Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ионпроводящие свойства Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и ее гидрофобного фрагмента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ионпроводящие свойства Са2+-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и ее гидрофобного фрагмента"

ОРДЕНА ЛШША II ОРДШ ДРУаШ НАРОДОВ АКАДШИ НАУК УКРАИШ

ОРДьНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОШДШ им. А.В.ГШШЩИНА

На правах рукописи

ЫАТУРСКШ Олег Ярославович

ИОНПРШОДиШ СВОЙСТВА Са2+-АТРазы САГК0ШЗМТИЧКС1С0Г0 КвШШЫА СШВТШХ Ш1Щ КРОШКА И ЙЗ 11ЩРС№Ж1ЮГ0 ФРАШЕНТА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на ооисканиа ученой степени кавдпдата биологических наук

Клеп - 19'Л

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.В.Палладина Академии наук Украины

Научный руководитель: доктор биологи чеках наук, Профессор М.Д.КУРСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор биологи чеоках наук В ,К .РЫБАЛЬЧЕШО

' доктор биологических наук

в.ы.воищщШ

/

Ведущее учревдение: Институт физиологии

им. А.А.Богомольца АН Украины

Защита состоится " У " О^лГЛ 1991 г. в /Ц-

Ъ о

ч

на заседании специализированного совета К 016.07.01 в Институте биохимии им. А.В.Палладина АН Украины Адрес: 252030, г.Киев, ул.Леонтошча,8, коишеренц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им.А.В.Палладина АН Украины

Автореферат разослан ty^Jp 1991 Г.

УченнИ секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

О.В.Кирсошсо

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов _ 2+

транспорта Са т в мембранной системе саркоплаэматического рети-кулума (CP) является одной из актуальншс задач современной биохимии мышц. Механизм закачивания кальция в CP и ведущая роль в этом процессе Са^+-АТРазы в настоящее время на подвергается сомнению. Осуществляемый этим ферментом транспорт против градиента концентрации является необходимым уоловяем расслабления мышцы после ее сокращения. В то яа время механизм выхода Са^* из ретикулума в цитозоль, как и весь процесс инициации сокращения мышечной клетки до сих пор обсуждается.

Предположения о наличии молекулярных структур, формирующих ионный канал в мембранах CP, обеспечивающий высвобождение Са2+, получили определенные экспериментальные подтверждения: был выделен рианоднновый рецептор с молекулярной массой 400 кДа /Lai Antony et ai., 1988 /. Реконструкция его в БЛМ приводит к формированию Са2+-канала со свойствами, аналогичны!® таковым в на-тивных мембранах ратинулуш. Однако электронномикроскопичеоккй анализ свидетельствует, что этот белковый комплекс идентичен "соединительным ножкам", локализованным мезду мембранами Т-си-стеш и терминальными цистернами CP / Antony, Meieaner, 1969 /.

Анализ данных о влиянии различных ингибиторов и индукторов

о ,

выхода Са из CP предполагает наличие различных изоформ или типов Са2+-каналов в различных структурах указанной мембранной системы, в формировании которых на исключается Са^+-АТРаза СР. Последнее вытекает из следующих фактов: I) способность везпку-лированных препаратов CP к ионному фосфорилировашго авр при пассивном выхода и синтезу АТР при д^фосфорилировании

Лршштче сокращения: CP - саркошгазматичвскпй рвтлкулум; БЛМ - бислойная липидная мембрана; MX - вольтамперкая характеристика.

АТРазы, имеющем место в процессе активного закачивания Оа^4" в ретикулум /навве1ЪасЬ, 1978 /; 2) существенное повышение скорости пассивного выхода Са2+ из везикул CP при работа Са2+-АТРазы /Ритов, 1977/; 3) способность искусственных фосфолипид-ных мембран, модифицированных ферментом, к Са^+-селективному транспорту ИОНОВ / Shamoo, Maclemian, 1974? Sharaoo, Goldstein, 1977/. Для окончательного разрешения вопроса об участии С'а?'+-АГРазы в формировании Са2+-каналов в CP требуется получение точных доказательств этого факта на адекватных моделях.

Следует отметить, что несмотря на наличие определенных сведений о возможном участит Са^+-АТРази в транспорте Ca^f, полученных на плоских фосфолилидкых мембранах /Николаева и др., t

1985; Shamoo, MacLennan, 1974/ и мембранах люгосом /Назаренко, 1986; Martonosi, 1982; Sharaoo, Murphy, 1979/, модифицированных ферментом и отдельными его фрагментами, в литературе отсутствуют данные,непосредственно указывающие на способность последних образовывать структуры типа ионных каналов, а также характеризующие их.

Целью работы было изучение ионтранспортирующих свойств искусственных бислойных мембран, модифицированных Ca'J -АГРазой и ее гидрофобным фрагментом.

Были поставлена следующие задачи:

1. Исследовать взаимодействие Са^+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента, полученного, при триптическом гидролизе реконструированного, в ляпосош цельного фермента, с бислолкыми фосфолятщ-ными мембранами и определить условия их встраивания в ЬИ.

2. Изучить ориентацию Сай+-ЛТРазн и ее гидрофобного фрагмента в лшщдном бислое и ярозчстя о|»яинепи(; их яоптршюпортпчх свойств.

3. Выяснить влияние потенциала на процесс пассивного транспорта Са^"1" на этой глодали.

