Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка физиологических моделей для исследования морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов золотой рыбки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка физиологических моделей для исследования морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов золотой рыбки"

На правах рукописи

Штанчаев Рашид Шамильевич

РАЗРАБОТКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АСИММЕТРИИ МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ ЗОЛОТОЙ РЫБКИ

Специальность 03 00 13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ164174

Пущино 2007

003164174

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Г Пущино

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Дмитрий Алексеевич Мошков

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Владимир Иванович Архипов

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор, Николай Степанович Косицын

Ведущая организация Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится «20» февраля 2008 г в 13 часов 30 минут на заседании Совета Д 002 093 01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, по адресу 142290, г Пущино Московской обл , ул Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН по адресу 142290, г Пущино Московской обл , ул Институтская, 3

Автореферат разослан «_»_2008 г

Ученый секретарь совета, к ф -м н

Панина Н Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы При исследовании механизмов памяти, а также функциональной асимметрии мозга центральной проблемой является определение взаимосвязи функции и структуры нервной ткани (Косицын, 1975, Бабминдра, 1986, Роуз, 1995, Butt et al , 2002, Фокин, 2004, Tailby et al, 2005, Hickmott et Ethell, 2006, Cuntz et al, 2007, Fornito et al, 2007) Предполагается, что повышенная активность отделов или центров мозга характеризуется увеличенным числом и/или размером нейронов с его многочисленными разветвленными дендритами и синапсами (Thompson, 2001, Chiu, Weliky, 2003, Stewart et al, 2005, Matsuzaki, 2007) На это указывают многочисленные экспериментальные данные и теория (Goodman et al, 1988, 1991, Sunanda et al , 1995, Agmon-Smr et al, 1998, Mizrahi et Libersat, 2002, Kuo et al, 2005, Zuo et al, 2005, Haas et al , 2006, Samsonovich et Ascoli, 2006, Makarova et al, 2007) Вместе с тем из-за слишком сложной организации мозга до сих пор не объяснено, как конкретная структурная особенность индивидуального дендрита проявляется в функции конкретного нейрона В исследованиях этой проблемы очевидна перспектива использования маутнеровских нейронов (МН) рыб и амфибий (Stefaneiii, 1951, Сахаров, 1961), классических объектов для изучения различных аспектов адаптации, памяти (Мошков, 1985, Korn et Faber, 2005), а с недавнего времени и асимметрии мозга (Михайлова и др, 2005а, б, 2006а, б) Сома и латеральный дендрит каждого МН получают слуховую и вестибулярную (Spray et al, 2003, Fremont et Hale, 2006), а вентральный дендрит - зрительную (Zottoll et al , 1987, Zhang et al, 2000, Weiss et al, 2006a, b) афферентацию Аксон иннервирует через мотонейроны мускулатуру противоположной стороны тела Слуховая (вестибулярная) или зрительная стимуляция одного из МН, благодаря полному анатомическому перекресту зрительных нервов и аксонов M H (Roth, 1979), вызывает поворот тела рыбки Этот С-образный поворот наблюдается как при реакции испуга, так и при свободном плавании и осуществляется в противоположную от МН сторону за счет унилатерального изгиба хвоста Число поворотов, отнесенное ко времени, коррелирует с амплитудой электрического ответа, измеренной в переживающих срезах мозга (Тирас, 2007), поэтому оно может служить косвенной оценкой функциональной активности МН Однако пока в таком морфофункциональном аспекте с использованием вестибулярных и слуховых стимуляций и денерваций в основном изучается сома и латеральный дендрит МН (Безгина и др , 1999, Zottoll et Faber, 2000, Kimmel et al , 2004, Михайлова, 2006) Исследование же вентрального дендрита и взаимосвязи его со зрительными восприятиями проводится раздельно или только с позиций участия зрения в эволюции поведения и экологии рыб вне связи с МН (Brown et al, 2004, Barth et al, 2005, Vallortigara et Rogers, 2005, Canfield, 2006, Rossignol et al, 2006), или же техникой вживленных микроэлектродов на закрепленной рыбке с позиций вовлечения зрительных сигналов в электрофизиологическую активность МН (Canfild, 2003, Preuss et Faber, 2003, Preuss et al , 2006, Weiss et al, 2006b) Взаимосвязь структуры вентрального дендрита МН, функциональной активности МН и свободного поведения рыбок остается абсолютно не изученной, в частности, из-за нерешенности вопроса о его естественной унилатеральной избирательной зрительной стимуляции (Anderson, 1988, Bisazza et al, 2005) Не в полной мере изучен вклад структуры сомы и дендритов в функциональное состояние МН Для его оценки не применяется внутриклеточная микроэлектродная регистрация вызванных электрических ответов в переживающих срезах мозга Для решения обозначенных задач необходима разработка соответствующих физиологических моделей и морфофункциональные исследования системного и клеточного уровней

Цель и основные задачи исследования Целью данной работы являлась разработка физиологических моделей для исследования вклада латерального и вентрального дендритов в функциональную активность МН золотой рыбки с точки зрения их

морфофункциональной асимметрии Были поставлены следующие задачи 1 Изучить функциональную активность МН в виде моторной асимметрии золотой рыбки при унилатеральной вестибулярной стимуляции и депривации статоакустического входа Исследовать морфологические характеристики латерального дендрита при данных воздействиях 2 Разработать установку для изучения избирательного влияния зрительной стимуляции на один из двух МН, подобрать условия оптимальных режимов данной стимуляции, приводящих к инверсии моторной асимметрии рыбки Исследовать влияние односторонней энуклеации глаза на моторную асимметрию рыбок Разработать условия для воздействия зрительной (оптокинетической) стимуляции на закрепленную в пространстве (иммобилизованную) рыбку Изучить морфологические характеристики вентрального дендрита МН при различных воздействиях на зрительный аппарат 3 Подобрать условия для регистрации внутриклеточной электрической активности МН in vitro в переживающих фрагментах продолговатого мозга мальков золотой рыбки

Научная новизна 1 Унилатеральное воздействие на вестибулярный аппарат впервые рассмотрено с точки зрения избирательного воздействия на сому и латеральный дендрит правого или левого МН Показано, что уменьшение функциональной активности МН, оцениваемое по сглаживанию и инверсии моторной асимметрии рыбок, сопровождается пропорциональным изменением структурной асимметрии МН за счет уменьшения размеров сомы и латерального дендрита 2 Впервые показано, что односторонняя оптокинетическая стимуляция, контралатеральная к исходно предпочитаемой стороне поворота, способна вызывать сильную и длительную инверсию поведенческой моторной асимметрии рыбок Установлено, что изменение функциональной активности МН при контралатеральной оптокинетической стимуляции сопровождается существенным уменьшением размеров вентрального дендрита ипсилатерального МН Разработка этой физиологической модели дает возможность управления структурой и функцией индивидуального вентрального дендрита 3 Подобраны условия и впервые показана возможность внутриклеточного исследования электрической активности МН в переживающих срезах продолговатого мозга рыб Научно-практическая значимость работы Проведенное исследование имеет важное общебиологическое значение Разработанные подходы и полученные данные показывают, что МН могут служить адекватным объектом для исследования роли индивидуальных дендритов отдельно взятого нейрона в создании функциональной интегральной активности Они показывают также, каким образом два нейрона одного мозга и два дендрита одного нейрона благодаря своей асимметрии вносят свой вклад в гомеостаз двигательных центров мозга, поддерживая стабильную двигательную активность рыбки в широко изменяющихся условиях внешней среды Данные результаты, в целом, дают возможность предполагать, что МН играют роль двухклеточного двигательного центра, обеспечивающего выполнение поворотов при свободном движении рыбок

Проблема имеет и прикладной аспект, затронутый в ходе выполнения основной работы Используя асимметрию МН и их дендритов и связь ее с моторной асимметрией рыбки, можно проводить исследования медицинского характера на МН В частности, аппликацией бета-амилоида, полимерного нерастворимого токсического компонента сенильных бляшек, можно индуцировать в МН изменчивость геометрии и тестировать влияние данного эффекта в виде патологического изменения структуры нейронов на поведение рыбки Это дает возможность изучать структурные механизмы модельной формы болезни Апьцгеймера

Апробация диссертации Результаты диссертационной работы были представлены на 1-м съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 19-23 сентября 2005г), на 14-й Международной конференции «Проблемы нейрокибернетики» (Ростов-на-Дону, 27-30 сентября 2005г), на конференции Украинского товарищества нейронаук, посвященной 75-летию Донецкого государственного медицинского университета им Горького

(Донецк, 24-26 мая 2005г), на 5-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Копосовские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, 21-23 мая 2006г), на 10-й и 11-й Пущинских конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 17-21 апреля 2006г и 29 октября - 2 ноября 2007г), на Всероссийской медико-биологической конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» в рамках 10-й Всероссийской конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 20-21 апреля 2007г), на 20-м Юбилейном съезде физиологического общества им И П Павлова (Москва, 4-8 июня 2007г), на 3-м Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 12-20 июня 2007г), на конференции «Нейронауки теоретические и клинические аспекты» (Донецк, июнь 2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них 1 статья в сборнике и 4 статьи в рецензируемых журналах

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы Диссертация изложена на 149 страницах, содержит 32 таблицы и рисунка Список литературы включает 110 наименований отечественной и зарубежной литературы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объектом исследования служили 3-6-месячные неполовозрелые золотые рыбки Carassius auratus породы Оранда, размером 3-5 см, массой около 2 г, и маутнеровские нейроны (МН) их продолговатого мозга В работе было использовано 420 рыбок С каждой рыбкой работали отдельно на протяжении всего эксперимента, все это время рыбки содержались в индивидуальных мини-аквариумах емкостью 1 л Исследование моторного поведения рыбок У рыбок предварительно определяли их индивидуальную фенотипическую моторную асимметрию по специально разработанной методике (Михайлова и др , 2005) Для этого их приблизительно в одно и то же время суток в течение 5-15 дней тестировали в узком прямолинейном канале В течение 5 мин подсчитывали число полных (на угол более 90°) поворотов, совершенных вправо, и число полных поворотов влево При тестировании внешние факторы, способные повлиять на свободное поведение рыбки при выборе ею стороны поворота (посторонние звуки, движения вблизи арены с рыбкой, изменения освещенности, перепады температуры воды и т д) сводились к минимуму Асимметрию поворотов, или моторную асимметрию рыбок, предпочтение их поворачиваться в ту или иную сторону, выражали в виде коэффициента моторной асимметрии (КМА) - отношения количества поворотов в сторону, предпочитаемую рыбкой, к суммарному числу поворотов в обе стороны Вычисляли средние арифметические значения КМА для каждой рыбки при многократном тестировании и для группы рыбок, участвовавших в определенных сериях экспериментов Рыбок, чаще спонтанно поворачивающихся при свободном движении вправо относили к рыбкам-правшам, рыбок, которые предпочитали поворачиваться влево, считали рыбками-левшами Повторные тестирования показывают, что у индивидуальных рыбок на протяжении длительного наблюдения (несколько месяцев) моторная асимметрия в большинстве случаев самопроизвольно не меняется, стабилен также их КМА Это свидетельствует о том, что данная особенность индивидуального поведения может рассматриваться как фенотипический признак рыбки Более того, такая моторная асимметрия прямо коррелирует с асимметрией размеров правого и левого МН рыбок (коэффициент корреляции = 0 9) У правшей доминирует по размерам левый нейрон, у левшей - правый Т о, доминантный МН благодаря своей большей активности предопределяет ориентацию моторной асимметрии (Михайлова и др , 2006)

Оценка вкладов статоакустической и зрительной афферентации в моторное поведение рыбок Учитывая особенности их внутримозговых связей, раздельно исследовали влияние статоакустических и зрительных входов на морфофункционапьное состояние МН Во-первых, использовали операции по удалению основных сенсорных входов, вызывающих активацию МН - вестибулярных и зрительных Для вестибулярной депривации (совместно с Н Р Тирас) у рыбок хирургически повреждали ипсилатеральную или контралатеральную рецепторную выстилку лабиринта (вестибулярного аппарата) Соответственно, это был правый или левый лабиринт у рыбок-правшей и левый или правый - у рыбок-левшей Моторную асимметрию этих рыбок оценивали через 2 недели после операции Для градуального естественного изменения моторной асимметрии золотой рыбки и прямого воздействия на латеральный дендрит и сому избирательно одного из МН проводили также унилатеральную вестибулярную стимуляцию Контралатеральную и ипсилатеральную вестибулярную стимуляцию длительностью 0 5, 1 и 2 часа проводили в пластиковом барабане, принудительно вращающем рыбок со скоростью 30 об/мин вокруг ростро-каудальной оси тела Направление стимуляции соотносили с локализацией доминантного МН Для рыбок-правшей контралатеральным было вращение по часовой стрелке, а ипсилатеральным - вращение против часовой стрелки, для левшей -наоборот

Для анализа влияния зрения на моторную асимметрию рыбок и на вентральный дендрит их МН у рыбок с соблюдением дезинфекции и использованием холодовой анестезии удаляли один глаз - либо ипсилатеральный, либо контралатеральный по отношению к стороне, в которую рыбка изначально предпочитала спонтанно поворачиваться при свободном движении Оценку моторной асимметрии оперированных рыбок проводили через один - три месяца после операции (в отдельных случаях - через две недели)

