Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость состояния ансамбля грамицидиновых каналов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость состояния ансамбля грамицидиновых каналов"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи

ИВАНОВ Павел Сергеевич

УДК 519.23: 577.352.2

УСТОЙЧИВОСТЬ СОСТОЯНИЯ АНСАМБЛЯ ГРАМИЦИДИНОВЫ'Х КАНАЛОВ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1992 г.

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

■ профессор С.Э.Шноль.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Ф.И.Атауллаханов,

доктор физико-математических наук, профессор К.В.Шайтан

Ведущая организация: Институт электрохимии РАН.

Л! « лии

-¡5

Вс

Защита состоится

и

1992 Г. В

часов на заседании Специализированного совета Л 3 Отделения физики твердого тела (К 053.05.77) в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горн, МГУ, физический факультет, аУд. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета #3 ОФТТ ■ кандидат <&13ико-матемаг,"л"""''

Т.М.Козлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наиболее надегсним способом получения информации об особенностях функционирования биологических объектов является применение невозмущащих методов исследования. Ода! из таких методов состоит в анализе флуктуаций физико-химических параметров систолы. Его возмокности достаточно полно проявились в изучении шумов проводимости ионных каналов.

Грамицидиновые каналы в липидном бислое являются традиционным объектом исследования в биофизике ионного транспорта. Достаточно простая структура, легкость химической модификации, уста-новленность основных физико-химических свойств, развитость теоретических подходов позволили в 80-х годах рассматривать эту систему в качестве удобной модели клеточных ионных каналов. В то ке время поведение грамицидиновых каналов в ансамбле, возможность их взаимодействия исследованы недостаточно.

В многолетних исследованиях, проводимых на физическом факультете МГУ и в Институте теоретической и экспериментальной биофизики в Пущино, коллективные эффекты обнаружены ю флуктуациях характеристик различных физико-химических систем. Их основным проявлением слу&ит устойчивость дискретных форм распределений амплитуд фшуктуаций на малых выборках. Наблюдаемые (макроскопические) флуктуации отражают переходы меяду конечным числом состояний системы.

Проблема выявления физических механизмов, обусловливающих воспроизводимость макроскопических состояний, еще далека от своего разрешения. Актуальными в этой связи являются исследования на феноменологическом уровне, в частности,- вопроса об эволюции во времени макросостояний системы, выделение устойчивых состояний, оценка характерных времен этой устойчивости. В результате такого исследования показано существование устойчивых состояний ансамбля грамицидиновц* .каналов в Сислое и найдены их временные параметры. Для целей анализа эволюции состояний во времени разработаны новые количественные методы, применимые к исследованию флуктуаций параметров различных систем.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось исследование устойчивости и эволюции состояний ансамбля грамицидиновых каналов в оислойной /липидной мембране (БЛН). Рэ-'посредственной задачей работы являлось: . ; • ' ■-

- исследование вопроса о существовании устойчивых состояний ансамбля грамицидиновых каналов в ШШ, проявляпцихся в воспроизводимости форм гистограмм амллктуд флуктуаций;

- исследование процессов возвращения системы в данное состояние, выявление характерных времен установления устойчивых маловыборочных распределений амплитуд фпуктуаций проводимости и времен сохранения такой устойчивости, сопоставление этих величин с характерными временами элементарных процессов в системе;

- разработка новых одно- и многомерных методов анализа формы несостоятельных гистограмм и доказательство с их помощью достоверности сходства форм экспериментальных распределений;

- выявление современными методами кластерного анализа небольшого числа типов форда несостоятельных гистограмм амплитуд флуктуаций проводимости;

- исследоваше характера случайных блуадашй системы в многомерном признаковом пространстве.

Научная новизна. До настоящего времени проблема существования устойчивых состояний ансачбля грамицидиновых каналов не исследовалась. В работе впервые установлено наличие сходных (воспроизводимых) распределений величин проводимости системы грами-цидиновых каналов, построенных по малым выборкам, исследована их эволюция во времени, а такке получены оценки характерных времен устойчивости этих распределений.

Доказательство неслучайности наблюдаемого сходства потребовало разработки и применения особах статистических методов анализа несостоятельных гистограмм. В диссертации развит подход к обоснованию достоверности сходства дискретных форм гистограмм, нспользущий некоторые мери расстояния в пространстве плотностей распределения вероятностей. Впервые предложен многомерный подход к анализу фора несостоятельных гистограмм, в основе которого ле-ннт переход к описанию их точками в признаковом пространства. Методами современного кластерного анализа проведена классификация типов формы несостоятельных гистограмм, получаемых в экспериментах по исследованию флуктуаций проводимости. Использование натуральной координаты и методов ортогонального проецирования позволило визуализировать случайные блуждания системы в признаковом пространстве и исследовать характеристики этого процесса.

