Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ионных потоков при индуцированном транспорте катионов через модельные и клеточные мембраны

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ионных потоков при индуцированном транспорте катионов через модельные и клеточные мембраны"

2-772

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АН СССР >

На правах рукописи УДК 577.352.2

ЩАГИНА Людмила Владимировна

ВЗАШСДЕПСШШ ИОННЫХ потеков ПРИ ШЩЦИРОВАННШ ТРАНСПОРТЕ ШИПОВ ЧЕРЕЗ МСЦЩЫЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ Ш-ШРАШ

03.00.17 - цитология 03.00.02 - биофизика

■ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в Зорма научного доглада

Л<ЭНИНГраЯ 1569

№

N от с^ ж С?.

С/Ги^ш ¿¿Ми 7 /ф

Работа выполнена в Лаборатории физической химии кпеточнш мембран Института цитологии АН СССР.

Официальные оппоненты:

- член-корроспондент АН СССР, доктор химических наук, профессор Ю.АЛизшоаев

- доктор биологических наук, профессор И.А.Скульский

- доктор биологических наук Т.Н.Игнатова

Ведущая организация - Ленинградский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова АН СССР

Защита состоится в " ___ 1989 г. в_час

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 Институт£ цитологии АН СССР по адресу: 194064 Ленинград, Тихорецкий просп., д.4.

С диссертацией мшю «знакомиться в библиотеке Институт цитологии АН СССР.

Автореферат разослан " " ....... 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Л.Н.;шсар1

Институт цитологии АН СССР

- 3 -

ОЩАЧ ХАРЖКШЛЖА РАБОТЫ

Актуальность теш. Сопряжение потоков частиц различных видов (потоков ионов, ионов и молекул неэлектролитов) при их переносе через плазматические мембрана клеток и мембраны внутриклеточных органоидов является одним из фундаментальных явлений, определяющих закономерности функционирования систем активного и пассивного транспорта в уявнх клетках. Механизмы поступления в клетки субстратов я удаления продуктов метаболизма, гомеостати-ровшгая ионного состава гиалоплазмы и внутренней среды клеточных органоидов теснейшим образом связаны с взаимодействием (сопряжением) потоков в мембранных транспортных системах. Несмотря на огромный литературный материал, посвященный феноменологии сопряжения потоков (в частности, ионных потоков), определению стехиометрии противоположно направленных потоков рг'ишчных ионов (сощиег^апзроП;) и сочетанных потоков частш^ в одном направлении (сс^гапзрог-ь), физические основы этого^ принципиально важного биологического явления до настоящего времени остаются практически неизвестными. Б значительной степени это обусловлено трудностью проведения точных количественных определений параметров, характеризующих взаимодействие трансмембранных потоков. Для получения наде:.-шых результатов, позволяющих выяснить принципы механизмов сопряжения, совершенно необходимым яштется широкое варьирование условий эксперимента, что в случае крайне лабильных клеточных мембран не представляется возможным. Это обстоятельство заставляет обращаться к мбделыщм системам и, ¿ частности, к бимолекулярным липидным мембранам в введенными в них веществами-каналоформерами. По раду показателей (скорости движения ионов, водной проницаемости, сопряжению ионных ¿ водных потоков и др.) такие системы могут рассматриваться как достаточно адекватные «одели клеточных мембран. - » .

К моменту начала нашей мботы в лгиторяфуро отсутстзовглн данные, касапциеся. сопряжения иокннх потоков в модельных системах. Наш была разработана методика, с Помощью которой было об-тружено и количественно охарактеризовано взаимодействие встреч-1ых ионных потоков в каналах, индуцированных антибиотиком-канедо-Ьормером грамицидином А в модельных лййвдных бислоях. Эти первые

исследования /Щагина и др. ,1978/ показали сходство грамицидино-вых каналов с калиевыми каналами клеточных мембран /Hodc:tin, Keynes,1955/ в отношении взаимодействия потоков ионов, что убедило нас в правильности выбора модели и принятого подхода к исследованию эффектов сопряжения ионных потоков. В основу этого подхода мы положили одновременное измерение изотопных и электрических параметров транспортных систем, сопоставление которых позволяет в ряде случаев делать выводы о свойствах системы без привлечения тех или иных модельных представлений. О наличии сопряжения трансмембранных потоков частиц можно судить по отклонению от единицы показателя п± В уравнении Уссинга-Ходакина-Кейнеса:

Ф^/Ф^ = (0^ /С^* exp (zjVn^/RT) (I)

где > - встречные потоки ионов i через мембрану; с^ , с^ -концентрации ионов сорта 1 по обе стороны мембраны; zi - заряд иона; V - трансмембранная разность потенциалов; р - число Фара-дея; R - универсальная газовая постоянная; т - абсолютная температура.

Результаты современных теоретических исследовании позволяют ввделить два случая отклонения значений показателя п± от единицы. Случай, в котором пА<1, относят к явлению обменной диффузии и трактуют в рамках представлений о транспорте, осуществляемом с помощью подвижного переносчика /Маркин, Чизмаджев,1974/. Величины п^ >1 считаются характерными для переноса ионов по трансмембранным ионным каналам, причем наиболее наглядной моделью такого транспортного механизма является так называемая однорядная диффузия /Нао1шаш1,1972/. Для того, чтобы убедиться в предсказательной силе транспортного параметра ni представлялось целесообразным в сходных условиях определить значения ni для случаев трансмембранного переноса ионов, индуцированного введением . в бисяойные липиднне мембраны антибиотика валиномицина, который принято считать подвижным переносчиком, и грамицидинаА, наиболее полно к настоящему времени изученного ващества-каналоформера. И если исследования на модельных системах - липвдных бислоях открывали возможность использования широкого диапазона эксперимен-

тальных условий, то последующее сопоставление результатов модельных опытов с данными, полученными при действии тех же модификаторов на мембраны живых клеток (эритроцитов человека), позволило приблизиться к пониманию транспортных процессов в этих объектах.

Цель и задачи исследование» Основной целью работы бшго детальное количественное изучение взаимодействия ионных потоков в транспортных системах, образованных введением в липидные бислои и клеточные мембраны веществ-модификаторов ионного транспорта» используемых в современных биологических исследованиях в качестве так называемых "химических инструментов".

В число задач входили следующие: I. Разработка методики количественных определений встречных потоков через бислойные липицные мембраны. 2. Обнаружение и исследовсгие взаимодействия встречных потоков ионов при индуцированном мембрано-активными антибиотиками транспорте катионов через искусственные липвднна бислои и эритроцитарные мембраны в зависимости от ионного состава среды: концентрации, вида и соотношения присутствующих в окружающих мембраны растворах катионов щелочных металлов. 3« Изучение кинетики каналойормерной активности антибиотика грамицидина А и ее зависимости от липидного соотара мембран. 4. Разработка общих представлений о механизмах каналоформерного эффекта грамицидина А.

Научная новизна -работы. Впервые систематически исследовано взаимодействие ионных потоков в строго детерминированных мембранных системах о использованием методов одновременного определения массопереноса и электрохимических транспортных параметров.

Впервые на модельных бимолекулярных лшщдных мембранах, кодифицированных валиномицином, получены непосредственные докаг-зательстьа существования явления обменной диффузии.

Впервые обнаружено влияние ввда проходящих по грамицидиво-вым каналам катионов на характеристики взаимодействия встречных ионных потоков и катионнуто избираНельность этих каналов.

