Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране

Ленц, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране"

на правах рукописи

ЛЕЩ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА И СТРУКТУРЫ КАНАЛОВ ПЕРЕНОСА ИОНОВ В Ыа+,К+-АТФазе С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ НА МОДЕЛЬНОЙ МЕМБРАНЕ

Специальность 03.00.02 - «Биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре Биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории биоэлектрохимии института физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН.

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук,

ведущий научный сотрудник B.C. Соколов член-корреспондент РАН, доктор химических наук,

профессор Ю.А. Чизмаджев Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.Н. Антоненко

кандидат химических наук А.В. Лебедев

Ведущая организация

Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

Защита диссертации состоится 9 февраля 2006 г. в 1Н час. 00мин, на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « Л 3 » ^екоЪрА_2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор | Т.Е. Кренделева

ZOOGb

157 2-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ка+,К+-АТФаза является одним из важнейших мембранных бежов эукариотических клеток, который участвует в поддержании асимметричного распределения ионов натрия и калия по обе стороны клеточной мембраны. Используя свободную энергию гидролиза одной молекулы АТФ, №+,К+-АТФаза переносит из цитоплазмы три иона натрия во внеклеточную среду и два иона калия в противоположном направлении. Трансмембранные градиенты концентрации ионов натрия и калия, создаваемые №+,К+-АТФазой, обеспечивают ключевые стадии жизни клетки: электрическую активность, работу систем вторично-активного транспорта, регуляцию клеточного цикла. Интенсивные исследования механизма функционирования Ка+,К+-АТФазы проводятся в течение ряда лет. Полученные данные привели к появлению модели активного транспорта, согласно которой ионы попадают в места связывания, расположенные внутри белка, через так называемые «каналы доступа». Активный транспорт реализуется путем сопряженного с гидролизом АТФ конформационного перехода, в результате которого происходит закрытие канала доступа с одной стороны мембраны и открытие другого канала с противоположной стороны. Одновременно изменяется сродство центра связывания: который с внутриклеточной стороны предпочитает связывать ионы натрия, а с внеклеточной - калия, что и делает возможным перенос этих ионов против градиентов их электрохимических потенциалов. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в последнее время, многие детали механизма транспорта, такие как структура каналов доступа и устройство «воротного» механизма На+,К+-АТФазы, остаются невыясненными.

Транспорт ионов можно изучать с помощью электрических измерений на модельной системе БЛМ - адсорбированные фрагменты с Ыа+,К+-АТФазой. Значительный прогресс был достигнут при изучении нестационарного транспорта ионов натрия, который реализуется в отсутствие ионов калия. Эти исследования проводились методами фиксации потенциала на клеточных мембранах и методами, основанными на измерениях частотных характеристик адмиттанса на искусственных мембранах. На основании таких исследований удалось выяснить существенные детали транспорта ионов натрия, включая его окклюзию и перенос во внеклеточном канале. Однако, детальной теоретической модели, описывающей различные стадии транспорта ионов в Ш+,К+-АТФазе, не было. Экспериментальные данные, доказывающие существование другого канала, с внутриклеточной стороны белка, отсутствовали, поэтому предполагали, что места связывания ионов с цитоплазматической стороны находятся на поверхности белка. Возможность изучения транспорта во внутриклеточном канале появилась сравнительно недавно, когда было показано, что этот транспорт приводит к появлению отрицательной емкости мембраны при введении АТФ (Боко1оу е1 а1., 1998). Этот транспорт реализуется до того, как №+,К+-АТФаза гидрояизует АТФ и переходит в фосфорилированное состояние, что не ша клеточных

системах, где ток от Ка+,К+-АТФазы получают вычитанием токов, измеренных до и после добавления ингибитора, действующего на фосфорилированный белок. Поэтому изучение на искусственной мембране электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа Ыа+,К+-АТФазы представляется весьма актуальным. Особый интерес представляет применение метода регистрации малых изменений емкости в зависимости от частоты приложенного напряжения при различной концентрации ионов натрия. Это позволяет разделить отдельные стадии ионного транспорта, определить их скорости и диэлектрические коэффициенты, с помощью которых можно оценить относительную глубину канала.

Сложность изучаемого объекта, а также определенные недостатки имеющихся методов исследования клеточных и модельных систем затрудняют исследование структуры каналов доступа и механизма активного транспорта, что диктует необходимость разработки новых модельных систем. Одной из них может служить система, состоящая из мембранных фрагментов с Иа+,К+-АТФазой, адсорбированных на покрытом тиолами золотом электроде. Свойства каналов можно изучать также на системе, состоящей из встроенных в липидный бислой трансмембранных фрагментов №+,К+-АТФазы, которые обладают ионофорными свойствами. Для этого представляется интересным использование подхода, основанного на реконструкции 19 кД фрагмента №+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера.

Цель и основные задачи исследования. Целью данной работы было изучение электрогенного транспорта ионов натрия Ыа+,К+-АТФазой. Были сформулированы следующие задачи:

1. Определить кинетические параметры отдельных стадий процесса транспорта ионов натрия, осуществляемого Ш+,К+-АТФазой, включая его перенос во внеклеточном и внутриклеточном каналах доступа.

2. Изучить влияние рН среды и концентрации ионов натрия на эти стадии, с целью выяснить их возможную конкуренцию за места связывания в Ыа+,К+-АТФазе.

3. Разработать теорию активного транспорта ионов натрия Иа+,К+-АТФазой й сопоставить ее с экспериментальными данными.

4. Оценить глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа и тем самым определить локализацию места связывания одного из ионов натрия в Ыа+,К+-АТФазе.

5. Осуществить реконструкцию 19-кД фрагментов №+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану и изучить их ионофорные свойства.

Научная новизна работы. Впервые при помощи электрических методов был детально исследован транспорт ионов натрия во внутриклеточном канале доступа, определены его кинетические параметры и изучено влияние на него рН среды. Изучено влияние концентрации ионов натрия на соотношение быстрой и медленной стадий транспорта этих ионов во внеклеточном канале.

Предложена теоретическая модель электрогенного транспорта ионов натрия во внеклеточном канале доступа Ыа+,К+-АТФазы, учитывающая 2 стадии: конформационный переход, приводящий к открытию канала доступа ионов с внеклеточной стороны мембраны, и пассивный транспорт ионов в канале. Впервые при помощи метода Шиндлера проведена реконструкция 19-кД фрагмента №+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану, обнаружены ионные каналы, образуемые 19-кД гидрофобными фрагментами этого белка.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты представляют ценность для выяснения механизма работы Ка+,К+-АТФазы и родственных АТФаз Р-типа. Разработанные автором методы исследования электрогенного транспорта и альтернативные модельные системы могут быть использованы для дальнейшего изучения работы не только Ка+,К+-АТФазы, но и других транспортных систем.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Мембранная биоэлектрохимия: От фундаментальных принципов к медицинским приложениям» (Москва, 2002), 10-ой Международной конференции по №+,К+-АТФазе и близким катионным насосам (Эльсинор, Дания, 2002), 59-м Ежегодном собрании физиологического общества (Вудсхол, США, 2005), 8-м Международном фрумкинском симпозиуме (Москва, 2005), 3-ем съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Международном конгрессе биофизиков (Монпелье, Франция,2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 23. наименований. Работа изложена на 159 страницах, иллюстрирована НЗ рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение.

Рассмотрена актуальность выбранной темы, обоснована теоретическая и практическая значимость, сформулирована цель работы и определены задачи исследования.

Глава 1. Обзор литературы.

Первая глава представляет собой обзор литературы. В первой части рассматриваются известные к настоящему моменту данные о структуре На+,К+-

АТФазы, последовательности реакций и субстратах ферментативного цикла ее работы. Особое внимание уделяется строению участков связывания ионов и каналам доступа. В этой же части описана структура и механизмы работы Са2+-АТФазы, в изучении которой в последнее время достигнут значительный прогресс. Эти данные позволяют сделать ряд предположений относительно структуры и возможных механизмов функционирования Ыа\К+-АТФазы, которая имеет высокую степень гомологии с Са2+-АТФазой.

Вторая часть литературного обзора посвящена рассмотрению результатов исследований, основанных на регистрации электрических токов, возникающих при работе №+,К+-АТФазы. Электрические токи связаны с электрогенными стадиями транспорта ионов, т.е., стадиями, в которых происходит перемещение заряда в мембране. Такими стадиями являются перемещения ионов натрия в каналах доступа. Рассматривается введенное Лойгером понятие диэлектрического коэффициента отдельной стадии, как характеристики ее электрогенности. Изучение этих стадий позволяет получить существенную информацию о структуре каналов. Особенно плодотворным оказался подход, основанный на регистрации переходных электрических токов в бескалиевой среде при быстром введении АТФ или воздействии электрического поля. Эти исследования привели к созданию концепции канала доступа ионов с внеклеточной стороны белка (Lauger, 1991).

Во следующей части обзора рассмотрена общепринятая модель строения и функционирования Ыа+,К+-АТФазы, объясняющая большинство известных экспериментальных данных. В основе модели лежит схема реакций переноса ионов, известная как схема Альберса - Поста (рис. 1). Описание и анализ транспорта ионов натрия и калия Ыа+,К+-АТФазой в настоящее время осуществляется на основании этой схемы. Согласно этой модели, для работы ^'а+,К+-АТФазы необходимо наличие по меньшей мере двух стабильных конформационных состояний белка. В исходном нефосфорилированном состоянии белок находится в конформации Е[. При этом открыт канал с внутриклеточной стороны мембраны, через который три иона натрия из раствора попадают в центр связывания ионов, расположенный внутри белка. При этом участки связывания первых двух ионов отрицательно заряжены, так что связывание двух ионов натрия с внутриклеточной стороны (как и двух ионов калия с внеклеточной) происходит электронейтрально. Связывание третьего иона в высокоспецифичном центре может произойти только после того, как будут заняты два предыдущих участка. Связывание третьего иона происходит электрогенно. После фосфорилирования белок переходит в новое состояние (окклюзии натрия), в котором ионы "запираются" внутри белка, затем происходит переход в состояние Е2, в котором открывается канал с внеклеточной стороны и ионы высвобождаются во внешнюю среду (Wuddel and Apell, 1995;Heyse et al., 1994; Holmgren et al., 2000). Через этот канал в раствор выходит один из ионов натрия (из высокоспецифичного участка связывания), а оставшиеся два иона натрия замещаются на ионы калия. После этого происходит дефосфорилирование и белок переходит в конформацию Е] через состояния окклюзии ионов калия и открытия канала с внутриклеточной

стороны, куда эти ионы выходят, и цикл завершается. В конце этого раздела проведено сравнение результатов измерений, полученных на клеточных системах с использованием методики пэтч - кламп и в модельной системе с мембранными фрагментами, адсорбированными на бислойной липидной мембране (БЛМ).

