Изучение взаимосвязи структуры и функции маутнеровских нейронов золотой рыбки при действии амилоида

Коканова, Надежда Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение взаимосвязи структуры и функции маутнеровских нейронов золотой рыбки при действии амилоида
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимосвязи структуры и функции маутнеровских нейронов золотой рыбки при действии амилоида"

005002669

Коканова Надежда Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ ЗОЛОТОЙ РЫБКИ ПРИ ДЕЙСТВИИ АМИЛОИДА

Специальность 03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Пущино -2011

005002669

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона Учреждения Российской академии наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Михайлова Гульнара Зульфатовна

Научный консультант:

Научный консультант: ^^ Надежда Романонпа

доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Гордон Рита Яковлевна

кандидат биологических наук Муганцева Екатерина Александровна

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится « 21 » декабря 2011г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу:

142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ

РАН.

Автореферат разослан « » ноября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Болезнь Альцгеймера клинически проявляется прогрессирующей потерей памяти и деградацией личности, а гистопатологически характеризуется церебральным амилоидозом, внеклеточным локальным отложением в виде сенильных бляшек полимерного волокнистого бета-амилоидного белка (Mattson, 2004; Преображенская, Яхно, 2006). На генетически предрасположенных к амилоидозу животных показано, что образование бляшек приводит к патологии мозга. Нейриты, которые проходят через отложения амилоида, изменяют свою форму и размеры (Knowles et al., 1999). Образование амилоидных отложений приводит к дистрофии дендритов, аксонов, дендритных шипиков и афферентных шипиковых и стволовых синапсов, индуцирует появление внутри нейронов нейрофибриллярных клубков (Taylor et al., 2002; Luebke et al., 2010). Такие нейрональные повреждения, по-видимому, инициируются взаимодействием между разными формами бета-амилоида (олигомеры или фибриллы) и мембранами клеток (Talaga et al., 2002; Verdier et al., 2004). Бета-амилоидные структуры способны увеличивать механическую жесткость нейрональных мембран (Lulevich et al., 2010), что, вероятно, приводит к изменению электрической проводимости дендритов, задержка которой на миллисекунды нарушает электрофизиологические свойства нейронов, а также ухудшать состояние слаженно работающей нейрональной сети и когнитивные процессы в мозге (Halpain et al., 2005; Meyer-Luehmann et al., 2008). Кроме того, такое изменение физических свойств мембран, по-видимому, обуславливает нарушение компенсаторно-приспособительных реакций нейронов на приток сенсорных стимулов извне (Hoffmann et al., 2009), что в конечном итоге вызывает их гибель. Остается неизвестным, что происходит с индивидуальными нейронами, продолжающими функционировать в условиях хронического амилоидоза. Понимание того, как изменяется структура и функция индивидуальных нейронов при повреждающем действии на них амилоидных отложений необходимо для выработки подходов к профилактике, коррекции и терапии нейродегенеративных изменений при деменции. Известные ограничения при работе на целостном мозге требуют создания адекватных модельных систем, на которых можно детально исследовать аспекты данной проблемы. Однако почти все разработанные в настоящее время модели амилоидоза (генетические, аппликационные, спорадические, комплексные) хороши для работы лишь на системном уровне (Paquet et al., 2009; Spires, Hyman, 2010; Каминский, Косенко, 2009; Муганцева, Подольский, 2009; Степаничев и др., 2009; Бобкова, 2010; Kamynina et al., 2010). Они не могут быть использованы для изучения клеточных механизмов нейродегенеративных заболеваний, вызванных амилоидозом. Поэтому создание адекватной клеточной формы амилоидоза с использованием идентифицированных нейронов остается актуальной задачей нейробиологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было комплексное исследование влияния бета-амилоида на морфофункциональную организацию индивидуальных нейронов, а также поиск подходов к индукции в нейронах устойчивости к бета-амилоиду. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создать адекватную клеточную нейрональную модель экспериментального амилоидоза, используя для этого морфофункциональные свойства идентифицированных маугнеровских нейронов золотой рыбки и аппликацию на них агрегированного бета-амилоида.

2. Исследовать морфофункциональное состояние маугнеровских нейронов рыбок на фоне развивающегося амилоидоза.

3. Изучить влияние адаптации к сенсорным стимуляциям как физиологической модели повышения устойчивости маугнеровских нейронов к бета-амилоиду.

4. Изучить влияние дофамина и системного воздействия L-ДОФА на морфофункциональное проявление амилоидоза на уровне нейронов.

Научная новизна работы

Впервые выявлено, что воздействие агрегатов бета-амилоида, обнаруживаемых на поверхности нейрона электронно-микроскопическим методом, приводит к значительным повреждениям структуры сомы и дендритов индивидуального нейрона. Впервые показано, что нарушается корреляция между моторной асимметрией рыбки и структурной асимметрией ее маутнеровских нейронов (МН) под влиянием аппликации агрегированного белка бета-амилоида. Полученные результаты в комплексе означают разработку новой экспериментальной клеточной модели амилоидоза Впервые установлено, что адаптирующая стимуляция вестибулярного или зрительного аппарата рыбки повышает устойчивость нейронов к патогенному воздействию агрегированного белка. Показано, что дофамин in vitro способен дезагрегировать ленты бета-амилоида на короткие фрагменты. Впервые определено, что аппликация дофамина на МН in vivo или увеличение его концентрации в мозге с помощью L-ДОФА предохраняет их структуру и функцию от повреждающего воздействия бета-амилоида.

Научно-практическая значимость работы

Результаты работы имеют теоретическое значение, расширяя представление о механизмах повреждения нейронов при амилоидозе. Полученные в работе данные по влиянию тренировочных стимуляций, повышающих резистентность МН к повреждающему действию бета-амилоида, можно рассматривать как один из подходов к предупреждению амилоидоза. Обнаружение протекторного действия дофамина, апплицируемого непосредственно на индивидуальные нейроны, или повышение концентрации дофамина в мозге с помощью медикаментозного средства, позволяют разработать новый подход к терапии амилоидозов с использованием этого гормона. Результаты позволяют выявить возможные способы профилактики, корректировки и лечения дегенеративных процессов в головном мозге при амилоидозе. В настоящее время ведется активный поиск фармакологических и иных способов лечения и предупреждения нейродегенеративных заболеваний, связанных с накоплением в мозге в виде сенильных бляшек агрегированных форм бета-амилоида.

Апробация диссертации и публикации

Результаты доложены на 11 международных и 7 российских конференциях: конференция «Нейронауки: теоретические и клинические аспекты» (Донецк, 2007; 2008); XV Международная конференция по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, сентябрь 2009); 11, 14, 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007; 2010; 2011); конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009; 2010); III Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, май 2010); XIII Всероссийская научно-техническая конференция «Нейроинформатика-2011» (Москва, январь 2011); Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, май 2011); VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, июнь 2011).

По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах, 5 статей в сборниках научных конференций и 16 - в виде тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Работа изложена на_страницах, содержит_таблиц и j_рисунков.

Список литературы включает_наименований отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования Объектами исследования служили 3-4-месячные неполовозрелые золотые рыбки Carassius auratus породы Оранда, Шубункин, размером 3-5 см, массой около 2 г и их маутнеровские клетки, два командных гигантских нейрона в продолговатом мозге, ответственные за совершение поворотов тела (Тирас и др., 2007). В работе было использовано 260 рыбок. Внутримозговые инъекции растворов проводили под оптическим контролем при 20-ти кратном увеличении, используя микроскоп МПСУ-2, микрошприцем вручную по методике, разработанной ранее (Тирас, Мошков, 1978; Kolaeva et al., 2000). Объем инъецируемого препарата с учетом размеров мозга составлял 4-5 мкл. В каждой серии экспериментов подопытной группе рыбок соответствовали свои контрольные группы. Контрольным рыбкам вводили в мозг среду разведения препаратов - физиологический раствор или дистиллированную воду (Степаничев и др., 2004; Cetin et al., 2007).

Подопытным рыбкам инъецировали фармакологически активные вещества: фрагмент бета-амилоида (АР25.35) и нетоксичный фрагмент бета-амилоида с обратной последовательностью (AP3S-25) (AnaSpec, San Jose, USA) (оба препарата концентрации 5 мг/мл, предварительно агрегировали в течение 3 суток при температуре 37°С; неагрегированная форма АР35.25 в условиях эксперимента была неэффективна); дофамин (Pharma Orion, Finland), разведенный 0.9% раствором хлорида натрия с метабисульфитом, в концентрации 1.0х10"2М, рН раствора 5.68. Эффективная доза дофамина вблизи МН составляла около 1.0х10"5М (Безгина и др., 2006). В качестве контрольного раствора использовали раствор метабисульфита с хлоридом натрия в соотношении 1:20. Медикаментозным путем повышали уровень дофамина в мозге с помощью препарата тидомет форте (Torrent Pharmaceutical, India). Это комбинированное средство содержит карбидопу (ингибитор декарбоксилазы ароматических аминокислот) и леводопу (предшественник дофамина - L-ДОФА, левовращающий изомер диоксифенилаланина). Препарат растворяли в дистиллированной воде и добавляли в сосуд, в котором выдерживали рыбок в течение 2, 5 и 24 час, концентрация L-ДОФА составляла 20 мг/мл. Препарат попадал в мозг, проникая в кровь через жабры. Одних рыбок выдерживали в растворе L-ДОФА после аппликации АР25-35, а других перед ней.

При изучении последствий аппликации препаратов в ряде случаев их сочетали с вестибулярной или зрительной стимуляцией МН. Интактным рыбкам апплицировали препарат агрегированного фрагмента бета-амилоида за 5, 17 или 24 час до последующей стимуляции. В одной из серий экспериментов после аппликации препарата проходило 3 недели, при этом стимуляцию не проводили. Адаптированным рыбкам также апплицировали агрегированный фрагмент АР25-35, после этого оставляли рыбок на 24 час, затем подвергали утомительной вестибулярной или зрительной стимуляции.

Моторную асимметрию рыбок определяли по специально разработанной методике в узком прямолинейном канале (Михайлова и др., 2005). В течение 5 мин подсчитывали число полных (на угол более 90°) поворотов, совершенных рыбкой вправо, и число полных поворотов влево. Моторную асимметрию рыбок выражали в виде коэффициента моторной асимметрии (КМА), вычисляемого как отношение числа поворотов в правую или в левую сторону к суммарному числу поворотов в обе стороны. Рыбок с величиной КМА, равной >0.55, относили к группе латерапизованных (правшей или левшей, в зависимости от стороны предпочтения). Величина КМА, равная 0.5±0.05, отражала равную вероятность выбора стороны поворота, таких рыбок считали «амбидекстрами». Изменение КМА рыбки от своей естественной величины, превышающей 0.5, до значения ниже 0.5 после воздействия означало инверсию моторной асимметрии.

Функциональную активность МН определяли по числу поворотов рыбки в узком канале в обе стороны за минуту. Оно, как было показано, коррелирует с электрической активностью

МН (Тирас и др., 2007; МскЬкоу е! а!., 1990) и выражает косвенное значение суммарной активности обоих МН.

Вестибулярную стимуляцию проводили, вращая рыбок одновременно вокруг ростро-каудапьной (длинной) и дорзо-вентральной (короткой) осей тела со скоростью 42 об/мин (Мошков, 1985). Длительность утомительной стимуляции составляла 2 час. В этой же установке у рыбок вырабатывали адаптированное состояние по методике, разработанной ранее (Мошков, 1985). Длительность процесса адаптации составляла 15 дней. Зрительную стимуляцию осуществляли в специальной оптомоторной установке (Штанчаев и др., 2007). При контралатеральной оптокинетической стимуляции оптомоторный барабан вращался против часовой стрелки для рыбок-правшей и по часовой стрелке - для левшей. Время стимуляции составляло 10 часов, скорость вращения барабанов была 30 об/мин. Выработку адаптированного состояния к зрительной стимуляции осуществляли в этой же установке, используя ранее разработанную методику (Дектярева и др., 2008). Длительность процесса адаптации составляла 15 дней.

Для ответа на вопрос, является ли адаптация МН системным процессом или носит локальный характер, вырабатывали адаптацию с помощью тренировочных стимуляций одного афферентного входа и проверяя уровень достигнутых адаптационных изменений утомительной стимуляцией другого входа. Поэтому в отдельной серии экспериментов у рыбок вырабатывали адаптированное состояние к утомительной вестибулярной стимуляции, а проверку адаптированного состояния проводили, используя зрительную стимуляцию по методике описанной ранее (Дектярева и др., 2008).

Трехмерная реконструкция МН. Для гистологических исследований рыбок декапитировали при холодовой анестезии, выделяли головной мозг, вырезали блок продолговатого мозга, содержащий МН, и фиксировали по прописи, используемой в электронной микроскопии (Мошков, 1985), обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в 100% ацетоне и заключали в эпоксидную смолу Эпон-812. Полученные блоки резали на пирамитоме ЬКВ (Швеция), при этом получали серию последовательных срезов толщиной 3 мкм.