В изучении роли латерального дендрита (ЛД) естественные стимуляции давно и широко применяются раздельно и в сочетании с другими воздействиями и дают хорошие результаты (Мошков, 1985, Михайлова и др , 2005, Тирас и др , 2006) В отношении же вентрального дендрита (ВД) такие подходы пока не разработаны Для естественной стимуляции, учитывая иннервацию вентрального дендрита со стороны зрительного аппарата, можно было бы использовать какие-то зрительные раздражители Предлагалось, но не реализовано из-за технической невыполнимости применение быстро предъявляемого зрительного образа, опасного для рыбки, например, силуэта хищника, проекция которого на сетчатке сложным образом через тектум должна бы вызывать электрический ответ МН (Anderson, 1988) Пытаются использовать сложную методику с применением зеркал (Bisazza et al, 2005) или билатеральное неожиданно наплывающее на голову закрепленной рыбы темное пятно, затемняющее глаза (Preuss et Faber, 2003, Weiss et al , 2006a, b) Однако все эти подходы не позволяют исследовать влияние зрительного стимула на моторное поведение рыбки, оценить роль МН и его вентрального дендрита в свободном движении, и непригодны для последующего морфологического анализа МН Поэтому перед нами стояла задача разработать такой метод, основываясь на других принципах, ранее для этих целей не предлагавшихся Описание этой части работы вынесено в раздел, содержащий основные результаты

Электрофизиологические исследования МН Для электрофизиологических экспериментов использовали методику, разработанную в нашей лаборатории, с некоторыми модификациями (Карпук, Штанчаев и др , 2004) У рыб при холодовой анестезии извлекали мозг, с помощью вибротома отрезали передний участок мозга (на уровне дорсального края мозжечка) и мозжечок Оставшийся блок мозга инкубировали в проточной среде 2-8 часов Использовали инкубационные растворы двух разных составов (мМ) 1 (Пахотин, 1997) NaCI - 76, KCl -0 4, CaCI2 - 4, NaHC03 - 12 5, MgS04 - 2 6, КН2Р04 - 1 2, глюкоза - 2, среду титровали 10 мМ трис-HCI до pH 7 4 2

(Карпук, 2004) NaCI - 124, KCl - 3-5, КН2Р04 - 1 25, MgS04 - 2, CaCh - 2, NaHC03 - 26, глюкоза - 10 Среду непрерывно насыщали карбогеном (95% 02 + 5% ССЬ) Для проверки выживаемости срезов мозга в разных солевых средах инкубированные блоки мозга в ряде случаев подвергали фиксации для дальнейших электронно-микроскопических исследований Во всех случаях применяли сходные условия инкубации (температура 12-15°С, скорость протока 3-5 мл/мин) Внеклеточную регистрацию вызванных антидромной или ортодромной стимуляцией ответов (прямоугольные импульсы тока через нихромовые биполярные электроды, заточенные и электрически изолированные по всей площади, кроме кончика, 0 1-0 5 мА, 0 1-0 2 мс) осуществляли с помощью стеклянных микроэлектродов сопротивлением 3-10 МОм, заполненных 2М NaCI Для внутриклеточной регистрации использовали стеклянные микроэлектроды с сопротивлением 10-30 Мом, заполненные ЗМ KCl Исследование морфологии МН После выполнения физиологической части работы у золотых рыбок исследовали морфологические характеристики МН, применяя технику трехмерной реконструкции по серийным гистологическим срезам Для гистологических исследований рыбок декапитировали при холодовой анестезии, выделяли головной мозг и вырезали блок продолговатого мозга, содержащий МН Этот блок затем быстро погружали в фиксирующий раствор объемом 1 5-2 0 мл, составленный по прописи Piccard (1976) с некоторыми модификациями, разработанными в нашей лаборатории (Мошков, 1985) Использовали фиксатор следующего состава (на 10 мл) 4% параформ на 01 М какодилатном буфере 5,6 мл, диметилсульфоксид 0 25 мл, 25 % глутаральдегид 2 04 мл, 1 М какодилатный буфер 0 44 мл, вода дистиллированная 1 56 мл, pH раствора 7 2 - 74 Фиксацию в этом растворе продолжали около 12 часов при комнатной температуре После промывки 0 1 М какодилатным буфером, кусочки мозга дополнительно фиксировали 4 часа в 2 % растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в 100 % ацетоне (3 смены общей продолжительностью не менее 2 часов) Затем пропитывали смесью эпон-ацетон в пропорции 1 1 первые сутки и 3 1 вторые сутки, после этого образцы заключали в эпоновую смолу Полимеризацию смолы проводили в течение 24 часов в термостате при 37° и последующие 24 часа при 60°

У полученных эпоновых блоков отпиливали боковые участки, максимально уменьшая площадь сечения, затем блоки резали фронтально на пирамитоме LKB Серийные срезы продолговатого мозга толщиной 3 мкм, содержащие участки МН, фотографировали при увеличении 250х последовательно с помощью цифрового фотоаппарата Nikon Coolpix 995, установленного на напольном световом микроскопе NU-2E Carl Zeiss Каждый срез фотографировали по частям, затем части среза объединяли, контрастировали и повышали резкость снимка, используя программу Adobe PhotoShop 8 0 Изображения срезов выравнивали относительно друг друга полуавтоматически в программе IGL Align SEM Align Трехмерные объекты получали с помощью программы IGL Trace, любезно предоставленной д б н В И Поповым (ИБК РАН) На каждом срезе вручную обводили контуры сечений МН Контуры дендритов прорисовывали до мест их бифуркации Для корректного и унифицированного определения границ между сомой и дендритами, которые зависят от варьирующих размеров мозга и МН, использовали величину d, расстояние от центральной линии мозга до центра ядрышка одного из МН Границу между сомой и ЛД выражали в виде 1 2d (357±22 мкм), а границу сомы с ВД - в виде 0 6d (146±7 мкм) При статистической обработке размерные характеристики разных МН, варьирующие от рыбки к рыбке, привязывались к величине d Специальное тестирование такого приема на многих препаратах МН, различающихся по размеру, показало его адекватность Количественные данные получали в программе 3D View 3 5, любезно предоставленной д б н В И Поповым (ИБК РАН) Вычисляли раздельно объемы сомы, базальных сегментов ЛД и ВД, а также начального сегмента аксона Объем МН представляли как сумму объемов его частей Кроме того, определяли объемы аксонных чаш (A4)

Асимметрию МН и их частей у каждой рыбки характеризовали, рассчитывая коэффициент структурной асимметрии (КСА) как отношение объема контралатерального предпочитаемой стороне поворота нейрона или его части (в ряде случаев - объема нескольких частей нейрона) к сумме объемов обоих МН или соответствующих частей Вычисляли также средние арифметические КСА объемов обоих МН или их частей, полученных на основании количественной обработки структуры МН нескольких рыбок Для определения взаимосвязи моторной асимметрии рыбки и структурной асимметрии ее МН и их частей вычисляли коэффициент корреляции (КК) между КСА и КМА

Статистическую обработку результатов проводили в программе Microsoft Excel Для проверки соответствия полученного распределения параметра КМА нормальному использовали критерий хи-квадрат Достоверность различий данных определяли при помощи t-теста Стьюдента Количественные данные представлены значениями среднего арифметического ± ошибка среднего (при уровне значимости доверительного интервала 0 05) Для выявления статистически значимой зависимости структуры нейрона или его определенной части от функциональной активности применяли метод корреляционного анализа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Влияние вестибулярной деафферентации на моторную асимметрию рыбки и структурную асимметрию МН

Повреждение ипсилатерального лабиринта изменяло КМА рыбок, снижая его до значения 0 3±0 06 (п=5), это свидетельствовало о смене предпочтения рыбкой стороны поворота по сравнению с таковым в интактном состоянии (0 56±0 05) Анализ морфологии МН отдельной рыбки (левши) с наиболее удачно проведенной операцией по ипсилатеральной денервации показал, что структурные различия между двумя МН в целом и их частями сглаживались Структурные составляющие МН интактных латерализованных рыбок, безотносительно к направлению латерализации, имеют следующие объемы (п=30) С - 179±16 хЮ3 мкм3 и 109±11 хЮ3 мкм3, ЛД - 77±8 хЮ3 мкм3 и 60+8 хЮ3 мкм3, ВД - 81±11 хЮ3 мкм3 и 69±Ю хЮ3 мкм3 у контралатеральных и ипсилатеральных нейронов, соответственно Объем сомы правого и левого МН в случае ипсилатеральной денервации составлял 80х103 мкм3 и 85х103 мкм3, ЛД - З1х103 мкм3 и 40x103 мкм3, ВД - 35x103 мкм3 и 37x103 мкм3, соответственно Величина КСА между контралатеральным и ипсилатеральным МН становилась равной 0 47 за счет уменьшения размеров сомы и латерального дендрита прежде доминантного (правого) МН Контралатеральная вестибулярная денервация приводила к усилению моторной асимметрии (КМА составил 0 6+0 07 и 0 77+0 1 до и после операции соответственно) и небольшому уменьшению объемов контралатеральных МН по сравнению с аналогичными величинами в контроле (286±103 хЮ3 мкм3 после контралатеральной денервации и 309±26 хЮ3 мкм3 в контроле, п=5) Размеры сомы, латерального и вентрального дендритов по сравнению с контролем практически не изменялись Все эти результаты, возможно, свидетельствуют о слишком большой травматичности операции, приводящей к неконтролируемым неспецифическим эффектам, как в поведении рыбки, так и в структуре МН

2 Изменения морфологической и функциональной асимметрии после унилатеральной вестибулярной стимуляции

Результаты исследования МН рыбок после воздействия унилатеральной ротационной стимуляции показали, что структурная асимметрия МН и их частей могла изменяться в зависимости от длительности и направления вращения рыбок Ипсилатеральная стимуляция любой длительности практически не влияла на моторную асимметрию рыбок и на КСА их МН После 30-минутной контралатеральной стимуляции значения КМА рыбок не отличались от исходного значения в интактном состоянии КСА

контралатерального и ипсилатерального МН и суммарные объемы также практически не изменялись по сравнению с тем, что наблюдалось у интактных рыбок После контралатеральной стимуляции в течение 1 ч КСА между суммарными объемами МН снижался с 0 59±0 03 до 0 53±0 02, а сами объемы уменьшались на 20% относительно контрольного уровня КМА таких рыбок падал с 0 6±0 05 до 0 45+0 08 После двухчасовой контралатеральной ротационной стимуляции размеры обоих МН уменьшались почти в 1 5 раза по сравнению с контрольными значениями, а структурная асимметрия МН сглаживалась за счет преимущественного уменьшения объемов латерального дендрита и сомы контралатерального нейрона (КСА достигал значения 0 48+0 03) При этом рыбки практически становились амбидекстрами (КМА=0 47±0 03) КК между КМА рыбок и КСА их МН составлял 0 8 Таким образом, данные свидетельствуют о корреляции функциональной активности МН, судя по предпочтению рыбки в выборе стороны поворота, и их структурной асимметрии Они говорят также о том, что с помощью естественной односторонней стимуляции можно избирательно влиять на структуру латерального дендрита и сомы одного из двух МН по выбору В целом, можно предположить, что МН представляют собой адекватную модель для морфофункциональных исследований роли структурных изменений сомы и латерального дендрита в организации функции индивидуального нейрона

3 Влияние зрительной деафферентации на моторную асимметрию рыбки и структурную асимметрию МН

Предыдущие исследования нашей лаборатории по зрительной денервации рыб не позволили адекватно оценить ее влияние на МН (Михайлова, Штанчаев и др , 2005, Михайлова и др, 2006) Это было связано, возможно, с малым числом выборки и с недостаточно разработанной методикой тестирования послеоперационного состояния моторной асимметрии рыбок

Мы повторили эти эксперименты с учетом указанных недоработок Наблюдалось достоверное усиление моторной асимметрии рыбок с одним энукпеированным глазом в «слепую» сторону приблизительно через месяц после операции в среднем на 25% по сравнению с предоперационным значением КМА Среднее значение КМА сдвигалось от 0 51±0 02 до 0 64+0 03 (п=23) Структурный анализ показывает, что КСА МН индивидуальной рыбки-правши после энуклеации становился равным 0 67 При этом суммарный объем левого нейрона составил 320x103 мкм3, а правого нейрона - 157x103 мкм3, т е левый МН значительно превышал по размерам правый В данном случае не наблюдалось изменений размеров сомы и латерального дендрита по сравнению с интактным контролем В то же время объем вентрального дендрита ипсилатерального МН (22x103 мкм3) уменьшался примерно в 3 раза по сравнению с контролем (69 9x103 мкм3) Таким образом, в целом подтвердились предположения о том, что энуклеация глаза прямо не влияет на структуру МН, а изменения размеров ВД происходят за счет последующей длительной зрительной нагрузки на него («хронического» утомления) со стороны неповрежденного глаза

4 Влияние оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию золотых рыбок

Для естественного избирательного воздействия на вентральный дендрит маутнеровского нейрона и для оценки влияния этой части нейрона на моторное поведение рыбок до настоящего времени не разработано специфической зрительной стимуляции Поэтому нами выбран ранее не использовавшийся подход, для которого мы обратились к таким зрительным стимулам, которые, по нашим представлениям, безусловно, изменяли бы латеральное поведение рыбки и одновременно являлись бы чисто зрительными и естественными Претендентом на такой раздражитель может быть оптомоторная реакция - следование животных за движущимися объектами Она характерна для всех живых существ, обладающих зрением, в том числе и для рыб (Павлов, 1970, Хайнд, 1975) Однако эта достаточно широко распространенная в

настоящее время методика, применяемая для оценки свойств самих глаз (Cronley-Dilion et Müntz, 1965; Anstis et al., 1998) и тектума (Springer et al., 1977, Roeser et Baier, 2003), до сих пор не рассматривалась с точки зрения своей применимости для воздействия на моторную асимметрию рыбок и на лежащую в ее основе морфофункциональную асимметрию МН (Михайлова и др., 2005; Bisazza et al., 2005). Поэтому первой целью этой части работы стала экспериментальная проверка предположения, что оптомоторная реакция вообще пригодна в качестве естественной зрительной стимуляции рыбок для длительного изменения их двигательного поведения (оптокинетической стимуляции). В случае его подтверждения следующей целью был подбор условий, при которых оптомоторная реакция могла бы существенно и надолго изменять моторную асимметрию рыбок.