.Впервые показана эволюция свойств грамицвдиновых каналов в модельных и эритроцитарннх мембранах (их "инактивация"). Доказана зависимость такого рода инактивации от стерольного состава мембран.

Научно-практическая значимость работы заключается в получении результатов, необходимых для фундаментальных исследований транспортних процессов в клеточных мембранах. Развитые в работе подходы позволяют устанавливать и количественно характеризовать механизмы индуцированного транспорта ионов через модельные и клеточные мембраны. Результаты работы обосновывают эффективность использования модифицированных мембрано-активными антибиотиками ■ искусственных липцдных бислоев для моделирования пассивного ионного транспорта в клеточных мембранах, Пояученнпе в работе результаты послужили основой для ряда теоретических моделей мембранного транспорта /Айтьян,1986; Kohler,I987/, Разработанный штод определения потоков веществ через бислойные липидные мембраны большой площади используется исследователями у нас в стране и за рубежом, в частности, для изучения сопряжения противогра-диеитного переноса ионов с активностью ферментов энергообеспечения транспорта. Результаты работы могут быть использованы d био-химичесглх и биофизических исследованиях процессов, происходящих • т. клетках и связанных с потоками ионов через клеточные мембраны. Результаты работы используются в курсах лекций по биофизике в Л1У, ЛПИ, в учебном процессе Медицинского университета Г.Будапешта /ВНР/, а также использованы в монографиях: А.АЛев "Моделирование ионной проницаемости клеточных мембран", 1976; B.Hille "Ionio channels in exitable membranes",1984.

На защиту выносится;

1. Новая методика исследования взаимодействия потопов ионов в модельных мембранных транспортных системах, основанная на сочетании измерения параметров массопереноса и злектрохишчесглх характеристик.

2. Доказательство зависимости свойств трансмембршшых ионных каналов от состава протекающего по ним потока ионов различных видов. Задвигается представление о том, что свойства ион-траиспор-тирующих оиотем определяются взаимодействием каналоформера с формирующим мембрану липздом и движущимися по транспортной системе ионами.

3. Доказательство протекающей во времени и зависящей от л жидкого состава мембран эволюции Каналоформерной активности грамицидина А - выявление стерод-завиоимой шахтивации канатоТ-ор-.:ера,

проявляющейся в уменьшении проницаемости модифицированных антибиотиком мембран.

Апробация -работы. Основные результаты работы были доложены или представлены на: Всесоюзных конференциях "Биофизика мембран" (Паланга, 1972,1973,1974), 21-м Ежегодном совещании по ядерной спектроскопии и структуре ядра (Киев,1972), 4-м и 5-м Международных биофизических конгрессах (Москва, 1972; Копенгаген,1975), 3-м и 4-м Всесоюзных биохимических съездах (Рига,1974; Москва, 1981), Научной конференции Института цитологии АН СССР (1974), семинаре Всесоюзного биохимического общества им.Д.И.Мевделеева "Биологические мембраны и физико-химические аспекты их функционирования" (Ленинград, 1975,1976,1977,1980,1981,1982), Международной конференции "Переносчики и каналы в биологических системах" (Нью-Йорк,1975), Зимних школах ЛШФ "Биофизика мембран" (1975,1980), 2-м Советско-американском симпозиума по биомембранам (Киев,1978), Международном симпозиуме "Энергетические аспекты мембранного транспорта" (Сегед,1978), Советско-финском совещании по проблемам "Биохимические аспекты структуры и функций ядерных и цитоплазматических мембран" (Ленинград,1979), 3-м Советско-шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" (Тбилиси,1981), Научных конференциях стран-членов СЭВ и СФНО по проблемам биофизики мембран (Смоленицы,1981; Балатонферед,1983; Эйзенах,1985; Москва,1987), Научных совещаниях Венгерского биофизического общества (Будапешт, 1981,1983,1987,1988,1989; Дебре-цен,1985; Шумег,1985), Рабочих совещаниях по биоэлектрохимии (Пущино,1983,1985; Рига,1986; Ленинград,1987), Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Таокент.1983; Рига,1988), Научной сессии па фазовым превращениям (Будапешт,1984), II-м Международном симпозиуме "Структура и функции яритронитарных мембран" (БерлинЛ986). 12-м Всесоюзном совещании "Ионный гомеостаэ и влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность клеток" (Иркутск,1987), Советско-западногерманском симпозиуме "Возбудимые мембраны" (Киев,1987), Международном симпозиуме "Структура и функции молекул, влияющих на свойства клеточных мембран" (Пария, 1987), 4-м Международном сишозкумя "Биоэлектрохимия сегодня и завтра" (Москва-Суздаль,1983), Всесо-

юзном симпозиума "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг,Х989), Кустовом научном семинаре Института цито-.логии АН СССР (Ленинград,1989).

Объем и структура работы: Для защиты диссертации представляется совокупность работ: 35 публикаций, в их числе 19 в отечественных и 16 в международных изданиях.

II. МАТЕРИАЛУ И 1.ШТСЙШ ИССЛЕДОВАНИЯ

Измерение потоков ионов через модельные липиднке мембраны

Плоские липидные пленки !Люллера Д962/, площадь которых не превышает 0.1 см2, оказались малопригодными для измерения изотоп ных потоков ионов 1а группы, поскольку коэффициенты проницаемости лишдашх бислоев, исходя из их проводимости на постоянном токе в 0.1 1.1 растворах хлоридов щелочных металлов (Ю~э - Ю-"^ См-см-2), доданы тлеть значения Ю-^ - Ю-12 см/сек. При малых скоростях перехода метки частиц 1 из одного объема б другой, разделенных мембраной, увеличение удельной активности метки в объеме V за время дг определяется уравнением:

дЯ* - р* <(0) Э л*/у (2)

Эффективность измерения л и*, при данном изотопном коэффициенте проницаемости ^ во- растает с увеличением удельной активности изотопа н.ц0) , площади мембраны Б и интервала времени лt. Нами установлено, что липидные бпслои быстро разрушаются при удельных активностях радиоизотопа превышающих 3 МБкчлл-1. Поэтому необходимо б;ио обладать методом формирования долгогдвущих бисло:шых липвдннх мембран, значительно превосходящих по площади мембраны Миллера.

' Ми использовали.идею Янга /1972/ создания одглочных сферических липпдкнх бислойных "е:.:бран. Разработанн;:;': наш метод позволил получать большие сферические фос-"ол;ш:1дк1:е бпслои, площадь которых достигала 2.5 см2, а гремя :хзнн доходило до 50 чр.соб /12/. Это дало созмогзюсть кадегпно измерять истоки изотопов исков, сблгдшцях т.-.глк:~: коэУицг.екте:.::: проницаемости, и на

одной мемс^ане проводить серию опытов по определению потоков в различных условиях. Схема установки приведена на рио.1а.

12

ш.

Т]—пи—пгц

I

у///////////////,

-8 -9

-10 -11

Рис. 1а. Схема установки для измерения изотопных потоков через липвднне бислои большой площади. Описание в тексте.