Рис. 1. Физическая модель транспорта ионов, осуществляемого №+,К+-АТФазой. Символами Е] и Е2 обозначен белок в двух разных конформациях. Пунктиром выделена часть цикла работы Ыа+,К+-АТФазы, которая осуществляется в отсутствии ионов калия. Пояснения см. в тексте.

В третьей части обзора рассматриваются особенности механизма переноса ионов, в частности, конкуренция Н* с ионами Ыа+ в цитоплазматических участках связывания №+,К+-АТФазы. Также проводится анализ различных модельных систем, разработанных для изучения электрогенного транспорта Ыа",К*-АТФазы, их недостатков и преимуществ. В заключении формулируются основные задачи исследования.

Глава 2. Теория транспорта ионов натрия в ^+,К+-АТФазе.

Разработана теория электрогенного транспорта ионов натрия Ыа+,К+-АТФазой, учитывающая 2 стадии: конформационный переход, приводящий к открытию канала, и пассивный транспорт ионов во внеклеточном канале доступа. Эта модель, в отличие от более ранних, учитывает конечную скорость перемещения ионов натрия в канале.

Энергетика и электростатика.

Мы исходили из принятой схемы работы Ш+,К+-АТФазы в бескалиевой среде (рис. 2А). Основной вклад в электрический ток, регистрируемый при

функционировании Ка+,К+-АТФазы, вносит перемещение только одного из трех ионов натрия, которое и рассматривалось в данной модели. В исходной конформации белка, обозначаемой Еь открыт внутриклеточный канал доступа, через который ион Иа может попасть во внутреннюю полость белка (состояние 0)). После этого происходит гидролиз АТФ, и Ыа+,К+-АТФаза присоединяет освобождающийся фосфат, приобретая энергию для дальнейшего осуществления активного транспорта, в ходе которого внутриклеточный канал закрывается, и ион натрия попадает в состояние окклюзии, 1). Далее открывается внеклеточный канал доступа 2), и ион натрия получает возможность выхода во внешнюю среду, 3). Связанная с гидролизом АТФ стадия перехода из состояния 0) в 1) в рассматриваемых условиях является необратимой, тогда как все остальные последовательные стадии 1)^>2)53) обратимы. Соответственно, предметом нашего анализа была кинетика перехода между состояниями 1), 2) и 3), заключенными в помеченный пунктиром прямоугольник на рис. 2А.

связывание иона

фосфорилирование, окклюзия ионна

нонформационный переход Е, - Е,, деопшюзия

высвобождение иона через внутриклеточ ный канал

Рис. 2 Физическая модель Ыа+,К+-АТФазы. А - совокупность состояний Ыат,К+-АТФазы, реализующихся в ходе гидролиза АТФ. Пунктиром выделена часть цикла работы Ка+,К+-АТФазы, которая осуществляется в отсутствии ионов калия. 1 - цитоплазматическая сторона системы, е - внутриклеточная сторона. Символами Е) и Е2 обозначен белок в двух разных конформациях. Б -динамические потенциальные барьеры, введенные в рассмотрение Лойгером (Ьаи§ег, 1991) и Апелем (Аре11 ег а1., 1987). Ион натрия, участвующий в транспорте, обозначен черным кружком (подробнее смотри в тексте).

Энергетика указанных состояний проиллюстрирована на рис. 2Б. Этот подход восходит к известным работам Лойгера и Апеля (АреН ег а1., 1987;

Ьаи£ег, 1991). Переходы между состояниями 1) и 2) - это фактически переход белка между двумя различными конформациями, которые характеризуются сильно различающимися энергетическими профилями. Это в полной мере очевидно из сравнения состояний 1) и 2) на рис. 2Б. Энергетика иона № в этих состояниях совершенно различна: в случае 1) ион заперт в потенциальной яме двумя высокими барьерами, а в случае 2) он может свободно выйти в раствор (смотри рис. 2Б). Переход между состояниями 2) и 3), по-видимому, не сопровождается конформационной перестройкой белка, а сводится к однорядной диффузии и миграции в канале доступа, когда к мембране приложено электрическое поле. Если поле и градиенты концентрации малы, можно описывать этот процесс как перескок иона через энергетический барьер. Этот подход, обоснованный в книгах (Маркин и Чизмаджев, 1974; Ьаидег, 1991) проиллюстрирован на рис. 3.

• 1

1 | ф, 1 . 1

\ч|чт>0

VI \\

к \к 1 Чт=о|\\ 1 \\

1 1 \\ 1

1 1 \

/к. 1 \

ф=0

Рис.3. А - энергетика различных состояний Ыа+,К+-АТФазы. Б -Распределение электрического потенциала в мембране фрагмента, содержащего Ка+,К+-АТФазу и профили энергии иона натрия в различных состояниях Ка+,К+-АТФазы (подробнее смотри в тексте).

Пусть N - полная поверхностная концентрация белка (число молекул на см2), образовавшегося в результате гидролиза АТФ и его перехода из состояния 0) в совокупность состояний 1), 2) и 3). Соответственно, щ - концентрация белка в состоянии 1), пг - концентрация в состоянии 2) и щ - концентрация в состоянии 3). Очевидно, N = щ + п2 + щ, т.е. в задаче остаются две независимые переменные, например, щ и щ. В дальнейшем мы пользовались безразмерными числами заполнения в\ = п\ /Л/, &1 = п2 Ш и ф = щ / N. Распределение потенциалов в мембране, содержащей в плоскости т определенное количество, и, + п2, ионов Ыа+ изображено на рис. 3. Через <р обозначена разность потенциалов между растворами. Потенциал раствора с внеклеточной стороны

белка (в дальнейшем эту сторону будем называть внешней) полагали равным нулю: <р,= 0. Тогда потенциал с внутриклеточной стороны (которую будем называть внутренней) равен р,-<р. Средний потенциал в плоскости т, удаленной на /2 от внешней поверхности мембраны обозначили <рт.

Кинетические уравнения.

Пусть к,2 - константа скорости перехода из состояния 1) в 2), а к2] -константа скорости обратного процесса. Аналогично к2е и ке2 - константы скорости переноса ионов из состояния 2) в 3) и обратно. Последние две константы зависят от потенциала. Состояние 1) распадается с константой скорости кп и пополняется с константой скорости к2,:

с1г\ _

Аналогично:

а (1)

^ = з (2)

Здесь последний член соответствует переходу ионов натрия из раствора в канал, скорость которого пропорциональна их концентрации в растворе и числу свободных каналов. Также

^ = (3)

Уравнения (1) - (3) не являются независимыми. Исключая величину п2 с помощью соотношения N = пх+п2 + щ и переходя к числам заполнения, получим систему:

^ = + (4)

^ = -к2ее,-[к2<+к,2тЩ+кг1 (5)

Емкость и проводимость.

Если I - толщина мембраны, а расстояние от внутренней стороны мембраны до плоскости т равно , то /2 = / - 1\. Емкости на единицу площади: С = еГ1е!1 , С, = £(,¿'/7,, С] = ейеИ2, где £ - диэлектрическая проницаемость мембраны. Ток в цепи равен:

где /, = Сй<р!& - ток заряжения емкости мембраны, 12 - переменный ток, возникающий из-за электрогенного переноса ионов Ыа",К+-АТФазой, а аШИ1 -полный диэлектрический коэффициент, равный произведению диэлектрического коэффициента ар перемещения иона в канале АТФазы на емкостный делитель (1/3). Соответствующий коэффициент 1/3 учитывает соотношение удельных емкостей БЛМ и мембранных фрагментов, из-за

которого только 1/3 приложенного извне переменного напряжения падает на мембране фрагмента. Вычислим ток 12:

(7)

Записывая ток в форме:

1г = ар8я>+срс1(р1ж (8)

получаем вклад электрогенного транспорта в проводимость О р и емкость

С,-

с =_Ма^'рНа&'^ + Ма^к^у + КЖ + М+Ш^М_ /т

' (1 + №, +ш%к„кпК, + к2,2(\ +№,)2 +к121{\ + К1У)+кп1к1,\\ + Ыа,

Кг^г,^ \_ С 1 Г)-»

" (1 + ЛЦ + №1АГ1)[в>4 + а>2[2к2!кпК, + *2,2(1 + + к,'{\ + )+*,22*2<2(1 + Ыа, + )г]

где Ь'а, = к®2(Ыа)/- безразмерная концентрация ионов натрия. Уравнения (9), (10) можно разложить на сумму простых дробей, что приводит к наглядной записи в виде суммы двух функций Лоренца:

^ = е^с^-^+с^-з^Ц- (11)

Р О) + щ со + со'. СО + <И0 СО + £У,

Значения юо и Ю|, можно определить, приравняв знаменатель в формуле (9) или (10) нулю и решив это квадратное уравнение по ©2. Уравнение имеет вещественные корни, что доказывает возможность такого разложения. Значения характерных частот ю0 и Ю[ зависят от концентрации ионов натрия.

В пределе, при частоте, близкой к нулю, проводимость исчезает, а выражение для емкости приобретает простой вид:

С I =еЫа гВ + (12)

Эта формула отражает равновесную зависимость суммарного заряда, связанного внутри белка, от напряжения. Ее можно получить простым дифференцированием связанного заряда по приложенному к мембране

напряжению: с\ - + Из формулы (12) следует

колоколообразная зависимость емкости от концентрации ионов натрия. Отметим, что коэффициенты С0 и С] в уравнение (11) также являются колоколообразными функциями концентрации ионов натрия.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

Экспериментальная система: БЛМ + адсорбированные мембранные фрагменты. В настоящей работе исследовался механизм переноса заряда Ка+,К+-АТФазой в отсутствие ионов калия. Большая часть экспериментов проводилась на модельной системе, состоящей из содержащих №+,К+-АТФазу мембранных фрагментов, адсорбированных на БЛМ (рис. 4).

| ADP

Caged-ATP —»ATP

Na+-

lp(t)

—

C„

-0-

Рис. 4. A - Схематическое изображение БЛМ с адсорбированным мембранным фрагментом, содержащими Na+,K+-ATOa3y. Сплошной линией показан профиль электрического потенциала, возникающий в результате заряжения контактирующих мембран при переносе ионов Ыа+,К+-АТФазой в условиях коротко замкнутой цепи. Б - эквивалентная электрическая схема: Ср -суммарная емкость адсорбированных на БЛМ мембранных фрагментов, содержащих Ыа+,К+-АТФазу, CF - емкость области БЛМ, контактирующей с фрагментами, Ip(t) - ток, генерируемый всеми активными №+,К+-АТФазами, I(t) - ток, регистрируемый в эксперименте.