Для проведения оптокинетической стимуляции была создана специальная установка (Рис.1). Она представляет собой неподвижный прозрачный круглый тест-аквариум (центральный цилиндр) объемом 0,5 л (диаметр 130 мм, высота 40 мм), который накрывается сверху вращающимся оптомоторным барабаном (диаметр 150 мм) с наклеенными на него чередующимися непрозрачными черными и белыми полосками. Цилиндр освещается сверху, через прозрачное дно барабана. Установка, снабженная тремя барабанами и тремя тест-аквариумами, соответственно, позволяет проводить одновременную стимуляцию 12 рыбок. Для осуществления оптокинетической стимуляции рыбок помещали в центральный цилиндр, опускали барабан почти до самого основания установки и приводили его во вращение с определенной скоростью и в определенном направлении. Полоски вращались непрерывно на протяжении всего эксперимента. Контралатеральной оптокинетической стимуляцией для рыбок-правшей считалось вращение полосок против часовой стрелки (влево), для левшей - вращение полосок по часовой стрелке (вправо). Ипсилатеральной стимуляцией считалось вращение полосок в ту сторону, которая предпочиталась рыбками при осуществлении поворота. Для оценки влияния оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию и изучения динамики изменения КМА после данного воздействия рыбок тестировали непосредственно до оптокинетической стимуляции, сразу после нее и через 1-3 (в некоторых случаях до семи) суток после подобной стимуляции. В каждом случае для группы рыбок вычисляли средний КМА± ошибка среднего.

Рис. 1. Схема установки для оптомоторной стимуляции мальков золотой рыбки (А) и расположения тест - аквариума (Ц) с рыбкой и оптомоторного барабана (Б), вид сверху. МБ -моторный блок с моторчиком и редуктором (закрыты кожухом), ПС - переключатель скоростей и Р - тумблер для реверсирования вращения. М - маховик, к которому крепится оптомоторный барабан (ОБ), О - массивное основание, С - стойка для перемещения МБ с ОБ вверх и вниз с помощью плавного вращения ручки (РВ). Тест - аквариум (Ц) с испытуемой рыбкой помещается под оптомоторный барабан соосно с ним.

Отдельно исследовали также влияние движущихся полосок на иммобилизованных, лишенных возможности плавать, рыбок, ориентированных в одних случаях параллельно стенке центрального цилиндра головой в сторону движения полосок, а в других - перпендикулярно, головой почти вплотную к стенке цилиндра. Иммобилизация

заключалась в закреплении рыбки с помощью нейлоновой сетки, опоясывающей тело в области за жабрами, так, чтобы грудные плавники оставались свободными, и нитки (уздечки), продетой через рот Сетку сверху фиксировали широким (10 мм) зажимом, захватывающим одновременно и сетку, и спинной плавник рыбки Зажим, в свою очередь, подвешивали на достаточно массивном держателе Держатель с закрепленной рыбкой ставили на дно тест-аквариума, и рыбку подвергали оптокинетической стимуляции Контролем в этом случае служили иммобилизованные аналогичным образом рыбки, находившиеся в равных условиях с подопытными рыбками, но не подвергавшиеся стимуляции

Для выявления возможной взаимосвязи оптомоторной реакции и асимметрии поворотов при свободном плавании требовалось определить следующие условия опыта экспериментальные параметры зрительных ориентиров (полосок), оптимальную скорость вращения оптомоторного экрана и длительность оптокинетической стимуляции

4 1 Выбор параметров зрительных ориентиров

В качестве зрительных ориентиров применяли черные (тестировались также красные и зеленые) полоски (Павлов, 1970) либо с прозрачными промежутками между ними, либо на непрозрачном белом фоне При этом использовали не световые проекции зрительных образов, как в некоторых работах по зрительной стимуляции (Weiss et al, 2006а, b), а наклеенные на оптокинетический барабан полоски непрозрачной ленты В начальных экспериментах ширина ленты составляла 4 мм с прозрачным промежутком между полосами б мм Использовали также полоски шириной 2 мм с прозрачными 8 мм интервалами между ними Результаты предварительных опытов по изучению влияния размеров полосок, а также ширины и прозрачности интервалов между ними на поведение рыбок в экспериментальном аквариуме показали, что рыбки одинаково реагируют на разные зрительные раздражители, проявляя стойкую реакцию следования за движущимися полосками Поэтому при разработке метода был выбран наиболее простой для экспериментатора и эффективный для изменения поведения рыбок вариант - непрозрачные (для исключения посторонних визуальных раздражителей при освещении центрального цилиндра сверху) черно-белые (для лучшего контраста) широкие (13-15 см) полоски

4 2 Влияние скорости вращения оптокинетического барабана на поведение рыбки Наблюдения показали, что поведение рыбок в экспериментальном аквариуме, накрытом неподвижным оптомоторным барабаном, не отличается от их свободного поведения в аквариуме с ограниченным объемом воды Однако даже минимальная из использованных нами скорость вращения полосок (3 об /мин) приводила к более или менее стойкой оптомоторной реакции Средняя скорость следования рыбок за полосками при 3 об/мин составляла 1 7±0 4 об/мин (п=13), а при скорости полосок 6 об/мин - 3 3±0 4 об/мин (п=14) При этом рыбки в целом неохотно плыли за полосками, часто останавливались и время от времени плыли в обратную движению полосок сторону

Наиболее активное следование рыбок за зрительными ориентирами было обнаружено при скоростях вращения оптомоторного барабана 12 и 30 об/мин Рыбки с относительно стабильной скоростью, почти без остановок плыли за полосками Средняя скорость плавания рыбки составляла 6 1±0 8 об/мин при скорости вращения оптокинетического экрана 12 об/мин (п=14) и, соответственно, 8 1±0 7 об/мин при 30 об/мин (п=65) При этом, в последнем случае, скорость следования рыбок за полосками иногда достигала 29 об/мин, т е была синхронна со скоростью вращения оптомоторного барабана

Увеличение скорости полосок до 60 об/мин приводило к резкому снижению скорости следования рыбок (4 0±1 2 об/мин, п=10) При этом в поведении рыбок наблюдалась явная дезориентация, оно становилось более хаотичным При скорости оптомоторного барабана 120 об/мин большинство рыбок уже не проявляло оптомоторной реакции, а в

редких случаях следования за полосками скорость рыбок была очень низкой (2 4+1 5 об/мин, п=4) Таким образом, был сделан вывод, что скорости вращения оптокинетического барабана 12 и 30 об/мин являются наиболее адекватными для проведения основных исследований

Оказалось, также, что скорости следования рыбки за зрительными ориентирами в разных направлениях вращения последних (вправо и влево) сильно отличаются между собой Это отличие оставалось, как правило, неизменным при смене скорости вращения полосок Как показали дальнейшие наблюдения, имеется прямая корреляция между скоростью следования рыбки за полосками и предпочтением стороны поворота в узком канале В 82% случаев (п=24) рыбки плавали быстрее в ту сторону, в которую предпочитали поворачиваться при свободном поведении (в ипсилатеральном относительно предпочитаемой стороны поворота направлении) КК между КМА и асимметрией скорости следования за полосками, вычисленной как отношение скорости движения рыбки в ипсилатеральную сторону к сумме двух скоростей в обе стороны (об/мин), был равен 0 57 (п=24) Т е , чем сильнее моторная асимметрия, тем больше была скорость следования за полосками в данном направлении Для той части рыбок, у которых наблюдалась данная связь (80-85% из исследованной группы), коэффициент корреляции достигал 0 83 В данном случае, можно предположить, что на нейрональном уровне имеется связующее звено между этими двумя поведенческими реакциями, претендентом на которое могут служить МН 4 3 Влияние длительности оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию рыбок

Контралатеральная оптокинетическая стимуляция (КОС) при 12 об/мин в течение 4-х часов приводила к изменению среднего КМА с 0 67±0 07 до 0 62+0 11 (п=5) При тех же условиях 6 часов стимуляции приводили к изменению КМА с 0 65±0 06 до 0 55±0 12 (п=6), 8 часов - с 0 65+0 04 до 0 53±0 07, соответственно (п=9) Т о был сделан вывод, что при скорости 12 об/мин КМА рыбок изменяется незначительно по мере увеличения длительности стимуляции В то же время вращение барабана со скоростью 30 об/мин обеспечивало сильный и длительно сохраняющийся поведенческий эффект, в связи с чем, эта скорость и была выбрана для дальнейших экспериментов КОС рыбок-правшей (п=4), КМА которых изначально был равен 0 57+0 01, в течение 4 часов при 30 об/мин приводила к снижению КМА до 0 46±0 05 После шестичасовой стимуляции КМА становился равным 0 39±0 15, а после восьмичасовой - 0 36±0 11, т е наблюдалась инверсия моторной асимметрии

Наблюдения показали, что рыбки примерно через 10-11 часов стимуляции при 30 об/мин переставали адекватно реагировать на движение полосок, следовать за ними, что можно было бы объяснить утомлением или привыканием животного к условиям эксперимента Дальнейшее увеличение длительности оптокинетической стимуляции не приводило к усилению эффекта КОС рыбок-правшей (п=5) при 30 об/мин в течение 24 часов влияла на моторную асимметрию гораздо слабее, чем 8-часовая КОС (КМА снижался с 0 59±0 03 до 0 47+0 07) Поэтому в последующих экспериментах использовалась длительность оптокинетической стимуляции не менее 8 часов и не более 11 (обычно 9-10 часов)

4 4 Изучение динамики моторной асимметрии золотых рыбок до и после длительной КОС

Из табл 1 видно, что у рыбок, независимо от их исходного предпочтения стороны поворотов, под действием КОС моторная асимметрия в целом по группе испытывала явную инверсию при сохранении прежней двигательной активности Ярко выраженные рыбки-правши становились левшами, а рыбки-левши - правшами Последующий отдых по-разному влиял на восстановление прежних значений КМА рыбок с разной латерализацией моторного поведения У рыбок-правшей наблюдалась плавная нормализация моторной асимметрии с полным восстановлением ее примерно через трое суток, в то время как у рыбок-левшей прежняя моторная асимметрия

восстанавливалась гораздо раньше (за сутки) Однако затем у них вновь наблюдалась инверсия моторной асимметрии, и лишь на третьи сутки КМА нормализовался полностью Следует отметить, что результаты, представленные в данных примерах, наблюдались во всех случаях интактных латерализованных рыбок, подвергавшихся КОС Неожиданное различие реакций рыбок-«левшей» на одинаковую зрительную стимуляцию, возможно, отражает общие различия левшей и правшей в связи с функциональной асимметрией мозга (Фокин, 2004) Подобные различия в моторном поведении рыбок обнаружены при действии на них унилатеральной и билатеральной вестибулярной стимуляции (Михайлова и др , 2006а)

Таблица 1 Динамика изменения моторной асимметрии мальков золотых рыбок под влиянием контралатеральной оптокинетической стимуляции._

Моторная асимметрия КМА До КОС Общее число поворотов до КОС КМА после КОС Общее число поворотов после КОС КМА на следующие сутки КМА через двое суток КМА через трое суток

Через 12 часов Через 24 часа

Рыбки-правши <п=8) 0 63 ± 0 03 23 ±4 0 39 ± 0 09* 29 ±13 0 45 ± 0 02* 0 45 ± 0 09* 0 44 ± 0 06* 0 59 ± 0 11

Рыбки-левши (п=8) 0 64 + 0 03 28 ±14 0 37 ± 011* 30 ± 16 0 56 ± 0 05 0 62 ± 0 07 0 44 ± 0 12* 0 59 ± 0 1

* - Достоверное отличие от значений КМА до стимуляции (контроль) Р<0 05

4 5 Влияние оптокинетической стимуляции на рыбок с энуклеированным ипсилатеральным глазом

Ипсилатеральная по отношению к слепой стороне и, следовательно, к предпочитаемой стороне поворота оптокинетическая стимуляция еще более усиливала моторную асимметрию В среднем КМА у рыбок-правшей увеличивался с 0 58±0 02 до 0 84±0 11 (п=10), у левшей - с 0 64±0 04 до 0 85±0 08 (п=8) При этом у отдельных рыбок наблюдали полную латерализацию моторного поведения, причем без снижения присущей им «поворотной» активности (число поворотов, совершенных в прямом канале за 5 минут тестирования, составляло 25±5 до стимуляции и 31±3 после) КМА этих рыбок восстанавливался на следующие сутки после ипсилатеральной стимуляции

Контралатеральная оптокинетическая стимуляция по-разному влияла на деафферентированных рыбок Большая часть (примерно две трети) рыбок-правшей и левшей не меняла асимметрии поворотов (КМА таких рыбок составлял 0 68±0 04 до КОС, 0 67+0 07 после КОС для правшей (п=11) и, соответственно, 0 64±0 04 и 0 69±0 11 для левшей, п=11) Примерно у трети рыбок отмечалась инверсия моторной асимметрии КМА этих рыбок, безотносительно к тому, правши это или левши, снижался с 0 63±0 04 до 0 32±0 1 (п=9) КМА данных особей восстанавливался на следующие сутки, достигая 0 7±0 09 На основании этих данных было предположено, что такая разная реакция рыбок с энуклеированным глазом на контралатеральную зрительную стимуляцию обусловлена присущей рыбам асимметрией зрения (Vallortigara, 2000, Малашичев, 2004), которая, по всей видимости, не связана с асимметрией поворотов

4 6 Влияние оптокинетической стимуляции на интактных иммобилизованных рыбок

Было показано, что 8-часовая КОС неподвижных рыбок, в большинстве случаев, инвертировала двигательную асимметрию (с 0 62±0 02 до 0 26±0 1) В контроле КМА

рыбок до и после длительной иммобилизации составил 0.66±0.09 и 0.51±0.15, соответственно (п=7) (большой разброс данных после воздействия, возможно, объясняется сильным иммобилизационным стрессом). Моторная асимметрия после КОС не изменилась лишь в одном случае, когда рыбка была зафиксирована в пространстве так, что могла видеть движущиеся полоски только одним глазом (это, возможно, подтверждает наши выводы, сделанные на основании результатов по КОС рыбок с односторонней зрительной энуклеацией, о присущей рыбкам асимметрии глаз). В целом, исследование влияния оптокинетической стимуляции на иммобилизованных рыбок позволяет предположить, что на асимметрию моторного поведения влияет не само плавание за полосками, а стимуляция глаза, соответствующего зрительного анализатора и, как следствие, вентральных дендритов маутнеровских нейронов.