Липидная сфера (I) фор;,тировалась и удерживалась на торце стеклянного капиляра (2) с внутренним диаметром 0.8-1.0 мм и внешним дишлигро;.! 8-12 Каппл.члр припаивался к калиброванной стекляшюй трубке (3), соединенной со шприцем (5). В трубку (3) набирался раствор, содержащий радиоизотоп исследуемого иона (внутренний раствор). ^ембранообраэуиций литщшя раствор ( 0.02 ш) набирался в капилляр, и капилляр опускался в кварцевую кювету {И), содержащую тот пе по ионног.г/ составу водный раствор без радиоизотопа (вкеанй! растяор). С потсльг япртга (?)

сначала раствор липвда, а затем и водный раствор из стеклянной трубки медленно выдавливались во внешний раствор: в результате внутренний раствор оказывался окруженным сферическим слоем липи-да, который самопроизвольно за 30-40 ыш. превращался в бислой. Внутрь стеклянной трубки (3) и в кювету (8) помещались хлорсе-ребряные электроды <6,7), соединенные с электрометром (13), самопишущим потенциометром <14) и источникам регулируемого напряжения (15). Термостатирование осуществлялось с помощью латунной рубашки (9), соединенной о термостатом. Все опыты проводились при температуре 27¿I0C. Раствор в кювете интенсивно перемешивался с помощью шаянного в полиэтиленовую трубочку магнита (10), приводившегося в движение магнитной мешалкой (II). Замена внешнего раствора во время опыта осуществлялась через помещенные в кювету стеклянные трубки (12), соединенные с перистальтическим насосом. Удельная активность радиоизотопов внутри липвдной сферы не превышала 2 МБк »шТ*. Для определения скорости выхода радиоизотопа во внешний раствор из него кагдые 20-30 мин. брались определенного объема пробы, в которых измерялась радиоактивность. Для сохранения постоянства объема внешнего раствора после взятия проб в него добавлялся тот же объем раствора без радиоизотопа. Испарение воды из кюветы компенсировалось систематическим добавлением в нее предварительно определенных объемов дистиллированной воды. Измерение Р - активности проб проводилось на f -счетчике Mark-2 или Bookman фирмы Nuclear Chicago. ¡f -активность определялась с помощью изготовленной наш установки, работающей при необходимости в режиме измерения Y - У совпадений. Радиохимическая чистота использованных препаратов проверялась с помощью / -спектрометра высокого разрешения /I/.

МембранообразупциЦ раствор имел следующий состав: 1.33% общего липида мозга быка + 1.33!? холестерина (по весу) в смеси растворителей: хлороформ, метанол, тетрадекан, взятых в объешых отношениях 4:2:3. Липвды экстрагировали из белого вещества головного мозга быка по методу Фолча без сущаствонних модификаций.

Модификация липвдного бислоя антибиотиком проводилась после почернения мембран (образования бислоя). Для модификации во внешний раствор электролита вводилось 0.05 г,и раствора антибиотика в этиловом спирте до коночной концентрации его Ю~й-1С~е и.

- II -

3 контрольных опытах было показано, что введенив во внешний раствор такого же объема этилового спирта не изменяет проницаемости мембран для измеряемых изотопов. В случае Модификации бислоев грамицидином А проводимость мембран падала во времени. На протяжении опыта проводимость бислоев подчеркивалась постоянной путем введения дополнительных количеств грамицидина А во внешний раствор.

Во время опыта измерялась удельная проводимость мембран на постоянном токе (0о)и потока катионов по выходу радиоизотопа (Ф1 )при различных значениях V .

а0 = (д1 /9 (3)

=■ 0А V / дъ Э (4)

3 этих выражениях I - ток,, протекающий через мембрану, при раз-юсти потенциалов на ней )Р , V -объем внешнего раствора, а^ -концентрация "холодного" изотопа в растворах,. окружающих мэмбра-1у. Величина обратного потока метки через бислои (из внешнего заствора во внутренний) в наших экспериментах была пренебрежимо нала: отношение удельных активностей радиоизотопа во внешнем и знутреннем растворах не превышала величину 10"^. Для примера же .16 показывает изменения потоков 8бш> в зависимости от раз-юсти потенциалов на модифицированной мембране.

Рис.16. Зависимость потока иъ-86 от трансмембранной разности потенциалов. Мембрана модифицирована грамицидином А и разделяет растворы

и» - 6.9.Ю-6 отГ^стГ2. ¥ 7

и(о) = 4.2«10 ишДтин,

й я. 1.9 С1Л2.

100 500 900 1;, МИН

- 12 -

Вое эксперименты проводились в симметричных по концентрат ям хлоридов одновалентных ионов условиях: с^ = с^ и г1=1. Для этих условий уравнение Уссинга-ХсдЕкина-Кейнеса принимает вид:

/ « ехр Ы^) (5

Здесь величина У выражена в единицах Р/ит, В опытах измеряли-потоки ионов одного направления (выходящие из объема, ограниче: ного сферической мембраной). Однако, потоки, измеряемые при ра ных по величине, но противоположных по знаку разностях потонци алов на мембране (£ V), эквивалентны выходящим и входящим пот кам, соответственно: . Одновременное измерени

электрических и изотопных характеристик мембран дало возможное находить значения п1 различными способами. Кроме уравнения (5) в работе Ходакина и Кейнеса /1955/ дано определение п1 при У7

п1 а р1£/ Р1 (

Здесь р±е - электрический коэффициент проницаемости:

ъ, КЕ

г.,- - -р--V

1 С^

Р1"1 - изотопный коэффициент проницаемости, определяемый по фо] муле (2); - число переноса иона 1. Измерение встречных пото ков позволило находить величину нетрадиционным способом:

Мы показали, что для липидных бислоев, модифицированных валинс мицином и грамицидином А, величины п^, определяемые с помощью уравнений (5) и (6), не различаются /22/. Это обстоятельство позволило нам при обработке экспериментальных данных усреднять величины аА и полученные о помощью уравнений (2-8) и вывес ряд дополнительных формул:

* Е&есь и в дальнейшем предполагается, что потоки и токи : выражены в одних единицах.

*i ■ Pi* ciln(1 + хч^С)/г

ч -f^texp - O/Pj,* 0iy? (10)

1спсдьзуя уравнения (9), (10) и их аналоги, мн определяли веЛй-шнн ti и п± из результатов изтрения изотопных потоков при аобых двух значениях токов или потенциалов. Расчет величин ^ i с использованием иррациональных уравнений типа (9,10) проводился с помощью ЭШ Ш-14-20.