Исследования проводились на основании методики, предложенной в (Borlinghaus et al., 1987) и развитой в лаборатории биоэлектрохимии (Sokolov et al., 2001). Регистрировались малые приращения адмиттанса при фотоактивации caged - ATP. Это позволяет вычислить изменение емкости и проводимости системы, связанные с перемещением заряда Ка+,К+-АТФазой. Измеренные изменения емкости и проводимости, вызванные введением АТФ, нормировались на величину заряда, перенесенного через мембрану Na+,K+-АТФазой, который определяли как максимальное значение интеграла тока короткого замыкания. Это позволило уменьшить разброс измерений на нескольких мембранах и усреднить результаты. Полученные частотные зависимости изменения емкости и проводимости анализировались по методике, подробно описанной в работе (Sokolov et al., 2001). Частотная зависимость аппроксимировалась функцией, в которой изменения емкости АС и проводимости AG описывались линейной комбинацией функций Лоренца с разными характерными частотами. При концентрации ионов натрия от 20 мМ до 1М было достаточно двух функций Лоренца и постоянной компоненты (уравнение 11 или уравнение 13 при С2 = 0). При низких концентрациях ионов натрия (< 10 мМ) вводили дополнительную функцию Лоренца с отрицательной амплитудой :

4 С-С.-^С.-Д^-С.-^С, д (13)

а +ю; ш +со' а> +а>1 щ +«„ ю +®, а

Обоснование такой аппроксимации будет дано ниже.

Экспериментальная система, основанная на использовании электродов на подложке. Для изучения транспорта ионов в цитоплазматическом канале доступа №+,К+-АТФазы методом импедансной спектроскопии была разработана новая модельная система. В предложенной системе мембранные фрагменты, содержащие Ыа+,К+-АТФазу, адсорбировались на электродах с различным покрытием, т.е. бислойная липидная мембрана была заменена подложкой, служащей при этом электродом. На электроды наносились различные покрытия, которые можно условно разделить на три группы: гидрофильные, гидрофобные и «spreader-bar». Для создания нужной поверхности использовались тиолы с соответствующей концевой группой: HS-(СН2),5-СООН - для гидрофильной, HS-(CH2)i5-CH3 - для гидрофобной и смесь HS-(CH2)irCH3 с 6 - MP (6 - меркаптопурин) или ТМРР (5,10,15,20 - тетраксис - (4 - сульфонатофенил) -порфипин) для «spreader-bar». Необратимость адсорбция мембранных фрагментов на электродах с покрытием была показана при помощи перфузии и метода плазмонного резонанса. Наилучшие результаты показали «spreader-bar» электроды, которые позволили решить проблему контакта внеклеточной части Ыа+,К+-АТФазы с ограниченным объемом «третьей» воды. На поверхности таких электродов чередуются участки, покрытые «линейными» тиолами (HS-(CH2)n-CH3), и тиолами на основе производных пурина и порфирина (6 - меркаптопурин и ТМРР). На рис. 5 приведено схематическое изображение поверхности таких электродов.

Рис.5. Схематическое изображение поверхности «spreader-bar» электрода (Au/{S(CH2)nCH3 + TNPP}) с адсорбированными мембранными фрагментами, содержащим Ыа+,К+-АТФазу. Объяснения в тексте.

Плоские молекулы ТМРР и ТМРР расположены практически параллельно поверхности электрода. В то же время, «линейные» тиолы покрывают золотой электрод так, что угол между осью молекулы и поверхностью электрода близок к 90°. Таким образом, поверхность «spreader-bar» электрода получается неоднородной по толщине.

Предложенная модельная система обладает рядом преимуществ по сравнению с системой БЛМ - адсорбированные мембранные фрагменты (МФ). Во-первых, решается проблема со стабильностью бислойной липидной мембраны на которую адсорбируются мембранные фрагменты, что

непосредственно расширяет диапазон возможных экспериментальных условий (состав растворов, амплитуда прикладываемого напряжения), а также увеличивает время, в течении которого можно проводить измерения. Во-вторых, можно расширить частотный диапазон, в котором проводятся измерения адмиттанса. В-третьих, можно отказаться от caged - АТФ, а «моментальное» введение АТФ осуществлять при помощи быстрой смены растворов в ячейке (перфузии). Ранее высказывалось предположение, что caged - АТФ может оказывать ингибирующее воздействие на фосфорилирование Ыа+,К+-АТФазы (Fendler et al., 1993).

Встраивание 19-кД фрагмента в бислойную липидную мембрану. Для встраивания 19-кд фрагмента Ма+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану использовался метод Шиндлера. БЛМ формировалась на отверстии в тефлоновой пленке сведением монослоев, образующихся при раскрытии протеолипосом (с 19-кД фрагментами №+,К+-АТФазы) на границе раздела раствор - воздух.

Глава 4. Результаты исследования и их обсуждение.

Ранее были проведены измерения частотных зависимостей изменений емкости и проводимости, вызванных функционированием Ыа+,К+-АТФазы при высокой концентрации ионов натрия, и показано, что транспорт, состоит из нескольких стадий (Sokolov et al, 2001). В настоящей работе проведены измерения частотных зависимостей для широкого диапазона концентраций ионов натрия (от 1 мМ до 1 М), в более широком диапазоне частот и с большей точностью по сравнению с ранними работами, что позволило разделить различные электрогенные стадии транспорта и определить их количественные характеристики.

Типичная частотная зависимость изменения емкости и проводимости мембраны, вызванных функционированием Ка+,К+-АТФазы при 150 мМ NaCl, приведена на рис. 6. Именно эти кривые были использованы для выбора тех значений кинетических параметров, при которых наблюдается наилучшее совпадение теории (сплошные кривые на рис. 6) и эксперимента. Эти значения таковы: к)2= 20 с"1, k2i = 40 с"1, К) = к21/ к12 = 2, к2е=Зх103 с"1,1^=4x103 М"\ К« = 0,19, N = Ю10 см"2. Теоретические кривые строились по формулам (9) и (10), а емкость и проводимость нормировалась на полный перенесенный заряд. Не столь удовлетворительное согласие теоретических кривых с экспериментальными точками для других концентраций ионов натрия (52 мМ и 300 мМ, данные не приведены) объясняется тем, что моделью не учитывался солевой эффект и специфика системы, состоящей из БЛМ с адсорбированными фрагментами.

В дальнейшем, при всех остальных концентрациях NaCl аппроксимацию экспериментальных зависимостей проводили с помощью суммы лоренцианов по формуле (13), подбирая характерные частоты и амплитуды методом наименьших квадратов.

100

1000

100

1000

f,ru

f,ri;

Рис. 6 Частотные зависимости изменения емкости и проводимости, нормированные на максимальный перенесенный заряд, при 152 мМ NaCl. Состав растворов: 152 мМ NaCl, 30mM имидазола, 10тМ MgCb, 1тМ ЭДТА, рН 6,5. Сплошные линии - теоретические кривые, построенные по уравнениям (9), (10) (пояснения см. в тексте).

Частотные зависимости изменения емкости и проводимости при различных концентрациях ионов натрия

Была проведена серия измерений в широком диапазоне концентраций ионов натрия 1 мМ - 1 М. Для большей наглядности на рис. 7 приведена одна частотная зависимость, полученная при 300 мМ, которая является представительной для большого диапазона высоких концентраций от 20 до 1 М, и несколько зависимостей при низких (3-12 мМ) концентрациях ионов натрия. Эти зависимости, полученные при высокой концентрации ионов натрия, удовлетворительно описываются суммой двух лоренцианов с постоянной составляющей, что указывает на наличие двух стадий. Характерная частота «медленного» лоренциана, в зависимости от концентрации ионов натрия, лежит в области 20 - 100 с'1. Помимо «медленной» стадии транспорта, присутствует более быстрая стадия. Характерная частота этого лоренциана оказалась равной ~ 1600 с'1. Зависимость, полученная при 150 мМ NaCl (рис.6), согласуется с полученной ранее (Sokolov et al., 2001).

При уменьшении концентрации натрия положительное изменение емкости в области частот, соответствующей «быстрой» стадии переноса ионов, исчезает и появляется частотно-зависимое отрицательное изменение емкости (рис.7). Процессом, который вызывает появление отрицательного изменения емкости и проводимости, зависящего от частоты, является электрогенный транспорт одного иона натрия во внутриклеточном канале доступа, который существует в нефосфорилированном белке и прекращается после введения АТФ, вызывающего фосфорилирование и конформационный переход EpEj.

£ Гц

Рис. 7 Частотные зависимости изменения емкости и проводимости в области высоких и низких концентраций натрия (пояснения см. в тексте). Сплошные линии - теоретические кривые. Состав растворов: ИаС1 (3, 7, 12, 152,300 мМ), ЗОшМ имидазола, ЮшМ Ъ^СЬ, 1тМ ЭДТА, рН 6,5.

Проявление вклада транспорта ионов во внутриклеточном канале доступа именно в виде отрицательного изменения емкости объясняется процедурой обработки регистрируемых в нашей модельной системе сигналов. В работе изучались нестационарные электрические токи после быстрого введения АТФ. Приращения емкости и проводимости вычислялись как разность между значением до введения АТФ и значением, установившимся после 0,5 секунды после добавки АТФ. Поскольку внутриклеточный канал открыт только до фосфорилирования, его вклад вместе с фоном вычитается из части сигнала, записанного после вспышки УФ - света, что в определенных условиях приводит к появлению отрицательного изменения емкости.

Ранее, на примере простейшей модели канала было показано, что вклад транспорта ионов в изменение емкости максимален в том случае, когда половина участков связывания занята ионами, а половина свободна. Этот случай реализуется при концентрации ионов натрия, близкой к константе равновесия в центре связывания (Соколов et al., 1997; Lu et al., 1995). Тот факт, что отрицательное изменение емкости наблюдается при концентрации ионов натрия (около 3-5 мМ), близкой к константе связывания иона в высокоспецифичном участке с внутриклеточной стороны (5-6 мМ при концентрации ионов Mg2+ порядка 10 мМ (Schneeberger and Apell, 1999)) подтверждает предположение о том, что отрицательное изменение емкости связано с транспортом этого иона натрия во внутриклеточном канале. Аналогично, максимальный вклад транспорта этого иона во внеклеточном канале доступа должен достигаться при концентрации, близкой к соответствующей константе связывания (100 - 150 мМ), что и наблюдается в эксперименте. При снижении концентрации NaCl до ~ 3-5 мМ уменьшается заселенность участков связывания, расположенных во внеклеточном канале доступа, так что процесс транспорта иона перестает давать заметный вклад в измеряемое приращение адмиттанса. В области «средних» частот исчезает положительная емкость и вместо нее появляется отрицательная емкость, что отражает появление вклада транспорта ионов во внутриклеточном канале и исчезновение вклада от внеклеточного канала доступа.

Для эмпирической аппроксимации частотных зависимостей, полученных в низкой концентрации ионов натрия, помимо двух лоренцианов с постоянной составляющей, используемых для фитирования данных, полученных в нормальных условиях, был дополнительно введен еще один лоренциан с отрицательной амплитудой (см. «Материалы и методы исследования»). Характерная частота, «отрицательного» лоренциана, описывающего полученные данные, составила около 800 с"' ( для 5 мМ NaCl). При увеличении концентрации ионов натрия в диапазоне 1-10 мМ значение характерной частоты возрастало от 600 с'1 до 1000 с"1.

На рис. 8 приведены зависимости амплитуды (А) лоренцианов и соответствующих "характерных" частот (Б) от концентрации ионов натрия. Данный рисунок хорошо иллюстрирует влияние концентрации ионов натрия на соотношение отдельных стадий транспорта ионов Ка+,К+-АТФазой. Можно видеть, что амплитуда «быстрого» лоренциана (СО уменьшается с концентрацией ионов натрия, и при концентрациях меньше 10 мМ, близка к нулю. В то же время ненулевая при низких концентрациях натрия амплитуда «отрицательного» лоренциана (С2) обращается в ноль при повышении концентрации натрия. Медленная стадия присутствует при всех концентрациях ионов натрия, но ее амплитуда при увеличении концентрации падает. Теория предсказывает, что амплитуды лоренцианов должны зависеть от концентрации ионов натрия колоколообразно, принимая максимальное значение при концентрации, близкой к половинному насыщению соответствующих мест связывания. Зависимости на рис.8 скорее монотонны, но это связано с тем, что изменения емкости и проводимости нормировали на величину заряда,

перенесенного через мембрану. Эта величина тоже зависит от концентрации ионов натрия, поэтому такая нормировка приводит к превращению колоколообразных зависимостей амплитуд на рис. 8 в монотонные.

о"

е£

медленная"стадия)

С ("быстрая стадия) 1 аы-п

с2 ("внутриклеточная" стадия^ 1000

10 100 Na+, мМ

10000 г

О 1000 г

со, ("быстрая" стадия),.

* 100 о

ш ("внутриклеточная" стадия)

К* ;

^ ш0 ("ждленная" стадия) ■

10 + 100 Na+, мМ

1000

Рис. 8. Зависимости изменения амплитуды лоренцианов (А) и соответствующих характерных частот (Б) от концентрации ионов натрия (пояснения см. в тексте). Состав растворов: NaCl (1мМ - 1 М), ЗОшМ имидазола, ЮшМ MgCl2, ImM ЭДТА, рН 6,5.

В работе проанализированы также возможные побочные эффекты, которые могли бы привести к отрицательному изменению емкости. Одним из таких эффектов является электрострикция - изменение емкости в результате сжатия мембраны в электрическом поле. В нашей работе было показано, что при адсорбции фрагментов мембран с Ма+,К+-АТФазой на бислойной липидной мембране наводится электрическое поле. Значительная часть изменения граничного потенциала вызвана адсорбцией на БЛМ низкомолекулярных соединений типа SDS, и только небольшая часть, (около 10 мВ), - адсорбцией МФ. Отрицательное изменение емкости вследствие электрострикции может появиться, если перенос ионов натрия Ка+,К+-АТФазой из раствора в область между фрагментом мембраны с На+,К+-АТФазой и БЛМ уменьшает исходное электрическое поле, возникшее из-за электростатического взаимодействия мембран и адсорбции детергента. Однако, против этого говорят следующие эксперименты. Во-первых, отрицательное изменение емкости наблюдалось также на модельной системе, основанной на электродах на твердой подложке, где эффекта электрострикции не может быть. Типичные частотные зависимости изменения емкости и проводимости, вызванные введением АТФ, представлены на рис. 9. Аналогичные зависимости были получены для электродов со всеми тремя типами покрытий, но максимальное отрицательное изменение получилось на «spreader-bar» электродах.

100 1000 частота, Гц

Рис. 9. Изменение емкости и проводимости вызванное добавлением АТФ к адсорбированным на «spreader-bar» электроде (Au/{S(CH2)hCH3 + TNPP}) мембранным фрагментам, содержащим Na+,K+-ATOa3y.

Во-вторых, отрицательное изменение емкости зависит от частоты, что вряд ли имело бы место, если бы эффект был обусловлен электрострикцией. В-третьих, мы показали, что эффект не зависит от ионной силы раствора, а значит, не связан с электростатическим потенциалом, возникающим из-за наличия поверхностного заряда мембраны. Для того чтобы это доказать, были проведены дополнительные эксперименты, в которых в условиях низкого содержания NaCl ионная сила доводилась до 150 мМ добавлением хлористого холина (или NMG+). Сопоставление частотных зависимостей, которые были получены в экспериментах двух типов (с хлористым холином и без него), не выявило сильных отличий, что позволяет сделать вывод о том, что отрицательное изменение емкости не связано с уменьшением ионной силы либо концентрации ионов хлора.

Диэлектрические коэффициенты

Анализ частотных зависимостей позволил определить не только характерные частоты, но и амплитуды лоренцианов, соответствующих различным стадиям транспорта. Амплитуда изменения емкости позволяет оценить так называемый диэлектрический коэффициент электрогенной стадии, вызывающей это изменение. Диэлектрический коэффициент был введен в рассмотрение Лойгером (Lauger, 1991). Данный параметр говорит о том, какая часть от приложенного к мембране напряжения действует на перемещающиеся заряды. Таким образом, диэлектрический коэффициент может служить характеристикой глубины канала. Данные, полученные в этой части работы, позволяют сделать вывод, что глубина внутриклеточного канала примерно в три раза меньше глубины внеклеточного канала доступа. Таким образом, высокоспецифичное место связывания иона натрия расположено в мембране

асимметрично и находится ближе к внутриклеточной стороне мембраны. Отметим, что определение диэлектрического коэффициента процесса, вызывающего отрицательное изменение емкости, и оценка глубины внутриклеточного канала доступа ионов проведены нами на основе прямых электрических измерений впервые.

Зависимость электрогенного транспорта ионов натрия Na*,К*-АТФазойотрН.

Рассмотренные выше результаты относятся к транспорту одного из трех ионов натрия Ыа+,К+-АТФазой. Долгое время считалось, что транспорт двух других ионов натрия является почти электронейтральным (диэлектрический коэффициент 20%) и дает лишь небольшой вклад в электрический ток, настолько быстрый, что определить его скорость не удается (Holmgrem, 2001, Sokolov et al,2001). Причина столь низкой электрогенности этой стадии оставалась непонятной. В последнее время в литературе было выдвинуто предположение, что транспорт этих ионов электронейтрален потому, что сопряжен с протонированием - депротонированием центра связывания. Фактически, вместо перемещения двух ионов натрия в мембране происходит их электронейтральный обмен на протоны. Однако, с помощью электрохромных флуоресцентных красителей (Apell and Diller, 2002) было показано, что при увеличении рН при связывании ионов натрия с внутриклеточной стороны белка происходит перенос заряда в мембране. Это позволяет предположить, что при увеличении рН электронейтральный обмен превращается в электрогенный транспорт. Используемый нами метод позволяет проверить эту гипотезу с помощью прямых электрических измерений. Если при повышении рН транспорт двух ионов натрия становится электрогенным, это должно привести к появлению дополнительной стадии, которую можно обнаружить по частотным зависимостям емкости и проводимости.

На рис. 10 приведены частотные зависимости изменений емкости и проводимости, полученные при различных рН при высокой и низкой концентрациях ионов натрия. При высокой концентрации ионов натрия увеличение рН не приводило к заметному изменению частотных зависимостей во всем диапазоне, за исключением рН 8, где наблюдалось уменьшение емкости и проводимости, вызванное, по-видимому, исчезновением быстрой стадии перемещения ионов натрия во внеклеточном канале. Следует отметить, что в этих условиях существенно уменьшался и ток короткого замыкания, что свидетельствует о торможении активного транспорта ионов Na^lO-АТФазой. При низкой концентрации ионов натрия, увеличение рН приводило к появлению отрицательных изменений емкости и проводимости большой величины, причем частотная зависимость этих изменений сильно отличается от той, что наблюдалась при низких рН.

СО

cf <

* 152 мМ NaCl рН«,5 A 1S2MMN&CI, рН8 О 152 мМ NaCl рН7 5

3 -Р п а

1F 4 Ч

* %

А А Л 4 1

A A A ÍM

10 100 частота, Гц

СП

• •

• 3 мМ NaCl рН 6 5 V 3 мМ NaC!, рН 7 5.