Научная новизна работы. В цредставлзнной работе с помощью ряда методов показано, что путам обработки трипсином протеоли-посом с реконструированной Са^-А'ГРазой получены протзоллпосо-мц, содержащие ее гидрофобный фрагмент (45 кДа). •

Исследовано взаимодействие очищенной А'ГРаэи и протеолипо-соы с гидрофобным фрагментом на БЛМ. При этом показано, что пальнш фермент и его гвдрофобнцй фрагмент образуют в БЛИ проводящие структуры типа потенциалзависшлых кальциевых каналов. Определена проводимость одиночных каналов, формируемых АТРазсй в Б.'Ы и их ориентация при встраивании в бислой в различных условиях.

Показано, что расщепление трипсином не влияет на ковформа-цшо Са^-селективного центра Caá+~ATPa3ti, реконструированной в липосокы, что позволяло предположить aro возможную локализации в молекуле варианта.

На БЛГЛ, модифицированной оэияеияым цельным ферментом, установлено влияние кокаина на пассивный транспорт кальция.

Тнореткческая н практическая значимость работы. Полученные результаты подтверждают возможность участия Са^-АТРазн в процессе пассивного транспорта из CP, который может регулироваться кпмбрзичпм потетшалом, а такие позволяют предположить, существование положительного потенциала внутри ретнкулумз а момент выхода Са~+.

Подобраны условия выделения и встраивании Са'*+~ЛТРазн, при которых удалось определить проводимость структур типа ионных иэаятоз, ;ор:ктруг!.г1х гяцро'эбдом догмзктои Ca*"f-A'EPa3H в EE.I и их ориентации.

ч

Показано, что при обработке трипсином получен Са -селективный гидрофобный фрагмент АТРазы, что позволяет использовать данный метод для получения гидрофобпух участков других ионтран-спортирушях Мембранных систем.

Апробация работы. Результаты проведенных экспериментальных исследований и основные выводы были представлены на У Всесоюзном симпозиуме по биофизике и биохимии биологической подвижности (Тбилиси, 1990), на 20-м съезде ревз (Будапешт, 1990), па научных семинарах Института биохимии им, А.В.Палладяна.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы. Объем работы. Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы из 102 наименований.

Материалы и методы: Са2+-АТРаза была солюбшшзирована из белях скелетных мышц кролика по методу, предложенное В.Б.Битовым /Ритов, 1977/.

Реконструкцию АТРазы в липосомы проводили в процессе их формирования в присутствии 10$ глицерина /Ритов, 1982/.

Протеолипосода с гидрофобным фрагментом получали обработок

кой трипсином протеолипосом с реконструированной цельной Са -АТРазой /Лишко и др., 1987/,

Мембранный потенциал на протеолипосомах создавали разностью концентраций К1" внутри и снаружи последних по методу, ОППСаННОМУ В / Ва^вЬа^ Суг, 1980/.

Полученную после тряптичвекого гидролиза омзеь белков исследовали с помощью электрофореза в поляакрилагадном геле

/ Weber, Oaborn, 1969/.

Иммунологический контроль триптического гидролизата проводили при помощи РСК в микропостановке / Levine, van Vunakis, 1Э67/. Комплементом служила сыворотка морской свинки. Реакционная смесь в конечном объеме 3 мл содержала: 0;5 мл комплемента, дающем в титра 70-804 гемолиз, 0,5 мл антигена, 0,5 мл антител в рабочем разведении и 1,5 wi буфера (0,14 M HaCI, 0,01 î.I трио-НС I, pH 7,4). Смесь инкубировали 18 ч. при +4°С, после чего добавляли 0,25 гл 0,25? сенсибилизированных бараньих эритроцитов и вздергивали 60 глин при 37°С, затем центрифугировали 10 мин. при 1500 g . Степень гемолиза определяли по абсорбции суперна-танта при 413 нм.

Плоские фосфолшшднна. мембрана формировали по методу 1Лал-лера /jueller, Rudin, 1964 /, на отверстии диаметром 0,6 мм в тефлоновом стаканчике из раствора, представляющего собой смесь фосфатидалхолина с холестерином (соотношение 2:1) в н-гептана. Концентрация лашщов в растворе составляла 20 мг/мл.

Омывающий БЛГ.1 раствор содержал 10 мМ трие-НСГ, pH 7,4 и необходимое количество хлоридов металлов. В работе использовались хлоребребряншзе электродн, находящиеся в 2 M раствора KCl с агаровыми мостиками из 31 агар-агара в 0,3 M КСI. Поляризационный потенциал мезду электродами на превышал 1-1,5 гдВ.

Измерения трансмембранного тока производились при помощи операционного усилителя, позволяющего регистрировать токи до Ю-*'" А. Разность потенциалов подавалась на мембрану от источника напрялеиия, позволяющего получать постоянное (до +100 мВ) или линейно изменяющееся напряжение,.которое контролировалось пнТровым яольтметром (И!-4300). Потенциал снаругл стаканчика (цис-сторонп) задавали относительно потенциала внутреннего объе-

£

ма (трапс-сторона), который принимали равным О ыЗ. Регистрация

тока производилась на двухкоординатном самописце тина ешш? -620.02 (1ДР). - -

Во всех экспериментах введение фермента и протеолипосом в ячейку проводилось с цас-стороны ЕЛМ. При этом концентрация белка составляла 2-Ю- Ю-® мг/мл.

Для удаления фермента, не встроившегося в мембрану, и для изменения ионного состава раствора с цис-стороны мембраны, применяет технику перфузии БЛМ, описанную в работе / щГоп6\-, Зокп 1оу, 1906/.

Результаты исследований ц их обсуждение; Реконструированная в лшосомн Са2+-АТРаза проявляла АГР-гицролнтическую активность (5,2+0,Ь5 мкмоль ^/мг белка-мин) и способность активно транспортировать кальций через мембрану (3-4 мкмоль Са'~+/ыг. белка-мин; соотношение Са^+/Р. при этом соотавяяло 0,5-0,8).

Протеашгасомы, содержащие активнэд фврмонт, подвергали обработке трипсином, в результате чего отмочено образование, в основном, двух фрагментов'с молекулярной массой 45 п 55 кДа с небольшой примесью болзе лехдах фрагментов (ряс,. I).

Рис. I, Элвктрофореграмма продуктов триптического гвдро-

Л

лиза Са^-АТРазы, встроенной в липосомы; I - альбумин (45 кДа); 2 - каталаэа (60 «Да);

3 - Са2-АТРаза (100 кДа); 2

4 - образец после 2-мин.гидролиза Са^-АТРазы; 5 - трипсин (23 ; 6 - гидрофобный фрагмент Саь+-АТРазн (45 кДа,);7-

пгарофильный фрагмент Са'г+-АТРазы (55 ада). .

А-

í Z 5 Л 5 6 7

Эти главные фрагменты бши разделены путем центрифугирования. При этом гидрофобная часть, находящаяся в лилосомах, осаждалась центрифугированием при 40 ООО в в течение I ч, а гидрофильная оставалась взвешенной в надосздочной л осаздалась последующим центрифугированием при 105 ООО @ в течение I ч.

Электрофоретячески эти фрагменты бшш близки по молекулярной массе: 4и и 55 кДа.

На таких же объектах ранее было показано, что получекаиа фрагменты отличались по аминокислотному составу. В гидрофобном $рагшпт8 содержалось 260 гидрофобных аминокислот и 140 гидро' филышх, а в гидрофильном - '¿15 гидрофобных и 164 гидрофильных. Отношение количества гидрофобных аминокислот к, гидрофильным в гидрофобном фрагменте составляло 1,8, а в гидрофильном - 1,34 /Федоров, 1989/.

Антитела, полученные против протаолипосом с гидрофобным Фрагментом Са^-АТРазн, хорошо связывались с солпбнлизировашгсм препаратом форментз. Вели жо Са"+-АТРазу реконструировали в лн-посомы, их способность связываться с этим антигеном резко снизалась. Слабо связывались они и с гидрофобным фрагментом, реконструированным в липосоми.

Приведенные данные (рис. 2) свидетельствуют о том, что в оргатгзпе питуха антитела вырабатываются против делипидипиропзн-тго гидрофобного фрагмента. 3 солябюгазирозашшй Са -АТРаза гицроЛюбнкЙ фрагмент лишен липндноИ оболочки и поэтому доступен антителам, что обуславливает их интенсивное связывание. Но, если Са"+~ЛТРазу реконструировать в лнпосомы, то в этом случае ее гцдроТпбная члеть долят погрузиться в лпипдпуп мембрану и тогда доступ к при антител сильно затрудняется и антитела сняз-па-Ч1ст слабо (кряпчя 3). То не наблюдается и с гщцюДОтм '¿р-п--

ментом в протеояипосомах (кривая 2).

% в

Л

й -1 4 5 3 ЬдС (МКГ/М/1)

Рио.2. Связывание антител против гидрофобного фрагмента Са2 — АТРазы с антигенами:

о.

I - солюбилязироваяная Са-АТРаза; 2 - гидрофобный фрагмент в ляпосомах; 3 - Са2+~АТРаза в ляпосомах; 4 - гидрофильный фрагмент (55 кДа); 5 - нормальная сыворотка + солюбилизирован-ная Са2+-ДТРаза; по оси ординат - связывание антител в по оси абсцисс - логарифм концентрации антигена.

Кривая 3 показывает, что гидрофильная часть АТРазы оставшаяся не закрытой липидом не реагирует с антителами против гидрофобного фрагмента. Это подтвердилось при непосредственном взаимодействии этих антител о гидрофильной частью-фермента (кривая 4; Для реконструкции в БЛРЛ использовали очищенную Са -А'ГРазу

и ее гидрофобный фрагмент, получанный при триптической обработка

р,

протеолипосом с реконструированной Са' -АТРазой.

2+

Провэдвняые исследования показали, что при введении Са -АТРазы,- предварительно отмытой от дезоксихолага натрия, в ячейку с БЛМ происходит скачкообразное увеличение траггсмембранного тока, которое обычно начинается через 2-3 юга после, добавления Фермента (рис. 3, А).

3

-ЙЭпСм j_

БОС

Рис. 3. Одиночные каналы, образуемые в БЛМ: А - Са2+-А1Разой; раствор содержит I fil CaGIg; Б - гидрофобным фрагментом Са2+-АТРазы; раствор содержит 100 мМ K0I; стрелками указаны моменты введения препарата; концентрация белка в ячейке в обеих случаях 20 нг/мл.

Введение АТРазы в примембранную область обеспечивало более быстрое встраивание (в пределах I мин). Известно, что скачкообразное увеличение трансмзмбранного тока характерно для образования в липидвом бислое структур типа ионных каналов. Проводимость большинства каналов в растворе I мМ СаС^ (рис. 4,) укладывалась в интервал 20-100 пСм с четко выраженным максимумом при

50 пСм.

Рис. 4. Гистограмма распределения проводимостей одиночных канатов, образованных Са2+-АТРазой, в симметричном растворе I ьМ СаС^Ш) а 0,9 мМ СаС12 + 10% глицерина (нормированная по отношению элек-тропроводностей растворов) (I). Потенциал на БЛМ +50 мВ.

Достигнутый уровень проводимости БЛМ на снижался в течение длительного Ерамени. При удалении АТРазн из ячейки путем перфузии проводимость устанавливается на некотором постоянном уровне, что свидетельствует о необратимости встраивания.

Следует сказать, что удалить детергент (в данном случае де-эоксихолат натрия) применяемый при выделении фермента полностью ие удается, поэтому были сомнения, что наблюдаемый эффект повышения проводимости БЛМ может быть результатом воздействия детергента. В связи с этим в качестве контроля в ячейку с БЛМ вносили; I) среду реконструкция Са2+-АТРаэы в липосомн; 2) препараты Са2'1"-АТРазы; 3) протеолипосош с гидрофобным фрагментом.

Са^+-АТРазу и протеолипосомн с гидрофобным фрагментом предварительно хранили в течение суток при +4°С. Контрольные образцы вносили в примембраиную область. При этом проводимость мембраны не изменялась. Использование Са2+-АТРазы и протеолипосом с гидрофобным фрагментом, полученншс из предварительно подвергнутых замораживанию фрагментов CP также не изменяло проницаемость мембраны.

Скачкообразное увеличение проводимости БЛМ наблюдалось только при внесении в ячейку свежеввделенных препаратов АТРазы.

о ,

Известно, что в молекуле Са -АТРазы есть довольно протяженные участки, которые почти полностью состоят из остатков гидрофобных аминокислот /Болдырев, Мельгунов, 1985/. Поэтому, после выделения, долипидяровапный фермент, как и его бромциановые и протео-литические фрагменты, в течение суток агрегирует, что возможно, приводит к экранированию мембранноактивных участков. Указанная причина, по-видимому, привела к отсутствию скачкообразных флуктуация трансмембранного тока и нестабильности БЛМ при встраивании очищенной АТРазы и со бромциановнх и триптяческих фрагментов В работах /Николаева И др., п?80; Shanoo, i "с'^щап, 197«{;Ciro».oo, i;yan, 1976/.

Били исследованы также ионпроводящие свойства БЛМ после

добавления в ячейку протеолипосом, содержащих гвдрофобный фраг-2+

мент Са -АТРазы. В этом случае происходило слияние протеолипо-сом с плоским бислоем /Соколов, 1982/, поскольку наблюдались дискретные флуктуации тока (рис. З.Б), подобные тем, которые описаны для АТРазы. Однако частота образования каналов в БЛМ была заметно ниже (особенно в раствора хлорида калия). Поэтому в калиевом растворе встраивание гидрофобного фрагмента осуществлялось введением смеси протеолипосом непосредственно в примам-бра нную область, либо при добавлении с цис-оторонн БЛМ 5 мМ СаС12

Увеличение проводимости мембраны при встраивании Са^+-АТРазы и ее гидрофобного фрагмента сопровождалось падением вв ~ стабильности. Поэтому большая часть экспериментов проводилась на модифицированных мембранах с невысзсими значениями проводимости (0,8-2 иСм). Активирующее влияние Са®?" на слияние протеолипосом с БЛМ можно объяснить тем, что неравномерное распределение Са2+ относительно липидных бислоев вызывает их структурные изменения, при которых гидрофобные участки мембран могут быть экспонированы в водную фазу. Такие участки на протеолипосомах и на плоском бислоа предполагаются наиболее подходящими для инициации слияния мембран /Соколов, 1982/,

о .

Встраивание Са -АТРазы в растворах одновалентных катионов таете происходит значительно медленнее чем в растворах хлорида кальция. В этом случае достаточно введения 2-3 мМ СаСГд с цис-стороны на фоне 100 мМ КС1, чтобы активировать этот процесс. Одностороннее добавление Са2+, по-видимоцу, вызывает на БЛГЛ та- -кой яа эффект,как и при слиянии протеолипосом (см. выше), а достаточно протяженные гидрофобные участки АТРазы могут'служить наряду с экспонированными в водную фазу углеводородными цепоч-

ками бислоя вероятными участками инициации встраивания.

Возможно, что в нашем случае под влиянием одностороннего

о.

добавления Са в ячейку происходит модификация как бислоя, так и фермента.

Кроме этого, существенное влияние на встраивание Са2+-АТРа-зы в БЛМ оказывает величина траномембранного потенциала. Встраивание достаточно эффективно проходит как при положительных (+ 100), так и при отрицательных (- 100) потенциалах, что соответствует данным, приведенным В /й!штоо, Кос1егтап, 1374 /. Однако снижение потенциала до + 40 мВ может полностью ингибировать этот процеоо.

В данном случае предотавляется маловероятным воздействие потенциала на поверхностные группы липида, поскольку эксперименты проводились на нейтральных лецитин-холестериновых мембранах. Поэтому, учитывая то, что наличие эффекта деформации при повышении потенциала не зависит от его знака дал симметричной мембраны /Чангурия, Лшако, 1988/, а также то, что встраивание проявлялось при достаточно выооких значениях потенциала, можно предположить, что основной причиной потенциалзависимости проникновение фермента в бислой является деформация последа его при наложении напряжения выше определенного уровня.

Необратимость встраивания АТРазы в ЕЖ позволила снять стационарные вольтамперныа характеристики модифицированных мембран. Их форма (рио. 5,А) указывает на способность трансмембранного потенциала влиять на процесс пассивного транспорта ионов через Са^+-АТРазу, подобно ионным каналам возбудимых мембран, латро-токсину и др. /Костюк, 1986, кхгопоу, Зоко1оу, 19вб/, а также на ориентированное встраивание фермента.

Реконструированная в липосомн Са2+-АТРаза, с такой же

ориентацией как и в СР, обладала односторонней проводимостью для Са2+, причем положительный потенциал внутри протеолипосом стимулировал пассивное высвобождение Са2+ /Назаренко, 1986/, что в общем не противоречит форме полученных нами ВАХ.

ы

V

и

ЦиВ

20

Ко

®0 -ЮО

Рис. 5. Вольтамперные характеристики БШ, модифицированных Са2+-АТРазой (А) и ее гидрофобным фрагментом (Б) в симметричном растворе I ММ СаС^:

А: I- - фермент вводился с цис-стороны БЛГЛ; 2 - фермент вводился с транс-стороны БЛМ. Б: Гидрофобный фрагмент был добавлен с цис-стороны мембраны.

Известно /шгопоу, Боко1оу, 1986/, что асимметрия ВАХ модифицированной мембраны отражает ориентированное встраивание фермента в БЛМ. ВАХГ полученная при встраивании АТРаэн с трансстороны, является обратным отображением той, которая получена при встраивании с цис-стороны (рис. 5,А).

Форма ВЛХ, модифицированных гидрофобным фрагментом БЛМ, была такой же как и у цельного фермента (рис. 5,Б). Это позволяет предположить, что в протеолипосомах с гидрофобным фрагментом, полученным г^осле трилсинолиза реконструированной в липосомы А'ГРазы, сохраняется потенциалчувствительннй участок. Асимметричность ВЛХ указывает на сохранение ориентированности при встраи-

ванпи гидрофобного фрагмента в БЛМ. Ранее, на полученных тем же методом протеолипосомах так же была отмечена асимметричность ионпроводящих свойств гадрофобного фрагмента /Лито я др., 1987/.

Известно, что АТРаза in vivo ориентирована определенным образом: ее АТР-гидролитическая часть выступает в миоплазму, а ионпроводящая (канальная) пронизывает мембрану CP / Shamoo, Goldstein , 1977/. Предполагают, что при реконструкции Са2+-А'ГРазы в.липосош часть молекул фермента ориентируется в обратном направлении /Лишко и др., 1987; Ритов и др., 1982; Назаран-ко, 1986/. Ряд авторов /Ритов и др., 1982; Лито и др., 1987/ считает, что введение 10$ глицерина в среду, используемую для реконструкции предотвращает эту переориентацию. В нашей работе исследовались БИЛ, модифицированные ферментом в присутствии 10? глицерина с обеих сторон мембраны. При этом форма ВАХ сохраняла нелинейность (рис. 6), но соотношение величин тока при положительных я отрицательных потенциалах изменялось с 1,8+0,6 (без глицерина) на 0,7+0,2 (в 10$ глицерине). Кроме того, в распределении амплитуд возрастал пик каналов, тлеющих мате величины проводимости (рис. 4).

Учитывая зависимость проводимости канала от направления тока, можно предположить, что каналы малой амплитуды появляются в

1-пА

Рис. 6. Вольтамперная характе^

тл.то Па2+_ДТРао1.т>

ристика Са -АТРази: I - в симметричном растворе

I м!Л СаС12; 2 - в симметричном раствора 0,9 мМ CaCIg+IO^ глицерин; в обеих случаях фермент

добавляли с цис-стороны мембраны.

результате инвертированного встраивания фермента в БЛМ. Повышение вероятности такой инйзрсии в присутствии гл1щерш!а, возможно связано с образование!! в БЛМ не бислбйннх и/или мультислойннх структур /Руденко и др., 1987/ или же с изменением гидатяой оболочки фермента в растворе, что также может облегчигь встраивание обратноориентированнпх молекул.

В опытах с протеолппосомами, полученными при встраивании Са2*"-ЛТРазы в присутствии 10$ глицерина показано, что пассивный выход Са при полояитолышх потенциалах внутри лшгосом больше, чем при отрицательных (рис. 7). -

--¡00 -50 Щ £р 1

50 Ч>

<00

Рис. 7. Влияние мембранного потенциала па пассивный транспорт Са2+-АТРазы. По оси абсцисс - значения мембранного потенциала; по оси ординат - выход кальция,%.

Кроме того, известно /Нэзаренко, Гс)86/, что положительный внутри-тдбраниый потенциал стимулирует высвобождение из них Было показано /Ритов и др., 1982/, что фермент в таких протеолплосо-мах ориентирован гидролитическим участком наружу (рис. 8,Л). Сопоставив эти результаты с результатами, полученными на БЛМ (рис. 5,А), можно предположить, что при встраивании Са^+-АТРазы в БЛМ (без глицерина), ее гидролитический участок расположен преимущественно с транс-стороны мембраны (рис. 8,Б).

В этих условиях наибольший ток кальция через мембрану, модифицированную АТРазой наблюдается при положительных потенциалах с цис-стороны. При встраивании фермента в растворе, содержащем 10"? глицерин гидролитический участок расположен с цис-стороны. Тогда наибольший ток кальция будет при положительных потенциалах

с транс-стороны. Аналогичная ориентация, судя по форма ВАХ (рис. 5,Б), цо-ввдимоцу, сохраняется и дня гидрофобного фрагмента.

<V ° °à J, -

о. Ъ

а 'о WO?

си »

CX'^t.

4" Psl

Рис, 8. Ориентация молекулы Са2^-АТРазы: А - при реконструкции

в липосомы в присутствии БЛМ (без глицерина).

глицерина; Б - при встраивании в

Установлено /Назаренко, 1986; Тугай, Войцицкий, 1983'; Тугай, Дкдюша, 1988; zimniak, Backer, 1978 /, что пассивный транспорт Са2+ из СР, как и его активный транспорт Са2+-АТРазой может регулироваться мембранным потенциалом. Поэтому приведенные наш результаты позволяют предположить участив фермента не только в активном накоплении Ca в цистернах СР, но и в его пассивном высвобождении.

Кроне того, с учетом предполагаемой локализации Са2+-АТРазц В мембранах СР / Shaffloo, Goldetein, 1977; Shnnoo, I.urphy, 1979; Brandl et al., 1986 /, a также ее участия в пассивном транспорте Са2+ /Липко и др., 1987; Назаренко, 1986; Николаева и др.,1985; Shamoo,. MacLennan, 1974 /, пожученные результаты позволяют предположить наличие положительного заряда внутри СР в момент выхода Са2+.

При исследовании катион-анионной селективности установлено,

что А'ГРаза и ее гидрофобный фрагмент образует в ШМ преимущественно катион-селективные каналы. Катион-анионная селективность гидрофобного фрагмента незначительно отличается от таковой для исходного фермента. Сдвиг потенциала реверсии тока при к£ранс-10 мМ, К^, - 100 мМ равен 25+4 мВ для гидрофобного фрагмента, а для Са2+-АТРазн - 30+2 мВ. Аналогичные эксперименты для Са2+-АТРазы были поставлены в работе / БЬашоо, ЫпсЬепаап, 1974/ (сдвиг потенциала реверсии для цельного фермента 20 мВ).

Кроме этого ш исследовали также селективность АТРазы и ее гидрофобного фрагмента к двух-, одновалентным катионам. Показано, что ВЛМ, модифицированная АТРазой также селективна к двухвалентным катионам, как и гидрофобный фрагмент. При атом селективности обеих объектов незначительно отличаются друг от-друга (сдвиг потенциала реверсия тока при К^ис - I мМ, Са2рано - I йЛ равен 20+5 для АТРазы и 16+0,5 для гидрофобного фрагмента)(табл.1,2)..

Таблица 1

Сдвиг потенциала реверсии и/мВ/ и отношение ■ проводимостей (потенциал на мембране +100 мВ), возникающие при I »М СаС^ с транс-стороны мембраны и I мМ других хлоридов с цис-сторонн ( зСа2+, , соответственно)

Ион : °Са2+/'01 : и /тлВ/

Ва2+ 0,9+0,14 _

Са2+ 1,0+0,1 -

1,2+0,14 6,3+1,5

2П2+ 8,1+1,8 —

са2+ 19,2+0,6.

к+ 1,56+0,2 20,0+5,0

БЛТЛ модифицирована Са2+ -АТРазой.

В / злокос, япсЪвппап, 1974/ сдвиг потенциала реверсии для цельного 'впг^чтп составил 10 мЗ. Более низкая сялоктичкость АТРгззн

а данном случав, по-видимому, объясняется достаточно жестким воздействием на фермент в процессе выделения и перед встраиванием в ЕШ. Установлено (табл. I), что ионные каналы, образованные Са2+-АТРазой в БЛМ проводят двухвалентные катионы в предпочтительной последовательности: Ва2+> Ca2+>Hg2+> Zn2+> Cd2+> 1С1". При этом ионы цинка и кадмия элективно блокируют ток Са2+ при

Сатранс ~ 1 2ицис 11,10 Сйцис ~ 1 Эти Данаыа согласуются с результатами, подученными дои ДТРазы в работе /зьшаоо, ь&сьеп-вдш, 1974 / и кальциевых каналов Достюк, 1979, laronov, Sokoiov, 1933/. Для одновалентный катионов получен следующий ряд: 1С^>Иа+ Са+ > еъ+> (сдвиг потенциала реверсия при 10 мМ KGI с трансстороны мембраны и 10 (¿.5 других хлоридов с цис-сторона соответственно: 1+0,3; 3,81+0,5; 4,5*0,5^5,5+1; 7,26+2,2. Существенные' различав этого ряда от приведенного в работе /sharaoo, Goldstein, 1977/, по-видимому, связаны с тем, что в нашем случае -мезду собой сравнивались только одновалентные катионы, а в / shanoo, Goldstein , 1988/ одновалентные катионы сравнивались с Са2+.

Данные о значительной структурной гомологии Са2+-АТРазы CP с системами обеспечивающими транспорт К*" /Hesse et ui., 19аа/, а также предположение о функционировании фермента в качества элактрогевной Са2+/Н\ Ma (К\ Па , Ug ) - обманной система /Печатников, IS30; Ztmniaic, Itacker, 1978s Beller, 1983 / ВОЗМОЖНО объясняют полученную селективность к К+ и ifa+ в отсутствии Са2+.

Селективность гидрофобного фрагмента к двух-,одновалентным' катионам отличается от таковой для исходного фермента только более низким значением сдвига потенциала реверсии (табл. 2). Ионные каналы, образованные гидрофобным фрагментом в REI, проводят двухвалентные катионы в предпочтительной последовательности: Впг+» Са2+> £п2+> са2+ > К*" (и са-+ эЭДчктпвио о'ло-

кпругат ток Са2+" при Са^ан0 - I м?<Т, гп2£с или - I Л),

такой ке как. и для цельного фермента. Приведенный ряд селоктиэ-

нооти для гидрофобного фрагмента полностью совпадает с таковым,

полученным методом синтетических проникающих ионов на протооли-

посомзх /Лишко и др., 1987; Назаренко, 1986/, а такие з целом

„ 2+

еоответствует полученному для Са -селективного фрагмента (20 кДа) /Николаева И др., 1985; ЗИотоо еЬ а1., 1976; БЬплоо, иигрИу, 1979/(близки даже'численные значения бияонних потенциалов (табл. 2), однако полностью отличается от результатов, приведенных в / ИЬптоо, 0о1йзге1п, 1977; 5йатоо, иигрЬу, 1979/ ДЛЯ гидрофобного фрагмента, полученного при трипсинолпзе СР.

Таблица 2

Сдвиг потенциала реверсии - и/мЗ/ и отношение проводимосте'Д (потенциал па мембрана +100 т/В), возникающие при I мМ СаС12 с трапс-сторонн мембраны и I глМ других хлоридов с цис-сторонн ( °сд2+, , соответственно)

Ион_^__: у А.{В/

Ва^ 0,75+0,06

Са2+ 1,0+0,05

Ыз2+ 1,24+0,30 4,0+0,5

Ът?* 7,5+0,5

Сс1г+ 1,78+0,3

К+ 1,35+0,2 16,0+0,5

БД1 модифицирована гидрофобным фрагментом Са -АТРазы.

Согласно этим результатам, полученный таким путем гидрофобный фрагмент, формирует в БЛМ не селективные для Са2+ ионные каналы, Нами также обнаружено, что проводимость Б®, модифицированной ЛТРазой, хорошо блокируется ионами кадмия в' калиевом растворе и значительно слабев в растворе-хлорида кальция (рис. 9,А,Б), известно, что кальциевая проводимость для Са'+-АТРазн ингкби-рустоя дяухчу.-гицтпнтдя катионами, такта® кап £пг+, ¡ле2+, с<!2+

I,nA 12

А

I,nA so

g

Л

л

г

-tp чо -го —;—ь

S % ёэ

-4

ЦмВ -ер -4а -гр

го 4а 60

ЦпВ

Рдо. 9, Вояьташерннв характеристики Са-+АТРазы в БЛМ:

А: I - в симметричном растворе 10 мМ KCI; 2 - в тех же условиях

с цис—стороны ивыйраны добавлен 2 мМ CdCIg.

Б: I - в симметричном раствора ¡¡0 мГ.1 СаС12; 2 - в тех же уело- . виях с цис-стороны мембраны добрая 2 ъй CdGIg.

о.

Предполагается, что эти ионы конкурируют за Са -ионофорный сайт /Коствк, 1979; Shaaoo, Goldstein, 1977/. В соответствии с представлениями о конкурентном механизма блокирования можно предположить, что ионы кальция к кадмия незначительно различаются по связыванию с Са2+-свлецтшшым центром АТРазы, чем объясняется слабое блокирование кадмием кальциевого тока в соотношении 1:5 (рис. 9,Б) к эффективное в соотношении 1:1 (табл. I). Выраженное блокирование кадмием калиевого тока согласуется с результатами, подученными для кальциевых каналов /Костюк, 1979/.

В случав с модифицированными гидрофобным фрагментом мембранами, блокирование проводимости ионами кадмия также было выражено в раствора хлорида кадия (рис. 10, А,Б)» Вместе с тем, гидрофобный фрагмент блокировался кадмием слабее, чем нативная А'ГРаэа. По-видимому, ато ¡дожно объяснить изменением его конформа-цвп после отщепления вемембранных участков. Аналогичные результаты были получены после обработки трипсином реконструированной АТРазы /Лкшко и др., 1987./. Кальциевая проводимость' полученных

Рис. 10. Вольтамперные характеристики гидрофобного фрагмента Са2+-АТРазы. Обозначения те да, что и для рис. 9.

протеолипосом также блокировалась попами кадмия.

С учетом предполагаемой локализации Са2+~АТРази в мембранах CP /Shamoo, Goldstein, 1977; Brandl et al., 198б/> согласно которой гидрофобный фрагмент (45 цЦа) полностью погружен в мембрану и формирует неселективный катионннй канал, а Са2+-се-лективный центр локализован во фрагменте 20 кДа, примыкающем к нему с внешней стороны, слабое различие селективных свойств Ca2í АТРазы и ее гидрофобного фрагмента можно обменить незначительным влиянием расщепляемых, трипсином участков молекулы АТРазы, реконструированной в липосомах, на конформацию селективного центра.

С помощью аминокислотного анализа было показано, что гидрофобный фрагмент, полученный при тршти веком гидролизе, реконст-

р.

руированной в лотосомн Ca -АТРазы содержит больше аминокислотных остатков на I моль, чем гидрофобный фрагмент, полученный

при гидролизе солюбшшзированного фермента /Федоров я др., 1989/.

р,

Установлено, *-что основная масса Ca -АТРазы, реконструированной в липосомп, расщепляется по валяну в 465 положении, а солюбшпг-зировагшая по аланину в 505 положении /Федоров и др., 1939/. Следовательно, гидрофобный фрагмент, исследований нами на 40

аминокислотных остатков длинное. Учитывая различия в селективности щцрофодных фрагментов, полученных из солвбшшзироваяной АТРазы /Федоров и др., 1989/ и реконструированной з липосомах /Лишко и др., 1987/, можно предположить, что эти 40 аминокислот и определяют структуру Са2+-ионофорного сайта.

Ранее было показано влияние кофеина на активный транспорт Са2+ в СР /Ритов, 1971/ и на пассивный выход Са2+ из везикул ре-тикулума /Меньшикова, Ритов, 1988/. При этом отмечалось, что кофеин может влиять на транспорт Са2+ через мембраны СР благодаря взаимодействию с Са2+-АТРазой. Установлено, что рвцепторно-ка-нальный комплекс ретикулума, активируемый кофеином, расположен трансмамЗранно, то есть является интегральным балком с молекулярной массой 100 кДа Двныликова* Ритов, 1986/, что соответствует молекулярной массе АТРазы. Показано также, чго ионный состав среды, в которой кофеин активирует пассивный выход Са2+ из везикул СР сходен с условиями, в которых происходит активный транспорт Са2+ в протеолипосомы с реконструированной Са2+-АТРазой /маг-Ьопоз! , 1982/.

Б нашей работе исследовалось влияние кофеина на БЛМ, модифицированной Са2+-АТРазой.

В омывающий мембрану раствор 5 Ш СаС^, предварительно отмытый от не встроившегося фермента, с цис-сторонн добавляли О, I мМ кофеина (при этом АТР-гидролитический участок расположен с транс-стороны мембраны). Через 1-2 мин. после добавления проводимость модифицированной АТР-азой мембраны возрастала (рис. II).

Дня того чтобы установить влияние кофеина на используемую нами Б®, в аналогичных условиях с цис-сторонн немодифицирован-ной мембраны добавляли от 0,1 до 25 ы?Л кофеина. При этом проводимость ЕЖ! не менялась.

Рис. II. Активирующее влияние кофеина на пассивный транспорт

ионов через БЛМ, модифицированную Са^-АТРазой. Раствор содержит 5 мМ СаС^; потенциал на БЛ?,1 50 мВ; стрелкой показан момент введения О, I мГЛ кофеина с цис-стороны мембраны; короткой линией указано значение тока при нулевом потенциале па мембране.

Обнаруженный нами эффект активации кофеином пассивного переноса ионов -кальция через Са2+-АТРазу наряду с данными, полученными на рзтикулума Д1еньяшко ва, Рптов, 1986/ и рядом резулъ-' татов экспериментов и допущений, изложенных в нашей работе, также позволяет предполагать участие формента в пассивном выбросе Са2+ из цистерн ретикулума.

ВЫВОДЫ

1. Путем обработки трипсином протеолипосом с реконструированной Са2+-АТРазой СР белых скелетных мышц кролика получен гидрофобный фрагмент (45 кДа).

2. Осуществлена реконструкция Са2+-АТРазы и протеолипосом . с ее гидрофобным фрагментом с бислойныа фосфолипиднне Мембраны.

Установлено активирующее влияние трансмембранного потенциала и ионов кальция на встраивание очищенной Са24"-АТРазы в БЛМ.

3. Показано, что очищенная АТРаза и протеолипосош с ее гидрофобным фрагментом образуют' в БЛ.Ы ионтранспортирующяе структуры типа потеипиалзаеисишХ калыгиавнх каналов возбудимых мембран.

Впервые исследована проводимость одиночных каналов, образованных при встраивании очищенного фермента в плоский фосфоли-шщный бислой, в также их ориентация в последнем.

Установлен ряд селективности для цельной АТРазы: Ва2+> Са2+> - эффективные блокатори кальциевого тока), соответствующий таковому и для гидрофобного фрагмента. Показано, что незначительные различия их селективности объясняют-2+

ся сохранением Са -селективного центра после обработки тршси-

р,

ном реконструированной в липосомы Са -АТРазы.

4. Впервые показано активирующее влияние кофеина на пассивный траснпорт Са2+ через плоские фосфолипидные бислои, модифицированные очищенной Са2+-АТРазой.

б. Полученные результаты подтверждают возможность участия фермента в процессе пассивного выхода Са2+ из СР, который может регулироваться мембранным потенциалом. При атом предполагается

наличие положительного потенциала внутри ретикулума в момент 2+

выхода Са ,

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Шатурский О.Я., Курский 1.1.Д., Диброва М.Д,, Федоров А.Н.,

2*

Пискарев В.Б,, Чантурия А.Н. Ионпроводящие свойства Са-А'ГРазы саряоплазматического ретикулума скелетных мышц и ее гидрофобного фрагмента // Биологические мембраны. - 1930. - т. 7. -1! 9.0. 938-944.

2. Шатурский О.Я., Курский М.Д., Федоров А.Н., Писка-

„ 2-

рев В.Б., Пешкова Л.П., Чантурия А.Н. Канальные свойства Са-4ТРазы саркоилазматичаского ретикулуш скелетных мышц кролика // Докл. АН УССР. - Серия Б.- 1989. - II 12. - С. 57-39.

3, Shatursky O.J., Kursky IvI.D., Pedorov A.If,, Meehkova L.I.,

Piskarev V.B., Chanturia A.H. Ionconductive properties of sarco-2*

pl&smic reticulum Ca-A'iPase of rabbit skeletal muscle and its hydrophobic fragment// FEBS Abstracts. - Sudapest. - 1990. - P. 273.

4. Шатурский О.Я., Курский М.Д., Федоров A.H., Пешкова Л.И., Пискарев В.Б., Чантурия А.Н. Влияние траясмембраяного потенциала на пассивный транспорт ионов через бислойные липиднне мембраны модифицированные Са-АТРазой саркоплазматического ретикулума и ее гидрофобным фрагментом // Тбилиси. - 1990. - С. 63.

Подп. в печ. 23.09.91. Формат 60x84/16. Бумага тип. Офс.печать. Усл.печ.л.1,63. Усл.кр.-отт.1,63. Уч.-изд.л. 1,0.Тираж 100 жз. Зак. 33 3 . Бесплатно.

Отпечатано в Институте математики АН Украины. 252601 Киев 4, ГСП, ул. Репина, 3