Измерение потоков катионов через модийишгоованнке. антибиотиками эритроцитарные мембраны

Систему симметричную по концентрации одновалентных катионов ! обеих сторон мембраны клеток получали в результате 3-х кратной >тмывки эритроцитов в растворе следупцего состава: 130 tiM kci; ¡0 Ш Ыасх , 2.5 мМ caci2, I ъМ MgCi2', 27 гМ сахарозы. В ряде 1пытов изменение внутриклеточного солевого состава производилось ;утем предварительного инкубирования суспензии эритроцитов в гзотонических растворах иного состава в присутствии 2 »КГ® М •рамшвдина А в течение 30 мин. при 35°0.- Такая процедура приво-;ила к выравниванию концентраций катионов щелочных металлов в :аружном и внутриклеточном объемах, что контролировалось с помо-;ыо пламенного фотометра. В случае изучения выхода радиоизотопа :акопление метки (8бщ>, ^Св, 42к)во внутриклеточном простран-тве эритроцитов происходило в результате работы систем активно-'о транспорта в процессе инкубации крови с соответствующим изо-опом при 37°С в течение 1.5 часа. Введение в эритроциты 22На в некоторых опытах 42к проводилось иным способом: путем инку-ирования суспензии клеток при 35°С в течение 30 мин. после до-авления в нее грамицидина А до концентраций 2«I0~® М в радио-зотопа. Антибиотики, влияние которых на пронииаамопть яттрлт»-арных мембран следовало изучить, вводились в суспензию 3-х ратно отмытых от радиоизотопа эритроцитов, в виде растворов в таловом или метиловом спиртах. Концентрации спирта, аспользу-мие в опытах, как было предварительно установлено, не влияла на зотопную проницаемость мембран эритроцитов. Введение антибиоти-

ков не приводило к изменению формы и объема клеток, что контролировалось наблюдением в микроскоп и измерением гематокритного числа. Опыты проводились при концентрации клеток в суспензии, соответствующей гематокритным чйслам (Н) от 0.06 до 0.45. Выход метки йз эритроцитов измерялся через 2 мин. после добавления антибиотиков, Вход радиоизотопа в клетки измерялся либо непосредственно после одновременного введения антибиотика и метки в суспензию эритроцитов, либо радиоизотоп добавлялся в суспензию клеток и измерения начинались после предварительного инкубирования системы с антибиотиком. На протяжении опыта суспензия эритроцитов медленно перемешивалась в термостате. Для определения скорости входа или выхода метки через заданные промежутки времени отбирались определенные объемы суспензии клеток, которые центрифугировались при 15 ООО об/мин в течение 0.5 мин. Содержание радиоизотопа в супернатанте измерялось с помощью указанных выше f> - и ¡f- счетчиков.

Расчет значений проводился по формуле:

a¿ « % / (II)

где - константа скорости выхода "холодного" изотопа i; ic1 -константа скорости выхода радиоизотопа i. Константы скорости входа (выхода) ki и находились из тангенса угла наклона экспериментальных кривых к оси абсцисс в координатах: для входа метки в эритроциты:

НЛО

_ln(_i--1) = f(t) (12)

^(оо)

для выхода радиоизотопа или "холодного" изотопа из клеток:

-1а(1--±-) - f(t) (13)

Здесь Jíjít) - концентрация метки (или "холодного" изотопа в случае определения КА) во внешнем растворе в момент времени t , Н±(°°) - равновесная концентрация частиц i во внешне;: среде к внутри клеток при t» со , которая находилась по формуле н(со) - (1-н)/(1-о.32Н). Измерения концентрации "холоцнкх" изотопов проводились на пламенном фотометре CI - szöv /ВНР/. В

работе использовалась кровь здоровых доноров, хранившаяся не болое 3-х дней при t°=4°c. Величина "Ь" - доля эритроцитов в суспензии с модифицированными антибиотиком мембранами рассчитывалась по формулам: при измерении выхода метки

Ъ 2 Ш - а/О - °-б8аН ■) (14)

1-Н

при измерении входа метки

Ъ В х/н » (1-а)(1-Н)/0.63а (15)

где х - объем клеток с модифицированными мембранами, аи1Т(<*>)(1-еА), А - отрезок, отсекаемый на оси ординат прямой, соответствующей медленной экспоненте входа (выхода) метки /26/. В расчетах принималось, что внутриклеточный водный объем составляет 68% объема эритроцита.

Экотраздия хлоридов щелочных металлов из водных растворов в содержащий валиномицин органический растворитель - гептан проводилась путем 2-х минутного встряхивания и последующего разделения фаз в результате 10-минутного центрифугирования при 4 ООО об/мин. Концентрация катионов вида i в органической фазе (о^) определялась на основании значений коэффициентов распределения их радиоизотопов к^*. В случае равенства объемов обеих фаз K1*=*ci°/*ci^ , где *о±° и \ь концентрации радиоизотопа иона i в органической и водной фазах, соответственно. = к^*« о^, где с^ - концентрация катионов в водной фазе,

III. "СР/йЗКИТЕЛШОН ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АНТИБИОТИКА ВАЛИНОМИЦИНА НА ИОННУЮ ПРСШЩЕМОСТЬ МОШЕЯЫХ Й КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Транспорт ионов через немодийицированннэ липидные бислои

Для количественно:': характеристики систем индуцированного ионного транспорта необходимо знать параметры переноса ионов

через липкдны": матрикс бислойной мембраны. Как известно, лигшднш

* _

величина экстракции исследованных хлоридов щелочных металлов в гептан в отсутствии ионофора пренебрежимо мала.

бислои в растворах хлоридов щелочных металлов обладают низкой проводимостью на постоянном токе. Результаты наших экспериментов на сферических бислойных мембранах из общего липида мозга быка и холестерина (табл.1) показали, что изотопные коэффициенты проницаемости мембран Р^* для 22На, 137Са, 42к, 8бнь и збС1 существенно превышают электрические коэффициенты проницаемости (р1е),

Таблица I

Отношения изотопных и электрических коэффициентов проницаемости немодифютрованных бислоев **

Состав водного Go.I0"XU р>:1и P^/Pf Число

раствора См>сьГ2 1 -i см»с опытов

.0.003 М ЕЪ*С1 15.0 7.0 5.4 I

0;0I М - " - 7.0 5.9 37.3 3

0.02 М - " - 5.6 1.8 2.5 I

OÍOS М 300 4.4 7.8 2

Oil М 64.4 4.5 76.0 5

0.5 И 7.7 10.0 2700 I

1;0 м 2.9 ' 1.5 200 2

Oil М К*С1 10.0 4.0 150 I

Oil М Cs*Cl 145 2.9 36.3 5

0.1 М На*01 3.1 1.6 225 3

0.1 М NaOl* 12.2 0.8 15 3

.0.05 М HaCl! 0.05 М НЪ01 7.5 3.0 150 5

' Индексом обозначены ионы, по радиоизотопам которых измерялся коэффициент проницаемооти.

рассчитанные из проводимости мембран (в предположении . При этом обнаружено, что изотопные потоки катионов и анионов хлора не зависят от величины и знака разности потенциалов, при-лояенной к мембране, а также не наблюдается зависимость от вида ионов и концентрации хлоридов щелочных штанов в окружающем мембрану растворе. Анализ этих фактов позволил нам прийти к

заключению, что ионы пересекают липцдный биолой в ввде ионных пар (анион + катион), образующихся в фазе мембраны /18/. Лимити-рукщей стадией процесса является вход ионов в липидный бислой, а реакция образования ионных пар в нем протекает быстро. Полученный экспериментальный факт V^/ P1S> I, т.е. n^ < I может трактоваться как проявление обменной диффузии в рамках механизма подвижного переносчика. Роль такого переносчика по отношению к катионам играют анионы хяора, либо катионы - по отношению к анионам.

Взаимодействие потоков катионов в модельных мембранах.