Рис. 1. Изображение МН на гистологическом фронтальном срезе мозга золотой рыбки (А) и вид реконструированных МН (Б). Обозначения: С - сома, ЛД и ВД - латеральный и вентральный дендриты, соответственно. К - контралатерапьный МН, И - ипсилатеральный МН. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Срезы, содержащие участки МН (рис. 1А), фотографировали при увеличении 250х. Затем изображения срезов обрабатывали в программах Adobe PhotoShop CS3 Extended 10.0.1., IGL Align SEM Align, IGL. Trace и получали объемные изображения МН с помощью программы 3D View 3.5. (рис. 1Б). Вычисляли раздельно объем сомы, латерального, а также вентрального дендритов. Объем одного МН представляли как сумму объемов данных частей. Асимметрию МН и их частей у каждой рыбки характеризовали с помощью коэффициента структурной асимметрии (КСА) как отношение объема контрапатерального нейрона или его части к сумме объемов обоих МН или соответствующих частей (Григорьева и др., 2009).

Контралатеральный (доминантный) МН расположен на стороне противоположной по отношению к предпочитаемой стороне поворота. Ипсилатерапьный (субдоминантный) МН расположен на стороне, которая предпочиталась рыбками при осуществлении поворота. Средние КСА объемов МН вычисляли по полученным количественным данным объемов МН нескольких рыбок.

Статистический анализ данных проводили в программе Microsoft Excel 2003. Для проверки соответствия полученного распределения параметра КМА нормальному использовали критерий х2 (хи-квадрат). Достоверность различий данных определяли при помощи t-теста Стьюдента. Количественные данные представлены значениями среднего арифметического ± доверительный интервал. Для выявления статистически значимой зависимости структурной асимметрии МН (КСА) от моторной асимметрии рыбок (КМА) применяли метод корреляционного анализа.

Для электронно-микроскопического исследования фиксированные и залитые в смолу фрагменты продолговатого мозга разрезали на фронтальные срезы толщиной 3 мкм, переклеивали их на эпоновые столбики, затачивали нужный участок с МН, резали ультратонко на ультрамикротоме LKB-3 (Швеция) или EM UC6 (Leica, ФРГ) и исследовали в электронном микроскопе Tesla BS-500 (Чехословакия) при увеличении 10000, 14000 и 32000 раз.

Для электронно-микроскопического исследования агрегированного фрагмента Aß2s-is использовали метод негативного контрастирования образцов. Каплю раствора наносили на сеточку, покрытую плёнкой из формвара и укреплённую углеродным напылением. Препараты контрастировали 1% раствором уранилацетата. При изучении взаимодействия фрагмента Aß25-35 с дофамином in vitro совместно инкубировали дофамин и агрегированный фрагмент Aß25-35 в течение 3-4 час при комнатной температуре, а затем препараты негативно контрастировали и результат взаимодействия оценивали визуально в электронном микроскопе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СОЗДАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ НЕЙРОНАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА

1.1. Электронно-микроскопическая идентификация амилоида

Электронно-микроскопическое исследование показало, что агрегированный фрагмент АР25-35 представляет собой закрученные по спирали протяженные ленты длиной от нескольких мкм до десятков мкм и шириной 30-80 нм (рис. 2А). В поле зрения попадаются и протофибриллы, но их количество незначительно. Ультраструктурный анализ агрегированного фрагмента бета-амилоида АР35-25 выявил, что данный фрагмент представляет собой фибриллы длиной до 10 мкм, шириной 20-45 нм (рис. 2Е).

1 I

Рис. 2. Электронно-микроскопическое изображение амилоида, агрегированного в течение 3-х суток.

А - агрегированный фрагмент АР25-35; Б - агрегированный фрагмент АР35.25. Масштабный отрезок: 0.1 мкм.

Исходя из результатов ультраструктурного исследования данных белковых фрагментов, можно сделать следующее заключение. Наблюдается большое количество скоплений полимерных структур, а также олигомерных форм, которые имеют определенную плотность. Как следствие, они могут оказывать непосредственное механическое воздействие на живые клетки. Для того чтобы проверить это предположение, мы исследовали действие на нейроны агрегированного фрагмента АР25-35, вызывающего различные яркие эффекты на клеточном и системном уровнях (Aigelsreiter et al., 2007), и нейтрального по своим свойствам фрагмента АР35-25 (Гуляева и др., 2009).

1.2. Изучение связи структуры и функции МН при аппликации агрегированных фрагментов Л/!25-з5 и АР35.25

Морфофункционалъное исследование МН после аппликации A/¡2¡-3s. Исследование контрольной группы рыбок не выявляет изменений их моторной асимметрии. Функциональная активность МН также не изменяется после аппликации растворителя. Аппликация агрегированного фрагмента АР25-35 У одних рыбок приводит к достоверному сглаживанию моторной асимметрии с 0.65±0.05 до 0.5±0.07 (n=12, р<0.01). У других рыбок моторная асимметрия усиливается под влиянием пептида с 0.56±0.03 до 0.68±0.08 (п=15, р<0.01). Функциональная активность МН в одних случаях увеличивается после аппликации бета-амилоида с 4.0±0.6 до 8.2±1.5 (п=13, р<0.01), в других - снижается с 5.7±1.4 до 2.6±0.63 (п=15, р<0.01).

Изучение объемов МН контрольных рыбок показывает менее выраженную структурную асимметрию, чем у интактной группы. Несмотря на это количественные данные демонстрируют преобладание размера контралатерального нейрона (его тела и обоих дендритов) над размером ипсилатерального МН (рис. ЗА).

А Б

Рис. 3. Реконструированные МН контрольной рыбки (А) и подопытных рыбок спустя 5 час (Б) и 3 недели (В) д. после аппликации фрагмента АРг5-э5-Обозначения: С - сома; ВД и ЛД -вентральный и латеральный дендриты, соответственно; К и И -контралатеральный и ипсилатеральный МН. Стрелка указывает на участок МН,

цифры - объемы соответствующего 131х103цт3 --\ 53х103цт3

участка МН в 103цт3, £к и £и - сумма объемов контралатерального и ® ипсилатерального МН, соответственно. Масштабный отрезок: 100 мкм

Аппликация фрагмента АР25-35 вызывает существенные аномальные структурные изменения МН (рис. 3 Б и В). В среднем объемы вентральных дендритов обоих МН уменьшаются в 3-9 раз. В связи с этим уменьшаются объемы обоих нейронов, что наглядно представлено на рис. 4.

900

л 5

Ф г"

ю О

600

300

и А *

■

Рис. 4. Изменение объемов обоих МН после аппликации фрагмента АР25.35. Интактные рыбки (п=10), контрольные рыбки (п=12), подопытные рыбки - после аппликации фрагмента АР25-35 (п=10). * - р<0.05.

интактные контроль амилоид

Анализ морфометрических данных контрольной группы рыбок показывает наличие корреляции функциональной асимметрии МН (КМА) с их структурной асимметрией (КСА). Значение коэффициента корреляции у них составляет 0.82 (рис. 5).

Корреляционный анализ изменений функционального состояния МН и их структурных сдвигов, вызванных аппликацией Ар25.з5- выявляет низкое значение коэффициента корреляции 0.06 (рис. 5). Соответственно, полученные результаты свидетельствуют о серьезном нарушении и исчезновении закономерной взаимосвязи этих двух важных параметров под влиянием агрегированного бета-амилоида.

0,8

£ = = 5 я я- 0,6

15 ■е- о. г- с. 0,4

& 2 0,2 0

0,82

0,06 I шШт<Ш

Рис. 5. Корреляция между коэффициентами моторной асимметрии рыбок и структурной асимметрии их МН после аппликации среды разведения и агрегированного фрагмента АР25-35.

1 - контрольные рыбки (п=10);

2 - подопытные рыбки (после аппликации АР25.35; п=15).

В ходе гистологического исследования обнаружены повреждения структуры соматической части и дендритов нейронов (рис. 6). Наблюдается дистрофическая вакуолизация отдельных частей МН и изменение формы дендритов дистрофического характера: они истончаются и

укорачиваются по сравнению с контролем.

^тш

Рис. 6. Фронтальный гистологический срез МН ? „ , ;■

рыбки после аппликации растворителя (А, В) и у фрагмента АР25-35 (Б, Г). А, В - сома нейрона, Б и Г - вентральный дендрит МН. Стрелкой показаны соответствующие части МН. Масштабный отрезок: 50 мкм.

Ультраструктура МН контрольных рыбок (рис. 7А) практически не отличается от структуры интактных нейронов (Мошков, 1985). Поверхность соматических частей и дендритов покрыта многочисленными афферентными синаптическими окончаниями, содержащими большое количество диффузно рассредоточенных внутри сечений бутонов синаптических везикул и некоторое число митохондрий, имеющих интактную морфологию. Постсинаптическая цитоплазма представлена плотными пучками нейрофиламентозного цитоскелета, перемежающимися в соматических частях скоплениями полисом и немногочисленными набухшими митохондриями.

Рис. 7. Ультраструктура соматической части МН после аппликации растворителя (А) и бета-амилоида (Б).

А - срез МН контрольной рыбки через 17 час после аппликации среды разведения, Б - срез МН подопытной рыбки через 17 час после аппликации фрагмента АР25-35. Обозначения: МН - цитоплазма маутнеровского нейрона, мтх - митохондрии, мф - миелиновые фигуры, вак -вакуоль, с - синапс, АР - скопления бета-амилоида в межклеточных пространствах вблизи МН. Масштабный отрезок: 0.5 мкм.

Аппликация бета-амилоида в течение 17 час приводит к структурным сдвигам в ультраструктуре МН (рис. 7Б). Вокруг синапсов появляются серые осмиофильные крупнозернистые межклеточные включения амилоидных агрегатов, подходящие к поверхности нейронов. Поверхность МН становится менее ровной, синаптические окончания запустевают и вдавливаются в нее, иногда довольно глубоко, что свидетельствует о нарушении плотности плазматической мембраны. Митохондрии повреждаются, часть крист исчезает, а в матриксе образуются просветы. Форма митохондриальных профилей, как правило, искажается. В соматических частях исчезает значительное количество рибосом, от чего цитоплазматический матрикс просветляется. Постсинаптическая цитоплазма вакуолизируется, появляются многочисленные миелиновые фигуры, свидетельствующие о дистрофических изменениях. В то же время цитоскелетные ее элементы сохраняют свою относительно плотную упаковку и продольную ориентацию относительно плазматической мембраны.

Анализируя полученные ультраструктурные данные, можно сделать предположение, что основу дистрофических изменений МН составляет вакуолизация цитоплазмы, связанная с повышенным функционированием афферентных синапсов. Такое усиленное функционирование может быть вызвано непрерывным механическим раздражением нервных элементов амилоидными фибриллами, окружающими и сдавливающими отростки и тела нейронов. Поэтому вызванные ими функциональные сдвиги (увеличение подвижности и резкое изменение КМА рыбки) через структурные изменения отростков нейрона часто противоположны естественной функции нейрона.

Функциональное исследование МН после аппликации АРнл показывает, что величина КМА рыбок снижается с 0.65±0.04 до 0.55±0.05 (п=26, р<0.01). Функциональная активность

МН после аппликации АРз5.25 увеличивается с 4.8±0.7 до 9.0±2.6 (р<0.01). Вестибулярная стимуляция нивелирует моторную асимметрию (КМА изменяется с 0.67±0.05 до 0.45±0.13, п=11, р<0.05). Функциональная активность МН после стимуляции на фоне АР35-25 достоверно снижается с 5.3±0.5 до 2.7±0.8 (п=19, р<0.01).

Анализ структурных данных после аппликации АЦц.ц на МН свидетельствует о том, что агрегированный фрагмент Ар35_25 как отдельно, так и в сочетании со стимуляцией так же, как и АР25-35, повреждает морфологию МН (рис. 8). Уменьшаются объемы соматической части и латеральных дендритов обоих МН и в несколько раз - объемы обоих вентральных дендритов, в большей степени контралатерального МН. Соответственно, уменьшаются суммарные объемы обоих нейронов, при этом размеры контралатерального и ипсилатерального МН практически выравниваются.

Исходя из результатов эксперимента с агрегированным фрагментом Арз5_25, можно сделать заключение, что образование агрегатов нетоксичного фрагмента бета-амилоида оказывает травматичное действие на структуру и функцию МН.