5. Исследование реконструированных МН до и после воздействия оптокинетической стимуляции-

Примеры трехмерной реконструкции морфологии правых и левых МН индивидуальных контрольных и подопытных рыбок показаны на рис.2, а измерения реальных объемов отдельных частей и вычисленных суммарных усредненных и индивидуальных объемов МН представлены в таблице 2.

Рис.2. Объемная реконструкция левого (Л) и правого (П) МН мальков золотых рыбок с разной латерализацией моторного поведения до и после длительной КОС. А. - МН контрольной рыбки-правши. Б. - МН рыбки-правши после длительной КОС. В. - МН контрольной рыбки-левши. Г. - МН левши после длительной КОС. Масштабная линейка - 50 мкм.

Количественная обработка данных по реконструированным МН рыбок-правшей и левшей до и после КОС показала, что в соотношениях суммарных объемов между контралатеральными и ипсилатеральными МН при сравнении контрольных и подопытных рыбок не наблюдается заметных изменений. По значению КСА, показателя количественных различий между доминантным и субдоминантным МН, подопытные рыбки сохраняют характерную для контроля морфофункциональную асимметрию МН. В то же время размер ВД ипсилатерального МН, являвшегося субдоминантным и в контроле практически не отличавшегося от контралатерального ВД, заметно уменьшается (рис. 2А, В и рис. 2Б, Г, соответственно). Морфометрический анализ выявил уменьшение объемов ипсилатерального ВД в 3-3.5 раза по сравнению с объемами контралатерального ВД и контрольных ВД.

1.2(1

лд

лд

лд

Таблица 2 КМ А и размерные характеристики МН после КОС

Рыбки КМА до КОС КМА рыбки после КОС МН Объем МН, x10J mkmj

Сома ЛД ВД Аксон АЧ I1MH I2MH КСА МН

Рыбки-правши, контроль (п=4) 0 59 ± 0 06 Левый 132 ±26 57± 16 57± 18 131± 37 34± 9 379± 59 658+ 90 0 56 + 0,08

Правый 67 ± 10"' 35± 7 50+ 6 125+ 34 23± 4 278+ 47

Рыбки-правши после КОС (п=4) 0 62 ± 0 04 0 33± 0 11* Левый 125 ±45 54 ± 16 56 ± 26 102 ± 34 30 ± 8 368 + 75 638 ± 68 0 58 ± 0,08

Правый 93 ± 24 48 ± 11 15 ± 4" 87 ± 16 27 ± 8 270 ± 25

Иммобилизованная рыбка-левша после КОС 0 64 ± 0 08 0 14 Правый 162 13 64 219 40 458 713 0 64

Левый 76 17 30 132 63 255

* Достоверное отличие значений КМА после КОС от исходного значения (Р<0 05) "Достоверное отличие значения объемов ВД правого и левого МН (Р<0 05) "* Достоверное отличие значений объемов сомы ипсилатеральных МН от объемов сомы контралатеральных МН (Р<0 05) у контрольных рыбок

п - количество особей, АЧ - аксонная чаша, 11 МН - полный объем одного МН, Z2MH -полный суммарный объем двух МН

У иммобилизованной рыбки-левши, подвергнутой КОС, объем ВД левого МН уменьшался более чем в 2 раза Следует отметить, что в последнем случае наблюдалась также существенная и одновременная редукция размеров латеральных дендритов обоих МН Такое изменение коррелировало со значительным снижением общей двигательной активности рыбок после иммобилизации, поэтому оно может быть неспецифическим результатом иммобипизационного стресса, сильнейшего угнетающего фактора, способного сильно нарушать в мозгу рыб структуру нейронов и синапсов супраоптических ядер (Schuster, 1978)

Анализ корреляции между КМА рыбок и КСА вентральных дендритов после воздействия КОС показал наличие отрицательного коэффициента корреляции (-0 72, п=8) Чем сильнее инвертировалась моторная асимметрия, тем больше наблюдалась разница между размерами ВД в пользу контралатерального Ранее, при исследовании структурной асимметрии МН у интактных латерализованных рыбок (Михайлова и др , 2006), была обнаружена слабая отрицательная корреляция между КСА ВД и КМА рыбки (-0 44) Кроме того, контралатеральная к предпочитаемой стороне поворота зрительная депривация также приводила к увеличению размеров контралатерального ВД, при КК между КМА рыбки и КСА ВД = -0 68 (п=5) Взятые вместе, эти результаты, вероятно, свидетельствуют о реципрокности функциональной активности МН и размера его вентрального дендрита

6 Исследование электрической активности маутнеровских нейронов В 43 экспериментах на мозге золотых рыбок in vitro были проанализированы свыше 200 записей нейронной активности, зарегистрированной в области местонахождения МН Синаптические ответы нейронов, вызванные стимуляцией VIII нерва (ортодромной стимуляцией), были зарегистрированы в 29 экспериментах, но внутриклеточного отведения от этих клеток удалось добиться пока лишь в нескольких опытах Генерацию фоновой активности отдельными нейронами отмечали в 30 экспериментах На рис 3 представлены внеклеточные отведения антидромных (А-В) и ортодромных (Г-Е)

ответов МН Ответы, вызванные стимуляцией аксонов МН на стороне, контралатеральной месту отведения (антидромная стимуляция), имели амплитуду 4-6 мВ, были достаточно близкими по амплитуде и длительности и отличались лишь широко варьирующими латентными периодами (от 1 до 20 мс) Ортодромные ответы отличались еще большей вариацией между собой Стимуляция VIII черепно-мозгового нерва приводила к ответам МН с разными латентными периодами (0 5-1 мс), разной амплитудой (2-6 мВ) и различной выраженностью электротонического и химического компонентов ответа Данный факт не принимался во внимание при первоначальной постановке опытов, однако, он может свидетельствовать о функциональной асимметрии МН, способной проявляться не только в поведении, а также в структуре клеток, но и в электрических характеристиках данных нейронов

На рис 3 Ж представлен характерный пример внутриклеточно зарегистрированного вызванного потенциала МН в условиях in vitro Ортодромная стимуляция данного нейрона при определенной силе стимула приводила к генерации им одиночных потенциалов действия Допороговое раздражение приводило к генерации возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) Этот МН мог генерировать множественные потенциалы действия во время повреждения или возбуждения его мембраны импульсным током близко расположенного регистрирующего микроэлектрода (не представлено), что характерно и для других нейронов при электрофизиологическом изучении их активности Т о, показана возможность внутриклеточной регистрации электрической активности МН в условиях in vitro Разработка этого подхода имеет методологическое значение, открывая новые возможности изучения функционирования нейронов, в том числе, и с точки зрения асимметрии активности и структуры индивидуальных нервных клеток мозга

Рис 3 Вызванные потенциалы маутнеровских нейронов при стимуляции аксона (А-В) и VIII нерва (Г-Е) in vitro Стрелкой на А и Г указан электротонический компонент ответа, а двойной стрелкой на Г отмечен химический компонент Начало стимуляции указано стрелкой на В Ж - пример внутриклеточного ортодромно вызванного потенциала действия МН Указано значение мембранного потенциала, мВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Одной из важных целей нейроморфологии является доказательство взаимосвязи структуры и функции нейронов. Под структурой можно подразумевать геометрию или размер нейрона, а под функцией - его активность, проявляемую в виде амплитуды ответа или частоты активации, которую можно регистрировать прямо как электрофизиологические скачки напряжения на мембране или косвенно по совершаемому животным поведенческому акту, индуцированному именно этим нейроном. Уникальность маутнеровских нейронов золотой рыбки, симметрично расположенных в мозгу гигантских нейронов, отвечающих вместе с ретикулоспинальными нейронами и мотонейронами за контрактуру правой или левой туловищной мускулатуры (Мошков, 1985; Korn et Faber, 2005), доминирование одного МН над другим, проявляющееся как преимущественное выполнение поворотов рыбки в определенную сторону, и его структурная изменчивость под влиянием билатеральной и унилатеральной вестибулярной стимуляции (Михайлова и др., 2006), способствуют исследованию этого вопроса. Возможность объемной реконструкции структуры по серийным гистологическим срезам и определения истинных объемов МН и их индивидуальных дендритов (Михайлова и др., 2005) послужила предпосылкой напрямую исследовать влияние размера МН или любой его части на функциональную активность. Для разработки обозначенной проблемы в совокупности требовались дальнейшие комплексные исследования, главными из которых являлись разработка способов естественного раздельного избирательного воздействия на любой из дендритов МН, затрагивающего их структуру, и регистрация их функции не только по поведению рыбки, но и эпектрофизиологическим методом. Полученные нами данные показывают, что естественная контралатеральная вестибулярная стимуляция сопровождается коррелирующими друг с другом уменьшением размера сомы и латерального дендрита контралатерального МН и снижением его функциональной активности. Последнее проявляется в сглаживании моторной асимметрии рыбки. Применение впервые оптокинетической стимуляции как внешнего фактора воздействия на моторную асимметрию золотой рыбки выявило, что она в случае контралатеральной направленности инвертирует моторную асимметрию. При непрерывном следовании за полосками, наблюдаемыми через прозрачную стенку аквариума, рыбки, чтобы не упустить их из поля зрения, вынуждены все время поворачиваться в одну сторону, обращая один свой глаз в сторону полосок и совершая периодически С-образные изгибы тела (рис. 4).

Рис.4. Поведение рыбки в центральном цилиндре (Ц) во время вращения оптомоторного барабана (ОБ). Съемка производилась снизу, через модифицированное прозрачное дно установки. Два кадра из видеоролика, демонстрирующие С-образные изгибы хвостового плавника при движении рыбки вслед за полосками.

Оптомоторная реакция рыбок является врожденной, т.е. безусловнорефлекторной, и очень сильной (Kröger et аI., 2003). Известно, что МН управляются двумя главными сенсорными афферентными входами, статоакустическим (Zottoli et Faber, 1979) и зрительным (Zottoli et al., 1987). Электрическая стимуляция каждого из этих сенсорных

входов вызывает потенциал действия одного из двух МН (в зависимости от того, с какой стороны приходит стимул), который, в свою очередь, производит С-изгиб хвостового плавника рыбки В поведении он характеризуется как поворот рыбки на 90° с одновременным рывком тела вбок в ту же сторону, и назван реакцией испуга Кинематическая характеристика С-изгиба и сопровождающего его полевого электрического потенциала, регистрируемого с поверхности продолговатого мозга как внеклеточный ответ МН, коррелирует с направлением реакции, вне зависимости, вызвана ли она звуковым или зрительным стимулом (Weiss et al, 2006а, b) На основании этого можно предположить, что рыбка для адекватного поведения в естественных условиях при свободном плавании тоже может использовать как зрительные, так и вестибулярные стимулы, и при этом в поведенческую реакцию будут вовлекаться МН как центры управления поворотами рыбки Поэтому мы рассматриваем наши данные об инверсии моторной асимметрии рыбок под влиянием длительной оптомоторной стимуляции как результат утомления зрительного входа контралатерального МН, впервые наблюдаемый при спонтанном движении рыбки

2 Важным наблюдением являются различия в реакции рыбок на контралатеральную стимуляцию в случае энуклеации одного глаза У 2/3 рыбок-правшей с удаленным правым глазом и рыбок-левшей с удаленным левым глазом (Штанчаев и др , 2007) оптомоторная реакция не вызывала никакого эффекта, в то время как у оставшихся рыбок она приводила к инверсии моторной асимметрии Известно, что у рыбок перекрест зрительных входов между собой не превышает 5%, т е фактически является полным, и каждый глаз иннервирует контралатеральный тектум (Roth, 1979), а значит и МН Зрение необходимо рыбке для распознавания пищи (положительный стимул) и хищника (отрицательный стимул) Настройку экспрессии данных стимулов в виде адекватного поведения осуществляет тектум и ретикулоспинальные нейроны (Roeser et Baier, 2003) В настоящее время доказано, что зрение у рыб асимметрично (Vallortigara, 2000, Lesley et Andrew, 2002, Фокин, 2004) Поэтому наши данные по энуклеации глаз и последующей оптомоторной стимуляции предполагают, что у мальков золотых рыбок также проявляется асимметрия зрения, и что она не всегда совпадает с асимметричностью моторного поведения рыбок

3 Результаты нашей работы позволили также впервые установить, что контралатеральная зрительная стимуляция МН приводит к существенному избирательному уменьшению вентрального дендрита, не затрагивая при этом других частей МН Ранее на основании опытов по односторонней зрительной деафферентации, мы установили, что для КМА рыбок и структурной асимметрии вентрального дендрита характерны реципрокные отношения (Михайлова, Штанчаев и др , 2005, Михайлова и др , 20066) Можно предположить, что отмеченные корреляции между изменением латерализации поведения рыбки и односторонней зрительной деафферентацией связаны с усилением активности интактного зрительного входа В случае односторонней естественной зрительной стимуляции с помощью оптомоторного барабана редукция размеров ВД, той части МН, где расположены синапсы от зрительного анализатора (Zottoll et al , 1987), тоже, вероятно, обусловлена увеличенной нагрузкой зрительного входа Очевидно, что длительная стимуляция избирательно утомляла ВД у одного и того же МН, активация которого требовалась для совершения поворота в сторону следования полосок Это, по-видимому, и приводило к уменьшению размеров ВД, аналогично тому, как естественная длительная вестибулярная стимуляция уменьшала сому и ЛД (Михайлова и др, 20066), иннервируемые статоакустическим нервом Поэтому в целом данные показывают, что оптокинетическая, по сути визуальная, стимуляция является адекватным неинвазивным и абсолютно нетравматическим инструментом для естественной избирательной стимуляции МН через ВД, и что ВД может оказывать влияние на функциональное состояние МН при свободном движении рыбки Ее последующее