модифицированных валиномицином

Антибиотик валиномицин - циклический додекадепсипептид, состоящий из трех идентичных тетрадепсипептидных фрагментов: D-Vai-L-Lao-L-Val-D-Hylv. Молекула валиномицыа в малополярных растворителях образует браслетную структуру, внешняя поверхность которой гидрофобна благодаря большому количеству метильных групп.* Комплексообразование катиона и антибиотика происходит за счет ион-дипольных взатлодействий мезду ионом и 6-ю гислородами карбонильных групп комплексона, повернутыми внутрь браслета. Такая структура позволяет иону находиться в малополярной фазе, при этом считается, что "сольватация" иона осуществляется карбонильными кислородами. Полученные нами данные показали, что при экстракции валиномицином воды и катионов в неполярный растворитель гептан (£ =2) в органическую фазу каддой молекулой валиномицина вносится две молекулы воды независимо от концентрации и вида катиона /9/. Эти результаты дают возможность предположить, что в "сольватации" комплексных катионов, находящихся в органической фазе, участвуют также и молекулы воды.

Введение валиномицина в бислойную фосфолипвднуи мембрану mr3tfRPfiT резкое увеличение провялимос1?!! бйС.ТОЯ для Пенов Rh+ f 0s+, к+, мало изменяя проводимость для ионов На+, и практически не влияет на проводимость для аниона 01" /Mueller, Rudia, 1967/. Подтверждением механизма переноса ионов в виде комплекса с антибиотиком считается близость катионной избирательности, определяемой из отношения проводимостей мембран при нулевом токе (, с отношением констант переноса ионов валиномицином в объем

органической фазы, не смешивающейся с водой (к1в^0/к^В/,0). Так, Эйзенман с соавторами /1969/ определили это отношение в системах, содержащих соли катионов щелочных металлов и жирорастворимых анионов, используя органическую фазу с диэлектрической постоянной близкой к 4, и получили хорошее совпадение величин отношений ^в/о^в/о 11 ао1/ео3 • АвтоРы предполагали, что константы образования ионных пар комплексов (катпон-ионофор) и анионов не зависят от вида катионов, а отношение этих констант не зависит от вида растворителя. Однако, наши исследования показали, что эти предположения выполняются не всегда /3,9/. В системах, содержащих органический растворитель с малой полярностью, близкой к . принимаемой дня липидного бислоя, обнаружена мицеллярная экстракция: в процессе переноса валиношщином катионов из водных растворов в гептан, в последнем образуются водно-валиномициновые мицеллы /4,9/. При этом ионов калия переходит в гептан лишь в 10 раз больше, чем натрия, а цезия даже меньше, чем натрия /2/. Эти результаты но согласуются с катионной избирательностью определенной по проводимости модигЪицировашшх валиномицином липидных бислоев: > О* > 0°° ■$> /Лев, Бужинский,1967/. Высоко-

избирательное комплексообразование валшошцкна с катионами если и происходит, то экстракция соли- в водно-валиношщиновые мицеллы нивелирует катионную избирательность комплексообразования. Добавление в гептан яичного фосфатвдилхолила не привело к увеличению К/Иа избирательности экстракции. Анализ результатов этих экспериментов позволил нам сделать вывод, что в органической тазе (гептане) образуются инвертированные мицеллы, содержащие липвд, валиномицин и воду, в которые и происходит экстракция ионов

до,и/.

Представления о мицеллярном характере экстракции катионов валиномицином в низкополярные растворители в дальнейшем были использованы и развиты в работах школы академиков БЛ1.Никольского и М.М.Шульца /Степанова,1987/.

Следовало ожидать, что мицеллбобразование, обусловленное присутствием в органической фазе валиномицша, может бить вовлечено в индуцированный этим антибиотиком транспорт катионов через липвдннб биолои. Для выяснения этого вопроса необходимо было

наряду с измерением электрических характеристик бислоев провеоти одновременные измерения массопереноса ионов через мембраны. Если в бислое существуют содержащие катионы и анионы мицеллы, способные обмениваться ионами с водной фазой, то в соответствии с результатами экстракционных измерений можно ожидать индуцированного валиномицином малоизбирательного транспорта катионов а анионов через бислой. Являясь электронейтральным, такой транспорт не должен сказываться на электрических параметрах мембраны. Результаты измерения потоков 2%а и через липвдные бислои (рис.2)

Рис.2. Влияние.валино-мицина и трансмембранной разности потенциалов на изотопные потоки 01-36 (а) И На-22 <б) через сферические фос-Фолипидные шмбраш. Стрелками указано время введения в систему ваяиномицина и приложения указанной разности потенциалов к мембране.

показывают, что эти потоки не зависят от введения валиномицина в окружавшие мембраны растворы. Как следует из приведенных в табл.2 данных, определенные о помощью радиоизотопов числа переноса для модифицированных валиномицином мембран, разделяющих растворы м>01. СяС1. КС1. я пределах погрешности зкепери-ментов не отличаются от единицы /5,12/, т.е. проницаемость мембран модифицированных валиномицином преимущественно катионная. Эти данные позволяют исключить возможность мицеллярного транспорта катионов и анионов валиномицином через бислой.

Отсутствие зависимости величин потоков 22на и от на-шчгя в ет.стеме валнкомгдаза т'.роме того показывает, что введение

Таблица 2

Числа переноса катионов, определенные изотопным методом для липщщых бислоав, модифицированных валиномицином

«101 V (мВ) Ч

0.05 ЙЪС1 50 0.88

0.05 ЙЬ01 200 0.84

0.1 ЕЬС1 50 1.07

0.1 ЙЬС1 100 0.84

0.1 ЙЬ01 200 0.87

0,1 К01 100 0.99

0.05 СвС1 50 . 1.02

0.05 0е01 100 1.06

среднее 0.95*0.08

Здесь и во всех последущих таблицах при средних значениях приведены стандартные отклонения.

этого антибиотика в лишвдннй бислой не изменяет его характеристик для потоков катионов и анионов, что позволило нам рассматривать изотопные потоки, измеренные для неысдифицированных мембран как "фоновые" при определении индуцированных катионных потоков.

Как упоминалось, исследования взаимодействия потоков (определения индекса ^ в уравнении (I)) позволяет получить информацию о механизме индуцированного транспорта. Результаты изучения зависимости величин ^ от концентрации льсл в окружающих мембраны водных растворах в присутствии валиномицина даны на рис.3. Увеличение концентрации'НЬС1 в водном растворе до 0.1 М приводит к выраженному взаимодействию ионных потоков, проявляющемуся в уменьшении величин пдъ до, значений 0.54*0.16, Этот факт является свидетельством того, что валиномицин в бислоях осуществляет транспорт катионов по механизму подвижного переносчика, при котором рост концентрации электролита приводит к проявлению феномена обменной диффузии /13,17,22/. Одна из главных характеристик подвижного переносчика - насыщение его лнгавдньк групп при

Рпе.З. Зависимость индекса п^ от концентрации

нъа в растворах, окружающих модифицированные валиномицаном бислойные фосфолипидные мембраны. Сплошная кривая соответствует теоретической зависимости а^ от 0НЬС,

Маркин, Чизмадаев,1974/.

-2

l8 CRbCt

больпшх концентрациях в среде переносимого субстрата, в нашем случае катионов Rb+. В результате ионофор пересекает мембрану в обоих направлениях в ниде комплекса с катионом, при этом осуществляется массоперенос катиона в обоих направлениях, регистрируемый с помощью радиоизотопной матки, баз переноса нетто-заряда, что приводит к уменьшению величины п^ /Маркин, Чизмадкев,1974/.

Другой, не менее ваяной характеристикой модели подвижного переносчика является локализация комплексообразования: происходит ли реакция образования комплексов ионофор-катион в водной фазе (механизм "большой карусели") или на границе мембрана -водный раствор электролита (механизм "малой карусели"). Сравнение потоков переносчика и катиона через мембрану позволяет сделать выбор мезду этими механизмами. Измеренный Hai.rn трансмемб-ранныГ; поток валиномицина, меченного по % оказался независящим от гида катиона в растворе (0.1 MRbCi, 0.1 М NaCl), величины и полярности приложенной к мембране разности потенциалов (от 100 мВ до -100 мБ), а его Бкличнна (¿„„ =10"*® о) нг 3 по -

üdJi.

рядка ниде значений потоков Rb . Последнее говорит в пользу механизма "малой карусели", поскольку транспорт, осуществляемый по механизму "большой карусели" предполагает равенство потоков переносимого вещества и переносчика /Маркин, Чизмаджзв,1974/.

Таким образом, itai.ni впервые на модельных липшшых мембранах удалось обнаружить явление о&.®нной диффузии, прояплявдсеся при

транспорте рубидия валиномвдином, и показать, что валиномицин осуществляет транспорт катионов, находясь в мембранной фазе. Результаты наших экспериментов демонстрируют такке, что при транспорте ионов через ^модифицированные липидные бислои, осуществляемом с помощью ионных пар (катион + анион), ион одного вида можно рассматривать как переносчик противоиона.

Ишшщрованная ваяиномипрном проницаемость эритроцит арных мембран.

Способность валиномицина избирательно изменять проницаемость клеточных мембран для катионов 1а группы широко используется при решении ряда вопросов биофизики и биохимии клеток. К моменту начала наших исследований существовали только разрозненные и противоречивые данные о влиянии валиномицина на проницаемость плазматических мембран /Овчинников и др., 1974; ЗоМеак!,

Мы провели систематическое исследование характеристик индуцированного валиномицином транспорта катионов через мембраны эритроцитов человека в симметричных по концентрации одновалентных катионов с обеих сторон мембраны клеток условиях. Изучение зависимости проницаемости эритроцитарных мембран от концентрации антибиотика в окружающем клетки растворе, показало, что кинетика выхода 86нь из эритроцитов хорошо описывается одноэкспоненциаль-ной кривой (рис.4), соответствующей распределению радиоизотопа

1983/.

'6-10-% 1й*20°С.

6

10~7 ы

Рис.4. Кинетические кривые индуцированного валиномицином выхода аъ-еб из эритроцитов. Цилры у кривых - концентрации

антибиотика в окружающем клетки растворе. Н=0.4,

50

100 'Ь, мин

Рис.5. Зависимость констант скорости выхода 1?ъ~8б от концентрации валиномицина во внешнем раст-

-2

воре.

-7 -6 -5 !дС

вал

между внутри- и внеклеточными водными объемами. Рассчитанные из кривых рис.4 константы выхода кнь представлен1' на рис.5 в виде зависимости от концентрации антибиотика в водном растворе. Приведенная лине!1ная зависимость 1в кдь от 1е СВ!ЗЛ (в диапазоне концентрации валиномицина от 10"' до 4М/с наклоном к оси абсцисс, равным единице, предполагает 1;1 стехиометрию комплекса валиномицина и катиона, что согласуется о результатами, полученными на модельных липздных мембранах /Готлиб и др.,1968/, Определение констант выхода каъ и кСв позволило найти катионную избирательность валиномицин-индуцированного транспорта через эрит-роцитарные мембраны. Отношение к^/^ оказалось равным 5. Эта величина совпадает со значением отношения изотопных коэффициентов проницаемости Р*Нь/Р 0а , найденным нами /12{ для модифицированных валшюмицшом модельных фосфолипвдных мембран. Высокая щ>,с а/На избирательность, характерная для модельных липвдных бисдоев в присутствия валиномицина, обнаружена нами и для эрит-роцлтарных мембран: константа выхода кЯа не отличается от величины. соответствующей интактншл клеткам. Веским аргументом в пользу модели подвижного переносчика для йонофора валиномицина явилась работа Красне и др. /1971/-, показавших, что охлаждение системы ниже температуры фазового перехода липвда полностью инги-бируе? индуцированную антибиотиком катионную проводимость мембран. Проведенные каш измерения проницаемости эрптроцитарных мембран для нь, Са,На в присутствии валино'/шцина г.ри *°=3°С не

- 24 -

выявили входа этих радиоизотопов в эритроциты /26/.

Таким образам, в результате сравнения индуцированной вали-номицином проницаемости эритроцитарнцх и модельных лшщцных мембран различий в механизме модифицирующего действия этого ионофо-ра на исследованных объектах не обнаружено. Валиномицин-индуци-рованный транспорт катионов в обеих системах подчиняется законо-г мерностям, вытекающим из модели подвижного переносчика.

1у. иссвдование взаимодействия встречшх потоков катионов в гращцщшовш канале - 1ЮНЯ1 подход .к вдшрованию свойств шслошеоких каналов

■ Определение числа и положения ион-связыванвшх мест в

грамишшиновом канале

Каналошормер грамицидин А, встроенный в липидный бислой, в настоящее время считается по ряду характеристик достаточно полно изученной моделью ионных каналов клеточных мембран. Эта относительно простая система позволяет проверить применимость физико-химических подходов, используемых при изучении ионных накалов клеток, и обоснованность трактовки результатов. Грамицвди-новнй канал привлекает внимание исследователей по нескольким причинам. Во-первых, по некоторым-параметрам он подобен катион-нш каналам плазматических мембран: выраженная катион-анионная селективность; высокая скорость движения ионов и молекул поды (Ю6- Ю7 частиц в секунду); однородность движения частиц в канале (по крайней мере в некоторых его участках) и как следствие- сопряжение ионных потоков и потоков ионов и воды; блокирование транспорта одних ионов другими; зависимость характеристик переноса от вида проходящих по каналу ионов. Во-вторых, установление первичной структуры грамицидина А позволило построить модель канала, что дает возможность сопрягать характеристики транспорта со структурой канала. В-третьих, направленное изменение первичной структур!.' молекулы каналоформера открывает возможности изучения функционально!; роли отдельных участков канала.

Молекула грамицидина А - линейный пентадеканептвд, построенный из гидрофобных аминокислотных остатков, с уникально": для природных пептидов последовательностью изомеров /Эагсев, ашсор,1965/:

"голова") ОНО-Ь-Уа1-а1у-Ь-А1а-1)-Х.еи-1.-А1а-В-Уо1-.1.-7а1-1)-7а1-1г-1Гр_В-Ьеи-Ь-Тгр-В-Ьеи-Ь-Тгр-С-Ьви-Ь-Тгр-1П1СН2СН2ОН ( "ХВОСТ" )

ироко используемая в настоящее время модель грамицидинового ка-ала, предложенная Урри /1271,1972/, предполагает, что две моле-улн грамицидина А формируют однонитевую левозакрученную £ -спи-аль ("голова-к-голове"). Спираль содержит 6,3 аминокислотных статка на виток, ее внутренний диаметр равен 0.4 ш и длина -ркмерно 2.8 нм. Внутрь канала обращены гидрофильные карбониль-ие и аминогруппы, а также формильная и этаноламинная группы онцевых остатков. Внешняя поверхность спирали образована гидро-обными аминокислотными остатка».®, благодаря чему осуществляется Активное встраивание кшала а гидрофобный ливидный бислой.

Однж.; из существенных доказательств механизма проводимости эдкфзщироЕанных грамицидином А лшшдаых бисхосв по типу ионного знала явилось обнаружение дискретных фяуктуаций тока о опредв-энпыми повторяющимися амплитудами. Дискретность изменения про-здимости бислоя трактуется как результат образования и распада диночных ионных каналов /Шайку а!.,1972/. Модели транспорта энов через грамицидиновую пору базируются главным образом на ззультатах измерения электрохимических и ЯМР-спектральных ха-зктеристик бислойных мембран, модифицированных антибиотиком, эвокупность экспериментальных данных позволила предположить щорядность диффузии катионов в канале и применить для описшшя ранспорта ионов через канал теорию абсолютных скоростей реакций ¿ринга. Молекулярная модель грашцидинового канала дает возмож-эсть предполагать, что барьерами могут слуаить области пептид-эй спирали, где расположены >н-н группы, а потенциальные ямы леста связывания ионов в канале) образованы' >с«0 группами, другой стороны, теоретические расчеты Парсегяна /1969/ и Левит-1 /1978/ показали, что центральная часть канала япяяется барье-зм при движении но каналу катионов, и два места связывания исн-з расположены на расстоянии приблизительно 0.2 шл от устьев шала.

Экспериментальное изучение взаимодействия встречных потоков гтноков через модифицкрованные грамицидином А мембраны должно '.ть дополнительную информацию о законогшрноогях движения ионоз позволить определить число и положение иоксвязываадях мест в

канале. До нас таких исследований не проводилось, и вопрос о числе ион-связывавдих мест и их положении в канале не бил решен.

Известно, что введение грамицидина А в липццный бислой впаивает возмущение его структуры, проявляющееся в изменении тер-мотропного поведения липвда, ЯМР-спектров, упругих свойств би-слоев и ряда других параметров /chapman et аЗ.,1977/. Поэтому необходимо было установить характеристики массопереноса через липидный матрикс мембран в присутствии грамицидина А. Как показали наши исследования, модификация бислоев грамицидином А не приводит к изменении потоков 36С1 через мембраны (рис.6), в то время как проводимость бислоев увеличивается на несколько порядков. Предположив (далее это будет показано), что проницаемость липидного матрикса мембран для катионов также не изменяется в результате введения в бислой грамицидина, изотопные потоки через ^модифицированные бислои учитывались при определении индуцированных грамицидином А потоков катионов.

Рис.6. Выход С1-36 из объема ограниченного би-слойной сферической мембраной. с¿oi=0.04 М HbCi+ +0.12 М NaCl. (| ) указывает время введения грамицидина во внешний раствор. Вверху - изменение разности потенциалов, приложенной к мембране. До введения грамицидина

0о=8.5.Ю~10 ом^см-2, после введения грамици-

,, , . дина 0о=7,Ю"6 ом-1 см"2.

15Q! 1 1 О

100 • 200 t.MHH S=I'S

Как слэдует из формул (6,7) величины г^ можно найти, если известны числа переноса катионов (ti). Для липидннх бислоев из глицеролмоноолеата Эйзенман и др. /1977,1978/ пришли к заключению, что при концентрациях электролита выше 0.1 М величины t+< I.' Для исследованных систем мы определили числа переноса катионов изотопным методом (табл.3) и ладил, что величины t+ доотогерно не отличаются от единицы для всех использованных ксн-

♦70шУ

Таблица 3

Числа переноса катионов, определенные изотопным методом для бислоев, модифицированных грамицидином А

Состав водного раствора Оо 7 Ч

1 01 Концентра- ш См»см-2 мВ

НЬ01 1.0 ю-1 Ю-1 Ю-1 кг1 Ю-1 Ю-1 Ю-1 ю-2 ю-2 з.пг3 4.7.I0-6 9.9.I0**7 1.2 «Ю-6 1.9*10"® 2.6 •Ю"6 2.8'Ю-6 3.7ÍI0"6 7.2 «Ю-6 2.3-Ю"7 б.О-Ю"7 1.4'Ю"8 ±29 42 41 67 ¿29 67 81 . ±31 ' ±22 ±18 35 1.0 1.0 0.9 1.0 1.0 I.I 0.9 1.0 0.9 0.9 1.0

среднее 1.00±0.07

CaCl HaCl Ю-1 ю-1 Ю-1 6.6'КГ6 2.5.10"7 1.9'Ю"^ ±24 ±24 ±29 1.0 1.2 0.^

центраций Rboi, GsCi и Nací. Определение величин ai для модифицированных грамицидином А мембран в растворах различных концентраций яьл, ОвЛ, NaCi показало отсутствие корреляции меяету значениями индекса nj и проводимостью бислоев, а также разностью потенциалов, приложенной к мембранам /22/. Эти результаты подтвердили наше предположение о том, что введение грамицидина в бислой не изменяет проницаемость липидного матрнкоа мембран для потоков катионов.

В таблице 4 представлены величины индексов для различных катионов и концентраций электролитов в растворах, окружащюс

Таблица 4

Значение индекса г^ для лилидких бислоев, модифицировавшие грамицидином А

Состав ВОДНОГО раствора i Cl HbCl HbCl RbOl RbOl CsCl HaOl NaOl NaCl

концентра» fit 2.2'Ю-3 ■ I0~2 io-1 1.0 I0-1 I0-2 ю-1 I.6.I0-1

ni I.7IÎ ±0.16 2.12-±0.19 2.14± ±0.23 I.65± ±0.24 I.68± ±0.15 I.22± ±0.16 I.2I± ±0.15 1.21 ±0.12

модигсицировашше грамицидином А мембраны. Отличие величин ^ от единицы во всех изученных система;': указывает на взаимодействие встречных потоков катионов в грамицидиновом канале. Факт превышения значений индекса nt единицы позволяет заключить, что в канале может одновременно находиться более одного катиона и транспорт катионов происходит по механизму однорядно!; диффузии Д4,16/. Обнаруженное различие величин для ионов Rb+, Св+ и На+ при одинаковых концентрациях хлоридов этих катионов в водных растворах (табл.4) является результатом разной вероятности одновременного нахождения в ;::::зле более одного иона, которая определяется различием энергетических профилей канала.