Рис. 8. Реконструированные МН рыбки после аппликации агрегированного фрагмента АР35.25 и последующей вестибулярной стимуляции. Обозначения такие же, что и на рис. 3; МД - медиальный дендрит. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Таким образом, аппликация бета-амилоида на МН в целом вызывает дистрофию дендритов и сомы нейронов. Можно заключить, что под действием агрегированных фрагментов бета-амилоида как с прямой, так и с обратной последовательностью нарушается взаимосвязь между структурой и функцией МН, характерная для интактных и контрольных животных, и именно этот факт является ярким патологическим проявлением эффекта амилоида на клеточном уровне.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОФУНКЦИОНЛЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МН РЫБОК НА ФОНЕ РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ АМИЛОИДОЗА

2.1. Влияние сенсорных стимуляций на взаимосвязь между функциональной активностью и структурой нейронов после аппликации фрагмента АР25.Ц

Вестибулярная стимуляция

У контрольных рыбок после стимуляции наблюдается достоверное сглаживание моторной асимметрии с 0.61±0.09 до 0.46±0.07 и значительное снижение функциональной активности МН с 8.3±3.3 до 3±2.7 (п=10, р<0.05).

Аппликация фрагмента АР25-35 и последующая вестибулярная стимуляция вызывают сильные нарушения функциональных показателей МН. Через 5 час после данных воздействий у рыбок наблюдается ярко выраженная инверсия моторной асимметрии (0.69±0.09 - до стимуляции, 0.35±0.07 - после стимуляции; п=5, р<0.05). При этом функциональная активность МН достоверно снижается с 5.3±1.8 до 1.06±0.6 (п=11, р<0.05). После 24 час воздействия бета-амилоида и последующей стимуляции изменений показателей моторной асимметрии не происходит, при этом обнаружены высокие показатели функциональной активности МН (6.3±2.0, п=6).

ВД = 14 ч

1и = 68x103цпг

1к =

-79x103 цт"

У контрольных рыбок после стимуляции наблюдается сглаживание структурных различий из-за уменьшения объема сомы и латерального дендрита контралатерального МЫ до размеров, наблюдавшихся у ипсилатерального нейрона (рис. 9А).

87x10 цш

Рис. 9. Реконструированные МН рыбок после вестибулярной стимуляции. А - МН контрольной рыбки, Б - МН подопытной рыбки после аппликации фрагмента АР25-35. Обозначения такие же, что и на рис. 3; МД - медиальный дендрит, Я - ядро нейрона. Масштабный отрезок: 100 мкм.

У рыбок, которым вводили фрагмент АР25-35, после стимуляции наблюдаются значительные структурные изменения МН (рис. 9Б). Существенно истончаются вентральные дендриты, в них появляются перетяжки, гипертрофируются практически незаметные в норме медиальные дендриты, отходящие от вентральной поверхности соматической части МН, значительно уменьшается и становится короче и _уже латеральный дендрит контралатерального МН, а ядро ипсилатерального нейрона перемещается в латеральный дендрит. При этом оба нейрона претерпевают сильную дистрофию, и происходит изменение структурной асимметрии за счет уменьшения размера контралатерального нейрона до размера ипсилатерального МН.

Статистически выявлено, что на объемы МН контрольных рыбок не влияет сочетание воздействия среды разведения и последующей их стимуляции (рис. 10). Характерным результатом воздействия амилоида остается достоверное снижение объемов обоих МН.

контроль

амилоид

Рис. 10. Изменение объемов обоих МН после вестибулярной стимуляции. Контрольные рыбки (п=6); подопытные рыбки - после аппликации фрагмента АР25-35 (п=10). Звездочкой отмечено значение, достоверно отличающееся от аналогичных значений контрольных МН после стимуляции. * - р<0.05.

- до стимуляции [~] - после стимуляции

Анализ морфометрических данных контрольной группы рыбок показывает, что совместное действие аппликации среды разведения и вестибулярной стимуляции практически не влияет на коэффициент корреляции между КМА и КСА данных рыбок (рис. 11).

В случае аппликации фрагмента АР25.35 и последующей вестибулярной стимуляции не наблюдается зависимости между КМА рыбок и КСА их МН, о чем свидетельствует крайне низкое значение коэффициента корреляции.

и Я

Я я

я Ч

1? а

0,73

0,07 | |

Рис. 11. Корреляция между коэффициентами моторной асимметрии рыбок и структурной асимметрии их МН после вестибулярной стимуляции.

1 - контрольные рыбки (п=6);

2 - подопытные рыбки (после аппликации АР25-35; п=7).

Полученные данные позволяют предположить, что амилоид на фоне действия сенсорной вестибулярной стимуляции вызывает еще более значительные морфофункциональные изменения маутнеровских нейронов. Известно (Мошков, 1985), что такой повреждающий фактор как вестибулярная стимуляция изменяет морфофункциональное состояние МН, не искажая нормальной взаимосвязи их структуры и функции. Однако деформированные агрегированным амилоидом нейроны не способны адекватно реагировать на стимуляцию, по-видимому, из-за хронического раздражающего действия амилоида. Похожий эффект амилоида наблюдали также и при исследовании МН с использованием метода зрительной стимуляции.

Зрительная стимуляция

Зрительная стимуляция контрольных рыбок приводит к снижению величины КМА с 0.61±0.08 до 0.47±0.12 (п=8). Функциональная активность МН не меняется, оставаясь на интактном уровне после аппликации растворителя и стимуляции (2.96±0.67 - до стимуляции, 2.33±0.48 - после стимуляции; п=8). Сочетание аппликации агрегированного фрагмента АР25-35 и стимуляции приводит к инверсии моторной асимметрии рыбок (0.61±0.08 - до стимуляции, 0.35±0.12 - после стимуляции; п=7, р<0.05). Функциональная активность МН снижается с 2.9±1.07 до 0.8±0.6 (п=5).

Морфология МН контрольных рыбок после стимуляции не отличается от структуры МН интактных рыбок после такой же стимуляции (рис. 12А).

И К

ЛД = 66

С =

ВД=17

1иГ 170x103

ЛД = 3

3 = 114 С = 25

ВД = 57

1к = 103рт3

42x10

ЛД = 53 51

МД = 40

Ек = 212x10 рт3

Рис. 12. Реконструированные МН рыбок после зрительной стимуляции. А - МН коцгрольной рыбки, Б - МН рыбки после аппликации фрагмента АР25.35. Обозначения такие же, что и на рис. 3; МД - медиальный дендрит. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Известно, что зрительная стимуляция (Штанчаев, 2007) интактных рыбок сопровождается уменьшением вентрального дендрита ипсилатерапьного МН. Это же наблюдается и у контрольных рыбок. Значительно уменьшается объем вентрального дендрита ипсилатерапьного МН, из-за чего этот МН и становится функционально доминантным, но в целом один МН от другого отличается не более чем в 1.5 раза.

Анализ структуры МН подопытных рыбок после стимуляции на фоне действия бета-амилоида показывает, что наряду со структурными изменениями вентральных дендритов, наблюдаемых и при действии стимуляции, обнаруживаются и другие изменения, ранее у МН никогда не наблюдавшиеся (рис. 12Б). Размер вентрального дендрита контрапатерального МН уменьшается в 6-7 раз, он истончается. Видна фрагментация латерального дендрита и его атрофия. Кроме этого, наблюдается гипертрофия медиальных дендритов МН, которые становятся в 8-10 раз крупнее (рис. 12Б), чем в контроле, где они в виду малого размера не обращают на себя внимания. Несмотря на то, что функция и афферентные связи гипертрофированных отростков пока остаются неизвестными, можно предположить, что они являются проявлением компенсаторно-приспособительного механизма реорганизации нейрона в ответ на комплексное повреждающее действие амилоида и стимуляции. Структурная асимметрия нейронов усиливается из-за дистрофии ипсилатерального МН, который становится в 3-5 раз меньше контралатерального.

Суммарные объемы МН интактных и контрольных рыбок после зрительной стимуляции достоверно не отличаются. Объемы МН рыбок после аппликации фрагмента Aß2s-35 и зрительной стимуляции сильно меняются в противоположном направлении. У одних суммарные объемы МН гипертрофируются (п=4), у других - сильно уменьшаются (п=4).

Морфометрический анализ данных контрольных рыбок показывает наличие взаимосвязи между моторной асимметрией рыбки и соотношением размеров вентральных дендритов их МН (рис. 13). Она имеет реципрокный характер, что также наблюдается у интактных животных, у которых она была впервые обнаружена (Штанчаев и др., 2007). Оценка взаимосвязи моторной асимметрии рыбок и величины вентральных дендритов их МН после сочетанного воздействия аппликации Aß25-35 и стимуляции выявляет существенное нарушение корреляции. Данные свидетельствуют об аномальном влиянии Aß2s-35 на морфофункциональную организацию МН.

1 2

_____ Рис. 13. Корреляция между

коэффициентами моторной асимметрии рыбок и структурной

____ асимметрии вентрального дендрита

0,45 МН после зрительной стимуляции.

1 - контрольные рыбки (п=10);

--2 - подопытные рыбки (после

аппликации АР25-35; п=8).

Ультраструктурные исследования МН (рис. 14) после сочетанного действия амилоида и стимуляции показывают, что каждый синаптический бутон становится окруженным узким слоем межклеточного пространства, заполненного амилоидом, имеющего вид осмиофильного зернистого материала. Вентральные дендриты МН, подвергнутые стимуляции на фоне действия амилоида, вызывают практически полное запустевание афферентных окончаний. Наблюдается сильное повреждение цитоскелета. Между тем, известно, что при воздействии одной только зрительной стимуляции происходит уплотнение цитоскелета вентрального дендрита МН (Михеева и др., 2011). По-видимому, именно

деструкция этого клеточного органоида является главной причиной значительной дистрофии вентрального дендрита, как, впрочем, и других частей нейрона.

Рис. 14. Ультраструктура части вентрального дендрита МН через 17 час после аппликации фрагмента АР25-35 и последующей стимуляции рыбки. Обозначения такие же, что и на рис. 7. Масштабный отрезок: 0.5 мкм.

: "«л/Г■ * . «Ж

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что травматический эффект аппликации агрегированного фрагмента АР25-35 на МН усугубляется действием сенсорной стимуляции. Наблюдаемые изменения в организации дендритов, не проявляющиеся ранее, позволяют предположить приспособительные реакции нейрона к сочетанию естественного и механического раздражения извне. Наличие агрегатов амилоида, оказывающих непрерывное механическое действие на клетку, мешает ее нормальному функционированию и обусловливает нарушение корреляции между структурой и функцией МН.

3. ВЛИЯНИЕ АДАПТАЦИИ К СЕНСОРНЫМ СТИМУЛЯЦИЯМ НА ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ МН К БЕТА-АМИЛОИДУ

Поскольку амилоидные отложения повреждают структуру нервной клетки, одним из способов предотвратить такое воздействие и уменьшить морфофункциональный эффект бета-амилоида может быть ее укрепление. Известно, что выработка адаптированного состояния с помощью повторяющихся кратковременных сенсорных стимулов (Мошков, 1985), а также использование фармакологически активных веществ, стабилизируют и укрепляют цитоскелет нейронов, в результате чего МН становятся устойчивыми к повреждающим факторам. Мы использовали модель адаптации (воздействие повторяющихся тренировочных сенсорных стимуляций) для исследования возможности индукции резистенции МН к механическому действию амилоида.

После аппликации растворителя (рис. 15) у предварительно адаптированных рыбок не изменяется КМА (0.53±0.02 - до аппликации и 0.53±0.04 - после аппликации, п=20) и функциональная активность МН (7.0±1.2 и 9.0±1.6, соответственно, п=20). Применение вестибулярной стимуляции также не приводит к изменению данных показателей, что свидетельствует о выработки устойчивости рыбок к утомлению (0.52±0.04 и 8.4±1.9, соответственно).

Рис. 15. Изменение коэффициента моторной асимметрии адаптированных рыбок после аппликации веществ. Контрольные рыбки (п=20); подопытные рыбки - после аппликации АР25-35 (п=16). Звездочкой отмечено значение, достоверно отличающееся от аналогичных значений контрольных рыбок. * - р<0.05.

контроль амилоид

до аппликации после аппликации

После аппликации бета-амилоида величина КМА адаптированных рыбок достоверно увеличивается от исходного уровня с 0.54±0.03 до 0.65±0.05 (рис. 15). Функциональная активность МН как после выработки адаптации, так и последующей аппликации амилоида не изменяется и остается высокой (7.8±2.0). После стимуляции функциональные показатели рыбок также не изменяются (КМА 0.63±0.12, функциональная активность МН 7.08±1.6).

Результаты исследования структуры МН после адаптации к вестибулярной стимуляции представлены на рис. 16. У адаптированных рыбок, подвергнутых аппликации растворителя (рис. 16А), наблюдается уменьшение объемов обоих дендритов контралатерапьного МН по сравнению с ипсилатеральным нейроном. Однако сохраняется превышение объема контралатерапьного МН приблизительно в 1.5 раза по сравнению с ипсилатеральным нейроном. В целом структурно они напоминают МН адаптированных рыбок без аппликации каких-либо препаратов и дополнительных стимуляций.

-» . ■

ЛД>25 | С =186 1*- ВД = 43

\ Ек= 254х103цт3

Рис. 16. Реконструированные МН адаптированных рыбок.

А - после аппликации растворителя, Б - после аппликации фрагмента Ар25-35- Обозначения такие же, что и на рис. 3. Масштабный отрезок: 100 мкм.

У адаптированных рыбок, подвергнутых аппликации фрагмента Ар25-35 (рис. 16Б), а затем и проверочной утомляющей вестибулярной стимуляции, также не наблюдается нарушения целостности МН и особых патологических изменений их структуры. Как и в контроле, обнаружено уменьшение объемов обоих дендритов контралатерапьного МН. Отсутствуют медиальные дендриты. У всех подопытных рыбок наблюдается сглаживание соотношения объемов контралатеральных и ипсилатеральных нейронов.

Суммарные объемы МН адаптированных рыбок не изменяются после аппликаций препаратов и утомляющей стимуляции и остаются на уровне 481±55х103мкм3, что подтверждает выработку устойчивости нейронов к воздействиям не только сенсорных стимулов, но и к механическому воздействию.

В ходе гистологического исследования не обнаружено каких бы то ни было дистрофических нарушений структуры МН (рис. 17). Все части нейронов сохраняют форму и размеры, характерные для нейронов контрольных и интактных рыбок.

Рис. 17. Фронтальный гистологический срез МН адаптированной рыбки после аппликации фрагмента АР25-35. А - сома нейрона, Б -вентральный дендрит МН. Стрелкой показаны соответствующие части МН. Масштабный отрезок: 50 мкм.

Анализ морфометрических данных выявляет обратную взаимосвязь между размером вентрального дендрита контралатерального нейрона рыбок как контрольных, так и подопытных, и коэффициентом моторной асимметрии этих рыбок (рис. 18). Чем меньше объем вентрального дендрита нейрона, тем функционально активнее этот нейрон. Аналогичные морфофункциональные данные были получены при использовании утомляющей зрительной стимуляции адаптированных рыбок.

1 2

« г

= я я я

я ч

3 = & *

-0,2 -0,4 -0,6 -0,8

-0,7

-0,77

Рис. 18. Корреляция между коэффициентами моторной асимметрии адаптированных рыбок и структурной асимметрии их МН после аппликации веществ и стимуляции.

1 - контрольные рыбки (п=10);

2 - подопытные рыбки (после аппликации АР25-35; п=10).

Таким образом, в результате экспериментов выявлена устойчивость МН адаптированных рыбок к механическому воздействию амилоида, которая не зависела от модальности сенсорных входов, используемых для индукции адаптации и проверочной утомляющей стимуляции.

4. ВЛИЯНИЕ ДОФАМИНА И Ь-ДОФА НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ МН, ПОДВЕРГНУТЫХ ДЕЙСТВИЮ БЕТА-АМИЛОИДА

4.1. Морфофункциональное исследование МН после аппликации дофамина и агрегированного фрагмента АР25-35

У контрольной группы рыбок после аппликации физраствора и агрегированного фрагмента АР25-35 на МН не происходит изменений величины КМА, но увеличивается функциональная активность МН с 4.04±1.1 до 5.9±1.1 (п=10) (рис. 19). Применение вестибулярной стимуляции приводит к сглаживанию моторной асимметрии и достоверному снижению функциональной активности МН до 2.0±0.9 (п=10, р<0.01).

Рис. 19. Изменение подвижности рыбок после аппликации дофамина и последующего действия фрагмента АР25.35 и вестибулярной стимуляции. * - отмечено значение, достоверно отличающееся от значения до аппликации ДА и - отмечено значение, достоверно отличающееся от значения после сочетанного действия аппликации ДА, АР25-35 и вестибулярной стимуляции (ВС). Уровень достоверности - р<0.05.

до после после

аппликации аппликации аппликации ФР и ДА ФР и ДА АР25-35 после физраствора (ФР)

□ после дофамина (ДА)

Аппликация дофамина на МН интактных рыбок увеличивает величину их КМА (с 0.59±0.05 до 0.68±0.09) и усиливает функциональную активность МН с 4.07±1.02 до 8.4±1.3 (п=10, р<0.01) (рис. 19). Последующая аппликация фрагмента АР25-35 на МН нивелирует КМА (с 0.68±0.09 до 0.52±0.1) и нормализует функциональную активность МН до уровня, соответствующего контрольному (5.05±0.9). После вестибулярной стимуляции КМА и функциональная активность МН не изменяются (0.57±0.15 и 5.06±0.8, соответственно).

Аппликация дофамина не приводит к изменению объемов отдельных частей МН (рис. 20А). Структура нейронов не нарушается, наблюдается сохранение величины суммарных объемов МН и сохраняется структурная асимметрия с преобладанием контралатерального МН над ипсилатеральным. Количественные показатели структурной асимметрии и суммарных объемов соответствуют аналогичным значениям нейронов адаптированных рыбок.

Г - . ■ \

Ч':Глд = 71 I С = 134 | ВД "63

% 268x103рт3

Рис. 20. Реконструированные МН рыбок после аппликации дофамина. А - МН после аппликации дофамина, Б - МН после аппликации дофамина и фрагмента АР25-35, В - МН после аппликации дофамина и сочетанного действия фрагмента АР25.35 и стимуляции. Обозначения такие же, что и на рис. 3. Масштабный отрезок: 100 мкм.

ж «

лд=

С = 94 ВД = 46 1к = 204х103рт3

Л/Ш*

С = 51

= 40

Хи = 146х103рт3

50 = 100

ВД = 23

1и = 173х103рт3

ЛД = 54 С = ВД = 52

1к = 291х103рт3

Аппликация дофамина, а затем фрагмента АР25-35 также не изменяет структуры нейронов, все его отдельные части сохраняются в целостности. Объемы обоих МН незначительно уменьшаются за счет изменения величин их отдельных частей (рис. 20Б). Несмотря на это структурная асимметрия сохраняется в пользу контралатерального нейрона.

Вестибулярная стимуляция нейронов после аппликации дофамина и бета-амилоида не приводит к дистрофическому изменению структуры МН (рис. 20В). Отмечены лишь структурные изменения в дендритах - уменьшаются в длине вентральные дендриты обоих нейронов, и увеличивается порядок ветвлений латеральных дендритов обоих МН. Существенным моментом является отсутствие уменьшения суммарных объемов МН и сохранение структурной асимметрии с преобладанием в размере контралатерального МН.

Таким образом, дофамин оказывает влияние на морфофункциональное состояние МН, похожее на то, которое наблюдается при выработке адаптированного состояния, а именно, способствует повышению устойчивости нейронов к повреждающим факторам. Физиологические параметры рыбок стабильны, структура нейронов не нарушается при

различных видах применяемых воздействий, сохраняется соответствие структурной асимметрии МН и моторной асимметрии рыбок. Исходя из полученных данных, можно предположить, что механизм действия дофамина на МН схож с преобразованиями, происходящими в МН при выработке адаптированного состояния. По-видимому, и в том, и в другом случае цитоскелет нейрона стабилизируется, об этом свидетельствуют данные, ранее полученные в нашей лаборатории (Шубина и др., 2009). В результате МН приобретают способность противостоять негативному механическому воздействию агрегатов амилоида. Кроме того, дофамин, по всей вероятности, дезагрегирует амилоидные образования, о чем, как можно предположить, свидетельствуют эксперименты, проведенные в условиях in vitro, тем самым, снижая влияние механического воздействия амилоида.

4.1.1. Электронно-микроскопическое исследование совместного инкубирования агрегированного фрагмента Ap2s-3s " дофамина in vitro показало, что наблюдается фрагментация протяженных лентовидных фибрилл фрагмента АР25-Л на весьма короткие белковые комплексы длиной около 0.5 мкм и шириной 30-40 нм (рис. 21), несоизмеримые с размерами МН и их дендритов.

Рис. 21. Электронно-микроскопическое изображение агрегированного фрагмента АР25-35 после совместной 3.5 час инкубации с дофамином в концентрации 10"3М. Масштабный отрезок: 0.1 мкм.

4.2. Влияние Ь-ДОФА на морфофункциональные состояния МН, подвергнутых действию фрагмента ЛРа-зз

Чтобы проверить, действительно ли дофамин оказывает укрепляющее воздействие на структуру нейрона благодаря воздействию на цитоскелет или защитное его действие проявляется за счет диссоциации бета-амилоидных агрегатов, мы использовали его предшественник Ь-ДОФА, который опосредованно проникает в область нейронов и воздействует на них.

4.2.1. Морфофункционапъное исследование МН после предварительного выдерживания рыбки в растворе Ь-ДОФА и последующей аппликации фрагмента Л[!25-з$

Предварительное выдерживание рыбок в растворе Ь-ДОФА не изменяет исходной моторной асимметрии рыбок (п=5). При аппликации на МН таких рыбок фрагмента АР25-35 происходит инверсия моторной асимметрии (п=5, р<0.05) (рис. 22А).

до Ь-ДОФА □ после Ь-ДОФА Щ после Ь-ДОФА и Ар25.35

Рис. 22. Изменение показателей моторной активности рыбок после воздействия сначала Ь-ДОФА, а затем фрагмента АР25.35.

А - изменение моторной асимметрии рыбок, Б - изменение функциональной активности МН. Звездочкой отмечены значения, достоверно отличающиеся от значений после воздействия Ь-ДОФА и до аппликации бета-амилоида. р<0.05.

Относительно функциональной активности МН наблюдается тенденция к ее снижению после действия Ь-ДОФА, а после аппликации фрагмента АР25.35 - функциональная активность МН возрастает в 2 раза (р=0.05) (рис. 22Б).

Аппликация бета-амилоида сказывается на структуре МН: происходит уменьшение длины обоих вентральных дендритов и уменьшение их объемов в 7-9 раз; уменьшение длины и ширины обоих латеральных дендритов в 3-4 раза (рис. 23). Соответственно, данные отклонения приводят к уменьшению суммарных объемов обоих нейронов в 3-4 раза по сравнению с суммой объемов контрольных рыбок, что свидетельствует о развившейся дистрофии. Заметно гипертрофируются медиальные дендриты.

Рис. 23. Реконструированные МН рыбки после воздействия Ь-ДОФА и последующей аппликации фрагмента АР25-35.

Обозначения такие же, что и на рис. 3. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Таким образом, после выдерживания рыбок в растворе Ь-ДОФА и аппликации фрагмента Ар25-з5 структурная асимметрия МН сохраняется, но не соответствует моторной асимметрии рыбок. Полученные результаты свидетельствуют о том, что действие Ь-ДОФА имеет кратковременный характер и не приводит к стабилизации структуры нейронов перед аппликацией бета-амилоида, что сопровождается нарушением функциональных и структурных характеристик нейронов. То есть сам дофамин при системном увеличении его концентрации в мозге не защищает МН от последующего повреждающего действия бета-амилоида.

ЛД= 10

С = 40 ВД = 6

2и = 56х103рш3

1к = 130х103

4.2.2. Мир ф о функц и он т ьное исследование МН после аппликации фрагмента А/¡25-15 и последующего выдерживания рыбок в растворе Ь-ДОФА

При аппликации фрагмента АР25-35 значение КМА рыбок уменьшается (п=5). После воздействия Ь-ДОФА на данных рыбок степень их моторной асимметрии возвращается к значениям, характерным для контрольных рыбок до воздействия (рис. 24А). Функциональная активность МН при аппликации бета-амилоида и воздействии Ь-ДОФА сохраняется на уровне, характерном для контрольных рыбок (6.7±1.03) (рис. 24Б).

до ар25.35

□ после АР25-35 Д после АР25.35 и Ь-ДОФА

Рис. 24. Изменение показателей моторной активности рыбок после воздействия фрагмента АР25-35 и Ь-ДОФА.

А - изменение моторной асимметрии рыбок, Б - изменение функциональной активности МН.

Никаких негативных изменений в структуре МН не наблюдается, суммарный объем нейронов остается на уровне значений объемов МН контрольных рыбок и составляет 509х103мкм3 (рис. 25). Сохраняется взаимосвязь между структурной асимметрией МН и моторной асимметрией рыбок.

ЛД = 50 % /

С = 143 ВД=54 -

Хк= '' 247х103цт3

Рис. 25. Реконструированные МН рыбки после аппликации фрагмента АР25.35 и последующего воздействия Ь-ДОФА.

Обозначения такие же, что и на рис. 3. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Полученные данные свидетельствуют о том, что Ь-ДОФА укрепляет структуру МН, стабилизируя и функциональный их параметр - подвижность рыбок, однако действие Ь-ДОФА кратковременно. Таким образом, было обнаружено, что использование Ь-ДОФА приводит к стабилизации функциональных параметров (подвижность рыбок) и структуры МН на фоне аппликации амилоида скорее всего за счет активной диссоциации агрегатов бета-амилоида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что при функционировании организма в нормальных условиях среды поддерживается морфологический гомеостаз нейронов - постоянство пропорций между разными дендритами индивидуальных нейронов разных отделов ЦНС млекогаггающих, например, гиппокампа крыс, коры мозга обезьян (Samsonovich, Asccoli, 2006). Эта закономерность свойственна и просто организованным нейронам низших позвоночных, в частности МН, функциональная асимметрия которых, проявляемая в виде моторной асимметрии золотой рыбки, строго коррелирует с их структурной асимметрией (Михайлова и др., 2005). Естественная стимуляция зрительного и вестибулярного афферентных входов способна изменить и даже вызвать инверсию моторной асимметрии рыбок, но при этом корреляция ее со структурной асимметрией их МН сохраняется (Михайлова и др., 2006; Тирас и др., 2006).

Роль дисфункции нейронов, остающихся живыми при развитии болезни Альцгеймера и находящихся под хроническим воздействием церебральных отложений бета-амилоидных бляшек, остается малоизученной. Предполагается, что одним из механизмов дисфункции мозга человека и высших животных при естественном и экспериментальном амилоидозе может быть дистрофия нейрональных отростков, вызванная сжатиями, растяжениями, изгибом и другими видами механической деформации, испытываемыми центральными нейронами в сенильных бляшках (Knowles et al., 1999; Spires, Hyman, 2004; Morris, Mucke, 2006; Lulevich et al., 2010). Для проверки этого предположения требуются клеточные модели амилоидоза. Таких моделей нет. Недавно разработана модель таупатии на рыбках данио-рерио (Paquet et al., 2009). Однако она пока не позволяет перевести исследования механизмов амилоидоза на клеточный уровень. В нашей работе в качестве модели амилоидоза, гистопатологического свидетеля клинических признаков болезни Альцгеймера (Wolfe, 2006), было использовано прямое воздействие бета-амилоида в остром опыте на МН золотой рыбки. Установлено, что аппликация на МН бета-амилоида вызывает различные дистрофические изменения структуры местного и общего характера, что можно объяснить неконтролируемой лигатурой МН лентами бета-амилоида, которые, как нами было показано, окружают МН и, как оказалось, способны их деформировать. Патология структуры, вследствие местного сжатия или окклюзии дендритов нейронов в условиях in vitro способна приводить к серьезным функциональным сдвигам (Beekker, Hausser, 2007). Подобная картина наблюдается нами ш vivo, например, уменьшение вентрального дендрита, вызванное бета-амилоидом, идентичное эффекту длительной зрительной стимуляции рыбок (Штанчаев и др., 2007). Существенно, что деформация структуры влечет за собой аномалии в поведении, которое можно рассматривать как спровоцированную бета-амилоидом патологию функции. Деструктивный, непредсказуемый эффект амилоида на МН и не согласующаяся с ним «неправильная» функция в виде нарушенной или инвертированной моторной асимметрии можно рассматривать как главные свидетели модельной формы амилоидоза, индуцированного аппликацией бета-амилоида. В целом, можно заключить, что МН являются адекватным объектом для изучения клеточных механизмов амилоидоза.

Нами также установлено, что тренировочные вестибулярные стимуляции, а также аппликация дофамина и увеличение его в мозге с помощью L-ДОФА, существенно повышают морфофункциональную устойчивость МН золотой рыбки к повреждающему действию бета-амилоида и сенсорной стимуляции. Можно было бы предположить, что укрепляющий эффект связан с полимеризацией цитозольного актина дофамином, управляющим МН (Безгина и др., 2006; Михайлова и др., 2006; Тирас и др. 2007; Moshkov et al., 2009). Вместе с тем некоторые детали не согласуются с таким представлением. Так, предшествующая обработка рыбок L-ДОФА не укрепляла МН против бета-амилоида, хотя должна была бы стабилизировать акгиновый цитоскелет. С другой стороны, эффект L-ДОФА вслед за АР25-35 вряд ли объясняется цитоскелетным механизмом, так как амилоидоз уже к

этому времени был ярко выражен. Терапевтический эффект дофамина может быть основан на его способности in vitro дезагрегировать фибриллы бета-амилоида (Li ct al., 2004). Действительно, нами показано, что дофамин in vitro фрагментирует протяженные лентовидные фибриллы АР25.35 на весьма короткие белковые комплексы, несоизмеримые с размерами МН и их дендритов. Диссоциация крупных агрегатов бета-амилоида, по-видимому, существенно снижает травматичность их действия, которое мы рассматриваем как главный механизм патогенеза амилоидоза в нашей модели. В целом, данные предполагают, что работа на клеточной модели амилоидоза, созданной на МН золотой рыбки, может быть полезной при разработке новых подходов к профилактике и терапии заболеваний, связанных с отложением агрегированного белка в мозге.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено, что при аппликации агрегированных фрагментов бета-амилоида (АР;5-з5 и АРз5-:5) на МН развивается дистрофия дендритов и сомы нейронов, приводящая к нарушению их функционального состояния. Показано, что утомляющая сенсорная стимуляция на фоне действия бета-амилоида усиливает деградацию нейронов. Электронно-микроскопическим методом определено, что отложения бета-амилоида плотно окружают и деформируют МН и афферентные синапсы. Полученные данные о структурной патологии МН согласуются с представлением о механическом воздействии на них бета-амилоида.

2. Впервые обнаружено, что под влиянием аппликации агрегированных фрагментов бета-амилоида (АР25.35 и АР35.25) нарушается и исчезает характерная и закономерная для интактных и контрольных рыбок корреляция между функциональной активностью МН, проявляемой в уровне моторной асимметрии рыбки, и величиной структурной асимметрии ее МН.

3. Установлено, что адаптация к тренировочной сенсорной стимуляции разной модальности индуцирует высокую устойчивость МН к патологическому воздействию как бета-амилоида самого по себе, так и в сочетании с утомляющей сенсорной стимуляцией. Обнаружена реципрокная взаимосвязь между моторной асимметрией адаптированных контрольных и подопытных рыбок и размером вентрального дендрита их контралатерального МН.

4. Выявлено, что аппликация дофамина на МН сама по себе и в сочетании с утомляющей сенсорной стимуляцией, а также медикаментозное увеличение уровня дофамина в мозге после развития амилоидоза повышают устойчивость МН к действию бета-амилоида. Это свойство дофамина, по-видимому, вызвано его способностью диссоциировать крупные агрегаты бета-амилоида на короткие фрагменты, выявленной нами in vitro.

5. В целом можно заключить, что МН золотой рыбки являются адекватной клеточной моделью для изучения функциональных и структурных механизмов амилоидоза и для выработки подходов к профилактике, коррекции и терапии нейродегенеративных заболеваний, вызванных амилоидозом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярева Н.Ю., Коканова H.A., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Влияние оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию у золотой рыбки. Нейрофизиология/Neurophysiology. 2007. Т. 39, № 2. С. 133-145.

2. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярева Н.Ю., Коканова H.A., Мошков Д А. Изменения вентрального дендрита маутнеровского нейрона золотой рыбки под воздействием оптокинетической стимуляции. Морфология. 2007. Т. 132, № 6. С. 29-34.

3. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Безгина E.H., Мошков Д А. Морфофункциональные изменения маутнеровских нейронов золотой рыбки после аппликации бета-амилоида. Морфология. 2009. Т. 136, № 6. С. 43-47.

4. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Индукция морфологической устойчивости нейронов к ß-амилоиду. Морфология. 2012. Т. 141, №1. С. 12-16.

Список работ в сборниках научных конференций

1. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Безгина E.H., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Влияние тренировки на развитие экспериментального бета-амилоидоза маутнеровских нейронов. В сб.: Материалы XV Международной конференции по нейрокибернетике. (2325 сентября 2009, Ростов-на-Дону). Т. I. С. 20-23.

2. Мошков Д А., Михайлова Г.З., Григорьева Е.Е., Штанчаев Р.Ш., Коканова H.A. Роль разных дендритов индивидуальных маутнеровских нейронов в управлении моторной асимметрией золотой рыбки. В сб.: Фундаментальные проблемы науки (труды научной сессии НИЯУ МИФИ-2010). (2010, Москва). Т. 3. С. 198-203.

3. Коканова H.A., Цаплина Н.Ю., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш. Влияние тренировочных стимуляций и аппликации экзогенного дофамина на структуру и функцию маутнеровских нейронов с экспериментально индуцированным в них амилоидозом. В сб.: научных трудов XIII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика-2011». (24-28 января 2011, Москва). Ч. 1. С. 226-235.

4. Цаплина Н.Ю., Коканова H.A. Стабилизация структуры маутнеровских нейронов при перекрестной адаптации к сенсорным стимуляциям. В сб.: научных трудов XIII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика-2011». (24-28 января 2011, Москва). С. 217-226.

5. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Роль дофамина в защите структуры и функции нейронов от ß-амилоида. Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». 24-26 мая 2011, Пущино, Россия. Т. 1.С. 119-125.

Список тезисов

1. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярева Н.Ю., Коканова H.A. Разработка подхода к индукции реверсии моторной асимметрии золотых рыбок с помощью специфической зрительной стимуляции. В сб.: «Фундаментальная наука и клиническая медицина». X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье». 20-21 апреля 2007, Санкт-Петербург, Россия. С. 529-530.

2. Тирас Н.Р., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Коканова H.A., Мошков Д.А. Взаимодействия бета-амилоида с маутнеровскими нейронами. XX съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. 4-8 июня 2007, Москва, Россия. С. 443.

3. Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Коканова H.A., Дектярева Н.Ю., Мошков Д А., Тирас Н.Р. Морфофункциональное исследование асимметрии правого и левого маутнеровских нейронов золотой рыбки при экспериментально индуцированной болезни Альцгеймера

III Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 12-20 июня 2007, Судак, Украина. С. 163-164.

4. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярева Н.Ю., Коканова H.A., Мошков ДА. Морфофункциональное исследование вентрального и латерального дендритов при экспериментально индуцированных изменениях асимметрии правого и левого маутнеровских нейронов золотой рыбки. III Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 12-20 июня 2007, Судак, Украина. С. 271-272.

5. Мошков ДА., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Коканова H.A., Дектярева Н.Ю. Структурные механизмы поддержания гомеостаза функционального состояния маутнеровских нейронов золотой рыбки. В сб.: Нейронауки: теоретичш та клппчш аспекта. IX Международная конференция «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы». 23-25 мая 2007, Донецк, Украина. Т. 3, № 1. С. 27.

6. Дектярева Н.Ю., Коканова H.A., Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З. Изучение морфологии вентрального дендрита маутнеровских нейронов золотых рыбок в норме и после выполнения ими оптомоторной реакции. 11-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия. С. 242.

7. Коканова H.A., Дектярева Н.Ю., Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З. Маугнеровские нейроны как объекты для изучения структурных изменений клеток при моделировании болезни Альцгеймера. 11-ая Международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино, Россия. С. 253.

8. Дектярева Н.Ю., Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш. Влияние определенных режимов адаптации к контралатеральной оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию мальков золотых рыбок. В сб.: «Фундаментальная наука и клиническая медицина». XI Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье». 19 апреля 2008, Санкт-Петербург, Россия. С. 100-101.

9. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Изменения функционального состояния и структуры маутнеровских нейронов при аппликации бета-амилоида. В сб.: «Нейронауки: теоретичш та клЫчш аспекта». IV конференция Украинского общества нейронаук. 9-12 июня 2008, Донецк, Украина. Т. 4,№ 1. С. 32-33.

10. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Маугнеровские нейроны золотой рыбки как объект для изучения клеточных механизмов экспериментально индуцированной болезни Альцгеймера. Четвертый Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 10-20 июня 2008, Судак, Украина. С. 154-155.

11. Коканова H.A. Разработка клеточной модели болезни Альцгеймера на примере экспериментального бета-амилоидоза маутнеровских нейронов золотой рыбки. Конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика '09». 20-21 октября 2009, Пущино, Россия. С. 28-30.

12. Коканова H.A. Приспособление к стрессу вынуждает нейроны на борьбу с неблагоприятными факторами. 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 19-23 апреля 2010, Пущино, Россия. Т. 1. С. 140-141.

13. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш. Создание клеточной модели бета-амилоидоза на маутнеровских нейронах золотой рыбки. III Всероссийский, с международным участием, конгресс студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010». 24-28 мая 2010, Нижний Новгород, Россия. С. 173-174.

14. Коканова H.A. Новый подход к профилактике и терапии амилоидозов. Конференция «Экспериментальная и теоретическая биофизика '10». 19-20 октября 2010, Пущино, Россия. С. 21-22.

15. Коканова H.A. Способы индукции морфофункциональной устойчивости нейронов к ß-амилоиду. 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». 18-22 апреля 2011, Пущино, Россия. С. 156.

16. Коканова H.A., Михайлова Г.З. Нейрональная модель амилоидоза и разработка новых подходов для его терапии. VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 3-13 июня 2011, Судак, Украина. С. 221.

Работа выполнена при поддержке грантов НШ № 217.2008.4; РФФИ № 09-04-00451а, и

Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной

России», ГК№ 02.740.11.0301.

Подписано в печать:

28.10.2011

Заказ № 6139 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коканова, Надежда Александровна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Амилоид, его природа и свойства.

1.1.1. Фрагменты бета-амилоидного пептида.

1.1.2. Агрегация бета-амилоидного пептида.

1.2. Механизмы действия бета-амилоида на клетку.

1.2.1. Оксидативный стресс.

1.2.2. Митохондрии.

1.2.3. Кальциевый гомеостаз.

1.2.4. Механическое действие агрегатов бета-амилоида на физические свойства мембран.

1.2.5. Действие бета-амилоида на дендриты и синапсы.

1.3. Способы защиты нейронов от действия бета-амилоида.

1.3.1. Компенсаторная терапия.

1.3.2. Подходы, основанные на использовании антиоксидантов и белков теплового шока.

1.3.3. Вещества, влияющие на структуру бета-амилоида.

1.4. Модели для изучения действия бета-амилоида.

1.5. Преимущества маутнеровских нейронов как модели для изучения действия бета-амилоида на клетку.

1.5.1. Взаимосвязь между структурой и функцией маутнеровских нейронов в норме.

1.5.2. Структурные перестройки маутнеровских нейронов при экспериментальных воздействиях.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования.^

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Тестирование моторной асимметрии золотых рыбок.

2.2.2. Вестибулярная билатеральная стимуляция.

2.2.3. Зрительная стимуляция.

2.2.4. Схема выработки адаптированного состояния маутнеровских нейронов золотых рыбок.

2.2.5. Фармакологические воздействия.

2.2.6. Приготовление ткани мозга для гистологического изучения.

2.2.7. Приготовление парафиновых срезов мозга для гистохимического окрашивания.

2.2.8. Методика трехмерной реконструкции маутнеровских нейронов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование агрегированного фрагмента Ар25-35 in vitro и влияние его аппликации на МН.

3.1.1. Электронно-микроскопическая идентификация амилоида.

3.1.2. Изучение связи структуры и функции МН при аппликации агрегированного фрагмента Ар25-35.

3.2. Влияние сенсорных стимуляций на функциональную активность МН и структуру их отдельных компонентов после аппликации фрагмента АР25-35.

3.2.1. Морфофункциональное исследование МН после аппликации агрегированного фрагмента А(325-35 и вестибулярной стимуляции.

3.2.2. Морфофункциональное исследование МН после аппликации агрегированного фрагмента АР25-35 и зрительной стимуляции.

3.3. Влияние фрагмента бета-амилоида с обратной последовательностью (АР35.25) на морфофункциональные характеристики МН.

3.3.1. Электронно-микроскопическая идентификация фрагмента Ар3 5.25.д g

3.3.2. Морфофункциональное исследование МН после аппликации фрагмента А(Зз525.

3.4. Исследование устойчивости МН рыбок, адаптированных к длительной стимуляции, к амилоидозу.

3.4.1. Морфофункциональное исследование МН адаптированных к вестибулярной стимуляции рыбок после аппликации фрагмента А(325-з5 и утомляющей вестибулярной стимуляции.

3.4.2. Морфофункциональное исследование МН адаптированных к зрительной стимуляции рыбок после аппликации фрагмента А{325-35 и утомляющей зрительной стимуляции.

3.4.3. Морфофункциональное исследование МН адаптированных к вестибулярной стимуляции рыбок после аппликации фрагмента АР25-35 и утомляющей зрительной стимуляции.

3.5. Влияние дофамина на морфофункциональные состояния

МН, подвергнутых действию фрагмента АР25.35.

3.5.1. Электронно-микроскопическое исследование совместного инкубирования агрегированного фрагмента А(325и дофамина in vitro.

3.5.2. Морфофункциональное исследование МН после аппликации дофамина и агрегированного фрагмента АР25-35.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение взаимосвязи структуры и функции маутнеровских нейронов золотой рыбки при действии амилоида"

Болезнь Альцгеймера клинически проявляется прогрессирующей потерей памяти и деградацией личности, а гистопатологически характеризуется церебральным амилоидозом, внеклеточным локальным отложением в виде сенильных бляшек полимерного волокнистого бета-амилоидного белка (Mattson, 2004; Преображенская, Яхно, 2006). На генетически предрасположенных к амилоидозу животных показано, что образование бляшек приводит к патологии мозга. Нейриты, которые проходят через отложения амилоида, изменяют свою форму и размеры (Knowles et al., 1999). Образование амилоидных отложений приводит к дистрофии дендритов, аксонов, дендритных шипиков и афферентных шипиковых и стволовых синапсов, индуцирует появление внутри нейронов нейрофибриллярных клубков (Luebke et al., 2010). Такие нейрональные повреждения, по-видимому, инициируются взаимодействием между разными формами бета-амилоида (олигомеры или фибриллы) и мембранами клеток (Talaga et al., 2002; Verdier et al., 2004). Бета-амилоидные структуры способны увеличивать механическую жесткость нейрональных мембран (Lulevich et al., 2010), что, вероятно, приводит к изменению электрической« проводимости дендритов, задержка которой на миллисекунды может нарушать электрофизиологические свойства нейронов, ухудшать состояние слаженно работающей нейрональной сети и когнитивные процессы в мозге (Halpain et al., 2005; Meyer-Luehmann et al., 2008). Кроме того, такое изменение физических свойств мембран может обуславливать нарушение компенсаторно-приспособительных реакций« нейронов на приток сенсорных стимулов извне (Hoffmann et al., 2009), что в конечном итоге может вызывать гибель клеток. Остается неизвестным, что происходит с индивидуальными нейронами, продолжающими функционировать в условиях хронического амилоидоза. Понимание того, как изменяется структура и функция индивидуальных нейронов при повреждающем действии на них амилоидных отложений необходимо для выработки подходов к профилактике, коррекции и терапии нейродегенеративных изменений при деменции. Известные ограничения при работе на целостном мозге требуют создания адекватных модельных систем, на которых можно детально исследовать аспекты данной проблемы. Однако почти все разработанные в настоящее время модели амилоидоза (генетические, аппликационные, спорадические, комплексные) хороши для работы на системном уровне (Степаничев и др., 2002; Spires, Hyman, 2005; Paquet et al., 2009; Муганцева, Подольский, 2009; Бобкова, 2010; Kamynina et al., 2010). Для изучения клеточных механизмов нейродегенеративных заболеваний, вызванных амилоидозом, они не могут быть использованы. Поэтому создание адекватной клеточной формы амилоидоза с использованием идентифицированных нейронов остается актуальной задачей нейробиологии.

Целью настоящей работы было комплексное исследование влияния бета-амилоида на морфофункциональную организацию индивидуальных нейронов, а также поиск агентов, индуцирующих в нейронах устойчивость к бета-амилоиду.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создать адекватную клеточную нейрональную модель экспериментального амилоидоза, используя для этого морфофункциональные свойства идентифицированных маутнеровских нейронов золотой рыбки и аппликацию на них агрегированного бета-амилоида;

2. Исследовать морфофункциональное состояние маутнеровских нейронов рыбок на фоне развивающегося амилоидоза;

3. Изучить влияние адаптации к сенсорным стимуляциям как физиологической модели повышения устойчивости маутнеровских нейронов к бета-амилоиду;

4. Изучить влияние дофамина и L-ДОФА на морфофункциональное проявление амилоидоза на уровне нейронов.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Коканова, Надежда Александровна

выводы

1. Впервые выявлено, что при аппликации агрегированных фрагментов бета-амилоида (АР25-35 и АР35.25) на МН развивается дистрофия дендритов и сомы нейронов, приводящая к нарушению их функционального состояния. Показано, что утомляющая сенсорная стимуляция на- фоне действия бета-амилоида усиливает деградацию нейронов. Электронно-микроскопическим методом определено, что отложения бета-амилоида^ плотно окружают и деформируют МН и афферентные синапсы. Полученные данные о структурной патологии МН согласуются с представлением о механическом воздействии на них бета-амилоида.

2. Впервые обнаружено, что под влиянием аппликации агрегированных фрагментов бета-амилоида (А{325-з5 и АР35.25) нарушается и исчезает характерная и закономерная для интактных и контрольных рыбок корреляция между функциональной активностью МН, проявляемой в уровне моторной асимметрии рыбки, и величиной структурной асимметрии ее МН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коканова, Надежда Александровна, Пущино

1. Арушаняю Э:Б., Бейер Э.В. Гиппокамп и нарушения познавательной деятельности//Ж. неврологии и психиатрии. 2007. Т. 7. С. 72-77.

2. Бачурин С.О. Медико-химические подходы к направленному поиску препаратов для лечения и предупреждения болезни Альцгеймера // Вопросы медицинской химии. 2001. Т. 47, № 2. С. 155-197.

3. Бачурин С.О., Шевцова Е.Ф. Направленный поиск лекарственных препаратов для лечения болезни Альцгеймера и; родственных нейродегенеративных заболеваний // Технологии живых систем: 2010. Т. 7, № 1. С. 12-18.

4. Беляева Н.Ф., Каширцева В.Н., Медведева Н.В., Худоклинова Ю.Ю., Платова О.М.,. Арчаков А.И. Зебрафиш как модель в биомедицинских исследованиях // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56, вып. Г. С. 120-131.

5. Виноградова О.М. Первичный и генетические варианты амилоидоза. М: Медицина, 1980. 224 с.

6. Вишневская А.Б., Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д. Нейродегенеративные амилоидозы: дрожжевая модель // Молекулярная биология. 2007. Т. 41, № 2. С. 346-354.

7. Григорьева Е.Е. Роль дендритов в регуляции функциональной активности маутнеровских нейронов. Автореф. дис. . канд. биол. наук. Пущино, 2011. 20 с.

8. Григорьева Е.Е., Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Корреляция размеров отдельных частей маутнеровского нейрона золотой рыбки с его интегральной функцией после энуклеации глаза // Морфология. 2010. Т. 138, № 6. С. 10-15.

9. Гуляева Н.В., Степаничев М.Ю., Лазарева H.A., Моисеева Ю.В., Онуфриев М.В. Изменения пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне мозга у взрослых крыс при введении бета-амилоидного пептида (25-35) // Морфология. 2009. № 1. С. 13-16.

10. Дектярева Н.Ю., Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Мошков Д.А. Стабилизация моторной асимметрии у золотой рыбки под влиянием оптокинетической стимуляции // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2008. Т. 40, №3. С. 211-220.

11. Захарова Е.В., Хрыкина A.B., Проскурнева Е.П., Варшавский В.А. Случай первичного амилоидоза: трудности диагностики и лечения, // Нефрология и диализ. 2002. Т. 1. С. 54-61.

12. Каминский Ю.Г., Косенко Е.А. Популярно и не очень о болезни Альцгеймера. М.: Либроком, 2009. 136 с.

13. Коканова H.A., Михайлова Г.З., Штанчаев Р.Ш., Тирас Н.Р., Безгина E.H., Мошков Д.А. Морфофункциональные изменения маутнеровских нейронов золотой рыбки после аппликации ß-амилоида // Морфология. 2009. Т. 136, №6. С. 43-47.

14. Коршунова Т.А., Самарова Е.И., Браваренко Н.И., Балабан П.М. Влияние ß-амилоида (25-35) на обучение у виноградной улитки // Журн. высш. нерв. деят. 2007. Т. 57, № 2. С. 229-236.

15. Мавлютов Т. А. Ультраструктурные исследования роли гладкого ретикулума в утомлении нейронов и в адаптации к нему. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Пущино, 2000. 16 с.

16. Мамалыга M.JL, Гуркин A.A. Роль моноаминергических систем ЦНС в формировании адаптивных перестроек в организме // Успехи современного естествознания. 2006. № 2. С. 17-19.

17. Михайлова Г.З., Арутюнян A.B., Санталова И.М., Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Асимметрия моторного поведения золотой рыбки в узком канале // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2005а. Т. 37, № 1. С. 52-60.

18. Михайлова Г.З., Павлик В.Д., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Корреляция размеров маутнеровских нейронов с предпочтением золотых рыбок поворачиваться вправо или влево // Морфология. 20056. Т. 37, № 1. С. 52-60.

19. Михайлова Г.З., Тирс Н.Р., Григорьева Е.Е., Мошков Д.А. Изменения моторной асимметрии золотой рыбки при адаптации к эффектам ротационной стимуляции // Нейрофизиология/Neurophysiology. 2005в. Т. 37, № 5/6. С. 432-442.

20. Михеева И.Б., Тирас Н.Р., Мошков Д.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В. Десмосомоподобные контакты как мишени действия яда скорпиона // Цитология. 2000. Т. 42, № 7. С. 635-646.

21. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука, 1985. 200 с.

22. Муганцева Е.А. Исследование пространственной памяти и спектрально-корреляционных характеристик ЭЭГ гиппокампа и фронтальной коры на модели болезни Альцгеймера. Автореф. дне. . канд. биол. наук. Пущино, 2010. 24 с.

23. Муганцева Е.А., Подольский И.Я. Индивидуальные различия пространственной памяти, вызванные действием ß-амилоидного пептида (25-35) у крыс //Журн. высш. нерв. деят. 2009. Т. 59, № 5. С. 609-614.

24. Павлик JI.JL, Безгина Е.С., Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Удальцов С.Н., Мошков Д.А. Структура смешанных синапсов маутнеровских нейронов при воздействии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов // Морфология. 2004. Т. 125, № 2. С. 26-31.

25. Павлик JLJL, Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Актин в маутнеровских нейронах золотых рыбок после действия фаллоидина и адаптации к длительной стимуляции // Цитология. 1997. Т. 39, № 12. С. 1109-15.

26. Павлик JI.JL, Тирас Н.Р., Пахотина И.Д., Мошков Д.А. Влияние цитохалазина Д на структуру смешанных синапсов и их электротоническую проводимость // Цитология. 1999. Т. 41, № 7. С. 590-597.

27. Парнышкова Е.Ю., Лавровская В.П., Безгина E.H., Павлик JI.JI., Лежнев Э.И., Мошков Д.А. Морфологические основы влияния дофамина нажизнеспособность опухолевых клеток НЕр-2 // Морфология. 2011. Т. 140, № 6. С. 10-14.

28. Подлубная З.А., Подольский И.Я., Шпагина М.Д., Марсагишвили Л.Г. Электронно-микроскопическое изучение влияния фуллерена на формирование амилоидных фибрилл Абета 25-35 пептидом // Биофизика. 2006. Т. 51. С. 795-798.

29. Подольский И.Я., Подлубная З.А., Годухин О.В. Фуллерены Сбо, антиамилоидное действие, мозг и когнитивные процессы // Биофизика. 2010. Т. 55, вып. 1. С. 88-94.

30. Преображенская И.С., Яхно H.H. Болезнь Альцгеймера: клиника, патогенез, лечение // Русский медицинский журнал. 2006. Т. 14, № 4. С. 641652.

31. Проссер Л. Сравнительная физиология животных. М.: Мир, 1978. Т. 13.

32. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 6. С. 4-10.

33. Степаничев М.Ю., Лазарева H.A., Онуфриев М.В., Митрохина О.С., Моисеева Ю.В., Гуляева Н.В. Влияние введения фрагмента (25-35) бета-амилоидного пептида на поведение крыс // Журн. высш. нерв. деят. 1997. Т. 47, № 3. С. 597-600.

34. Степаничев М.Ю., Моисеева Ю.В., Гуляева Н.В. «Инъекционные» модели болезни Альцгеймера: окислительный стресс в механизме токсичности AF64A и ß-амилоидного пептида у грызунов // Нейрохимия. 2002. Т. 19, №3. С. 165-175.

35. Тирас Н.Р., Михайлова Г.З., Мошков Д.А. Эффекты, вызываемые полимеризующим актин пептидом в маутнеровских нейронах золотой рыбки. Нейрофизиология/Neurophysiology. 2006. Т. 38, № 5/6. С. 389-400.

36. Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Пахотин П.И., Мошков Д.А., Удальцов С.Н. Морфофункциональные изменения инкубированных маутнеровских нейронов золотых рыбок под влиянием пептидов из яда скорпиона. Морфология. 2003а. Т. 123, № 3. С. 40-45.

37. Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на Маутнеровские нейроны золотой рыбки // Эволюц. биохимии и физиологии. 1978. Т. 39, № 5. С. 486490.

38. Тирас Н.Р., Потемкин В.В., Мошков Д.А. Действие каиновой кислоты на Маутнеровские нейроны адаптированных и неадаптированных рыб. Цитология. 1990. Т. 32, № 8. С. 795-800.

39. Тирас Н.Р., Удальцов С.Н., Михайлова Г.З., Мошков Д.А. Выявление с помощью электронной микроскопии в яде скорпиона пептидов, взаимодействующих с актином // Биол. Мембраны. 20036. Т. 20, № 1. С. 7276.

40. Черноситов A.B., Орлов В.И. Функциональная асимметрия мозга и неспецифическая резистентность // В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия; под ред. В.Ф. Фокина. М.: Научный мир, 2004. С. 444-480.

41. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярёва Н.Ю., Коканова H.A., Мошков Д.А. Изменения вентрального дендрита маутнеровского нейрона золотой рыбки под воздействием оптокинетической стимуляции // Морфология. 2007а. Т. 132, № 6. С. 29-34.

42. Штанчаев Р.Ш., Михайлова Г.З., Дектярёва Н.Ю., Коканова Н.А., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Влияние оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию у золотой рыбки. Нейрофизиология / Neurophysiology. 20076. Т. 39, № 2. С. 133-145.

43. Шубина B.C., Лавровская В.П., Безгина Е.Н., Павлик Л.Л, Мошков Д.А. Цитохимическая и ультраструктурная характеристика клеток ВНК-21, подвергнутых воздействию дофамина // Морфология. 2010. Т. 137, № 1. С. 59.

44. Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., Черноусова Н.И. Природные антиоксиданты надежная защита человека от опасных болезней и старения. М.: НПО «Химавтоматика», 2008. 122 с.

45. Aksenov M.Y., Aksenova M.V., Butterfield D.A., Geddes J.W., Markesbery W.R. Protein oxidation in the brain in Alzheimer's disease // Neuroscience. 2001. V. 103. P. 373-383.

46. A1 Habori M., Raman A., Lawrence M.J., Skett P. In vitro effect of fenugreek extracts on intestinal sodium-dependent glucose uptake and hepatic glycogen phosphorylase A // Int. J. Exp. Diabetes Res. 2001. V. 2. P. 91-99.

47. Bekkers J.M., Hausser M. Targeted dendrotomy reveals active and passive contributions of the dendritic tree to synaptic integration and neuronal output // PNAS USA. 2007. V. 104, No. 27. P. 11447-52.

48. Blanchard B.J., Konopka G., Russell M., Ingram V.M. Mechanism and prevention of neurotoxicity caused by beta-amyloid peptides: relation to Alzheimer's disease // Brain Res. 1997. V. 776, No. 1-2. P. 40-50.

49. Bush A.I. The metallobiology of Alzheimer's disease // Trends in Neuroscience. 2003. V. 26, No. 4. P. 207-214.

50. Canevari L., Clark J.B., Bates T.E. Beta-amyloid fragment 25- 35 selectively decreases complex IV activity in isolated mitochondria // FEBS Lett. 1999. V. 457. P. 131-134.

51. Castegna A., Thongboonkerd V., Klein J.B., Lynn B., Markesbery W.R., Butterfield D.A. Proteomic identification of nitrated proteins in Alzheimer's disease brain // J Neurochem. 2003. V. 85. P. 1394-1401.

52. Cetin F., Dinger. The effect of intrahippocampal P-amyloid peptide injection on oxidant and antioxidant status in rat brain. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007. V. 1100. P. 510-517.

53. Chagnon P., Betard C., Robitaille Y., Cholette A., Gauvreau D. Distribution of brain cytochrome oxidase activity in various neurodegenerative diseases // NeuroReport. 1995. V. 6. P. 711-715.

54. Chapman M., Robinson L., Pinkner J., Roth R., Heuser J., Hammar M.,

55. Normark S., Hultgren S. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation// Science. 2002. V. 295. P. 851-855.

56. Cirrito J.R., Kang J.E., Lee J. Endocytosis is required for synaptic activity-dependent release of amyloid-beta in vivo //Neuron. 2008. V. 58. P. 42-51.

57. Delobette S., Privat A., Maurice T. In vitro aggregation facilities beta-amyloid peptide-(25-35)-induced amnesia in the rat // Eur. J. Pharmacol. 1997. V. 319. P. 1-4.

58. Demuro A., Mina E., Kayed R., Milton S.C., Parker I., Glabe C.G. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers // J. Biol. Chem. 2005. V. 280, No. 17. P. 294-300.

59. Diamond-J. The Mauthner cell // In: Fish physiology N.Y.; Acad. Press. 1971. V. 5. P. 265-346.

60. Ding Q., Dimayuga E., Keller J.N. Oxidative damage, protein synthesis, and protein degradation in Alzheimer's disease // Current Alzheimer Research. 2007. V. 4. P. 73-79.

61. Dobson C.M. Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24. P. 329-332.

62. Dyrks T., Dyrks E., Masters C.L., Beyreuther K. Amyloidogenicity of rodent and' human beta A4 sequences // FEBS Lett. 1993. V. 324, No. 2. P. 231236.

63. Fallgatter A.J., Roesler M., Sitzmann« L., Heidrich A., Mueller T.J., Strik W.K. Loss of functional hemispheric asymmetry in Alzheimer's dementia assessed with near-infrared spectroscopy // Cognitive Brain Res. 1997. V. 6. P. 67-72.

64. Gadad B.S., Britton G.B., Rao K.S. Targeting oligomers in neurodegenerative disorders: lessons from a-synuclein, tau, and amyloid-p peptide // J. Alzheimers Dis. 2011. V. 24, suppl. 2. P. 223-232.

65. Ghiso J., Shayo M., Calero M., Ng D., Tomidokoro Y., Gandy S., Rostagno A., Frangione B. Systemic catabolism of Alzheimer's Abeta40 and Abeta42 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 45897-908.

66. Goedert M. The significance of Tau and alpha-synuclein inclusions in neurodegenerative diseases // Curr. Opin. Genet. Dev. 2001. V. 11. P. 343-351.

67. Gouras G.K., Tampellini D., Takahashi R.H., Capetillo-Zarate, E. Intraneuronal beta-amyloid accumulation and synapse pathology in Alzheimer's disease // Acta Neuropathol. 2010. V. 119, No. 5. P. 523-541.

68. Green K.N., Peers C. Amyloid beta peptides mediate hypoxic augmentation of Ca(2+) channels // J. Neurochem. 2001. V. 77, No. 3. P. 953-956.

69. Grurzlender J., Helmin K., Tsai J., Gan W.B. Various dendritic abnormalities are associated with fibrilar amyloid deposits in Alzheimer's disease //Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007. V. 1097. P. 30-39.

70. Halpain S., Spencer K., Graber S. Dynamics and pathology of dendritic spines // Prog. Brain Res. 2005. V. 147. P. 29-37.

71. Hardy J-., Allsop D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease//Trends. Pharmacol. 1991. V. 12, No. 10. P. 383-388.

72. Ho R., Ortiz D., Shea T.B. Amyloid-beta promotes calcium influx and neurodegeneration via stimulation of L voltage-sensitive calcium channels rather than NMDA channels in cultured neurons // J. Alzheimers Dis. 2001. V. 3, No. 5. P. 479-483.

73. Hoffmann E.K., Lambert I.H., Pedersen S.F. Physiology of cell volume regulation in vertebrates // Physiol. Rev. 2009. V. 89, No. 1. P. 193-277.

74. Hsieh H., Boehm J., Sato C., Iwatsubo T., Tomita T., Sisodia S., Malinow R. AMPAR removal underlies Abeta-induced synaptic depression and dendritic spine loss //Neuron. 2006. V. 52. P. 831-843.

75. Huang H.M., Ou H.C., Hsieh S.J. Antioxidants prevent amyloid peptide-induced apoptosis and alteration of calcium homeostasis in cultured cortical neurons // Life Sci. 2000. V. 66, No. 19. P. 1879-92.

76. Huang Y., Wu L., Xu C., Yang B., Wang R. Increased HO-1 expression and decreased iNOS expression in the hippocampus from adult spontaneously hypertensive rats // Cell Biochem. Biophys. 2006. V. 46. P. 35-42.

77. Kasparovä J., Lisa V., Tucek S., Dolezal V. Chronic exposure of NG108-15 cells to amyloid beta peptide (A beta(l-42)) abolishes calcium influx via N-type calcium channels//Neurochem. Res. 2001. V. 26, No. 8-9. P. 1079-84.

78. Klein W.L., Krafft G.A., Finch C.E. Targeting small Abeta oligomers: the solution to an Alzheimer's disease conundrum? // Trends Neurosci. 2001. V. 24, No. 4. P. 219-224.

79. Knowles R.B., Wyart C., Buldyrev S.V., Cruz L., Urbane B., Hasselmot

80. M.E., Stanley H.E., Hyman B.T. Plaque-induced neurite abnormalityes: Implications for disruption of neural networks in Alzheimer's disease // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96, No. 9. P. 5274-79.

81. Kolaeva S.G., Semenova T.P., Santalova I.M., Moshkov D.A., Anoshkina I.A., Golozubova V. Effects of L-thyrosyl-L-arginine (kyotorphin) on the behavior of rats and goldfish // Peptides. 2000. V. 21, No. 9. P. 1331-36.

82. Korichneva I., Hammerking' U. F-actin as a functional target for retro-retinoid: a potential role in antidroretinol triggered cell deth // J. Cell Sei. 1999. V.112, No. 2521. P. 25-28.

83. Korn H., Faber D.S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making? // Neuron. 2005. V. 47, No. 1. P. 1328.

84. Kremer J.J., Pallitto M.M., Sklansky D .J., Murphy R.M. Correlation of beta-amyloid aggregate size and hydrophobicity with decreased bilayer fluidity of model membranes // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 10309-318.

85. Kumar S., Faber D.S. Plasticity of first-order sensory synapses: Interactions between homosynaptic long-term potentiation and hetorosynaptically evoked dopaminergic potentiation // J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 1620-35.

86. Lacor P.N., Buniel M.C., Chang L. Synaptic targeting by Alzheimers-related amyloi beta oligomers // J. Neurosci. 2004. V. 24. P. 10191-200.

87. Lai R., Lin H., Quist A.P. Amyloid beta ion channel: 3D structure and relevance to amyloid channel paradigm // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. V. 1768. P. 1966-75.

88. Lang F. Mechanisms and significance of cell volume regulation // J. American College of Nutrition. 2007. V. 26, No. 5. P. 613-623.

89. Li J., Zhu M., Manning-Bog A.B., Di Monte D.A., Fink A.L. Dopamine and L-dopa disaggregate amyloid fibrils: implications for Parkinson's and Alzheimer's disease // FASEB J. 2004. V. 18, No. 9. P. 962-964.

90. Lim G.P., Russel M.J., Cullen M.J., Tokes Z.A. Matrix metalloproteinasesin dog brains exhibiting Alzheimer-like characteristics // J. Neurochem. 1997. V. 68, No. 4. P. 1606-11.

91. Lin H., Bhatia R., Lai R. Amyloid P protein forms ion channels: implications for Alzheimer's disease pathophysiology // FASEB J. 2001. V. 15. P. 2433-44.

92. Lulevich V., Zimmer C.C., Hong H., Jin L., Liu G. Single-cell mechanics provides a sensitive and quantitative means for probing amyloid-(3 peptide and neuronal cell interactions // PNAS. 2010. V. 107, No. 31. P. 13872-77.

93. Makin O.S., Serpell L.C. Structures for amyloid fibrils // FEBS J. 2005. V. 272, No. 23. P. 5950-61.

94. Makovitzky J. George Romhanyi (1905-1991): pioneer in amyloid researchthand polarization microscopy, on the 100 anniversary of his birth // Amyloid. 2005. V. 12, No. 4. P. 251-257.

95. Maltsev A.V., Bystryak S.,Galzitskaya O.V. The role of p-amyloid peptide in neurodegenerative diseases // Ageing Res. Rev. 2011. V. 10, No. 4. P. 440-452.

96. Mattson M. Pathways toward and away from Alzheimer's disease // Nature.2004. V. 430. P. 631-638.

97. Maurice T., Lockhart B.P., Privat A. Amnesia induced in mice by centrally administered beta-amyloid peptides involves cholinergic dysfunction // Brain Res. 1996. V. 706. P. 191-193.

98. Mauthner L. Untersuchungen über den Bau des Ruckenmarks der Fishe // S. Ber. Akad. Wiss. Wien. 1859. No. 34. P. 31-36.

99. Mecocci P., MacGarvey U., Beal M.F. Oxidative damage to mitochondrial DNA is increased in Alzheimer's disease // Ann. NeuroK 1994. V. 36. P. 747-751.

100. Meyer-Luehmann M., Spires-Jones T.L., Prada C., et al, Rapid appearance and local toxicity of amyloid-ß plaques in a mouse model'of Alzheimer's disease // Nature. 2008. V. 451, No. 7. P. 720-725.

101. Mintz I., Gotow T., Triller A., Korn H. Effect of serotonergic afférents on quantal release at central inhibitory synapses // Science. 1989. V. 245, No. 4914. P. 190-192.

102. Moshkov D. A., Tiras N. R., Saxon M.E. Ye. Phalloidin changes the synaptic contacts ultrastructure // Naturwissenschaften. 1980. No. 67. P. 194-195'.

103. Moshkov D.A., Saveljeva L.N., Yanjushina G.V., Funtikov V.A. Structural and neurochemical changes in the cytoskeleton of the goldfish Mauthner cells at different functional states // Acta Histochem. 1992. V. 41. P. 241-247.

104. Mückle T.J. Protein components of amyloid // Nature. 1964. V. 203. P. 773774.

105. Muralikrishnan D., Mohanakumar K.P. Neuroprotection by bromocriptine against l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine-induced neurotoxicity in mice // FASEB J. 1998. V. 12, No. 10. P. 905-912.

106. Murphy M.P., LeVine H. Alzheimer's disease and the amyloid-beta peptide //J. Alzheimers Dis. 2010. V. 19, No. 1. P. 311-323:

107. Pereda A.E., Triller A., Korn H., Faber D.S. Dopamin enhances both electrotonic coupling and chemical excitatory postsynaptic potential at mixed synapses // PNAS USA. 1992. V. 89. P. 12088-92.

108. Petkova A.T., Buntkowsky G., Dyda F., Leapman R.D., Yau W.M., Tycko R. Solid state NMR reveals a pH-dependent antiparallel beta-sheet registry in fibrils formed by a beta-amyloid peptide // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 247-260.

109. Picard J.J. Utrastructure of the cement gland of Xenopus laevis // J. Morphol. 1976. V. 148, No. 2. P. 193-208.

110. Preuss T., Faber D.S. Central cellular mechanisms underlying temperature-dependent changes in the Goldfish startle-escape behavior // J. Neurosci. 2003. V. 23, No. 13. P. 5617-26.

111. Reinke A.A., Gestwicki J.E. Insight into amyloid structure using chemical probes // Chem. Biol. Drug. Des. 2011. V. 77. P. 399-411.

112. Remington R., Chan A., Kotlya E., Shea T.B. Apple juice improved behavioral but not cognitive symptoms in moderate-to-late stage Alzheimer's disease in an open-label pilot study // J. Alzheimers Dis. Other Demen. 2010. V. 25, No. 4. P. 367-371.

113. Rodney H.F., Raymond L.C., Skinner M. The systemic amyloidoses // New England Journal of Medicine. 1997. V. 337, No. 13. P. 898-909.

114. Rovira C., Arbez N., Mariani J. Abeta(25-35) and Abeta(l-40) act on different calcium channels in CA1 hippocampal neurons // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 296, No. 5. P. 1317-21.

115. Samsonovich A.V., Ascoli G.A. Morphological homeostasis in cortical dendrites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103, No. 5. P. 1569-74.

116. Santalova I.M., Moshkov D.A. Smooth endoplasmic reticulum in fish Mauthner cells at different functional states // Neuroscience. 1999. V. 89, No. 2. P. 593-602.

117. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy // Physiol. Rev. 2001. No. 81. P. 741-766.

118. Selkoe D.J; American College of Physicians; American Physiological Society. Alzheimer disease: mechanistic understanding predicts novel therapies // Ann. Intern. Med. 2004. V. 140, No. 8. P. 627-638.

119. Serpell L.C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1502. P. 16-30.

120. Shan X., Chang Y., Lin C-l.G. Messenger RNA oxidation is an early event preceding cell death and causes reduced protein expression // FASEB J. 2007. V. 21. P. 2753-64.

121. Silva A., Kumar S., Pereda A., Faber D.S. Regulation of synaptic strenght at mixed synapses: effects of dopamine receptor blockade and protein kinase C activation//Neuropharmacology. 1995. V. 34. P. 1559-65.

122. Sloviter R.S., E. Dean E., Sollas A.L., Goodman J.H. Apoptosis and necrosis induced in different hippocampal neuron populations by repetitive perforant path stimulation in the rat// J. Comp. Neurology. 1996. V. 366, No. 3. P. 516-533.

123. Spires T.L., Hyman B.T. Neuronal structure is altered by amyloid plaques // Rev. Neurosci. 2004. V. 15, No 4. P. 267-278.

124. Spires T.L., Hyman B.T. Transgenic models of Alzheimer's disease: learning from animals // NeuroRx. 2005. V. 2, No. 3. P. 423-437.

125. Stefani M. Generic cell dysfunction in neurodegenerative disorders: role of surfaces in early protein misfolding, aggregation, and aggregate cytotoxicity // Neuroscientist. 2007. V. 13, No. 5. P. 519-531.

126. Sticht H., Bayer P., Willbold D., Dames S., Hilbich C., Beyreuther K., Frank R.W., Rosch P. Structure of amyloid A4-(l-40)-peptide of Alzheimer's disease // Eur. J. Biochem. 1995. V. 233, No. 1. P. 293-298.

127. Stix B., Reiser G. Beta-amyloid peptide 25-35 regulates basal and hormone-stimulated Ca2+ eve Is in cultured rat astrocytes 11 Neurosci. Lett. 1998. V. 243, No. 1-3. P. 121-124.

128. Szabo T.M., McCormick C.A., Faber D.S. Otolith endorgan input to the Mauthner neuron in the goldfish // J. Comp. Neurol. 2007. V. 505, No. 5. P. 511525.

129. Talaga P., Quere L. The plasma membrane: a target and hurdle for the development of anti-Abeta drugs? // Curr. Drug Targets CNS Neurol. Disord.2002. V. 1, No. 6. P. 567-574.

130. Tiraboschi P., Hansen L.A., Thai L.J., Corey-Bloom J. The importance of neuritic plaques and tangles to the development and evolution of AD // Neurology.2003. V. 62, No. 11. P. 1984-89.

131. Tiras N.R., Pavlik L.L., Moshkov D.A. Alterations in the cytoskeleton of the goldfish Mauthner cells under various pharmacological treatments // Acta Histochem. 1992. V. 41. P. 249-256.

132. Verdier Y., Zarandi M., Penke B. Amyloid beta-peptide interactions with neuronal and glial cell plasma membrane: binding sites and implications for Alzheimer's disease // J. Pept. Sci. 2004. V. 10, No. 5. P. 229-248.

133. Walsh D.M., Selkoe D.J. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease // Neuron. 2004. V. 44, No. 1. P. 181-193.

134. Wilson C.A., Doms R.W., and Lee V.M. Intracellular APP processing and A(3 production in Alzheimer disease // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1999. V. 58. P. 787-794.

135. Wolfe M.S. Shutting down Alzheimer's // Scientific American. 2006. P. 6167.

136. Xi Y., Noble S., Ekker M. Modeling neurodegeneration in Zebrafish // Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 2011. V. 11. P. 274-282.

137. Yamaguchi Y., Kawashima S. Effects of amyloid-p-(25-35) on passive avoidance, radial-arm maze learning and choline acetyltransferase activity in the rat // Eur. J. Pharmacol. 2001. V. 412. P. 265-272.

138. Yamashita K., Kataoka Y., Sakurai-Yamashita Y. et al. Involvement of glial endothelin/nitric oxide in delayed neuronal death of rat hippocampus after transient forebrain ischemia // Cell Mol Neurobiol. 2000. V. 20. P. 541-551.

139. Zhu Y.J., Lin H., Lai R. Fresh and nonfibrillar amyloid beta protein(l-40) induces rapid cellular degeneration in aged human fibroblasts: evidence for AbetaP-channel-mediated cellular toxicity // FASEB J. 2000. V. 14, No. 9. P. 1244-54.

140. Выражаю глубокую благодарность д.б.н., профессору, заведующему лаб. Ультраструктуры нейрона ИТЭБ РАН Дмитрию Алексеевичу Мошкову за неоценимую помощь в работе, подготовке статей, за всестороннюю и постоянную поддержку и ценные рекомендации. (

141. Хочу выразить благодарность молодым сотрудникам лаборатории Екатерине Григорьевой, Екатерине Парнышковой, Наталье Цаплиной за помощь в проведении экспериментальных методов над животными.

142. Выражаю благодарность к.б.н., молодому сотруднику лаборатории Рашиду Шамильевичу Штанчаеву за широкий вклад в работу: за обучение методам, за моральную поддержку, за обучениедисциплинированности и правильному построению экспериментальной части.

143. Очень признательна д.б.н., сотруднику лаборатории Системной организации нейронов ИТЭБ РАН Зинаиде Николаевне Журавлевой за ценные наставления в столь трудоемком процессе.

144. Очень благодарна своим друзьям и родным за моральную и материальную поддержку в написании диссертации.

Информация о работе

Коканова, Надежда Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Изучение взаимосвязи структуры и функции маутнеровских нейронов золотой рыбки при действии амилоида - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы