Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином

Михеева, Ирина Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином"

На правах рукописи МИХЕЕВА ИРИНА БОРИСОВНА

;; / £ ¿я £

Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1999

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук Научные руководители: доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Мошков Д. А. Тирас Н.Р.

Лебедев О.Е. Попов В.И.

Ведущая организация: Институт Цитологии РАН, г. Санкт-Петербург Защита состоится «

¿6 2000 гв//

2б0.22.С

часов на заседании

Диссертационного Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г. Пущино, Московской области, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН. Автореферат разослан 1999 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 200.22.01/

кандидат биологических наук ~/7 ПА. Нелипович

рм ч, н^; ^ / -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования: Участие нейронального актина в сииаптической пластичности привлекает в последнее время пристальное внимание [Fifkova, 1995; Niethammer et al., 1998]. Локализуясь в пре- и поетеинаптических областях, этот белок обеспечивает транспортировку везикул к активным зонам и секрецию медиаторов [Tamie et al., 1994], выполняет адгезионную роль, удерживая синапсы в топографически определенном месте и создавая, таким образом, строго специфические межнейронные связи [Liberman, Spacek, 1997], регулирует функцию постсинапгических рецепторов [Rosenmund, Westbrook, 1993]. Модификация актина в любом из этих звеньев неизбежно приводит к модуляции синаптической функции. Установлено вовлечение актина в долговременную потенциацию синаптической передачи как химического [Pavlik, Moshkov, 1992], так и электротонического [Moshkov et al., 1998] сигналов, в создании и поддержании резистентности к утомительным стимуляциям [Павлик и др., 1997; Tiras et al., 1999]. При изучении механизмов синаптической пластичности для выяснения роли в них нейронального актина широко применяют физиологически активные вещества, специфически взаимодействующие с актином, изменяя его агрегатное состояние и другие свойства [Павлик и др., 1997; Павлик и др., 1998]. Пользуясь ими как тонкими фармакологическими инструментами, оказывается возможным не только определить функциональный вклад актина в поведение нейрона, но также выяснить локализацию актина, и, следовательно, увидеть то звено в структуре синапгического аппарата, в функционировании которого он, возможно, принимает участие. До сих пор обнаружение таких специфических соединений, выделяемых из животных и растительных объектов, можно рассматривать как явление случайное[Ра1г et al., 1995; Bai et al., 1995; Shin-ya Saito et al., 1997]. Набор таких веществ ограничен. Кроме того, некоторые из них токсичны, другие плохо или совсем не проникают в клетку. Поэтому расширение списка препаратов, которые способны специфически взаимодействовать с цитоскелетным актином, является в настоящее время актуальной задачей. Перспективным источником токсинов, обладающих различными свойствами, являются яды паукообразных и других ядовитых членистоногих [Neurotoxins, 1996]. Однако, существование в них физиологически активных соединений прямого цитоскелетного дейстни до сих пор не установлено. Негативным фактором, по-видимому, служит неадекватность объектов, которые используются для скрининга этих ядов. Такими объектами в силу ряда причин могли бы стать Маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб. Предыдущими исследованиями установлено, что их функция в существенной мере зависит от актина. Это уникальное свойство воспроизводимо идентифицируется в морфофункциональных экспериментах [Мошков, 1985; Tiras et al, 1992; Moshkov et al., 1998]. Актина в МН много, и часть

его локализована в компактных образованиях синаптических контактов, так называемых десмосомоподобных контактах (ДПК) [Янюшина и др., 1990; Павлик и др., 1997], от состояния которых зависит функциональное состояние нейронов и структуру которых легко контролировать элекгронномикроскопически [Moshkov et al., 1980]. Крупные размеры этих уникальных нейронов, их строгая топография в мозгу облегчает аппликацию различных физиологически активных веществ, в том числе ядов насекомых [Тирас; Мошков, 1980; Мошков и др., 1981]. Однако, требуются комплексные морфофункциональные исследования, чтобы показать пригодность МН для испытания ядов паукообразных с целью поиска нейротоксинов, взаимодействующих с цигоскелетом.

Цель и основные задачи исследования. Целью данной работы была разработка нового подхода для скрининга цельных ядов и фракций ядов паукообразных с целью идентификации среди них таких физиологически активных соединений, которые активно взаимодействуют с цитоскелетом и его актиновым компонентом, используя для этого в качестве тест-объекта Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки. Были поставлены следующие задачи.

1. Исследовать возможность использования Маутнеровских нейронов золотой рыбки в качестве тест-объекта для дифференцированной оценки нейротоксичности цельных ядов некоторых видов паукообразных и губоногих.

2. Изучить функциональное состояние и ультраструкгуру МН в близкие и отдаленные сроки после аппликации цельного яда среднеазиатского черного скорпиона и длительной естественной стимуляции.

3. Разделить цельный яд скорпиона на фракции, проанализировать их влияние на функцию МН и сравнить эффект некоторых из них с воздействиями, которые специфически изменяют состояние нейронального актина.

4. Разработать методику прямой диагностики in vitro функционального состояния МН в условиях нормы, утомления и резистентности к утомлению, индуцированной in situ естественными тренировками или аппликацией фракции яда.

5. Провести сравнительный качественный и количественный ультратруктурный анализ контактов афферентных химических синапсов МН после различных экспериментальных воздействий, известно изменяющих состояние нейронального актина, и аппликаций фракций ада скорпиона неизвестного механизма действия, а также исследовать взаимодействие этих фракций с хроматографически чистым актином.

Научная новизна работы. Впервые было показано, что рыбы и их МН являются адекватными объектами для проведения скрининга ядов неизвестного происхождения и неустановленного действия с целью поиска новых нейротоксинов и физиологически активных соединений.

Установлено, что использование этих объектов имеет ряд преимуществ, главным из которых является возможность одновременного проведения комплекса токсикологических исследований разного уровня организменного, тканевого, клеточного и субклеточного, затрачивая при этом весьма малую дозу исследуемого препарата. Впервые показано, что апплицнруя цельные яды на МН, можно дифференцировано определять нейротропную активность, степень нейротоксичности, а при необходимости и цитотоксичность яда, что является необходимым шагом на пути дальнейшего анализа активных компонентов ядов после соответствующего их фракционирования. Впервые было проведено испытание цельного яда среднеазиатского черного скорпиона, ранее в токсикологических экспериментах на этом объекте не изучавшегося. Обнаружено, что при аппликациях яда скорпиона на МН рыб раздельно и в сочетании с длительной естественной стимуляцией (ДЕС) яд, обладая сильной токсичностью, проявил неизвестный ранее защитный эффект от угнетающего действия ДЕС, который выразился в быстром восстановлении исходной функции и ультраструктуры МН. Определено, что некоторые фракции, выделенные из цельного яда скорпиона, хорошо воспроизводят отдельные свойства, отмеченные у цельного яда. Одна среди них обладала сильно выраженным протекторным свойством, а другая, наоборот, как и ДЕС угнетала функцию МН. Выявлена аналогия между морфофункциональным эффектом фракций яда скорпиона н испытанными в тех же условиях специфическими воздействиями на МН, изменяющими состояние нейроналыюго актина известным образом. Установлено, что мишенью действия фракций являются актин-содержащие специализированные структуры синаптических контактов. Впервые показан прямой эффект указанных фракций яда скорпиона на хроматографически чистый актин. Фракция, повышающая резистентность МН к утомлению, трансформировала G-актин в F-актин и индуцировала формирование пучков. Фракция, угнетающая функцию МН, разрушала F-актин. Таким образом, получены абсолютно новые данные о существовании в яде скорпиона фракций, взаимодействующих с нейрональным актином, которые впоследствии могут послужить объектом для дальнейшей очистки и молекулярно-биологической идентификации. Впервые разработана методика электрофизиологической диагностики функционального состояния МН in vitro после косвенной оценки его по поведению, измененному аппликацией физиологически активных веществ или естественной стимуляцией. Выявлена схожесть результатов оценки функционального состояния МН прямым и косвенным методами.

Научно-практическая ценность работы.

Проведенное исследование имеет большую теоретическую ценность, так как впервые показывает существование в цельном яде скорпиона компонентов, взаимодействующих с цитоскелетом, что расширяет наши представления об окружающем мире. Данные

результаты имеют определенную практическую значимость при разработке подходов к исследованию веществ, выделяемых из других животных и растительных объектов и обладающих потенциальной специфической токсичностью неизвестного спектра действия. Использование МН как тест-объекта может способствовать расширению этих исследований с целью идентификации новых нейротропных соединений и нейротоксинов или новых свойств у известных нейротоксинов. Выделенные и охарактеризованные фракции яда скорпиона уже на достигнутом уровне очистки могут оказаться полезными нейрофармакологическими инструментами, пригодными для исследования актина in vitro и для тонких вмешательств in vivo в структурную организацию и функцию цитоскелета живых клеток, для выяснения механизмов пластичности, адаптации и памяти на клеточном и мембранном уровнях.

Результаты работы используются при чтении курса лекций в ПущГУ.

Апробация работъи Результаты исследований были доложены и обсуждены на 1-ой, П-ой и IV-ой научных конференциях молодых ученых города Пущино (Пущино, 1996, 1998, 1999), на Ш-ей международной конференции по функциональной нейроморфологии (С-Петербург, 1997), на П-м Всероссийском биофизическом съезде (Москва, 1999), на аттестационном Ученом совете ИТЭБ РАН и на совместном заседании лаборатории системной организации нейронов и Пущинского отделения Физиологического общества России в 1999 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Содержание работы изложено на страницах

машинописного текста, включающих таблиц и иллюстраций (микрофотографии, схемы, графики). Библиография содержит отечественных и //Иностранных источников. Использованные сокращения:

A3 - активные зоны, ДЕС - длительная естественная стимуляция, ДПК -десмосомоподобные контакты, МН - маутнеровский нейрон.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования.

Объектом исследования были 3-месячные мальки золотой рыбки Carassius auratus породы шубункин и ваккин, размером 2,5-3,0 см, массой около 2 г.

Функциональную активность МН оценивали косвенно по поведению рыбки в кольцевой камере (Мошков, Подольский и др., 1982), подсчитывая число поворотов, совершаемых с помощью унилатерального

удара хвоста, индуцируемых активацией МН (Canfield et al., 1993). Сенсорную стимуляцию МН через вестибулярный аппарат, главный источник афферентации МН [Eaton et al., 1988], осуществляли в специальной установке (Мошков, 1985), вращающей рыб в 2-х плоскостях со скоростью 42 оборота в минуту. Утомление МН индуцировали непрерывной 2-х или 3-х часовой стимуляцией. Для выработки адаптированного состояния МН, характеризующегося резистентностью к утомляющей нагрузке, рыб ежесуточно дважды подвергали коротким стимуляциям с интервалом 6 час. Продолжительность стимуляций начиналась с 1 мин и с каждым разом возрастала на 1 мин, заканчиваясь 30 мин на 15-е сут. Оценку адаптации проводили через 4 сут по окончании тренинга.

Яды для исследований любезно предоставлены чл. корр. РАН, проф. Е.В. Гришиным, ИБХ РАН. Исследовали цельные яды: среднеазиатского черного скорпиона (Orthochirus scrobiculosus), южнорусского тарашула (Licosa singoriensis), степного и домашнего пауков (Segestria florentina и Tegenaria domestica) - все из класса паукообразных, а также сколопендры кольчатой (Scolopendra singulata), класс губоногих. Яды получали от животных электрической стимуляцией ядовитых желез. Собранные яды высушивали лиофнлгоацией и до проведения работы хранили при -40°С. Для проведения экспериментов яды растворяли в изотоническом растворе для холоднокровных (в дальнейшем - физраствор). Иногда в физраствор добавляли 20 шМ Трис-НС1, рН 7,4. Разделение цельного яда черного скорпиона на полипептидные фракции, содержащие компоненты разного молекулярного веса, проводили совместно с В.Н.Пашковым (ФИБХ РАН) на колонке TSK 2000 SW в аммоний-ацетатном буфере, рН 5,7, содержащем 150 mM NaCl (рис.1). Содержание белка во фракциях определяли по модифицированному методу Лоури. Для унификации исходную рабочую концентрацию каждой фракцш (по белку) доводили до рабочей концентрации цельного яда. Яды испытывали, инъецируя их в продолговатый мозг в область расположения МН (аппликации на МН) под микроскопом в объеме 4-5 мкл, обездвиживая рыбок в тающем льду [Тирас, Мошков, 1980]. Контрольным рыбкам на МН апплнцировали физраствор. Части подопытных рыбок в каждой серии экспериментов проводили внутрибрюшинные инъекции яда. В ряде случаев апплнцировали раствор цитохалазина D, препарата, который деполимеризует актин. Электрофизиологические эксперименты проводили в условиях in vitro на переживающих фрагментах продолговатого мозга совместно с П.И. Пахотиным (ИБК РАН) по разработанной ранее методике [Павлик и др., 1996]. Функциональное состояние МН оценивали по амплитуде внеклеточных ортодромно вызванных ответов МН (Furshpan, Furukawa, 1963). В качестве утомляющей нагрузки, вызывающей продолжительное (до 120 мин) угнетение электрических ответов МН, применяли непрерывное 2-2,5 час

электрическое раздражение корешков вестибулярного нерва пачками из 10 прямоугольных импульсов с частотой 20 Гц и чередованием пачек 0,5 Гц, подобранное экспериментально в предварительных опытах. Восстановление активности МН регистрировали непрерывно в течение 30 мин-2 час по завершении стимуляции.

Для электронно-микроскопических исследований у части контрольных и подопытных рыбок выделяли кусочки продолговатого мозга, содержащие МН, и погружали на 16 час при комнатной температуре в фиксатор, который состоял из глутаральдегида, формальдегида, диметилсульфоксида и 0.1 М какодилатного буфера, pH 7.2 (Мошков, 1985). Затем препараты фиксировали в 2%-м растворе четырехокиси осмия на этом же буфере, обезвоживали в спиртах и ацетоне, и заключали в Эпон. С эпоновых блоков на пирамитоме LKB готовили срезы толщиной 10 мкм. После отбора в световом микроскопе центральных срезов МН (с ядром и ядрышком) их переклеивали на новые блоки и резали ультратонко на ультратоме LKB-3. Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе Tesla BS-500 при увеличении 10 тысяч.

Для морфометрического анализа при одном и том же увеличении фотографировали аксонные окончания, расположенные по периметру плазматической мембраны МН. Отбирали только те бутоны, которые одновременно содержали активные зоны и ДПК, наиболее надежный критерий идентификации синапсов химического типа МН. Морфометрическнй анализ негативов проводили на приборе Микрофот (Carl Zeiss) при окончательном 65000-кратном увеличении структур. Подсчитывали количество специализированных контактов в терминалях, с помощью курвиметра измеряли протяженности аксосоматических контактов, активных зон и ДПК, вычисляли долю аксосоматического контакта, занятого каждым из этих специализированных контактов. В постсинапгической области измеряли периметр субповерхностных цистерн и подсчитывали их количество. Для дальнейшего структурного анализа после некоторых воздействий (рис. 2) по 50 случайно выбранных ДПК для каждого случая зарисовывали на экране прибора Микрофот при увеличении в 135000 раз. Каждый ДПК оцифровывали с использованием сканера Mustek. Морфометрический анализ проводили на компьютере Pentium 166 с использованием специальной программы, разработанной A.A. Деевым (ИТЭБ РАН). Она позволяет последовательно измерять на изображении количественные характеристики исследуемых структур -линейные размеры и площади - и сохранять их в памяти. В итоге получили данные о протяженности, площади и удельной ширине (площадь на единицу длины) электронно-плотного материала и щели ДПК. Статистическая обработка всех полученных результатов измерений проводилась программой Excel. Для сравнения средних арифметических значений пользовались критерием Стьюденга и, если требовалось, непараметрическим критерием Манна-Уитни.

Для исследования взаимодействия фракций яда скорпиона 6 и 9, предположительно обладающих цитоскелетным действием, с хроматографически чистым мышечным актином использовали методику негативного контрастирования. Препараты электрофоретически гомогенного F- и G-актина из мышцы кролика, выделенные по методу Spudich, Watt (1971), были любезно предоставлены С.Н. Удальцовым и проф. З.А. Подлубной, ИТЭБ РАН. Среда для F-актина содержала 125 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,4, для G-актина - 2 мМ Трис-HCl, pH 7,5; 0,2 шМ СаС12, 0,5 шМ ß-МЭ. Исходные концентрации F- и G- актина составляли 1-4 мг/мл. Конечная концентрация актина составляла 0,1-0,2 мг/мл. Реакцию между актином и фракциями яда скорпиона, а также цитохалазином D и фаллоидином проводили в лунках на поверхности тефлоновой пластинки в холодильнике, время реакции и концентрации реагентов меняли для оценки динамики наблюдаемых изменений. Контролем служили реакции G-актина с KCl, а также G- и F-акгина со средами разведения актина, фракций яда, цитохалазина D и фаллоидина. Для негативного контрастирования препаратов применяли 3%-й раствор молибденовокислого аммония (МКА) или 1%-й раствор уранилацетата. Съемку проводили при увеличении 32 тысячи.

Результаты и обсуждение

1) Исследование влияния аппликации цельных ядов некоторых паукообразных на функциональное состояние МНзолотой рыбки. Результаты скрининга ядов различных членистоногих показал, что рыбы как объект исследования проявили неодинаковую чувствительность к действию тестируемых ядов (Табл. 1). Они оказались в три раза более чувствительными к внутримозговым инъекциям ядов, чем к внутрибрюшинным. Выявилось, что яды обладают разной токсичностью. Так, яд может вообще не иметь летального эффекта (сколопендра), иметь очень низкую летальность (домашний паук и тарантул), среднюю летальность (степной паук) и очень высокую летальность (черный скорпион). При этом каждая градация летальности отличается на порядок, что свидетельствует о чувствительности теста и, по-видимому, отражает общее свойство яда. Нами определены физиологические (рабочие) концентрации для каждого яда, при которых нейротоксический эффект после инъекций наблюдался без летального исхода в течение 10 дней, что необходимо для проведения хронических экспериментов, требующих оценки состояния рыб и их МН в отдаленные сроки после воздействий. Рабочие концентрации также варьировали в зависимости от природы яда и были малыми (скорпион), средними (степной паук) и большими (домашний паук, тарантул и сколопендра), различаясь друг от друга на порядок. Следует отметить, что для всех исследуемых ядов, кроме яда сколопендры, наблюдали зависимость эффекта на функциональное состояние МН от используемой рабочей

Таблица. 1. Оценка некоторых свойств исследуемых ядов при их действии на золотых рыбок.

Источник яда и число рыб в опыте, включая контроли (п) Исследованная концентрация, мг/мл ЛДзо. мг/мл Рабочие концентрации мг/мл

Степной паук (75) 0.03; 0.3; 1; 3 3 (в/б); 1 (в/м) 0.3

Домашний паук (80)* 0.03; 0.3; 3; 10 10 (в/м) 3

Сколопендра кольчатая (62) 0.03; 0.3; 3; 10 Не установлена 3; 10

Тарантул южнорусский (70) 0.03; 0.3; 1;3; 10 10 (в/м) 3

Черный скорпион (113) 0.003; 0.012; 0.03;3 0.03 (в/м) 0.012

*- проходит через ГЭБ; в/м (в/б) - внутримозговая (внутрибрюшшшая) инъекция.

Таблица 2. Изменение размеров ЛЗ и ДПК в среднем на синапс после аппликаций на МН некоторых физиологически активных веществ, адаптации и ДЕС

Активные зоны Десмосомоподобные контакты

Воздействие Длина одного сечения нм Число сечений Длина одной структуры нм Число сечений

Без адаптации

1. Контроль 2. Фракция 9 238 ±6 (118) 260 ±6' (140) 1.73±0.09 (68) 1.78 ±0.11 (79) 194 ±8 (74) 203 ±9 (95) 1.08 ±0.03 (68) 1.22 ±0.06 (79)

3. Фракция 6 186 ±6° (101) 1.44 ±0.06' (70) 378 ±18' (91) 1.3±0.06б (70)

Адаптация

4. Без ДЕС 184 ±5' (119) 1.58± 0.09 (75) 376 ±15' (103) 1.37 ±0.07' (75)

5. ДЕС 6. Цитохалазин Б 283 ± 6* (99) 203 ±8 (140) 1.62 ±0.1 (81) 1.21 ±0.11 (38) 173 ±8 (82) 144 ± 8Г (61) 1.36 ±0.07" (81) 1.6 ± 0.1 (38)

7. Фракция 9 и ДЕС 286 ± 8* (98) 1.48 ±0.08' (66) 186 ±9 (74) 1.1 ±0.03 (66)

В скобках дано количество измеряемых объектов; достоверность различий определена по сравнению с контролем (а - р < 0.05, б -р < 0.01, в -р < 0.001) и адаптацией (г - р< 0.001).

Оптическая плотность, О

ТЭК 2000

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Время (мин)

Рисунок 1. Профиль элюцш! яда Среднеазиатского черного скорпиона.

^ .......

угль— __________

^Р ' н и

Рисунок 2. Примеры сканограмм типичных ДНК афферетпых сга[апсов МН в контроле (а); после действия фракции 6 (б) и сочетания адаптации, аппликации фракции 9 и ДЕС(в). ^ - локальное исчезновение элекгргашо-гсютного материала ДИК, деформация щели.

140 120 10080 60 40 20

на □ б

I I I г

% 100

г-. П Г5

»1

123 Ьл. Яз. Т.а. (Ъ.

Рисунок 3. Оценка функционального состояния МН (в %) под действием внутри-брюшинных □ и внутримозговых □ инъекций физраствора и некоторых ядов паукообразных (обозначения в тексте). 1 - ингактные; 2, 3 - с инъекцией физраствора.

1 2 3 1 2 3 1 2 3

Рисунок 4. Изменение функциональной активности МН (в %) после аппликации яда среднеазиатского черного скорпиона и ДЕС. А - через 2 ч после инъекций; Б - сразу после ДЕС; В- через сутки после ДЕС; 1 - ингактные; 2 - контрольные; 3 -подопытные рыбки.

1111

гп

концентрации (рис. 3). У яда сколопендры обнаружена обратная зависимость эффекта от концентрации: меньшая оказывалась эффективнее, в то время как при ее увеличении в три раза действие яда пропадало. При аппликациях на МН ядов в рабочих концентрациях, как правило, функция МН была угнетена. Исключением оказалось идентичное физраствору возбуждающее действие яда тарантула. Сравнение эффектов внутрибрюшинных и внутримозговых инъекций на поведение рыбок позволило установить, что для яда домашнего паука они были одинаковыми, что, по-видимому, свидетельствует о прохождении яда или его эффективного компонента через ГЭБ. Другие яды такого свойства не проявили. Существенным на наш взгляд является то, что значения ЛД50 ядов для рыбок, выявленные в наших экспериментах, в своих абсолютных значениях сопоставимы с данными, полученными на мышах [Dehesa-Davila М., Ramirez A.N. et al., 1996]. Поэтому можно считать правомерным экстраполирование результатов, полученных на рыбах, на более высокоорганизованных животных.

Рассмотрение полученных данных в совокупности позволяет сделать вывод, что яды проявили специфическую нейротоксичность разной степени, пропорционально которой видится перспективность их дальнейшего изучения с целью поиска в их составе индивидуальных нейротоксинов.

Таким образом, настоящим сравнительным исследованием показано, что золотые рыбки и их МН можно признать адекватными объектами для проведения скрининга ядов неизвестного происхождения и неустановленного действия. Используя эти объекты, можно дифференцировано определять нейротропную активность, степень нейротоксичности и, вероятно, цитотоксичность ядов, что является необходимым шагом на пути дальнейшего анализа их активных компонентов после соответствующего фракционирования.

2). Изучение влияния аппликации цельного яда скорпиона в сочетании с утомительной стимуляцией на функциональное состояние и ультраструктуру МН золотой рыбки

Результаты косвенной оценки функции МН после аппликации цельного яда скорпиона представлены на рис. 4. Видно, что функциональная активность нейронов снижалась почти на 70 % по сравнению с интактным и контрольным уровнями активности. После длительной вестибулярной стимуляции функция МН интактной, контрольной и подопытной групп рыбок почти полностью подавлялась. Через сутки после стимуляции угнетенное функциональное состояние МН интактных рыбок практически сохранялось, а контрольных рыбок -восстанавливалось только на 18 % . В то же время исходная функциональная активность МН рыбок, которых подвергали воздействию яда и вестибулярной стимуляции, полностью восстанавливалась. Таким образом, обнаружилось, что яд при аппликации определенно защищает функцию МН от утомления,

вызываемого длительной естественной стимуляцией, несмотря на сильный токсический эффект яда самого по себе на функцию МН.

Ультраструктурный анализ МН рыб из интактных, контрольных и подопытных групп в близкие и отдаленные сроки после стимуляции показал результаты, согласующиеся с представлениями о защитном свойстве яда скорпиона. Стимуляция интактных и контрольных рыбок приводила к сильным изменениям синаптических окончаний и цитоплазмы МН, опорожнению большого числа терминалей, разрастанию агранулярной эвдоплазматической сети и появлению крупных миелиноподобных образований, в целом значительно повреждала ультраструктуру МН. В противоположность этому стимуляция МН рыбок, подвергнутых действию яда, таких структурных повреждений синапсов и цитоплазмы не вызывала. Хотя отмечались специфические структурные изменения, вызванные именно аппликацией яда, а не физраствора. Главным из признаков можно считать появление под внешней клеточной мембраной МН многочисленных протяженных субповерхностных цистерн (СПЦ). Через сутки после стимуляции у МН интактных и контрольных рыбок повреждения синапгического аппарата сохранялись. В то же время, ультраструктура синапгического аппарата МН, на которые апплицнровали яд и затем подвергали длительной стимуляции, через сутки почти нормализовалась. У части синапсов наблюдали усиление электронной плотности синаптических мембран и, что представляется важным, в синаптических контактах отмечали возрастание числа десмосомоподобных структур, которые к тому же выглядели более осмиофильными и лучше идентифицировались, чем в других препаратах.

Таким образом, анализ электронно-микроскопических данных вместе с результатами физиологических экспериментов выявил определенную корреляцию структуры и функции МН в разных группах рыбок после соответствующих воздействий. Очевидно, что аппликация яда, не затрагивая функциональных и структурных основ работы синапгического аппарата МН (таких признаков не обнаружено), существенно предохраняет его структуру и функцию от чрезмерного повреждения и позволяет быстрее восстанавливать их после утомления. Результаты этого исследования позволили предположить, что мишенью действия цельного яда скорпиона является нейрональный актин, так как было известно, что повышение резистентности МН коррелирует с увеличением в клетке содержания Р-акгина [Павлик и др., 1997], признаки чего проявлялись в лучшей визуализации структур, содержащих актин, (ДПК) в синаптических контактах после обработки ядом.

3). Исследование влияния аппликации некоторых индивидуальных фракций, выделенных из яда скорпиона, на функциональное состояние МН золотой рыбки.

Анализ токсикологических данных показал, что исследуемые фракции воспроизвели отдельные свойства цельного яда. Так, фракция 5 проявила очень сильную общую токсичность, ее ЛД50была 2.4 мкг/мл, что на порядок превышало токсичность цельного яда (30 мкг/мл). Фракция 6 оказалась почти в три раза менее токсична, чем цельный яд: ее ЛД50 была 12 мкг/мл. Фракции 8 и 9 токсичностью не обладали. Определение функциональной активности МН по поведению рыбок (рис.5) показало, что в результате длительной естественной стимуляции (ДЕС) ингактных МН она угнеталась более чем в 5 раз (рис. 5а) и не восстанавливалась до своего первоначального уровня даже через сутки (на рис. не представлено). Аппликации фракций 5 и 8 (рис. 56 и 5г соответственно) не оказывали влияния на функцию МН ни раздельно, ни в сочетании со стимуляцией. В то же время фракция б делала МН практически нечувствительными к стимуляции (рис. 5в). Это свидетельствует о ее протекторном действии, сравнимым с адаптирующим влишшем повторяющихся стимуляций, индуцирующих в МН резистентность к ДЕС (рис. 5ж), а также с защитным эффектом фаллондина, установленным ранее (Мошков и др., 1984). С другой стороны, аппликация фракции 9 на МН еще до ДЕС значительно угнетала функцию МН, которая становилась в 7 раз ниже исходного уровня (рис. 5д). Действие этой фракции уже само по себе напоминало эффект ДЕС, которая в данном случае снижала активность МН до очень низкого уровня (ниже исходного состояния в 15 раз). Такое действие фракции напоминало эффект цигохалазнна О, угнетающего активность МН до и после ДЕС и, следовательно, не защищающего их от утомления (рис. 5е) (Мошков и др., 1998). Похожим оказалось действие фракции 9 и цнтохалазина О на адаптированные МН, резистентные к ДЕС (рис. 5ж). Фракция 9 и цигохалазин Б снижали функциональную активность адаптированных МН до интактного уровня в %-ном отношении (рис. 5з, 5и,к, светлые столбики), а также и в абсолютных значениях (не представлено), что позволяет говорить о разрушении ими адаптированного состояния, так как в случае действия и цнтохалазина Б, и фракции 9 МН становились чувствительными к последующей ДЕС (рис. 5з,5н,к, темные столбики). Хотя количественно в абсолютных значениях эффекты препаратов были несколько различными, последнее можно объяснить различной проницаемостью плазматической мембраны МН для пептидов фракции 9 и для цнтохалазина О и разным временем от начала инъекции до тестирования функциональной активности МН. Подтверждением этого предположения могут служить данные о влиянии цнтохалазина Б на шггактные и адаптированные МН золотых рыбок из разных серий опытов (рис. 5и, 5к), в которых измерение функциональной активности МН проводили с различной отсрочкой после инъекций.

Изучение экстраклеточной электрической активности неадаптированных МН показало, что до электрической ортодромной стимуляции они имели высокий уровень вызванного ответа (амплитуда

100

Без адаптации

Адаптированные

1мВ |_

1мс

Рисунок 5. Функциональное состояние МН, тестированное косвенно по поведению рыбки in vivo или прямо по амплитуде вызванного электрического ответа до D и после естественной ЕЗ и электрической Ш стимуляции на фоне воздействия: б - фракции 5; в - фракции 6; г - фракции 8; д - фракции 9; е -цитохалазина D; з - фракции 9; и, к - цигохалазина D (через 3 и 18 час соответственно), а - ингактный и ж - адаптированный нейроны. (Ц) - ответы через 60 мин после прекращения электростимуляции.---базовая линия.

около 5 мВ) (рис.5а,0 ). После стимуляции ответы исчезали (рис. 5а, Ш ) и не восстанавливались полностью в течение последующих 60 минут (рис. 5а, ® ). Ответы после длительной электростимуляции как адаптированных МН (рис.5ж,Ш), так и неадаптированных МН после аппликации фракщш 6 (рис.5вЕШ ) практически сохранялись на прежнем уровне. Активность неадаптированных нейронов после аппликации цитохалазина Б (рис. 5е,Е1 ) и короткой электрической стимуляции снижалась примерно на 40% и полностью не восстанавливалась через 60 минут (рис 5е, (¡¡) ). После длительной стимуляции функция МН угнеталась полностью и не восстанавливалась даже через 2 часа. Аналогичный эффект оказывало воздействие фракции 9 (не показано).

Таким образом, результаты свидетельствуют о том, что функция МН, каким бы способом ее ни оценивать, одинаково защищается как действием фракции 6, так и естественными стимуляциями, адаптирующими нейроны и делающими их резистентными против утомления благодаря полимеризации нейронального актина [Павлик и др., 1998]. С другой стороны, функция МН угнетается после аппликации как фракции 9, так и цитохалазина Б, влияние которого, безусловно, объясняется главным образом деполимеризацией нейронального актина [Павлик и др., 1999]. Такая аналогия позволяет более однозначно судить о предполагаемом механизме действия фракций ядов как на клеточном, так и на организменном (системном) уровнях. Основываясь на сходстве физиологических эффектов препаратов, неизвестных и известных по механизму своего действия, можно предположить, что фракция 6 содержит полипептидные компоненты, полимеризующие актин, подобно фаллоидину [Виланд, Фаулыптих, 1978], в то время как полипептиды фракции 9, по-видимому, обладают свойствами цитохалазина Б, деполимеризующего Р-актин.

4). Качественный ультраструктурный анализ действия фракций 6 и 9, выделенных из яда скорпиона, наМН.

Аппликация фракции 6 на неадаптированные МН приводила к изменениям ультраструктуры афферентных синапсов и цитоплазмы. Главной особенностью было то, что десмосомоподобные контакты (ДПК) синапсов становились интенсивно осмиофильными и более протяженными, чем в контрольных препаратах, что значительно облегчало их идентификацию (рис. 2 б). Другой особенностью ультраструктуры МН после воздействия этой фракции было появление в постсинаптических областях цитоплазмы обширных многослойных СПЦ. Третья отличительная особенность заключалась в перестройке под действием фракции 6 цигоскелета МН, о которой судили по появлению в цитоплазме протяженных специфически устроенных жгутов, состоящих из нескольких регулярных толстых или зигзагообразных нитей, напоминающих актиновые нити, обработанные миозином или его фрагментами [Павлик и др., 1998]. Такие жгуты встречались только в адаптированных МН [Мошков, Масюк, 1981], а также после обработки

их фаллоидином [МобЫсоу й а1., 1980], но отсутствовали в интактных и контрольных МН, а также при действии на них цитохалазина Э или фракции 9. В целом, ультраструктура МН после аппликации фракции 6 была близкой к той, которая наблюдалась у них при адаптации. Исключение составили СПЦ, которые в адаптированных МН были немногочисленными.

Аппликация фракции 9 на неадаптированные МН также вызывала изменения в аксосоматических терминалях и цитоплазме. Под действием этой фракции яда ДПК становились явно асимметричными с точки зреши размеров и осмиофильности электронно-плотного материала по обе стороны от щели. Еще одним отличием постагаапгической цитоплазмы МН под действием фракции 9 была гипертрофия субповерхностных цистерн.

В результате ДЕС адаптированных МН и МН после аппликации фракции 6 яда повреждений их структуры или заметных изменений строения аксосоматических термнналей, активных зон и ДПК не происходило. Все структуры сохраняли вид, типичный для интактных или контрольных препаратов.

Сочетание ДЕС и аппликации фракции 9 на адаптированный МН вызывало сильную деструкцию ДПК. На рис. 2в представлены варианты строения ДПК в синапсах таких препаратов МН. Наблюдали ослабление осмиофильности волокнистого материала в целом, гетерогенную его осмиофильность со стороны терминали и клетки, частичное или полное исчезновение волокнистого материала со стороны цитоплазмы МН с преобразованием ДПК в полу-ДПК. Расстояние между мембранами, образующими ДПК (ширина щели), становилось нерегулярным, а сами мембраны часто выглядели извитыми. Похожее действие на улътраструкгуру при аппликации на адаптированные и неадаптированные МН оказывал цигохалазин Б. Наблюдения показали, что такая деструкция ДПК сохранялась даже спустя 18 часов после аппликации препарата.

5) Количественный ультраструктурный анализ афферентных синапсов МН после действия фракций 6 и 9, выделенных из яда скорпиона.

Результаты морфометрического анализа состояния активных зон и ДПК синапсов МН рыбок в различных экспериментальных ситуациях представлены в таблице 2.

Под действием фракции 9 достоверно почти на 10 % увеличивалась величина индивидуальных сечений активных зон неадаптированных МН. В то же время аппликация фракции 6 приводила к уменьшению на 22% длины профилей индивидуальных активных зон и снижению почти на 17% числа этих контактов на синапс. Одновременно почти в два раза возрастала протяженность сечений индивидуальных ДПК, а их количество в синапсе в среднем увеличивалось на 20%.