использование открывает новые перспективы в изучении роли этого дендрита в морфофункциональной организации и пластичности МН

4 Основным результатом электрофизиологической части работы является демонстрация того, что внутриклеточные микроэлектродные исследования МН мальков золотой рыбки в условиях in vitro возможны Установлены основные приемы работы с такими объектами, выяснены возможные артефакты, возникающие в ходе экспериментов, а также определены параметры стимуляции и отведения Вместе с тем, наша работа выявила существенные сложности таких экспериментов значительные затруднения при попытках получить качественные внутриклеточные отведения активности МН и необходимость слишком длительного интервала между приготовлением препарата и первыми проявлениями жизнеспособности расположенных в нем МН (до 6 часов), что существенно отодвигает время основных экспериментов Последнее, по нашим ультраструктурным данным, связано с сильными повреждениями нейронов и их отростков при выделении и приготовлении срезов, а также гипоксическими процессами внутри срезов мозга довольно большой толщины, обусловленной крупными размерами самих нейронов (минимальные геометрические размеры препарата обусловлены крупными размерами МН и разветвленностью их дендритных веточек) Обычно это является препятствием для внутриклеточных исследований in vitro (Отмахов, 1987) Данное затруднение, видимо, преодолимо в дальнейшем с помощью разработки и опробования известных приемов, уменьшающих последствия препарирования и инкубации крупных нейронов Это, например, уменьшение толщины срезов, модификация сред инкубации, обработка срезов веществами, повышающими их выживаемость, изменение температуры инкубации и др (King et Schmidt, 1993, Pakhotin et Pakhotina, 1994, Oka, 1996, Pakhotin et al, 1999) Кроме того, нами впервые установлено, что амплитуда вызванных ортодромных ответов МН в переживающих срезах существенно варьирует (рис 3 Г-Е) Ранее, при регистрации антидромно вызванных отрицательных потенциалов в области аксонных чаш МН золотой рыбки обнаружено, что потенциалы правого и левого МН сильно разнятся по амплитуде (Zottoll et al, 1999) Причины такой функциональной асимметрии авторы не исследовали Мы предполагаем, что различия в электрофизиологических свойствах МН отражают присущую всем рыбкам асимметричность функционального состояния мозга на нейрональном уровне В целом, можно предположить, что МН представляют собой адекватную модель для морфофункциональных исследований зависимости активности от размеров нейрона и различных его участков для изучения тонких механизмов адаптации, памяти и патологических проявлений нейродегенеративных заболеваний на клеточном уровне

ВЫВОДЫ

1 Разработан подход к избирательному воздействию на сому и латеральный дендрит одного из двух маутнеровских нейронов, который заключается в направленном физиологическом воздействии на вестибулярный аппарат рыбки, посылающий афферентные входы на указанные структурные части нейрона Результаты экспериментов по унилатеральной вестибулярной стимуляции позволяют предложить маутнеровские нейроны как адекватную модель для дальнейших исследований роли структурных изменений сомы и латерального дендрита в организации функции индивидуального нейрона

2 Впервые применен поведенческий подход к исследованию морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов, который заключается в использовании специфической зрительной стимуляции рыбок Показано, что вызываемое оптомоторной реакцией побуждение рыбки плыть в сторону, противоположную предпочитаемой, в определенных условиях приводит к длительной инверсии моторной асимметрии золотой рыбки На клеточном уровне результат оптокинетической стимуляции выражается в трехкратном уменьшении объема вентрального дендрита ипсилатерального, прежде функционально менее активного, маутнеровского нейрона Таким образом, впервые получены данные, указывающие на прямую взаимосвязь вентральных дендритов, принимающих афферентные входы от зрительного анализатора, со зрительным восприятием движущихся объектов при свободном поведении животного Полученные данные, в целом, показывают, что оптокинетическая стимуляция является адекватным и неинвазивным инструментом для естественной избирательной стимуляции маутнеровского нейрона через вентральный дендрит, и что этот дендрит может оказывать влияние на функциональное состояние маутнеровского нейрона при свободном движении рыбки Последующее использование этого метода открывает новые перспективы в изучении роли данного дендрита в морфофункциональной организации маутнеровского аппарата

3 Показано, что внутриклеточные микроэлектродные исследования маутнеровских нейронов мальков золотой рыбки в условиях in vitro возможны Установлены основные приемы работы с такими объектами для внутриклеточных исследований, возможные артефакты, возникающие в ходе экспериментов, параметры стимуляции и регистрации, а также выявлены некоторые сложности таких экспериментов В целом, разработка метода внутриклеточной регистрации электрической активности маутнеровских нейронов открывает новые возможности изучения функционирования этих нейронов, в том числе, и с точки зрения асимметрии активности и структуры индивидуальных нервных клеток мозга

4 Обнаруженные морфофункциональные корреляции между моторной асимметрией рыбки и структурной асимметрией ее маутнеровских нейронов могут указывать на возможность поддержания баланса функциональной активности маутнеровского аппарата как двухкпеточного двигательного центра за счет перераспределения доминирующей роли с одного нейрона на другой Данные о реципрокном влиянии двух дендритов на морфофункциональное состояние маутнеровского нейрона могут свидетельствовать о способности индивидуального нейрона сохранять постоянство физиологической активности посредством компенсаторной регулировки соотношения размеров сомы и латерального дендрита с одной стороны и вентрального дендрита - с другой Можно предположить существование подобных способов поддержания межнейронной и внутринейронной активности и в ЦНС высших животных

Список работ, опубликованных по данной теме

1 НН Карпук, НВ Орешкин, И Б Михеева, Р Ш Штанчаев. Л Л Павлик, ДА Мошков, «Электрическая активность маутнеровских нейронов мальков золотой рыбки in vitro», Нейрофизиология/Neurophysiology, т 36, №4, стр 288-296 (2004)

2 ДА Мошков, Л Л Павлик, Н Р Тирас, Е Н Безгина, Г 3 Михайлова, Р Ш Штанчаев. «Исследование механизмов воздействия глутамата и дофамина на морфофункциональную асимметрию маутнеровских нейронов золотой рыбки» Научные труды I съезда физиологов СНГ, М Медицина-Здоровье, т 1, стр 36-37 (2005)

3 Г 3 Михайлова, Н В Орешкин, Р Ш Штанчаев. Е Е Григорьева, Е Б Баландина, Н Р Тирас, Д А Мошков, «Морфофункциональное исследование правого и левого маутнеровских нейронов в связи с моторной асимметрией золотых рыбок», в сб Проблемы нейрокибернетики (материалы 14-ой Международной конференции по нейрокибернетике), Ростов-на-Дону, ООО «ЦВВР», т2, стр 253-257 (2005)

4 HP Тирас, Г 3 Михайлова, Е Б Баландина, Е Е Григорьева, Р Ш Штанчаев. ДА Мошков, «Маутнеровские нейроны как модельные объекты для исследования нейродегенеративных заболеваний», в сб Нейронауки теоретичн! та клшнн! аспекти, ДонДМУ, т 1, №1, стр 119-120 (2005)

5 ДА Мошков, ГЗ Михайлова, HP Тирас, Р Ш Штанчаев. «Исследование морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов золотой рыбки», Морфология Колосовские чтения - 2006 (материалы V Международной конференции по функциональной нейроморфологии), Санкт-Петербург, ООО «Эскулап», т129, №2, стр 63-64 (2006)

6 Г 3 Михайлова, Д А Мошков, Р Ш Штанчаев. «Исследования электрической активности маутнеровских нейронов в связи с асимметричностью их структуры», в сб «Биология - наука XXI века» (материалы 10-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), ГП Серпуховская типография, стр 177 (2006)

7 НЮ Дектярева, Н А Коканова, Р Ш Штанчаев, Г 3 Михайлова, «Изучение морфологии вентрального дендрита маутнеровских нейронов золотых рыбок в норме и после выполнения ими оптомоторной реакции», в сб «Биология - наука XXI века» (материалы 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), стр 242 (2007)

8 НА Коканова, Н Ю Дектярева, Р Ш Штанчаев. Г 3 Михайлова, «Маутнеровские нейроны как объекты для изучения структурных изменений болезни клеток при моделировании болезни Альцгеймера», в сб «Биология - наука XXI века» (материалы 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых), стр 253 (2007)

9 Р Ш Штанчаев, «Корреляция функции и структуры двухклеточного аппарата маутнеровских нейронов золотой рыбки», в сб «Биология - наука XXI века» (материалы 11-й Мездународной Пущинской школы-конференции молодых ученых), ГП Серпуховская типография, стр 291-292 (2007)

10 Р Ш Штанчаев. ГЗ Михайлова, НЮ Дектярева, НА Коканова, «Разработка подхода к индукции реверсии моторной асимметрии золотых рыбок с помощью специфической зрительной стимуляции», в сб «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (материалы 10-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье»), Санкт-Петербург, СПбГУ, стр 529-530 (2007)

11 HP Тирас, ГЗ Михайлова, Р Ш Штанчаев. НА Коканова, ДА Мошков, «Взаимодействия бета-амилоида с маутнеровскими нейронами», в сб «XX съезд Физиологического общества им И П Павлова Тезисы докладов», Москва, «Русский врач», стр 443 (2007)

12 Р Ш Штанчаев. ГЗ Михайлова, НЮ Дектярева, НР Тирас, ДА Мошков, «Оптомоторная реакция изменяет функциональную и структурную асимметрию маутнеровских нейронов золотой рыбки», в сб «XX съезд Физиологического общества им И П Павлова Тезисы докладов», Москва, «Русский врач», стр 493(2007)

13 ГЗ Михайлова, Р Ш Штанчаев. НА Коканова, НЮ Дектярева, ДА Мошков, Н Р Тирас, «Морфофункциональное исследование асимметрии правого и левого маутнеровских нейронов золотой рыбки при экспериментально индуцированной болезни Апьцгеймера» Третий Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», М «Макс-пресс», стр 163-164 (2007)

14 Р Ш Штанчаев. ГЗ Михайлова, НЮ Дектярева, НА Коканова, ДА Мошков, «Морфофункциональное исследование вентрального и латерального дендритов при экспериментально индуцированных изменениях асимметрии правого и левого маутнеровских нейронов золотой рыбки» Третий Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», М «Макс-пресс», стр 271-272 (2007)

15 ДА Мошков, ГЗ Михайлова, Р Ш Штанчаев. НА Коканова, НЮ Дектярева, «Структурные механизмы поддержания гомеостаза функционального состояния маутнеровских нейронов золотой рыбки», в сб Нейронауки теоретичш та кл1Н1чж аспекти, ДонДМУ, т 3, №1, стр 27 (2007)

16 Р Ш Штанчаев. Г 3 Михайлова, Н Ю Дектярева, НА Коканова, Н Р Тирас, ДА Мошков, «Влияние оптокинетической стимуляции на моторную асимметрию у золотой рыбки», Нейрофизиология/ЫеигорЬувюЬду, т 39, N22, стр 133-145 (2007)

17 Р Ш Штанчаев, ГЗ Михайлова, НЮ Дектярева, НА Коканова, ДА Мошков, «Изменения вентрального дендрита маутнеровского нейрона золотой рыбки под воздействием оптокинетической стимуляции», Морфология, т132, №6, стр 29-34 (2007)

18 НЮ Дектярева, Р Ш Штанчаев. ГЗ Михайлова, ДА Мошков, «Влияние оптокинетических тренировочных стимуляций на стабилизацию моторной асимметрии рыбки», НейрофизиологияЛЧеигор11узю1оду (2008), принята в печать

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 05-04-48839 и гранта поддержки ведущих научных школ НШ-№4981 2006 4

Заказ № 129/12/07 Подписано в печать 28 12 2007 Тираж 100 эю Уел пл 1,25

ООО "Цифровичок", Тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 штк с/г ги, е-тт1 т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Штанчаев, Рашид Шамильевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. МОРФОЛОГИЯ И ФУНКЦИИ МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ

1.2. ОСНОВНЫЕ СЕНСОРНЫЕ ВХОДЫ МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ i ' ; »

1.2.1. ВЕСТИБУЛЯРНЫЙ АППАРАТ И СВЯЗЬ ЕГО С

МАУТНЕРОВСКИМИ НЕЙРОНАМИ

1.2.2. ЗРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗАТОР РЫБ. СТРОЕНИЕ И СВЯЗЬ ЕГО С НЕЙРОНАМИ РЕТИКУЛЯРНОЙ ФОРМАЦИИ

1.3. ИССЛЕДОВАНИЯ ЗРИТЕЛЬНО-ДВИГАТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ ЖИВОТНЫХ

1.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ

1.5. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ МОТОРНАЯ АСИММЕТРИЯ ПОЗВОНОЧНЫХ. ВЛИЯНИЕ СЕНСОРНОЙ СИСТЕМЫ, СТРЕССА И ОБУЧЕНИЯ НА МОТОРНУЮ АСИММЕТРИЮ

1.6. СТРУКТУРНАЯ АСИММЕТРИЯ МОЗГА ПОЗВОНОЧНЫХ И КОРРЕЛЯЦИЯ ЕЕ С МОТОРНОЙ АСИММЕТРИЕЙ. ВЛИЯНИЕ РАЗРУШЕНИЯ СЕНСОРНЫХ ОРГАНОВ НА МОРФОЛОГИЧЕСКУЮ АСИММЕТРИЮ

1.7. ВКЛАД ДЕНДРИТОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ

ИНДИВИДУАЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ

1.7.1. УЧАСТИЕ ДЕНДРИТОВ В ОБРАБОТКЕ СИНАПТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

1.7.2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ НЕЙРОНАЛЬНОГО ГОМЕОСТАЗА И СВЯЗЬ ЕГО СО СТРУКТУРОЙ ДЕНДРИТОВ

1.7.3. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СТРЕССОРНЫХ ФАКТОРОВ, СТИМУЛЯЦИИ И ДЕАФФЕРЕНТАЦИИ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ДЕНДРИТОВ

1.7.4. РОСТ И РАЗВИТИЕ ДЕНДРИТОВ. УЧАСТИЕ ВНУТРИДЕНДРИТНЫХ ОРГАНЕЛЛ В ПРОЦЕССАХ ДЕНДРИТНОГО РАЗВИТИЯ И ПЛАСТИЧНОСТИ

1.8. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ИЗУЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ СТРУКТУРНО

ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ НЕЙРОНОВ

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2. ТЕСТИРОВАНИЕ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ РЫБОК

2.3. ОЦЕНКА ВКЛАДОВ СТАТОАКУСТИЧЕСКОЙ И'ЗРИТЕЛЬНОЙ АФФЕРЕНТАЦИИ В МОТОРНОЕ ПОВЕДЕНИЕ РЫБОК

2.3.1. ДЕАФФЕРЕНТАЦИЯ ВЕСТИБУЛЯРНОГО ВХОДА НА МН

2.3.2. ЗРИТЕЛЬНАЯ ДЕАФФЕРЕНТАЦИЯ

2.3.3. ВЕСТИБУЛЯРНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ

2.3.4. ЗРИТЕЛЬНАЯ СТИМУЛЯЦИЯ

2.4. ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МН

2.5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ МН

2.5.1. МЕТОДИКА ФИКСАЦИИ БЛОКОВ МОЗГА

2.5.2. МЕТОДИКА ТРЕХМЕРНОЙ РЕКОНСТРУКЦИИ МН

2.6. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ВЛИЯНИЕ ВЕСТИБУЛЯРНОЙ ДЕАФФЕРЕНТАЦИИ НА МОТОРНУЮ АСИММЕТРИЮ РЫБКИ И МОРФОЛОГИЮ МН

3.2. ИЗМЕНЕНИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ' АСИМЕТРИИ МН ПОСЛЕ УНИЛАТЕРАЛЬНОЙ ВЕСТИБУЛЯРНОЙ СТИМУЛЯЦИИ

3.3. ВЛИЯНИЕ ЗРИТЕЛЬНОЙ ДЕАФФЕРЕНТАЦИИ НА МОТОРНУЮ АСИММЕТРИЮ РЫБКИ И СТРУКТУРНУЮ АСИММЕТРИЮ МН

3.4. ВЛИЯНИЕ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НА МОТОРНУЮ АСИММЕТРИЮ ЗОЛОТЫХ РЫБОК

3.4.1. ВЫБОР ПАРАМЕТРОВ ЗРИТЕЛЬНЫХ ОРИЕНТИРОВ

3.4.2. ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ И НАПРАВЛЕНИЯ ВРАЩЕНИЯ ОПТОМОТОРНОГО БАРАБАНА НА ПОВЕДЕНИЕ РЫБКИ

3.4.3. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ

СТИМУЛЯЦИИ НА МОТОРНУЮ АСИММЕТРИЮ РЫБОК

3.4.4. ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ МОТОРНОЙ АСИММЕТРИИ ЗОЛОТЫХ РЫБОК ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОЙ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ

3.4.5. ВЛИЯНИЕ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НА РЫБОК С ЭНУКЛЕИРОВАННЫМ ГЛАЗОМ

3.4.6. ВЛИЯНИЕ КОНТРА ЛАТЕРАЛЬНОЙ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НА ИНТАКТНЫХ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ РЫБОК

3.5. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ МН ДО И ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ КОНТРАЛАТЕРАЛЬНОЙ ОПТОКИНЕТИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ

3.6. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

МАУТНЕРОВСКИХ НЕЙРОНОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка физиологических моделей для исследования морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов золотой рыбки"

Определение взаимосвязи функции и структуры нервной ткани является одной из важнейших проблем при исследовании механизмов памяти, а также функциональной асимметрии мозга (Косицын, 1976; Бианки, 1985; Фокин, 2004; Tailby et al, 2005; Cuntz et al, 2007). Предполагается, что при увеличении активности отделов или центров мозга увеличиваются число и размер нейронов с их многочисленными разветвленными дендритами, и синапсами. На это указывает большое количество экспериментальных данных и гипотез (Goodman et al, 1988; Ben-Ari et Represa, 1990; Sunanda et al, 1995; Agmon-Snir et al, 1998; Mizrahi et Libersat, 2002; Kuo et al, 2005; Zuo et al, 2005; Haas et al, 2006; Samsonovich et Ascoli, 2006; Makarova et al, 2007).

Вместе с тем, из-за слишком сложной организации мозга до сих пор не объяснено, как конкретная структурная особенность индивидуального дендрита проявляется в функции конкретного нейрона. В исследованиях этой проблемы очевидна перспектива использования, маутнеровских нейронов (МН) рыб и амфибий (Stefanelli, 1951; Сахаров, 1961), классических объектов для изучения различных аспектов адаптации, памяти (Мошков, 1985; Korn et Faber, 2005), а с недавнего времени и асимметрии мозга (Михайлова и др., 2005; 2006). Сома и латеральный дендрит каждого МН получают слуховую и вестибулярную, а вентральный дендрит - зрительную афферентацию (Zottoli et al, 1987; Weiss et al, 2006). Аксон иннервирует через мотонейроны мускулатуру противоположной стороны тела. Слуховая (вестибулярная) или зрительная стимуляция одного из МН, благодаря полному анатомическому перекресту зрительных нервов и аксонов МН (Roth, 1979), вызывает поворот тела рыбки. Этот С-образный поворот наблюдается как при реакции испуга, так и при свободном плавании и осуществляется в противоположную от МН сторону за счет унилатерального изгиба хвоста. Число поворотов, отнесенное ко времени, коррелирует с амплитудой электрического ответа, измеренной в переживающих срезах мозга (Тирас и др., 2006), поэтому оно может служить косвенной оценкой функциональной активности МН.

Однако пока в таком морфофункциональном аспекте с использованием вестибулярных и слуховых стимуляций и денерваций в основном изучается сома и латеральный дендрит МН (Безгина и др., 1999; Zottoli et Faber, 1979; Михайлова и др., 2006). Исследования же вентрального дендрита МН и зрительного восприятия проводятся раздельно, либо с позиций участия зрения в эволюции поведения и экологии рыб (Vallortigara, 2000; Canfield, 2006), либо с позиций вовлечения зрительных сигналов в электрофизиологическую активность МН (Canfield, 2003; Preuss et Faber, 2003; Weiss et al, 2006). Взаимосвязь структуры вентрального дендрита с функциональной активностью МН и свободным поведением рыбок остается абсолютно не изученной, в частности, из-за нерешенности вопроса о его естественной направленной зрительной стимуляции.

Кроме того, не в полной мере изучен вклад структуры сомы и дендритов в функциональное состояние МН. Для оценки функционального состояния этих клеток не применяется внутриклеточная микроэлектродная регистрация вызванных электрических ответов в переживающих срезах мозга. Для решения обозначенных задач необходима разработка соответствующих подходов и морфофункциональные исследования системного и клеточного уровней.

Цель данной работы заключалась в разработке физиологических моделей асимметрии МН, которые могут быть использованы для выяснения вопроса о межнейронных взаимоотношениях и исследования вклада латерального и вентрального дендритов в функциональную активность индивидуального МН золотой рыбки.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить функциональную активность МН в виде моторной асимметрии золотой рыбки при унилатеральной вестибулярной стимуляции и депривации статоакустического входа. Исследовать морфологические характеристики латерального дендрита при данных воздействиях.

2. Разработать установку для изучения избирательного влияния зрительной стимуляции на один из двух МН, подобрать условия оптимальных режимов данной стимуляции, приводящих к инверсии моторной асимметрии рыбки. Исследовать влияние односторонней энуклеации глаза на моторную асимметрию рыбок. Разработать условия для воздействия зрительной (оптокинетической) стимуляции на закрепленную в пространстве (иммобилизованную) рыбку.

3. Изучить морфологические характеристики вентрального дендрита МН при различных воздействиях на зрительный аппарат.

4. Подобрать условия для регистрации внутриклеточной электрической активности МН in vitro в переживающих фрагментах продолговатого мозга мальков золотой рыбки.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Штанчаев, Рашид Шамильевич

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны подходы к избирательному воздействию на сому и латеральный дендрит одного из двух маутнеровских нейронов посредством направленного физиологического воздействия на вестибулярный аппарат рыбки. Результаты экспериментов по унилатеральной вестибулярной стимуляции позволяют предложить систему маутнеровских нейронов как адекватную модель для дальнейших исследований роли структурных изменений сомы и латерального дендрита в организации функции индивидуального нейрона.

2. Впервые применен поведенческий подход к исследованию морфофункциональной асимметрии маутнеровских нейронов, который заключается в использовании специфической зрительной стимуляции рыбок. Полученные данные указывают на прямую взаимосвязь вентральных дендритов, принимающих афферентные входы от зрительного анализатора, со зрительным восприятием движущихся объектов при свободном поведении животного. Показано, что оптокинетическая стимуляция является адекватным и нетравматическим инструментом для естественной избирательной стимуляции маутнеровского нейрона через вентральный дендрит, и что этот дендрит может оказывать влияние на функциональное состояние маутнеровского нейрона при свободном движении рыбки. Последующее использование этого метода открывает новые перспективы в изучении роли данного дендрита в морфофункциональной организации системы маутнеровских нейронов.

3. Показана возможность внутриклеточных микроэлектродных исследований маутнеровских нейронов мальков золотой рыбки в условиях in vitro. Разработка метода внутриклеточной регистрации электрической активности маутнеровских нейронов открывает новые возможности изучения функционирования этих нейронов, в том числе, и с точки зрения асимметрии активности и структуры индивидуальных нервных клеток мозга.

4. Обнаруженные морфофункциональные корреляции между моторной асимметрией рыбки и структурной асимметрией ее маутнеровских нейронов могут указывать на возможность поддержания баланса функциональной активности маутнеровского аппарата как двухклеточного двигательного центра за счет перераспределения доминирующей роли с одного нейрона на другой. Данные о реципрокном влиянии двух дендритов на морфофункциональное состояние маутнеровского нейрона могут свидетельствовать о способности индивидуального нейрона сохранять постоянство физиологической активности посредством компенсаторной регулировки соотношения размеров сомы и латерального дендрита с одной стороны и вентрального дендрита - с другой. Можно предположить существование подобных способов поддержания межнейронной и внутринейронной активности и в ЦНС высших животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из важных целей нейроморфологии является доказательство взаимосвязи структуры и функции нейронов. Под структурой можно подразумевать геометрию или размер нейрона, а под функцией - его активность, проявляемую в виде прямой электрической активности нейрона или косвенного совершаемого животным поведенческого акта, индуцированного именно этим нейроном. Уникальность маутнеровских нейронов золотой рыбки, симметрично расположенных в мозгу гигантских клеток, отвечающих вместе с ретикулоспинальными нейронами и мотонейронами за контрактуру правой или левой туловищной мускулатуры (Мошков, 1985; Korn et Faber, 2005), доминирование одного МН над другим, проявляющееся в преимущественном выполнении поворотов рыбкой в определенную сторону, и его структурная изменчивость под влиянием билатеральной и унилатеральной вестибулярной стимуляции (Михайлова и др., 2006), способствуют исследованию на этих нейронах структурно-функциональной взаимосвязи. Возможность объемной реконструкции структуры по серийным гистологическим срезам и определения истинных объемов МН и их индивидуальных дендритов (Михайлова и др., 2005) послужила предпосылкой напрямую исследовать влияние размера МН или любой его части на функциональную активность.

Для разработки обозначенной проблемы в совокупности требовались дальнейшие комплексные исследования, главными из которых являлись разработка способов естественного раздельного избирательного воздействия на любой из дендритов МН и регистрация функции этих нейронов не только по поведению рыбки, но и электрофизиологическим методом.

Полученные данные показали, что контралатеральная вестибулярная стимуляция сопровождается коррелирующими друг с другом уменьшением размера сомы и латерального дендрита контралатерального МН и снижением его функциональной активности. Последнее проявляется в сглаживании моторной асимметрии рыбки. Применение впервые оптокинетической стимуляции как внешнего фактора воздействия на моторную асимметрию золотой рыбки выявило, что она в случае контралатеральной направленности инвертирует моторную асимметрию. При непрерывном следовании за полосками, наблюдаемыми через прозрачную стенку аквариума, рыбки, чтобы не упустить их из поля зрения, вынуждены все время поворачиваться в одну сторону, обращая один свой глаз в сторону полосок и совершая периодически С-образные изгибы тела (рис.23).

Оптомоторная реакция рыбок является врожденной, т.е. безусловнорефлекторной, и очень сильной (Kroger et al., 2003). Известно, что МН управляются двумя главными сенсорными афферентными входами, статоакустическим (Zottoli et Faber, 1979) и зрительным (Zottoli et al, 1987). Электрическая стимуляция каждого из этих сенсорных

Рис.23. Поведение рыбки в центральном цилиндре (Ц) во время вращения оптомоторного барабана (ОБ). Съемка производилась снизу, через модифицированное прозрачное дно установки. Два кадра из видеоролика, демонстрирующие С-образные изгибы хвостового плавника при движении рыбки вслед за полосками. входов вызывает потенциал действия одного из двух МН (в зависимости от того, с какой стороны приходит стимул), который, в свою очередь, производит С-изгиб хвостового плавника рыбки. В поведении он характеризуется как поворот рыбки на 90° с одновременным рывком тела вбок в ту же сторону, и назван реакцией испуга. Кинематическая характеристика С-изгиба и сопровождающего его полевого электрического потенциала, регистрируемого с поверхности продолговатого мозга как внеклеточный ответ МН, коррелирует с направлением реакции, вне зависимости, вызвана ли она звуковым или зрительным стимулом (Weiss et al, 2006).

На основании этого можно предположить, что рыбка для адекватного поведения в естественных условиях при свободном плавании тоже может использовать как зрительные, так и вестибулярные стимулы, и при этом в поведенческую реакцию будут вовлекаться МН как центры управления поворотами рыбки. Поэтому данные об инверсии моторной асимметрии рыбок под влиянием длительной оптокинетической стимуляции рассматриваются как результат утомления зрительного входа ипсилатерального МН, что впервые наблюдается при спонтанном движении рыбки.

Интересным наблюдением являются различия в реакции рыбок на контралатеральную оптокинетическую стимуляцию в случае энуклеации одного глаза. У 2/3 рыбок-правшей с удаленным правым глазом и рыбок-левшей с удаленным левым глазом оптомоторная реакция не вызывала никакого эффекта, в то время как у оставшихся рыбок она приводила к инверсии моторной асимметрии. Известно, что у рыбок перекрест зрительных входов является полным, и каждый глаз иннервирует контралатеральный тектум (Roth, 1979), а значит и МН. Зрение необходимо рыбке для распознавания пищи (положительный стимул) и хищника (отрицательный стимул). Настройку экспрессии данных стимулов в виде адекватного поведения осуществляет тектум и ретикулоспинальные нейроны (Roeser et Baier, 2003). В настоящее время доказано, что зрение у рыб асимметрично (Vallortigara, 2000; Lesley et Andrew, 2002; Фокин, 2004). Поэтому данные по энуклеации глаз и последующей оптокинетической стимуляции позволяют предположить, что у мальков золотых рыбок также проявляется асимметрия зрения, и что она не всегда совпадает с асимметричностью моторного поведения рыбок.

Результаты данной работы позволили также впервые установить, что контралатеральная зрительная стимуляция МН приводит к существенному избирательному уменьшению вентрального дендрита, не затрагивая при этом других частей нейрона. В этом случае редукция размеров ВД, той части МН, где расположены синапсы от зрительного анализатора (Zottoli et al, 1987), вероятно, обусловлена увеличенной нагрузкой зрительного входа. Очевидно, что длительная стимуляция избирательно утомляла ВД у того нейрона, частая и продолжительная активация которого требовалась для совершения поворота в сторону следования полосок. Это, по-видимому, и приводило к уменьшению размеров ВД. Аналогичный случай можно было наблюдать, когда естественная длительная вестибулярная стимуляция уменьшала сому и латеральный дендрит, иннервируемые статоакустическим нервом, у того МН (на этот раз контралатерального), преимущественная активация которого, по-видимому, требовалась для сохранения равновесия рыбки.

В целом, исследования влияния оптомоторной реакции на морфофункциональное состояние МН показывают, что оптокинетическая стимуляция является адекватным и неинвазивным инструментом для естественной избирательной стимуляции МН через ВД, и что ВД может оказывать влияние на функциональное состояние МН при свободном движении рыбки. Ее последующее использование открывает новые перспективы в изучении роли этого дендрита в морфофункциональной организации и пластичности МН.

Основным результатом электрофизиологической части работы является демонстрация того, что внутриклеточные микроэлектродные исследования МН мальков золотой рыбки в условиях in vitro возможны. Кроме того, интересно заметить, что экстраклеточные электрические характеристики вызванных ортодромных ответов МН в переживающих срезах существенно варьируют при отведениях от разных клеток. Ранее, при регистрации антидромно вызванных отрицательных потенциалов в области аксонных чаш МН золотой рыбки обнаружено (рис.24), что потенциалы правого и левого МН сильно отличаются друг от друга (Zottoli et al, 1999). Причины такой функциональной асимметрии авторы

Рис.24. Антидромно вызванные потенциалы левого (А) и правого (В) маутнеровских нейронов одной и той же золотой рыбки in vivo. Калибровка 5 мВ, 1 мс. Регистрация производилась вблизи аксонной чаши, в области максимального спайка. Видны различия в амплитуде ответа, а также характеристиках внешнего гиперполяризационного потенциала, представляющего собой активность тормозных интернейронов, ассоциированных с МН (Zottoli et al, 1999). не исследовали. Мы предполагаем, что различия в электрофизиологических свойствах МН отражают присущую всем рыбкам асимметричность функционального состояния мозга на нейрональном уровне.

Таким образом; разработанные подходы и полученные данные показывают, что МН могут служить адекватным объектом для исследования роли индивидуальных дендритов отдельно взятого нейрона в создании функциональной интегральной активности. Они показывают также, каким образом два нейрона одного мозга и два дендрита одного нейрона благодаря своей асимметрии вносят свой вклад в гомеостаз; двигательных центров мозга, поддерживая стабильную двигательную активность рыбки в широко изменяющихся условиях внешней среды. Данные результаты, в целом, дают возможность предполагать, что МН играют, роль двухклеточного двигательного центра, обеспечивающего выполнение поворотов при свободном движении рыбок.

Проблема имеет и прикладной аспект, затронутый в ходе выполнения основной работы. Используя асимметрию МН и их дендритов и связь ее с моторной асимметрией рыбки, можно проводить исследования медицинского характера на МН. В частности, аппликацией бета-амилоида, полимерного нерастворимого токсического компонента сенильных бляшек, можно индуцировать в МН изменчивость геометрии и тестировать влияние данного эффекта в виде патологического изменения структуры нейронов на поведение рыбки. Это дает возможность изучать структурные механизмы модельной формы болезни Альцгеймера.

В целом, можно предположить, что МН представляют собой адекватную модель для морфофункциональных исследований зависимости активности от размеров нейрона и различных его участков для изучения тонких механизмов адаптации, памяти и патологических проявлений нейродегенеративных заболеваний на клеточном уровне.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Штанчаев, Рашид Шамильевич, Пущино

1. Безгина Е.Н., Мошков Д.А., Никитин В.А., Савельева Л.Н., Утешев В.К. Морфогенез маутнеровских нейронов головастиков шпорцевой лягушки в условиях ранней односторонней энуклеации глаза. Морфология, 1999, т. 115, № 3, с. 49-52.

2. Бианки В.Л. Асимметрия мозга животных. Л.: Наука, 1985.

3. Боголепова И.Н., Малофеева Л.И. Структурная асимметрия корковых формаций мозга человека. М.: Изд-во Росс, ун-та дружбы народов, 2003, 155с.

4. Габибов И.М., Глезер В.Д. Асимметрия размеров рецептивных полей нейронов 21-го поля коры больших полушарий мозга кошки. Докл. АН СССР, 1985, т.284, №4, с. 1014-1015.

5. Гусельников В.И., Логинов Б.В. Зрительный анализатор рыб. М: изд-во Московского ун-та, 1976, 152 с.

6. Егоров А.Ю., Тихомирова Т.В. Профили функциональной асимметрии мозга у больных алкоголизмом и наркоманией. Ж. Эвол. Биох. и Физиол., 2004, т.40, №5, с.450-454.

7. Иоффе М.Е., Плетнева Е.В., Сташкевич И.С. Природа функциональной моторной асимметрии у животных. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия, под ред. В.Ф. Фокина, Научный мир, Москва, 2004, с.80-97.

8. Карпук Н.И., Орешкин Н.В., Михеева И.Б., Штанчаев Р.Ш., Павлик Л.Л., Мошков Д.А. Электрическая активность маутнеровскихнейронов мальков золотой рыбки in vitro. Нейрофизиология/Neurophysiology, 2004, т.36, №4, с. 288-296.

9. Косицын Н.С. Микроструктура дендритов и аксодендритических связей в центральной нервной системе. М.: Наука, 1976, 198 с.

10. Леутин В.П., Осипова Л.П., Кривощеков С.Г. Связь гормональных показателей стресса с сенсомоторными асимметриями у северных селькупов. Физиология человека, 1996, т.22, №1, с.131-133.

11. Михайлова Г.З., Павлик В.Д., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Корреляция размеров маутнеровских нейронов с предпочтением золотых рыбок поворачиваться вправо или влево. Морфология, 2005, т.37, №1, с.52-60.

12. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука, 1985, 200с.

13. Непомнящих В.А., Гремячих В.А. Связь между структурой траектории и асимметрией выбора направления движений у тиляпий Oreochromys mossambicus Peters (Cichlidae). Журнал общей биологии, 1993, т.54, №5, с. 619-626.

14. Павлов Д.С. Оптомоторная реакция и особенности ориентации рыб в потоке воды. М.: Наука, 1970, 147 с.

15. Проссер JI., под ред. Сравнительная физиология животных. Т. 1-3, М.: Мир, 1978.

16. Протасов В.Р. Биоакустика рыб. М.: Наука, 1965, 207 с.

17. Прощина А.Е., Бесова Н.В., Воронов К.А., Гулимова В.И., Серова Л.В., Савельев С.В. Исследование морфогенеза асимметрии ядер головного мозга крысы в норме и условиях микрогравитации. Бюлл. эксп. биол. и мед., 2000, т.130, №9, с. 342-345.

18. Садеков Р.А., Вендрова М.И. Моторная асимметрия и межполушарные взаимодействия при болезни Паркинсона. Журн. Неврологии и психиатрии, 2004, №1, с. 42-46.

19. Сахаров Д.А. Гигантские нейроны Маутнера. Успехи совр. биологии, 1961, т.52, № 4, с.112-124.

20. Тирас Н.Р., Михайлова Г.З., Мошков Д.А. Эффекты, вызываемые полимеризующим актин пептидом, в маутнеровских нейронах золотой рыбки. Нейрофизиология/Neurophysiology, 2006, т.38, №5, с.389-400.

21. Фокин В.Ф. Эволюция центрально-периферической организации функциональной межполушарной асимметрии. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия, под ред. В.Ф. Фокина, Научный мир, Москва, 2004, с.47-79.

22. Хайнд Р. Поведение животных. Синтез этологии и сравнительной психологии. М.: Мир, 1975, 856 с.

23. Черноситов А.В., Орлов В.И. Функциональная асимметрия мозга и неспецифическая резистентность. В кн.: Функциональная межполушарная асимметрия, под ред. В.Ф. Фокина, Научный мир, Москва, 2004, с.444-480.

24. Agmon-Snir, Н., Carr, С.Е., Rinzel, J. The role of dendrites in auditory coincidence detection. -Nature, 1998, vol.393, 268-272.

25. Anstis, S., Hutahajan, P., Cavanagh P. Optomotor test for wave length sensitivity in guppyfish {Poecilia reticulata). -Vision Res., 1998, vol.38, No. 1,45-53.

26. Ben-Ari, Y., Represa, A. Brief seizure episodes induce long-term potentiation and mossy fibre sprouting in the hippocampus. -Trends Neurosci. 1990, vol.13, 312-318.

27. Binder, J.R., Frost, J.A., Hammeke, T.A. Function of the left planum temporale in auditory and linguistic processing. -Brain, 1996, vol.119, Pt.4, 1239-1247.

28. Bisazza, A., Cantalupo, C., Robins, A., Rogers, L., Vallortigara, G. Rightpawedness in toads. -Nature, 1996, vol.379, 408.

29. Bisazza, A., Vallortigara, G. Rotational swimming preferences in mosquitofish (Gambusia holbrooki): Evidence for brain lateralization? -Physiology and Behavior, 1997, vol.62, 1405-1407.

30. Bisazza, A., Rogers, L.J., Vallortigara, G. The origins of cerebral asymmetry: a review of evidence of behavioural and brain lateralization in fishes, amphibians, and reptiles. -Neurosci Biobehav Rev., 1998, vol.22, 411 -426.

31. Bisazza, A., Dadda, M., Cantalupo, C. Further evidence for mirror-reversed laterality in lines of fish selected for leftward or rightward turning when facing a predator model. -Behav. Brain Res., 2005, vol.156, No.l, 165-171.

32. Borst, A., Egelhaaf, M. Dendritic processing of synaptic information by sensory interneurons. -TINS, 1994, vol.17, No6, 257-263.

33. Canfield, J.G., Functional evidence for visuospatial coding in the Mauthner neuron. -Brain, Behav. and Evol., 2006, vol.67, 188-202.

34. Canfield, J.G. Temporal constraints on visually directed C-start responses: behavioral and physiological correlates. -Brain Behav, Evol., 2003, vol.61, No.3, 148-158.

35. Canfield, J.G., Rose, G.Y. Activation of Mauthner neurons during prey capture. -J. Compar. Physiology A, 1993, vol. 172, Iss. 5, p. 611-618.

36. Cantalupo, C., Bisazza, A., Vallortigara, G. Lateralization of predator evasion response in a teleost fish (Girardinus falcatus). Neuropsychologia, 1995, vol. 33, 1637-1646.

37. Chuang, J.Z., Zhao, Y., Sung, C.H. SARA-regulated vesicular targeting underlies formation of the light-sensing organelle in mammalian rods. -Cell, 2007, vol.130, 535-47.

38. Coleman, P.D., Flood, D.G. Neuron numbers and dendritic extent in normal aging and Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging, 1987, vol.8, 521-545.

39. Concha, M.L., Wilson, S.W. Asymmetry in the epithalamus of vertebrates. -J.Anat., 2001, vol. 199, Pt 1-2, 63-84.

40. Cronley-Dillon, J.R., Muntz, W.R.A. The spectral sensitivity of the goldfish and the clawed toad tadpole under photopic conditions. -J. Exp. Biol., 1965, vol.42, No. 3, 481-493.

41. Cuntz, H., Borst, A., Segev, I. Optimization principles of dendritic structure. -Theor. Biol. Med. Model., 2007, vol.4.

42. Curti, S. Pereda, A. Voltage-dependent enhancement of electrical coupling by a subthreshold sodium current. -J. Neurosci., 2004, vol.24, 3999-4010.

43. Diamond, J. The Mauthner cell. In: Fish physiology N.Y., Acad. Press., 1971, vol. 5, p. 265-346.

44. Dickstein, D.L., Kabaso, D., Rocher, A.B., Luebke, J.I., Wearne, S.L., Hof, P.R. Changes in the structural complexity of the aged brain. -Aging cell, 2007, vol.6, No.3, 275-284.

45. Eaton, R.S., Lavender, W.A., Wieland, C.M. Identification of Mauthner-initiated response patterns in goldfish: Evidence from simultaneouscinematography and electrophysiology. -J. Сотр. Physiol., 1981, vol.144, 521-533.

46. Faber, D.S., Korn, H. Neurobiology of the Mauthner cell. N.Y.: Raven Press, 1978, 279.

47. Fallgatter, A.J., Roesler, M., Sitzmann, L., Heidrich, A., Mueller, T.J., Strik, W.K. Loss of functional hemispheric asymmetry in Alzheimer's dementia assessed with near-infrared spectroscopy. -Cognitive Brain Res., 1997, vol.6, 67-72.

48. Fulga, T.A., Elson-Schwab, I., Khurana, V., Steinhilb, M.L., Spires, T.L., Hyman, B.T., Feany, M.B. Abnormal bundling and accumulation of F-actin mediates tau-induced neuronal degeneration in vivo. -Nat. Cell Biol., 2007, vol.9, No.2, 139-148.

49. Furshpan, T.J., Furukawa, T. Intracellular and extracellular responses of the several regions of the Mauthner cell. -J. Neurophysiol., 1962, vol.25, 732-771.

50. Goodman, L.J. The role of certain optomotor reactions in regulating stability in the rolling plane during flight in the desert locust Schistocerca Gregaria. -J. Exp. Biol., 1965, vol.42, 385-407.

51. Goodman, L.A., Covell, D.A., Model, P.G. Regenerating afferent fibers stimulate the recovery of mauthner cell dendritic branching in the axolotl. -J. Neurosci., 1988, vol.8, 3025-3034.

52. Grover, B.G., Sharma, S.C. Tectal projections in the goldfish (Carassius auratus): a degeneration study. -J. Сотр. Neurol., 1979, vol.184, 435454.

53. Gtinturktin, O. Avian visual lateralization: a review. -NeuroReport, 1997, vol.8, 3-11.

54. Haas, K., Li, J., Cline, H.T. AMPA receptors regulate experience-dependent dendritic arbor growth in vivo. -PNAS, 2006, vol.103, No.32, 12127-12131.

55. Hall, G.F., Yao J., Lee G. Human tau becomes phosphorylated and forms filamentous deposits when overexpressed in lamprey central neurons in situ. -Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, vol.94, No.9, 4733-4738.

56. Horstmann, A., Hoffmann, K.P. Target selection in eye-hand coordination: Do we reach to where we look or do we look to where we reach?-Exp. Brain Res., 2005, vol.167, No.2, 187-195.

57. Horton, A.C., Ehlers, M.D. Secretory trafficking in neuronal dendrites. — Nature cell biology, 2004, vol.6, No.7, 585-591.

58. Kimmel, Ch.B., Powell, S.L., Kimmel, R.J. Specific reduction of development of the Mauthner neuron lateral dendrite after otic capsule ablation in Brachyodanio rerio. -Develop. Biol., 1982, vol. 91, No.2, 468473.

59. Kimura, D. Cerebral dominance and the perception of verbal stimuli. -Canad. J. Psychol, 1961, vol.15, No. 1, 166-171.

60. King, W.M., Schmidt, J.T. Nucleus isthmi in goldfish: in vitro recordings and fiber connections revealed by HRP injections. -Visual Neuroscience, 1993, vol.10, No.3, 419-437.

61. Klar, M, Hoffmann, K.-P. Visual direction-selective neurons in the pretectum of the rainbow trout. -Brain Res. Bull., 2002, vol.57, 431-433.

62. Korn, H., Faber, D.S. The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making? -Neuron, 2005, vol. 47, No.l, 13-28.

63. Kroger, R.H.H., Knoblauch, В., Wagner, H.-J. Rearing in different photic and spectral environments changes the optomotor response to chromatic stimuli in the cichlid fish Aequidens pulcher. -J. Exp. Biol., 2003, vol.206, No.l 1, 1643-1648.

64. Kuffler, S.W., Nicholls, J.G. From neuron to brain. Sinauer Assotiates, Inc., Sunderland, Mass, 1976, 486.

65. Kuo, Ch.T., Jan, L.Y., Jan, Y.N. Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling. -PNAS, 2005, vol.102, No.42, 15230-15235.

66. Legendre, P., Korn, H. Voltage dependence of conductance changes evoked by glycine release in the zebrafish brain. -J. Neurophysiol., 1995, vol.73, No.6, 2404-2412.

67. Lesley, R., Andrew, R. Comparative vertebrate lateralization. -Cambridge University Press, Cambridge, 2002.

68. Lesne, S., Koh, M.T., Kotilinek, L., Kayed, R., Glabe, C.G., Yang, A., Gallagher, M., Ashe, K.H. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. -Nature, 2006, vol.440, 352-357.

69. Li, Z., Okamoto, K.-I., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. -Cell, 2004, vol.119, 873-887.

70. Majewska, A.K., Newton, J.R., Sur, M. Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo. -J. Neurosci., 2006, vol.26, 3021-3029.

71. Makarova, J., Ibarz, J.M., Canals, S., Herreras O. A steady-state model of spreading depression predicts the importance of an unknown conductance in specific dendritic domains. -Biophysical J., 2007, vol.92, 4216-4232.

72. Malashichev, E.B., Wassersug, R.J. Left and right in the amphibian world: which way to develop and where to turn? -BioEssays, 2004, vol.26, 512522.

73. Mizrahi, A., Libersat, F. Afferent input regulates the formation of distal dendritic branches. -J. Сотр. Neur., 2002, vol.452. 1-10.

74. Moolman, D.L., Vitolo, O.V., Vonsattel, J.-P., Shelanski, M.L. Dendrite and dendritic spine alterations in alzheimer models. -J. Neurocytol., 2004, vol.33, No.3, 377-387.

75. Nguyen, M.D., Shu, Т., Sanada, K., Lariviere, R.C., Tseng, H.C., Park, S.K., Julien, J.P., Tsai, L.H. A NUDEL-dependent mechanism of neurofilament assembly regulates the integrity of CNS neurons. -Nat. Cell Biol., 2004, vol.6, 595-608.

76. Nottebohm, F. Origins and mechanisms in the establishment of cerebral dominance. In M.S. Gazzaniga (Ed.), Handbook of behavioral neurobiology. New York: Plenum, 1979, vol. 2, 295-334.

77. Oka, Y. Characterization of TTX-resistant persistent Na current underlying pacemaker potentials of fish gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons. -Neurophysiology, 1996, vol.75, No.6, 2397-2404.

78. Pakhotin, P.I., Pavlik, L.L., Pakhotina, I.D., Andreev, A.A. Long-term morphofunctional survival of guinea pig hippocampal slices after brief treatment with cyclooxygenase inhibitors. -Neurosci. Behav. Physiol., 1999, vol.29, No.5, 595-598.

79. Preuss Т., Faber D.S. Central cellular mechanisms underlying temperature-dependent changes in the goldfish startle-escape behavior. -J. Neurosci., 2003, vol.23, No.13, 5617-5626.

80. Roeser, Т., Baier, H. Visuomotor behaviors in larval zebrafish after GFP-guided laser ablation of the optic tectum. -J. Neurosci., 2003, vol.23, No.9, 3726-3735.

81. Rogers, L.J. Behavioral, structural and neurochemical asymmetries in the avian brain: a model system for studying visual development and processing. -Neurosci Biobehav Rev, 1996, vol. 20, 487-503.

82. Roth, R.L. Decussation geometries in the goldfish nervous system: Correlation with probability of survival. -Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, vol.76, No.8, 4131-4135.

83. Rovainen, C.M. Physiological and anatomical studies on large neurons of central nervous system of the sea lamprey (Pteromyzon marinus). —J. Neurophysiol., 1967, vol.30, No.5.

84. Ryugo, D.C., Wu, M.M., Pongstaporn, T. Activity-related features of synapse morphology: a study of endbulbs of held. -J. Сотр. Neurol., 1996, vol.365, No.3, 141-158.

85. Samsonovich, A.V., Ascoli, G.A. Morphological homeostasis in cortical dendrites. -PNAS, 2006, vol.103, No.5, 1569-1574.

86. Shen, J., Kelleher, RJ. The presenilin hypothesis of Alzheimer's disease: Evidence for a loss-of-function pathogenic mechanism. -PNAS, 2007, vol.104, No.2,403-409.

87. Sin, W.C., Haas, K., Ruthazer, E.S., Cline, H.T. Dendrite growth increased by visual activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. -Nature, 2002, vol.419, No.3, 475-479.

88. Singer, S.J., Dewji, N.N. Evidence that Perutz's double-|3-stranded subunit structure for (3-amyloids also applies to their channel-forming structures in membranes. -PNAS, 2006, vol.103, No.5, 1546-1550.

89. Springer, A.D., Easter, S.S., Agranoff, W. The role of the optic tectum in various visually mediated behaviors of goldfish. -Brain Res., 1977, vol.128, No. 3,393-404.

90. Stefanelli, A. The Mauthnerian apparatus in the ichtyopsida: its nature and function and correlated problems of neurohistogenesis. -Quart. Rev. Biol., 1951, vol.26, No. 1, 17-34.

91. Sunanda, Rao, M.S., Raju, T.R. Effect of chronic restraint stress on dendritic spines and excrescences of hippocampal CA3 pyramidal neurons a quantitative study. -Brain Res., 1995, vol.694, 312-317.

92. Szabo, T.M., Weiss, S.A., Faber, D.S., Preuss, T. Representation of auditory signals in the M-cell: role of electrical synapses. -J. Neurophysiol., 2006, vol.95, 2617-2629.

93. Tailby, C., Wright, L.L., Metha, A.B., Calford, M.B. Activity-dependent maintenance and growth of dendrites in adult cortex. -PNAS, 2005, vol.102, No.12, 4631-4636.

94. Vallortigara, G. Comparative neuropsychology of the dual brain: a stroll through left and right animals' perceptual worlds. -Brain Lang, 2000, vol.73, 189-219.

95. Vallortigara, G., Regolin, L., Pagni, P. Detour behaviour, imprinting and visual lateralization in the domestic chick. -Cognit. Brain Res, 1999, vol. 7, 307-320.

96. Wang, Y.P., Biernat, J., Pickhardt, M., Mandelkow, E., Mandelkow, E.-M. Stepwise proteolysis liberates tau fragments that nucleate the Alzheimer-like aggregation of full-length tau in a neuronal cell model. -PNAS, 2007, vol.104, No.24, 10252-10257.

97. Ward, J.P., Hopkins W.D. Primate laterality: Current behavioural evidence of primate asymmetries. New York: Springer Verlag., 1993.

98. Waters, N.S., Denenberg, V.H. Analysis of two measures of paw preference in a large population of inbred mice. -Behav. Brain Res., 1994, vol.63, 195-204.

99. Weiss, S.A., Zottoli, S.J., Do, S.C., Faber, D.S., Preuss, T. Correlation of the C-start behaviors with neural activity recorded from the hindbrain in free-swimming goldfish (Carassius auratus). -J. Exp. Biol., 2006, vol.209, No. 23, 4788-4801.

100. Wolfe, M.S. Shutting down Alzheimer's. -Scientific American, 2006, 6167.

101. Yamamoto, N., Fukata, Y., Fukata, M., Yanagisawa, K. GM1-ganglioside-induced A(3 assembly on synaptic membranes of cultured neurons. -Biochimica et Biophysica Acta, 2007, vol.1768, 1128-1137.

102. Zottoli, S.J. Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish. -J. Exp. Biol., 1977, vol.66, No. 5, 243-254.

103. Zottoli, S .J., Hordes, A.R., Faber, D.S. Localization of optic tectal input to the ventral dendrite of the goldfish Mauthner cell. -Brain res., 1987, vol.401, No.l, 113-121.

104. Zottoli, S.J., Newman, B.C., Rieff, H.I., Winters, D.C. Decrease in occurence of fast startle responses after selective Mauthner cell ablation in goldfish (Carassius auratus). -J. Сотр. Physiol. A., 1999, vol. 184, No. 2, 207-218.

105. Zottoli, S.J., Faber, D.S. Properties and distribution of anterior VIII nerve excitatory inputs to the goldfish Mauthner cell. -Brain Res., 1979, vol.174, No.2, 319-323.

106. Zuo, Y., Yang, G., Kwon, E., Gan, W.-B. Long-term sensory deprivation prevents dendritic spine loss in primary somatosensory cortex. -Nature, 2005, vol.436, 261-265.

107. Хочу выразить огромную благодарность молодым сотрудникам лаборатории, магистрантам ПущГУ Надежде Кокановой и Наталье Дектяревой за помощь в содержании, тестировании и стимуляции животных, фиксации и трехмерной реконструкции маутнеровских нейронов.

108. Глубоко признателен сотруднику лаборатории Виктору Даниловичу Павлику за поддержку в проведении электрофизиологических экспериментов, за помощь при обсуждении и статистической обработке результатов.