Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биофизические свойства реконструированных клеточных систем ионного транспорта и их модификация антителами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биофизические свойства реконструированных клеточных систем ионного транспорта и их модификация антителами"

>'П о?

л/3

АКАДЕМИЯ НАУК СССР НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ

На правах рукописи УДК 577.352.26:577.352.465

коломыткин

Олег Владимирович

БИОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

ИОННОГО ТРАНСПОРТА И ИХ МОДИФИКАЦИЯ АНТИТЕЛАМИ (03.00.02 - биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

ЛЕНИНГРАД 1 9 8 9 ' '

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор физико-математических наук

' Э.Н.Казбеков

доктор физико-математических наук, профессор

Г.Н.Еерестовский,

академик АН УССР, доктор биологических наук В.К.Лишко.

Ведущая организация: Институт проблем передачи

информации АН СССР.

Защита состоится "_"_1990 г. в_часов

на заседании Специализированного совета Д 003.53,01 при Научно-техническом объединении АН СССР по адресу: 198103, Ленинград, пр. Огородникова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-технического объединения АН СССР.

Автореферат разослан " " 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук В.А. ШКУРОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из самых актуальных проблем современной биофизики мембран является выяснение молекулярных механизмов функционирования систём ионного транспорта клеточных мембран. Эти системы играют чрезвычайно важную роль б передаче нервного импульса и обработке информации в мозге. Они выполняют ключевую роль в синтезе аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального носителя энергии в живых клетках, а тага® осуществляют другие разнообразные и важные функции.

Особый интерес для исследования представляют постсинаптичес-кие рецепторы ГАМК и протонная АТФаза. Этот интерес обусловлен тем, что ГАМКергические синапсы являются одними из важнейших элементов мозга, обеспечивающих передачу и обработку сигналов. Кроме того, синапсы данной медиаторной природы являются наиболее распространенными тормозными синапсами и составляют до 20-40% от всех синапсов мозга млекопитающих (Tower, 1976). В то же время протонная АТФаза играет определяющую роль в синтезе АТФ в нервных клетках мозга, а также во многих других" типах клеток (Kagawa.et al. , 1979). Следовательно, постсинаптические рецепторы ГАМК и протонная АТФаза являются одними из главнейших систем ионного транспорта клеточных мембран мозга.

К настоящему времени установлена первичная последовательность отдельных субъедиц рецептора ГАМК и" протонной АТФазы, появились новые чувствительные электрофизиологические методы, которые позволяют оценить параметры отдельных ионных каналов рецептора. Однако, несмотря на достигнутые результаты, проблема расшифровки пространственной структуры и физических принципов функционирования вышеуказанных, а также и всех других мембранных белков, остается до настоящего времени по существу неисследованной. В то же время решение даже некоторых задач этой проблемы позволяет не только продвинуться в понимании фундаментальных физико-химических механизмов работы мозга, но также дает возможность целенаправленно вести поиск физических и химических факторов внешней среды, оказывающих заданное воздействие на центральную нервную систему.

Существует множество надежных предпосылок для утверждения, что реконструкция в искусственной мембране таких молекулярных устройств как рецептор ГАМК и Н+-АТФаза и их исследование при' помощи техники изучения одиночных каналов позволит достичь

значительного прогресса в понимании физических принципов их функционирования.

Модно предположить, что прорыв в исследовании пространственного строения и молекулярных основ функционирования Ионотранс-портных клеточных систем будет достигнут в значительной степени благодаря применению моно- и поликлональных антител, обладающих уникальными свойствами высокоспецифического связывания. Для достижения указанной цели актуальное значение имеет расшифровка практически неизвестных молекулярных физических механизмов взаимодействия антител с ионными каналами.

Важное фундаментальное и практическое значение имеет исследование изменений свойств реконструированных синаптических структур под воздействием электромагнитных полей. Неотложность решения этой задачи вызвана повышением интенсивности электромагнитных полей, воздействующих на мозг и весь организм человека, вследствие развития современной техники.

Для разработки указанного комплекса фундаментальных и практических проблем можно сформулировать следующую цель работы.

Цель работы. Выяснить биофизические свойства и механизмы функционирования реконструированных клеточных систем ионного транспорта, играющих фундаментальную роль в обработке информации и энергетике в мозге: синаптических рецепторов ГАМК и протонной АТОвзы. Для создания научной основы применения антител в исследовании пространственной организации и молекулярных принципов функционирования клеточных систем ионного транспорта расшифровать молекулярные механизмы взаимодействия ионных каналов с моно- и поликлональными антителами.

Основные задачи исследования. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. РазЕить перспективное направление в исследовании клеточных систем ионного транспорта на основе разработки нового метода реконструкции таких систем в плоском липидном бислое, отличающегося от известных способов высокой эффективностью и универсальностью.

2. Экспериментально исследовать и проанализировать основные физико-химические свойства и принципы функционирования таких важнейших транспортных мембранных систем как рецептор гамма-аминомасляной кислоты из синапсов мозга крысы и протонная АТФаза, реконструированных в липидном бислое при помощи нового

разработанного метода.

3. Экспериментально исследовать и развить теоретические представления о молекулярных физико-химических механизмах взаимодействия реконструированных простейших и хорошо изученных тонных каналов (образованных амфотерицином Б и ^-латротоксином) с поли-и моноклональными антителами, а также расшифровать пространственную структуру комплексов, образованных каналами и молекулами антител.

С целью выяснения структуры рецептора ГАМК и принципов его функционирования при помощи антител определить взаимную прост-ранотвеную локализацию ионного канала и места связывания медиатора на реконструированном рецепторе.

4. Экспериментально исследовать возможность реконструированных синаптических рецепторов мозга изменять свои свойства при воздействии электромагнитных волн УВЧ диапазона, направление и физические механизмы этих изменений.

5. Проанализировать и обобщить полученные результаты для создания нового фундамента в исследовании пространственной организации и молекулярных основ функционирования реконструированных клеточных систем ионного транспорта при помощи целенаправленного применения антител.

Научная новизна. Полученные результаты имеют следующую принципиальную новизну. &

1. Разработано перспективное направление в исследовании клеточных систем ионного транспорта на основе разработки нового метода реконструкции таких систем в плоском липидном бислое, отличающегося от известных способов высокой эффективностью и универсальностью.

2. С помощью разработанного нового метода впервые реконструирован в липидном бислое рецептор ГА1Ж из мозга и определены основные физико-химические характеристики одиночных реконструированных рецепторов. Показано, что мозг содержит рецепторы ГАШ, имеющие разные типы ионных каналов: одни при взаимодействии с

ГАМК открывают в мембране хлорные каналы, другие - катионные + +

(Иа , К ) каналы.

3. Впервые показано, что при протекании на липидном бислое фермент-субстратной реакции в липидной мембране возможно образование одиночных ионных каналов.

4. С помощью разработанного нового метода Епервые произве-денно встраивание функционирующей протонной АТФазы в плоскую

бимолекулярную лшидную мембрану, что позволило экспериментально с помощью прямого измерения количественно определить основные электрические характеристики АТФазы б БШ Известные до сих пор способы оказались непригодными для реконструкции рецептора ГАМК и протонной АТФазы в плоском бислое.

5. Впервые расшифрован молекулярный физико-химический механизм взаимодействия ионных каналов с поли- и моноклональ-ными антителами и установлено пространственное строение каналов, модифицированных антителами.

6. Показано, в результате впервые проведенного экспериментального исследования,_ что свойства модельной мембраны со встроенными синапгическими рецепторами ГАМК изменяются при воздействии на нее электромагнитного поля УВЧ диапазона. Обнаружен механизм такого воздействия.

7. Из вышеперечисленного следует, что в работе создан фундам&нт нового направления, основанного на реконструкции и целенаправленном применении антител, в исследовании пространственной организации и молекулярных основ функционирования клеточных систем ионного транспарта, играющих важную роль в жизнедеятельности организма.

Практическая ценность. Разработка нового универсального метода реконструкции мембранных белков открывает возможность быстрого и эффективного исследования физических принципов функционирования на молекулярном уровне не только рецепторов ГАМК и протонной АТФазы, но и других самых разнообразных клеточных систем ионной проницаемости, что может быть примененным в биофизических и других исследованиях.

Реконструкция рецепторов ГАМК из мозга крысы и протонной АТФазы в модельной мембране позволила выяснить электрические свойства данных важнейших клеточных систем ионного транспорта, что имеет большое значение в понимании фундаментальных физико-химических механизмов работы мозга на молекулярном уровне. В то хв время это открывает новые возможности для целенаправленного поиска физических и химических факторов внешней среды, воздействующих на центральную нервную систему в заданном направлении.

Создание модельных мембран со встроенными рецепторами ГАМК и протоной АТЗазой открывает уникальные возможности для быстрого и дешевого скрининга веществ, которые могут оказывать высокоэффективное действие на данные белковые системы. Это может найти широкое применение в медицине.

С другой стороны, поскольку рецепторы ГАМК играют важную роль в нейромышечном соединении многих насекомых - вредителей сельского хозяйства, то расшифровка принципов функционирования данного рецептора и его реконструкция в БЛМ дает удобную возможность быстрее и эффективнее проводить поиск веществ, уничтожающих данных вредителей.

Выясненные закономерности воздействия электромагнитных волн УВЧ диапазона на синаптические структуры мозга имеют исключительно Еажное значение в связи с развитием современной техники и повышением интенсивности электромагнитных полей, воздействующих на мозг и таким образом на весь организм человека.

Расшифровка молекулярного механизма взаимодействия реконструированных одиночных ионных каналов с антителами создает научную основу для применения моноклональных антител в исследовании структуры и физических принципов функционирования разнообразных клеточных систем ионного транспорта.

В связи с тем, что структура антигенных рецепторов Б-лимфоцитов похожа на структуру антител и поскольку ионные каналы являются антигенами, то расшифровка указанного механизма имеет принципиальное значение для выяснения молекулярного механизма работы рецепторов этих важнейших клеток иммуной системы.

Последнее направление имеет также самостоятельное значение и в иммунологии. Это обусловлено тем, что связывание антитела с клеточной мембраной, вследствие последующего взаимодействия комплекса антиген-антитело с комплементом, приводит к деградации мембраны. Данный процесс играет важную роль в утилизации чужеродных клеток.' Знание изученных в диссертации физико-химических свойств комплекса, образованного ионными каналами с антителами, позволяет приступить к исследованию биофизических аспектов данного явления и более эффективно воздействовать на утилизацию чужеродных клеток в организме.

Публикации. Результаты, вошедшие в диссертацию, опубликованы в 42 печатных работах (из них 12 в ведущих международных изданиях) , а также доложены на Всесоюзных конференциях по биофизике мембран в Паланге, 1973 и 1979 г.; VII Всесоюзной Нейрохимической конференции, Ростов-на-Дону, 1976 г. ; Всесоюзном симпозиуме "Нейромедиаторы в норме и патологии", Казань, 1979; Всесоюзном рабочем совещании по действию электромагнитных полей на простейшие биологические системы и их модели; Пущина, 1979; Ееесоюзных симпозиумах по закономерности биологического действия

неионизирующих электромагнитных излучений в Пущино в 1980, 1982 и 1987 гг.; I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1983; III Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран", Пущино, 1984; IV и V Всесоюзном рабочем совещании по биоэлектрохимии мембран в Риге в 1985 и в Ленинграде в 1986 г.; Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах", Пущино, 1985; 3-ем Всесоюзном рабочем совещании "Блокаторы ионных каналов", Пущино, 1987 г. ;

XIX Генеральной ассамблее международного союза радионаук (URSI), Хельсинки, Финляндия, 1978 г.; II Международной школе "Структура и функция биомембран", Варна, НРБ; III Советско-Швейцарском Симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция", Ташкент, 1983; 8-м Мезкдународном биофизическом конгрессе, Бристоль, Великобритания, 1984 г.; 16-ом симпозиуме Европейского биохимического общества (FEBS), Москва, 1984 г.; III Симпозиуме СССР-ФРГ "Возбудимые мембраны", Киев, 1987 г.; Международной симпози-умепо действию зарядов и полей в биосистемах, Ричмонд, США, 1989. Диссертация прошла апробацию на совместном заседании секций по биофизике мембран и физической среде Ученого Совета Института биофизики АН ССС£, а также на биофизическом семинаре Научно-технического объединения АН СССР.

Структура диссертации. Диссертация содержит введение, 10 глав, выводы и список литературы. Объем диссертации 363 страницы, в том числе 76 рисунков, 3 таблицы и 256 названий цитируемых литературных источников. Во введении и в главе 1 рассмотрено современное состояние исследуемой проблемы, формулируются актуальность, основная цель работы,- задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы. В главе 2 изло-иены основные используемые материалы и методы. В главе 3 описан созданный новый метод реконструкции мембранных белков в липидном бислое. В главах 4 и 5 изложены свойства рецептора ГАМК и протонной АТФазы, встроенных в БЖ В главе 6 изложены свойства липид-ного бислоя при протекании на нем фермент-субстратной реакции, показана необходимость правильного выбора параметров, характеризующих нативное состояние реконструированных ионотранспортных систем. В главах 7-9 описывается исследование молекулярного механизма взаимодействия антител с ионотранспортными системами, встроенными в липидный бислой. В главе 10 выяснен механизм воздействия УВЧ электромагнитного поля на рецептор ГАМК. В конце диссертации сформулированы основные результаты и выводы.

- 9 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для формирования бимолекулярных липидных мембран (БЛМ) использовались липиды, указанные ниже. Общие липиды, выделенные из мозга быка методом, описанным Нага, Radin (1978). Общие фосфолипиды из мозга быка, полученные удалением из общих липидов мозга холестерина и других нейтральных липидов методом Labarca et al. (1980). Азолектин, выделенный в ДВГУ из соевых бобов и любезно предоставленный Костецким. Отсутствие холестерина в общих фосфолипидах мозга быка и в азолектине проверялось при помощи тонкослойной хроматографии (Кейтс, 1975). Холестерин и лецитин производства фирмы "Fluka". фосфатидная кислота и фос-фатадилсерин - фирмы "Serva". Фосфатидилзтаноламин - фирмы "Sigma" (США). Эргостерин и 5«-андростан-Зр-он любезно предоставлены Де Гиром (Нидерланды).

Для модификации БЛМ использовались следующие вещэства. Полиеновые антибиотики: амфотерицин Б, нистатин и леворин производства Ленинградского института антибиотиков, рофламикоин, выделенный Schlegel и сотр. (ГДР).

Моноклональные антитела против амфотерицина Б были получены в диссертационной работе при помощи гибридомной техники (Eshbar, 1985). Фрагменты синаптических мембран, связывающие 3Н-ГАМК, выделялись из мозга крыс методом центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, изложенным в диссертации. Константа диссоциации препарата солюбилизированного рецептора с ^Н-ГАМК равнялась 250 нМ, на 1 мг белка приходилось 10 пмоль мест специфического связывания.

Протеолипосомы со встроенной Н+-АТФазой и фрагментом F , изготовлены Бабаковым и сотр. в ИБХ им. Шемякина АН СССР.

p-латротоксин и антитела к нему, полученные методом имму-носорбции, любезно предоставлены Касымовым и Салиховым из Института биоорганической химии АН УзССР.

Для измерения электрических характеристик ионотранспорт- • ных систем собирались плоские бислои на отверстии в лавсановой пленке или на кончике стеклянного микроэлектрода из протеоли-пидных слоев, сформированных на-границе раздела фаз воздух-вода. Поверхностное давление протеолипидных слоев на границе раздела фаз измерялось методом Вильгельми. Трансмембранный ток регистрировался в режиме фиксации потенциала.

Для воздействия УВЧ электромагнитного поля на модельную мембрану применялся конденсаторный облучатель, на пластины которого

подавали высокочастотную энергию от генераторов ГЗ-20 и ГЗ-21. Удельная мощность поглощения УВЧ поля оценивалась по скорости нагрева раствора в области отверстия в лавсановой перегородке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДА РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ИОННОГО ТРАНСПОРТА В ПЛОСКОМ ЛЖЩНОМ БИСЛОЕ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ

Исследование структуры плоских мембран, сформированных из липосом методом Шиндлера. В 1978 г. Шиндлер предложил собирать плоские мембраны со встроенными белками из двух протеолипидных, слоев, спонтанно образующихся на границе раздела фаз воздух-водная суспензия протеолипосом. Данный метод обладал рядом достоинств по сравнению с другими известными способами реконструкции (например, отсутствие контакта белков с органическими растворителями и детергентами). Поэтому его молено было рассматривать как наиболее перспективный. Однако физические процессы, в результате которых происходит формирование такой мембраны, оставались неизученными. Вследствие этого правомерность применения данного метода для реконструкции мембранных белков оставалась проблематичной.