Похожие, почти аналогичные изменения специализированных контактов наблюдали и при адаптации. Длина сечений активных зон в синапсах адаптированных МН уменьшалась на 23%, в то время как длина профилей ДНК возрастала вдвое. Увеличивалось также более чем на четверть количество ДНК. После ДЕС структура синагггических контактов адаптированных МН становится близкой к наблюдаемой под действием фракции 9 на неадаптированные МН. При сочетании воздействия ДЕС и фракции !) на адаптированные МН количество ДНК в синапсах значительно уменьшалось. Структура ДНК адаптированных МН существенным образом затрагивалась также аппликацией цитохалазина D. Протяженность ДНК снижалась почти в 1.5 раза. При этом несколько увеличивалась протяженность и число A3, приближаясь к величине, характерной для неадаптированных МН. По этому структурному признаку можно было сделать вывод о том, что цитохалазин D трансформирует структуру синаптического аппарата из адаптированного в неадаптированное состояние.

Таким образом, видно, что фракции 6 и 9 влияют на ДПК противоположным образом. Действие фракции 6 подобно влиянию адаптации. Действие фракции 9 аналогично влиянию ДЕС. Существенно то, что, затрагивая структуру ДНК, все воздействия сопровождаются специфическими реципрокными изменениями размеров активных зон, величина которых определяет эффективность химической передачи в синапсах [Kashapova et al., 1991; Cooper et al., 1995].

Подсчет числа промежуточных форм ДПК химических синапсов после комплексного воздействия фракции 9 на адаптированные МН показал, что 23% ДПК сохраняли нормальное строение, 23% ДПК имели ослабленную осмиофильность волокнистого материала со стороны цитоплазмы МН, у 20% ДПК с одной из сторон контакта наблюдалось локальное исчезновение волокнистого материала, в то время как с противоположной стороны он идентифицировался по всей длине ДПК, 4% ДПК имели чрезвычайно слабую осмиофильность волокнистого материала с обеих сторон контакта, наконец, 30% ДПК имели осмиофильный материал только с одной стороны контакта (как правило, в синаптическом бутоне), а с другой стороны он полностью отсутствовал. В последнем случае мы классифицировали эту разновидность контакта как полу-ДПК.

Дополнительную информацию о воздействии фракций яда на структуру ДПК дают измерения их рисунков с помощью компьютерного анализа сканограмм. Он позволил увидеть, что как под воздействием фракции 6, так и адаптации по сравнению с контролем увеличивается площадь электронно-плотного материала почти в 2 и 1.5 раза (8100± 180 нм2, 6400±300 нм2 и 4700± 180 нм2) соответственно. Измерение удельной ширины ДНК при действии фракции 6 яда показало существенное ее возрастание с 68±1 нм в контроле до 76± 1 нм, в то время как адаптация

сама по себе этого параметра не меняла Аппликация фракции 9 тоже увеличивала до 78± 3 нм удельную ширину ДПК, однако, сочетание ДЕС и фракции 9 на адаптированные МН приводило к снижению площади электронно-плотного материала (до 2700± 100 нм2) и одновременно к существенному уменьшению удельной ширины ДПК (до 52±1 нм). Одновремешю достоверно увеличивался фактор формы таких ДПК (0.7±0.01) по сравнению с контрольными (0.6б± 0.01) препаратами, а также подвергнутых воздействию фракции 6 (0.65±0.01) или адаптации (0.65± 0.01).

Количественный анализ синапсов после воздействий фракций, адаптации и ДЕС позволил установить закономерности изменений субповерхностных цистерн, выявленных уже на качественном уровне. Оказалось, что в синапсах неадаптированных МН реакция этих структур на аппликацию фракции 6 или 9 была одинакова: их периметр удваивался, а среднее количество под каждой терминалью увеличивалось почти в 1.5 раза. Адаптация не вызывала изменений структуры субповерхностных цистерн. Однако ДЕС адаптированных МН приводит к почти двойному возрастанию их периметра и к увеличению на треть их числа, а сочетание действия фракции 9 и ДЕС - утраивало периметр СПЦ ив 1.5 раза увеличивало их число. Анализ этих данных показывает, что обе фракции загрязнены какими-то блокаторами ионных каналов, так как подобный же эффект был отмечен при действии апамина, блокатора Са2+-зависимых К+ -каналов [Мошков и др., 1979].

б).Исследование взаимодействия фракций яда, обладающих потенциальными свойствами взаимодействовать с нейрональным актином, с хроматографически чистым мышечным актином в модельных экспериментах in vitro.

Применив этот подход, мы показали, что взаимодействие фракции 6 с G-актином приводило к его трансформации в F-актин, нити которого выявились при негативном контрастировании. Точно так же влияла обработка G-атина раствором КС1 (от 50 до 100 мМ) и фаллоидином. Фракция 9, напротив, действовала аналогично цитохалазину D. Это обнаруживалось по фрагментированию нитей F-актина, уменьшению плотности нитей в поле зрения и полному их исчезновению по мере удлинения инкубации.

Таким образом, мы показали, что фракции 6 и 9, которые на основании физиологических и ультраструктурных исследований МН были выбраны нами как компоненты цельного яда, предположительно проявляющие свойство взаимодействовать с нейрональным актином, действительно прямо способны менять агрегатное состояние этого белка. Это свидетельствует о правильности произведенных оценок комплексного скрининга ядов с использованием в качестве тест-объекта МН золотой рыбки.

Заключение.

Наша работа была посвящена изучению возможности использования Маутнеровских нейронов золотой рыбки в качестве объекта для скрининга ядов паукообразных с целью последующего поиска среди них таких нейротоксинов, которые могли бы служить инструментами для изучения цнтоскелета и его роли в пластических изменениях нейронов. Ранее такого рода исследований МН не предпринималось. Между тем именно этот объект для указанных целей должен был бы быть весьма приемлемым с нескольких точек зрения. Во-первых, весьма малые дозы веществ можно апплицировать прямо на МН in vivo [Тирас, Мошков, 1980]. Во-вторых, электрическую активность МН можно регистрировать на клеточном уровне в виде специфического Маутнеровского спайка [Furshpan, Furukawa, 1963]. В-третьих, активация МН вызывает специфическое движение рыбки - startle-reflex или быстрый отскок благодаря сильному унилатеральному удару хвоста [Canfleld et al., 1993], то есть, функция МН проявляется также и в поведешш. Поэтому структурные или химические изменения, вызванные воздействием апплицируемого вещества, можно увязывать с функциональными сдвигами, происходящими на клеточном и на организменном уровнях. Наконец, давно стало известно, что функция МН в существенной мере зависит от состояния цитоскелета [Мошков, 1985], причем определенные производные цитоскелета, содержащие F-актин, ответственные за пластические сдвиги, структурно обособлены в сииаптических контактах в виде ДПК [Nakajima, 1984]. Поэтому, наблюдая за их структурой, можно судить о состоянии щггоскелета в целом и увязывать структурные изменения с функциональными (и наоборот).

Мы впервые начали систематические исследования в этом направлении и показали, что, используя МН в качестве тест-объекта, можно дифференцировать среди ядов паукообразных и других ядовитых насекомых степень активности каждого из них и, по-видимому, пропорциональную ей перспективность тех или иных ядов для дальнейшего углубленного изучения. Затем мы для реализации этих целей изучили яд скорпиона, наиболее широко используемый для выделения многих специфических нейротоксинов в последние годы [Neurotoxins, 1996], и по нашим данным - наиболее активный среди изученных нами ядов, применив ряд экспериментальных подходов. Результаты комплексных исследований показали, что в яде скорпиона наряду со многими другими до конца не идентифицированными токсическими компонентами, изучать которые не входило в задачу настоящего исследования, присутствуют вещества, взаимодействующие с нейрональным цигоскелетом, предположительно с актиновым его компонентом. Их специфическое действие распознается уже на фоне сложного действия цельного яда. Фракционирование яда позволило установить, что таким же действием обладали две из девяти фракций. Комплексное сравнение эффекта одной из них, №6 на поведение и

ультраструктуру содержащих актин специализированных контактов позволило наблюдать определенную аналогию с фаллоидином, токсином выделенным из бледной поганки, полимеризующим актин [Виланд, Фаулыптих, 1978]. Но в отличие от него токсичность фракции была обратимой. По влиянию на структуру химических синапсов и по эффекту на синаптическую передачу действие фракции было аналогичным действию естественной повторяющейся стимуляции, приводящей к длительной адаптации [Мошков, Масюк, 1981], в основе которой, как известно, лежит полимеризация актина [Павлик и др., 1998], т. е. было вполне физиологичным. Прямое вовлечение фракции в полимеризацию продемонстрировано нами на хромато графически чистом актине in vitro. Мы показали, что взаимодействие фракции 6 с G-актином приводило к его трансформации в F-актин. Похоже, влияла обработка G-актина раствором КС1 (от 50 до 100 мМ) или фаллоидином. Кроме того, фракция 6 индуцировала образование пучков нитей актина. Подобные пучки выявлялись цигохимически и ультраструктурно в цитоплазме адаптированных МН, при действии на них фаллоидина, а также при аппликации фракции 6 яда. Такая аналогия убеждает нас, что впервые в яде скорпиона (и вообще в яде паукообразных) обнаружен компонент (одно или несколько веществ пептидной природы), который оказывает прямое действие на актин, полнмеризуя его. Что касается фракции 9, ее действие на функциональное состояние и ультраструктуру МН весьма напоминало эффект другого антицитоскелетного препарата цитохалазина D, деполимеризующего актин. Однако, комплексное испытание этой фракции и сравнение ее действия с цитохалазином D показало, что она, повреждая, актинсодержащне структуры МН, вместе с тем по ультраструктурным данным вместе с деполимеризующим актин эффектом также обнаруживала свойство повреждать и другие взаимодействующие с актином белки ДПК, по-видимому, адгезивные интегральные белки типа кадхеринов или катенинов, недавно обнаруженные в ДПК химических синапсов [Uchida et al., 1996].

До настоящего времени в ядах скорпионов не обнаруживали компонентов, специфически взаимодействующих с цигоскелетом. [Neurotoxins, 1996]. Между тем известно, что яд змеи Notechis scutatus включает вещества, влияющие на актин и другие цитоскелетные белки, дезагрегируя их [Faiz et al., 1995], а в яде моллюска Dolabella auricularia обнаружен пептид, действие которого на микротрубочки клеток напоминает эффект колхицина и винбластина [Bai et al., 1995]. Подобие структурно-функциональных преобразований МН под действием фракции 6, фаллоидина и адаптации с одной стороны, и фракции 9 и цитохалазина D с другой стороны предполагает, что и в яде паукообразных могут присутствовать вещества, влияющие на актин. Еще более убеждает в этом прямой эффект фракций яда на хромато графически чистый актин.

Выводы

1. Комплексными морфофункциональными исследованиями впервые показана возможность использования золотых рыбок и их Маутнеровских нейронов в качестве тест-объекта для скрининга ядов различных паукообразных и выделенных из них фракций с целью дифференцированной оценки общей и специфической нейротоксичности и первичного отбора ядов, перспективных для дальнейшего исследования.

2. Впервые обнаружено свойство цельного яда среднеазиатского черного скорпиона предохранять функцию МН от утомления, а его структуру от повреждений, вызываемых длительной естественной стимуляцией.

3. Среди индивидуальных фракций яда скорпиона у одной установлено протекторное свойство в чистом виде, а у другой - свойство угнетать функцию МН. Показано, что они оказывают свой эффект благодаря взаимодействию с содержащими актин контактными структурами афферентных синапсов химического типа.

4. Исследованиями взаимодействия указанных фракций яда с мышечным актином in vitro установлено, что они действительно прямо меняют агрегатное состояние этого белка.

5. Методика оценки фракций яда по действию их на актин in vitro может использоваться для быстрого скрининга физиологически активных соединений, выделяемых из этих фракций при дальнейшей их очистке для нужд фармакологии и для целей их более глубокой идентификации.

6. Сравнение результатов косвенного определения функциональной активности МН in vivo по поведению рыб в узком кольцевом канале и прямой регистрации электрической активности МН in vitro после некоторых одинаковых воздействий впервые показало, что косвенная оценка является адекватной при различных морфофункциональных исследованиях.

Список работ опубликованных по данной теме

1. Шодина И.Б., Тирас Н.Р. Маутнеровские нейроны золотой рыбки как объект для испытания ядов некоторых паукообразных. Тезисы. 1-ой научной конференции молодых ученых. Пущино, 1996, с. 102.

2. Мошков ДА., Мавлютов Т.А., Савельева Л.Н., Болотов Б.Д., Шодина И.Б., Мухтасимова Н.Ф., Хохлов А.А. Разработка метода и аппаратуры для комплексных морфофункциональных исследований идентифицированных нейронов. Сборник Трудов городской научной конференции молодых ученых. Пущино, ПНЦ 1996, с. 425-427.

3. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Шодина И.Б., Мошков Д.А Изменения актинового цитоскелета Маутнеровских нейронов золотой рыбки после длительной стимуляции. Цитология, 1997, т.39, №7, с.546-551.

4. Тирас Н.Р., Шодина И.Б., Мошков Д А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд среднеазиатского черного скорпиона Orthochirus scrobiculosus защищает Маутнеровские нейроны от повреждающего действия длительной

стимуляции. Тезисы. 3-ей .международной. конференции. по функциональной нейроморфологии. С-Петербург, 1997, с. 87.

5. Михеева И.Б., Тирас Н.Р., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Исследование действия некоторых фракций яда среднеазиатского черного скорпиона ОнИосМгия ьсгоЫсиЬшя на функцию Маутнеровских нейронов. Тезисы. Н-ой Научной конференции молодых ученых. Пущино, 1998, с. 122.

6. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд среднеазиатского черного скорпиона защищает Маутнеровсие нейроны от повреждающего действия длительной стимуляции. Морфология, 1998, т.113,№1, с. 100-104.

7. Михеева И.Б., Тирас Н.Р. Сравнение прямого и непрямого методов определения функционального состояния Маутнеровских нейронов золотых рыбок. Тезисы. IV научной конференции молодых ученых. Пущино, 1999, с. 29.

8. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков ДА., Пашков В.Н. и Гришин Е.В. Маутнеровские нейроны рыб как тест-объект для скрининга ядов членистоногих. Доклады Академии наук, 1999, т.364, №1, с.123-125.

9. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Пахотин П.И., Мошков ДА., Пашков В.Н. и Гришин Е.В. Яд скорпиона содержит фракции, взаимодействующие с нейрональным цитоскелетом. Доклады Академии наук, 1999, т.368, №3, с. 416-419.

10. Мошков ДА., Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Пашков В.Н., Павлик Л.Л., Удальцов С.Н., Гришин Е.В. Актин и ультраструктура десмосомоподобных контактов в химических и смешанных синапсах. Тезисы. И-ого съезда биофизиков. Москва, 1999, с. 342.

11. Михеева И.Б., Тирас Н.Р., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Десмосомоподобные контакты Маутнеровских нейронов как мишени действия яда скорпиона. Цитология, 1999 (Принята в печать).

Научное издание Автореферат И.Б.Михеевой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры.

Подписано в печать 29.11.99 г. Заказ 8494Р. Тираж 100 экз. Усл.псч.л. 1,25.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН.

142292, г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михеева, Ирина Борисовна

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Морфофункциональные исследования пластичности нейронов с использованием фармакологических воздействий. 1.1.1. Морфофункциональные исследования пластичности нейронов.

1.2. Использование идентифицированных нейронов Маутнера в изучении механизмов пластичности.

1.2.1. Маутнеровские нейроны, структура и функция.

1.2.2. Морфофукциональные исследования Маутнеровских нейронов рыб и амфибий.

1.3. Использование специфических нейротоксинов в качестве фармакологических инструментов в нейробиологических исследованиях.

1.4. Роль цитоскелета в пластических изменениях нейронов и синапсов.

2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Исследованные яды.

2.3. Фракционирование цельного яда среднеазиатского черного скорпиона.

2.4. Инъекции веществ.

2.5. Оценка функционального состояния Маутнеровских нейронов по поведению рыб в кольцевой камере.

2.6. Естественная стимуляция Маутнеровских нейронов.

2.7. Адаптация Маутнеровских нейронов к длительной естественной стимуляции.

2.8. Электрофизиологические методы исследования.

2.9. Электронномикроскопические методы.

2.10. Морфометрический анализ.

2.11. Метод негативного контрастирования. 3. Результаты.

3.1. Исследование влияния на функциональное состояние МН золотых рыбок аппликации цельных ядов некоторых паукообразных.

3.1.1. Характеристика общей токсичности исследованных ядов.

3.1.2. Оценка проницаемости для гематоэнцефалического барьера.

3.1.3. Оценка специфической нейротоксичности исследованных ядов.

3.2. Изучение влияния аппликации цельного яда скорпиона в сочетании с утомительной стимуляцией на функциональное состояние и ультраструктуру МН золотой рыбки.

3.2.1. Результаты косвенной оценки функционального состояния МН золотых рыбок.

3.2.2. Результаты ультраструктурных исследований.

3.3. Исследование влияния аппликации некоторых индивидуальных фракций, выделенных из яда скорпиона на функциональное состояние МН золотых рыбок.

3.3.1. Характеристика общей токсичности некоторых фракций, выделенных из яда скорпиона.

3.3.2. Косвенная оценка функционального состояния МН.

3.3.3. Исследование экстраклеточной электрической активности МН.

3.4. Ультраструктурный анализ действия на МН фракций 6 и 9, выделенных из яда скорпиона.

3.4.1. Качественный ультраструктурный анализ.

3.4.2. Количественный анализ афферентных синапсов МН после действия фракций 6 и 9, выделенных из яда скорпиона.

3.5. Исследование взаимодействия фракций яда, обладающих потенциальными свойствами взаимодействовать с нейрональным актином, с хроматографически чистым мышечным актином в модельных экспериментах in vitro.

4. Обсуждение.

5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином"

Участие нейроналыюго актина в синаптической пластичности привлекает в последнее время пристальное внимание (Fifkova, 1995; Niethammer and Sheng, 1998). Локализуясь в пре- и постсинаптических областях, этот белок обеспечивает транспортировку везикул к активным зонам и секрецию медиаторов (Chilcote et al., 1994), выполняет адгезионную роль, удерживая синапсы в топографически определенном месте и создавая, таким образом, строго специфические межнейронные связи (Liberman, Spacek, 1997), регулирует функцию постсинаптических рецепторов (Rosenmund, Westbrook, 1993). Модификация актина в любом из этих звеньев неизбежно приводит к модуляции синаптической функции. Установлено вовлечение актина в долговременную потенциацию синаптической передачи как химического (Pavlik, Moshkov, 1992), так и электротонического (Moshkov et al., 1998) сигналов, в создании и поддержании резистентности к утомительным стимуляциям (Павлик и др., 1997; Tiras et al., 1999). При изучении механизмов синаптической пластичности для выяснения роли в них нейронального актина широко применяют физиологически активные вещества, специфически взаимодействующие с актином, изменяя его агрегатное состояние и другие свойства (Павлик и др., 1997; Павлик и др., 1998). Пользуясь ими как тонкими фармакологическими инструментами, оказывается возможным не только определить функциональный вклад актина в поведение нейрона, но также выяснить локализацию актина, и, следовательно, увидеть то звено в структуре синаптического аппарата, в функционировании которого он, возможно, принимает участие. До сих 5 пор обнаружение таких специфических соединений, выделяемых из животных и растительных объектов, можно рассматривать как явление случайное (Faiz et al., 1995; Bai et al., 1995; Shin-ya Saito et al., 1997). Набор таких веществ ограничен. Кроме того, некоторые из них токсичны, другие плохо или совсем не проникают в клетку. Поэтому расширение списка препаратов, которые способны специфически взаимодействовать с цитоскелетным актином, является в настоящее время актуальной задачей. Перспективным источником токсинов, обладающих различными свойствами, являются яды паукообразных и других ядовитых членистоногих (Neurotoxins, 1996). Однако, существование в них физиологически активных соединений прямого цитоскелетного действия до сих пор не установлено. Негативным фактором, по-видимому, служит неадекватность объектов, которые используются для скрининга этих ядов. Такими объектами в силу ряда причин могли бы стать Маутнеровские нейроны (МН) костистых рыб. Предыдущими исследованиями установлено, что их функция в существенной мере зависит от актина. Это уникальное свойство воспроизводимо идентифицируется в морфофункциональных экспериментах (Мошков, 1985; Tiras et al, 1992; Moshkov et al., 1998). Актина в них много, и часть его локализована в компактных образованиях синаптических контактов, так называемых десмосомоподобных контактах (ДНК) (Янюшина и др., 1990; Павлик и др., 1997), от состояния которых зависит функциональное состояние нейронов и структуру которых легко контролировать электронно-микроскопически (Moshkov et al, 1980). Крупные размеры этих уникальных нейронов, их строгая топография в мозгу облегчает 6 аппликацию различных физиологически активных веществ, в том числе ядов насекомых (Тирас ,Мошков, 1978; Мошков и др., 1981). Однако, требуются комплексные морфофункциональные исследования, чтобы показать пригодность МН для испытания ядов паукообразных с целью поиска нейротоксинов, взаимодействующих с цитоскелетом.

Целью данной работы была разработка нового подхода для скрининга цельных ядов и фракций ядов паукообразных с целью идентификации среди них таких физиологически активных соединений, которые активно взаимодействуют с цитоскелетом и его актиновым компонентом, используя для этого в качестве тест-объекта Маутнеровские нейроны (МН) золотой рыбки. Были поставлены следующие задачи.

1) Исследовать возможность использования Маутнеровских нейронов золотой рыбки в качестве тест-объекта для дифференцированной оценки нейротоксичности цельных ядов некоторых видов паукообразных и губоногих.

2) Изучить функциональное состояние и ультраструктуру МН в близкие и отдаленные сроки после аппликации цельного яда среднеазиатского черного скорпиона и длительной естественной стимуляции.

3) Разделить цельный яд скорпиона на фракции, проанализировать их влияние на функцию МН и сравнить эффект некоторых из них с воздействиями, которые специфически изменяют состояние нейронального актина.

4) Разработать методику прямой диагностики in vitro функционального состояния МН в условиях нормы, утомления и резистентности к 7 утомлению, индуцированной in situ естественными тренировками или аппликацией фракции яда.

5) Провести сравнительный качественный и количественный - ультратруктурный анализ контактов афферентных химических синапсов МН после различных экспериментальных воздействий, известно изменяющих состояние нейронального актина, и аппликаций фракций яда скорпиона неизвестного механизма действия, а также исследовать взаимодействие этих фракций с хроматографически чистым актином.

Научная новизна. Впервые было показано, что рыбы и их МН являются адекватными объектами для проведения скрининга ядов неизвестного происхождения и неустановленного действия с целью поиска новых нейротоксинов и физиологически активных соединений. Установлено, что использование этих объектов имеет ряд преимуществ, главным из которых является возможность одновременного проведения комплекса токсикологических исследований разного уровня организменного, тканевого, клеточного и субклеточного, затрачивая при этом весьма малую дозу исследуемого препарата. Впервые показано, что апплицируя цельные яды на МН, можно дифференцировано определять нейротропную активность, степень нейротоксичности, а при необходимости и цитотоксичность яда, что является необходимым шагом на пути дальнейшего анализа активных компонентов ядов после соответствующего их фракционирования. Впервые было проведено испытание цельного яда среднеазиатского черного скорпиона, ранее в токсикологических экспериментах на этом объекте не изучавшегося. Обнаружено, что при аппликациях яда скорпиона на МН рыб раздельно и в сочетании с длительной естественной стимуляцией (ДЕС) яд, обладая 8 сильной токсичностью, проявил неизвестный ранее защитный эффект от угнетающего действия ДЕС, который выразился в быстром восстановлении исходной функции и ультраструктуры МН. Определено, что некоторые фракции, выделенные из цельного яда скорпиона, хорошо воспроизводят отдельные свойства, отмеченные у цельного яда. Одна среди них обладала сильно выраженным протекторным свойством, а другая, наоборот, как и ДЕС угнетала функцию МН. Выявлена аналогия между морфофункциональным эффектом фракций яда скорпиона и испытанными в тех же условиях специфическими воздействиями на МН, изменяющими состояние нейронального актина известным образом. Установлено, что мишенью действия фракций являются актин-содержащие специализированные структуры синаптических контактов. Впервые показан прямой эффект указанных фракций яда скорпиона на хроматографически чистый актин. Фракция, повышающая резистентность МН к утомлению, трансформировала G-актин в F-актин и индуцировала формирование пучков. Фракция, угнетающая функцию МН, разрушала F-актин. Таким образом, получены абсолютно новые данные о существовании в яде скорпиона фракций, взаимодействующих с нейрональным актином, которые впоследствии могут послужить объектом для дальнейшей очистки и молекулярно-биологической идентификации. Уже на достигнутом уровне очистки эти фракции могут оказаться полезными нейрофармакологическими инструментами, пригодными для исследования актина in vitro и для тонких вмешательств in vivo в структурную организацию и функцию цитоскелета живых клеток, для выяснения механизмов пластичности, адаптации и памяти на клеточном и мембранном уровнях. Впервые разработана методика 9 электрофизиологической диагностики функционального состояния МН in vitro после косвенной оценки его по поведению, измененному аппликацией физиологически активных веществ или естественной стимуляцией. Установлена четкая корреляция между прямым и косвенным методами оценки функции МН.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. МОРФОФУИКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙРОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ

ВОЗДЕЙСТВИЙ.

1.1.1. МОРФОФУИКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПЛАСТИЧНОСТИ НЕЙРОНОВ.

Из широкого круга проблем, связанных с организацией и физиологией головного мозга, большой интерес представляет функциональная морфология нервной системы. Постановка этих вопросов своей историей обязана применением в биологии методов электронной микроскопии и микроэлектродной техники (Питере и др, 1972; Артюхина, 1979). На сегодняшний день электронная микроскопия дает наиболее полное представление о строении основных структур клеток и межклеточных образований (Саркисов, Боголепов, 1967; Бабминдра, Брагина, 1982; Бабминдра и др, 1988). Благодаря ей было обнаружено разнообразие элементов синапсов головного мозга, что послужило основой для предположения об изменчивости синаптической организации и причастности внутрисинаптических процессов к мозговым функциям (Бабминдра, 1972; Манина, 1976; Косицын, 1976).

Сочетание ультраструктурного подхода в изучении идентифицированных нейронов с воздействиями на них, индуцирующими изменение функции этих нервных клеток, дает новую информацию о процессах, которые лежат в основе приспособления клеток и синапсов в ответ на изменение макро- или микроокружения. Такой подход приближает к решению одной из ключевых задач современной морфофизиологии - ультраструктурной диагностике

11 определенного функционального состояния нейронов по структурным признакам нейронов и синапсов.

Изучение механизмов пластичности единичной нервной клетки сводится к выявлению меры пластичности отдельных звеньев: афферентных синапсов, синаптических мембран, внутриклеточных компонентов постсинаптических и других областей цитоплазмы. Подразумевается, что совокупность определенных структурных особенностей всех перечисленных звеньев определяет то или иное функциональное состояние нейронов (Пушкин, 1972; Бабминдра, 1972; Ярыгин, 1973; Попова, 1976). Чтобы иметь возможность оценить вклад каждого звена в функцию отдельного нейрона, нужны надежно воспроизводимые экспериментальные высокоспецифичные и тонкие вмешательства и адекватные объекты, позволяющие от опыта к опыту исследовать одни и те же клетки или даже отдельные участки клетки. Этим требованиям отвечают идентифицированные нейроны. Среди позвоночных животных классическим объектом такого рода может служить Маутнеровский нейрон рыб и амфибий. А в качестве инструментов для тонких вмешательств в нейробиологических исследованиях давно зарекомендовали себя специфические нейротоксины.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Михеева, Ирина Борисовна

5. ВЫВОДЫ.

137

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михеева, Ирина Борисовна, Пущино

1. Александров О.И., Чубаков А.Р., Мошков Д.А. Влияние этанола на формирование цитоскелета дендритов в культуре ткани гиппокампа. В кн.: Ультраструктура и пластичность нейрона. Пущино, 1990, с. 37-44.

2. Анисимова В.А., Копылов П.Х., Шемякин И.Г. Белки направленного действия как потенциальные лекарственные препараты. Вестн. Рос. АМН, 1997, №6, с. 52-59.

3. Артюхина H.H. Структурно функциональная организация нейронов и межнейронных связей. М., Наука, 1979.

4. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в синаптической передаче. Итоги науки и техники. Сер. Физиология человека и животных. М.: ВИНИТИ, 1988, в. 34, с. 128-176.

5. Бабминдра В.П. Структурная пластичность межнейрональных синапсов. JI: Изд-во ЛГУ, 1972.

6. Бабминдра В.П. Стабильность и изменчивость конструкции межнейронных связей. В кн.: Синаптическая организация мозга. JL: Изд-во ЯГУ, 1980.

7. Бабминдра В.П., Брагина Т.А. Структурные основы межнейронной интеграции. Л.: Наука, 1982.

8. Бабминдра В.П., Брагина Т.А., Ионов И.П., Нуртдинов Структура и модели нейронных комплексов головного мозга. Л.: Наука, 1988, 96 с.

9. Байдан Л.В., Жолос A.B. Апамин высокоспецифический и эффективный блокатор некоторых кальцийзависимых калиевых проводимостей. Нейрофизиология, 1988, т. 20, № 6, с. 833-846.

10. Белоус A.M., Землянских Н.Г. Молекулярная динамика белков цитоскелета в норме и при воздействии температурно-осмотических факторов. Проблемы криобиологии, 1994, № 1, с. 14-23.

11. И. Боголепов H.H. Ультраструктура синапсов в норме и патологии. М. Медицина, 1975.

12. Боголепов H.H. Ультраструктура мозга при гипоксии. М.: Медицина, 1979.

13. Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л.: Наука, 1987, 231 с.

14. Ведерникова Е.А., Максимов A.B., Негуляев Ю.А. Функциональные свойства и цитоскелетзависимая регуляция натриевых каналов в138плазматической мембране лейкозных клеток. Цитология, 1997, т. 39, № 12, с. 1142-1151.

15. Виланд Т., Фаулынтих X. Фаллоидин. В кн.: Итоги и перспективы развития биоорганической химии и молекулярной биологии. М., Наука, 1978, с. 96-110.

16. Волкова Т.М., Дулубова И.Е., Тележинская Н.И. и Гришин Е.В. Токсические компоненты яда среднеазиатского скорпиона Orthochirus scrobiculosus. Биоорганическая химия, 1984, т. 10, № 8, с. 1100-1108.

17. Гречко А.Т. Физиологические механизмы адаптации и ее фармакологическая коррекция "быстродействующими адаптогенами". Int. Med. Revws., 1994, у. 2, № 5, р. 330-333.

18. Двигательные белки. Сер.: Белки и пептиды. М.: Наука, 1995, т. 1, гл. 2, с. 249-317.

19. Жердев Г.В., Мошков Д.А., Белозерцев Ю.А., Тирас Н.Р. Влияние изонитрозина и вестибулярной стимуляции на сому и дендриты Маутнеровских нейронов . Цитология, 1991, т. 33, № 8, с. 20-32.

20. Коваленко В.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Биоорганическая химия, 1981, т.7, с. 1828-1837.

21. Косицын Н.С. Микроструктура дендритов и аксодендритических связей в центральной нервной системе. М.: Наука, 1976.

22. Крыжановский Г.Н., Поздняков О.М., Полгар A.A. Патология синаптического аппарата мышцы. М.: Медицина, 1974.

23. Кузнецов В.И., Тонких А.К., Ким О.Н., Полгар A.A. Связывание ГАМК с рецептором синаптических мембран мозга крыс и солюбилизация связывающих участков. Укр. биохим. ж. , 1982, т. 54, № 4, с. 482-430.

24. Манина A.A. Ультраструктурные основы деятельности мозга. JI.: Медицина, 1976.

25. Мошков Д.А., Гордон Р.Я., Перевощиков В.В. Ультраструктура механорецепторного нейрона при ускорении его адаптации к адекватному раздражителю. Цитология, 1978, т. 20, № 3, с. 280-285.

26. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Мирошников А.И. Изучение ультраструктуры Маутнеровских нейронов рыб после воздействия апамина. Докл. АН СССР, 1979, т. 545, № 4, с. 1014-1016.

27. Мошков Д.А., Музафарова JI.H., Кашапова Л.А., Левадный В.Д. Изучение в онтогенезе структуры Маутнеровских нейронов золотой рыбки. Онтогенез, 1980, т. 11, № 5, с. 518-523.139

28. Мошков Д.А., Масюк J1.H. Аккомодационные изменения синаптических контактов при длительной адаптации нейрона к экстремальной стимуляции Цитология, 1981, т. 23, № 4, с. 360-367.

29. Мошков Д.А., Подольский И.Я., Кашапова J1.A. и др. Количественная характеристика двигательной активности золотых рыбок Carassius auratus как возможный индикатор состояния Маутнеровских нейронов. Журн. Эволюц. Биохим., 1982, т. 18, № 2, с. 155-160.

30. Мошков Д.А., Тирас Н.Р., Потемкин В.В. Влияние фаллоидина и длительной сенсорной стимуляции на ультраструктуру Маутнеровских нейронов золотых рыбок. Цитология, 1984, т. 26, № 12, с. 1351-1356.

31. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука, 1985, 200 с.

32. Мошков Д.А., Тирас Н.Р. Различия цитоскелета в тормозных и возбуждающих синапсах. Цитология, 1987, т. 29, № 2, с. 156-160.

33. Никольская В.П., Мажуль В.М., Конев C.B. Влияние модификации цитоскелета на процесс трипсин индуцированной агрегации клеток. Цитология, 1996, т. 38, № 4/5, с 494-499.

34. Ниукканен H.JL, Мошков Д.А. Маутнеровский нейрон как модель для изучения пластических изменений на клеточном уровне. В кн.: Физиологические и биохимические исследования памяти. Пущино, 1977, с. 155-171.

35. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Актин в Маутнеровских нейронах золотых рыбок после действия фаллоидина и адаптации к длительной стимуляции. Цитология, 1997а, т. 39, № 12, с. 1109-1115.

36. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Экспериментально вызванная деполимеризация актина разрушает адаптивное состояние нейрона. Морфология, 1998, т. 114, № 4, с. 24-27.140

37. Павлик JI.JI., Тирас Н.Р., Пахотина И.Д., Мошков Д.А. Действие цитохалазина D на структуру смешанных синапсов и их электрическую проводимость. Цитология, 1999, т. 41, № 7, с. 590597.

38. Питере А., Палей е., Уэбстер Г. Ультраструктура нервной системы. М.: Мир, 1972.

39. Попова Э.Н., Лапин С.К., Кривицкая Т.Н., Морфология приспособительных изменений нервных структур. М.: Медицина, 1976, 263с.

40. Потапенко H.A., Волкова Т.М. Полная аминокислотная последовательность нейротоксина Os 1 из яда среднеазиатского черного скорпиона Orthochirus scrobiculosus. Биоорганическая химия, 1986, т. 12, №5, с. 581-590.

41. Потемкин В.В., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Исследование возможности оценки функционального состояния Маутнеровских нейронов по двигательной активности золотой рыбки. В кн.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия. Пущино, 1981.

42. Пушкин A.C., Яковлева Н.И. Изменения ультраструктуры клеток при длительной стимуляции и депривации. В кн.: Функционально-структурные основы системной деятельности и механизмы пластичности мозга. М., 1972, с. 98-99.

43. Санталова И.М., Мошков Д.А., Зиганшин Р.И. и др. Влияние кеоторфина на ультраструктуру и функцию Маутнеровских нейронов золотой рыбки. В сб.: Колосовские чтения. С.-Петербург, 1994, с. 64.

44. Саркисов С.А., Боголепов H.H. Электронная микроскопия мозга. М.: Медицина, 1967.

45. Саркисов Д.С., Втюрин Б.В. Электронная микроскопия деструктивных и регенераторных внутриклеточных процессов. М.: Медицина, 1967.

46. Сахаров Д.А. Гигантские аксоны Маутнера. Успехи современной биологии, 1961, т. 62, вып. 1, № 4, с. 112-124.

47. Сейфулла Р.Д. Фармакологическая коррекция факторов лимитирующих работоспособность человека. Экспериментальная и клиническая фармакология, 1998, т. 61, № 1, с. 3-12.

48. Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на Маутнеровские нейроны золотой рыбки. Ж. Эволюц. биохимии и физиологии, 1978, т. 39, № 5, с. 486-490.141

49. Тирас Н.Р., Потемкин В.В., Мошков Д.А. Действие каиновой кислоты на Маутнеровские нейроны адаптированных и неадаптировааных рыб. Цитология, 1990, т. 32, № 8, с. 795-800.

50. Тирас Н.Р. Жердев Г.В., Мошков Д.А. Ультрастурктура Маутнеровских нейронов рыб, адаптируемых к длительной стимуляции при воздействии этанола. Цитология, 1995, т. 37, № 5-6, с. 430-439.

51. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд среднеазиатского черного скорпиона защищают маутнеровские нейроны от повреждающего действия длительной стимуляции. Морфология, 1998, т. 113,№ 1, с. 100-104.

52. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Пахотин П.И., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Яд скорпиона содержит фракции, взаимодействующие с нейрональным цитоскелетом. ДАН, 1999, т. 368, № 3, с. 416-419.

53. Трикаш И.О., Терлецкая Я.Т., Колчинская Л.И., Малышева М.К., Сердюк Е.С. Способность латротоксиноподобного белка головного мозга вызывать слияние отрицательно заряженных липосом. Нейрофизиология, 1993, т. 1, № 5, с. 329-334.

54. Трикаш И.О., Терлецкая Я.Т., Колчинская Л.И., Малышева М.К. Мембранотропные свойства латротоксиноподобного белка: исследование на липосомах. Нейрофизиология, 1998, т. 30, № 2, с. 94-97.

55. Ярыгин Н.Е., Ярыгин В.Н. Патологические и приспособительные изменения нейронов. М.: Медицина, 1973, с. 190.

56. Adams М.Е., Olivera В.М. Neurotoxins: overview of an emerging research technology. Trends Neurosci., 1994, v. 17, № 4, p. 151-155.

57. Bai R., Taylor G. F., Schmidt J.M. et. al. Interaction of dolastatin 10 with tubulin: induction of aggregation and binding and dissociation reactions. Mol. Pharmacol., 1995, vol. 47,1 5, p. 965-976

58. Bartelmez G.W. Mauthner's cell and the nucleus motorius tegmenti. J. Сотр. Neurol., 1915, v. 25, p. 87-128.

59. Bodian P. The structure of the vertebrate synaps. A study of the axon endings on Mauthner's cell and neighboring centers in the goldfish. J. Сотр. Neurol., 1937, v. 68, p. 117-159.142

60. Bretscher A., Drees B., Haray E. et al. What are the basic functions of microfilaments? J. Cell Biol., 1994, v. 126, № 4, p. 821-825.

61. Canfield Y. G., Rose G. Y. Activation of Mauthner neurons during prey captre.- J. Compar. Physiology A, 1993, vol. 172, Iss 5, p. 611-618.

62. Cantiello H.F., Stow J.L., Prat S.G., Ansiello D.A. Actin filaments regulate epithelial Na+ channel activity. Amer. J. Physiol., 1991, v. 261, p. C882-C886.

63. Capogna M., Gahwiler B.N., Thompson S.M. Calcium-independent actions of a-latrotoxin on spontaneous and evoked synaptic transmission in the hippocampus. J. Neurophysiol., 1996, v. 76, № 5, p. 3149-3158.

64. Carlier M.-F. And Pantaloni D. Control of actin dynamics in cell motility. J. Mol. Biol., 1997, v. 269, № 4, p. 459-467.

65. Cestele S., Borchani L., El Ayeb M., Rochat H. Bot IT2: a new scorpion toxin to study receptor site on insect sodium channels. FEBS Letters, 1997, v. 405, p. 77-80.

66. Cestele S., Gordon D. Depolarization differentially affects allosteric modulation by neurotoxins of scorpion a-toxin binding on voltage-gated sodium channels. J. Neurochem., 1998, v. 70, № 3, p. 1217-1226.

67. Chilcote T.J., Siow Y.L. et al. Synapsin lia bundles actin filaments. J. Neurochem., Raven Press, New York, 1994, v. 63, № 4, p. 1568-1571.

68. Cochran S., Hackett J., Brown D. The anuran Mauthner cell and its synaptic bed. Neuroscience, 1980, v. 5, p. 1629-1646.

69. Colonnier M. Synaptic patterns on different cell types in the different laminae of the cat visual cortex: an electron microscope study. Brain Res., 1968, v. 2, p.268-287.

70. Cooper J.A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. J. Cell Biol., 1987, v. 105, p. 1473-1478.

71. Cox K.J.A., Fetcho J.R. Labeling blastomeres with a calcium indicator: A non-invasive method of visualizing neuronal activity in zebrafish. J. Neurosci. Methods, 1996, v. 68, p. 185-191.

72. Davey D.F., Bennett M.R. Variation in the size of synaptic contacts along developing and mature motor terminal branches. Develop. Brain. Res., 182, v. 5, p. 11-22.

73. De Bin, Strechertz, Toxicon, 1991, v. 29, p. 1403-1406.

74. Delepierre M., Prochnica-Chalufour A., Possani L.D. A novel potassium channel blocking toxin from the scorpion Pandinus imperator: c^H NMR analysis using a nano-NMR probe. Biochemistry, 1997, v. 36, № 9, p. 2649-2658.

75. Demerens C., Stankoff B. et al. Induction of mielinization in the central nervous system by electrical activity. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, № 18, p. 9887-9892.

76. Diamond J. and Huxley A.F. The activation and distribution of GABA and L-glutamate receptors on goldfish Mauthner neurons: an analysis of dendritic remote inhibition. J. Physiol., 1968, v. 194, p. 669-723.

77. Diamond J. The Mauthner cell. In: Fish physiology N.Y., Acad. Press., 1971, v. 5, p. 265-346.

78. Dudet L.I., Cheiller P. et al. Pasteurella multocida toxin stimulates mitogenesis and cytoskeleton reorganization in Swiss 3T3 fibroblasts. J. Cellular Physiol, 1996, v. 68, p. 173-182.

79. Eaton R., Bombardieri R. Behavioral function of the Mauthner neuron. In: Neurobiology of the Mauthner cell. N. Y.: Raven press, 1978, p. 221-224.

80. Eaton R.C., Lavender W.A., Wieland C.M. Identification of Mauthner -initiated response patterns in goldfish: evidence from simultaneous cinematography and electrophysiology. J. Comp. Physiol., 1981, v. 144, p. 521-531.

81. Eaton R.C., Domenico R., Nissanov J. Role of the Mauthner cell in sensorimotor integration by the brainstem escape network. Brain Behav. Evol., 1991, v. 37, p. 272-285.

82. Faber D., Klee M. Ethanol suppresses collateral inhibition of the goldfish Mauthner cell. Brain Res., 1976, vol. 104, p. 347-353.

83. Faber DS, Korn H. Unitary conductance changes at teleost Mauthner cell glycinergic synapses: a voltage-clamp and pharmacological analysis. J. Neurophysiol., 1988, v. 60, p. 1982-1999.

84. Fetcho J.R., O'Malley D.M. Visualization of active neural circuitry in the spinal cord of intact zebrafish. J. Neurophysiol., 1995, v. 73, p. 399-406.

85. Fifkova E. Actin in nervous system. Brain Res., 1985, v. 9, p. 187-215.

86. Finkelstein A., Lee L. Rubin, Mu-C. Tzeng Black Widow Spider venom: effects of purified toxin on lipid bilayer membranes. Science, 1976, v. 193. № 10, p. 1009-1011.144

87. Flatau G., Lemichez E. et al. Toxin-induced activation of the G protein p 21 Rho by deamidation of glutamine. Nature, 1997, v. 387, № 6634, p. 729-733.

88. Fletcher M.D., Possani L.D., Fletcher P.L. Morphological studies by light and electron microscopy of pancreatic acinar cells under the effect of Titius serrulatus venom. Cell and Tissue Res., 1994, v. 278, № 2, p. 255-264.

89. Furshpan E.P., Furukawa T. Intracellular and extracellular responses of the several region of the Mauthner cell of the goldfish after polymerization and gelation of actin. J. Neurophysiol, 1962, v. 25, p. 732-771.

90. Geiger B., Avnur Z., Volberg T., Volk T. The cell in contacts. New-York, J. Wieley and Sons, 1985, p. 461-489.

91. Gray J. Studies in animal locomotion. The relationship between waves of muscular contraction and propulsive mechanism of the cell. J. Exp. Biol, 1933, v. 10, p. 386-400.

92. Gronewold T.M.A., Sasse F. et al. Effects of rhizopodin and latrunculin B on the morphology and on the actin cytoskeleton of mammalian cells. Cell Tissue Res., 1999, v. 295, p. 121-129.

93. Habermann E., Cheng-Raude D. Central neurotoxicity of apamin, crotamin, phospholipase A and amanitine. Toxicon, 1975,v.l3,p.465-473.

94. Hacket J.T., Cochran S.L., Brown D.L. Functional properties of afferents which synapse on the Mauthner neuron in the amphibian tadpole. Brain Res., 1979, v. 176, p. 148-152.

95. Hassler J. A., Moran P. J. The effects of ethanol on embryonic actin : A possible role in teratogenesis. Experientia, 1986, v. 42, № 5, p. 575-577.

96. Hasson A., Shon K.-Y., Olivera B.M., Spira M.E. Alterations of voltage-activated sodium current by a novel conotoxin from the venom of Conus gloriamaris. J. Neurophysiol., 1995, v. 73, № 3, p. 1295-1302.

97. Itoh M., Nagafuchi A., Moroi S., Tsukita S. Involvement of ZO-1 in cadherin-based cell adhesion through its direct binding to a catenin and actin filaments. J. Cell Biol., 1997, v. 138, № 1, p. 181-192.

98. Jerusalinsky D., Harvey A. L. Toxins from mamba venoms : small proteins with selectivities for different subtypes of muscarinic acetylcholine receptors. Trends Pharmacol. Sci., 1994, vol.15, № 11, p. 424-430.

99. Kashapova L.A., Moshkov D.A., Bezgina E.N. Active zones and plasticity of motor nerve terminals. In: Plasticity of Motoneuronal Connections. Elsevier Sci. Pub. BV, 1991, cp. 163-173.

100. Kharrat R., Mansuelle P., Sampieri F. et al. Maurotoxin, a four disulfide bridge toxin from Scorpio maurus venom: purification, structure and action on potassium channels. FEBS Lett., 1997, v. 406, № 3, p. 284-290.145

101. Kidokoro Y., Yen E. Synaptic contacts between embryonic xenopus neurons and myotubes formed from a rat skeletal muscle cell line. Develop Biol., 1981, v. 86, № l,p. 12-18.

102. Kimmel Ch. B., Schabtach F. Pattering in synaptic knobs which connect with Mauthner ' s cell (Ambystoma mexicana).-J. Compar. Neurol., 1974, vol. 156, p. 49 -80.

103. Kimmel Ch.B., Powell S.L., Eaton R.S. Does the Mauthner neuron mediate unique behavior? Soc. Neurosci. Abstr., 1978, v. 4, p. 1156.

104. Kimmel Ch. B., Sessions S. K., Kimmel R. J. Morphogenesis and synaptogenesis of the zebrafish Mauthner neuron .-J. Compar. Neurol., 1981, vol. 198, p. 101-120.

105. Kumar S., Faber D.S. Plasticity of first-order sensory synapses: Interactions between homosynaptic long-term potentiation and heterosynaptically evoked dopaminergic potentiation.J. Neurosci, 1999, v. 19, p. 1620-1635.

106. Legros C., Oughuideni R. et al. Characterization of a new peptide from Tityus serrulatus scorpion venom which is a ligand of the apamin-binding site. FEBS Lett., 1996, v. 390, p. 81-84.

107. Liberman A.R., Spacek J. Filamentous contacts: the ultrustructure and three-dimentional organization of specialized non-synaptic interneuronal appositions in thalamic relay nuclei. Cell Tissue Res., 1997, v. 288, p. 4357.

108. Lin J.W., Faber D.S., Wood M.R. Organized projection of the goldfish saccular nerve onto the Mauthner cell lateral dendrite. Brain Res., 1983, v. 247, p. 319-324.

109. Liu J., Misler S. A-latrotoxin -induced quantal release of catecholamines from rat adrenal chromaffin cells. Brain Res., 1998, v. 799, № 1, p. 55-63.

110. Liu K.S., Fetcho J.R. Photoablations of serially homologous reticulospinal neurons support their differential contributions to escape behavior in larval zebrafish. Soc. Neurosci. Abstr., 1998, v. 24, p. 1667.

111. Magazanic L.G., Fedorova Y.M., Kovalevskaya G.I. et al. Selective presynaptic insectotoxin (a-latroinsectotoxin) isolated from black widow spider venom. Neurosci., 1992, v. 46, № 1, p. 181-188.

112. Markharm J. A., Fifkova E. Effect of chronic ethanol consumption on the fine structure of the dentate gyrus in long-sleep and short-sleep mice.-Exp. Neurol., 1987, vol. 95, p. 290-302.

113. Martin M.-F., Courraud F. Handbook of neurotoxicology. New York, Marsel Dekker, 1995.146

114. Mauthner L. Untersuchungen über den Bau des Rückenmarks der Fishe.- S. -Ber. Akad. Wiss. Wien, 1859, Bd. 34, S. 31-36.

115. Messier C., et. al. Effect of aparnin, a toxin that inhibits Ca^-dependent K+-channels, on learning and memory processes. -Brain Res., 1991, vol. 551, №1/2, p. 322-326.

116. Moshkov D. A., Tiras N. R., Saxon M. Ye. Phalloidin changes the synaptic contacts ultrastructure.-Naturwissenschaften, 1980, Bd. 67, S. 194-195.

117. Moshkov D.A., Saveljeva L.N., Yanjushina G.V., Funtikov V.A. Structural and neurochemical changes in the citoskeleton of the goldfish Mauthner cells at different functional states. Acta histochemica, 1992, S (41), p. 241-247.

118. Moshkov D.A. and Santalova I.M. Distribution of calcium pyroantimonate precipitates in Xenotoca Mauthner cells at normal and increased functional activity. Neurosci., 1995, v. 65, № 3, p. 917-925.

119. Moshkov D.A., Mukhtasimova N.F. et al. In vitro long-term potentiation is accompanied by the changes of mixed synapses. Neurosci., 1998, v. 88, p. 109-12

120. Mulkey R.M., Malenka R.C. Mechanisms underlying induction of homosynaptic long-term depression in area CA lof the hippocampus. Neuron, v. 9, p. 967-975.

121. Nakajima Y. Fine structure of the synaptic ending on the Mauthner cell of the goldfish.-J. Comp. Neurol., 1974, vol. 156, p. 375-402.

122. Neurotoxins. In: Trends in neuroscience. Cambridge: Elsevier Trends J. Suppl. June, c. 1-37.

123. Niethammer M., Sheng M. Identification of ion channel-associated proteins using the yeast two-hybrid system. Methods Ensimol., 1998, in press.

124. O'Malley D.M., Kao Y.-H., Fetcho J.R. Imaging the functional organization of zebrafish hindbrain segments during escape behaviors. Neuron, 1996, v. 17, p. 1145-1155.

125. Orrenius S. , et al. Role of Ca^in toxic cell killing.-Trends Neurosci., 1989, vol. 10, p. 281-285.

126. Osmanovic S. S., Shefner S. A., Brodie M. S. Functional significance of the apamin -sensitive conductance in rat locus coeruleus neurons.- Brain Res., 1990, vol. 530,№ 2, p. 283-289.

127. Otsuka N. Weitere vergleichend-anatomische Untersuchungen an Mauthnerschen zellen von Fischen. Ztschr. Zelforsch., 1964, Bd. 62, p. 6171.147

128. Pavlik L. L., Moshkov D. A. Actin in synaptic sytoskeleton during long-term potentiation in hippocampal slices.-Acta Histochemica, 1992, Suppl. Band 41, S. 257-264.

129. Protti D.A., Uchitel O.D. Transmitter release and presynaptic Ca2+ currents blocked by the spider toxin co-aga-IVA. Neuroreport, 1993,v.5, № 3, p. 333-336.

130. Retzlaff E., Fontaine J. A differential straining reactions demonstrating reciprocal activity in Mauthner cells.- Experientia, 1960, vol. 19, p. 359-361.

131. Reuner K.H., Dunker D. et al. Regulation of actin synthesis in rat hepatocytes by cytoskeletal rearrangements. Eur. J. Cell Biol., 1996, v. 69, №2, p. 189-196.

132. Reuter H. Measurments of exocytosis from single presynaptic nerve terminals reveal heterogeneous inhibition by Ca2+ channel blockers, Neuron, 1995, v. 14, № 4, p. 773-779.

133. Ritter D., Fetcho J.R. Confocal calcium imaging of spinal interneurons during swimming in larval zebrafish. Soc. Neurosci. Abstr., 1998, p. 1667.

134. Rock M. K., Hackett J. T., Brown P. L. Does the Mauthner cell conform to the criteria of the command neuron concept?- Brain Res., 1981, vol. 204, p. 21-27.

135. Romi-Lebrun R., Lebrun B., Martin-Eauclaire M.-F. et al. Purification, characterization and synthesis of three novel toxins from the Chinese scorpion Buthus martensi, which act on K+ channels. Biochemistry, 1997, v. 36, №44, p. 13473-134482.

136. Rosenmund C., Westbrook G.L. Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron, 1993, v. 10, p. 805-814.

137. Rubtsova S.N., Kondratov R.V. et al. Disruption of actin microfilaments by cytochalasin D leads to activation of p53. FEBS Lett., 1998, v. 430, p. 353-357.

138. Sachs F. Biophysics of mechanoreception. Membr. Biochem., 1986, v. 6, p. 173-175.

139. Saito S.-Y, Watabe S., et al. Effect of dimeric macrolides, Bisteonellide A and Swinholide A. J. Biochem., 1998, v. 23, p. 571-578.

140. Sandvig K., Garred Q. et al. Importance of glycolipid synthesis for butyric acid induced sensitization to Shiga toxin and intracellular sorting to toxin in A431 cells. Molecular Biology, 1996, v. 17, p. 1391-1404.148

141. Shatursky O.Y., Pashkov V.N., Bulgakov O.Y., Grishin E.V. Interaction of a-latroinsektotoxin from Latrodectus mactans venom with bilayer lipid membranes. BBA Biomembranes, 1995, v. 1233, № 1, p. 14-20.

142. Shepard P. D., Bunney B. S. Repetitive firing properties of putative dopamine containing neurons in vitro: regulation by an apamin-sensitive Ca^-activated K+" conductance.- Exp. Brain Res., 1991, vol. 86, № 1, p. 141-150.

143. Silva A., Kumar S., Pereda A., Faber D.S. Regulation of synaptic strength at mixed synapses: effects of dopamine receptor blockade and protein kinase С activation. Neuropharmacology, 1995, v. 34, p. 15591565.

144. Smith S.J. and Augusta G.J. Calcium ions, active zones and synaptic release. Tr. inNeurosci., 1988, v. 11, p.458-464.

145. Stefanelli A. The Mauthner apparatus in the Ichthyopsida; Its nature and correlated problems of histogenesis. Quart. Rev. Biol., 1951, v.26, p.17-34.

146. Stefanelli A., Caravita S. Ultrastructura dei systemi sinaptici del neurone di Mauthner di un Teleosteo.- Ztschr. Zellforsch., 1964, Bd. 62, S. 1-15.

147. Stefanelli A. I neuroni di Mauthner degli ittopsidi. Valutazioni comparative morphologiche e funzionali. Lincei. Mem. Sci. Fis. Eccol., Roma, 1980, v. 16, p. 1-45.

148. Suzuki M., Miyazaki K. et al. F-actin network may regulate а СГ channel in renal proximal tubule cells. J. Membr. Biol., 1993, v. 134, p. 3139.

149. Tanaka H. et al. Fetal alcohol effects: decreased synaptic formations in the fields CA3 of fetal hippocampus .-Int. J. Develop. Neurosci., 1991, vol. 9, p. 509-517.

150. Tamura K., Shan W.-S. et al. Structure-function analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron, 1998, v. 20, p. 1153-1163.

151. Tang L., Hung C., Schuman E. A role for the cadherin family of cell adhesion molecules in hippocampal long-term potentiation. Neuron, 1998, v. 20, №6, p. 1165-1175.

152. Tiras N. R., Pavlik L. L., Moshkov D. A. Alterations in the cytoskeleton of goldfish Mauthner cells under various pharmacological treatments.-Acta Histochem., 1992, Suppl. Bd. 41, S. 249-256.

153. Tiras N.R., Zherdev G.V. and Moshkov D.A. Ultrastructure of Mauthner cells in fish adapted to long-duration vestibular stimulation and the effect of etanol. Neural Plastisity, 1999, v. 6, № 4, p. 91-102.

154. Uchida N., Honjo Y. et al. The catenin /cadherin adhesion system is localized in synaptic junctions bordering transmitter release zones. J. Cell Biol., 1996, v. 135, p. 767-779.

155. Valdivia H. H., Kirby M. S., Lederer W. J., Coronado R. Scorpion toxins targeted against the sarcoplasmic reticulum Ca^- release channel of skeletal and cardiac muscle.- Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, № 24, p. 12185-12189.

156. Viviani B., Galli C.L., Marinovich M. Is actin polymerization relevant to neurosecretion? A study on neuroblastoma cells. Biochem and Biophys. Res. Communs., 1996, v. 223, № 3, p. 712-717.

157. Wang G. , Lemos J. R. Effects of funnel web spider toxin on Ca^ currents in neurohypophysial terminals.- Brain Res., 1994, vol. 663, № 2, p. 215-222.

158. Yakoubek B., Edstrom J. E. RNA changes in the Mauthner axon and myelin cheath after increased functional activity. J. Neurochem., 1965, v. 12, p. 845.

159. Yamagata M., Hermann J.P., Sanes J.R. Laminin-specific expression of adhesion molecules in developing chick optic tectum. J. Neurosci., 1995, v.15, p. 4556-4571.

160. Yang X.-D., Korn H., Faber D.S. Long-term potentiation of electronic coupling at mixed synapses. Nature, 1990, v. 348, p. 542-545.

161. Yang X.-D., Faber D.S. Initial synaptic efficacy influences induction and expression of long-term changes in transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 4299-4303.

162. Zottoli S. J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditori responses in unrestrainet goldfish.-J. Exp. Biol., 1977, vol. 66, p. 243-254.

163. Zottoli S.J. Comparison of Mauthner cell size in teleosts. J. Comp. Neurol., 1978, v. 178, p. 741-758.

164. Zottoli S.J., Bentley A.P., Prendergast B.J., Rieff H.I. Comparative studies on the Mauthner cell of teleost fish in relation to sensory input. Brain Behav. Evol., 1995, v. 46, p. 151-164.

165. Zamudio F.Z., Gurrola G.B., Arevalo C., Sreekumar R. et al. Primary structure and synthesis of imperatoxin A (IpTxa), a peptide activator of150

166. Ca2+ release channels (ryanodine receptors) FEBS Lett., 1997, vol. 405, № 3, p. 383-389.

167. Zottoli S.J., Feiner D.G., Faber D.S. Behavioral recovery of fast startle responses after spinal cord crash in goldfish can occur in the absence of Mauthner cells. Soc. Neurosci. Abstr., 1998, v. 24, p. 309

168. Zottoli S.J. and Faber D.S. The Mauthner cell: What has it taught us? The Neuroscientist, 1999 (in press).

Информация о работе

Михеева, Ирина Борисовна
кандидата биологических наук
Пущино, 1999
ВАК 03.00.02

Диссертация

Маутнеровские нейроны рыб как объект для испытания ядов паукообразных и их фракций с целью поиска новых нейротоксинов, взаимодействующих с актином - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы