Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск признаков длительной потенциации в естественной модификации функции Маутнеровских нейронов золотой рыбки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Поиск признаков длительной потенциации в естественной модификации функции Маутнеровских нейронов золотой рыбки"

На прагм /ч копись

Ллчкч Дмитрий Алекса!ироиич

Пи'чи- ••¡,:1н:лков лшгмьчич п(,11'1!!;!1,(|;Ы1 в естественной мотмфнкяпим ф . ш.-цнн \1а.м нгрсг.ских гсчронов золотой рмбкг

fb.li! О (П'с/чли.,

,КЮ!'Ь<?' ГГ-41

1>*1;и'р| лип. н<. (.сиск-лнио \ ченой с 101 >: 1 • к ач 1а 1о ю ■ V•: 1 \ на,-!.'

I киши I 20 »!

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона

Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г.Пущино

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Д.А. Мошков

Официальные оппоненты: доктор биоло! ических наук

В.И. Архипов

заслуженный деятель науки РФ, докюр биологических наук, профессор 11.С. Косииин

Ведущая организация:

Институт Биофизики Клетки РАН

Диссертационно! о совет Д 002.093.01 в Инетту 1е Теоретической и Эксперимешальной Биофизики РАН ноа1ресу: 142290.1. Пушимо. Московской обл., уд. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссергациеп можно ознакомиться и библиотеке И Г)Б РАН но адресу 142290, г. Пушимо. Московской обл., ул Инсти1у гская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан « » МАрюД 2004 1.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат фкзико --математических наук

Лапина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

Длительная потенциация (Д11), модельная форма синаптической памяти, тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды (Wickens, 1988; Calvarley, Jones, 1990; Stevens, 1996). Возможно, ДП является физиологической основой для определенных видов естественной адаптации, обучения и памяти (Stevens, 1998). Возлагались определенные надежды на то, что ее всестороннее исследование объяснит, как осуществляется обучение и запоминание в нейронах на функциональном, структурном и молекулярном уровнях. Вместе с тем, со времени открытия ДП (Брагин, Виноградова, 1973; Bliss, Lomo, 1973), несмотря на многочисленные данные о ее механизмах, участие ДП в памяти до сих пор остается неясным. Вовлечение модельных форм памяти, чаще всего ДП и длительной депрессии (ДД), в формирование естественной памяти пытаются выявить, используя преимущественно различные физиологические и фармакологические подходы (Baudry, 2000; Абрамцев, 2000; Большаков, 2001). Пока к особому успеху это не привело. Морфофункциональные исследования взаимоотношения модельных и естественных форм памяти на системном уровне или на целостном мозге и его крупных отделах тоже оказались непродуктивными (Bailey, 1999; Thomson, 2000). Это связано с чрезвычайной сложностью организации нервных центров, в которых их изучают, и невозможностью точно определить вклад функции этих центров в естественное поведение. По нашему мнению, адекватным объектом для этих целей могут служить Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки, имеющие определенную и легко регистрируемую экспериментально изменяемую функцию, проявляемую в специфическом поведении. В них удалось обнаружить различные виды естественной и искусственной (модельной) пластичности: модификацию поведения, обусловленную изменениями функционального состояния МН, ДП и ДД смешанных синапсов, адаптацию (депрессию) химических синапсов (Мошков, 1985; Yang, Faber, 1990; Yang et. al., 1991; Павлик, 1997, 1999; Moshkov et. al., 1998; Oda et. al., 1998; Faure, 2000). Остается непонятной роль элементов синапсов, вовлекаемых в повышение проводимости при ДП. Неизвестно, вовлекается ли ДП в адаптацию, естественную модификацию функции МН. Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции функционирования мозга необходимы сравнительные морфофункциональные исследования механизмов Д11 и естественной адаптации.

Цель и задачи исследования:

Целью работы было определить специфические ультраструктурные признаки посттетанической (модельной) ДП в смешанных синапсах МН, а затем исследовать, не обнаруживаются ли они в этих синапсах при естественно выработанной модификации функции, проявляемой в свободном поведении рыбок.

юс. тнначальная

БИГ>п 'i'.IEKA С.Петербург

JOOfaPK

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктуру МЫ золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротонического ответа (модельной формы памяти) и адаптации (естественной формы памяти).

2. Выявить похожие структурные изменения в афферентных смешанных синапсах.

3. 11роизвести сравнительный качественный и количественный ультраструктурный анализ контактов афферентных смешанных синапсов и других структурных изменений (мостиков).

Научная новизна работы:

Впервые в сравнительном аспекте изучена ультраструктура МН золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротоническою ответа, модельной формы синашической памяти, и адаптации, резистенции к утомлению, естественной формы нейрональной памяти. В обоих случаях в щели десмосомоподобных контактов (ДГЖ) афферентных смешанных синапсов МН выявлено пропорциональное увеличение числа фибриллярных мостиков. Показано, что фибриллярные мостики в щели ДПК смешанных синапсов являются специфическим признаком, отличающим их от ДПК химических синапсов. Впервые с помощью метки фаллоидин - золото установлено, что мостики содержат филаментозный (Ф-) актин. При сравнительных цитохимических исследованиях пироаншмонатным методом локализации ионов кальция в смешанных синапсах адаптированных МН, а также при аппликации блокатора или активатора проницаемости щелевых контактов (ЩК) впервые показано, что ЩК при адаптации оказываются заблокированными, индикатором чего было заполнение щели ЩК плошыми преципитатами, отсутствующими в контроле и при усилении проводимости. В то же время мостики в щели ДПК интенсивно декорировались преципитатом. Это указывало на вероятность функционирования мостиков в этих }словия\ как своеобразных катионных транссинаптических шунюв. Обнаружение структурного признака ДП, имеющего, по-видимому, такие же функциональные последствия и в смешанных синапсах адаптированных МН, дает основание предположить, что ДП, модельная форма пластичности, может быть естественным свойством нервной системы

Научно - практическая значимость исследования:

I Доведенные исследования имеют теоретическое и определенное практическое значение. Теоретическое значение работы мы видим в обнаружении новой структуры в щели ДПК смешанных синапсов - актиновых мостиков, которые, по-видимому, участвуют в усилении электротонической передачи Эти данные расширяют наши представления о процессах адаптации на нейрональном уровне, а в более широком смысле - о нехимических свойствах коммуникации в мозге, учитывая широкое распространение ДПК в различных отделах мозга

Практическая значимость работы заключается в возможной последующей разработке подходов к управлению адаптивными процессами в ЦНС путем воздействия на Состояние филаментозного актина различными фармакологическими и физиологически активными веществами.

Апробация работы:

Результаты работы были доложены на конференции «Цитоскелет и клеточная регуляция» (Пущино, май 2000); школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, июнь 2000); на VII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нсйробиолог ии» (Казань, сентябрь 2000); на XVIII съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, сентябрь 2001); на IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии (Санкт-Петербург, май 2002); на Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2002); на VII Пущинской конференции «Биология. Наука XXI века» (Пущино, апрель 2003); на Международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы» (Украина, Донецк, июнь 2003); на Международном научном семинаре «Прогресс в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина» (Египет, Хургада, февраль 2004).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых журналах. Из них одна принята к печати

Структура и объём диссертации:

Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы».

Диссертация изложена на_страницах, содержит_рисунков,_таблиц

и библиографический список из_источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования:

В качестве объекта исследования использовали мальков золотой рыбки Carassius auratus auratus породы Шибункин и Вакин, длиной 3 см, массой около 3 г, 3-4 месячного возраста. Всего в основных экспериментах было использовано около 400 рыбок.

Сенсорную стимуляцию МН через вестибулярный аппарат, главный источник афференации МН (Eaton et al., 1988), проводили в специальной установке (Мошков, 1985), вращающей рыб в 2-х плоскостях со скоростью 42 оборота в минуту. Стимуляции подвергалось одновременно 14 рыбок. Утомление МН индуцировали непрерывной 2-х часовой стимуляцией. Для

выработки адаптированного состояния МН к утомляющей нагрузке рыбок в течение 15 дней, 2 раза в сутки, утром и вечером, подвергали коротким стимуляциям, с каждым разом удлиняющимся на 1 минуту. В первый день она продолжалась 1 мин. утром и 2 мин. вечером, интервал составлял 9 часов. Во второй день - 3 мин. утром и 4 мин. вечером, и т.д., до 30 мин. на 15 сутки. Оценку адаптации проводили через 3 суток после окончания стимуляций путем наблюдения активности рыбок до и после длительной вестибулярной стимуляции и сравнения ее с аналогичными данным, полученными на интактных рыбках.

Оценку функциональной активности МН проводили косвенным путем по поведению рыбки в кольцевой камере (Мошков, Подольский и лр. 1982), подсчитывая в течение 10 мин. число поворотов, совершаемых рыбкой с помощью унилатерального удара хвостового плавника, инициируемого активацией МН (Canfíeld et al., 1993). Пример регистрации адаптированного состояния МН косвенным методом представлен на рис. 1. В настоящее время установлено, что такая косвенная неинвазивная регистрация функции МН in vivo тесно коррелирует с электрической активностью тех же нейронов, регистрируемой в виде спайка в электрофизиологических экспериментах in vitro (Михеева, 1999; Тирас и др., 2002). Пример прямой регистрации адаптированного состояния МН представлен на рис. 2.

120

Рис. 1. Проявление адаптированного состояния МН в поведении золотой рыбки.

Видно, чю в то время как интактные рыбки утомляются после 2-х часовой сенсорной стимуляции, адаптированные рыбки остаются нечувствительными к ней

* - достоверно отличается от контрольных значений, р < 0,05

0

интактные

адаптированные

□ до стимуляции ■ после стимуляции

Интактный нейрон

Рис. 2. Функциональное состояние МН, тес-

состояние МН, тестированное по электро-тоннческому ответу in vitro.

А - до утомительной стимуляции (2 часа), Б - сразу после стимуляции, В - через час после стимуляции Точкой отмечен момент нанесения тест-стимула Пунктирная линия - базовая.

Для олектрофизиологических исследований МП фронтальные срезы изолированного продолговатого мозга толщиной 1-2 мм инкубировали при температуре 15°С. Блоки продолговатого мозга готовили при помощи вибротома и помещали в камеру, содержащую модифицированную среду Рингсра следующего состава (в мМ): NaCl, 76; КС1, 0,4; СаСЬ, 4,0; NaHCO¡, 12,5; MgS04, 2,6; KH2P04, 1,2; глюкоза, 2,0, среду титровали ЮмМ 1рис-НС1 до рН 7,5. Инкубационная проточная камера погружного типа постоянно насыщалась смесью кислорода и углекислого газа (95% и 5% соответственно). При извлечении мозга рыбок для анестезии помещали на тающий лед. Функциональное состояние фрагментов мозга на первых этапах работы оценивали по спонтанной активности неидентифицированных клеток, а в последующем - по регистрации внеклеточных вызванных ответов МН. В электрофизиологических экспериментах, которые выполнялись совместно с П.И. Пахотиным (ИБК РАН) in vitro в условиях, описанных выше, экстраклеточные электрические ответы МН записывали непрерывно в процессе инкубации срезов до 5 часов по стандартной методике, описанной ранее для исследования МН рыб in vivo (Furshpan, Furukawa, 1963; Yang et al., 1990). Стимулирующие биполярные вольфрамовые электроды с сопротивлением кончика 0,1 МОм устанавливали на задние корешки 8-го нерва и раздражали прямоугольными импульсами тока (50-500 мкА, 0,2 мс). Ответ МН регистрировали экстраклеточно вольфрамовым микроэлектродом (1-3 МОм), подведенным вертикально с дорзальной поверхности мозга на расстояние 10-20 мкм от сомы МН. Тетанизацию корешков 8-го нерва проводили током частотой 200-400 имп/с 3 раза по 1с с интервалом 30 с. Для индукции длительной потенциации применяли тетанизацию корешков 8 нерва током двух уровней интенсивности: пороговой и надпороювой. С помощью специальной программы получали суперпозицию 5 ответов МН и усредненные значения

Рис. 3. Пример усиления элекгро-тонического ответа МН после тетанизации афферентного входа, заканчивающегося смешанными синапсами на днетальном участке латерального дендрита. Усиление ответа заключается в увеличении его амплитуды. А - ответ МН до тетанизации; Б - после тетанизации. Точкой отмечен момент нанесения тест-стимула Пунктирная линия -базовая.

Для электронномикроскопического анализа материал фиксировали в течении 16 часов по принятой в лаборатории методике в растворе альдегидного фиксатора, содержащем формальдегид, диметилсульфоксид и глутарапьдегид на 0,1 М какодилатном буфере, (рН 7,2), дофиксировали в 2% растворе 0s04 на том же буфере в 1ечение 2 часов, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заключали в Эпон-812 (Мошков,

амплитуд и латентных периодов (рис. 3).

1985). Готовили срезы толщиной 10 мкм и после идентификации нужных участков, содержащих МЫ или их дендриты, срезы фотографировали в световом микроскопе NU-2E, переклеивали на чистые эпоновые блоки и получали ультратонкие срезы на ультратоме LK.B-3. После последовательного контрастирования водными растворами уранилацетата и цитрата свинца ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Tesla BS-500 и фотографировали при увеличении 10000 и 14000х.

Электронномикроскопические исследования МН в переживающих срезах проводили после электрофизиологической регистрации их активности. После инкубации, тетанизации и идентификации Д11 в течение 2-х часов срезы переносили в фиксирующий раствор. При опенке ультраструктуры МН в качестве контроля использовали срезы продолговатого мозга, не подвергаемые стимуляциям, находящиеся в инкубационной камере то же время, что и подопытные срезы.

Для морфометрического анализа структуры синапсов использовали метод, специально разработанный в нашей лаборатории для последующих целей исследования пластичности синапсов МН (Коган и др. 1981). Почти все значимые для выводов измерения повторно проводили в «слепом» варианте с негативов на приборе «Микрофот» с общим увеличением 90000х. Измеряли протяженность сечения всего синаптического контакта (прилегания смешанного или химического синапсов к поверхности дендрита), длину индивидуальных профилей специализированных контактов - активных зон (A3), ЩК и ДПК, число и суммарную длину их в пересчете на синапс. Морфометрические данные обрабатывали стандартными статистическими методами.

Хроматографически чистый цитохалазин D (Calbiochem, США) растворяли до концентрации 4 мкг/мл в физиологическом растворе с добавлением диметилсульфоксида до конечной концентрации 0,25 % и при холодовой анестезии в объеме 5 мо апплицировали на МН Контрольным рыбкам на МН апплицировапи физиологический раствор. 11римерно через 20 часов после инъекции мозг выделяли. Электрофизиологическую часть выполняли по выше описанной методике.

Хроматографически чистый фаллоидин (Sigma, США) разводили в дистиллированной воде до концентрации 10 мг/мл. Раствор фаллоидина объемом 5 мкл при холодовой анестезии апплицировали на МН. Контрольным рыбкам вводили равный объем дистиллированной воды. Мозг выделяли через 5 часов после аппликации. При проведении электрофизиологических исследований применяли метод изучения влияния на эффективность синаптической передачи парных стимулов (11авлик и др., 2003).

По электрофизиологическим данным аппликация этих веществ на МН вызывала усиление электрической передачи в смешанных синапсах (фаллоидин) (Павлик и др., 2003) и долговременную депрессию такой передачи (цитохалазин D) (Павлик и др., 1999).

Декорацию маркером фаллоидин - коллоидное золото с размером чаешц 15нм проводили по ранее описанном) методу (Lachapelle, 1988). Для выявления

актина в МН на ульгратонких срезах моз! фиксировали в растворе 2% параформа и 0,1% глутаральдегида и заключали в смолу Ы?-\УЬке или К4М.

Цитохимическую фиксацию для выявления локализации ионов кальция пироантимонатом калия (Петруняка, 1987) проводили в следующей последовательности: фрагменты продо;иоватого мозга с МН погружали на 15 мин. в фиксатор, содержащий 2% пироантимонат калия, 2% глутаральдегид, 0,2% таниновую кислоту и 0,5% 1ритон Х-100 при рН 9,0, которую доводили добавлением соответствующих количеств КОН. Затем объекты помещали на 3 часа в аналогичный фиксатор, не содержащий Тритон Х-100. Постфиксацию проводили в течение 2-х часов в растворе, содержащем 2% пироантимонат калия и 2% тетроксид осмия. Далее образцы промывали в 0,2% растворе тритона Х-100, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне и заливали в Эпон. Все растворы, где использовался пироантимонат калия, были приготовлены на деионизованной воде. Цитохимическую реакцию проводили при комнатной температуре. Контролем специфичности реакции осаждения Са2+ пироантимонатом калия была обработка ультратонких срезов с МН, содержащих преципитаты по результату просмотра и идентификации их в электронном микроскопе, в течение 1 часа при 37°С 20 мкл раствора ЭГТА, имеющего рН р 7,2 - 7,4. В результате данной обработки было выявлено исчезновение почти всех гранул осадка в тех локусах, где они перед этим обнаруживались.

Результаты и обсуждение:

1. Поиск специфического признака, ответственного за ДП смешанных синапсов. Обнаружение мостиков в ДП К

Качественный анализ ультраструктурных данных показывает, что инкубация в течение 5 часов не оказывает значительного разрушительного воздействия на нейроны и афферентные смешанные синапсы МН. В таблице 1 представлены результаты количественного анализа основных компонентов смешанных синапсов после длительной инкубации (контроль) и теганизации, вызывающей потенциацию различного уровня (75% и 90%) (опыт).

При изучаемых в данной работе уровнях потенциации синапсы характеризовались уменьшением средней протяженности их профилей прилегания к дендриту на 35% и 29% соответственно. В обоих случаях почти на 30% снижалось среднее число ДПК в синапсе и на 24% и 21%, соответственно, падала протяженность сечений индивидуальных ДПК. Примерно так же изменялись размеры ЩК, среднее число которых в потенциированных синапсах снижалось примерно на 30% по сравнению с контролем Средняя протяженность профилей ЩК при высоком уровне потенциации оставалась такой же, как и после инкубации, однако при среднем уровне потенциации она уменьшалась почти на 30%. Таким образом, мы наблюдали существенные сдвиги в структуре контактных специализаций смешанных синапсов, которые могут принимать участие в передаче электротоиических сигналов через синапс на МН.

Таблица 1. Параметры специализированных контактов смешанных синапсов при

инкубации и ДП

Инкубация ДП 75% ДП 90%

Длина прилегания синапса к дендриту, ц, хЮО 378,9 ± 0,4 (п=21) 245,6 ± 0,3" (п=21) 269,8 ± 0,3 (п=21)

Средняя длина ДПК, р, хЮО 35,3 ±1,7 (п=82) 26,8 ± 0,02' (п=48) 28 ± 0,02' (п=45)

Среднее число ДПК на синапс, хЮ 39 ±0,4 (п=21) 27,8 ± 0,4 (п= 16) 28 ±0,3 (п=18)

Среднее число мостиков, на ДПК, хЮ 14,7 ±0,15(п=69) 23,8 ±0,33'(л=35) 37,3 ± 0,5' (п=37)

Средняя длина ЩК, р, хЮО 27,8 ± 0,02 (п=60) 20,4 ± 0,03 (п=24) 29,3 ± 0,03 (п=28)

Среднее число ЩК, на синапс, хЮ 30 ± 0,4 (п=20) 22 ±0,3 (п=12) 20 ±0,4' (п= 17)

Данные представлены как (х ± Эх); - р < 0,05; п - число измеренных параметров.

Таблица 2. Изменение размеров ДПК химических синапсов при инкубации и ДГ1

Инкубация Длительная потенциация

Длина отдельного ДПК в химических синапсах, р, хЮО 21 ±0,8 (п=58) 25 ± 1,4 (п=40)"

- Из работы МскЬкоу е( а1., 1998, " - достоверно отличается от контроля, р< 0,001.

Это в первую очередь уменьшение размеров ЩК, главных участников процесса электрической межклеточной коммуникации (Вгиг2опс и а1., 1996), а также ДПК, участие которых в указанных процессах сигнализации было предположено ранее (МоэЬкоУ е( а1., 1998) на основании ряда экспериментальных данных. Из полученных в настоящей работе результатов из> чения структуры специализированных кон1актов видно, что при возрастании электротонической проводимости смешанных синапсов размер ЩК уменьшается весьма значительно, что не укладывается в представления об их исключительной роли в создании и поддержании электротонической связи в этих типах межклеточных соединений. То же можно сказать и о ДПК, если судить об их протяженности. В то же время обнаружилось, что изменение одного из ультраструктурных парамезров прямо коррелирует с увеличенной электротонической проводимостью синапсов.

В щели ДПК нами выявлены фибриллярные мостики, соединяющие пре- и постсинаптические мембраны под некоторым углом (рис. 4А). Тонкая структура мостиков однообразна. Как правило, диаметр формирующей его фибриллы соизмерим с толщиной мембраны. Чаше всего на один профиль ДПК (из тех, где мостики обнаруживались) приходится один мостик. Вместе с 1ем, попадались Д! 1К с двумя мостиками, которые располагались близко или далеко друг 01 друга, под у!лом или параллельно. Встречались ДПК с несколькими мостиками.

Рис. 4. Ультраструктура смешанных и химических синапсов МН in vitro при индукции долговременной потенцнации. А - контрольный препарат, в щели ДПК смешанных синапсов видны мостики; Б - мостики в ДПК потенциированных смешанных синапсов; В -отсутствие мостиков в ДПК химических синапсов; | - одиночные мостики в щели ДПК; f f -двойные мостики.

11отенциированные синапсы по сравнению с контролем характеризуются качественно, во-первых, увеличенным количеством мостиков в ДПК, во-вторых, повышенным диаметром фибрилл, в-третьих, появлением парных мостиков (рис. 4Б). В этих случаях пары фибрилл следуют параллельно друг к другу с примерно равным небольшим промежутком. Другой особенностью мостиков ДПК потенциированных синапсов было различие диаметров фибрилл по их длине.

При подсчете мостиков видно, что их количество в щели ДПК смешанных синапсов при ДП увеличивается в 2,5 раза по сравнению с инкубированным контролем, в то же время протяженность ДПК при ДП снижается (таблица 1) Такая изменчивость этих контактов отмечена ранее как реакция на инкубацию и стимуляцию (Мошков и др., 1997; Гирас и др., 2002). В то же время ранее полученные данные (Moshkov et al, 1998) показывают (таблица 2), что длина ДПК в химических синапсах потенциированных МН, наоборот, увеличивается почти на 12%, хотя тетанизация не затрагивала передних корешков слухового нерва, афферентного химического входа МН. Важно отметить, что в ДПК химических синапсов фибриллярных мостиков не обнаруживается (рис. 2В).

Наличие в смешанных синапсах ДПК, которые по своей обшей морфологии неотличимы от ДПК химических синапсов, но в месте с тем обладают ранее неизвестной структурной особенностью, мостиками, заставило нас более подробно исследовать эти виды специализированных контактов. До недавнего времени вопрос о существовании различий между ними даже не ставился (Lieberman, Spacek, 1998).

2. Изучение десмосомоподобных контактов химических и смешанных синапсов МН.

Изучение тонкой структуры ДПК химических синапсов МН выявило типичное для них строение, характерное как для синаптических, так и для

несинаптических и ненервных межклеточных контактов этого типа. ДПК представляют собой компактные образования, характеризующиеся наличием симметрично расположенных осмиофильных рыхлых фибриллярных уплотнений, примыкающих к мембранам контакта с цитоплазматической стороны бутона и постсинаптического нейрона ДПК химических синапсов характеризуются щелью, пространством, разделяющим мембраны. Она четко выделяется своей упорядоченностью по сравнению с межклеточным пространством, располагающимся вне специализированных контактов. Ее отличает ровность и гладкость очертаний, однообразная ширина по всей длине ДПК, а также гомогенно-гранулярный вид матрикса в отличие от неровных, извилистых очертаний неспециализированного контакта, неравномерной ширины щели и прозрачного межклеточного содержимого в ней. Различные экспериментальные неспецифические воздействия на химические синапсы, такие как аппликация па МЫ физраствора, которая не затрагивает химической передачи, а также специфическое воздействие - утомление, вызванное естественной длительной или электрической стимуляцией афферентного входа, по нашим данным в целом повреждает морфологию ДПК Они становятся менее осмиофильными Фибриллярные уплотнения меняют свою ширину, часто прерываются и представлены в некоторых участках, чаще с пресинаптической стороны, в виде фрагментов. Уплотнение с постсипаптической стороны исчезает или не идентифицируется на фоне цитоплазматического матрикса, что фактически преобразует ДПК в полу- ДПК. Особенностью щели ДПК химических синапсов вне зависимости от предшествовавших воздействий на них является полное отсутствие каких-либо дискретных образований, которые можно было бы рассматривать как мостики или перемычки, проходящие через щель и соединяющие две противоположные мембраны контакта.

Иные результаты получены при ультраструктурном изучении синапсов смешанного типа, расположенных на дистальной части латерального дендрита МН Главное отличие этих синапсов от химических является наличие 1ЦК в зоне их прилегания к дендриту (рис. 2А). Эти контакты характеризуются тесным сближением двух соседних мембран и формированием узкой щели шириной около 10 нм. В случае прохождения плоскости среза строго поперек контакта в его строме хорошо видна регулярная поперечная исчерченность. Она представляет собой упорядоченно расположенные каналы - коннексоны, составляющие основу этих соединений (Bruzzone et al., 1996). Предполагается, что пара коаксиально располагающихся коннексонов в двух примыкающих друг к другу мембранах формируют канал, который способен пропускать небольшие молекулы весом до 1000 D, а также обладает электротонической проводимостью 100 - 150 пС (Tuttle et al, 1986). ЩК по периметру обязательно соседствуют с Д1 IK. 11ри этом всегда один контакт трансформируется в другой без видимого перехода между ними. Это является результатом того, что щелевая бляшка всегда имеет округлую форму, которая поддерживается ДПК, размещенными по периферии, окантовывая ее Поэтому при любом

прохождении среза по обе стороны от ЩК в нем обязательно присутствуют ДПК.

ДПК смешанных синапсов похожи по строению на ДПК химических синапсов. Они представлены осмиофильным фибриллярным материалом, примыкающим к пре- и постсинаптическим сторонам контакта, разделенным ровной щелью однообразной ширины. Щель наполнена гомогенным мелкогранулярным материалом. Вместе с тем более детальное изучение ДПК в смешанных синапсах выявило одно принципиальное отличие от ДПК химических синапсов. Внутри щели на фоне равномерного матрикса нами впервые обнаружены фибриллярные осмиофильные структуры, располагающиеся поперек щели и соединяющие две противоположные мембраны. Оценка размеров мостиков показала, что их диаметр составляет не менее 10 нм. Они прямолинейны, чаще пересекают щель под небольшим углом и, безусловно, что установлено «слепыми» экспериментами, не являются артефактом резки или результатом оптической аберрации. Конечно, не всегда они попадают в срез в нужном ракурсе Из-за этого не в каждом ДПК мостик идентифицируется. Иногда в одном и том же ДПК присутствуют несколько мостиков, но из-за того, что все они располагаются на разной глубине, каждый из них имеет разную четкость из-за различий в фокусировке.

Мы показали, что различные экспериментальные воздействия не вносят существенных изменений в такое необычное строение щели ДПК смешанных синапсов. Обнаруженные нами мостики можно было видеть как в интактных препаратах МП, так и после утомительной стимуляции, реабилитации от утомления, аппликации на МН физраствора, длительной инкубации кусочков продолговатого мозга с МН in vitro. Важно отметить, что последнее воздействие существенным образом повреждает структуру ДПК, не влияя на электрическую проводимость самих синапсов (Мошков и др., 1998), что необходимо учитывать при сравнении результатов ультраструктурного анализа ДПК in vitro и in vivo (см. ниже).

Таким образом, в результате проведенных исследований обнаружены четкие структурные различия между ДПК химических и ДПК смешанных синапсов. Обнаруженные мостики, пересекающие контакт ДПК смешанных синапсов, могут служить структурами, которые выполняют коммуникационную функцию, предположенную ранее на основании электрофизиологических и биофизических данных (Moshkov et al, 1998; Grigoriev et al, 2000).

3 Изучение природы мостиков.

а) Действие препаратов, полимеризующих и деполимеризующих актин

Известно, что основным структурным компонентом межклеточных ДПК является актин (Geiger et al., 1985; Lieberman, Spacek, 1998). С этой точки зрения представлялось важным знать, состоят ли мостики из аюиновых филаментов или устроены как-то иначе. Было показано, что в случае депрессии элекгроюнической передачи, индуцированной в смешанных синапсах МН 1етанизацией, проводимой на фоне аппликации циюхалазипа D (Павлик и др.,

1999), который, как известно, деполимеризует актин, число мостиков не изменялось по сравнению с контролем. При этом сама фибриллярная структура мостиков под воздействием цитохалазина В становилась трубчатой. С другой стороны, полимеризация актина в МЫ аппликацией фаплоидина, препарата, который полимеризует актин, сопровождалась усилением электротоничсской передачи в смешанных синапсах (11авлик и др., 2003) и увеличением количества поперечных мостиков в щели их ДПК (рис. 5).

□ Контроль

□ Цитохалазин О щФаллоидин

Рис. 5. Изменение числа мостиков в ДПК смешанных синапсов после различных

ВОЗДСЙС1ВИЙ.

* - достоверно отличается от контрольных значений, р < 0,05

Таким образом, полученные нами результаты позволяют предположить, что, по-видимому, формирование мостиков как-то связано с дополнительной полимеризацией актина. Ширина мостиков и их реакция на воздействие препарата, деполимеризующего или полимеризующего актин, свидетельствуют о том, что хотя структура мостика, может быть, и основана на актине, она, тем не менее, сложнее, чем просто одиночная нить актина. Более вероятно, что мостик представляет собой канал, в котором актин расположен как в нанотрубочках или в плазмодесмах в виде пучка из 2-4 нитей филаментозного (Ф-) актина, ассоциированных боковыми поверхностями.

Такая ортнизация, по-видимому, объясняет наблюдаемую ранее (Павлик и др, 1999) устойчивость мостика к прямому воздействию цитохалазина Б и делает его, вероятно, более стабильным в отношении других внешних повреждающих факторов, как это показано нами ранее.

б) Выявпение актина в ДПК с помощью Аи - фаллоидиновой метки

Используя фаллоидин, меченный золотом, обнаружено, что актин содержится в примембранных уплотнениях и в щели ДПК на мостиках (рис. 6). Можно утверждать, что ДГ1 в смешанных синапсах сопровождается увеличением числа актиновых мостиков в щели ДПК. Они шунтируют синаптический контакт в области ДПК. Ранее проведенные эксперименты, которые показали, что актин проводит электрический катионный сигнал по своей поверхности в воде (Ьш, СапПеПо, 1993) и через искусственные мембраны (Григорьев и др., 1999; С^опеу е1 а1., 2000), дают основание предположить, что мостики мо1у! как-то участвовать или вовлекаться в электротоническую связь.

Рис. 6. Наличие актина в ДПК смешанных синапсов. А - контроль, ДПК химического синапса Золотая метка обнаруживается только на фибриллярных уплотнениях пре- и постсинаптической мембран; Б - золотая метка в ДПК смешанного синапса обнаруживается * как на фибриллярных уплотнениях пре - и постсинаптической мембран, так и в щели ДПК.

\ - показана золотая метка в шели ДПК.

» 4. Цитохимическое выявление ионов кальция в ЩК и в ДПК смешанных

синапсов в норме, после аппликации веществ, изменяющих проводимость синапсов, и после адаптации.

Известно, что в покоящейся клетке концентрация ионов кальция составляет и что пироантимонат калия формирует видимые преципитаты, начиная с концентрации этих ионов 10"5 М, а более интенсивное осаждение наблюдается при концентрации 10"4 М и выше (Петруняка, 1987). Поэтому интенсивность реакции может быть как качественным, так и количественным признаком локального повышения концентрации ионов кальция на 2 - 3 порядка в местах их выявления в виде преципитатов.

После аппликации физраствора в качестве контроля на МЫ в щели ЩК и в примембранных цитоплазматических областях ЩК осадок пироантимоната кальция не обнаруживался. Мостики в ДПК имели обычный вид.

При аппликации экдизона, усиливающего электрическую проводимость ЩК, и хлорпромазина, блокирующего ее, а также после адаптации мы выявили разную локализацию и интенсивность преципитатов кальция в области ЩК и ДПК смешанных синапсов МН. После действия экдизона на смешанные л синапсы наблюдали усиление реакции преципитации преимущественно в

постсинаптической области ЩК, что, по-видимому, свидетельствует о повышении концентрации ионов кальция на выходе из коннексоновых каналов Л и более интенсивном функционировании ЩК. Наоборот, при действии

хлорпромазина наблюдалась интенсивная реакция преципитации в щели ЩК, что является как бы структурным признаком блокады их проводимости. При адаптации цитохимическое выявление ионов кальция в смешанных синапсах показало, что преципитаты, как в случае с воздействием хлорпромазина, выстилают всю щель ЩК, что свидетельствует об их блокаде. Вместе с тем усиливается преципитация в щели ДПК, в том числе интенсивно декорируются мостики в ДПК (рис. 7). Это может свидетельствовать в пользу участия их в переносе катионного (кальциевого) тока. Во всяком случае, это служит проявлением их электрических кабельных свойств мостиков в условиях адаптации.

Рис. 7. Выявление кальция в ЩК и ДНК смешанных синапсов. А - контроль, преципитаты отсутствуют, Б - смешанный синапс адаптированного МН после обработки пироантимонатом калия. Щель ЩК забита преципитатом Мостики ДПК декорируются преципитатом. | - показан осалок преципигата кальция в шели ДПК и ЩК.

5 Исследование ультраструктуры смешанных синапсов поле адаптации.

Изучение улыраструктурных изменений смешанных синапсов при адаптации, резистеныии МН к утомительной стимуляции (рис. 8), показало, что в основном тонкая структура этих синапсов в норме и при адаптации визуально практически не отличалась. Правда, по сравнению с синапсами МН, которые подвергались длшельной инкубации (в опытах по ДП), смешанные синапсы интактных и адаптированных МН отличались лучшей сохранностью всех специализированных контактов и симметричностью плотного фибриллярного материала с пре- и постсинаптических сторон ДПК.

Рис. 8. Ультраструктура синапсов МН при выработке состояния поведенческой адаптации.

А - сечение смешанного синанса на мембране дендрита интактного МН, Б - структура щели ДПК и локализация мостиков в синапсах адаптированных МН > | - показаны мостики в щели ДПК

ДПК смешанных синапсов как интактных, так и адаптированных МН содержат в щели фибриллярные мостики. В контроле они, как правило, одиночные и располагаются наклонно к мембранам контакта.

При адаптации иногда в щели ДПК появляются сдвоенные мостики, как и при ДП. Диаметр мостиков ДПК смешанных синапсов адаптированных МН увеличивается по сравнению с контролем. По этим признакам ДПК и мостики адаптированных МН весьма напоминают ДНК смешанных синапсов при ДП. Количество мостиков в смешанных синапсах интактных МН варьирует от 1 до 2 на один ДПК. В смешанных синапсах адаптированных МН встречаемость в

случайных срсзах и число мостиков по сравнению с контролем растет, как показывают морфометрические данные, в два раза (табл. 3). Таким образом, и количественные данные о числе мостиков в ДПК смешанных синапсов МН при адаптации и ДП тоже схожи.

Качественный анализ структуры афферентных химических синапсов на соматической части интактных и адаптированных МН показывает, что в щели ДПК фибриллярных мостиков не обнаружено, она заполнена только беспорядочно расположенным зернистым материалом. Выявлены также специфические изменения АЗ и ДПК. Как было известно и ранее, при адаптации ДПК распространяются на активную зону, частично прерывая доступ пресинаптических пузырьков к мембране, оттесняя их вглубь буюпа При этом размер АЗ уменьшается до величины, равной диаметру 1-3 пузырьков, а размер ДПК возрастает.

Таблица 3. Параметры специализированных контактов смешанных и химических синапсов при адаптации

| интактные адаптированные

смешанные синапсы

242,1 ± 44,2 (п = 40) 290,3 ± 34,6* (п = 38)

2,9 ± 0,6 (п = 28) 2 ± 0,4 (п = 35)

1,1 ±0,26 (11 = 38) _ 2,3 ± 0,25' (п = 46)

23,4 ± 2,7 (п = 49) 35,1 ± 4,3* (п = 56)

2,5 ± 0,75 (п = 36) 2,18 + 0,46 (п = 45)

25,1 +2,8(п = 55) 23,0 ±3,1 (п = 50)

Средняя длина синаптическою контакта, ц, хЮО

Среднее число ДПК на синапс, хЮ Среднее число мостиков на ДПК, х 10 Средняя длина ДПК, ц, хЮО Среднее число ЩК, на синапс, х 10

Средняя длина ЩК, ц, х 100__

химические синапсы

Средняя длина ДПК, ц.хЮО __ [ 29 ±3,1 (п = 48) 42,1 ± 7,3" (п = 31) Данные представлены как (х ± Бх), - достоверно отличается от контроля, р < 0,05, " - р < 0,01, п - число измеренных параметров

Количественный анализ числа и протяженности ДПК химических синапсов показывает, что при адаптации, несмотря на небольшое снижение среднего числа ДПК в одном прилегании при адаптации, средняя их длина возрастает в полтора раза (табл. 3). Это подтверждает наши качественные наблюдения за состоянием химических синапсов МН в норме и при адаптации и свидетельствует о том, что изучаемые МН находятся в адаптированном состоянии. Важно отметить, что структура и размер ЩК смешанных синапсов адаптированных МН практически не отличаются от контроля.

Заключение:

Для исследования возможности вовлечения ДП, модельной (искусственной) формы синаптической памяти, в формирование памятного следа, вызванного естественными тренировками и проявляющегося не только на нейрональном (синаптическом) уровне, но и на уровне поведения животного (Михеева и др., 2000), нами выбраны МН золотой рыбки - пара гигантских командных нейронов продол го ват го мозга. Их активность инициирует унита1еральный

удар хвостового плавника и резкий поворот тела рыбки при ее движении в воде (Diamond, 1971). Известно, что МН обладают ярко выраженной пластичностью способностью изменять свою реактивность под воздействием предшествующего поведенческого опыта (Конорски, 1970). Весьма существенно, что этим свойством обладают синапсы разных афферентных входов, располагающиеся на разных, строго сегрегированных и, следовательно, доступных для раздельного морфологического исследования участках МН.

Ранее была обнаружена специфическая изменчивость химических аксо-соматических синапсов, образованных окончаниями волокон передних корешков слухового нерва, под воздействием естественных вестибулярных стимуляций, повторяющихся в тренировочном режиме (Мошков, 1985). Благодаря такой изменчивости рыбки адаптируются, приобретают устойчивость к истощающей стимуляции, утомительной для нетренированных рыбок. Механизмом, обеспечивающим такую адаптацию, являлось значительное уменьшение размеров активных зон, мест выброса медиатора в химических синапсах. Подобный структурный феномен соответствует подавлению межклеточной химически опосредованной коммуникации (Baily, 1999; Безгина и др., 1987; Kashapova et al., 1991; Тирас и др., 2002).

В последующем были обнаружены специфические структурные изменения аксо-дендритных смешанных синапсов, образованных на МН окончаниями афферентных волокон задних корешков слухового нерва. В данных синапсах под воздействием тетанизации афферентного входа в условиях как in vivo, так и in vitro (Yang, Faber, 1990; Павлик и др., 1999) могут индуцироваться и ДП, и ДД, т.е. усиление или ослабление электротонической передачи через такие синапсы, соответственно. При внеклеточном отведении эти изменения проявляются как стойкое увеличение или уменьшение амплитуды электрического компонента ответа МН. Предположено, что в механизм изменения электротонической связи в смешанных синапсах вовлекается филаментозный актин, как известно, обладающий кабельными свойствами (Lin, Cantiello, 1993; Grigoriev et al., 2000). Наличие актина было выявлено в щели ДПК смешанных синапсов МН. Актин образует фибриллярные мостики -возможный морфологический субстрат электротонической связи в синапсах (Мошков и др., 2001; Павлик и др., 2003). С использованием цитохимической реакции на кальций было продемонстрировано, что в условиях усиления электротонической передачи через смешанные синапсы МН (т.е. потенциации синаптического действия) мостики интенсивно декорируются кальцием и электрически закорачивают две смежные мембраны контакта (Павлик и др., 2003). Вместе с тем роль ДП в поведении целостного организма рыбки, как и сама возможность участия ДП в формирование естественной формы памяти, оставались невыясненными. В принципе, этот нерешенный частный вопрос относится к невероятно интригующей общей проблеме современной нейробиологии (Stevens, 1998). Мы показали, что при формировании естественной модификации поведения рыбок, в основе которой лежит стойкое долговременное изменение функции МН (Мошков, 1985; Тирас и др., 2002), т е. проявление естественной формы памяти на нейрональном уровне, в

афферентных смешанных синапсах МП происходя! структурные перестройки, идентичные перестройкам, которые наблюдаются при ДП. По-видимому, функциональный смысл таких перестроек как при экспериментально индуцируемой ДП, так и при поведенческой адатации одинаков. Они заключаются, вероятно, в стойком долговременном усилении эффекжвности электротонической связи через смешанные синапсы, т.е. длительном повышении их эффективности. Последнее, по-видимому, необходимо для поддержания баланса синаптических влияний на МП на нормальном уровне, что наблюдается в эксперименте, учитывая одновременную депрессию передачи в химических синапсах адаптированных МН. Эжм достшается устойчивость функционирования МН и их стабильность с сохранением пластичности обоих синаптических входов, необходимое условие для существования рыбок в изменяющихся условиях окружающей среды.

Одновременно наши ультраструктурныс данные позволяют предположить, почему до сих пор не удается обнаружить электрофизиологическими методами присутствие ДП и ДД в естес! венной модификации функции нервной системы, рассматриваемой как адаптация и память, информация о чем оценивается специалистами в 1 млн. долларов (Stevens, 1998). Дело в том, что одновременно с возникновением Д11 в одном локусе нейрона, в другом возникает ДД, которая нивелирует эффект изменения проводимости в первом, и наоборот (см. табл. 1, 2 и 3). Такая реципрокность изменчивости эффективности парных афферентных входов поддерживает возбудимость нейронов на нормальном уровне, который и наблюдается в эксперименте с адаптацией, естественной формы нейрональной пластичности, и обеспечивает устойчивость работы нейронов в нормальных условиях (рис. 1, 2). Иначе функция нейронов либо полностью угнеталась бы при верховодствс ДД (адаптация), либо переходила бы в эпилептоидный, неуправляемый режим при верховодстве ДП (Abbot, Nelson, 2003). Подобную картину стабилизации нейрональной функции обнаружили недавно в микрообъемах нервной ткани при формировании в них Д11 и ДД (Royer, Parc, 2003) Очевидно, тот же принцип функционирования существует и на уровне отдельного нейрона, в частности МН, что демонстрируют наши ультраструктурные данные.

Выводы:

1. Впервые в гнели десмосомоподобных контактов (ДПК) смешанных синапсов Маутнеровских нейронов (МН) золотой рыбки обнаружены фибриллярные мостики, которые отсутствуют в щели подобного типа контактов химических синапсов. Это позволяет считать мостики специфическим структурным признаком Д1IK смешанных синапсов.

2. Морфофункциональными исследованиями впервые установлено, что в основе посттетанической длительной потенциации электротонической передачи в смешанных синапсах, модельной формы синаптической памяти МН золотой рыбки in vitro, лежит количественное увеличение числа фибриллярных мостиков в щели Д1IK.

3. Используя воздействие актин-полимеризующих и деполимеризующих препаратов, а также идентификацию актина с помощью золотой метки и ионов кальция пироантимонатом, впервые установлена актиновая природа мостиков в щели ДПК и их электротонические (кабельные) свойства. Показано, что число мостиков и интенсивность их ассоциации с ионами кальция (декорирования) коррелирует со степенью электротонической проводимости смешанных синапсов.

4. Предположено, что ДПК как межклеточные органоиды в определенных условиях выполняют не только адгезионную, но и коммуникационную функцию, что расширяет наше представление о межклеточной сигнализации в нервной ткани и в мозге в целом.

5. Ультраструктурными исследованиями смешанных синапсов при естественной, вызванной сенсорной стимуляцией модификации функции МН, проявляющейся в поведении золотой рыбки, выявлено увеличение числа фибриллярных мостиков в щели ДПК, специфического признака ДП. Это предполагает участие модельной формы памяти в естественной функции нейрона.

Список работ, опубликованных по данной теме:

1. Н.Р. Тирас, И.Б. Михеева, Д.А. Дзебан, Д.А. Мошков. Роль актина в регуляции эффективности химических синапсов. В сборнике тезисов «Цитоскелет и клеточная регуляция», Пущино, 11-12 мая 2000, с. 35.

2. Д.А. Дзебан, И.Б. Михеева, Н.Р. Тирас, Л.Л. Павлик, Д.А. Мошков. Структурные исследования десмосомоподобных контактов химических и смешанных синапсов. В сборнике тезисов «1 оризонты физико-химической биологии». 11ущино, 28 мая- 2 июня 2000, т. 1, с. 169-170.

3. Д.А. Дзебан, И.Б. Михеева, Н.Ф. Мухтасимова, Л.Л. Павлик, Н.Р. Тирас, Д.А.Мошков. Сравнительные морфофункциональные исследования долговременной депрессии и долговременной потенциации синапсов разной природы В сборнике тезисов «Актуальные проблемы нейробиологии». VII Всеросийская школа молодых ученых. Казань, 27-29 сентября 2000, с. 47-48.

4. ТА. Мавлютов, ИМ Сашалова, Д.А. Дзебан, ДА. Мошков. Ультраструктурная локализация пироантимоната кальция в Маутнеровских

нейронах мальков золотой рыбки, адаптированных к естественной стимуляции. Цитология, 2001, т. 43, № 3, с. 261-268.

5. Д.А. Мошков, Н.Р. Тирас, Л.Л. Павлик, Д.А. Дзебан, И.Б. Михеева, Н.Ф.Мухтасимова. Структурные различия между десмосомоподобными контактами в афферентных химических синапсах Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2001, т. 120, № 4, с. 30-35.

6. J1.J1. Павлик, Т.А. Мавлюгов, Д.А. Дзебан, Н.Р. Тирас, Д.А. Мошков. Десмосомоподобный контакт смешанных синапсов как органоид, выполняющий коммуникационную функцию. В сборнике тезисов. XVIII съезд физиологического общества им. И.П.Павлова. Казань, 25 - 28 сентября 2001, с. 183.

7. D.A. Moshkov, N.R. Tiras, L.L. Pavlik, D.A. Dzeban, I.B. Mikheeva, N.F. Mukhtasimova. Structural differences between desmosome - like contacts in afferent chemical and mixed synapses of Mauthner neurons in the goldfish Neurosci and Behavioral Physiol. 2002, V. 32, № 5, p. 471-476.

8. Д.А. Мошков, Н.Р Тирас, Л.Л. Павлик, Д.А. Дзебан. Структурные и возможные функциональные различия десмосомоподобных контакюв химических и смешанных синапсов Маутнеровских нейронов золотой рыбки В сборнике тезисов IV Международная конференция по функциональной нейроморфологии. Санкт-Петербург, 29-31 мая 2002, с. 190-191

9. Д.А. Мошков, HP. Тирас, J1JI. Павлик, Д.А. Дзебан. Идентификация функционального состояния нейронов по ультраструктурным признакам. В сборнике «Проблемы нейрокибернетики». Международная конференция по нейрокибернетике. Ростов -на -Дону : «ЦВВР», 2002, т. 2, с. 269-270.

10. Д.А. Дзебан, Н.Ф. Мухтасимова, Л.Л. Павлик, Д.А Мошков. Ультраструктура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов Маутнеровских нейронов при долговременной потенциации. Морфология, 2003, т. 123, №2, с. 33-38.

11. Л.Л. Павлик, Н.Р. Гирас, Н.Ф Мухтасимова, II И. Пахогин, Д.А. Дзебан, Д.А.Мошков. Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов Маутнеровских нейронов золотой рыбки Морфология, 2003, т. 123, №1, с. 41-45.

12. Д.А. Дзебан, Л.Л. Павлик, Д.А Мошков. Вовлечение актин - содержащих структур смешанных синапсов в формирование модификации функции маутнеровских нейронов, индуцированной стимуляцией химических синапсов. В сборнике тезисов «Биология. Наука XXI века». Пущино, 2003, с. 20.

13. Д.А. Дзебан, Л.Л Павлик, Н.Р. Тирас, И.Б. Михеева, Д.А. Мошков. Ультраструктурные признаки долговременной потенциации смешанных синапсов при естественной модификации функции Маутнеровских нейронов, проявляемой в поведении рыбок В журнале «Архив клинической и экспериментальной медицины». Донецк, 2003, т 12, №1, с 9.

14. Д.А. Мошков, Л.Л. Павлик, Н.Р. Тирас, Д.А. Дзебан, И Б. Михеева. Ультраструктурпые признаки изменений эффективности синаптической передачи через смешанные синапсы Маутнеровских нейронов при

естественной модификации двигательной функции. Нейрофизиология. 2003, т. 35, №5, с. 392-401.

15. JI.JI. Павлик, E.H. Безгина, Д.А. Дзебан, Д.А. Мошков. Локализация пироантимоната кальция в смешанных синапсах Маутнеровских нейронов при действии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов. Морфология, 2004, т. 124, (принята к печати).

16. И.Б. Михеева, Д.А. Дзебан, JI.JI. Павлик, Н.Р. I ирас, Д.А. Мошков. Актин и opi анизация интегративного поведения нейрона. В сборнике тезисов «I Iporpecc в биотехнологии и нейробиологии - интегративная медицина». Международный междисциплинарный научный семинар. Египет, Хургада; М.: МАКС Пресс, 2004, с. 111-113.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 01-04-48053, руководитель Л.Л. Павлик; проект № 02-04-48368, руководитель Д.А. Мошков; грант MAC № 03-04-06758, Д.А. Дзебан).

f

ä

I

г h

РИБ Русский фонд

2006-4 17434

г':;"иса"с с ¿I февра ь' 2ЭСК г

З^а.- 4 )î Формат tiC X &0'16 í:,pa/i. 10.J ski Ji 'friivr с сагоне опесгтиси^й пе'-чт:' АотПог ir Б Якимаш? Ii с Л ¿10 "Iр-л 778-9"

1 Ь MAP Ш

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дзебан, Дмитрий Александрович

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Пластичность нервной системы

1.1.1. Проблемы пластичности нервной системы

1.1.2. Строение и морфологическая изменчивость синапсов — 9 элементов пластичности нейронов

1.1.3. Длительная потенциация как проявление пластичности нервной 19 ткани

1.1.4. Роль акина в синаптической пластичности

1.2. Маутнеровские нейроны, как объект для изучения 29 пластичности

1.2.1. Структура и функция Маутнеровского нейрона

1.2.2. Морфофункциональные исследования Маутнеровских 34 нейронов рыб и амфибий

2. Объекты и методы исследования

2.1. Объекты исследования

2.2. Естественная стимуляция Маутнеровских нейронов

2.3. Адаптация МН к длительной естественной стимуляции

2.4. Оценка функционального состояния Маутнеровских нейронов 39 по поведению рыб в кольцевой камере

2.5. Электрофизиологические методы исследования

2.6. Электронно-микроскопические методы

2.7. Морфометрический анализ

2.8. Аппликация на МН веществ, полимеризующих и 45 деполимеризующих актин

2.8.1. Аппликация цитохалазина Б на МН

2.8.2. Аппликация фаллоидина на МН

2.9. Опыты с маркером фаллоидин - коллоидное золото

2.10. Цитохимический метод изучения синаптических контактов МН

3. Результаты

3.1. Поиск специфического признака, ответственного за ДП 47 смешанных синапсов. Обнаружение мостиков в ДПК

3.2. Изучение десмосомоподобных контактов химических и 51 смешанных синапсов

3.3. Изучение природы мостиков

3.3.1. Действие препаратов, полимеризующих и деполимеризующих 56 актин

3.3.2. Выявление актина в ДПК с помощью Аи - фаллоидиновой 65 метки

3.4. Цитохимическое выявление ионов кальция в ЩК и в ДПК 66 смешанных синапсов в норме, после аппликации веществ,. изменяющих проводимость синапсов, и после адаптации

3.5. Исследование ультраструктуры смешанных синапсов после адаптации

4. Обсуждение

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск признаков длительной потенциации в естественной модификации функции Маутнеровских нейронов золотой рыбки"

Нервная система играет важнейшую роль в процессе взаимодействия между живыми организмами и средой их обитания. В основе такого взаимодействия лежит способность нервной системы приобретать, хранить и воспроизводить информацию о прошлом опыте. Эта способность обеспечивается пластичностью нейронов, т.е. их способностью изменять реактивность под влиянием последовательных раздражений рецептивных органов. [Конорски, 1970]. Однако клеточные механизмы, лежащие в основе пластичности, как отдельного нейрона, так и синапсов, изучены недостаточно хорошо.

В настоящее время большинство нейробиологов считает, что суть памяти, а в более широком смысле - адаптации нервной системы к повторяющимся стимулам - заключается в длительных изменениях эффективности межнейрональных взаимодействий, которые осуществляются через синапсы. Реальные доказательства этого положения отсутствуют. С другой стороны, известны модельные (искусственные) формы стойкого изменения синаптической функции - долговременная потенциация (ДП) и долговременная депрессия (ДД), участие которых в модификации естественного поведения животных тоже не доказано.

ДП тесно связана с адаптацией нервной системы к воздействию внешней среды [Wickens, 1988; Calvarley, Jones, 1990; Stevens, 1996]. Возможно, ДП является физиологической основой для определенных видов естественной адаптации, обучения и памяти [Stevens, 1998]. Возлагались определенные надежды на то, что ее всестороннее исследование объяснит, как осуществляется обучение и запоминание в нейронах на функциональном, структурном и молекулярном уровнях. Вместе с тем, со времени открытия ДП [Брагин, Виноградова, 1973; Bliss, Lomo, 1973], несмотря на многочисленные данные о ее механизмах, участие ДП в памяти до сих пор остается неясным. Вовлечение модельных форм памяти, чаще всего ДП и ДД, в формирование естественной памяти пытаются выявить, используя преимущественно различные физиологические и фармакологические подходы [Baudiy, 2000; Абрамцев, 2000; Большаков, 2001]. Пока к особому успеху это не привело. Морфофункциональные исследования взаимоотношения модельных и естественных форм памяти на системном уровне или на целостном мозге и его крупных отделах тоже оказались непродуктивными [Bailey, 1999; Thomson, 2000]. Это связано с чрезвычайной сложностью организации нервных центров, в которых их изучают, и невозможностью точно определить вклад функции этих центров в естественное поведение. По нашему мнению, адекватным объектом для этих целей могут служить Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки, имеющие определенную и легко регистрируемую экспериментально изменяемую функцию, проявляемую в специфическом поведении. В них удалось обнаружить различные виды естественной и искусственной (модельной) пластичности: модификацию поведения, обусловленную изменениями функционального состояния МН, ДП и ДД смешанных синапсов, адаптацию (депрессию) химических синапсов [Мошков, 1985; Yang, Faber, 1990; Yang et. al., 1991; Павлик, 1997, 1999; Moshkov et. al., 1998; Oda et. al., 1998; Faure, 2000]. Остается непонятной роль элементов синапсов, вовлекаемых в повышение проводимости при ДП. Неизвестно, вовлекается ли ДП в адаптацию, естественную модификацию функции МН. Для понимания роли различных синаптических структур в регуляции функционирования мозга необходимы сравнительные морфофункциональные исследования механизмов ДП и естественной адаптации.

Такая постановка проблемы обозначила цель работы - определить специфические ультраструктурные признаки посттетанической (модельной) ДП в смешанных синапсах МН, а затем исследовать, не обнаруживаются ли они в этих синапсах при естественно выработанной модификации функции, проявляемой в свободном поведении рыбок.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить ультраструктуру МН золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротонического ответа (модельной формы памяти) и адаптации (естественной формы памяти).

2. Выявить похожие структурные изменения в афферентных смешанных синапсах.

3. Произвести сравнительный качественный и количественный ультраструктурный анализ контактов афферентных смешанных синапсов и других структурных изменений (мостиков).

Научная новизна работы. Впервые в сравнительном аспекте изучена ультраструктура МН золотой рыбки в двух функциональных состояниях: ДП электротонического ответа, модельной формы синаптической памяти, и адаптации, резистенции к утомлению, естественной формы нейрональной памяти. В обоих случаях в щели десмосомоподобных контактов (ДНК) афферентных смешанных синапсов МН выявлено пропорциональное увеличение числа фибриллярных мостиков. Показано, что фибриллярные мостики в щели ДНК смешанных синапсов являются специфическим признаком, отличающим их от ДНК химических синапсов. Впервые с помощью метки фаллоидин - золото установлено, что мостики содержат филаментозный (Ф-) актин. При сравнительных цитохимических исследованиях пироантимонатным методом локализации ионов кальция в смешанных синапсах адаптированных МН, а также при аппликации блокатора или активатора проницаемости щелевых контактов (ЩК) впервые показано, что ЩК при адаптации оказываются заблокированными, индикатором чего было заполнение щели ЩК плотными преципитатами, отсутствующими в контроле и при усилении проводимости. В то же время мостики в щели ДНК интенсивно декорировались преципитатом. Это указывало на вероятность функционирования мостиков в этих условиях как своеобразных катионных транссинаптических шунтов. Обнаружение структурного признака ДП, имеющего, по-видимому, такие же функциональные последствия и в смешанных синапсах адаптированных МН, дает основание предположить, что ДП, модельная форма пластичности, может быть естественным свойством нервной системы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дзебан, Дмитрий Александрович

5. Выводы

1. Впервые в щели десмосомоподобных контактов (ДПК) смешанных синапсов Маутнеровских нейронов (МН) золотой рыбки обнаружены фибриллярные мостики, которые отсутствуют в щели подобного типа контактов химических синапсов. Это позволяет считать мостики специфическим структурным признаком ДПК смешанных синапсов.

2. Морфофункциональными исследованиями впервые установлено, что в основе постгетанической длительной потенциации электротонической передачи в смешанных синапсах, модельной формы синаптической памяти МН золотой рыбки in vitro, лежит количественное увеличение числа фибриллярных мостиков в щели ДПК.

3. Используя воздействие актин-полимеризующих и деполимеризующих препаратов, а также идентификацию актина с помощью золотой метки и ионов кальция пироантимонатом, впервые установлена актиновая природа мостиков в щели ДПК и их электротонические (кабельные) свойства. Показано, что число мостиков и интенсивность их ассоциации с ионами кальция (декорирования) коррелирует со степенью электротонической проводимости смешанных синапсов.

4. Предположено, что ДПК как межклеточные органоиды в определенных условиях выполняют не только адгезионную, но и коммуникационную функцию, что расширяет наше представление о межклеточной сигнализации в нервной ткани и в мозге в целом.

5. Ультраструктурными исследованиями смешанных синапсов при естественной, вызванной сенсорной стимуляцией модификации функции МН, проявляющейся в поведении золотой рыбки, выявлено увеличение числа фибриллярных мостиков в щели ДПК, специфического признака ДП. Это предполагает участие модельной формы памяти в естественной функции нейрона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дзебан, Дмитрий Александрович, Пущино

1. Абрамец И.И. Нейрохимические механизмы основных форм длительной депрессии передачи, Нейрофизиология / Neurophysiology, 2000 32, № 6, 463-472.

2. Артюхина Н.И. Структурно функциональная организация нейронов и межнейронных связей. М., Наука, 1979.

3. Ашмарин И.П. Загадки и откровения биохимии памяти. Л.:Изд-во ЛГУ, 1975.

4. Бабминдра В.П. Стабильность и изменчивость конструкции межнейронных связей. В кн.: Синаптическая организация мозга. Л.: Изд-во ЛГУ, 1980.

5. Безгина Е.Н., Драбкина Т.М., Земскова С.Н. и др. Особенности временного течения миниатюрных токов концевой пластинки в разных участках нервно-мышечного соединения лягушки, Нейрофизиология, 1987, 19, №6,779-789.

6. Боголепов Н.Н. Ультраструктура синапсов в норме и патологии. М.: Медицина, 1975.

7. Боголепов Н.Н., Пушкин А.С. Структурные основы пластичности мозга. — Вестн. АМН СССР, 1978, № 12, с. 21-28.

8. Большаков В.Ю. Механизмы долговременной синаптической депрессии гиппокампа. Рос. физиол. ж., 2001, 87, № 4,441-447.

9. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Явление хронической потенциации в кортикальном афферентном входе пирамид поля САЗ гиппокампа, в кн.: Физиологические механизмы памяти, под ред. Е. А. Громовой, Пущино, 1973, с. 8-25.

10. Ю.Ведерникова Е.А., Максимов А.В., Негуляев Ю.А. Функциональные свойства и цитоскелетзависимая регуляция натриевых каналов в плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология, 1997, т. 39, № 12, с.1142-1151.

11. И.Виноградова О.С. Нейронаука конца второго тысячеления: смена парадигм, Ж. высш. нервн. деят., 2000, 50, вып. 5, 743-774.

12. Григорьев П.А., Тараховский Ю.С., Павлик JI.JL, Мухтасимова Н.Ф., Лукоянова Н.А., Иваницкий Г.Р., Мошков Д.А. Ф-актин как основа трансмембранной передачи электротонического сигнала через искусственные мембраны. Докл. Академии Наук, 1998.

13. Григорьев П.А., Тараховский Ю.С., Павлик JI.JI., Мухтасимова Н.Ф., Удальцов С.Н., Мошков Д.А и Иваницкий Г.Р. Взаимодействие Ф-актина с искусственными фосфолипидными мембранами. Докл. РАН, 1999, т. 366, № 5, с. 695-698.

14. Дзебан Д.А., Мухтасимова Н.Ф., Павлик JI.JI и Мошков Д.А. Ультраструктура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов маутнеровских нейронов при долговременной потенциации. Морфология, 2003, т. 123, вып. 2, с. 33-38.

15. Жердев Г.В., Мошков Д.А., Белозерцев Ю.А., Тирас Н.Р. Влияние изонитрозина и вестибулярной стимуляции на сому и дендриты Маутнеровских нейронов. Цитология, 1991, т. 33, № 8, с. 20-32.

16. Конев C.B., Мажуль В.М. Межклеточные контакты, Минск, Наука и техника, 1977.

17. Конорски Ю. Интегративная деятельность мозга. М: Мир, 1970.

18. Косицын Н.С. Микроструктура дендритов и аксодендритических связей в ЦНС. М.: Наука, 1976.

19. Кэндел Э. Клеточные основы поведения. М., Мир, 1980.

20. Майоров В.Н. Морфология и морфофизиология реактивных состояний нейрона. Арх.анатомии, гистологии и эмбриологии. 1978, т. 74, № 5, с. 5-1.

21. Маттиес X. Регуляция синаптической эффективности.- В кн.:Системный анализ интегративной деятельности нейронов. М.:Наука, 1974, с. 32-40.

22. Михеева И.Б. Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином. Автореферат канд. дис., 1999, Пущино.

23. Михеева И.Б., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. и др. Десмосомоподобные контакты как мишени действия яда скорпиона. Цитология, 2000, 42, № 7, 635-646.

24. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Мирошников А.И. Изучение ультраструктуры Маутнеровских нейронов рыб после воздействия апамина. Докл. АН СССР, 1979, т. 545, № 4, с. 1014-1016.

25. Мошков Д.А., Музафарова Л.Н., Кашапова JI.A., Левадный В.Д. Изучение в онтогенезе структуры Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Онтогенез, 1980, т. 11, № 5, с. 518-523.

26. Мошков Д.А., Масюк Л.Н. Аккомодационные изменения синаптических контактов при длительной адаптации нейрона к экстремальной стимуляции Цитология, 1981, т. 23, № 4, с. 360-367.

27. Мошков Д.А., Подольский И.Я., Кашапова Л.А. и др. Количественная характеристика двигательной активности золотых рыбок Carassius auratus как возможный индикатор состояния Маутнеровских нейронов. Журн. Эволюц. Биохим., 1982, т. 18, № 2, с. 155-160.

28. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Потемкин В.В. Влияние фаллоидина и длительной сенсорной стимуляции на ультраструктуру Маутнеровских нейронов золотых рыбок. Цитология, 1984, т. 26, № 12, с. 1351-1356.

29. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука, 1985, 200 с.

30. Мошков Д.А., Тирас Н.Р. Различия цитоскелета в тормозных и возбуждающих синапсах. Цитология, 1987, т. 29, № 2, с. 156-160.

31. Мошков Д. А., Тирас Н.Р., Павлик Л. Л., Мухтасимова Н.Ф. Ультраструктура маутнеровских нейронов в переживающем продолговатом мозге золотых рыб. Морфология, 1996, т. 110, № 4, с. 5659.

32. Мошков Д.А., Мавлютов Т.А., Савельева JI.H. и др. Исследование Маутнеровских нейронов мальков золотой рыбки методом замораживания-скалывания. Разработка методики. Цитология, 1997, т. 39, № 4\5, с. 267-272.

33. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Дзебан Д.А. и др. Структурные различия между десмосомоподобными контактами в афферентных химических и смешанных синапсах маутнеровских нейронов золотой рыбки. Мофрология, 2001, 120, № 4, 30-35.

34. Мошков Д.А., Безгина E.H., Павлик Л.Л., Мухтасимова Н.Ф. и Мавлютов Т.А. Функциональная активность маутнеровских нейронов золотой рыбки и интенсивность осаждения пироантимоната кальция в смешанных синапсах. Морфология. 2003. 000.

35. Ниукканен Н.Л., Мошков Д.А. Маутнеровский нейрон как модель для изучения пластических изменений на клеточном уровне. В кн.: Физиологические и биохимические исследования памяти. Пущино, 1977, с. 155-171.

36. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Актин в Маутнеровских нейронах золотых рыбок после действия фаллоидина и адаптации к длительной стимуляции. Цитология, 1997, т. 39, № 12, с. 1109-1115.

37. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Экспериментально вызванная деполимеризация актина разрушает адаптивное состояние нейрона. Морфология, 1998, т. 114, № 4, с. 24-27.

38. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Пахотина И.Д. и Мошков Д.А. Влияние цитохалазина D на структуру смешанных синапсов и их электротоническую проводимость. Цитология, 1999, т. 417, с. 595-597.

39. Павлик Л. Л., Мухтасимова Н. Ф., Безгина Е. Н. и др., Ультраструктура смешанных синапсов при изменении эффективности синаптической передачи.- В кн.: Проблемы нейрокибернетики, под ред. Б. М. Владимирского, Ростов-на-Дону, 2002, ч. 2, с. 273-274.

40. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мухтасимова Н.Ф., Пахотин П.И., Дзебан Д.А. и Мошков Д.А. Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология, 2003, т. 123, вып. 1, с. 41-45.

41. Павлик Л. Л., Безгина Е. Н, Тирас Н. Р., Михеева И. Б. и Мошков Д. А. Влияние веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов, на структуру смешанных синапсов маутнеровских нейронов. Морфология, 2003, 000:

42. Потемкин В.В., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Исследование возможности оценки функционального состояния Маутнеровских нейронов по двигательной активности золотой рыбки. В кн.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия. Пущино, 1981.

43. Петруняка В.В. Цитохимические методы выявления ультраструктурной локализации кальция. Цитология, 1987, т. 29, 8, с. 875-883. •

44. Санталова И.М., Мошков Д.А., Зиганшин Р.И. и др. Влияние кеоторфина на ультраструктуру и функцию Маутнеровских нейронов золотой рыбки. В сб.: Колосовские чтения. С.-Петербург, 1994, с. 64.

45. Санталова И.М., Мошков Д.А. и Мавлютов Т.А. Особенности морфофункциональной реабилитации Маутнеровских нейронов после утомления. Цитология, 2000, т. 42, № 4, с. 351-357.

46. Сахаров Д.А. Гигантские аксоны Маутнера. Успехи современной биологии, 1961, т. 62, вып. 1, № 4, с. 112-124.

47. Тирас Н.Р. Ультраструктурные исследования пластичности маутнеровских нейронов с использованием биологически активных веществ. В сб.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия. Пущино, ОНТИ НЦБИ, 1981, с. 134-141.

48. Тирас Н.Р., Д.А. Мошков. Ультраструктура афферентных тормозных и возбуждающих синапсов Маутнеровских нейронов. Цитология, 1987, Том 29,N3,0. 288-294.

49. Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на Маутнеровские нейроны золотой рыбки. Ж. Эволюц. биохимии и физиологии, 1978, т. 39, № 5, с. 486-490.

50. Тирас Н.Р., Потемкин В.В., Мошков Д.А. Действие каиновой кислоты на Маутнеровские нейроны адаптированных и неадаптировааных рыб. Цитология, 1990, т. 32, № 8, с. 795-800.

51. Тирас Н.Р., Павлик Л.Л., Мошков Д.А. Выявление актина и особенности организации цитоскелета маутнеровских нейронов золотой рыбки // Цитология, 1990, т. 32,4, с. 352-358.

52. Тирас Н.Р., Жердев Г.В., Мошков Д.А. Ультрастурктура Маутнеровских нейронов рыб, адаптируемых к длительной стимуляции при воздействии этанола. Цитология, 1995, т. 37, № 5-6, с. 430-439.

53. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд среднеазиатского черного скорпиона защищают маутнеровские нейроныот повреждающего действия длительной стимуляции. Морфология, 1998, т. 113, № 1, с. 100-104.

54. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Пахотин П.И., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд скорпиона содержит фракции, взаимодействующие с нейрональным цитоскелетом. ДАН, 1999, т. 368, № 3, с. 416-419.

55. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков Д.А., Пахотин П.И., Морфофункциональные исследования адаптированных маутнеровских нейронов золотых рыбок в условиях длительной инкубации продолговатого мозга. Морфология, 2003, 122, № 6, 19-24.

56. Тушмалова Н.А., Маракуева И.Б. Сравнительно-физиологические исследование ультраструктурных аспектов памяти. Наука, Москва, 1986.

57. Abbott L.E. and Nelson S.B. Synaptic plasticity: taming the best. Nature Neurosci., 2003, № 3,1178-1183.

58. Baily C.H., M.Chen. Morphological basis of long-term habituation and sensitization in Aplisia. Science, 1983,220,91-93.

59. Bailey C.H. Structural changes and the storage of long-term memory in Aplisia. Can J. Physiol. Pharmacol., 1999, 77,738-747.

60. Ваппо Т., К. Kohno. Conformational changes of smooth endoplasmic reticulum induced by brief anoxia in rat Purkinje cells. J.Compar.Neurol., 1996, vol. 369, p. 462-471.

61. Baudry M. Advances in synaptic plasticity. MIT Press, 2000, 1-335.

62. Baux G., Simonneau M., Tauc L. and Segundo J.P. Uncoupling of electrotonic synapses by calcium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, № 9, p. 45774581.

63. Bartelmez G.W. Mauthner's cell and the nucleus motorius tegmenti. J. Сотр. Neurol., 1915, v. 25, p. 87-128.

64. Bennett M.V.L. and Godenough D.A. Gap junctions. Neurosci. Res. Progr. Bull., 1979, v. 16, p. 373-485.

65. Berdan R.S. and Caveney S. Gap junction ultrastructure in three states of conductance. Cell Tissue Res., 1985, v. 239, p.l 11-122.

66. Bliss T. V. P. and Lomo T., Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the anaesthesized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Phisiol., 1973,232,331-356.

67. Bruzzone R., T.W. White, D.A. Goodenough. The cellular internet: on-line with connexins. BioEssays, 1996, vol 18, p. 709-718.

68. Buchtel H On defining neiral plasticity. Arch. Ital. Biol., 1978, vol 116, p. 241246. Couteaux R. The differentiation of synaptic areas. Proc. Roy.Soc. London B, 1963, vol. 158, p.475-480.

69. Campbell A.K. Intracellular calcium, its universal role as regulator. Chichester. John Wiley, 1983, p. 1-513.

70. Canfield Y. G., Rose G. Y. Activation of Mauthner neurons during prey captre.- J. Compar. Physiology A, 1993, vol. 172, Iss 5, p. 611-618.

71. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat A.G., Ansiello D.A. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Amer.J.Physiol., vol. 261, c. 882-886.

72. Chen L., Meng M.Q. Compact and scattered gap junction in diffusion mediated cell-cell comunication. J.Theor. Biol., 1995, vol. 176, p. 39-45.

73. Cochran S., Hackett J., Brown D. The anuran Mauthner cell and its synaptic bed. Neuroscience, 1980, v. 5, p. 1629-1646.

74. Cooper. J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J.Cell Biol., 1987, vol. 105, p. 1473-1478.

75. Cox KJ.A., Fetcho J.R. Labeling blastomeres with a calcium indicator: A noninvasive method of visualizing neuronal activity in zebrafish. J. Neurosci. Methods, 1996, v. 68, p. 185-191.

76. Diamond J. The Mauthner cell. In: Fish physiology N.Y., Acad. Press., 1971, v. 5, p. 265-346.

77. Ding B. Cell to cell transport of macromolecules through plasmodesmas a novel signaling pathway in plant. Trends Cell Biol. 1997, v. 7, p. 5-8.

78. Eaton R., Bombardieri R. Behavioral function of the Mauthner neuron. In: Neurobiology of the Mauthner cell. N. Y.: Raven press, 1978, p. 221-224.

79. Eaton R.C., Lavender W.A., Wieland C.M. Identification of Mauthner -initiated response patterns in goldfish: evidence from simultaneous cinematography and electrophysiology. J. Comp. Physiol., 1981, v. 144, p. 521-531.

80. Eaton R.C., Domenico R., Nissanov J. Role of the Mauthner cell in sensorimotor integration by the brainstem escape network. Brain Behav. Evol., 1991, v. 37, p. 272-285.

81. Elias E. and Boyer J.L. Chlorpromazine and its metabolites alter polymerization and gelation of actin. Science, 1979, v. 206, № 21, p. 14041406.

82. Faber D.S, Korn H. Unitary conductance changes at teleost Mauthner cell glycinergic synapses: a voltage-clamp and pharmacological analysis. J. Neurophysiol., 1988, v. 60, p. 1982-1999.

83. Faure P., Kaplan D., and Korn H. Synaptic efficacy and the transmission of complex firing pattern between neurons. J. Neurophysiol., 2000, 84, 30103025.

84. Fetcho J.R., O'Malley D.M. Visualization of active neural circuitry in the spinal cord of intact zebrafish. J. Neurophysiol., 1995, v. 73, p. 399-406.

85. Fujisawa H.H., Marioka et al. A dacay of gap junction in assocition with cell differentiation of neural retina chick tmbryo devolopment. J. Cell Sci. 1976, vol. 22, p. 585-596.

86. Furshpan E.P., Furukawa T. Intracellular and extracellular responses of the several region of the Mauthner cell of the goldfish after polymerization and gelation of actin. J. Neurophysiol. 1962. vol. 25. p. 732-771.

87. Geiger B., Avnur Z., Volberg T., Volk T. The cell in contacts. New-York, J. Wieley and Sons, 1985, p. 461 -489.

88. Geiger B, Ginsberg D. The cytoplasmic domain of adherens type junctions. Cell. Motil. Cytoskel., 1991, v. 20, p. 1-6.

89. Gray J. Studies in animal locomotion. The relationship between waves of muscular contraction and propulsive mechanism of the cell. J. Exp. Biol., 1933, v. 10, p. 386-400.

90. Grigoriev P.A., Tarahovsky Yu.S., Pavlik L.L., Udaltsov S.N. and.Moshkov D.A. Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranes. IUBMB Life, 2000, v. 30, p. 227-233.

91. Hall D.H., Gilat E., M.V.L.Bennett Ultrastructure of the rectifying electrotonic synapses between giant fibers and pectoral fin adductor motoneurons in the hatchetfish. J. Neurosci. 1985, v. 14, p. 825-834.

92. Heuser J.E., Reese T.S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J. Cell Biol., 1973, vol. 57, p. 315-344.

93. Heuser J.E., Reese T.S. Structure of synapse. In: The handbook of physiology. Sect.l. The nervous system. Bethesda (Md), 1977, vol. 1, p. 261294.

94. Heuser J.E., Reese T.S., Dennis M.J. et al. Synaptic vesicle exocytosis captured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J. Cell Biol., 1979, v. 81, p. 275-300.

95. Janka Z., L. Latzkovitz, F. Joo, J. Szentistvanyi. Cell-to-cell- contacts in primary cultures of dissociated chicken embiyonic brain. Cell Tissue Res., 1979, vol 199, p. 153-157.

96. Jefferys J.E. Nonsynaptic modulation of neuronal activity in the brain: electric currents and extracellular ions. Physiol. Rev. 1995, vol. 75, № 4, p. 689-723.

97. Kadota T., Mizote M., Kadota K. Synaptic spinules attendant on post-tetanic potentiation in cat sympathetic ganglion. Proc. Japan Acad., 1996, vol. 72(B), p. 48.

98. Kashapova L.A., Moshkov D.A., Bezgina E.N. Active zones and plasticity of motor nerve terminals. In: Plasticity of Motoneuronal Connections. Elsevier Sci. Pub. BV, 1991, p. 163-173.

99. Kelly R. D., B. D. Perdue. Devolopment of the agin cell surfase. Exp. Gerontol. 1980, vol. 15, p. 407-421.

100. Kimmel Ch.B., Powell S.L., Eaton R.S. Does the Mauthner neuron mediate unique behavior? Soc. Neurosci. Abstr., 1978, v. 4, p. 1156.

101. Kimmel Ch. B., Sessions S. K., Kimmel R. J. Morphogenesis and synaptogenesis of the zebrafish Mauthner neuron. J. Compar. Neurol., 1981, vol. 198, p. 101-120.

102. Kohno K. Symmetrical axo-axonic synapses in the axon cap of the goldfish Mauthner cell. Brain res., 1970, vol. 23, p.255-258.

103. Kolaeva S.G., Semenova T.P., Santalova I.M., Moshkov D.A. Anoshkina I.A. and Golozubova V. Effect of L-thyrosyl-L-arginine (kyotorphin) on the behavior of rats and goldfish. Peptides, 2000, v. 12, № 9, p. 1331-1336.

104. Korte G.E., Rosenbluth J. Freese-fracture study of the .postsynaptic membrane of the cerebellar mossy fiber synapse in the frog. J.Comp. Neurol., 1980, vol. 193, p. 689-700.

105. Kumar S., Faber D.S. Plasticity of first-order sensory synapses: Interactions between homosynaptic long-term potentiation and heterosynaptically evoked dopaminergic potentiation. J. Neurosci, 1999, v. 19, p. 1620-1635.

106. Liberman A.R., Spacek J. Filamentous contacts: the ultrustructure and three-dimentional organization of specialized non-synaptic interneuronal appositions in thalamic relay nuclei. Cell Tissue Res., 1997, v. 288, p. 43-57.

107. Lin E.C., Cantiello H. A novel method to study the electrodynamic behavior of actin filaments. Evidence for cable -like properties of actin. Biophys. J., 1993, v. 65, p. 1371-1378.

108. Lin J.W., Faber D.S., Wood M.R. Organized projection of the goldfish saccular nerve onto the Mauthner cell lateral dendrite. Brain Res., 1983, v. 247, p. 319-324.

109. Liu K.S., Fetcho J.R. Photoablations of serially homologous reticulospinal neurons support their differential contributions to escape behavior in larval zebrafish. Soc. Neurosci. Abstr., 1998, v. 24, p. 1667.

110. Macklis J. D. New memories from new neurons. Nature, 1998, 396, p. 414415.

111. Mauthner L. Untersuchungen uber den Bau des Ruckenmarks der Fishe.- S. -Ber. Akad. Wiss. Wien, 1959, Bd. 34, p. 31-36.

112. Mienhardt H. Cell determination baundaris as organizing region for secandary embryonic fields. Dev. Biol., 1983, vol. 96, p. 375-385.

113. Model P.G., Bornstein M.B., Crain S.M., Pappas G.D. An electron microscopic study of the development of synapses in cultural • fetal mouse cerebrum continuously exposed toxylocain. J. Cell Biol., 1971, v. 2, p. 113126.

114. Moshkov D. A., Tiras N. R., Saxon M. Ye. Phalloidin changes the synaptic contacts ultrastructure.-Naturwissenschaften, 1980, Bd. 67, p. 194-195.

115. Moshkov D.A., Saveljeva L.N., Yanjushina G.V., Funtikov V.A. Structural and neurochemical changes in the citoskeleton of the goldfish Mauthner cells at different functional states. Acta histochemica, 1992, S (41), p. 241-247.

116. Moshkov D.A. and Santalova I.M. Distribution of calcium pyroantimonate precipitates in Xenotoca Mauthner cells at normal and increased functional activity. Neurosci., 1995, v. 65, № 3, p. 917-925.

117. Moshkov D.A., Mukhtasimova N.F. et al. In vitro long-term potentiation is accompanied by the changes of mixed synapses. Neurosci., 1998, v. 88, p. 10912.

118. Mulkey R.M., Malenka R.C. Mechanisms underlying induction of homosynaptic long-term depression in area CA1 of the hippocampus. Neuron, 1992, vol. 9, p. 967-975.

119. Mills J.W., Pedersen S.F., Walmod P.S. and Hoffmann E.K. Effect of cytochalasins on F-actin and morphology of Ehrlich ascites tumor cells. Exptl. Cell Res., 2000, v. 261, p. 209-219.

120. Nakajima Y. Fine structure of the synaptic ending on the Mauthner cell of the goldfish. J. Comp. Neurol., 1974, vol. 156, p. 375-402.

121. O'Malley D.M., Kao Y.-H., Fetcho J.R. Imaging the functional organization of zebrafish hindbrain segments during escape behaviors. Neuron, 1996, v. 17, p. 1145-1155.

122. Oda Y., Kawasaki K., Morita M., et al. Inhibitory long-term potentiation underlies auditory conditioning of goldfish escape behaviour. Nature, 1998, 394,192-185.

123. Palay S.L. Morphology of synapses in the central nervous system. Exp. Cell Res., 1958, vol. 5, p.275-293.

124. Pappas G.D., E.B. Cohen, D.P. Purpura. Fine structure of synaptic and non-synaptic neuronal relations in the thalamus of the cat.In Purpura D.P., Yahr M.D. (Eds). The thalamus Columbia University, New York, 1966, p. 47-75.

125. Pappas G.D., Waxman S.G. Synaptic fine structure-morphological correlated of chemical and electronic transmission. In: Structure and function of synapses. N.Y. Raven press, 1972, p. 1-43.

126. Pavlik L. L., Moshkov D. A. Actin in synaptic sytoskeleton during long-term potentiation in hippocampal slices.-Acta Histochemica, 1992, Suppl. Band 41, S. 257-264.

127. Popov S.V., Svitkina T.M., Margolis L.B., Tsong T.Y. Mechanism of cell protrusion formation in electrical field: the role of actin. Biochem. Biophys. Acta, 1991, vol. 1066, p. 151-158.

128. Rees R. The morphology of the interneuronal synaptogenesis: a review. Feder. Proceed., 1978, vol. 37, p. 2000-2009.

129. Retzlaff E., Fontaine J. A differential straining reactions demonstrating reciprocal activity in Mauthner cells.- Experientia, 1960, vol. 19, p. 359-361.

130. Revel J-P., Brown S.S. Cell junction in development with particular reference to the neural tube. Cold Spring Harbor Symp Quant. Biol., 1976, vol. 40, p. 443-455.

131. Revel J-P., Karnovsky M.J. Hexaganal array of subunist in intrecellular junction of the mousa heart and liver. J. Cell Biol., 1967, vol. 33, p. 7-12.

132. Ritter D., Fetcho J.R. Confocal calcium imaging of spinal interneurons during swimming in larval zebrafish. Soc. Neurosci. Abstr., 1998, p. 1667.

133. Robertson J.D. The occurence of a subunit pattern in the unit membranes of club endings in Mauthner cell sinapses in goldfish brains. J. Cell Biol., 1963, vol. 19, p. 201-220.

134. Rock M. K., Hackett J. T., Brown P. L. Does the Mauthner cell conform to the criteria of the command neuron concept?- Brain Res., 1981, vol. 204, p. 21-27.

135. Rosenbluth J. Subsurface cisterns and their relationship to the neuronal plasma membrane. J. Cell Biol., 1962, vol. 13, p. 405-421.

136. Rosenmund C., G.L. Westbrook. Calcium- induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron, 1993, vol. 10, p. 805-814.

137. Rosenzweig M.R., Mijllgaard K., Diamond M.E., Bennett E.L. Negative as well as positive synaptic changes may store memory. Physiol. Revs, 1972, vol. 79, p. 93-96.

138. Royer S. and Pare D., Conservation of total synaptic weight through balanced synaptic depression and potentiation. Nature, 2003,422, 518-522.

139. Sachs F. Biophysics of mechanoreception. Membr. Biochem, 1986, vol. 6, p.173-195.

140. Saito A., Wang Ch-T. and Fleischer S. Membrane asymmetry and enhanced ultrastructural detail of sarcoplasmic reticulum revealed with use of tannic acid. J.Cell Biol., 1978, v. 79, p. 601-616.

141. Schuster Th. Experimental alteration in number and length of different membrane complexes on axosomatic contact in the trout (Salmo iridens, Gibbon, 1885). J. Hirnforschung, 1978, v. 19, p. 45-73.

142. Siegesmund K.A. The fine structure of subsurface cisterns. Anat. Rec., 1968, vol. 162, p. 187-196.

143. Silva A., Kumar S., Pereda A., Faber D.S. Regulation of synaptic strength at mixed synapses: effects of dopamine receptor blockade and protein kinase С activation. Neuropharmacology, 1995, v. 34, p. 1559-1565.

144. Staehelin L. A. Structur and function of intercellular junctions. Int. Rev. Cytol. 1974, vol. 39,p. 191-283.

145. Stefanelli A. The Mauthner apparatus in the Ichthyopsida; Its nature and correlated problems of histogenesis. Quart. Rev. Biol., 1951, v.26, p. 17-34.

146. Stefanelli A., Caravita S. Ultrastructura dei systemi sinaptici del neurone di Mauthner di un Teleosteo. Ztschr. Zellforsch., 1964, Bd. 62, S. 1-15.

147. Stefanelli A. I neuroni di Mauthner degli ittopsidi. Valutazioni comparative morphologiche e funzionali. Lincei. Mem. Sci. Fis. Eccol., Roma, 1980, v. 16, p. 1-45.

148. Stevens C. A million dollar question: does LTP=Memoiy? Neuron, 1998, 20,1-2.

149. Suszkiw J.B.,Zimmermann H., Whittaker V.P. Vesicular storage and release of acetylcholine in Torpedo electroplaque synapses. J. Neurochem., 1978, vol. 30, p. 1269-1280.

150. Suzuki M., Miyazaki K. et al. F-actin network may regulate а СГ channel in renal proximal tubule cells. J. Membr. Biol., 1993, v. 134, p. 31-39.

151. Tanaka H. et al. Fetal alcohol effects: decreased synaptic formations in the fields CA3 of fatal hippocampus.-Int. J. Develop. Neurosci., 1991, vol. 9, p. 509-517.

152. Tamura K., Shan W.-S. et al. Structure-function analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron, 1998, v. 20, p. 1153-1163.

153. Tang L., Hung C., Schuman E. A role for the cadherin family of cell adhesion molecules in hippocampal long-term potentiation. Neuron, 1998, v. 20, №6, p. 1165-1175.

154. Thomson A. M. Facilitation, augmentation and potentiation at central synapses. Trends Neurosci., 2000, 23, № 7,305-312.

155. Tiras N. R., Pavlik L. L., Moshkov D. A. Alterations in the cytoskeleton of goldfish Mauthner cells under various pharmacological treatments.-Acta Histochem., 1992, Suppl. Bd. 41, S. 249-256.

156. Tiras N.R., Zherdev G.V. and Moshkov D.A. Ultrastructure of Mauthner cells in fish adapted to long-duration vestibular stimulation and the effect of etanol. Neural Plastisity, 1999, v. 6, № 4, p. 91-102.

157. Torri-Torelli F., Crohovas F., Tesce R.,Ceccarelli B. Temporal coincidence between synaptic vesicles fusion and quantal secretion of acetylcholine. J Cell Biol., 1985, v. 101, p. 1386-1399.

158. Triller A., Korn H. Morphologically distinct classes of inhibitory synapses arise from the same neurons: ultrastructural identification from classed vestibular interneurons intracellularly stained with HRP. J. Comp. Neurol., 1981, v. 203, p. 131-155.

159. Tuttle R., S. Masuko, Y. Nakajima. Freeze-fracture study of the large myelinated club ending synapse on the goldfish Mauthner cell: special reference to the quantitative analysis of gap junctions. J. Compar. Neurol., 1986, vol. 246, p. 202-211.

160. Uchida N., Honjo Y. et al. The catenin /cadherin adhesion system is localized in synaptic junctions bordering transmitter release zones. J. Cell Biol., 1996, v. 135, p. 767-779.

161. Valdivia H. H., Kirby M. S., Lederer W. J., Coronado R. Scorpion toxins targeted against the sarcoplasmic reticulum Ca""- release channel of skeletal and cardiac muscle. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, № 24, p. 12185-12189.

162. Viviani B., Galli C.L., Marinovich M. Is actin polymerization relevant to neurosecretion? A study on neuroblastoma cells. Biochem and Biophys. Res. Communs., 1996, v. 223, № 3, p. 712-717.

163. Wang G., Lemos J. R. Effects of funnel web spider toxin on Ca4-1" currents in neurohypophysial terminals.- Brain Res., 1994, vol. 663, № 2, p. 215-222.

164. Wang Y. and Rose B. Clustering of Cx43 cell-to-cell channels into gap junction plaques: regulation by cAMP and microfilaments. J. Cell Sci., 1995, v. 108, p.3501-3508.

165. Wilson-Kubalek E.M., Brown R.E., Celia H., Milligan R.A. Lipid nanotubules as a substrate for helical crystallization of macromolecules. Proc.Natl.Acad.Sci, USA, 1998, v.95, p. 8040-8045.

166. Yakoubek B., Edstrom J. E. RNA changes in the Mauthner axon and myelin cheath after increased functional activity. J. Neurochem., 1965, v. 12, p. 845.

167. Yamagata M., Hermann J.P., Sanes J.R. Laminin-specific expression of adhesion molecules in developing chick optic tectum. J. Neurosci., 1995, v. 15, p. 4556-4571.

168. Yamane Y., Shiga H., Sou H. and Ito E. Gap junctional channel inhibition alters actin organization and calcium propagation in rat cultured astrocytes. Neuroscience, 2002, v.l 12, № 3, p.593-603.

169. Yanka Z. Latzkovitz, Yoo, Szentistvangi J. Cell-to-Cell contacts in primary cultured of dissociated chicken embrionic brain. Cell Tissue Res., 1979, v. 199, p. 153-157.

170. Yang X.-D., Korn H., Faber D.S. Long-term potentiation of electronic coupling at mixed synapses. Nature, 1990, v. 348, p. 542-545.

171. Yang X.-D., Faber D.S. Initial synaptic efficacy influences induction and expression of long-term changes in transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 4299-4303.

172. Zhang Y.D.W., McBride J.R. and Hamill O.P. The ion selectivity of membrane conductance inactivated by extracellular calcium in Xenopus oocytes. J.Physiol. (Lond.), 1998, v.508, № 3, p.763-776.

173. Zottoli S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditori responses in unrestrainet goldfish.-J. Exp. Biol., 1977, vol. 66, p. 243-254.

174. Zottoli S.J. and Faber D.S. Properties and distribution anterior VIII nerve exitatory inputs to the goldfish Mauthner cell. Brain Res., 1979, v. 174, p. 319323.

175. Zottoli S.J., Bentley A.P., Prendergast B.J., Rieff H.I. Comparative studies on the Mauthner cell of teleost fish in relation to sensory input. Brain Behav. Evol., 1995, v. 46, p. 151-164.

176. Zottoli S.J. and Faber D.S. The Mauthner cell: What has it taught us? The Neuroscientist, 1999.