Поэтому прежде всего в настоящей работе была поставлена задача исследовать указанные.процессы, а также выяснить какова структура мембраны Шиндлера. Для этой цели были использованы липосомы, в мембрану которых встроены ионные каналы из амфоте-рицина Б. Выбор данных каналов был обусловлен тем, что их свойства хорошо изучены (Ermishkin et al. , 1976; De Kruyff, Demel, 1974; Finkelstein, Hols, 1973; Borisova et al. , 1979).

На рис. 1 показаны возможные структуры липосом, частично и полностью слившихся с липидным монослоем и бислоем. Наличие таких структур можно ожидать при формировании мембраны методом Шиндлера.

Для того, чтобы оценить количество липосом, частично сливающихся с плоской ВЛМ (рис. 1,в), были использованы для формирования мембраны липосомы, внутри и снаружи которых присутствовал в одинаковой концентрации тетраэтиламмоний - блокатор амфотерициновых каналов. Вольт-амперная характеристика мембраны, приготовленной методом Шиндлера из такой эмульсии, представлена на рис.2 (график 1).

Из сравнения графиков 1 и 3 (рис. 2) четко видно, что при возрастании напряжения на мембране кривая 1 отклоняется

- и -

т

№

- __

— в—-в __

_

(V

- С

-

I

к.

Рис. 1. Структуры слившихся липосом.

(а). Гипотетическая структура липосомы, частично слившейся с монослоем. (б). Структура липосомы,частично слившейся с БЛМ. Мембрана сформирована методом Шиндлера из двух разных монослоев. В одном отсеке ячейки находились липосомы с амфотерицином Б, в другом -липосомы без амфотерицина Б. Показаны амфотерициновые каналы, состоящие из одной "полупоры" и собранные из двух "полупор". (в). Структура липосомы, частично слившейся с БЛМ. Мембрана сформирована методом Шиндлера из двух одинаковых монослоев. В обоих отсеках ячейки находились липосомы с амфотерицином Б. Показаны амфотерициновые каналы, собранные из двух "полупор", через которые течет ток. (г). Липосома, полностью имплантированная в БЛМ -заштрихованная часть мембраны.

от касательной, проведенной через начало координат, к оси абсцисс. Такое отклонение происходит вследствие блокирования тока тетраэтиламшнием. Затем эмульсии в обоих отсеках ячейки заменили на растворы, в которых отсутствовал тетраэтиламмоний. На графике 2 (рис.2) видно, что блокирование тока после удаления тетраэтиламмония уменьшилось, однако не исчезло совсем.

Предположение о том, что мембрана, изготовленная методом Шиндлера, является истинной ЕЛМ, не объясняет полученный результат. Действительно, если мембрана Шиндлера являлась бы БЛМ, не содержащей липосом, частично слившихся с ней, то тогда после удаления тетраэтиламмония из раствора блокирование тока наблюдаться не должно, поскольку этот блокатор хорошо отмывается от амфотерициновых каналов в БЛМ (Зильберштейн, персональное сообщение). Однако, в эксперименте был получен другой результат. Следовательно, мембрана, сформированная методом Шиндлера, имеет структуру, отличную от ЕЛМ.

II

Рис. 2< Интегральная вольт-амперная характеристика БЛМ, сформированной методом Шиндлера из липосом с амфотерицином Б:

(1) 2 мМ тетраэтиламмония присутствует внутри и снаружи липосом.

(2) После замены растворов в ячейке на растворы, не содержаще тетраэтиламмоний. (3) Для сравнения показана вольт-амперная характеристика мембраны, сформированной из липосом, внутри и.снаружи которых отсутствует тетраэтиламмоний (блокирования тока нет). Масштаб тока для графиков 1,2 показан на оси ординат справа, для графика 3 - слева. В обоих отсеках ячейки 0,25 М KCl.

I

/

Данные эксперимента молено объяснить, предположив, что мембрана Шиндлера представляет собой БЛМ, в которую встроено достаточно большое количество замкнутых липосом способом, показанным на рис. 1,в.

Предположим, что: (1) липосомы, частично слившиеся с БЛМ, представляют собой сферы, симметричные относительно плоскости мембраны; (2) поверхностная плотность амфотерициновых каналов (п) одинакова на всей поверхности частично слившихся липосом и в плоской БЖ Теоретический анализ экспериментальных кривых рис. 2, основанный на законах Киргхофа и Ома, а также на известных электрических свойствах амфотерициновых каналов в присутствии блокатора (Вопзоуа еЪ а1., 1979) показывает, что при допущенных предположениях доля площади мембраны, занятой частично слившимися липооомами, равна 0,5+0,2.

На рис. 3 показан результат другого проведенного в работе независимого эксперимента, подтверждающего наличие большого количества липосом, частично слившихся с мембраной, сформированной методом Шиндлера.

Рис. 3. Сравнение блокирования трансмембранного тока тетраэтилам-монием для мембран, сформированных методами Шиндлера и Монтала. (1) Вольт-амперная характеристика мембраны Шиндлера, сформированной из липосом с амфотерицином Б, в присутствии 10 мМ тетраэтил-аммония внутри и снаружи липосом. (2) Вольт-амперная характеристика БЛМ, собранной из двух фосфолипидных монослоев методом Монтала, в присутствии амфотерицина Б и 10 мМ тетраэтиламмония. Масштаб тока для графика 1 показан на оси ординат справа, для графика 2 - слева. В обоих случаях в ячейке находилось 0,15 М KCl.

4

-400

г

При сравнении вольт-амперных зависимостей мембран, изготовленных методами Шиндлера и Монтала (рис.3), видно, что кргЕые 1 и 2 отличаются друг от друга. Расстояние между положениями экстремумов представленных кривых 60±10 мВ является достоверной, хорошо воспроизводимой величиной.

В настоящей работе разработана математическая модель блокирования те.траэтиламмонием трансмембранного тока через БЛМ со встроенными замкнутыми липосомами в присутствии амфотерицина Б. Основой теории явилась модель мембраны, показанная на рис. 1,в. Из анализа модели следует, что трансмембранный ток равен:

1

I ^ гпЗ -:- + ---

где К - доля площади мембраны, занятой частично слившимися липосомами; V - напряжение на мембране; ({, р, у - параметры, зависящие от свойств амфотерициноЕого канала и концентрации блокатора.

Из сравнения полученных выражений для тока с экспериментальной кривой 1 (рис.3), получается, что при сделанных выше предположениях доля площади мембраны, занятой частично слившимися липосомами, равна 0,45 ±0,15.

Таким образом, численные оценки, сделанные на основе двух независимых экспериментов, дали одинаковый результат. Примерно 50% плошади мембраны Шиндлера занято частично слившимися липосомами.' Следовательно, можно предположить, что в мембране, сформированной из протеолипосом подобным методом, содержится большое количество частично слившихся с плоской БЛМ протеолипосом. Поэтому некоторые мембранные белки могут переходить в БЛМ из таких протеолипосом.

Анализ результатов дополнительных экспериментов с липосомами, содержащими амфотерициноЕые каналы, приводит к следующим заключениям:

1). Встраивание большого количества замкнутых липосом в мембрану Шиндлера происходит, по всей вероятности, в следующей последовательности. Липосомы сначала частично сливаются с монослоем фосфолипидов на границе раздела фаз вода-воздух (рис. 1,а) (либо взаимодействуют с монослоем фосфолипидов каким-либо другим способом), а затем после формирования мембраны эти замкнутые липосомы оказываются встроенными в БЛМ (рис.1,б,в).

- 15 -

2). Во время формирования мембраны из липосом методом Шиндлера не происходит разворачивания регистрируемого количества липосом так, чтобы их мембрана полностью слилась с плоским бислоем, как показано на рис.1,г. Поэтому можно предположить, что аналогичная имплантация протеолипосом в БЛМ - также маловероятное событие.

Сложная структура модельной мембраны, изготовленной методом Шиндлера, затрудняет интерпретацию результатов при встраивании в нее природных мембранных белков. Поэтому возникла необходимость разработать такой способ формирования мембран из протеолипосом, который позволит собирать плоский бислой без встроенных в него заь^кнутых везикул.

Разработка способа формирования плоского бислоя из протеолипосом. Развитые в настоящей работе теоретические представления о процессах, происходящих при формировании плоских мембран из липосом, позволили разработать адекватный способ формирования плоской бимолекулярной мембраны из липосом (Kolomytkin, 1987). Для формирования мембран была применена ячейка специально разработанной конструкции (рис.4). В отличие от метода, предложенного Шиндлером, даннаялчейка имела четыре, а не два отсека.

Плоская мембрана формировалась следующим образом. Отсеки 2 и 3 в ячейке заполняли раствором электролита, не содержащим липо-сомы, оставляя отверстие в лавсановой пленке в воздухе. Затем отсеки 1 и 4 заполняли водной эмульсией липосом (или протеолипосом!

В отсеках 1 и 4 на границе раздела фаз воздух-вода спонтанно образовывались слои фосфолтаидов. Эти слои самопроизвольно распространялись по границе воздух-вода в отсеки 2 и 3. Формирование слоев фосфолипидов на границе раздела фаз воздух-вода в отсеках 2 и 3 контролировали, измеряя поверхностное давление.

Через 30 минут после того как поверхностное давление достигало равновесного значения 43±2 мН/м, формировали мембрану на отверстии в лавсановой пленке, путем поднятия уровней растворов в отсеках 2 и 3.

Применение липосом со встроенными амфотерициновыми каналами позволило показать, что плоская мембрана, сформированная предложенным способом, является истинным бислоем и не содержит встро-знных в нее замкнутых везикул. Липидные слои на границе воздух-вода в отсеках 2 и 3 через »30 минут после введения липосом в этсеки 1 и 4 являются, по всей вероятности, истинными монослоями.

Эти монослои использовались также для формирования бислоя на кончике микроэлектрода при регистрации одиночных ионных кана-

ЛОБ.

.„ЦСЯМ>В

у///////////?///////,

Рис.4. Схема измерительной ячейки: 1,4 - Еодная эмульсия липосом; 2,3 - электролит; 5 - согнутая пластинка из матового стекла, смоченная электролитом; 6 - лавсановая пленка с отверстием, на котором формируют БЛМ; 7 - тефлон; 3 - подвижные барьеры вставляются в ячейку и служат для изменения поверхностного давления в отсеках 2 и 3; 9 - стеклянные пластины для измерения поверхностного давления в отсеках 2 и 3 подвешены к механотронам и погружены в раствор; 10 - механотрон; хюр-серебрянные электроды, контактирующие с растворами в отсеках 2 и 3, и каналы в ячейке для введения растворов в отсеки 2 и 3 для наглядности на данном рисунке не показаны.

ГЛАВА 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СВОЯСТЕА МОДЕЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ СО ВСТРОЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЯ КИСЛОТЫ ИЗ МОЗГА КРЫСЫ

Синапсы ГАМКергической природы играют важную роль в передаче и обработке информации в мозге. Поэтому синаптические рецепторы ГАМК были выбраны в качестве объекта исследования.

Полученное большое количество экспериментальных данных в диссертационной работе показало, что известные до сих пор способы оказались непригодными для реконструкции рецептора ГАМК в плоском бислое. Адекватным методом реконструкции рецептора в плоском бислое является разработанный нами'способ (рис. 4). Для

этого использовали протеолипосомы со встроенным рецептором ГАМК, полученные методом "дезоксихолатного диализа" (Ко1отуи<1п, Киг-пеЬэоу, 1986).

Модельную мембрану с большим количеством встроенных в нее рецепторов ГАМК конструировали следующим способом. Отсек 1 измерительной ячейки (рис.4) заполняли эмульсией протеолипосом, у которых соотношение белок: липид было равным 1:10 (по весу). При этом на поверхности раствора в отсеке 2 со временем формировался протеолипидный монослой. На поверхности водного раствора в отсеке 3 формировали липидный монослой, путем наноса на поверхность небольшого количества раствора липидов в гексане. Мембрану собирали поднятием уровней растворов в отсеках 2 и 3 выше отверстия. Согласно контрольным экспериментам при таком способе формирования мембраны все рецепторы ГАМК были ориентированы в бислое одинаково.

Хемочувствительность плоской модельной мембраны со встроенным рецептором ГАМК из синапсов мозЕа. Интегральная электропроводность. Эксперименты показали, что модельная мембрана обладала высокоспецифичной хемочувствительностью к ГАМК (рис. 5). Добавление ацетилхолина и глутамата в раствор, омывающий мембрану,

Рис. 5. Влияние ацетилхолина, ГАМК и•пикротоксина на электропроводность модельной мембраны. В ячейке находилось 0,1 М KCl. Стрелками показаны моменты добавления указанных веществ с одной стороны мембраны в отсек 2. Во время добавления пикротоксина самописец был отключен от измерительной системы.

в концентрациях до 10 мкМ не приводило к изменению электропроводности мембраны. Добавление ГАМК в отсек 3 электропроводность мембраны также не изменяло. В то же время, если 1 мкМ ГАМК добавляли в отсек 2, то электропроводность мембраны увеличивалась в 8-15 раз по отношению к исходному уровню до добавления ГАМК. Последующее добавление пикротоксина (специфического блокатора хлорного канала природного рецептора ГАМК) вызывало уменьшение трансмембранного тока на 30-60%.

Согласно классическим представлениям рецептор ГАМК открывает в мембране хлорные каналы. Однако, селективность модельной мембраны для одновалентных анионов и катионов была малой. Поэтому было выдвинуто предположение, что наш препарат представлял собой смесь рецепторов ГАМК разных типов. Одни рецепторы при взаимодействии с ГАМК открывали в мембране хлорные каналы, другие рецепторы - катионные каналы. Это предположение было подтверждено в экспериментах с одиночными каналами.

Одиночные ионные каналы рецепторов ГАМК. На рис. 6, а,б представлены записи одиночных ГАМК-чувствительных ионных каналов для двух разных мембран. В первую мембрану был встроен рецептор с хлорным каналом, во вторую - с катионным каналом (Na+,K+). Селективность каналов определялась по направлению тока короткого замыкания при различных концентрациях KCl с разных сторон мембраны.

В последнее время появились публикации, указывающие на то, что ГАМК может вызывать не только гиперполяризацию, но также и деполяризацию нейронов, по всей вероятности за счет увеличения проводимости для Na+ (Anderson et al. , 1980). Однако, зарегистрировать одиночный катионный канал рецептора ГАМК никому ранее не удавалось. Впервые это удалось сделать в данной работе, используя модельную систему (рис. 6,б,в).

Было проведено всестороннее исследование свойств и параметров ионных каналов рецептора. В том числе были изучены свойства данных каналов, исследовать которые с помощью электрофизиологических методов невозможно. Например, было показано, что для работы рецептора необходимо наличие в мембране холестерина. Введение в мембрану растворителей типа декана приводило к утрате функциональных свойств рецептора. Работа рецептора зависела от физического состояния липидной фазы мембраны. Для нормальной работы рецептора бислой надо бйло собирать из монослоев, поверхностное давление которых находилось в достаточно узком интервале 37-42 мН/м. Проведено всестороннее сравнение свойств модельной мембраны с известными свойствами природной постсинаптической.

мембраны. Обнаружилось их хорошее совпадение. Это указывает на то, что в процессе проведения экспериментов удалось встроить в БЛМ нативный рецептор ГАМК.

(а)

(С)

I >пА 10

о П-^т?,

ATl

>

время 50 MC

-10

0,3 P,l/TlA

1

.1 О

(В)

Рис. 6. Скачкообразные изменения трансмембранного тока при фиксированном напряжении на модельной мембране. В ячейке находилось 1 мкМ ГАМК; с одной стороны мембраны-2 М KCl, с другой-0,2 М KCl., '(а,б) - трансмембранный ток короткого замыкания через две разные мембраны. Трансмембранный ток, текущий из отсека с 0,2 М в отсек с 2 II KCl, считается положительным, (в) - скачкообразные изменения тока вызваны открыванием и закрыванием катионоселективного канала, показанного на записи (б), к мембране приложено электрическое напряжение 100 мВ от внешнего источника, положительный знак в отсеке с 2 М KCl. Справа показаны плотности вероятностей распределения соответствующих трансмембранных токов.

ГЛАВА 5. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕОИСТВА МОДЕЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ СО ВСТРОЕННОЙ ПРОТОННОЙ АТФазой

Успешное встраивание в липидный бислой рецептора ГАМК при

помощи разработанного в данной работе метода и исследование его свойств позволило поставить задачу о реконструкции в липидном бислое другой важнейшей транспортной системы - протонной АТФазы.

Ранее Рекер, Кагава и др. изучали качественно свойства Н+-АТФазы, встроенной в протеолипосомы. Однако, проводить количественные исследования, необходимые для выяснения механизма работы АТФазы, в такой системе практически невозможно. Эти исследования чрезвычайно удобно'производить на плоской реконструированной мембране. Драчеву и др. в 1974 г. удаЗюсь адсорбировать протеолипосомы со встроенной Н+-АТФазой на плоскую липидную мембрану. При добавлении АТФ на мембране возникало ЭДС «20 мВ. Низкое значение данной величины по сравнению с ЭДС нативных АТФаз, по-Еидимому , являлось следствием сложной структуры использованной

(а)

(в)

б о

а.

£

8 0,0

1 НМ АТФ

,10 »"„ ■ (б)

-300

о.о хоо гоо НАПРЯЖЕНИЕ. НВ

Рис. 7. Действие АТФ на вольт-амперную характеристику мембраны, модифицированной протонной АТ Фазой. (а) - Изменение напряжения на мембране во времени. Напряжение задается внешним источником ЭДС. (б) - Изменение во времени тока через мембрану, модифицированную протонной АТФазой, при добавлении 1 мМ АТФ с цис-стороны мембраны и компенсация генерируемого тока внешним напряжением, приложенным к мембране. (в) - Еольт-амперные. характеристики мембраны, модифицированной протонной АТФазой, в отсутствии (1) и в присутствии (2) 1 мМ АТФ с одной стороны мембраны. Потенциал раствора с транс-стороны мембраны, где АТФ отсутствовал, принимали равным нулю.

авторами плоской мембраны, а также наличия в БЛМ органического растворителя.

В настоящей работе впервые удалось сформировать плоский липидный бислой со встроенной АТФазой и получить активный протонный транспорт через такую мембрану. На рис.7 показано, что при добавлении АТФ с одной стороны мембраны наблюдалась генерация трансмембранного тока. Этот ток можно было скомпенсировать до нуля, прикладывая к мембране напряжение от внешнего источника, величина которого находилась в интервале от 0,24 ±0,05 до 0,3 ±0,05 В для различных мембран.

Генерация тока блокировалась при добавлении в ячейку карбо-диимида - блокатора протонного канала АТФазы.

Преимущество метода реконструкции в плоском бислое состоит е том, что он позволяет производить количественные измерения параметров АТФазы, которые было невозможно определить другими известными способами. Например, уже первая удачная реконструкция позволила нам впервые измерить вольт-амперную характеристику мембраны. Она оказалась близкой к линейной в -исследованном интервале напряжений. Добавление АТФ приводило к сдвигу вольт-амперной характеристики без изменения ее наклона.

Реконструкция позволяет фактически прямым способом измерить количество протонов, переносимых АТФазой при расщеплении одной молекулы АТФ, (р). Величина р определялась подставлением экспериментально измеренных величин в формулу:

-Р0+ ет- Ьп( С АТФ] /(С АДФ] • [ФШ Р + 1)

где Р0 - стандартная свободная энергия, г - число Фарадея, V - напряжение, прикладываемое к мембране от внешнего источника и компенсирующее ток до нуля, И и Я - внутреннее сопротивление АТФаз и сопротивление липидного бислоя (К1<<Кт)- Из проведенных экспериментов получено р = 2.

Для того, чтобы получить дополнительный довод о нативности АТФазы, было произведено удаление каталитических фрагментов от АТФаз, в протеолипосомах. Затем из полученных протеолипосом была сформирована плоская мембрана. Такая мембрана не обладала способностью к активному транспорту протонов при добавлении АТФ. Было показано, что мембрана обладает высокоселективной проводимостью для протонов, которая блокируется карбодиимидом - блокатором

протонного канала АТФазы. Последний эксперимент указывает на то, что в БЛМ были встроены протонные каналы АТФаз. Следовательно., АТШазы содержали протонные каналы в нативном состоянии.

ГЛАВА 6. ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЛШВДНЫХ МЕМБРАН В ПРИСУТСТВИИ «-ХИШТРШ1СИНА И ЕГО СУБСТРАТОВ

При анализе экспериментов по реконструкции следует поставить вопрос, действительно ли в модельных мембранах находятся ионотранспортные системы в нативном состоянии. Не являются ли полученные нами эффекты результатом каких-либо посторонних реакций? Действительно, проведенными экспериментами было доказано, что при протекании на БЛМ фермент (химотрипсин) - субстратной (денатурированный овальбумин) реакции в ней образуются ионные каналы. Причем для появления каналов достаточно образования фермент-субстратного комплекса. Следовательно, фермент-субстратная реакция может моделировать работу рецептора. Из вышеупомянутого эксперимента вытекает важность правильного выбора параметров, по которым производится сравнение реконструированных и нативных систем. В случае рецептора ГАМК и протонной АТФазы нами было произведено исчерпывающее сравнение высокоспецифичных свойств модельных и природных мембран. Сделанное сравнение с высокой степенью достоверности показывает, что в проведенных экспериментах рецептор ГАМК и протонная АТФаза находились в модельной мембране в нативном состоянии.

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

йот- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С ИОННЫМ КАНАЛОМ, СФОРМИРОВАННЫМ АМФОГЕРИЦИНОМ Б И ХОЛЕСТЕРИНОМ В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ

Успешная реконструкция ионотранспортных систем в липидном бислое позволила поставить задачу разработки новых эффективных методов их исследования. Уникальным инструментом для изучения таких систем представляются моно- и поликлональные антитела. Однако, заметный прогресс в этом направлении у других исследователей отсутствует. Неизвестны даже молекулярные механизмы, по которым происходит взаимодействие антител с иоными каналами. Поэтому, прежде чем применять антитела для исследования сложных ионотранспортных систем, мы предприняли исследование молекулярных механизмов взаимодействия антител с относительно простыми ион-

ными каналами, строение и (звойетва которых хорошо изучены. Для указанной цели были выбраны амфотерициновый и р-латротоксиноЕЫй каналы. При решении этой задачи нами был проделан большой объем экспериментальной работы, разработаны математические модели, произведено сравнение теоретических выводов с данными экспериментов, в результате которых был расшифрован молекулярный механизм взаимодействия антител с амфотерициновым и латротокси-новым каналами. Приведем только несколько основных результатов и выводов, полученных в представляемой работе.

Согласно современным представлениям существуют два типа ионных каналов, образованных амфотерицином.^ Первый вид каналов образуется при добавлении антибиотика с "одной (цис) стороны мембраны. Данный канал является полупорой, которая может на короткие времена пронизывать БЛМ насквозь, осуществляя в это время транспорт ионов. Второй тип каналов образован двумя состыкованными полупорами. Такие каналы практически все время находятся в открытом состоянии. (Ermishkin et al., 1976; De Kruyff, Demel, 1974; Finkelstein, Hols, 1973; Брутян, 1982).

Нами впервые были получены моноклональные антитела к амфо-терицину Б (Kolomytkin et al. , 1989). Разработанный в диссертационной работе метод иммуноанализа, основанный на измерении электропроводности мембраны, показал, что полученные антитела относятся к классу IgM.

Данные антитела не оказывали влияния на проводящие свойства ионного канала, образованного двумя состыкованными полупорами. Антитела не оказывали так же действия на свойства канала-полупоры при их добавлении с цис-стороны мембраны. Однако, при добавлении антител с транс-стороны мембраны они оказывали сильное и еы-сокоспецифичное действие на свойства канала-полупоры. Ожидалось, что, если действие антител на канал и будет, то оно будет тривиальным - блокирование. Однако, действие антител оказалось прямо противоположным - проводимость каналов активировалась. Из экспериментальных зависимостей, показанных на рис. 8, следует, что при образовании комплекса амфотерицинового канала с антителами сильно увеличивается время жизни канала в открытом состоянии практически без изменения амплитуды его проводимости.

В диссертации разработана теория взаимодействия антител с ионными каналами. Было использовано следующее предположение: интегральная электропроводность мембраны определяется комплексом, состоящим из М амфотерициновых каналов-полупор и N молекул антител. Согласно предложеной теории образование комплексов, состоя-

Р(1/П А) 0,5

ЗПА

(__JlfUL

ЛЖ

U,

(а)

Р(1/П А)

о,г5

о б

ЛпА)

ЗПА1

5с

(О)

О 6

ЛпА)

Рис. 8. Действие специфических моноклональных антител на одиночный амфотерициновый канал в симметричной мембране, в обоих монослоях которой находился холестерин, (а) - Запись скачков трансмембранного тока б присутствии 10 нМ амфотерицина Б в цис-отсеке и при отсутствии антител в ячейке, (б) - Запись скачков трансмембранного тока через 30 минут после добавления моноклональных антител (1 мг/л) в транс-отсек. СпраЕа показаны функции распределения тока через канал. Напряжение на мембране 0,325 В, плюс в цис-отсеке. Концентрация электролита в ячейке-2 М KCl.

Рис.9. Схематичное изображение амфотерицинового канала и трех молекул антител, связанных с ним. Слева, для наглядности, показаны только две молекулы антитела, связанные с каналом.

- 25 - .

щих из М антигенов и N моноклональных антител, происходит путем протекания цепочек реакций. Причем в начальный период времени после добавления антител каждая реакция имеет следующий вид:

(С^) + (С^) (С1+кАз+1)

где индексы - натуральные числа или ноль,

(СГА^) - комплекс, состоящий из 1 каналов и j моноклональных

антител, - константа скорости прямой реакции.

При решении дифференциальных уравнений, описывающих такие реакции, и применил метода математической индукции, получается, что в начальный период времени после добавления антител с транс-сгороны мембраны интегральная электропроводность мембраны должна увеличиваться следующим образом:

а-сс^.сд]".^-1 ,

где [С] и [А] - концентрации амфотерициновых полупор в мембране и антител в растворе, t - время.

Исходя из данных экспериментов, электропроводность пропорциональна концентрации [С] и возрастает как степенная функция третьего порядка при увеличении [А] и Сравнивая этот результат с полученной формулой, а также, исходя из молекулярных моделей амфотерицинового канала и молекулы антитела (рис.9), можно сделать вывод, что молекулярный механизм взаимодействия антител с полупорой заключается в следующем. Три молекулы антител связываются с полупорой на транс-стороне мембраны, удерживая канал все время в открытом состоянии (рис.9). Таким образом, впервые расшифрован молекулярный механизм взаимодействия антител с ионным каналом, надежно подтвержденный экспериментами и их сопоставлением с теорией (Ка1о!т^к1п et а1. 1989).

Действие моноклональных антител на амфотерициновые каналы, как показало экспериментальное исследование, зависит от распределения холестерина в бислое. В случае, когда холестерин присутствовал только в одном цис-монослое и практически отсутствовал в транс-монослое мембраны, антитела уменьшали (а не увеличивали) интегральную ионную проводимость мембраны.

Рассмотренная в диссертации математическая модель реакций, которые могут приводить к такому блокированию проводимости, приводит к выводу об экспоненциальном спаде тока во времени после добавления антител, что соответствует данным эксперимента.

- 26 -

Контрольные эксперименты с использованием неспецифических иммуноглобулинов, а так же аналогов амфотерицина Б и холестерина показали высокую специфичность действия полученных нами монокло-нальных антител на амфотеришновый канал. Было показано, что в формирование антигенных детерминант вовлечены группы, расположенные на транс-концах молекул как амфотерицина Б, так и холестерина.

ГЛАВА 8. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОГО СТРОЕНИЯ ИОННОГО КАНАЛА, ОБРАЗОВАННОГО р-ЛАТРОТОКСИНОМ В ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ, ПРИ ПОМОЩИ АНТИТЕЛ

Важнейшие ионотранспортные системы имеют белковую природу. Однако, исследованный амфотерицин Б является полиеновым антибиотиком, а не белком. Поэтому в настоящей работе было рассмотрено взаимодействие антител с достаточно хорошо изученным каналом пептидной природы, образованным в БЛМ /3-латротоксином при добавлении последнего с одной (цис) стороны мембраны.

Применение антител позволило показать важную особенность структуры данного канала. При использованном липидном составе мембраны вольт-амперная характеристика канала была линейной. Из этого казалось бы следует предположение о том, что структура канала симметрична относительно плоскости мембраны. Применение антител позволило строго доказать, что структура канала асимметрична относительно плоскости мембраны. На канале с цис-стороны отсутствовали антигенные детерминанты, связываясь с которыми антитела изменяли электрические свойства мембраны. В то же время на канале с транс-стороны такие детерминанты присутствовали. Связывание с ними антител приводило при отрицательных напряжениях на мембране к переходам каналов в закрытое состояние (Ко1оту1кт еЬ а1. , 1988).

Важно отметить, что при исследовании действия антител на ионный канал, образованный р-латротоксином, была обнаружена точно такая же асимметрия действия, как и в случае канала, образованного полиеновым антибиотиком амфотерицином Б. Антитела к амфотерицину Б изменяли проводимость полупоры, образованной антибиотиком, необратимо связываясь с каналом на транс-стороне мембраны. В то же время данные антитела не влияли на электропроводность канала при добавлении их с цис-стороны мембраны.

Обобщая экспериментальные данные, можно выскззать предположение о том, что обнаруженная асимметрия действия имеет место для антител ко многим веществам, встраивающимся в липидный бислой.

ГЛАВА 9. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОГО СТРОЕНИЯ СИНАПТИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА ГАМК, РЕКОНСТРУИРОВАННОГО В ЛИПИДНОМ ВИСЛОЕ, ПРИ ПОМОЩИ АНТИТЕЛ

Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия антител с простыми хорошо изученными каналами позволила нам применить антитела для исследования рецептора ГАМК. Были получены поликло-нальные антитела к рецептору ГАМК. Оказалось, что полученные антитела не оказывали действия на константы связывания ГАМК с рецептором. В то же время добавление антител к модельной мембране со встроенным рецептором с той стороны мембраны, с которой расположены места связывания медиатора, приводило к блокированию интегрального трансмембранного тока.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что антитела не взаимодействуют с местом связывания ГАМК. Антитела взаимодействуют непосредственно с каналом рецептора блокируя его проводимость. Поскольку масса молекулы антитела (150 ООО кД) велика и сравнима с массой рецептора, то место связывания ГАМК и еход в ионный канал находятся на рецепторе на достаточно удаленном друг от друга расстоянии.

ГЛАВА 10. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЛН УЛЬТРАВЫСОКОЧАСТОТНОГО ДИАПАЗОНА НА МОДЕЛЬ ПОСТСИНАПТИЧЕСКОЯ МЕМБРАНЫ ГАМК-ЕРГИЧЕСКОГО СИНАПСА

В качестве практического приложения проведенной работы исследовалось воздействие электромагнитных волн УВЧ диапазона на рецептор ГАМК. В связи с тем, что УВЧ поле распределяется в ячейке с модельной мембраной крайне неоднородно и происходит концентрация поля в отверстии для формировании мембраны, был разработан оригинальный метод, позволяющий оценивать поле непосредственно в области мембраны. Сравнение эффектов УВЧ поля и температурных зависимостей проводимости рецептора ГАМК показало,• что такое воздействие электромагнитного поля на мембрану определяется главным образом локальным разогревом липидной мембраны и раствора вблизи неё, происходящего вследствие концентрации поля в данной локальной области. Эти эффекты не зависели от низкочастотной модуляции поля.

Полученный результат не является тривиальным потому, что в настоящее время имеются данные о возможности нетеплового механизма действия слабых УВЧ и СВЧ электромагнитных полей на рецеп-

- 28 -

тор ГАМК iri vivo (Kolomytkin, Kuznetsov, Akoev, 1989). Данные результаты указывают на то, что действие поля на рецептор in vivo может быть опосредовано через другие Солее чувствительные к полю системы организма. Выяснение природы этих бесспорно важных и интересных систем является задачей будущих исследований.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОЗДАЛИ ФУНДАМЕНТ НОВОГО НАПРАВЛЕНИЯ, ОСНОВАННОГО НА РЕКОНСТРУКЦИИ И ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННОМ ПРИМЕНЕНИИ АНТИТЕЛ, В ИССЛЕДОВАНИИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ФИЗИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ИОННОГО ТРАНСПОРТА, ИГРАЮЩИХ ВАЖНУЮ РОЛЬ В ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗМА.

2. РАЗРАБОТАН ЭФФЕКТИВНЫЙ И УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ИОННОГО ТРАНСПОРТА В ПЛОСКОМ ЛИПИДНОМ БИСЛОЕ,

Основу метода составляют четыре стадии: 1) встраивание системы ионного транспорта в липосомы, 2) формирование протео-липидного слоя на границе раздела фаз воздух - водная суспензия протеолипосом, 3) перемещение полученного слоя в отсек, в котором отсутствуют протеолипосомы; в данном отсеке на границе раздела фаз Еоздух - вода со Бременем («20 минут) формируется протеолипидный монослой, 4) сборка плоской мембраны из полученных монослоев. Эффективность и универсальность предложенного способа были продемонстрированы на примере встраивания в лнпидный бислой таких разных транспортных мембранных систем как рецептор гамма-аминомасляной кислоты из синапсов мозга крысы-и протонная АТФаза. Следовательно, впервые показана принципиально новая возможность выделения рецептора ГАМК из синапсов мозга крысы, а также протонной АТФазы, их последующего встраивания в плоскую БЛМ и изучения ионотранспортных свойств.

3. НА ОСНОВЕ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ФОРМИРОВАНИЯ МЕМБРАН ИЗ ПРОТЕОЛИПОСОМ ВПЕРВЫЕ ПОЛУЧЕНА МОДЕЛЬНАЯ МЕМБРАНА СО ВСТРОЕННЫМ ФУНКЦИОНИРУЮЩИМ РЕЦЕПТОРОМ ГАМК И ОПРЕДЕЛЕНЫ ОСНОВНЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ. ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ СЛЕДУЕТ, ЧТО МОЗГ СОДЕРЖИТ' РЕЦЕПТОРЫ ГАМ£, ИМЕЮЩИЕ РАЗНЫЕ ТИПЫ ИОННЫХ КАНАЛОВ. ОДНИ ЕРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ГАМК ОТКРЫВАЮТ В МЕМБРАНЕ ХЛОРНЫЕ КАНАЛЫ,

ДРУГИЕ - КАТИОННЫЕ (Ма+, К+) КАНАЛЫ.

Выделены из мозга крысы и измерены константы диссоциации очищенных рецепторов с гамма-аминомасляной кислотой. Впервые определено количество состояний, проводимость, вольт-амперные характеристики, ионная селективность и временные параметры каналов данных рецепторов. Сопоставление свойств реконструированных и нативных рецепторов показало, что хлорные каналы принадлежат гиперполяризу-ющим рецепторам ГАМК мозга, катионные каналы - деполяризующим рецепторам ГАМК мозга.

4. ВПЕРВЫЕ ПОКАЗАНО, ЧТО й-ХИМОТРИПСИН В ПРИСУТСТВИИ СУБСТРАТОВ" ИЛИ КОНКУРЕНТНЫХ ИНГИБИТОРОВ ОБРАЗУЕТ ОДИНОЧНЫЕ ИОННЫЕ КАНАЛЫ В ЛИПИДНОМ ВИСЛОЕ, ПРИЧЕМ ДЛЯ ПОЯВЛЕНИИ ИОННЫХ КАНАЛОВ ДОСТАТОЧНО ОБРАЗОВАНИЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА.

Следовательно, работу природных рецепторов можно смоделировать фермент-субстратной реакцией, протекающей на липидном бислое.

5. НА ОСНОВЕ РАЗРАБОТАННОГО МЕТОДА ФОРМИРОВАНИЯ МЕМБРАН ВПЕРВЫЕ ПРОИЗВЕДЕНО ВСТРАИВАНИЕ ПРОТОННОЙ АТФазы В ПЛОСКУЮ БИМОЛЕКУЛЯРНУЮ ЛШВДНУЮ МЕМБРАНУ, ЧТО ПОЗВОЛИЛО В ПРЯМОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ КОЛИЧЕСТВЕННО ОПРЕДЕЛИТЬ ОСНОВНЫЕ^ ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АТФазы В БЛМ И ПОКАЗАТЬ, ЧТо' ПРИ РАСЩЕПЛЕНИИ АТФазой ОДНОЙ МОЛЕКУЛЫ АТФ СОЗДАЕТСЯ ЭДС 240-300 мВ, ПРИВОДЯЩАЯ К ПЕРЕНОСУ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ ДВУХ ПРОТОНОВ.

Показано, что Еольт-амперная характеристика АТЗазы в отсутствии АТФ близка к линейной в исследованном интервале напряжения. Добавление АТФ приводит к сдвигу вольт-амперной характеристики, практически без изменения её наклона. Следовательно, в первом приближении АТФазу можно смоделировать эквивалентной схемой из последовательно соединенных источника ЭДС и сопротивления.

Показано, что фрагмент Р0 бактериальной Н+-АТФазы, остающийся в мембране после отщепления от АТФазы каталитического фрагмента Р^, формирует протоноселективную проводимость плоского липидного бислоя, которая не чувствительна к АТФ и блокируется дициклогексйлкарбодшмидом.

е. ВПЕРВЫЕ РАСШИФРОВАН МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ С ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ И УСТАНОВЛЕНО ПРОСТРАНСТВЕННОЕ СТРОЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ КАНАЛ-АНТ ИТ ЕЛА.

1). Впервые получены поли- и моноклональные антитела, изменяющие свойства ионного канала, образованного полиеновым антибиотиком амфотерицином Б в мембране при его добавлении с одной стороны мембраны.

Показано, что именно три молекулы моноклональных антител, связываясь с каналом на другой стороне мембраны, увеличивают время жизни канала в открытом состоянии, практически не изменяя его проводящие свойства в этом состоянии.

2).Применение антител позволило доказать, что ионный канал, образованный ^-латротоксином, в липидной мембране является асимметричной структурой, связываясь с которой антитела вызывают зависящее от мембранного потенциала блокирование трансмембранного тока.

3). Использование атител позволило установить взаимную прост-ранственую локализацию ионного канала и места связывания ГАМК на исследуемом рецепторе. Оказалось, что канал и место связывания ГАМК расположены на достаточно удаленном друг от друга расстоянии.

7. ПОКАЗАНО, ЧТО СВОЙСТВА МОДЕЛЬНОЙ МЕМБРАНЫ СО ВСТРОЕННЫМИ СИНАПГИЧЕСКИМИ РЕЦЕПТОРАМИ ГАМК ИЗМЕНЯЮТСЯ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА НЕЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЛН УВЧ ДИАПАЗОНА. УСТАНОВЛЕНО, . ЧТО ВОЗДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ВОЛН ДАННОГО ДИАПАЗОНА НА МЕМБРАНУ ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ ГЛАВНЫМ ОБРАЗОМ ЛОКАЛЬНЫМ РАЗОГРЕВОМ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ И РАСТВОРА ВБЛИЗИ НЕЕ, ПРОИСХОДЯЩЕГО ВСЛЕДСТВИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛЯ в" ОБЛАСТИ МЕМБРАНЫ. Модуляция электромагнитных волн существенно не влияет на обнаруженный эффект. В то же время облучение целого животного УВЧ электромагнитными волнами приводит к изменению связывающих свойств рецепторов ГАМК в синапсах мозга, которые следует объяснять не только локальным разогревом, поскольку появляется зависимость эффекта от низкочастотной модуляции электромагнитных волн. Впервые обнаруженное явление указывает на существование в организме биофизических систем, высокочувствительных к УВЧ электромагнитным волнам и опосредующих действие электромагнитного поля на синаптические рецепторы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коломыткин О. В., Емельянов В. Б., Печатников В. А. Измерение светорассеяния лецитиновых оболочек под действием многовалентных катионов. -В кн.: Биофизика живой клетки. Пупщно, 1972, с. 22-26.

2. Коломыткин О. В., Ненашев В. А. Движение холестерина в БЛМ. -В кн.: Биофизика мембран. Каунас, 1973, с. 328-332.

3. Коломыткин О. а , Ермишкин JL К Электропроводность липидных мембран в присутствии протеолитических ферментов и их суб/ стратов. -Биофизика, 1976, т. XXI, N6, с. 1008-1012.

4. Коломыткин О. В., Кузнецов В. И. Исследование частично очищенного рецептора глутамата из гиппокампа крыс на искусственных фосфолипидных мембранах. -Е кн.: VII Нейрохимическая конференция. Л. , АН СССР, 1976, с. 46-47.

5. Коломыткин О. В. , Кузнецов В. К , Ермишкин Л. Е Выделение частично очищенного рецептора глутамата и его изучение на БЛМ. -В кн.: Биофизика сложных систем и радиационных нарушений. М.: "Наука, 1977, с. 29-33.

6. Коломыткин О. В; , Кузнецов В. И., Акоев И. Г. Действие высокочастотного электромагнитного поля на ионные каналы в БЛМ, образованные фрагментами синаптических мембран, связывающими глутамат. -В кн.: Межсистемные взаимодействия при радиационном поражении. Пущино, 1978, с. 116-123.

7. Коломыткин' О. В. , Кузнецов Е И. Выделение и очистка фрагментов мембран, связывающих^ глутамат, из синаптосом гиппокампа крыс. 15 с. Деп. ВИНИТИ 1979, N 1959-79.

8. Коломыткин О. В. , Ермишкин Л. Е , Кузнецов В. И. Исследование свойств липидных мембран в присутствии фрагментов синаптических мембран, связывающих глутамат. 25 с. Деп. ВИНИТИ 1979, N 1672-79.

9. Коломыткин О. В. , Кузнецов В. И. , Ермишкин Л. Н. , Акоев И. Г. Реконструкция рецептора глутамата на БЛМ. -В кн.: Нейро-медиаторы в норме и патологии. Казань, 1979, с. 185-186.

10. Коломыткин О. В., Григорьев П. А., Акоев И. Г., Шишлов Ю. В. К исследованию механизма действия микроволн на биологические и искусственные мембранные системы. 14 с. Деп. ВИНИТИ 1982, N 1726-82.

11. Коломыткин О. В., Кузнецов В. И., Григорьев П. А. , Акоев И. Г. Исследование механизмов действия радиочастотных излу-

чений на модель постсинаптической мембраны глутаматного синапса. -Мат.: I Всесоюзного биофизического съезда. К , 1982, с. 117.

12. Коломыткин О. В., Абдрасилов Б. С. , Чистякова Л. Г. , Кузнецов В. И. Встраивание фрагментов мембран глутаматных и ГАМК-овых синапсов в плоскую фосфолипидную мембрану. -Мат.: I Всесоюзного биофизического съезда.

М. , 1982, с. 241.

13. Коломыткин О. В. , Акоев И. Г. , Кузнецов В. И., Григорьев П. Эффекты высокочастотного электромагнитного поля на модели постсинаптической мембраны. -В мат. Всесоюзного симпозиума Биологическое действие электромагнитных полей. Пущино, 1982, с. 10-11.

14. Коломыткин 0. В. , Акоев И. Г., Кузнецов В. И. Действие СВЧ волн на модель постсинаптической мембраны. -Радиобиология, 1983, т. XXIII, вып. 5, с. 670-672.

15. Борисова М. П., Бабаков А. В., Коломыткин О. R Протонная АТФ-аза в плоском липидном бислое. -Биологические мембраны, 1984, Т. 1,N2, 187-189.

16. Коломыткин О. В., Абдрасилов Б. С., Касымов Ш. К. , Салихов IIL И. Блокирование антителами ионных каналов, образованных латротоксином в БЛМ. -Биологические мембраны, 1984, т. 1, N12, с. 1266-1271.

17. Коломыткин О. В. Структура липидной мембраны, сформированной из водной эмульсии липосом. 22 с. Деп. ВИНИТИ 1984,

N 5430-84.

18. Коломыткин О. В., Иммуноглобулины - блокаторы ионных каналов латротоксина. 10 с. Деп. ВИНИТИ 1984, N 5075-84.

19. Акоев И. Г., ТяжелоЕ В. В. , Коломыткин 0. В. , Алексеев С. И. , Григорьев П. А. Исследование механизма действия микроволн на модельные мембранные системы. -Известия АН СССР, 1985, N1, с. 41-52.

20. Коломыткин О. В. , Абдрасилов Б. С. , Кузнецов В. И. Рецептор ГАМК из мозга крысы в плоской фосфолипидной мембране. -Биологические мембраны, 1985, т. 2, N1, с. 11-16.

21. Коломыткин O.E., Абдрасилов Б.С. Формирование плоской БЛМ из липосом. -Биологические мембраны, 1985, г. 2, N5,

с. 519-524.

22. Коломыткин 0. В. Исследование структуры плоской мембраны, сформированной из липосом. -Биологические мембраны, 1985,

т. 2, N2, с. 195-203.

23. Абдрасилов Б. С. , Коломыткин О. В. Блокирование пикроток-сином электропроводности модельной мембраны со встроенным рецептором ГАМК из мозга крысы. 10 с. Деп. ВИНИТИ 1985, N 8421-В85.

24. Акоев И. Г. , Каранова М. Е , Кузнецов В. И. , Коломыткин 0. В. Действие СВЧ поля на ГАМКергические и ацетилхолинерги-ческие системы синаптической передачи. -Радиобиология, 1985. т. 25, N3, с. 426-428.

25. Коломыткин О. В. Действие антител на электропроводность ионных каналов, образованных амфотерицином Б в БЖ -Биологические мембраны, 1986, т. 3, N6, с. 609-620.

26. Коломыткин 0. В. Свойства ионных каналов, образованных амфотерицином Б и антителами. 35 с. Деп. ВИНИТИ 1986, N 3043-В86.

27. Абдрасилов , Коломыткин 0. В., Акоев И. Г. Влияние СВЧ поля частотой 750 МГц на электропроводность липидной мембраны со встроенным рецептором ГАМК. -В кн.: Механизмы биологического действия электромагнитных излучений. Пущино, 1987, с. 20.

28. Коломыткин 0. а , Манцыгин Ю. А. , Святухина Н В. Действие моноклональных антител на ионную проводимость канала, сформированного амфотерицином Б в липидном бислое. -Доклады АН СССР, 1988, т. 300, N4, с. 986-989.

29. Коломыткин 0. В. , Манцыгин KL А. , Святухина Н. В. Взаимодействие антител с амфотерициновым каналом. -Известия АН СССР, 1989, N3, с. 394-400.

30. Коломыткин О. В. , Манцыгин Ю. А. , Святухина Е В. Моноклональ-С ные антитела - активаторы и блокаторы амфотерицинового канала. -В кн.: Одиночные ионные каналы в биологических мембранах. Пущино, 1989, с. 47.

31. Kolomytkin 0. V. , Akoev I. G. To the mechanism of microwave effect on biomembrane. -In: BEMS 4-th Annual Scientific Session Bioelectromagnetic Sosciety. Los Angeles, California, 1982, p. 84.

32. Kolomytkin 0. V. , Babakov A. V.,, Borisova M.P. Active proton transport across planar membrane ■with incorporated ATP-ase from Streptococcus faecal is. -In: Biological membranes: structure and function. Ill Soviet-Swiss Symposium, 1983, p. 165.

33. Borisova M.P., Kolomytkin O.V. , Kusnetsov V. I. SABA receptor and proton ATP-ase in planar lipid membrane. -In: 8-th International Biophysics Congress. Bristol, Great Britain, 1984, p. 304.

34. Kolomytkin 0. V. . Borisova M. P. , Babakov A. V. Proton ATP-ase in planar bimolecular lipid membrane. -In: 16-th FEBS ■ Meeting. M. , 1984, p. 288.

35. Kolomytkin 0. V., Kuznetsov V. I. Incorporation of gamma-ami nobuturic acid receptor into planar bilayer. -Studia biophysica, 1986, v. 115, N3, p. 157-164.

36. Kolomytkin 0. V. Structure of plana:- membrane formed from liposomes.

-Biochimica et Biophysica Acta, 1987, v. 900, p. 145-156.

37. Kolomytkin 0. V., Mantzyghin J. A. , Swyatukhina N. V. Antibodies affect the ionic conductance of channels formed by amphotericin B in a lipid bilayer. -Biochimica et Biophisica Acta, 1988, v. 945, p.335-349.

38. Kolomytkin 0. V., Kasymov S. K., Salikhov S. I. Blocking of the latrotoxm channels in bimolecular lipid membranes by antibodies.

-General Physiology and Biophysics, 1988, v. 7, p. 157-163.

39. Kolomytkin O.V. , Mantzygin J. A. , Svyatukina N. V. Increase of ionic conductance of amphotericin B channels under antibody action.

-General Physiology and Biophysics, 1988, v. 8, p. 73-78.

40. Kolomytkin O.V., Solubok A. 0. , Davydov D.N. , Timofeev V. A. , Tipisev S. Ya Ionic channels in langmuir-blodgett film studied by STM. -In: The 4th International conference on scanning tunneling microscopy/spectroscopy. Japan, 1989, p. 19.

41. Kolomytkin 0. V., Kuznetsov V. I., Akoev I. G. Microwaves affect the function of reconstituted and native receptor membranes of the brain. -In: Charge and field effects in Biosystems. New York, Plenum Publishing Corp. , 1989, p. 149-160.

42. Kolomytkin O.V. Antibodies affect the structure and function of ionic channels in a lipid membrane. -In: Charge and field effects in Biosystems. New York, Plenum Publishing Corp., 1989, p. 21-29.