Практическое значение работы. Обнаружение устойчивости со-етояний ансамбля грамицидиновых каналов вскрывает новые особен-

ности их функционирования и указывает на важность коллективных процессов в исследуемой системе. Полученные результата представляют интерес и для биофизики иотшх каналов клеточных мембран. Разработанные метода анализа форм несостоятельных гистограмм могут быть применены в различных прикладных исследованиях при работе с малыми внСорквми в условиях отсутствия априорной информации о вероятностных свойствах изучаемых процессов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 5-й и 6-й научных конференциях "Флуктуационше явления в физических системах" (Паланга, 1988 и 1991 гг.), 3-й Всесоюзной конференции "Перспективные методы планирования и анализа экспериментов при исследовании случайных полей и процессов" (Гродно, 1988 г.), Московском семинаре "Планирование эксперимента" (Москва, 1989 г.), 3-й Всесоюзной конференции "Математическое моделирование: нелинейные проблемы и вычислительная математика" (Звенигород, 1990 г.), Всесоюзном совещании-семинаре "Инженерно-физические проблемы новой .техники" (Звенигород, 1990 г.), 1-й Всеарабской конференции по медицинской биофизике (Каир, 1991 г.), Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы фундаментальных наук" (Москва, 1991 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. ~~

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы (152 наименования). Работа изложена на 178 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ГРАМШЩИНОВЫЕ КАНАЛЫ И ДИСКРЕТНОСТЬ МАКРОСКОПИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯ

В этой вводной главе проанализированы результаты исследований а существующие представления в биофизике грамидадинового канала и дискретных подсостояний проводимости одиночных КЛ8точных ионных каналов, а также рассмотрено современное состояние проблемы макроскопических флуктуаЦий в процессах разной природа.

■ В §1: первой главы-дан.-краткий обзор, теоретических и эксгл-ршзнтальшх работ,• способствовавших, выяснению!структуры, биоло-

гической функции и физико-химических свойств грамицидиновых молекул и их динаров. Проанализированы модели организации и функционирования одиночных каналов в бислое, экспериментальные данные по их проводящим, селективным и кинетическим свойствам, позволяйте рассматривать грамицидиновые каналы в качестве наиболее полно исследованной модели катион-селективных клеточных систем ионного транспорта (Andersen, 1984; Hladky, Haydon, 1984).

Особое внимание уделено вопросу о функционировании ансамбля грамицидиновых каналов. До недавнего времени поведение отдельных ^каналов предполагалось не зависящим от состояний соседних пор. Немногочисленные работы последних лет (SpiBnl et al., 1983; Stark et al., 1986), однако, указывают на появление качественно новых особенностей поведения каналов в ансамбле .- агрегацию в олигомерные структура, кооперативные перехода между состояниями.

В §2 первой главы рассмотрены аналогичные процессы в клеточных системах ионного транспорта. Проанализированы результаты экспериментов, в которых обнаружены множественные подсостояния проводимости клеточных каналов, проявляющиеся в дискретной форме выборочных распределений (Fox, 1987; Meves, Nagy, 1989). Рассмотрены возможные механизмы, приводящие к появлению дискретных уровней проводимости. Наиболее правдоподобной представляется модель канала-кластера (Гелетюк, Казаченко, 1990), предполагающая кооперативное или независимое функционирование нескольких проводящих пор, которые образуют ''одиночный канал".

§3 первой главы посвящен анализу явлений макроскопического квантования состояний в других физических и химических процессах (Удальцова и др., 1987). При измерениях флуктуаций скоростей химических и биохимических реакций, алектрофоретической подвижности клеток, времен спин-спиновой релаксации протонов воды, интенсивности а- и p-распада были обнаружены устойчивые дискретные формы распределений, построенных по малым выборкам. Проанализированы свойства макроскопичеких флуктуаций, проблема их объяснения и интерпретации.

В §4 первой главы на основе проведенного анализа литературных данных обсуждаются задачи исследования. Общим свойством всех рассмотренных систем является кооперативное поведение элементарных функциональных единиц, приводящее к устойчивости несостоятельных распределений величин флуктуирующих параметров. В этом эмпирическом смысле можно говорить о макроскопическом квантова-

нии состояний системы. В связи с тем, что конкретные механизмы такого квантования во многом не ясны, актуальной является задача феноменологического исследования на модельной система устойчивости и эволюции состояний во времени. Такое исследование требует разработки специальных статистических методов анализа несостоятельных гистограмм.

Состояния системы понимаются далее в феноменологическом смысле и идентифицируются по форме распределений величин флуктуирующего параметра (тока через БЛМ). Время устойчивости определенной формы гистограмм отождествляется с временем жизни системы в данном состоянии. Наличие воспроизводимого дискретного полигона частот означает выделенность определенных значений характеристики системы на данном интервале времени; при этом временная картина-реализации этих значений, очевидно, может быть совершенно произвольной.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ И ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

В §t второй главы описаны применявшиеся материалы и экспе-рименталыше ме то дики. Для получения плоских БЛМ использовали растворы в н-гептане и н-декане азолектина фирмы SIGMA (фосфати-дилхолин : фосфатидилзтанолвмин : фосфатидилинозит в вквкмоляр-ном соотношении). Каналы в ВЛМ формировали путем естественного встраивания молекул грамицидина А, В и С (препарат (£ирмы Boehr Inger Mannheim, Hamburg). В качестве электролита применяли 0,1 М и 0,2 М KCl, приготовленные из перекристаллизованной х.ч. соли. Опыты проводили при комнатной температуре, pH 7,4 (буферы Тг1з-НС1 и Trta-Base ффмы Stgma). Бислойнне мембраны формировали по методу Мюллера и др. (1962) на отверстии диаметром 0,5 мм в тефлоновой кювете, контролируя процесс по величине емкостного тока.

В §2 второй главы описаны метода регистрации флуктуаций ионного тока через ансамбль грамицидиновых каналов в БЛМ.

Для Наложения потенциала и отведения сигнала с мембраны использовали двухэлектродный метод с применением хлорсеребрянных электродов. Флуктуации мембранной проводимости изучали при наложении на мембрану постоянных напряжений в диапазоне 10-100 мВ. В "качестве предусилителя использовали операционный усилитель постоянного тока Kelttüey-427.. Верхняя частота среза фильтра в ра-

зтх опытах составляла 30 или 100 Гц. Для записи рядов с высоким временным разрешением установка была сопряжена с ЭВМ Роботрон СМ 1910. Оцифровка сигнала'осуществлялась 9-разрядным АЦП 47077/2. Максимально возможная частота оцифровки равнялась 17 кГц. Максимальная длина вводимого в ЭВМ ряда составляла 4-Ю5 точек.

Характерные емкости исследуемых мембран составляли 0,8-1,1 нФ, что соответствует площади бислойной части 0,10-0,15 мм2. В большинстве опытов БЛМ содержала Ю^Ю4 одновременно открытых каналов. Времена жизни БЛМ,.с которых производили автоматизированную запись шумов тока, лежали в пределах от 2 до 7 часов.

В §3 второй главы кратко рассмотрены процедуры рекурсивной и нерекурсивной цифровой фильтрации на основе фильтров Баттер-уорта и Поттера, а также метода скользящего среднего. Приведены формулы для вычисления и оценивания дисперсий спектральных характеристик случайных сигналов.

В §4 второй главы охарактеризованы современные методы многомерной непараметрической классификации. Приведены используемые метрики в признаковом пространстве и меры внутри- и мекгругаюво-го рассеяния. Описаны типичные алгоритмы кластерного анализа (Форель, метод ^-средних, адаптивные и иерархические процедуры).

В §5 второй главы проведено формальное описание метода главных компонент, предназначенного для снижения размерности признакового пространства. Обсуждаются метрические свойства получаемых ортогональных проекций.

В $6 второй главы рассмотрено использовавшееся программное обеспечение. Кратко проанализированы достоинства и недостатки существующих статистических пакетов. Необходимость работы с временными рядами в интерактивном режиме и другие специфические задачи исследования потребовали создания специального статистического пакета для работы с данными большого объема. Охарактеризованы его особенности как с точки зрения реализованных количественных процедур, так и в плане сервисных возможностей.

Глава 3. ПЕРВИЧНАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ И СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФОРМ РАСПРЕДЕЛЕНИИ (ОДНОМЕРНЫЙ ПОДХОД)

51 третьей главы посвящен предварительному анализу временных рядов - цифровой фильтрации и спектральному оцениванию.

Несмотря на применявшиеся экспериментальные меры, в зареги-

стрированных флуктуациях проводимости были заметны следа сетевых наводок (50 Гц и высшие гармоники). Для их устранения использовались низкополосныв и заградительные цифровые фильтры. Об удовлетворительном качестве фильтрации свидетельствовали оценки спектров мощности профильтрованных временных рядов. Вычисление автокорреляционной функции позволило исключить наличие вероятностных зависимостей в структуре исходных данных.

В §2 третьей главы рассмотрен основной количественный инструмент исследования - несостоятельные •гистограммные оценки плотности распределения. "Плохие" статистические свойства этих оценок не означают, как можно было бы думать, их бессодержательности. Напротив, оказывается, что свойство несостоятельности приводит к сохранению в выборочных распределениях той информации об объекте, которая пропадает в асимптотическом приближении.

Формально компоненты гистограммной оценки Рп&) могут быть записаны в виде :^

■рп,<*>"» — С (v.Crj/V.), I = 1,...,m (1)

;nl п (=1 1 1 1

где х = )'- выборка объема п, vl(xl) = 1 при xt « 1г и

Vj(x{) = о в противном случае; m - число интервалов группирования данных; Ij- 1-й интервал группирования; длина этого интервала. Для состоятельного оценивания плотности распределения генеральной совокупности, из которой извлечены данные, значение

я выбирают заметно меньшим объема выборки. При этом pn(î) будет сходиться по вероятности к функции плотности р(х) равномерно по х в случае стремления к нулю величин Vj при m .

Оценка теряет свойство состоятельности, как только ко-

личество интервалов группирования выбирается того же порядка, что и объем выборки (т < п); при этом форма полигонов частот характеризуется появлением нескольких максимумов и минимумов.

Все сказанное иллюстрирует рис. 1, на котором показаны несостоятельные гистограммы, построенные по соседним частям временного ряда флуктуаций тока длиной в 100 измерений.кавдв;, Укэ при визуальном рассмотрении можно заметить некоторое сходство форм отдельных выборочных оценок плотности.

• В §3 третьей главы сформулирована проблема построения критерия сходства форм несостоятельных гистограмм и показана неизбежность ограничения путей eè решения рамками непараметрического

ЛлЛ А

ж А Ж

Мл л ш

О 20 1

Рис. 1. Несостоятельные гистограммы ашиштуд флуктуации тока через ансамбль грамицидиновых каналов в БЛМ. В каждой гистограмме по 100 измерений. Шаг разбиения по оси абсцисс равен 0.8 пА.

уменьшении степени зависимости несостоятельных гистогракм: а -коэффициент дивергенции; б - метрика Бхаттачария; в - информационное расстояние Кульбака-Либлера.

подхода. Задача построения критерия сходства имеет два аспекта:

1) построение некоторой функции (статистики) выборочных значений случайной величины, порождающих данную пару гистограмм, такой, что она может служить мерой изменчивости формы распределений в этой паре. Необходимо потребовать, чтобы эта функция обладала достаточной степенью локальной чувствительности: ее изменения должны в какой-то степени отслеживать различия сопоставляемых распределений даже на небольшой части их носителей.

2) интервальное оценивание построенной статистики, позволяющее проверять с ее помощью гипотезу о случайности встретившегося сходства форм двух гистограмм с выбранным уровнем значимости.

В §4 третьей главы предложены новые критерии сходства форм несостоятельных гистограмм, основанные на метрических функционалах в пространстве плотностей распределения. Рассмотрены корреляционные методы анализа достоверности сходства распределений.

В качестве статистик для построения критерия неслучайности сходства (различия) форм гистограмм были выбраны: коэффициент дивергенции:

m I

J = Е In — (у.2/р,> (2)

<=1 у21 24

метрика Бхаттачария:

В = - Iii Е ^ У1 ty2l (3)

и информационное расстояние Кульбака-Либлера:

Ум .

<=1 " уг

где и 1уг- ординаты двух сравниваемых гистограмм,

т = ш1п(т1,«д). Величины (2) - (4) являются метриками в пространстве многомерных нормальных плотностей распределения с общей ковариационной матрицей. ' . '

§5 третьей главы посвящен методам непараметрическото интервального оценивания, используемым в критериях сходства форм не. состоятельных распределений, - рандомизации и бутстрепу.

Применительно к оцениванию достоверности сходства (или различия) двух гистограмм задача интервального оценивания сводится к следующему. Пусть имеется множество из N гистограмм, задаваемых векторами своих ординат .у = ....,уж)', и пусть степень '; сходства двух гистограмм оценивается'. с помощью одномерной стати-

стики Я(у.,у.). Для проверки гипотезы о неслучайности сходства гистограмм ук н у^ ,1 < < Н, необходимо оценить распре-

деление величины Л и определить, квкой квантили' соответствует значение этой статистики на паре (ук ,ук ).

В методе рандомизации значения Я вычисляют для каждой из В

= N(N-1)/2 возможных пар гистограмм, и полученное множество

отождествляют с генеральной совокупностью. Образуя из

величин (Я.) вариационный ряд Я. < Я. < ... < Я. и считая,

' *1 2 1В

что вероятности для каждого из интервалов (- — ;Я. ), (Я. ;Я, ),

...,(Я. ;—) равны 1/(В+1), в качестве оценки а-квантили распре-в

деления величины Я (у,,у.) берут Яп = Я. , где й = а(В+1). Огра-

ничешю метода состоит в требовании однородности выборки, по которой строились N перемешиваемых гистограмм.

Интервальное бутстреп-оценивание статистики Я(у1,у2), заданной на паре гистограмм (у1,у2), разбивается на три этапа:

1) построение выборочных распределений вероятностей Р. для

п.

-> 3

значений выборок х^ = )', ^ = Е у^» ^ = 1.2, пу-

тем назначения каждой из точек х}веса Переход

от ординат гистограмм к выборкам связан с требованием независимости и одинаковой распределенности (нор) случайных величин;

** » *

2) извлечение из Р бутстрап-выборок х^ = )': , ; нор * *

построение по ним гистограмм у} и у2 и вычисление значения

яф.у').

3) аппроксимация выборочного распределения величины Я бутс-

треп-распределением для Я* = Я(у1 ,у2,Р^). Последнее может быть получено повторением В2 раз случайного механизма (5) и построе-

нием гистограммы величин Я (у,' .у2'Я(у*1,у22,.^),...,

Я(у*в,у*в,^). Оценивание границ доверительных интервалов для

.Я(у1,у2) проводится аналогично методу рандомизации.

В §6 третьей главы рассмотрены результаты применения пред-

ложенных критериев сходства к анализу форм несостоятельных гистограмм амплитуд флукт'уаций тока через ансамбль грамицидиновых каналов в ЕЛЫ. Проведено сравнение метрических критериев меаду собой и с критериями, базирующимися на коэффициентах обычной и ранговой корреляции меаду ординатами гистограмм. Критически рассмотрены общие возможности одномерного подхода к анализу несостоятельных оценок плотности распределений.

Сопоставление разных методов включало два основных аспекта: 1) анализ локальной чувствительности критериев к небольшим отличиям распределений и 2) исследование устойчивости значений статистик и их распределений, оцениваемых различными способами (рандомизация, бутстреп). Сравнительный анализ метрических и корреляционных критериев был проведен на гистограммах, построенных по зависимым выборкам - перекрывающимся частям временного ряда. Степень перекрывания соседних частей лежала в пределах от О (независимые выборки) до 903. В последнем случае априорное отнесение двух гистограмм к категории сходных имело объективное статистическое основание.

Вычисление и последующее оценивание коэффициента дивергенции, значений метрик Бхаттачария и Кульбака-Либлера позволило в целом подтвердить статистическую достоверность наблюдаемого сходства зависимых распределений. Для соседних гистограмм значения указанных статистик в подавляющем большинстве случаев превышали 95Ж-ную квантиль; к соседним же гистограммам относились почти все значения, большие 9956-ной квантили. По мере роста сдвига к между выборками, порождающими гистограммы, значения коэффициентов убывали. При значительных сдвигах их изменения носили немонотонный характер. Поведение рассматриваемых величин для значений к от 1 до 500 иллюстрирует рис. 2.

В результате анализа нескольких массивов зависимых и независимых гистограмм выяснено, что наиболее надежные результаты (в смысле их близости между собой, воспроизводимости, при разных способах оценивания и достигаемой локальной чувствительности) дают коэффициенты дивергенции и метрика Бхаттачария.

Ограниченность одномерного подхода связана со значительной потерей информации на этапе перехода от двух гистограмм, содержащих по 30-60 ячеек, к одному числу - значению статистики. Исследование тонких деталей формы этих распределений возможно только в рамках многомерного подхода. Роль одномерных методов

при этом состоит в исследовании статистической достоверности результатов многомерного анализа. Несмотря на свою ограниченность, одномерные критерии оказываются более продвинутыми с точки зрения строгости производимых на их основе статистических выводов.

Глава 4. ТИПЫ ВЫБОРОЧНЫХ РАСПРЕДЕЛЕНИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ СОСТОЯНИИ АНСАМБЛЯ КАНАЛОВ (МНОГОМЕРНЫЙ ПОДХОД)

В 51 четвертой главы сформулирована основная идея многомерного подхода к анализу несостоятельных гистограмм, состоящая в их параметризации и дальнейшем отображении множества распределений в многомерное признаковое пространство. Изложена в общей постановке проблема выделения малого числа типов формы несостоятельных оценок плотности. Показана необходимость использования непараметрических процедур классифкации (кластерный анализ).

В §2 четвертой главы предложены два метода параметризации гистограммных оценок плотности распределения. - геометрический и основанный на оценивании характеристических функций.

Первый способ построения признакового пространства исходит из рассмотрения каждой гистограммы в качестве геометрической фигуры. Учет изрезанности ее формы базируется на понятии "пика" - ■ ординаты гистограммы, которая превосходит соседние ординаты на некоторое пороговое значение. Форму гистограмм характеризовали с помощью следующих 7 величин: отношение высоты гистограммы к ее ширине (числу ячеек); число пиков; средняя высота пиков; среднее расстояние между гаками; дисперсия расстояний между пиками; отношение длины ломаной полигона частот к его ширине; номер ячейки гистограммы, соответствующей первому пику. Значения построенных признаков лежали обычно в интервале от 3 до 6. В зависимости от использовавшегося набора параметров размерность признакового пространства составляла от 4 до 7.

Второй метод состоит в разложении по ортогональному базису в некотором функциональном пространстве; коэффициенты разложения , при этом являются компонентами вектора признаков для данной гистограммы. В качестве Оазисных была выбрана система тригонометрических Функция, что фактически означало применение к гистограмме дискротного косинус-преобразования Фурье:

ш-1 2%

Ш) = АХ £ у. соз(—(Й) - ■••№)

где - "Ординаты гистограммы , ш. - их число,. Ах - шаг .по оси об-*

сцисс (полагавшийся равным единице), к изменяется от О до целой части числа т/2, У(к) - значения Фурье-образа. Преимущество системы тригонометрических функций перед ортогональными полиномами заключается в очевидности интерпретации получаемых коэффициентов разложения: амплитуды "гармоник" У(й) определяются максимумами (модами) и минимумами полигонов частот, а также отражают расстояния между ними. С теоретико-вероятностных позиций Фурье-образ от плотности распределения представляет собой оценку характеристической функции случайной величины. Для параметризации гистограмм использовалась часть величин У(к); сформированное признаковое пространство имело размерность от 6 до 9.

§3 четвертой главы посвящен выделению характерных типов формы несостоятельных гистограмм методами кластерного анализа. С использованием обеих параметризаций и 16 различных алгоритмов неиерархической и иерархической классификации доказано существование малого числа (порядка 10) типов формы маловыборочных распределений. Проведено сопоставление разных процедур классификации. Использование нескольких оценок качества разбиения позволило подтвердить достоверность полученных результатов.

Непараметрическая классификация типов распределений, построенных по малым выборкам, осуществлялась на массивах зависимых и независимых гистограмм объемом в 100-200 распределений. В большинстве случаев использовалась обычная евклидова метрика. Качество получаемых разбиений оценивалось по формальным критериям (доля объясненной дисперсии, точечно-бисериальный коэффициент корреляции, вычисление внутри- и межклассового разброса данных) и путем сопоставления результатов классификации одного и того еэ массива разными методами.

Содержательный результат классификации состоял в выделении 8-12 классов в массивах из 100-200 гистограмм. Группы, получаемые в неиерархических алгоритмах, как правило, соответс«воваям определенным уровням дендрограммы. Кластеризация зависимых гистограмм свидетельствует о существовании скачкообразных измененна типов формы распределений (и, соответственно, состояний системы). Нетривиальным результатом явилось обнаружение возвращение системы в уже "встретившиеся" состояния через достаточно короткие промежутки времени. Такие возвращения, как правило, охватывают несколько подряд построенных гистограмм, что подтверждает их неслучайность и оправданность их физической интерпретации как

эволюционирования система между конечным числом ее состояний.

Доля объясненного разброса данных в случае зависимых распределений составляла 80-90Я, точечно-бисериальный коэффициент корреляции принимал значения от 0,55 до 0,75. Получаемые классы, как правило, обладали максимально возможной компактностью (являлись сгущениями). При анализе независимых распределений все указанные особенности структуры исследуемых данных также имели место, однако качество разбиений (как в формальном смысле, так и с точки зрения их воспроизводимости) было хуже.

Анализ типов зависимых распределений выявил группу алгоритмов, даицих близкие разбиения исходной совокупности, которые к тому же оказались устойчивыми к варьированию (в ограниченных пределах) начальных параметров. Сюда относятся разные варианты алгоритма й-средних, алгоритм Пульсар и алгоритмы иерархической классификации, использующие взвешенные процедуры объединения классов. Сопоставление результатов применения двух методов формирования признакового пространства позволило отдать предпочтение Фурье-параметризации, которая точнее отслеживает изменения формы гистограмм.

В §4 четвертой глава в многомерный анализ форм гистограмм введен фактор времени. Основная цель состояла в исследовании переходов системы между различными состояниями, выделенными средствами непараметрической классификации.

Количественный анализ случайных блужданий в многомерном признаковом пространстве проводился при помощи производной от натуральной координаты:

8*Ш » 1а(1+1) - 8{г))/% = <a{u(t+т),u(t)) (7)

где и(П - точка в признаковом пространства, соответствующая гистограмме, полученной в момент времени *,<!(.,.)- выбранная метрика. Временной сдвиг т отражает степень зависимости двух распределений.

Типичное поведение величины а'(*) для евклидовой метрики иллюстрирует рис. 3. На фрагменте За показан случай независимых распределений: % = ЯТ, где № ~ число измерений в гистограмме, Т - время дискретизации сигнала. Вариант с а = Т отражен на рис. Зб. В последнем случае основную часть времени производная натуральной координаты слабо флуктуирует около нулевой величины; но фоне этих фдуктуаций возникают заметные всплески, так что значение а' может увеличиваться на 3 порядка. Характерно., что гистог-

Рис. 3. Изменения производной от натуральной координаты во времени для Фурье-параметризациа и евклидовой метрики при 1 » ИТ (а), а = Г (б). В какдой гистограмме N = 100 измерений. Размерность признакового пространства равна 8.

раммы, отвечающие разным всплескам, обычно являлись статистически независимыми.

Промежутки между всплесками могут соответствовать как длительному нахождению точки-гистограммы в локальных областях (устойчивые состояния), так и медленным движениям по всему признаковому пространству. Определенность в картину случайных блузда-ний может быть внесена визуализацией многомерных траекторий.

В 85 четвертой главы представлены результаты визуализации случайных блужданий системы в многомерном признаковом пространстве, полученные методом главных компонент. Показано существование локальных областей, соответствующих устойчивым состояниям ансамбля грамицидиновых каналов, и оценены характерные времена такой устойчивости.

Основная идея построения главных компонент состоит в таком повороте исходных осёй признакового пространства, что в новых координатах рассеяние данных вдоль й-й оси больше рассеяния вдоль (й+1)-й. Анализ устойчивости и эволюционирования типов не-

Рис. 4. Траектория для 140 сильно зависимых гистограмм в подпространстве первых трех главных компонент для Фурье-параметризации и евклидовой метрики. Сплошными линиями обведены локальные области, отвечающие устойчивым состояниям ансамбля каналов.

состоятельных распределений ограничивался трехмерным подпространством главных компонент: в случае 6-мерного признакового пространства доля объясненной дисперсии составляла обычно 80-85%, для 7-мерного - 75-80$, для 9-мерного - около 70%.

На рис. 4 представлена типичная траектория точки-гистограммы в подпространстве трех главных компонент для массива из 140 сильно зависимых гистограмм. Отчетливо проявляются пространстнонные структуры,' соответствующие разным типам формы (обведены сплошными . линиями).. : Анализ траектории показывает, что указанные области отвечают устойчипым¡-состояниям '¡системы; вместо беспорядочных скачков можду областями наблюдается продолжатель-

ная локализация системы в каждой из них. При этом на основе проведенного анализа можно' утверждать, что с большой вероятностью и во все промежуточные моменты времени траектория находится в пределах данной локальной области.

Огрубление временного масштаба при переходе к независимым распределениям приводит к тому, что на диаграммах рассеяния боковые области устойчивости, отделенные от основного скопления, встречаются pese. Периферийные точки отвечают скачкообразным участкам траектории; в "лучшем" случае две-три такие точка составляют боковую группу вне основного ядра. По мере роста числа анализируемых независимых гистограмм количество разных локальных областей устойчивости увеличивается приблизительно как J/1 /2, где И - число элементов в совокупности. Это означает, что при огромном теоретически возможном числе разных несостоятельных гистог-ремм количество характерных типов их форш оказывается малым. Локальные устойчивые области соответствуют наиболее кокотактным и • воспроизводимым в разных алгоритмах классам, которые получаются в кластерном анализе. По одномерным критериям соотвэтствущиа распределения оказываются сходными с 1-556-ми уровнями значимости.

Введение натуральной координаты в признаковом пространства и визуализация траекторий позволили оценить времена жизни устойчивых состояний. Для а = 1 оценивались времена At{ между двумя соседними выбросами величины a*(í). Кроме того, для различных т вычислялась автокорреляционная функция процесса a'(í). По траекториям в подпространстве главных компонент оценивалось время непрерывного пребывания в докалышх устойчивых областях. В результате анализа нескольких массивов распределений с разной степенью зависимости для времен устойчивых состояний была найдены три характерных величины tyCT%: 1-2, 5 и 9 с, которые оказались слабо зависящими от частоты оцифровки и параметров обработки дгшых.

В §6 четвертой главы обсуждаются результаты исследования как с точки зрения проблемы макроскопического квантования состояний различных систем (гл.1), так и в плане особенностей многомерных методов анализа несостоятельных гистограмм. Кратко рассмотрены возможности развития данного направления исследований.

Основным результатом анализа флуктуаций тока через БЛЫ явилось обнаружение небольшого числа устойчивых состояний исследуемой системы, а также получение оценок их времен жизни. Практнчв-

скн все обсуждавшиеся результаты относились к малым ансамблям. Общее число мономеров в БЛМ составляло, по оценкам, 104 - Ю5 молекул, что приводило к наличию 30 - 300 одновременно открытых каналов. Устойчивость распределений амплитуд флуктуаций на временах, превышающих время жизни одиночного открытого канала (около 1 с), позволяет видеть в ней возможное отражение коллективных процессов. Интервалы между выделенными значениями тока, т.е. мезду "пиками" на гистограммах, также были в несколько раз больше величины тока через одиночный канал.

Коллективные процессы могли бы, в принципе, явиться причиной появления устойчивых полимодальных распределений на малых выборках; времена жизни кластера из грамицидиновых димеров в открытом состоянии соответствовали бы в этом случае временам устойчивости состояний (5 и 9 с). Эволюцию распределений можно рассматривать как отражение фактов распада каналов-кластеров и « появления новых агрегатов. Следует отметить, однако, что при отсутствии надежных количественных характеристик кооперативных процессов в системах грамицидиновых каналов выдвижение сколько-нибудь развитой гипотезы о механизмах, обеспечивающих устойчивость состояний ансамбля, не представляется возможным.

Это положение остается справедливым и при обращении к проблематике макроскопических флуктуаций. Основной интерес представляло введение фактора времени в исследование несостоятельных гистограмм и последующий анализ устойчивости и эволюционирования типов распределений. Обнаружение серий сходных зависимых распределений величин флуктуаций мембранной проводимости представляется нетривиальным результатом. Форма этих распределений, как выяснилось, не эволюционирует непрерывно, а обладает определенной устойчивостью на ограниченных временных интервалах. Смона типа формы (а, значит, и состояния системы) происходит скачкообразно.

Разработанная техника анализа гистограмм, построенных по малым выборкам, имеет и самостоятельное значение. Одно из очевидных ее приложений - изучение подсостояний проводимости клеточных иошшх каналов, в частности, надокная идентификация разных подуровней при недостаточно шеоком отношении сигнал/шум. В 80-е годы было предложено несколько процедур,"'улучшающих разрешахлцую способность .'.в';.'Определении 'подуровней Ваеапу, 1986;

РаИак, 1968).' -Их недостатками являются .непостоянная . точность, оценивания, . жёсткие требования к- параметрам'.' ъорзбатшаемн* иумон;

тока и др. Многомерные метода анализа момю использовать в качестве альтернативы указанным процедурам.

Вторая проблема, примыкающая к рассмотренной, состоит в описании изменений числа и характеристик отделышх подуровней (при инактивации, в результате действия блокаторов), что требуот явного введения фактора времени в исследование форм несостоятельных распределений. Надеяные количественные процедура для этих целей в настоящее время отсутствуют. В их качестве могян бы выступить; многомерные методы анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ВЫВОДУ

1. В ходе исследований флуктуация калиевой проводимости ансамбля грамицидтюЕых каналов, встроенных в бислойную лштадную мембрану, показано существование устойчивых несостоятельных гистограмм амплитуд флуктуация, построенных по малым выборкам.

2. Разработан непарамэтрическнй критерий сходства фор! гн-стогра).^, основанный на использовании нетричеюсих функционалов в пространстве плотностей распределеш1я. Применение построенного критерия и современных методов интервального оценивания (рандомизация, бутстреп) к несостоятельным гистограммам позволило подтвердить статистическую достоверность их сходства с уровнем значимости не более Ь%.

3. Разработан многомерный подход к исследованию выборочных распределений и способы параметризации гистограмм, исходящие из их статистического описания как геометрических фигур и из оценивания выборочных характаристичеасих функций. Проекционный ц метрический анализ рассеяния точек-гистограмм в признаковом пространстве подтвердил преимущество предложенного формализма перед одномерными методами.

4. С помощью неиерархических и бинарных агломеративных методов кластерного анализа осуществлена непараметрическая классификация типов формы распределений, возникающих на малых выборках. Показано, что в длительных (0.5 - 1 мин) измерениях проводимости одной и той же мембраны реализуется до 10 типов фора гистограмм.

5. С помощью современных методов снижения размерности проведена визуализация случайных блужданий системы в многомерном

признаковом пространстве. При анализе фазовых траекторий в подпространстве главных компонент обнаружено существование локальных областей сгущения, отвечавдих устойчивым состояниям системы. Характерные времена нахождения системы в этих состояниях составляют 1-2, Б и 9 секунд, что соответствует диапазону времен функционирования грамицидиновых каналов и их агрегатов в БЛМ.

6. Проведенное .исследование флуктуаций проводимости ансамбля грачшцидановых каналов в БЛМ позволяет считать, что обнаруженная устойчивость состояний системы обусловлена, в первую очередь, протекающими в ней внутренними физическими процессами. В качестве возможного механизма, приводящего к воспроизводимости форм распределений величин проводимости, рассмотрены процессы кластерообразования в системе грамицидиновых каналов.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Удальцова Н.В., Бодрова Н.Б., Шноль С.Э., Иванов П.С. Оценка сходства формы гистограмм, построенных по малым выборкам. В сб.: Тез. докл. 3-й Всес. конф. "Перспективные методы планирования и анализа экспериментов при исследовании случайных полей и процессов". Гродно, 1988, Ч. 2, с. 155-156. .

2. Бодрова Н.Б., Удальцова Н.В., Иванов П.С., Шноль С.Э. О неслучайности формы "несостоятельных" гистограмм. Препринт. Пу-щино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1989, 32 с.

3. Иванов П.С. Макроскопические флуктуации фоновой проводимости бислойных липидных мембран. В сб.: Тез. докл. Всвс. совещания-семинара "Инженерно-физические проблемы новой техники". Москва, Изд. МГТУ, 1990, с. 144-145.

4. Иванов П.С., Бутлин A.A. Ионные каналы как модель кооперативной биологической системы. В сб.: Доклады Мехд. научно-технической конф. "Актуальные проблемы фундаментальных наук". Москва, Изд. МГТУ, 199J, т. 3, с. 23-26.

5. ButylIn A.A., Ivanov P.S. Antiviral drußs / lipid membranes Interactions. In: 1st Arab conference on medical biophysics. Abstracts. Cairo Univ. Press, 1991, p. 28.

ИЗШОЗ ПАВЕЛ СЕРГЕЕВИЧ

УСТОЙЧИВОСТЬ СОСТОЯНИИ

Уч.изд.л.1,3 Тира* 100 Заказ 185

Ротапринт МАСИ/ЪТУЗ-ЗИЛ/, 109280,Москва,Автозаводская,16