* 3 мМ NaCl. рН 7 О 3 мМ NaCl рН 8

§ е

10 100 1000 частота, Гц

í* 152 мМ NaCl, рН 6 5 152 MMNaCl, рН7 5 i"* 152 мМ NaCl, рН 8

СО

2 %

Л*

ий

4 ★

10 100 частота, Гц

500

-500 "о -1000 "jj -1500 ^ -2000

О -2500 <

-3000

I •(

3 мМ NaCl, рН 6 5 3 мМ NaCl, рН 7 5 3 мМ NaCl, рН 7 * 3 мМ NaCl, рН 8

10 100 частота, Гц

Рис. 10 Частотные зависимости изменения емкости и проводимости в области 152 мМ и 3 мМ NaCl и при разном значении рН (пояснения см. в тексте). Составы растворов: а) 152 мМ NaCl, 30mM имидазола, ЮтМ MgCl2, 1тМ ЭДТА, рН 6,5; б) 152 мМ NaCl, ЗОтМ имидазола, ЮтМ MgCl2, 1тМ ЭДТА, рН 7,5; в) 150 mM NaCl, 10 mM TRIS, 10 mM MgC12, 1тМ ЭДТА, рН 8.

Это свидетельствует, что при высоком рН появляется новая электрогенная стадии транспорта ионов Ка+К+-АТФазой с внутриклеточной стороны белка. Диапазон рН и концентраций ионов натрия, где обнаружена эта новая стадия, согласуется с результатами измерений, проведенных с использованием флуоресцентных красителей (Apell and Diller, 2002). Это позволяет предполагать, что данная стадия действительно может быть связана с транспортом двух ионов натрия с цитоплазматической стороны белка, который электронейтрален (натрий - протонный обмен) при низких значениях рН, но становится электрогенным при высоких значениях рН.

Реконструкция 19 - кД фрагмента Na -АТФазы в бислойную липидную мембрану.

После того, как была получена №+,К+-АТФаза в очищенном виде, неоднократно делались попытки встроить ее в бислойную липидную мембрану, главным образом путем слияния БЛМ с липосомами, содержащими фермент. Они оказались безуспешными, поскольку приводили к денатурации фермента. При встраивании №+,К+-АТФазы в мембрану наблюдались только флуктуации проводимости мембраны, напоминающие поведение одиночных ионных

каналов (Kirnelberg and Papahadjopoulos, 1972; Hayman, 1977; Reinhardt et al., 1984; Сорокина, 1984). Было показано, что проводимость возрастает при расщеплении Ыа+,К+-АТФазы химотрипсином (Reinhardt et al., 1984). Аналогичные флуктуации наблюдались и при встраивании водорастворимого фрагмента а-субъединицы белка, причем они оказались зависимыми от АТР (Mironova et al., 1986; Zolotarjova et al., 1990). В последнее время было установлено, что при разобщении «ворот» Na+,K+-ATOa3bi палитоксином, появляются ионные каналы, о строении и функционировании которых на данный момент известно крайне мало.

0,5 -i

О 20 40 60 80 1 00 120 140

время, с

Рис. 11. Запись тока на мембране, содержащей 19-кД фрагменты.

Используя метод Шиндлера, мы осуществили реконструкцию 19-кД фрагментов Ыа+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану. Эти фрагменты представляют собой трансмембранные участки белка, оставшиеся после воздействия трипсина. Считается, что именно в 19-кД фрагменте находятся участки связывания ионов и каналы Ыа+,К+-АТФазы. Мы подтвердили это предположение, обнаружив ионные каналы, образуемые этими фрагментами. На рис. 11 приведены «каналоподобные» флуктуации тока, полученные на мембране, содержащей 19-кД фрагменты.

Оценки показали, что их проводимость составляет примерно 2,5 - 3 пС. Эти данные согласуются со значениями проводимости, полученными для каналов в нативной 1Ча+,К+-АТФазе, индуцированных добавлением палитоксина (Artigas and Gadsby, 2004; Artigas and Gadsby, 2003).

ВЫВОДЫ

1. Методом импедансной спектроскопии, реализованном в широком диапазоне концентраций ионов натрия, изучен активный транспорт этих ионов ШД-АТФазой во фрагментах мембран, адсорбированных на бислойной липидной мембране.

2 Измерения в области умеренных и высоких (50-1000 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерные частоты конформационной перестройки белка (от 30 с"1 при 50 мМ ЫаС1 до 100 с"1 при 1 М ЫаС1) и транспорта ионов натрия через внеклеточный канал доступа (1600 с'1). Таким образом, частоты и относительные вклады стадий зависят от концентрации ионов натрия.

3 Разработана теория активного транспорта ионов натрия Ыа+,К+-АТФазой, учитывающая конформационную перестройку белка и транспорт ионов через внеклеточный канал доступа. Она позволила количественно описать частотные зависимости емкости и проводимости, измеренные в области умеренных и высоких концентраций ионов натрия.

4 Измерения в области низких (< 10 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерную частоту (800 с'1, 1 - 5 мМ №С1) перемещения этих ионов во внутриклеточном канале доступа.

5 Существование электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном канале было качественно подтверждено с помощью импедансной спектроскопии на другой модельной системе, в которой мембранные фрагменты с Ка+,К+-АТФазой адсорбированы на твердой подложке золото - тиолы.

6 На основании сравнения диэлектрических коэффициентов перемещений первого иона натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа показано, что место связывания этого иона в Ыа+,К -АТФазе расположено асимметрично на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от ее цитоплазматической стороны.

7 Обнаружен электрогенный транспорт второго и третьего ионов натрия во внутриклеточном канале доступа при высоких рН. При низких рН этот транспорт сводится к электронейтральному Иа/Н обмену.

8 Проведена реконструкция 19-кД фрагментов Ыа+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера. Показано, что эти фрагменты обладают ионофорными свойствами и образуют ионные каналы с проводимостью около 2,5 пС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. V.S. Sokolov, A.A. Lenz, and H.J. Apell. Negative changes of the membrane capacitance due to electrogenic Na transport by the Na,K-ATPase. 10th International Conference on Na.K-ATPase and Related Cation Pumps, 2002, (Abstracts of Poster 2.1.8, p. 10, Elsinore, Denmark).

2. V. Sokolov, A. Ayuyan, A. Lenz, H.-J. Apell. Study of active transport in Na,K-ATPase by admittance method. International Conference "Membrane

bioelectrochemistry: from basic principles to human health", 2002, (Poster Session 1, p. 11, Moscow, Russia).

3. V.S. Sokolov, A.A. Lenz, and H.J. Apell. 2003. Negative changes of the membrane capacitance due to electrogenic Na transport by the Na,K-ATPase. Ann. N. Y Acad. Set. 986:229-231.

4. Valery S. Sokolov, Alexander A. Lenz and Vladimir M. Mirsky. Integration of biological ion pumps into self assembled nanostructure: Functional reconstitution of Na,K,ATP-ase. 1st International Symposium on Complex Materials, 2004, (Abstracts of Poster p. 61 Bremen, Germany).

5. Ленд A.A., Соколов B.C., Аюян А.Г., Павлов K.B., и Апель Х-Ю. Изучение нестационарного транспорта ионов натрия Na-.K-АТФ-азой в модельной мембране. 3-й Съезд биофизиков России, 2004, (тезисы докладов том 1 стр. 248, Воронеж).

6. V.S. Sokolov, A.A. Lenz, К. Grishanin, V. Hagen, and H.-J. Apell. Influence of pH on the Electrogenic Na Transport by Na,K-ATPase Studied by Admittance Measurements. 59th Annual Meeting of the Society of General Physiologists, 2005, (Abstracts of Poster p. 21a-22a, Woods Hole, USA).

7. A.A. Lenz, V.S. Sokolov, K. Grishanin, A.A. Scherbakov, K.V. Pavlov, H.-J. Apell. Electrogenic Na+ transport in access channels of Na,K-ATPase studied by the admittance measurements. International Biophysics Congress, 2005, (Abstracts of Poster p. 646, Montpellier, France).

8. Sokolov V.S., Lenz A.A., Grishanin K, Scherbakov A.A. Electrogenic Na Transport in access channels of Na+,K+-ATPase studied by the admittance measurements. VIII International Frumkin Symposium, 2005, (Abstracts of Poster p.237, Moscow)

9. A.A. Щербаков, Ю.А. Чизмаджев, A.A. Ленц, B.C. Соколов. Импедансная спектроскопия транспорта ионов натрия в Na+,K+,ATP-a3e. Биологические мембраны, 2005, том 22, № 6, с. 492 - 504.

10. Ayuyan A.G., V.S.Sokolov, A.A. Lenz, and H.J. Apell. Effect of chaotropic anions on the sodium transport by the Na,K-ATPase. Eur. Biophys J, 2005, V. 35,1-8.

к исполнению 28/12/2005 Исполнено 28/12/2005

Заказ № 1406 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

2/006 ft 1S7 2_

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ленц, Александр Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура №+,К+-АТФазы.

1.2 Субстраты, последовательность реакций и цикл Альберса - Поста.

1.3. Структура и механизм работы Са2+-АТФазы.

1.3.1 Перемещение цитоплазматических доменов и структурные изменения в трансмембранном домене.

1.3.2 Упрощенная схема работы Са2+-АТФазы.

1.4. Центры связывания ионов в белке.

1.4.1. Центры связывания ионов в Na+,1С-АТФазе.

1.4.2 Перестройка трансмембранных спиралей при конформационном переходе Et - Е2.

1.5. Электрогенность Na+,K+ - АТФазы. Диэлектрические коэффициенты.

1.6. Модель электрогенного транспорта ионов Na+,K+- АТФазой.

1.7. Изучение электрогенного транспорта, осуществляемого Na+,K+ - АТФазой.

1.8. Переходные токи в модельной системе БЛМ с адсорбированными фрагментами.

1.9. Изменения емкости, связанные с работой №+,К*-АТФазы.

1.10. рН зависимость электрогенного транспорта.

1.11. Реконструкция Na+,К^АТФазы.

ГЛАВА 2. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ТРАНСПОРТА ИОНОВ НАТРИЯ В NA+,K+-AT0>A3E.

2.1. Физическая модель.

2.2. Энергетика и электростатика.

2.3. Кинетические уравнения.

2.4. Емкость и проводимость.

2.5. Внеклеточный и внутриклеточный каналы.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Составы растворов, выделение Ка+,К+-АТФазы и 19 - кД фрагмента.

3.2. Экспериментальная система: БЛМ + адсорбированные мембранные фрагменты.

3.3. Экспериментальная система: золотой электрод - тиол - адсорбированные фрагменты.

3.4 Метод поверхностного плазмонного резонанса.

3.5. Реконструкция №+,К+-АТФазы и 19-кД фрагментов в бислойную липидную мембрану по методу Шиндлера.

3.6. Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Кинетика изменения емкости проводимости, связанные с работой №+,К+-АТФазы при фотовысвобожзении caged- АТФ.

4.2. Электрогенный транспорт в системе БЛМ - МФ. Частотные зависимости изменения приращения емкости и проводимости.

4.2.1. Аппроксимация частотных зависимостей.

4.2.2. Частотные зависимости изменения емкости и проводимости при различных концентрациях ионов натрия.

4.3. Сравнение глубины внеклеточного и внутриклеточного каналов доступа.

4.4. Зависимость электрогенного транспорта ионов натрия №*К+-АТФазой от рН.

4.4.1. Измерение частотных зависимостей изменения емкости и проводимости при разных значениях рН.

4.5 Электростатическое поле в системе БЛМ с адсорбированными мембранными фрагментами с №+,К+-АТФазой.

4.5.1. Электростатические потенциалы, возникающие при адсорбции МФ на БЛМ.

4.5.2. Изменение электростатического поля вследствие переноса ионов натрия Na+K*-AТФазой.

4.6 Электрогенный транспорт в системе золотой электрод-тиол-адсорбированные фрагменты.

4.7. Реконструкция №+,К+-АТФазы и 19 - кД фрагментов в бислойную липидную мембрану.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране"

Na+,K+-ATOa3a является одним из важнейших мембранных белков эукариотических клеток, который участвует в поддержании асимметричного распределения ионов натрия и калия по обе стороны клеточной мембраны. Трансмембранные градиенты концентрации ионов натрия и калия, создаваемые ферментом, обеспечивают ключевые стадии жизни клетки: электрическую активность, работу систем вторично-активного транспорта, регуляцию клеточного цикла. Используя свободную энергию гидролиза одной молекулы АТФ, Ыа+,К+-АТФаза переносит из цитоплазмы три иона натрия во внеклеточную среду и два иона калия в противоположном направлении. Таким образом, процесс является электрогенным, что позволяет регистрировать работу Ыа+,К+-АТФазы и исследовать ее функциональные свойства с помощью измерения переходных и стационарных токов, связанных с транспортом ионов, при воздействии быстрого введения АТФ или электрического поля от внешнего источника (Lauger, 1991).

Ма+,К+-АТФаза была открыта в 1957 году Йенсом Христианом Скоу (Skou, 1957), позднее (в 1997 г.) получившим за это Нобелевскую премию. С тех пор исследованию молекулярных механизмов работы и структуры Ма+,К+-АТФазы было посвящено большое количество работ. Установлены гены, кодирующие данный белок, определена аминокислотная последовательность, охарактеризованы основные функциональные свойства, найдены специфические ингибиторы, действующие на различные стадии работы фермента, разработаны методы выделения и очистки. Однако до сих пор не удалось получить белок в кристаллической форме и расшифровать структуру Ыа+,К+-АТФазы с атомным разрешением. Поэтому пока не установлена трехмерная структура Ма+,К+-АТФазы, и многие вопросы, касающиеся механизма ее функционирования, остаются на данный момент открытыми.

Особый интерес представляет изучение электрогенного переноса ионов натрия, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой в среде, не содержащей ионов калия. В этих условиях можно изучать кинетику процесса, регистрируя нестационарные электрические токи после быстрого введения АТФ, либо скачкообразного изменения напряжения. Нестационарный электрический ток в Ыа+,К+-АТФазе после скачкообразного изменения напряжения изучают на изолированных клетках или фрагментах клеточной мембраны ("гигантский пэтч кламп"). Такие объекты обычно содержат не только АТФазу, но и другие мембранные белки, что затрудняет измерения (для получения "чистого" электрического сигнала АТФазы приходится использовать процедуры вычитания сигнала, записанного после ее ингибирования. Исследования электрогенного транспорта в очищенной от посторонних белков Ыа+,К+-АТФазе проводятся на модельной системе, в которой мембранные фрагменты (МФ), содержащие Ыа+,К+-АТФазу, адсорбированы на поверхности бислойной липидной мембраны (БЛМ). Такая система позволяет исследовать электрогенный транспорт ионов натрия, вызванный либо быстрым освобождением АТФ из связанной формы, либо приложением переменного напряжения. Разработанные к настоящему времени экспериментальные методы позволяют с помощью электрических измерений определить скорость отдельных стадий электрогенного транспорта и получить важную информацию о пути переноса ионов в белке, в частности, о так называемых "каналах доступа" ионов, через которые происходит обмен ионов натрия и калия между водным раствором и центрами связывания ионов внутри белка. Несмотря на интенсивные исследования электрогенного транспорта, осуществляемого Ыа+,К+-АТФазой, ряд вопросов относительно механизма ее функционирования остается открытым. В настоящее время достаточно хорошо изучен транспорт ионов во внеклеточном канале, в частности, показано, что он состоит из нескольких стадий, хотя до сих пор остается невыясненным происхождение этих стадий и нет их теоретического описания. Очень мало изучен транспорт во внутриклеточном канале, само существование которого ставилось под сомнение. Предметом настоящей работы является детальное исследование электрогенного транспорта в обоих каналах Na+,K+-ATOa3bi с помощью метода импедансной спектроскопии на модельной системе.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ленц, Александр Александрович

ВЫВОДЫ

1. Методом импедансной спектроскопии, реализованном в широком диапазоне концентраций ионов натрия, изучен активный транспорт этих ионов №,К-АТФазой во фрагментах мембран, адсорбированных на бислойной липидной мембране.

2. Измерения в области умеренных и высоких (50-1000 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерные частоты конформационной перестройки белка (от 30 с'1 при 50 мМ NaCl до 100 с"1 при 1 М NaCl) и транспорта ионов натрия через внеклеточный канал доступа (1600 с'1). Таким образом, частоты и относительные вклады стадий зависят от концентрации ионов натрия.

3. Разработана теория активного транспорта ионов натрия №+,К+-АТФазой, учитывающая конформационную перестройку белка и транспорт ионов через внеклеточный канал доступа. Она позволила количественно описать частотные зависимости емкости и проводимости, измеренные в области низких, умеренных и высоких концентраций ионов натрия.

4. Измерения в области низких (< 10 мМ) концентраций ионов натрия позволили определить характерную частоту (800 с"1, 1 - 5 мМ NaCl) перемещения этих ионов во внутриклеточном канале доступа.

5. Существование электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном канале было качественно подтверждено с помощью импедансной спектроскопии на другой модельной системе, в которой мембранные фрагменты с №+,К+-АТФазой адсорбированы на твердой подложке золото - тиолы.

6. На основании сравнения диэлектрических коэффициентов перемещений первого иона натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа показано, что место связывания этого иона в №+,К+-АТФазе расположено асимметрично на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от ее цитоплазматической стороны.

7. Обнаружен электрогенный транспорт второго и третьего ионов натрия во внутриклеточном канале доступа при высоких рН. При низких рН этот транспорт сводится к электронейтральному Na+/H+ обмену.

8. Проведена реконструкция 19-кД фрагментов Na+,K+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера. Показано, что эти фрагменты обладают ионофорными свойствами и образуют ионные каналы с проводимостью около 2,5 пС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе рассмотрена теоретическая модель активного транспорта ионов натрия, осуществляемого №+,К+-АТФазой, учитывающая 3 стадии: медленный конформационный переход белка и транспорт ионов во внеклеточном и внутриклеточном каналах доступа. В экспериментальной части работы исследовался нестационарный транспорт ионов натрия на модельной системе, включающей БЛМ с адсорбированными на ней фрагментами мембран, содержащими белок. В эксперименте регистрировались малые изменения емкости и проводимости, вызванные фотоиндуцированным освобождением АТФ. Исследования проведены в широком диапазоне частот (2-1000 Гц), концентраций ионов натрия (1 - 1000 мМ) и рН среды. Экспериментальные данные были сопоставлены с разработанной теорией, которая позволила объяснить измеренные частотные зависимости приращений емкости и проводимости, а также влияние на них концентрации ионов натрия. В результате были определены кинетические параметры отдельных стадий переноса ионов натрия. Наилучшее совпадение теории и эксперимента наблюдается при 150 мМ NaCl. Как было предсказано теорией и подтверждено в эксперименте, частотные зависимости приращений емкости и проводимости описываются суммой трех функций Лоренца с амплитудами Со, Q и Сг и характерными частотами Шо, cc>i и со2. Каждый из этих лоренцианов отвечает определенной стадии транспорта. Значения амплитуд и характерных частот зависели от состава раствора.

Частотная зависимость при концентрации ионов натрия выше 50 мМ удовлетворительно описывается суммой двух лоренцианов с постоянной составляющей. Характерная частота первого лоренциана позволила оценить скорость конформационной перестройки белка (от 30 с"1 при 50 мМ NaCl до 100 с'1 при 1 М NaCl). Второй лоренциан связан с перемещением одного из трех ионов натрия во внеклеточном канале №+,К+-АТФазы. Характерная частота второго лоренциана составляла ~1600 с"1, а его относительная амплитуда уменьшалась при понижении концентрации ионов натрия в растворе и исчезала при концентрации менее 10 мМ.

При более низкой концентрации ионов натрия появлялись приращения емкости и проводимости отрицательного знака. Они объясняются электрогенным транспортом ионов натрия во внутриклеточном канале, который существует в нефосфорилированном белке и прекращается после введения АТФ. Показано, что отрицательные приращения емкости и проводимости зависят от частоты. Эта зависимость описывается лоренцианом с отрицательной амплитудой. Его характерная частота составляла 800 с"1 (1 - 5 мМ NaCl), а относительный вклад возрастал при уменьшении концентрации ионов натрия, достигая максимального значения при концентрации около 3 мМ, соответствующей константе связывания третьего иона натрия во внутриклеточном канале.

На основании сравнения диэлектрических коэффициентов перемещений первого иона натрия во внутриклеточном и внеклеточном каналах доступа был сделан вывод, что место связывания этого иона расположено асимметрично на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от цитоплазматической стороны белка.

Транспорт ионов натрия во внеклеточном и внутриклеточном каналах доступа был исследован также при различных значения рН. При низкой концентрации ионов натрия, увеличение рН приводило к появлению отрицательных приращений емкости и проводимости большой величины, что свидетельствует о появлении новой электрогенной стадии транспорта, прекращающейся после фосфорилирования белка при введении АТФ. Данная стадия связана с транспортом двух ионов натрия с внутриклеточной стороны белка, который является электрогенным при высоких значениях рН, и превращается в электронейтральный Na+/H+ обмен при низких рН.

Возможной альтернативной причиной появления отрицательных приращений емкости может быть электрострикция - изменение емкости

БЛМ при ее сжатии в электростатическом поле, которое может изменяться в результате функционирования Na+K+-ATOa3bi. Для оценки электрострикции проведены исследования электростатического поля, возникающего в МФ при его адсорбции на БЛМ. Показано, что при введении суспензии МФ в раствор с одной стороны БЛМ происходит адсорбция на поверхности мембраны как самих МФ, так и содержащейся в препарате примеси SDS, что приводит к возникновению электростатического потенциала в области контакта мембранных фрагментов с бислоем. Были проведены оценки потенциалов, возникающих при адсорбции мембранных фрагментов и SDS. Опыты со скачками напряжения показали, что изменение потенциала в щели между МФ и БЛМ вследствие функционирования Ка+К+-АТФазы мало и не может объяснить изменение емкости эффектом электрострикции. Кроме того, существование электрогенного транспорта ионов натрия во внутриклеточном канале было качественно подтверждено с помощью импедансной спектроскопии на другой модельной системе, в которой мембранные фрагменты с Ка+,К+-АТФазой адсорбированы на твердой подложке золотой электрод - тиолы. На этой системе было также зарегистрировано зависящее от частоты отрицательное приращение емкости и проводимости. Полученные результаты служат дополнительным доказательством того, что изменения емкости и проводимости вызваны транспортом ионов натрия Na+K+-АТФазой, поскольку данная система не содержит липидных бислоев с деканом, дающих основной вклад в электрострикцию.

В работе было осуществлено встраивание Ка+,К+-АТФазы в бислойную липидную мембрану методом Шиндлера. На данный момент удалось зарегистрировать токи короткого замыкания в ответ на введение АТФ, которые оказались небольшими по величине, что не позволило провести дальнейшее исследование Ка+,К+-АТФазы в этой системе при помощи импедансной спектроскопии. Более удачной оказалась реконструкция 19-кД фрагментов Na+,K+-АТФазы. Показаны ионофорные свойства этих фрагментов, которые образуют ионные каналы с проводимостью около 2,5 пС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ленц, Александр Александрович, Москва

1. Айтьян С.Х., Белая M.JL, и Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие заряженных бислойных липидных мембран // ДАН СССР - 1981. - Т. 256.- С. 990-994.

2. Айтьян С.Х., Белая МЛ., и Чизмаджев Ю.А. Взаимодействие мембран, несущих постоянный поверхностный заряд // Биофизика 1981. - Т. 26. -С. 467-473.

3. Albers R.W. Biochemical aspects of active transport // Annu. Rev. Biochem.- 1967.-V. 36.-P. 727-756.

4. Anner B.M. and Moosmayer M. Preparation of Na,K-ATPase-containing liposomes with predictable transport properties by a procedure relating the Na,K-transport capacity to the ATPase activity // J Biochem. Biophys Methods 1982. - V. 5. - P. 299-306.

5. Apell H.J. Toward an understanding of ion transport through the Na,K-ATPase // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - V. 986. - P. 133-140.

6. Apell H.J. and Diller A. Do H+ ions obscure electrogenic Na+ and K+ binding in the El state of the Na,K-ATPase? // FEBS Lett. 2002. - V. 532. -P. 198-202.

7. Apell H.J. and Karlish S.J. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques // J. Membrane Biol. 2001. - V. 180. - P. 1-9.

8. Apell H.-J., Borlinghaus R., and Lauger P. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: II. Microscopic Analysis of Transient Currents // J. Membrane Biol. 1987. - V. 97. - P. 179-191.

9. Artigas P. and Gadsby D.C. Ion occlusion/deocclusion partial reactions in individual palytoxin-modified Na/K pumps // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003a. -V.986.-P. 116-126.

10. Artigas P. and Gadsby D.C. Na+/K+-pump ligands modulate gating of palytoxin-induced ion channels // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2003b. - V. 100.-P. 501-505.

11. Artigas P. and Gadsby D.C. Large diameter of palytoxin-induced Na/K pump channels and modulation of palytoxin interaction by Na/K pump ligands // J. Gen. Physiol 2004. - V. 123. - P. 357-376.

12. Ермаков Ю.А. и Юсипович А.И. Граничный потенциал и натяжение плоских БЛМ в присутствии гадолиния. Регистрация в условиях непрерывной перфузии ячейки. // Биологические мембраны 2002. - Т. 19.-С. 541-548.

13. Babes A. and Fendler К. Na+ Transport, and the EiP-E2P Conformational Transition of the Na+/K+-ATPase // Biophys. J. 2000. - V. 79. - P. 25572571.

14. Bamberg E., Butt H.-J., Eisenrauch A., and Fendler K. Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes // Quart. Rev. Biophys. 1993. - V. 26. -P. 1-25.

15. Borlinghaus R., Apell H.-J., and Lauger P. Fast Charge Translocation Assotiated with Partial Rections of the Na,K-Pump: I. Current and Voltage Transients after Photochemical Release of ATP // J. Membrane Biol. 1987. -V. 97.-P. 161-178.

16. Buhler R., Sturmer W., Apell H.-J., and Lauger P. Charge translocation by the Na,K-pump: I. Kinetics of local field changes studied by time-resolved fluorescence measurements // J. Membrane Biol. 1991. - V. 121. - P. 141161.

17. Butscher C., Roudna M., and Apell H. Electrogenic partial reactions of the SR-Ca-ATPase investigated by a fluorescence method // J Membr. Biol. -1999.-V. 168.-P. 169-181.

18. Cornelius F. Incorporation of C^Eg-solubilized Na+,K+-ATPase into liposomes determination of sidedness and orientation // Meth. Enzymol. -1988.-V. 156.-P. 156-167.

19. Cornelius F., Mahmmoud Y.A., and Christensen H.R. Modulation of Na,K-ATPase by associated small transmembrane regulatory proteins and by lipids //J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 415-423.

20. Cornelius F. and Skou J.C. Reconstitution of (Na++K+)-ATPase into phospholipid vesicles with full recovery of its specific activity // Biochim. Biophys. Acta 1984. - V. 772. - P. 357-373.

21. De Weer P., Gadsby D.C., and Rakowski R.F. Voltage Dependence of the Na-K Pump // Ann. Rev. Physiol. 1988. - V. 50. - P. 225-241.

22. Deguchi N., Jorgensen P.L., and Maunsbach A.B. Ultrastructure of the sodium pump. Comparison of thin sectioning, negative staining and freeze-fracture of purified membrane-bound (Na+,K+)-ATPase // J. Cell Biol. -1977.-V. 75.-P. 619-634.

23. Domaszewicz W. and Apell H. Binding of the third Na+ ion to the cytoplasmic side of the Na,K-ATPase is electrogenic // FEBS Lett. 1999. -V. 458.-P. 241-246.

24. Drachev L.A., Jasaitis A.A., Mikelsaar H., Nemecek I.B., Semenov A.Y., Semenova E.G., Severina I.I., and Skulachev V.P. Reconstitution ofbiological molecular generators of electric current // J. Biol. Chem. 1976. -V.251.-P. 7077-7082.

25. Eisenrauch A., Grell E., and Bamberg E. Voltage Dependence of the Na,K-ATPase incorporated into Planar Lipid Membranes // 1991. P. 317-326.

26. Fendler K., Grell E., Haubs M., and Bamberg E. Pump Currents Generated by the Na+,K+-ATPase from kidney on Black Lipid Membranes // EMBO J. -1985.-V. 4.-P. 3079-3085.

27. Fendler K., Jarushewski S., Hobbs A.S., Albers W., and Froehlich J.P. Pre-Steady-State Charge Translocation in Na,K-ATPase from Eel Electric Organ //J. Gen. Physiol. 1993. - V. 102. - P. 631-666.

28. Glynn I.M. The Na+,K+-transporting adenosine triphosphatase // 1985. V. 2. -P. 35-114.

29. Goldshlegger R., Karlish S.J.D., Rephaeli A., and Stein W.D. The Effect of Membrane-Potential on the Mammalian Sodium- Potassium Pump Reconstituted into Phospholipid-Vesicles // J. Physiol. -London 1987. - V. 387.-P. 331-355.

30. Hayman E.S. J. Membrane Biol. 1977. - V. 37. - P. 263-263.

31. Heyse S., Wuddel I., Apell H.-J., and Sturmer W. Partial reactions of the Na,K-ATPase: determination of rate constants // J. Gen. Physiol. 1994. - V. 104.-P. 197-240.

32. Hilgemann D.W. Channel-Like Function of the Na,K Pump Probed at Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches // Science 1994. - V. 263. - P. 1429-1432.

33. Hirsch Т., Kettenberger H., Wolfbeis O.S., and Mirsky V.M. A simple strategy for preparation of sensor arrays: molecularly structured monolayers as recognition elements // Chem. Commun. (Camb. ) 2003. - P. 432-433.

34. Hladky S.B. Ion transport and displacement currents with membrane bound carriers: The theory for voltage - clamp currents, charge - pulse transients and admittance for symmetrical systems // J. Membrane Biol. - 1979. - V. 49. - P. 213-237.

35. Hokin L.E. and Dixon J.F. Reconstitution of the Na,K-pump by freeze thaw sonication estimation of coupling ratio and electrogenicity // Meth. Enzymol. - 1988.-V. 156.-P. 141-155.

36. Holmgren M. and Rakowski R.F. Pre-Steady-State Transient Currents Mediated by the Na/K Pump in Internaly Perfused Xenopus Oocytes // Biophys. J. 1994. - V. 66. - P. 912-922.

37. Holmgren M., Wagg J., Bezanilla F., Rakowski R.F., De Weer P., and Gadsby D.C. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions // Nature 2000. - V. 403. - P. 898-901.

38. Павлов K.B. и Соколов B.C. Электрогенный транспорт ионов Na/K-АТРазой // Биологические мембраны 1999. - Т. 16. - С. 604-638.

39. Маркин B.C. и Чизмаджев Ю.А. Индуцированный ионный транспорт // 1974.

40. Jain М.К., White F.P., Strickholm A., Williams Е., and Cordes E.H. Studies concerning the possible reconstitution of an active cation pump across an artificial membrane // J. Membrane Biol. 1972. - V. 8. - P. 363-380.

41. Jogansson A., Smith G.A., and Metcalfe J.C. The effect of bilayer thickness on activity of (Na-K)-ATPase // Biochim. Biophys. Acta 1981. - V. 641. - P. 416-421.

42. Jorgensen P.L. Isolation of the Na,K-ATPase // Meth. Enzymol. 1974. - V. 32. - P. 277-290.

43. Jorgensen P.L., Hakansson K.O., and Karlish S.J. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions // Annu. Rev. Physiol -2003. V. 65.-P. 817-849.

44. Karlish S.J. Organization of the membrane domain of the Na/K-pump. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. - V. 834. - P. 30-44.

45. Karlish S.J.D., Goldshleger R., and Stein W.D. A 19-kDa C-Terminal Tryptic Fragment of the Alpha-Chain of Na/K- ATPase Is Essential for Occlusion and Transport of Cations // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990. - V. 87. - P. 45664570.

46. Kimelberg H.K. and Papahadjopoulos D. Phospholipid requirements for (Na-K)-ATPase activity: head group specificity and fatty acid fluidity // Biochim. Biophys. Acta 1972. - V. 282. - P. 277-292.

47. Lauger P. Electrogenic Ion Pumps // 1991. P. 1-313.

48. Li C., Capendeguy O., Geering K., and Horisberger J.D. A third Na+-binding site in the sodium pump // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. - V. 102. - P. 12706-12711.

49. Lu C.-C., Kabakov A., Markin V.S., Mager S., Frazier S., Frazier G.A., and Hilgemann D.W. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -1995.-V. 1995.-P. 11220-11224.

50. Ma H., Lewis D., Xu C., Inesi G., and Toyoshima C. Functional and structural roles of critical amino acids within the"N", "P", and "A" domains of the Ca2+ ATPase (SERCA) headpiece // Biochemistry 2005. - V. 44. - P. 8090-8100.

51. Marcus M.M., Apell H.-J., Lauger P., Roudna M., Schwendener R.A., and Weder H.G. (Na+ K+)-ATPase in Artificial Lipid Vesicles - Influence of1.pid Structure on Pumping Rate // Biochim. Biophys. Acta 1986. - V. 854. -P. 270-278.

52. McLaughlin S. Electrostatic Potentials at Membrane-Solution Interfaces // 1977.-P. 71-144.

53. Mironova G.D., Bocharnikova N.I., Mirsalikhova N.M., and Mironov G.P. Ion transporting properties and ATPase activity of (Na+-K+)- ATPase large subunit incorporated into bilayer lipid membranes // Biochim. Biophys. Acta -1986.- V. 861.-P. 224-236.

54. Montal M. and Mueller P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1972. - V. 69. - P. 3561-3566.

55. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., and Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1963. - V. 67. - P. 534-535.

56. Nagel G., Bamberg E., Fendler K., and Grell E. Na+ Currents Generated by the Purified (Na+ K+)-ATPase on Planar Lipid-Membranes // Biochim. Biophys. Acta - 1987. - V. 901. - P. 239-249.

57. Nakao M. and Gadsby D.C. Voltage Dependence of Na Translocation by the Na/K Pump // Nature 1986. - V. 323. - P. 628-630.

58. Соколов B.C. и Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока // Биофизика 1980. - Т. 25. - С. 170-172.

59. Соколов B.C., Павлов К.В., Джанджугазян К.Н., и Бамберг Е. Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании №,К-АТФазы // Биологические мембраны 1992. - Т. 9. - С. 961-969.

60. Соколов B.C., Стуколов С.М., Дармостук А.С., и Апель Х.-Ю. Изучение нестационарного электрогенного транспорта ионов натрия Na,K,ATPазой методом измерения емкости // Биологические мембраны 1997. - Т. 14. - С. 529-548.

61. Соколов B.C., Черный В.В., Симонова М.В., и Маркин B.C. Распределение потенциала на границе мембрана-раствор при адсорбции амфифильных ионов // Биологические мембраны 1990. - Т. 7. - С. 872884.

62. Сорокина З.А. Ионофорные свойства пептидных фрагментов церебральной Na,К-АТФазы // Укр. Биохим. Ж. СССР 1984. - Т. 56. - С. 413-417.

63. Norby J.G. Na,K-ATPase Structure and Kinetics - Comparison with Other Ion- Transport Systems // Chemica Scripta - 1987. - V. 27B. - P. 119-129.

64. Ogawa H. and Toyoshima C. Homology modeling of the cation binding sites of Na+K+-ATPase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2002. - V. 99. - P. 15977-15982.

65. Or E., Goldshleger R., and Karlish S.J.D. An Effect of Voltage on Binding of Na+ at the Cytoplasmic Surface of the Na+ K+ Pump // J. Biol. Chem. 1996. -V.271.-P. 2470-2477.

66. Peinelt C. and Apell H.J. Time-resolved partial reactions of the SR Ca-ATPase investigated with a fluorescent styryl dye // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2003.-V. 986.-P. 325-326.

67. Peinelt C. and Apell H.J. Kinetics of Ca2+ Binding to the SR Ca-ATPase in the El State // Biophys. J. 2005. - V. 89. - P. 2427-2433.

68. Peluffo R.D. and Berlin J.R. Electrogenic K+ transport by the Na+,K+ pump in rat cardiac ventricular myocytes // Journal Of Physiology London 1997. - V. 501.-P. 33-40.

69. Pintschovius J. and Fendler K. Charge translocation by the Na+/K+-ATPase investigated on solid supported membranes: Rapid solution exchange with a new technique // Biophys. J. 1999. - V. 76. - P. 814-826.

70. Rakowski R.F. Charge Movement by the Na/K Pump in Xenopus Oocytes // J. Gen. Physiol. 1993.-V. 101.-P. 117-144.

71. Reinhardt R., Lindemann В., and Anner B.M. Leakage channel conductance of single (Na-K)-ATPase molecules incorporated into planar bilayer by fusion of liposomes // Biochim. Biophys. Acta - 1984. - V. 774. - P. 147-150.

72. Rettinger J., Vasilets L.A., and Schwarz W. Analysis the Na+/K+-pump in Outside-out Giant Membrane Patches of Xenopus Oocytes // 1994. P. 553556.

73. Rice W.J., Young H.S., Martin D.W., Sachs J.R., and Stokes D.L. Structure of Nal,Kl-ATPase at 11-Е Resolution: Comparison with Ca21-ATPase in El and E2 States // Biophys. J. 2001. - V. 80. - P. 2187-2197.

74. Sagar A. and Rakowski R.F. Access Channel Model for the Voltage Dependence of the Forward- running Na+/K+ Pump // J. Gen. Physiol. 1994. -V. 103.-P. 869-894.

75. Schneeberger A. and Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement // J. Membr. Biol. 1999. - V. 168. - P. 221228.

76. Schneeberger A. and Apell H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: II. Competition of various cations // J. Membr. Biol. 2001. - V. 179. - P. 263-273.

77. Schwappach В., Sturmer W., Apell H.-J., and Karlish S.J.D. Binding of sodium ions and cardiotonic steroids to native and selectively trypsinized Na,K pump, detected by charge movements // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. -P. 21620-21626.

78. Seifert K., Fendler K., and Bamberg E. Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes // Biophys. J. 1993. - V. 64.-P. 384-391.

79. Shull G.E., Schwarz A., and Lingrel J.B. Amino-acid sequence of the catalitic subunit of the Na,K pump deduced from complementary DNA // Nature -1985.-V. 316.-P. 691-695.

80. Skou J.C. The influence of some cations on an adenosinetriphosphatase from peripheral nerves // Biochim. Biophys. Acta 1957. - V. 23. - P. 394-401.

81. Sokolov V.S., Ayuyan A.G., and Apell H.-J. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps of the Na,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements // European Biophysics Journal 2001. - V. 30. - P. 515-527.

82. Sokolov V.S. and Mirsky V.M. Electrostatic potentials of bilayer lipid membranes: basic research and analytical applications // 2004. P. 255-291.

83. Sokolov V.S., Pavlov K.V., and Dzhandzhugazyan K.N. Change of Membrane Capacitance Coupled with Electrogenic Transport by Na,K-ATPase // 1994. P. 529-533.

84. Stengelin M., Eisenrauch A., Fendler K., Nagel G., van der Hijden H.T., de Pont J.J., Grell E., and Bamberg E. Charge translocation of H,K-ATPase and Na,K-ATPase //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992. - V. 671. - P. 170-188.

85. Sweadner K.J. and Donnet K. Structural similarities of Na,K,ATPase andл I

86. SERCA, the Ca -ATPase of the sarcoplasmic reticulum // Biochem. J. -2001.-V. 356.-P. 685-704.

87. Therien A.G., Pu H.X., Karlish S.J., and Blostein R. Molecular and functional studies of the gamma subunit of the sodium pump // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. - V. 33. - P. 407-414.

88. Toyoshima C. and Mizutani T. Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue // Nature 2004. - V. 430. - P. 529-535.

89. Toyoshima C., Nakasako M., Nomura H., and Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution // Nature -2000.-V. 405.-P. 647-655.

90. Toyoshima C. and Nomura H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium // Nature 2002. - V. 418. - P. 605611.

91. Toyoshima C., Nomura H., and Tsuda T. Lumenal gating mechanism revealed in calcium pump crystal structures with phosphate analogues // Nature 2004. - V. 432. - P. 361-368.

92. Vasilets L.A. and Schwarz W. Structure Function Relationship of Cation Binding in the Na+/K+ - ATPase // Biochim. Biophys. Acta - 1993. - V. 1154. -P. 201-222.

93. Wuddel I. and Apell H.-J. Electrogenity of the Sodium Transport Pathway in the Na,K-ATPase Probed by Charge-Pulse Experiments // Biophys. J. 1995. -V. 69.-P. 909-921.

Информация о работе

Ленц, Александр Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Изучение механизма активного транспорта и структуры каналов переноса ионов в Na+,K+-АТФазе с помощью электрических измерений на модельной мембране - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы