

Выводы

1. Сравнительное изучение морфофункциональных свойств Маутнеровских нейронов золотых рыбок после повторяющихся естественных стимуляций и аппликации фаллоидина и цитохалазина D показало, что актиновый компонент цитоскелета вовлекается в формирование адаптивного изменения функционального состояния.

2. Разработан подход к электрофизиологическим исследованиям Маутнеровских нейронов в переживающих срезах продолговатого мозга в условиях in vitro. Это позволило применить электронную микроскопию для исследования структурных изменений, сопровождающих изменения функционального состояния МН.

3. Впервые показана возможность морфофункциональных исследований синаптической пластичности Маутнеровских нейронов золотых рыбок в условиях длительного переживания срезов продолговатого мозга. Установлено, что в этих условиях в Маутнеровских нейронах индуцируется длительная потенциация и длительная депрессия, по электрофизиологическим критериям идентичные тем, которые продемонстрированы ранее в условиях in vivo.

4. Установлены ультраструктурные признаки длительной потенциации злектротонической связи в смешанных синапсах Маутнеровских нейронов -увеличение размеров десмосомоподобных контактов, которое хорошо коррелирует со степенью потенциации. Одновременно показано, что щелевые контакты структурно не менялись. Таким образом, определены ультраструктурные признаки усиления электротонической проводимости смешанных синапсов.

5. Изучена структура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов, функция которых ранее была неизвестной. Наглядно показано, что они отличаются от десмосомоподобных контактов химических синапсов наличием в щели фибриллярных мостиков, число которых увеличивалось после тетанизации и хорошо коррелировало со степенью проводимости синапса.

6. Цитохимическими исследованиями смешанных синапсов с помощью метки на актин доказана актиновая природа, как самих мостиков, так и филаментных примембранных уплотнений по обе стороны десмосомоподобных контактов. Это дало основание предположить участие актина в передаче электротонического транссинаптического сигнала.

7. Биофизическими и ультраструктурными исследованиями взаимодействия Ф-актина с искусственными фосфолипидными мембранами показано, что актин создает ярко выраженную катионную проводимость, пронизывая при этом билипидный слой. Такие данные предполагают участие Ф-актина в электротонической коммуникации не только внутри клетки, как считали ранее, но также и между клетками.

8. Цитохимическое изучение локализации ионов кальция показало, что при усилении проводимости смешанных синапсов кальций адсорбируется на мостиках десмосомоподобных контактов. Применение модуляторов проницаемости щелевых контактов позволило определить, что при усилении электротонической связи через десмосомоподобные контакты проводимость щелевых контактов по ультраструктурным данным блокируется.

9. Комплексные данные о структуре и функции десмосомоподобных контактов смешанных синапсов позволяют отнести их к ранее неизвестной разновидности межклеточных контактов, которые выполняют одновременно, адгезионную (механическую) и коммуникационную (передаточную) функции.

10. Морфофункциональными исследованиями впервые показано, что специфическим структурным признаком длительной потенциации шипиковых синапсов гиппокампа морских свинок, вызванной тетанизацией или увеличением концентрации ионов -кальция в среде, является перестройка шипикового актинового цитоскелета с формированием пучков актиновых волокон вместо рыхлой сети в контроле. Предлагается гипотеза о вовлечении известных кабельных механохимических и электротонических свойств актина в изменение электрических свойств шипиков за счет устойчивого сдвига ионного баланса между компартментом шипика и дендроплазмой.

Список публикаций по теме диссертации

1. Мошков ДА, Павлик Л.Л., Отмахов НА Изучение актина синапсов переживающих срезов гиппокампа при долговременной потенциации. Цитология, 1988, т. 30, №3, с. 259267.

2. Афонин Ю.Н., Павлик ЛЛ. Локализация ионов кальция в перикарионе и синапсах Маутнеровских нейронов. В сб.: Ультраструктура и пластичность нейронов. Пущино, 1990, под. ред. Мошкова ДА. с.69-73.

3. Тирас Н.Р., Павлик Л.Л., Мошков ДА Выявление актина и особенности организации цитоскелета Маутнеровского нейрона золотой рыбки. Цитология, 1990, т. 32, №4, с. 352358.

4. Павлик Л.Л., Пахотин П.И., Мошков Д.А. Влияние длительной гипотермии на структуру и функцию нейронов переживающих срезов гиппокампа морской свинки и суслика. Цитология, 1991, т. 33, №3, с. 23-29.

5. Moshkov DA, Pavlik L.L Actin in synaptic cytoskeleton during long-term potentiation in hippocampal slices. Ada histochemica. Suppl. 1992, v.41, p. 249-256.

6. Гусарук Л.Р., Павлик ЛЛ.. Мошков Д.А., Шурыгин А.Я. Функционально- структурные особенности нейронов в культивируемых эксплантатах коры головного мозга крыс, подвергнутых иммобилизационно-холодовому стрессу в пренатальный период развития. Цитология, 1995, т.37, №7, с.579-585.

7. Павлик-ЛЛ., Цыганова В.Г., Павлик В.Д., Мошков ДА. Изучение ультраструктуры нейронов гиппокампа мышей, подвергнутых тепловому воздействию. Цитология, 1996, т.

38. №6, с.571-577.

8. Мошков ДА, Тирас Н.Р., Павлик Л.Л., Мухтасимова Н.Ф.. Ультраструктура Маутнеровсш нейронов в переживающем продолговатом мозге золотых рыбок. Морфология, 1996, т. 38, №4, с.56-59.

9. Павлик ЛЛ., Тирас Н.Р., Пахотин ПА, Мухтасимова Н.Ф., Мошков Д.А. Индукция и длительное сохранение потенциации ответов Маутнеровских нейронов золотой рыбки во фрагментах продолговатого мозга, инкубируемых in vitro. Цитология, 1997, т. 39, №7, с. 541-545.

10. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Шодина И.Б., Мошков Д.А. Изменения актинового цитоскелета Маутнеровских нейронов золотой рыбки после длительной стимуляции. Цитология, 1997, т. 39, №7, с. 546-551.

11. Павлик Лл., Тирас Н.Р., Мошков ДА Актин в Маутнеровских нейронах золотых рыбок последействия фаллоидина и адаптации к длительной стимуляции. Цитология, 1997, т.

39, №12, с. 1109-1115.

12. Moshkov DA, Tiras N.R., Pavlik LL, Mukhtasimova N.F. infrastructure of Mauthner cell in the survival goldfish hindbrain. Neurisd. Behav. Physiol., 1997, v.27 (5), p. 56-59.

13. Мошков ДА, Тирас HP., Павлик ЛЛ., Мухтасимова Н.Ф., Пахотин ПА. Долговременная потенциация злектротонических ответов маутнеровских нейронов в инкубированных фрагментах продолговатого мозга золотых рыбок сопровождается ультраструктурными изменениями афферентных смешанных синапсов. Морфология, 1998, т. 112, №1, с. 7277.

14. Павлик Л Л., Тирас Н.Р., Мошков ДА Экспериментально вызванная деполимеризация актина разрушает адаптивное состояние нейрона. Морфология, 1998, т. 114, №4, с. 2427.

15. Пахотин П.И., Павлик ЛЛ., Пахотина И.Д., Андреев АА Структурно-функциональная стабильность срезов гиппокампа после краткой обработки ингибиторами циклооксигеназ. Морфология, 1998, т. 112, №1.

16. Мошков ДА, Мухтасимова Н.Ф., Павлик Л Л., Тирас Н.Р. Длительная инкубация in vitro фрагментов продолговатого мозга с маутнеровскими нейронами сопряжена с изменениями специализированных контактов в афферентных смешанных синапсах. Цитология, 1998, т. 40. №4, с. 260-265.

17. Moshkov D.A., Mukhtasimova N.F., Pavlik LL, Tiras N.R., Pakhotina I.D. In vitro electronic responses of goldfish Mauthner cells is accompanied by ultrastructural changes at mixed synapses. Neuroscience, 1998, v. 88 (3), p. 591-605.

18. Григорьев ПА, Тараховский Ю.С., Павлик Л.Л., Мухтэсимова Н.Ф., Удальцов С.Н., Мошков ДА, Иваницкий Г.Р. Взаимодействие Ф-актина с искусственными фосфолипидными мембранами. ДАН, 1999. т. 366, №5, с. 695-698.

19. Павлик Л Л., Тирас Н.Р., Пахотин П.И., Мошков ДА. Влияние цитохалазина Д на структуру смешанных синапсов и их электротоническую проводимость. Цитология, 1999, т.41, №7,с.590-597.

20. Pavlik LL, Tiras N.R., Moshkov D.A. Experimentally induced actin depolymerization disrupts the adaptive state of neurons. Neurosci. Behav. Physiol., 1999, v. 29 (4), p. 423-9.

21. Pakhotin PI, Pavlik LL, Pakhotina I.D., Andreev A.A. long-term morphofunctional survival of quinea pig hippocampal slices after brief treatment with cyclooxigenase inhibitors. Neurosci. Behav. Physiol., 1999, v.29 (5), p.595-8.

22. Moshkov DA Tiras N.R., Pavlik LL.Mukhtasimova N.F., Pakhotina I.D. Ultrastructura! changes in afferent mixed synapses in conditions of long-term potentiation of electronic responses on Mauhtner neurons in incubated fragments of the goldfish medulla oblongata. Neurosci. Behav. Physiol., 1999, v. 29 (3), p. 237-41.

23. Grigoriev PA, Tarahovsky Yu.S., Pavlik L.L, Udaltsov S.N., Moshkov D.A. Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranrs. 1UBMB Life, 2000, v. 50, p. 227-233.

24. Мошков Д.А. Тирас Н.Р., Павлик ЛД Мухтасимова Н.Ф., Михеева И.Б. и Дзебан ДА Структурные различия между десмосомоподобными контактами в афферентных химических и смешанных синапсах Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2001, т. 120, №4, с. 30-35.

25. Павлик ЛЛ., Тирас Н.Р., Мухтасимова Н.Ф., Пахотин П.И., Дзебан ДА Мошков ДА Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2003, т. 123, №1, с. 41-47.

26. Дзебан ДА, Мухтасимова Н.Ф., Павлик ЛЛ, Мошков Д.А. Ультраструктура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов Маутнеровских нейронов при долговременной потенциации. Морфология, 2003, т. 123, №2, с. 33-38.

27. Мошков ДА, Безгина Е.Н., Павлик ЛЛ, Мухтасимова Н.Ф., Мавлютов ТА Распределение ионов кальция в смешанных синапсах Маутнеровских нейронов золотой рыбки в норме, при утомлении и при адаптации к нему. Морфология, 2003, т. 124, №6, с. 41-46.

28. Д. А. Мошков, Л. Л. Павлик, Н.Р. Тирас, Д. А. Дзебан, И.Б. Михеева.- Признаки длительной потенциации 8 ультраструктуре афферентных смешанных синапсов маутнеровских нейронов при естественной модификации поведения. Нейрофизиология, 2003, т. 35, №3, с. 186-196.

29. Мошков Д.А., Павлик ЛЛ. Ультраструктурные исследования механизмов долговременной потенциации синаптической передачи. ЖВНД, 2004, т. 54, №1, с. 42-56.

30. Павлик ЛЛ, Безгина Е.Н., Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков ДА Влияние веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов," на структуру смешанных синапсов Маутнеровских нейронов. Морфология, 2004, принята к печати.

31. Павлик Л Л., Безгина Е.Н., Дзебан ДА, Мошков ДА Локализация пироантимоната кальция в смешанных синапсах Маутнеровских нейронов при действии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов. Морфология, 2004, принята к печати.

Работа поддержана фантами (Фонда Сороса JCD-100, РФФИ 96-04-50617, 98-0448021,01-04-48053).

Подписано в печать 03.04.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 2.0 пл. Тираж 800 экз. Заказ № 64 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

1- 74 8 8

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Павлик, Любовь Леоновна

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Поиски ультраструктурных признаков измененного функционального состояния синаптической передачи.

1.2. Изучение структуры шипикового аппарата и его возможной роли в длительной потенциации.

1.3. Исследование участия актина в стабилизации шипиковых синапсов.

1.3.1. Место актина в индукции и поддержании длительной потенциации.

1.3.2. Современные представления о структуре и свойствах актина.

1.3.3. Изучение локализации актина в постсинаптических уплотнениях синапсов.

1.3.4. Изучение роли актина в структуре и функции смешанных синапсов. Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки.

Глава 2. Материалы и методика.

Глава 3. Результаты.

Определение вовлеченности и места актина в адаптации и памяти на нейрональном уровне.

3.1. Визуализация актина в Маутнеровских нейронах золотой рыбки в условиях нормы и утомления.

3.1.1. Состояние МН в условиях нормы.

3.1.2. Изменение актинового цитоскелета МН после длительной стимуляции.

3.1.3. Изменение актинового цитоскелета МН, адаптированных к утомительной, стимуляции.

3.2. Определение по эффекту цитохалазина D вовлеченности актинового цитоскелета в функциональные перестройки МН.

3.3. Определение по эффекту фаллоидина участия актинового цитоскелета МН в резистентности к утомительной стимуляции.

Глава 4. Выявление роли актина в индукции и сохранении длительной потенциации как модельной формы памяти.

4.1. Исследование участия актина в создании длительной потенциации шипиковых синапсов поля САЗ гиппокампа морских свинок.

4.2. Исследование вовлечения актина в индукцию и длительное сохранение потенциации смешанных синапсов МН.

4.2Л. МН как модель для изучения пластических свойств смешанных синапсов в условиях in vitro.

4.2.1.1. Исследование морфофункциональных перестроек смешанных синапсов Маутнеровских нейронов в переживающих срезах.

4.2.1.2.Морфофункциональные исследования смешанных синапсов при -потенциации.

4.2.2. Сравнительный морфометрический анализ смешанных синапсов в инкубированных срезах и при длительной потенциации.

4.2.3. Изучение вовлечения актина в создание и поддержание длительной потенциации электротонической связи в смешанных синапсах МН.

4.2.4. Исследование взаимодействия филаментного актина с искусственными фосфолипидными мембранами.

4.2.5. Изучение структурных различий между десмосомоподобными контактами (ДПК) афферентных химических и смешанных синапсов МН.

4.2.6. Анализ вовлечения актина в построение фибриллярных мостиков по функциональному эффекту на МН биологически активных веществ, изменяющих состояние актина.

4.2.6.1. Изучение влияния на структуру и функцию МН цитохалазинаБ.

4.2.6.2. Изучение влияния аппликации фаллоидина на структуру и функцию МН.

4.2.7. Цитохимическое доказательство актиновой природы примембранных уплотнений ДПК и мостиков в щели ДПК.

4.2.8. Изучение тонкой структуры ДПК смешанных синапсов МН при длительной потенциации.

4.2.9. Цитохимические исследования электротонической проводимости смешанных синапсов МН через щелевые контакты (ЩК) и ДПК.

4.2.9.1.Распределение ионов кальция при изменении проводимости смешанных синапсов.

4.2.9.2.Ультраструктурное исследование модификации синаптической передачи смешанных синапсов с помощью веществ - модуляторов функции щелевых контактов.

4.2.9.3.Влияние веществ - модуляторов проводимости щелевых контактов на перераспределение ионов кальция в смешанных синапсах МН.

Глава 5. Исследование участия длительной потенциации смешанных синапсов в естественно модифицированной функции МН.

Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ультраструктурные признаки измененного функционального состояния синаптической передачи"

Синаптическая пластичность относится к процессам, с помощью которых нейроны меняют свою структуру и функцию в ответ на целый ряд событий (Котляр, 1990). Эта фундаментальная характеристика нейронов может быть главным механизмом, с помощью которого животные обучаются и адаптируются к окружающим условиям существования (Deller, Froetsher, 1997). События, которые приводят к изменениям в ЦНС, могут быть вызваны экспериментально или измененными естественными условиями окружения, формируя одинаковый каскад морфофункциональных изменений в ответ на раздражающий стимул через набор универсальных механизмов-в-синапсах. Поэтому для расшифровки механизмов памяти используют целый ряд экспериментальных моделей, существенно упрощающих задачу. С момента открытия явления длительной потенциации (ДП) (Bliss,Lomo, 1973; Брагин, Виноградова, 1973) эта модель становится наиболее популярной для изучения физиологических механизмов, связанных с изменением поведения, наблюдаемым в: процессе обучения. Она, как полагают, тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды (Wickens, 1988; Calverley, Jones, 1990; Stevens, 1996). До последнего времени изучение ДП концентрировалось на синапсах, в которых передача сигнала опосредуется химическим веществом, медиатором (Bliss, Lomo, 1973;Брагин, Виноградова, 1973; Виноградова, 1975; Мошков, 1985; Pavlik, Moshkov, 1992; Gold, Bear, 1994; Stevens, Wang, 1994; Malenka, 1994; Stella et al., 1997; Enger, Bonhoffer, 1997). Кроме химической передачи в нервной системе животных широко распространены чисто электрический и смешанный типы синаптической передачи (Bennett, 2000). Последний тип передачи включает химический и электрический компоненты (Zottoli, 2000). Зависимость проводимости таких синапсов от предшествующей стимуляции и долговременное поддержание их в активированном состоянии до недавнего времени даже не предполагались. Однако относительно недавно с помощью электрофизиологических методов было показано, что смешанные синапсы Маутнеровских нейронов золотой рыбки в результате тетанической стимуляции или аппликации дофамина также способны облегчать проведение электротонического сигнала на значительный срок (Yang et al., 1990; Yang, Faber, 1992; Pereda et al., 1992,1994; Pereda ,Faber, 1995, 1996).

Электронная микроскопия как метод исследования является неотъемлемым звеном в изучении ДП и других экспериментальных форм синаптической памяти. Она внесла существенный вклад в понимание механизмов, лежащих в основе ДП химических синапсов (Yuste, Bonhoffer, 2001; Fiala et al., 2000; Capani et al:, 2002; Matus, 2003). Однако, структурные механизмы, которые определяют усиление электротонической связи между смешанными синапсами и постсинаптическим нейроном, остаются совершенно неизученными. Неизвестны и элементы синапсов, вовлекаемые в повышение проводимости электротонического сигнала. Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции эффективности функционирования смешанных синапсов необходимы комплексные морфофункциональные исследования механизмов ДП.

Одним из возможных подходов к исследованию структурных проявлений пластичности нейронов на клеточном уровне является проведение экспериментов на относительно просто организованных нейрональных системах с известной функцией и хорошо изученной морфологией. Таким критериям отвечают идентифицированные нейроны беспозвоночных и позвоночных животных.

Преимуществом для проведения исследований на идентифицированных нейронах является наибольшая адекватность применения электронно-микроскопических методов (Мошков, 1985). В случае с ДП электротонической передачи, впервые открытой именно на простой нейрональной системе, логика подсказывала начать морфологические исследования на этом же объекте. Представленные в данной работе результаты получены при изучении ультраструктуры двух относительно простых нейрональных систем: Маутнеровских нейронов низших позвоночных и нейронов гиппокампа млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в комплексном исследовании ультраструктурных механизмов, лежащих в основе долговременных модификаций функции нейронов в мозге низших и высших позвоночных, которые могут служить основой пластичности мозга. Центральными были вопросы, какие из структурных звеньев синапсов обусловливают специфические изменения эффективности синаптической передачи и каковы способы управления ими. Особое внимание уделяли участию актинового цитоскелета в этих процессах. Были поставлены задачи:

1) изучить в условиях in vivo вовлечение актина в пластические перестройки Маутнеровских нейронов (МН) золотых рыбок при изменениях их функции.

2) разработать методику исследования механизмов пластичности смешанных синапсов МН на фрагментах продолговатого мозга золотых рыбок in vitro.

3) исследовать участие актинового цитоскелета в длительной потенциации химических шипиковых синапсов гиппокампа и смешанных синапсов МН.

4) провести сравнительный анализ ультраструктуры специализированных контактов афферентных смешанных синапсов МН после возникновения в них ДП электротонической передачи.

5) изучить взаимосвязь между агрегатным состоянием актинового цитоскелета и электротонической проводимостью смешанных синапсов МН, используя для этого физиологически активные вещества, избирательно взаимодействующие с актином и модулирующие проводимость щелевых контактов.

6) использовать иммуноцитохимические метки для визуализации актина в специализированных синаптических контактах.

7) провести биофизические и ультраструктурные эксперименты на искусственных билипидных мембранах в условиях фиксации потенциала и на липосомах при взаимодействии с ними актина для изучения участия Ф-актина в трансмембранной электротонической проводимости.

8) изучить распределение ионов кальция в МН и смешанных синапсах после изменения их функционального состояния и после действия модуляторов проводимости щелевых контактов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Павлик, Любовь Леоновна

Выводы

1. Сравнительное изучение морфофункциональных свойств Маутнеровских нейронов золотых рыбок после повторяющихся естественных стимуляций ■ и аппликации фаллоидина и цитохалазина D показало, что актиновый; компонент цитоскелета вовлекается в формирование адаптивного изменения функционального состояния.

2. Разработан подход к электрофизиологическим исследованиям Маутнеровских нейронов в переживающих срезах продолговатого мозга в условиях in vitro. Это позволило применить электронную микроскопию для исследования структурных изменений, сопровождающих изменения функционального состояния МН.

3. Впервые показана возможность морфофункциональных исследований синаптической пластичности. Маутнеровских нейронов-золотых рыбок в условиях длительного переживания срезов, продолговатого мозга. Установлено, что в этих условиях в Маутнеровских нейронах индуцируется длительная потенциация и длительная депрессия, по электрофизиологическим критериям идентичные тем, которые продемонстрированы ранее в условиях in vivo.

4. Установлены ультраструктурные признаки длительной потенциации электротонической связи в смешанных синапсах Маутнеровских нейронов - увеличение размеров десмосомоподобных контактов, которое хорошо коррелирует со степенью потенциации. Одновременно показано, что щелевые контакты структурно не менялись. Таким образом, определены ультраструктурные признаки усиления электротонической проводимости смешанных синапсов.

5. Изучена структура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов, функция которых ранее была неизвестной. Наглядно показано, что они отличаются от десмосомоподобных контактов химических синапсов наличием в щели фибриллярных мостиков, число которых увеличивалось после тетанизации и хорошо коррелировало со степенью проводимости синапса.

6. Цитохимическими исследованиями смешанных синапсов- с помощью метки на актин доказана актиновая природа, как самих мостиков, так и филаментных примембранных уплотнений по обе стороны десмосомоподобных контактов. Это дало основание предположить участие актина в передаче электротонического транссинаптического сигнала.

7. Биофизическими и ультраструктурными исследованиями взаимодействия Ф-актина с искусственными фосфолипидными мембранами показано, что актин создает ярко выраженную катионную проводимость, пронизывая при этом билипидный слой. Такие данные предполагают участие Ф-актина в электротонической коммуникации не только внутри клетки, как считали ранее, но также и между клетками.

8. Цитохимическое изучение локализации ионов кальция показало, что при усилении проводимости смешанных синапсов кальций адсорбируется на мостиках десмосомоподобных контактов. Применение модуляторов проницаемости щелевых контактов позволило определить, что при: усилении электротонической связи через десмосомоподобные контакты проводимость щелевых контактов по ультраструктурным данным блокируется.

9. Комплексные данные о структуре и функции десмосомоподобных контактов смешанных синапсов позволяют отнести их к ранее неизвестной разновидности межклеточных контактов, которые выполняют одновременно адгезионную (механическую) и коммуникационную (передаточную) функции.

10. Морфофункциональными исследованиями впервые показано, что специфическим структурным признаком длительной потенциации шипиковых синапсов гиппокампа морских свинок, вызванной тетанизацией или увеличением концентрации ионов кальция в среде, является перестройка шипикового актинового цитоскелета с формированием пучков актиновых волокон вместо рыхлой сети в контроле. Предлагается гипотеза о вовлечении известных кабельных механохимических и электротонических свойств актина в изменение электрических свойств шипиков за счет устойчивого сдвига ионного баланса между компартментом шипика и дендроплазмой.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Павлик, Любовь Леоновна, Пущино

1. Абрамец И. И. Нейрохимические механизмы основных форм длительной депрессии передачи. Нейрофизиология/Neurophysiology, 2000, т. 32, № 6, с. 463-472.

2. Бабминдра В.П. Стабильность и изменчивость конструкции межнейронных связей . В кн: Синаптическая организация мозга. Л., ЛГУ, 1980, 196 с.

3. Батуев А. С., Бабминдра В. Л. Нейрокинетическая гипотеза синаптической эффективности. Физиол. журн., 1984, т. 70, №8, с. 1149-1156.

4. Безгина Е. Н., Драбкина Т. М.,. Земскова С. Н и др. Особенности временного-течения миниатюрных токов концевой пластинки в разных участках нервно-мышечного соединения лягушки. Нейрофизиология, 1987,т. 19, № 6, с.779-789

5. Боголепов Н.Н. Ультраструктура синапсов в норме и патологии. М., Медицина, 1975.

6. Божкова В.П., Розанова Н.В. Современное состояние проблемы щелевых контактов и представление об их роли в развитии. Онтогенез, 1998,т. 29,№1, с. 5-20.

7. Большаков В. Ю. Механизмы долговременной синаптической депрессии гиппокампа. Росс, физиол. ж., 2001, т. 87, № 4, с. 441-447.

8. Брагин А. Г., Виноградова О. С. Явление хронической потенциации в кортикальном афферентном входе пирамид поля САЗ гиппокампа. В кн.: Физиологические механизмы памяти. Под ред. Е. А. Громовой, Пущино, 1973, с. 8-25.

9. Белоус А. М„ Землянских Н. Г. Молекулярная динамика белков цитоскелета в норме и при воздействии температурно-осмотических факторов. Проблемы криобиологии, 1994, № 1, с. 14-23.

10. Браун А. Д., Моженок Т. П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука, 1987. 230с.

11. Вызов А.Л. Управляемые синапсы. Природа, 1994, № 1, с. 71-81

12. Вассим Т.В. Участие цитоскелета в транспорте нейротрансмиттеров 14С. глутамата и [14С]ГАМК нервыными окончаниями мозга при осмотическом набухании. Докл.Нац.акад. наук Белоруси, 2003, т. 43, №3, с. 81-84.

13. Ведерникова Е.А., Максимов А.В., Негуляев Ю.А. Функциональные свойства и цитоскелетзависимая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология, 1997, т.39, №12, с.1142-1151.

14. Виланд Т., Фаулыптих X. Фаллоидин. Итога и перспективы развития биоорганической химии и молекулярной биологии. М.: Наука, 1978, с. 96110.

15. Виноградова О.С. Гиппокамп и память. М.: Наука. 1975, 333с.

16. Виноградова О. С. Современные представления об общих свойствах и пластических явлениях в нейронах гишпокампа. Усп. физиол. наук, 1984, т. 15, № 1, с. 28-53.

17. Виноградова О.С. Нейронаука конца второго тысячелетия : смена парадигм// Журн. высш. нерв, деят., 2000, т.50, №5, с.743-774.

18. Воронин JI. JI. Длительная посттетаническая потенциация в гиппокампе. Успехи, физиол. наук, 1982, т. 13, № 4. с. 45- 73.

19. Винников Я. JI. Цитологические и молекулярные основы рецепции. JL: Наука. 1971,372 с.

20. Григорьев П.А., Тараховский Ю.С., Павлик Л.Л., Мухтасимова Н.Ф., Удальцов С.Н., Мошков Д.А и Иваницкий Г.Р. Взаимодействие Ф-актина с искусственными фосфолипидными мембранами. Докл. РАН, 1999, т. 366, №5, с. 695-698.

21. Дзебан Д.А., Мухтасимова Н.Ф., Павлик Л.Л и Мошков Д.А. Ультраструктура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов маутнеровских нейронов при долговременной потенциации. Морфология, 2003, т. 123, вып.2, с.33-38.

22. Дьячкова JI.H. Некоторые ультраструктурные характеристики эволюционного развития межнейронных синапсов позвоночных. Журн. общ. биологии, 1979, т.40, №5, с.772-783.

23. Жердев Г.В., Мошков Д.А., Белозерцев Ю.А., Тирас Н.Р. Влияние изонитрозина и вестибулярной стимуляции на сому и дендриты Маутнеровских нейронов. Цитология, 1991, т. 33, с. 20-32.

24. Коган М.А., Машкин П.В., Мошков Д.А., Масюк JI.H. Количественные методы оценки ультраструктуры синапсов. Подходы и ограничения. В сб.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия, Пущино, 1981, ОНТИ НЦБИ, с.57-64.

25. Конев С.В., Мажуль В.М. Межклеточные контакты. Минск, Наука и техника, 1977.

26. Конорски Ю. Интегративная деятельность мозга, Мир, Москва. 1970.

27. Косицын Н.С. Микроструктура дендритов и аксодендритических связей в ЦНС. М.: Наука 1976. 250с.

28. Костюк П.Г. Ионы кальция и пластичность нервной системы. Росс, физиол. журн., 2001, т.87, №8, с.1017-1025.

29. Мавлютов Т.А., Санталова И.М., Дзебан Д.А., Мошков Д.А. Ультраструктурная локализация пироантимоната кальция в Маутнеровских нейронах мальков золотой рыбки, адаптированных к естественной стимуляции. Цитология, 2001, т.23, №3, с. 261-268.

30. Манина А.А. Ультраструктурные основы деятельности мозга. Л.:Медицина. 1976. 190с.

31. Михеева И. Б, Тирас Н. Р.,. Мошков Д. А и др. Десмосомоподобные контакты как мишени действия яда скорпиона. Цитология, 2000, т. 42, № 7, с. 635-646.

32. Мошков Д. А., Павлик JI. JL, Брагин А. Г. Посттетанические изменения в ультраструктуре гигантских шипиковых синапсов ноля САЗ гиппокампа. ДАН СССР, 1977, т. 237, №6, с. 1525-1527.

33. Мошков Д. А., Павлик JI. Л., Брагин А. Г. Ультраструктурное изучение основ посттетанической потенциации в срезах гиппокампа методом замораживания-замещения. Цитология, 1980, т. 22, № 1, с. 20-26.

34. Мошков Д; А., Павлик JI. JI. Изменение во времени структуры синапсов поля САЗ гиппокампа после их потенциирования. Цитология, 1983, т.25, №5, с. 500-507.

35. Мошков Д. А. Тирас Н. Р., Потемкин В. В. Влияние фаллоидина и длительной сенсорной стимуляции на ультраструктуру Маутнеровских нейронов золотых рыбок. Цитология, 1984, т. 26, № 12, с. 1351-1355.

36. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М., Наука, 1985,200 с

37. Мошков Д. А. Павлик JI. JI., Музафарова JI. Н., Удальцов С. Я., Лисин. Н. М. Цитохимическое выявление актина в структуре синаптического аппарата поля САЗ гиппокампа. Цитология, 1986. т. 27, №8, с. 802-806.

38. Мошков Д. А.,Тирас Н.Р. различия цитоскелета в тормозных и возбуждающих синапсах. Цитология, 1987, т.29, №2, с. 156-160.

39. Мошков Д. А., Тирас Н. Р., Павлик JI. Л., Мухтасимова Н. Ф. Ультраструктура Маутнеровских нейронов золотых рыб в переживающих фрагментах продолговатого мозга. Морфология, 1996, т. 38, № 4., с. 56-59.

40. Мошков Д. А., Мавлютов Т.А., Савельева JI.H. и др. Исследование Маутнеровских нейронов мальков золотой рыбки методом замораживания-скалывания. Разработка методики. Цитология, 1997, т. 39, №4/5, с. 267-272.

41. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Павлик Л.Л. и др. Структурные различия между десмосомоподобными контактами в афферентных химических и смешанных синапсах Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2001, т. 120, №4, с. 30-35.

42. Мошков Д.А., Безгина Е.Н., Павлик J1.JL, Мухтасимова Н.Ф. и Мавлютов Т.А. Распределение ионов кальция смешанных синапсах маутнеровских нейронов золотой рыбки в норме, при утомлении и адаптции к нему. Морфология, 2003, т. 124, №6, с.41-46.

43. Отмахов Н.А. Нейронная сеть гиппокампа: морфологический анализ. Успехи физиол. Наук, 1993, т.24. №4, с. 79-101.

44. Павленко В.К., Мошков Д.А. Ультраструктурное исследование механорецепторного нейрона речного рака. В сб.: Биофизика живой клетки. Пущино, 1973,вып.4, с. 137-147.

45. Павлик Л. JL, Брагин А. Г., Мошков Д. А. Изучение ультраструктуры клеток переживающих срезов гиппокампа в процессе инкубация in vitro. Цитология, 1975, т. 20, №3, с. 275-280.

46. Павлик Jl. JL, Тирас Н. Р., Шодина И. Б., Мошков Д. А. Изменения актинового цитоскелета Маутнеровских нейронов золотой рыбки после длительной стимуляции . Цитология, 1997, т. 39, № 7, с. 546-551.

47. Павлик Jl. JL, Тирас Н. Р., Мошков Д. А. Актин в Маутнеровских нейронах золотых рыбок после обработки фаллоидином и адаптации к длительной стимуляции. Цитология, 1997, т. 39, № 12, с. 1109-1115.

48. Павлик JI. J1., Тирас Н. Р., Мошков Д. А. Экспериментально вызванная деполимеризация актина разрушает адаптивное состояние нейрона. Морфология, 1998, т. 114, №4, с. 24-27.

49. Павлик J1.J1., Тирас Н.Р., Пахотина И.Д. и Мошков Д.А. Влияние цитохалазина D на структуру смешанных синапсов и их электротоническую проводимость. Цитология, 1999, т. 417, с. 590-597.

50. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мухтасимова Н.Ф., Пахотин П.И., Дзебан Д.А., Мошков Д. А. Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2003, т. 123, №1, с. 41-45.

51. Павлик Л. Л., Безгина Е. Н, Тирас Н. Р., Михеева И. Б. и Мошков Д. А. Влияние веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов, наструктуру смешанных синапсов маутнеровских нейронов. Морфология, 2003,000.

52. Петруняка В.В. Цитохимические методы выявления ультраструктурной локализации кальция. Цитология, 1987, т.29, №8, с.875-883.

53. Питере А., Палей С., Уэбстер Г. Ультраструктура нервной ткани системы. Москва, Мир, 1972, 173 с.

54. Повилайтите П.Е. Ультраструктурные основы пластичности синаптических контактов сенсомоторной коры и гиппокампа. В сб.: "Проблемы нейрокибернетики», Ростов-Дон, 2002, с.274-275.

55. Попов В.Ш, А.А.Деев, О.А.Клименко, Краев И.В. и др. Трехмерная реконструкция синапсов и дендритных шипиков в гиппокампе крыс и сусликов: новые структурно-функциональные парадигмы работы синапса. ЖВНД, 2004, т. 54, №1, с. 120-130.

56. Санталова И.М., Мошков Д. А. Реакция цитоскелета и гладкого ретикулума маутнеровских нейронов золотой рыбки на частичную денервацию и длительную сенсорную стимуляцию. Морфология, 1996, т. 110, № 6, с.

57. Санталова И.М., Мошков Д. А., Мавлютов Т.А. Особенности морфофункциональной реабилитации маутнеровских нейронов после их утомления. Цитология, 2000, т. 42, №4, с. 351-357.

58. Семченко В.В., Степанов С.С. Система субсинаптических единиц как универсальный системообразующий и регулирующий фактор синапсов головного мозга. Бюл. эксп. биол., 1997, т. 24, №7, с. 4-12.

59. Степанов С.С., Семченко В.В. Современные представления о структурно-функциональной организации межнейронных синапсов центральной нервной системы. Морфология, 2000, т. 118, №5, с. 71-80.

60. Тирас Н.Р. Ультраструктурные исследования пластичности маутнеровских нейронов с использованием биологически активных веществ. В сб.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия. Пущино, ОНТИНЦБИ, 1981, с.134-141.

61. Тирас Н; Р., Мошков Д. А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на Маутнеровские нейроны золотой рыбки Carassius auratus. Журн. эволюц. биохим. физиол., 1978, т. 14, №5, с. 486-491.

62. Тирас Н. Р., Павлик JL JL, Мошков Д. А. Выявление актина и особенности организации цитоскелета Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Цитология, 1990, т. 32, № 4, с. 352-358.

63. Тирас Н. Р., Потемкин В. В., Мошков Д. А. Действие каиновой кислоты на Маутнеровские нейроны адаптированных и неадаптированных рыб. Цитология, 1990, т. 32, № 8, с. 795-800.

64. Тирас Н. Р., Павлик JI. JL, Мошков Д. А. Выявление актина и особенности цитоскелета Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Цитология, 1990а, т. 32, № 4, с. 352-357.

65. Тирас Н. Р., Жердев Г. В., Мошков Д. А. Ультраструктура Маутнеровских нейронов рыб, адаптируемых к длительной стимуляции при воздействии этанола. Цитология, 1995, т. 37, № 5/6, с. 430-439.

66. Тирас Н.Р., Михеева И.Б. и др. Морфофункциональные исследования адаптации Маутнеровских нейронов золотых рыбок в условиях длительной инкубации продолговатого мозга. Морфология, 2002, т. 122, №6, с.хххх

67. Тирас Н.Р., Удальцов С.Н., Михеева И.Б., Пахотин П.И. и Мошков Д.А. Морфофункциональные изменения инкубированных маутнеровских нейронов золотых рыбок под влиянием пептидов из яда скорпиона. Морфология, 2003, т.123, вып.З, с.40-45.

68. Тирас Н.Р., Удальцов С.Н., Михайлова Г.З. и Мошков Д.А. Выявление с помощью электронной микроскопии в яде скорпиона пептидов, взаимодействующих с актином. Биологические мембраны, 2003, т.20, №1, с.73-77.

69. Тушмалова Н. А., Маракуева И. Б. Сравнительно-физиологические исследование ультраструктурных аспектов памяти. М., Наука, 1986.

70. Ушаков В.Н., Шапочка М.И. Сравнение подвижности щелевых соединений и десмосом гепатоцитов. Цитология, 1981, т. 23, №4, с. 454-458.

71. Янюшина Г.В., Потемкин В.В., Мошков Д.А. Нейрохимическое исследование срезов мозга с Маутнеровскими нейронами золотой рыбки приадаптации к повторяющейся стимуляции. Цитология, 1990, т. 32, № 1, с. 3440.

72. Abbott L. Е., S. В. Nelson. Synaptic plasticity: taming the best. Nature Neurosci., 2003, v. 3, p. 1178-1183.

73. Adams J.C. Cell adhesion-spreading frontiers, intricate insights. Trends Cell Biol., 1997, v.7, p. 107-110.

74. Alford S., Zompa I., Dubuc R. Long-term potentiation of glutamatergic pathway in the Lamprey brainstem. J. Neurosci. 1995, v.15, p.7528-38.

75. Alisson, D.W V.Gelfand, I.Spector, A.M.Craig. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons:differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J. Neurosci., 1998, v. 18, p.2423-2436.

76. Amankwar K. S., De Bowi U. Ultrastructural localization of filamentous actin within neuronal interphase nuclei in situ. Exp. Cell Res., 1994, v. 210, p. 315325.

77. Andersen P., A.F.Soleng. Long-term potentiation and spatial training are both associated with the generation of new exitatory synapses. Brain res. Rev., 1998, v.26, p.353-359.

78. Bailey С. H. Structural changes and the storage of long-term memory in Aplisia. Can .J. Physiol. Pharmacol., 1999, v. 77, p. 738-747.

79. Bailey C.H., Chen M. Morphological basis of long-term habituation and sensitization in Aplisia . Science, 1985, v. 220, p. 91-93.

80. Banno Т., К. Kohno. Conformational changes of smooth endoplasmic reticulum induced by brief anoxia in rat Purkinje cells. J.Compar.Neurol., 1996, v.369, p.462-471.

81. Bartelmez G. W. Mauthner's cell and the nucleus motorius tegmenti V. J. Сотр. Neurol., 1915, v. 25, p. 87- 128.

82. Baudry M. Advances in synaptic plasticity. MIT Press, 2000, p. 1-335.

83. Baux G., Simonneau M., Tauc L. and Segundo J.P. Uncoupling of electrotonic synapses by calcium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, №9, p. 4577-4581.

84. Bennett M.V.L. Electrical synapses, a personal perspective (or history). Brain Res. Rev., 2000, v. 32, p. 16-28.

85. Bennett M.V.L, Goodenough D.A. Gap junctions. Neurosci. Res. Progr. Bull., 1979, v.16, p. 373-485.

86. Bechinger B. Structure and function of channel-forming peptides: cecropins, melittin and alamethicin. J.Memb.Biol., 1997, v. 156, p. 197-211.

87. Bearer E.L., Reese T.S. Association of actin filaments with axonal microtubule tracts. J. Neurocytol., 1999, v. 28(2), p. 85-98.

88. Berdan R.C. and Caveney S. Gap junction ultrastructure in three state of conductance. Cell Tissue Res., 1985, v.239, p. 111-122.

89. Bemardini G., Peracchia C. Gap junction crystallization in lens fibers after increase in calcium. Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 1981, v. 21, p. 291-299.

90. Blaustein M.P., McGraw C.F., Somlyo A.V. et al. How is the cytoplasmic calcium concentration is controlled in nerve terminals? J.Physiol., 1980, v.70, p. 459-470.

91. Bliss TVP, Lomo T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dendritic area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol., 1973, v.232, p. 331-56.

92. Borovjagin V.L., Moshkov D.A. A study of the ultrastructurral organization of cytochrome c-phospholipid membranes as revealed by various experimental treatments. J. Membr. Biol., 1973, v.13, p. 245-262.

93. Bosch E. Ultrastructure of the electrotonic and chemical components of the lateral-to-motor and medial-to-motor synapses in crayfish nerve cord. J. Сотр. Neurol., 1990, v. 299, p. 446-461.

94. Bouchard M., Chantal Pare, Jean-Pierre Dutasta, Jean-Paul Chauvet, С Gicquaud, M. Auger. Interaction between G-actin and virious types of liposomes: A 19F, 31P, and 2H nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 1998, v. 37, p. 3149-55.

95. Bozhilova -Pastirova A., Ovtscharoff W. Freeze-etching and thin section electron microscopic study of neuronal gap junctions in the rat sensorimotor cortex. Comptes rendus de l'Academie bulgare des Sciences. 2002, v.55, p.91-94.

96. Brady S. T. Motor neurons and neurofilaments in sickness and in health. J. Cell, 1991, v. 73, p. 1-3.

97. Bray D., Thomas G. Unpolymerized actin in fibroblast and brain. J. Mol. Biol., 1976, v. 105, p. 527-544.

98. Bruzzone R., White T.W., Goodenough D.A. The cellular internet: on-line with connexins. Bio Essays, 1996, v.18, p.709-718.

99. Buchs P.A., Muller D. Induction of long-term potentiation is associated with major ultrastructural changes of activated synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, p. 8040-45.

100. Campbell A.K. Intracellular calcium, its universal role as regulator. Chichester. John Wiley, 1983, pp. 1-513.

101. Canfield J. G., G. J. Rose. Activation of Mauthner neurons during prey capture. J.Compar.Physiol. A. 1993, v. 172, p. 611-618.

102. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat A.G., Ansiello D.A. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Amer.J.Physiol., 1991, v. 261, С. 882-C886.

103. Capani F, M.H.Ellisman, M.E.Martone. Filamentous actin is concentrated in specific subpopulations of neuronal and glial structures in rat central nervous system. Brain Res., 2001, v.923, p. 1-11.

104. Carlier M.-F., Ch.Le Clainche, S.Wiesner, D.Pantaloni. Actin-based motility: from molecules to movements. BioEssays, 2003, v. 25, p. 336-345.

105. Chen H.B., W. Bernstein, J.R. Bamburg. Regulationg actin filament dynamic in vitro. TIBS, 2000, v. 25, p. 19-23.

106. Chen L. and Meng M.Q. Compact and scattered gap junction in diffusion mediated cell-cell communication. J. Theor. Biol., 1995, v. 176. p. 39-45.

107. Chicurel M.E., Harris K.M. Three-dimentional analysis of the structure and composition of CA3 area branched dendritic spines and their synaptic relationship with mossy fiber boutons in the rat hippocampus. J.Compar. Neurol., 1992, v. 325, p. 169-182.

108. Chien K-Y., Huang W-N., Jean J-H., Wu W-G. Fusion of sphingomielin vesicles induced by proteins from Taiwan cobra. J.Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 3252-3259.

109. Cohan C. S., Kater S. B. Suppression of neurite elongatin and growth cone motility by electrical activity. Science, 1986, v. 232, p. 1638-1840.

110. Colicos M.A., Collins B.E., Sailor M.J., Goda Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell, 2001, v. 107, p. 605-616.

111. Connor J.R., Diamond M.C. A comparison of dendritic spine number and type on pyramidal neurons of the visual cortex of old adult rats from social or isolated envoronments. J. Compar. Neurol., 1982, v. 210, p. 99-106.

112. Cooper. J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J. Cell Biol., 1987, v. 105, p.1473-1478.

113. D'Andrea P. and Vittur F. Propagation of intercellular Ca 2+ waves in mechanically stimulated articular chondrocytes. FEBS Lett., 1997, v.400,[[ N1, p.58-64.

114. Desmond N. L., Levy W. B. Synaptic correlates of associative potentiation/depression: an ultrastcructural study of hippocampus. Brain Res., 1983, v. 265, p. 21-30.

115. Desmond N.L., Levy W.B. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dentate gyrus. J.Compar. Neurol. 1986, v.253, p. 466-75.

116. Desmond N.L., Levy W.B. Changes , in the postsynaptic density with long-term potentiation in the hippocampal dentate gyrus. J. Compar. Neurol., 1986, v.253, p. 476-82.

117. Diamond J. The Mauthner cell. In: Fish physiology. W. S. Hoar and D. J. Randall (eds), Acad.Press, New York (1971), v. 5, pp. 265-346.

118. Diamond J., Huxley A. F. The activation and distribution of GABA and L-glutamate receptors on goldfish Mauthner neurons: an analysis of dendritic remote inhibition. J. Physiol., 1968, v. 194, p. 669-723.

119. Ding B. Cell to cell transport of macromolecules through plasmodesmas — a novel signaling pathway in plant. Trends Cell Biol., 1997, v. 7, p. 5-8.

120. Dora K.A., Martin P.E.M. et al. Role of heterocellular gap junctional communication in endothelium-dependent smooth muscle hyperpolarization: ingibition by a connexin-mimetic peptid. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1999, v.254, N1, p.27-31.

121. Dayhoff J., Hameroff S., Lahoz-Beltra R., Swenberg Ch. Cytoskeletal involvement in neuronal learning: a review. Eur. Biophys.J., 1994, v.23, p. 79-93.

122. Elias E., Boyer J.L. Chlorpromazine and its metabolites alter polimerization and gelation of actin. Science, 1979, v.206, p. 1404-1406.

123. Engert F, T.Bonhoeffer. Dendritic spine changes associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature, 1999, v.399. p.66-70.

124. Eugenin J., Alvarez J. Incorporation of amino acids into the axoplasm is enchanced by electrical stimulation of the fiber. Brain Res., 1995, v. 677, p. 319325.

125. Fath K. R., R. J. Lasek. Two classes of actin microfilaments are associated with the inner cytoskeleton of axons. J. Cell Biol., 1988, v. 107, p. 613-621.

126. Faure P., D. Kaplan, H. Korn. Synaptic efficacy and the transmission of complex firing pattern between neurons. J. Neurophysiol., 2000, v. 84, p. 30103025.

127. Feng J. Spinophilin regulates the formation and function of dendritic spines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, v.97, p. 9287-9292.

128. Fiala J.C., Spacek J., Harris K.M. Dendritic spines pathology: cause or consequence of neurological disorders? Brain Res. Revs., 2002, v.39, p.29-54.

129. Fifkova E. Synaptic hypertrophy of the dentate fascia of the hippocampus. In: Recent achievements in restarative neurology. I. Upper motor neuron functions and disfunctions. Karger, 1985b. p. 263- 271.

130. Fifkova E., Markham J.A. Delay R.J. Calcium in the spine apparatus of dendritic spines in the dentate molecular layer. Brain Res., 1983, v.266, p.163-168.

131. Fifkova E. A possible mechanism of morphometric change in dendritic spines induced by stimulation. Cell Mol. Neurobiol., 1985, v.5, p. 47-63.

132. Fifkova E. Actin in the nervous sistem. Brain Res., 1985, v.9., p.187-215.

133. Fischer M, Kaech S, Knutti D, Matus A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spine. Neuron, 1998, v.20, p.847-54.

134. Furshpan E.P., Furukawa T. Intracellilar and extracellular responses of the several region of the Mauthner cell of the goldfish after polymerization and gelation of actin. J. Neurophysiol., 1962, v. 25, p. 732-771.

135. Fujisawa H., Marioka H. A decay of gap junction in association with cell differentiation of neural retina chick embryo development. J. Cell Sci., 1976, v.22, p. 585-596.

136. Garner C.C., J.Nash, R.L.Huganir. PDZ domains in synapse assembly and signalling. Trends in Cell Biol., 2000, v. 10, p. 274-280.

137. Geiger В., Avnur Z., Volberg T. and Volk T. Molecular domains of adherens junctions. In: The Cell in Contacts (eds. Edelman G. and Thiery J.-P.), 1985, Chap. 21, p. 461-489. John Wiley, New-York.

138. Geiger B.,Ginsberg D. The cytoplasmic domain of adherens-type junction. Cell Motil. Cytoskel., 1991, v.20., p. 1-6.

139. Gert de Couet H. , Stowe S. , Blest D. Membrane-associated actin in the rhabdomeral microvilli of crayfish photoreceptors. J. Cell'Biol., 1984, v. 98, p. 834-846.

140. Ghosh A., Greenberg M.E. Calciun signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science, 1995, v.268, p.239-247.

141. Gicquaud C. Actin conformation is drastically altered by direct interaction with membrane lipids: a differential scanning calorimetry study. Biochemistry, 1993, v. 32, p.l 1873-11877.

142. Gicquaud C., Wong P.T.T. Biochem.J. 1994. 303,769-774. [[[[[

143. Globus A., Scheibel A. The effect of visual deprivation on cortical neurons: a Golgi study. Brain Res., 1967, v. 566, p. 77-88.

144. Gordon D.J., Yang Y.Z., Corn E.D. Polimerization of Acanthamoeba catin. Kinetics, thermodynamics, and co-polimerization with muscle actin. J.Biol.Chem., 1976, v. 251, p. 7474-7479.

145. Gottow Т., Miyaguchi K., Hashimoto P. H. Cytoplasmic architecture of the axon terminal: filamentous strands specifically associated with synaptic vesicles. Neuroscience, 1991, v. 40, p. 587-598.

146. Gourgeon A-M, Maingourd M., Mainsonhaute C. Effect of hydrogen peroxide on cytoskeletal protein of drosophila cells: comparison with haet shock and other stresses. Exptl.Cell Res., 1993, v. 204, p. 30-37.

147. Gray E. G. Neurotrasmitter release mechanisms and micritubules . Proc. Roy. Soc. Lond., 1983, v. 218, p.253-258.

148. Grigoriev P.A., Tarahovsky Yu.S., Pavlik L.L., Udaltsov S.N. and Moshkov D.A. Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranes. IUBMB Life, 2000, v. 30, p. 227-233.

149. Gully R., Reese T. S. Cytoskeletal organization at the postsynaptic complex. J. Cell Biol., 1981, v. 91, p. 298-302.

150. Hackett J.T., Buchheim A. Ultrastructural correlates of electrical-chemical synaptic transmission in goldfish cranial motor nuclei. J. Compar. Neurol., 1984, v. 224, p. 425-436.

151. Hall D.H., Gilat E., M.V.L. Bennett. Ultrastructure of the rectifying electrotonic synapses between giant fibers and pectoral fin adductor motoneurons in the hatchetfish. J. Neurosci., 1985, v. 14, p. 825-834.

152. Hamlyn L.H. The fine structure of the mossy fiber endings in the hippocampus of the rabbit. J.Anat., 1962, v.96, p.l 12.

153. Harreveld A., Fifkova E. Swelling of deudritic spines in the fascia dentate after stimulation olf perforant fibers as a mechanism of posttetanic potentiation. J. Exp. Neurol., 1975, v. 49, p. 736-749.

154. Harvell O. D., Sweeney M. L., Kirkpatrick F. H. Conformation changes of actin during formation of filaments and paracristals and upon interaction with DNAse 1, cytochalasin В and falloidin. J. Biol. Chem., 1980, v. 225, p. 12101220.

155. Hata Y., Y.Takai. Role of postsynaptic density-95/synapse-associated protein 90 and its interacting proteins in the organization of synapses. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 1999, v.56, p.461-472.

156. Hayashi K., Shirao T. Changes in the shape of dendritic spines caused by overexpression of drebrin in cultured cortical neurons. J. Neurosci., 1999, v. 19, p. 3918-3925.

157. Hering H., M. Sheng. Dendritic spines: structure, dynamic and regulation. Nature, 2001, v.2, p. 880-888.

158. Heuser J.E., Reese T.S. Structure of synapses. The handbook of physiology. Sect. 1. The nervous system. Bethesda (Md), 1977, v.l, p.261-294.

159. Heuser J.E., Reese T.S., Dennis M.J. et al. Synaptic vesicles exocytosis captured by quick freezing and correlated with guantal transmitter release. J.Cell Biol., 1979, v. 81,p. 275-300.

160. Holmes W. Is the function of dendritic spines to concentrate calcium? Brain Res. 1990.v.519.p.33 8-342.

161. Holmes K.C., D.Popp, W.Gebhard, W.Kabsch. Atomic model of the actin filament. Nature, 1990, v. 347, p. 44-49.

162. Hondo. H., Nagashima H., Asakura S. Directional movement of F-actin in vitro. J. Cell Biol., 1986, v. 191, p. 131-133.

163. Horwitz B. Electrophoretic migration due to postsynaptic potential gradients: theory and application to autonomic ganglion neurons and to dendritic spines. Neuroscience, 1984, v. 12, p. 887-905.

164. Huntley G.W., Benson D.L., Colman D.R. Structural remodeling of the synapse in response to physiological activity. Cell, 2002, v. 108 , p. 1-4.

165. Huxley H.E., A.Stewart, H.Sosa, T.Irving. X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscule. BiophyisJ., 1994, v. 67, p. 2411-2421.

166. Ioshi H. C., Chu Du, Buxbam R. E., Heideman S. R. Tension and compression in the cytoskeleton of PC 12 neurites. J. Cell Biol., 1985, v. 101, p. 697- 705.

167. Ishikawa H., Bischoff R., Holtzer H. Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types. J. Cell Biol., 1969, v.43, p. 312328.

168. Janmey P.A. The cytoskeleton and cell signalling: component localization and mechanical coupling. Physiol. Rev., 1998, v.78, N3, p.769-781.

169. Jefferys J.E. Nonsynaptic modulation of neuronal activity in the brain: electric currents and extracellular ions. Physiol.Rev., 1995, v. 75, p. 689-723.

170. Kachar В., Reese Th. S. The mechanism of cytoplasmic streaming in characean algal cells: sliding of endoplasmatic reticulum along actin filaments. J. Cell Biol., 1988, v. 106, p. 1545-1552.

171. Kachar B. Direct visualization of organelle movement along actin filaments dissociated from characean algae. Science, 1985, v. 227, p, 1355-1357.

172. Kadota Т., Mizote M., Kadota K. Synaptic spinules attendant on post-tetanic. Proc.Japan Acad., 1996, v.72 (B), p.48-51.

173. Kashapova L.A., Moshkov D.A., Bezgina E.N. Active zones and plasticity of motor nerve terminal. Plasticity of motoneuronal connections. Restorative Neurol., Amsterdam etc.: Elsevier Sci. Publ., 1991, v. 5, p. 163-173.

174. Kelly P., Cotman C.W. Synaptic proteins: characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. J. Cell Biol., 1978, v.79, p. 173-183.

175. Kelly R.D., Perdue B.D. Development of the agin cell surface. Exp. Gerontol.1980, v.15, p. 407-421.

176. Kirov S.A., Sorra K.E., Harris K.M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J.Neurosci., 1999, v.19, p. 2876-86.

177. Koch C., Zador A. The function of dendritic spines-devices subserving biochemical rather than electrical compartmentalization. J. Neurosci., 1993. v. 13, p. 413-422.

178. Kolaeva S.G., Semenova T.P., Santalova I.M., Moshkov D.A. Anoshkina I.A. and Golozubova V. Effect of L-thyrosyl-L-arginine (kyotorphin) on the behavior of rats and goldfish. Peptides, 2000, v.12, № 9, p. 1331-1336.

179. Korepanova E.A., Antonov V.F. Interaction of nuclear proteins of protamine and histamine with charged bilayer membranes. Biofizika, 1975,v. 20, p. 812-815.

180. Korichneva I., Hammerling U. F-actin as a functional target for retro-retinoid: a potential role in anhidroretinol triggered cell deth. J. Cell Sci., 1999, v.l 12,2521, p. 25-28.

181. Korkotian E., Segal M. Structure-function relations in dendritic spines: is size important? Hippocampus, 2000, v. 10, p. 587-595.

182. Krur P.J., Korn H., Faber D.S. The effects of geometrical parameters on synaptic transmission: a Monte Carlo simulation study. Biophys. J., 1997, v. 73, p. 2874-2890.

183. Krucer Т., G.R. Siggins, S. Halpain. Dynamic actin filaments are required for stable long-term (LTP) potentiation in area CA1 of hippocampus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2000, v. 97, p. 6856-6861.

184. Kumaru S.S., Varadaraj K. et al. Functional expression and biophysical properties of polymorphic variants of the human gap junction protein connexin37. Bioch. Bioph. Res. Comm., 2000, v.274, p.216-224.

185. Kuznetsov S.A., Langford G.M., Weiss D.G. Aetin-dependent organelle movement in squid axoplasm. Nature, 1992, v. 356, p.722-725.

186. Lachapelle M., Aldrich H.C. Phalloidin-gold complexes: a new tool for ultrastructural localization of F-actin. J. Histochem. Cytochem., 1988, v. 36 (9), p. 1197-1202.

187. Lancelle S. A., Hepler P. K. Cytochalasin induced ultrastructural alterations in Nicotiana pollen tubes . Protoplasma, 1988, Suppl. 2., p. 65-75.

188. Lazarides E., Weber K. Actin antibody: the specific visualization of actin filaments in non-muscle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, v.71, p. 22682272.

189. LeBeuxY.J., Willemot J. Ultrastructural study of the microfilaments in rat brain by means meromyosin labeling. I. The perikaryon, the dendrites and the axon. Cell Tissue Res., 1975, v. 1, p. 1-37.

190. Lee K.S., Schottler F., Oliver M., Lynch G. Brief bursts of high -frequency stimulation produced two types of structural change in rat hippocampus. J.Neurophysiol., 1980, v. 44, p. 247-58.

191. Legendre P., Korn H. Voltage dependence of conductance changes evoked by glycine release in the zebrafish brain. J. Neurophysiol., 1995, v. 73, p. 2404-12.

192. Lieberman A.R. and Spacek J. Filamentous contacts: the ultrastructure and three-dimentional organization of specialized non-synaptic intemeuronal appositions in talamic relay nuclei. Cell Tissue. Res., 1997, v. 288, p. 43-57.

193. Lin E.G.,Cantiello H.F. A novel method to study the electrodynamic behaviour of actin filaments. Evidence for cable-like properties of actin. BiophysJ., 1993, v. 65, p. 1371-1378.

194. Lindbloom G., Rilford L. Cubic phases and isotopic structures formed by membrane lipid-possible biological relevance. Biochim. Biophys. Acta, 1989, v. 998, p. 221-256.

195. Llinas R.R., Grace A.A., Yarom Y. In vitro neurons in mammalian cortical layer 4 exhibit intrinsic oscillatory activity in the 10-to 50-Hz frequency range. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v.88, p. 897-901.I

196. Lui P.P.Y., Lee C.Y., Tsang D., Kong S.K. Ca is released from the nuclear tubular structure into nucleoplasm in C6 glioma cells after stimulation with phorbol ester. FEBS Letters, 1998, v. 432, p. 82-87.

197. Lynch G., Larson J., Kelso S. et al. Intracellular injections of EGTA block induction of hippocampal long-term potentiation. Nature, 1983, v. 305, p. 719721.

198. Macklis J. D. New memories from new neurons. Nature, 1998, v. 396, p. 414415.

199. MacVicar В., Dudek A. Dye-coupling between CA3 pyramidal cells in slices of rat hippocampus. Brain Res., 1980, v.196, p. 494-497.

200. Makuch R., Zasada A., Mabuchi K., Krause K., Wang C-L.A., Dabrowska R. Phosphotidilserine liposomes can be tethered by caldesmon to actin filaments. Biophys. J., 1997, v. 73, p. 1607-1616.

201. Malenka R.C., Nicoll R.A. Long-term potentiation a cascade of progress? Science, 1999, v. 15, p. 463-470.

202. Majewska A., Brown E., Ross J., Yuste R. Mechanism of calcium decay kinetics in hippocampal spines: role of spine calcium pumps and calcium diffusion through the spine neck in biochemical compartmentalization. J.Neurosci., 2000, v.20, p. 1722-1734.

203. Maletic-Savatic M., Malinow R., Svoboda K. Rapid dendritic morphogenesis in CA1 hippocampal dendrites induced by synaptic activity. Science, 1999, v. 283, p. 1923-27.

204. Marron D.F., Petit T.L. The role of synaptic morphology in neuronal plasticity: structural interactions underlying synaptic power. Brain Res. Revs., 2002, v. 38, p. 291-308.

205. Matus A. Actin-based plasticity in dendritic spines. Science, 2000, v. 290, p. 754-758.

206. Matus A., Brinkhaus H., Wagner U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus, 2000, v. 10, p. 793-804.

207. Mayhew T.M. basic stereological relationships for quatitative microscopical anatomy-a simple systematic approach. J. Anat., 1979, v. 129, p. 95-105.

208. Mayhew T.M. How to count unbiasedly and efficiently at the ultrastructural level: proposal for standard sampling and counting protocol. J. Neurocytol., 1996, v. 25, p. 793-804.

209. McHale M. K., Hall G. F., Cohen M. J. Early cytoskeletal changes following injury of giant spinal axons in the Lamprey. J. Сотр. Neurol., 1995, v. 353, p. 2537.

210. McGraw C.F., McLaughlin B.J. Fine structural studies of synaptogenesis in the superficial layers of the chick optic tectum. J. Neurocytol., 1980, v. 9, p. 79937

211. McKinney R.A., M.Capogna, R. Durr, B.H.Gahwiler, S.M.Thompson. Nature Neurosci 1999,2,44. .]]]]]]

212. Meyer H.W., Richter W., Brezesinski G. Convex-concave curvatures in bilayers of dipalmytoilphosphatidilcholine and cholesterol induced by amphotericin B/deoxycholate after prolonged storage. Biochem. Biophys. Acta., 1994, v. 1190, p. 9-19.

213. Mienhardt H. Cell determination boundaris as organizing region for secondary embrionic fields. Dev. Biol. 1983, v. 96, p. 375-385.

214. Mills J.W., Pedersen S.F., Walmod P.S. and Hoffmann E.K. Effect of cytochalasins on F-actin and morphology of Ehrlich ascites tumor cells. Exptl. Cell Res., 2000, v. 261, p. 209-219.

215. Ming D., Y.Kong, Y.Wu, J.Ma. Simulation of F-actin filaments of several microns. Biophys. J., 2003, v. 85, p. 27-35.

216. Model P.G., Bornstein M.B., Crain S.M., Pappas G.D. An electron microscopic study of the development of synapses in cultural fetal mouse cerebrum continuously exposed to xylocain. J.Cell Biol., 1971, v. 2, p. 113-126.

217. Modesto E., Lampe P.D., Ribeiro M.C., Spray D.C., Campos de Carvalho A.C. Properties of chiken lens MIP channels reconstituted into planar lipid bilayers. J. Memb. Biol., 1996, v. 154, p. 239-249.

218. Moshkov D.A., Tiras N.R. and Saxon M.E. Phalloidin changes the synaptic contacts ultrastructure. Naturwissenschaften, 1980, Bd. 67, S. 194-195.

219. Moshkov DA. and Santalova I.M. Distribution of calcium pyroantimonate precipitates in Xenotoca Mauthner cells at normal and increased functional activity. Neuroscience, 1995, v.65, №3, p.917-925.

220. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Westcott W.C. Reconstruction of excitable cell membrane structure in vitro. Circulation, 1962, v. 26, p. 1167-1172.

221. Muller W., Connor J. A. Dendritic spines as individual neuronal compartments-for synaptic Ca2+responses. Nature, 1991, v.354, p.73-76.

222. Mulkey R.M., Malenka R.C. Mechanisms underlying induction of homosynaptic long-term depression in area CA1 of the hippocampus. Neuron, 1992, v. 9, p.967-975.

223. Musa H., Gough J.D. et al. Ionic blockade of the rat connexin40 gap junction channel by large tetraalkylammonium ions. Bioph .J., 2001, v.81, p. 3253-3274.

224. Nakajima Y. Fine structure of the synaptic ending on the Mauthner cell of the goldfish. J. Compar. Neurol., 1974, v. 156, p. 375-402.

225. Nakayama A.Y., Harms M.B., Luo L. Small GTFases Rac and Rho in the maintenance of dendritic spines and branches in hippocampal pyramidal neurons. J.Neurosci., 2000, v. 20, p. 5329-5338.

226. Nusser Z., Lujan R., Laube G., Roberts J.D.B., Molnar E., Somogyi P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor nember and variability in the hippocampus. Neuron, 1998, v. 21, p. 545-549.

227. Oda Y., Kawasaki K., Morita M. et al. Inhibitory long-term potentiation underlies auditory conditioning of goldfish escape behaviour. Nature, 1998, v. 394, p. 192-185.

228. Oda Т.К., Makino I., Yamashita K., Namba, Y.Maeda. Distinct structural changes detected by x-ray fiber diffraction in stabilization of F-actin by lowering pH and increasing ionic strength. Biophys. J., 2001, v. 80, p. 841-851.

229. Ohki S., Marcus E., Sukumaran D.K., Arnold K. Interaction of mellitin with lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1994, v. 1194, p. 223-232.

230. Рак D.T.S., Sheng M. Targeted protein degradation and synapses remodeling by an inducible protein kinase. Science, 2003, v.302, p. 1368-1373.

231. Pappas G.D., Cohen E.B., Purpura D.P. Fine structure of synaptic and non-synaptic neuronal relations in the thalamus of the cat. In Purpura D.P., Yahr M.D (eds). The Thalamus. Columbia University, N-Y, 1966, p. 47-75.

232. Pappas G.D., Waxman S.G.Synaptic fine structure-morphological correlated of chemical and electronic transmission. In: Structure and function of synapses. N.Y. Raven Press, 1972, p. 1-43.

233. Pardee J.D., Spudich J.A. Purification of muscle actin. Mehtods Cell Biol., 1982, 2A, p. 271-289.

234. Pavlik L.L., Moshkov D.A. Actin in synaptic cytoskeleton during long-term potentiation in hippocampal slices. Acta histochem. Suppl., 1992, Band XLI, p.257-264:

235. Pereda A., Triller A., Korn H. and Faber D.S. Dopamine enhances both electrotonic coupling and chemical excitatory postsynaptic potential at mixed synapses. PNAS USA , 1992, v.89, p. 12090-12092.

236. Pereda A.E., Nairn A.C., Woltszon L.R., Faber D.S. Postsynaptic modulation of synaptic efficacy at mixed synapses on the Mauthner cell. J. Neurosci., 1994, v.14, p. 3704-12.

237. Pereda A., Bell Th. D„ Faber D. S. Retrograde synaptic communication via gap junctions coupling auditory afferents to the Mauthner cell. J. Neurosci., 1995, v. 16, p. 983-992.

238. Pereda A., Brien J.O., Nagi J.I., Bukauskas F., Davidson K.G.V., Kamasawa N., Yasumura Т., Rash J.E. Connexin35 mediates electrical transmission at mixed synapses on Mauthner cells. J. Neurosci., 2003,v. 23, #20, p. 7480-7503.

239. Pettus Ed.H., Povlishock J.T. Characterization of a distinct set of intraaxonal ultrastructural changes associated with traumatically induced alteration of axolemmal permeability. Brain Res., 1996, v. 722, p. 1-11.

240. Peuvot J., Schanck A., Lins L., Brasseur R. Are the fusion processes involved in birth, life and death of cell depending on tilted insertion of peptides into membranes? J.Theor. Biol., 1999, v. 198, p. 173-181.

241. Picard J. J. Ultrastructure of the cement gland of Xenopus laevis. J. Morphol., 1976. v. 148, p. 193-208.

242. Pollard Th.D., Borosy G.G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell, 2003, v. 112, p. 453-465.

243. Popov S. V., Svitkina T.M., Margolis L.B., Tsong T. Y. Mechanism of cell protrusion formation in electrical field: the role of actin. Biochem. Biophys. Acta, 1991, v. 1066, p. 151-158.

244. Portlock S.H., Clague M.J., Cherry R.J. Leakage of internal markers from erythrocytes and lipid vesicles induced by melittin, gramicidin S and alamethicin. Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1030, p. 1-10.

245. Purves D., Hadley R.D. Changes in the dendritic branching of adult mammalian neurons revealed by repeated imaging in situ. Nature, 1985, v. 315, p. 404-406.

246. Rail W., Rinzel J. Branch input resistance and steady state attenuation for input to one branch of a dendritic neuron model. Biophys.J., 1973, v. 13, p.648-688.

247. Ramon у Cajal S. Neue Darstellung vom histologischen Bau des Zentralnervensystem. Arch. Anat. Entwick. 1893, p. 319-428. (цитир. no Yuste, Bonhoeffer).

248. Regehr W.G., Tang D.W. Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells. J. Neurosci.,1992, v. 12, p. 4202-4223.

249. Revel J-P., Brown S.S. Cell junction in development with particular reference to the neural tube. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1976, v. 140, p. 443455.

250. Revel J-P.,Karnovsky M.J. Hexagonal array of subunits in itercellular junction of the moyse heart and liver. J. Cell Biol. 1967, v. 33, p. 7-12.

251. Reume A.G., de Sousa P.A., Kulkarni S., Langille B.L., Zhu D., Davies T.C., Juneja S.C., Kedder G.M., Rossant J. Cardiac malformation in neonatal mice lacking connexin43. Science, 1995, v. 267, p. 1831-1834.

252. Rioux L., Gicquaud C. Actin paracrystalline sheets formed at the surface of positively charged liposomes. J. Ultrastructure Res., 1985, v. 93, p. 42-49.

253. Robertson J.D. The occurrence of a subunit pattern in the unit membranes of club endings in Mauthner cell synapses in goldfish brain. J. Cell Biol., 1963, v.19, p. 201-220.

254. Rorig В., Sutor B. Regulation of gap junction coupling in the developing neocortex. Molec.Neurobiol., 1996, v. 12, №. 3, p. 225-249.

255. Rose S.P.R. What should a biochemistry of learning and memory be about?// Neuroscience, 1981, v.6, p. 811-821.

256. Rose В., Rick R. Intercellular pH, intercellular free Ca++ and junctional cell-cell coupling. J. Membr. Biol., 1978, v. 44, p. 377-415.

257. Rose В., Simpson I., Loewenstein W.R. Calcium ion produces graded changes in permeability of membrane channels in cell junction. Nature, 1977, v. 267, p. 625-627.

258. Rosenkranz A.A., Antonenko Y.N., Smirnova O.A., Yurov G.K., Naroditsky B.S., Sobolev A.S. Avian adenovirus induces ion channels in model lipid membranes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997, v. 236, p. 750-753.

259. Rosenmund C., Westbrook G.L. Calcium-induced actin depolimerization reduces NMDA channel activity. Neuron, 1993, v.10, p.805-814.

260. Rossier M.F., Putney J.W. The identity of the calcium-stiring inositol 1/4/5-threephosphate-sensitive organelle in non-muscle cell: calcisome, endosome, endoplasmic reticulum.or both? Trends neurosci., 1991, v.14, p.310-314.

261. Rovainen C.M. Electrophysiology of vestibulospinal and vestibuloreticulospinal systems in Lampreys. J. Neurophysiol., 1979, v.42, p. 745766.

262. Royer S., D. Pare. Conservation of total synaptic weight through balanced synaptic depression and potentiation. Nature, 2003, v. 422, p. 518-522.

263. Rozental R., Giaume C. and Spray D.C. Gap junction in the nervous system. Brain Res.Reviews, 2000, v. 32, p. 11-15.

264. Sabatini B.L., Maravall M., Svoboda K. Ca2+-signalling in dendritic spines . Curr. Opin. Neurobiol., 2001, v.l 1, p. 349-356.

265. Sachs F. Biophysics of mechanoreception. Membr. Biochem., 1986, v. 6, p.173-195.

266. Saez J.C., Connor J.A. et al. Hepatocyte gap junctions are permeable to the second messenger, inositol 1,4,5-triphosphate, and to calcium ions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, p. 2708-2712.

267. Saito A., Wang Ch-T. and Fleischer S. Membrane asymmetry and enhanced ultrastructural detail of sarcoplasmic reticulum revealed with use of tannic acid. J.Cell Biol., 1978, v. 79, p. 601-61.

268. Schikorski Т., Stevens C.F. Quantitative ultrastructural analysis of hippocampal excitatory synapses. J.Neurosci., 1997, v.17, p. 5858-5867.

269. Schmidt J. Г., Shashoua V. E. Antibodies to ependymin block the sharpening of the regenerating retinotectal projection in goldfish: Brain Res., 1988, v. 446, p. 269-284.

270. Schuster Th. Experimental alteration in number and length of different membrane complexes on axosomatic contact in the trout (Salmo iridens, Gibbon, 1885). J. Hirnforschung, 1978, v. 19, p. 45-73.

271. Scott J.M., Zottoli S.J., Bwatty N.P., Korn H. Origin and function of spiral fibers projecting to goldfish Mauthner cell. J. Compar. Neurol., 1994, v. 330, p.76-90.

272. Shapovalov A.I., Shiriaev B.I. Dual mode of junctional transmission at synapses between primery afferent fibers and motoneurons in the amphibian. J. Physiol., 1980, v. 306, p. 1-15.

273. Sharp A.H., McPherson P.S., Dawson T.M. et al. Differentialimmunohistochemical localization of inositol 1,4,5-triphosphate and ryanodine-iisensitive Ca release channels in rat brain. J. Neurosci., 1993, v. 13, p. 30513063.

274. Sheng Z.H., Retting J., Cook Т., Catterall W.A. Calcium-dependent interaction of N-type calcium channels with the synaptic core complex. Nature, 1996, v. 379, # 6564, p. 451-454.

275. Sheperd G.M. The dendritic spine: a multifunctional investigative unit. J.Neurophysiol., 1996, v.75, p. 2197-2210.

276. Sheterline P., Sparrow J.C. Actin. Protein profile. 1994, v. 1. P. 1-121.

277. Sheterline P., Clayton J., Sparrow J.C. Actin. Oxford: University Press? 1998, 272 pp.

278. Sorra K.E., Fiala J.C., Harris K.M. Critical assessment of the involvement of perforations,spinules and spines branching in hippocampal formation. J. Compar. Neurol., 1998, v. 398, p. 225-240.

279. Sorra K.E., Harris K.M. Overview on the structure, composition, function, development, and plasticity of hippocampal dendritic spines. Hippocampus, 2000, v. 10, p. 501-511.

280. Southwick F. S., Punch D. L Dynamic remodelling of the actin cytoskeleton: lessons learned from Listeria locomotion. Bio Essays, 1994, v. 16, p. 885-891.

281. Spudich J. A., Watt S. J . The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolitic fragments of myosin. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, p. 4866-4871.

282. Star E.N., D.J.Kwiatkowski, V.N.Murthy. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature neurosci., 2002, v.5, p. 239-246.

283. Staehelin L.A. structure and function of intercellular junctions. Inter. Rev. Cytol.1974, v. 39, p. 191-283.

284. Sternberger L.A. Immunohystochemistry. NewYork. Wiley, 1979,487 pp.

285. Stevens C. A million dollar question: does LTP=Memory? Neuron, 1998, v. 20, p. 1-2.

286. St-Onge D., C. Gicquaud. Evidence of direct interaction between actin and membrane lipids. Biochem. Cell Biol., 1988, v. 67, p. 297-300.

287. Suzuki M., Miyazaki K., Ikeda M., Kawaguchi Y., Sakai O. F-actin network may regulate a Cl-channel in renal proximal tubule cells. J. Memb. Biol., 1993, v.134, p.31-39.

288. Syversen T. L. M., Sager P. Д., Clarkson T. W., Cavanagh J. G., Elgsaeter A., Guldberg H. C., Lee S. D., Lichtman M. JI., Mottet N. K., Olmsted J. B. The cytoskeleton. A target for toxic agents. New York, London, 1986, p. 23-34.

289. Tang J.X., Janmey P.A. The polyelectrolyte nature of F-actin and the mechanism of actin bundle formation. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 8556-8563.

290. Tanzi G. I fatti i le indizioni nell'odierna istologi del sistema nervoso. Rev. Sper. Freniatr., 1893, v.19, p. 419-72. (цитиров. no Yueste, Bonhoeffer).

291. Tarahovsky Y.S., Khusainov A.A., Daugelavichus R., Bakene E. Structural changes in Escherichia coli membranes induced by bacteriophage T4 at different temperature. Biophys. J., 1995, v. 68, p. 157-163.

292. Teyler T.J., Cavus I., Coussens C. Synaptic plasticity in the hippocampal slice: functional consequences. J. Neurosci. Meth., 1995, v. 59, p. 11-17.

293. Tiras N.R., Pavlik L.L. and Moshkov D.A. Alterations in the cytoskeleton of the goldfish Mauthner cells under various pharmacological treatments. Acta histochem., 1992, Suppl.-Band XLI, S.249-256

294. Tiras N.R., Zherdev G.V. and Moshkov D.A. Ultrastructure of Mauthner cells in fish adopted to long-duration vestibular stimulation and the effect of ethanol. Neural Plasticity, 1999, v.6. № 4, p. 91-102.

295. Thompson S.M. Synaptic plasticity: Building memories to last// Current Biology, 2000, v.10, R218-R221.

296. Thomson A. M. Facilitation, augmentation and potentiation at central synapses. Trends Neurosci., 2000, v. 23, № 7, p. 305-312.

297. Toni N., Buchs P.A., Nikonenko I. et al. LTP promotes formation of multiple spine synapses between a single axon terminal and a dendrite. Nature, 1999, v.402, p. 421-25.

298. Torri-Torelli F., Grohovaz F., Fesce R., Ceccarelli B. Temporal coincidence between synaptic vesicles fusion and guantal secretion of acetylcholine. J. Cell Biol. 1985, v. 101, p. 1986-1999.

299. Tuttle R., Masuko S. and Nakajima Y. Freeze-fracture study of the large myelinated club ending synapse on the goldfish Mauthner cell: special reference to the quantitative analysis of gap junction. J. Compar. Neurol., 1986, v.246, p.202-211.

300. Uchida N., Honjio Y., Johnson K.R., Wheelock M.J., Takeichi M. The catenin/cadherin adhesion system is licalized in synaptic junctions bordering transmitter release zones. J.Cell Biol., 1996, v. 135, p. 767-779.

301. Van Harreveld A., Fifkova E. Swelling of dendritic spines in fscia dentata after stimulation of the perforant fibers as a mechanism of post-tetanic potentiation. Exp. Neurol., 1975, v.49, p. 736-49.

302. Valverde F. Apical dendritic spines of visual cortex and light deprivation in the mouse. Exp. Brain Res., 1967, v. 3., p. 337-352.

303. Velazques J.L.P., Han D., Carlen P.L. Neurotransmitter modulation of gap junctional communication in the rat hippocampus. Europ. J. Neurosci., 1997, v. 9, #12, p. 2522-2531.

304. Vera В., Sanchez-Abarca L.I. et al. Inhibition of astrocyte gap junctional communication by ATP deplet is reversed by calcium sequestration. FEBS Lett., 1996, v.392, N3, p. 225-228.

305. Voronin L.L. Synaptic modification and memory. An electrophysiological analysis., Berlin, Springer-Verlag 1993, 303 pp.

306. Wachsstock D. U; Schwarz W. H., Pollard Th. D. Cross-linker dynamics determine the mechanical properties of actin gels . Biophys. J., 1994, v. 66, p. 801-809.

307. Wang Y. and Rose B. Clustering of Cx43 cell-to-cell channels into junction plaques: regulation by cAMP and microfilaments. J.Cell Sci., 1995, v. 108, p.3501-3508.

308. Weeks A.C.W., Ivanco T.L., LeBoutillier J.C., Petit T.L. Sequental changes in the synaptic structural profile following long-term potentiation in the rat dentate gyrus: II. Induction/early maintenance phase. Synapse, 2000, v. 36, p. 97-107.

309. Weeds A. G., Pope B. Studies of the chymotryptic digestion of myosin. Effect of divalent cations on proteolytic susceptibility. J. Mol. Biol., 1977, v. 111, p. 129-157.

310. Wesa J.M., Chang F-L.F., Greenough W.T., West R.W. Synaptic contact curvature:effects of differential rearing on rat occipital cortex. Develop. Brain Res., 1982, v. 4(2), p. 253-257.

311. Wessel R. In vitro study of phase resetting and phase locking in a time-comparison circuit in the electric fish, Eingenmannia. Biiophys. J., 1995, v. 69, p. 1888-90.

312. Westenbroek R. V.Ahlijanian, W.Catteral. Clustering of L-type Ca2+ channels at the base of major dendrites in hippocampal pyramidal neurons. Nature, 1990, v.347, p. 281-284.

313. Wiesner S, heifer E., Didry D, Ducouret G., Lafuma F., Carlier M.-F., Pantaloni D. A biomimetic motility assay provides insight into the mechanism of actin-based motility. J. Cell Biol., 2003, v. 160, (3), p. 387-398.

314. Wilson N.F., Snell W.J. Microvilli and cell-cell fusion during fertilization. Trends Cell Biol, 1998, v. 8, p. 93-96.

315. Wilson-Kubalek E.M, Brown R.E, Celia H, Milligan R.A. Lipid nanotubules as a substrate for helical crystallization of macromolecules. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998, v.95, p. 8040-8045.

316. Wickens J. Electrically coupled but chemically isolated synapses: dendritic spines and calcium in a rule for synaptic modification. Prog. Neurobiol, 1988, v. 13, p. 507-528.

317. White W, Bruzzone R. Gap junctions: fate worse than death? Current Biology, 2000, v. 10, p. 685-688.

318. WulfE, Deboben A, Bautz A, Faulstich H, Wieland Т.Н. Fluorescent phallotoxin, a tool for the vizualization of cellular actin. Proc.Natl. Acad. Sci USA, 1979, v.76, p.4498-4502.

319. Xu Z., Cork L.C., Griffin J.W., Cleveland D.W. Increased expression of neurofilament subunit NF-L produces morphological alterations that resemble pathology of human motor neuron desease. Cell, 1993, v.73, p.23-33.

320. Yamane Y., Shiga H., Sou H. and Ito E. Gap junction channel inhibition alters action organization and calcium propagation in rat cultured astrocytes. Neuroscience, 2002, v. 112, #3, p. 593-603.

321. Yanka Z. Latzkovitz, Yoo, Sventistvangi J. Cell-to cell contacts in primary cultured of dissociated chiken embrionic brain. Cell Tissue Res., 1979, v. 199, p. 153-157.

322. Yang X.D., Korn H. and Faber D.S. Long-term potentiation of electrotonic coupling at mixed synapses. Nature, 1990, v. 348, p. 542-545.

323. Yang Q., Michelsen H.B. Gap junctions synchronize the firing of inhibitory interneurons in guinea-pig hippocampus. Brain Res., 2001, v. 907, p. 139-143.

324. Zhang Y.D.W., McBride J.R. and Hamill O.P. The ion selectivity of membrane conductance inactivated by extracellular calcium in Xenopus oocytes. J.Physiol., 1998, (Lond.), v.508, № 3, p.763-776

325. Zhang W., D.L.Benson. Stages of synaptic development defined by dependance on F-actin. J. Neurosci., 2001, v. 21, p. 5169-81.

326. Zottoli S.J and Faber D.S. An identifiable class of statoacoustic interneurons with bilateral projection in the goldfish medulla. Neuroscience, 1981, v. 5, p. 1287-1302.

327. Zottoli S.J and Faber D.S. Properties and distribution anterior VIII nerve exitatory inputs to the goldfish Mauthner cell. Brain Res., 1979, v. 174, p. 319323.

328. Zottoli S.J., Faber D.S. The Mauthner cell: what has it taught us? The neuroscientist, 2000, #6, p. 26-38.

329. Yuste R., Denk W. Dendritic spines as basic units of synaptic integration// Nature, 1995, v.375, p.682-684.

330. Yuste R., T.Bonhoeffer. Morphological changes in dendritic spines associated with long-term synaptic plasticity. Ann. Rev. Neurosci., 2001, v.24, p. 1071-89.

331. Xu Z., Cork L.C., Griffin J.W., Cleveland D.W. Increased expression of neurofilament subunit NF-L produces morphological alterations that resemble the pathology of human motor neuron desease. Cell, 1993, v.73, p. 23-33.

332. Благодарю коллег, сотрудников лаборатории ультраструктуры нейрона, в которой была выполнена работа, за сотрудничество, помощь и моральную поддержку. Коллег из других лабораторий благодарю за участие при выполнении совместных работ.

333. Работа выполнена при финансовой поддержке: Фонда Дж. Сороса (JCD-100) и Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 96-04-50617, 9804-48021,01-04-48053).