Число мест связывания ионов с каналом можно определить из зависимости от концентрации Ионов в окружающем мембраны растворе. Теоретический анализ этой зависимости для движения частиц в узкой поре, проведенный Чизмдджевым и АКтьяном /1977/, Хилле и Шварцем /1978/, а также Колером к Хекманном /1978/ показал, что если функция n^ » f (ci) имает максимум, то величина в максимуме равна числу ион-связнваздах мест в канале. Приведенные на рис.7 результаты наших исследований свидетельствуют о том,_ что зависимость п^ от сКЬС1 имеет максимум, лежащий в области « 2; Этот факт позволяет заключить, что в грамицл-дпвовом кана-е .реализуются два цов-связывалдхх места /17,22/; ■

Рис.7. Зависимость индекса nRb от концентрации Rbci в

растворах, округеодих ли-пидкце бислои, моддаицитэо-вакнне: грамицидином А {«), 0-пиротлеллатилгра1,шцид1шом

—i-1-1—ъ—

' -2 0 egCRba

ПодоГти г; решения вопроса о положен:«! мост связывания ионов позволяют эксперименты с заряженным аналогом грамицидина А -О-пиромеллитилгршящвдином, который содержит три отрицательно заряженные группы на N-конце молекулы. Для этого аналога следовало озддсть существование мест связывания катионов, определяемых наи'.чием отрицательных зарядов у входа в канал. Вели в каналах, образовании:: заряхенним аналогом, места связывания катионов находятся там же, что а в каналах, образованных грамицидином А, то не долнно наблюдаться появления дополнительных даст связывания и, соответственно, изменения величин г^. Как следует из пред-ставлснных на рис.7 данных, именно такими оказались экспериментальна результаты: величина найденная для аналога, несущого зарягконние группы, не изменилась по сравнению о значением ПдЪ, полученным для граыициднга' А в тех же условиях. Tai: как отрицательные заряды в молекуле О-пиромеллитилграмицвдина располагаются у устьев канала, то резонно предположить, что два места связывания катионов в грампцпдиновом канале долями находиться вблизи его устьев. Позднее Урри а др. /1982/ с помощью метода ядерного магнитного резонанса обнаругали, что взаимодействие ионов Т1+ и На+ с каналом происходят в области 11-го триптофанового остатка молекулы, т.е. на расстоянии приблизительно 0.2 ни от входа в канал.

Таг-им образом, исследования изотопных потоков через гямбра-

2,0

1,5

нн, модифицированные грамицидином А и его заряженным аналогом, 0-пиромеллитидгра'.пщвдшом, показали, что индуцированный этими каналофорыерама транспорт катионов щелочных металлов происходит 'по механизму однорядной диффузии в двухместной узкой поре с местами связывания, располокеннимп вблизи устьев каната.

Свойства грамипршиношх каналов в этатропрташих жлбрангос

Гракищадш А широко используется в качестве "химического инструмента" в тех исследованиях меток и клеточных органоидов, в которых необходимо обеспечить высокую, но малоизбирательную катионнул проницаемость мембран этих объектов, например, заменять шутриклеточннй калий на натрий среды и тем самым варьировать трансмвмбранную разность потенциалов. Успех направленного использования грамицидина А в качестве "химического инструмента" зависит от знания механизма его действия на клеточные мембраны. Для грамицидина А не была изучена его каналоформернач активность и, в частности, не было показано взаимодействие потоков катионов при внесения этого антибиотика в биологические системы. В этой связи представлялось необходимым исследовать транспорт ионов через мембраны эритроцитов человека, модифицированные грамицидином А. Как отмечалось, в соответствии с моделью Урри, внутренний диаметр грамицвдпнового канала равен 0.4 нм. Катионы большего диаметра, например, тетраметвлешонии не проникают через модифицированные грамицидином А модельные липидные бислой. Так ли это для эратроцэтарта цо"Зран, модифицированных этим канадоформером, предстояло решать. Во внешний раствор был введен ион холила, при этой состав раствора был следущим: 145 >¿.1 холинхлорида, 5 ыМ КС1, 27 »М сахарозы. Катион холин имеет размеры, превышающие внутренний диаметр грамицпдинового канала, и следовало ожидать, что он не будет проходить через канал и онагется для эритроци-таракх мембран непроннкавдии. Введение грамицидина А в суспензию эритроцитов, содержащую в наружном растворе холинхлорид, досшо привести г. перераспределении ионов к+, На+ и сх~ ме:эду внутри-кяеточкой средой эритроцитов г. внешним раствором в соответствии с деннааовскеы равновесием. Градиент концентраций катионов к+ я должен вызвать потока этих катионов из эритроцитов через гра'лпгадаовые каналы. В силу требования электронейтральности

потоки катионов к+ и На+ будут сопровождаться импортом ионов С1~, для которых эритроцитарная мембрана хорошо проницаема (коэффициент проницаемости для нетто-потока хлора равен 2*10"® см/сек) /Cass, Delmark, 1979/. Выход ионов из эритроцитов впечет за собой поток воды наружу, и как следствие - сжимание клеток (уменьшение их объема). Результаты измерения индуцированного грамицидином А выхода калия из эритроцитов и гематокритного числа показывают <рио.8), что параллельно о увеличением концентрации калия во внешней среде происходит уменьшение размеров клеток, о чем свидетельствует падение величины гематокритного числа. Эти опыты позволили заключить, что грамицидин А в мембранах эритроцитов, как и в случае модельных баслойных,мембран, образует каналы, непроницаемые для одновалентных катионов, размеры которых превышают 0.4 ям.

Рис.8. Влияние грамицидина А на объем клеток (а,б) и выход калия из эритроцитов (в,г) во внешний раствор, содержащий Холпнхлорид. ^=20°а; (^ ) -введение грамицидина во внешний раствор до концентраций, указанных цифрами на кривых.

100 1,мин

Взаимодействие ионных потоков в грамицидиновых каналах, образованных в эрктроцитарных мембранах, можно определить из сравнения констант скорости выхода "холодного" иона и его радиоизотопа (см. иормулы (II)-(13)). Нами были проведены определения величины Bjj в условиях, когда внутриклеточный раствор содержал KCl, а наружный - HbCl. Необходима*! для фотометрического определения выхода из эритроцитов "холодного" катая замена во впегаеп растворе ионов К+ на Rb+ предстаалялась возможной, поскольку Rb/K избирательность грамицздшовы;: каналов незначительна (не более 1.4 раз).

Рис.9. Выход "холодного" калия (к) и к-42 из эритроцитов, проинкубированных с грамицидином. Внешний раствор: 150 Ш Rbca. 27 мМ сахарозы. н=0.42, t°=55C.

О 50 100 t, шн

На рис.9 приведены кривые выхода "холодного" калия и радиоизотопа '^ТС из эритроцитов, преинкубированних о грамицидином А. Среднее значение п^ = 2.2 -,0.3 достоверно не отличается от величины п^ с 2.1 - 0.2, определенной нами в растворах O.I М RbCl для модифицированных грамицидином А липидных бислоев, приготовленных из общего липвда мозга быка* Экспериментально полученных величин «g в литературе не имеется. Расчет, проведенный Урбаном С соавторами Д980/ для двухяыной трехбарьерной модели какала на основании измерений билонных потенциалов и проводимостей од1шочных каналов в мембрана-: из глицеролмоноолеата, показал, что при концентрации 150 Ш К01 величина г^ =1.7. Учитывая, что величина jig найдена Урбаном косвенным способом для бислоев, имеющих липидный состав, отличный от Состава мембран эритроцитов, а также полученное нами "равенство значений Hg и п^ для эритроцитар-ных и модельных мембран, можно, считать, что взаимодействие потоков ионов в модифицированных грамицидином А' эритроцитарных и модельных липидных мембранах пр;шципиально не различается.

Взаимодействие Потоков катионов разного вида в гра.дшци-новых каналах .

Математическое описание ионного транспорта через грамсга-динозке каналы основано на теории абсолютных скоростей реакций э предположении, что состояние частицы з местах сатанзакпя с кагалом не отличается от равновесного, т.е. вре:/л, необходимое для

достижения ионом и каналом равновесного состояния предполагается меньшим, чем вреда пребывания частиц в энергетических яг/ах. При этом фактически постулируется, что энергетический профиль канала не зависит от вида иона, прошедшего через канал или находящегося в энергетической яме*

Для выяснения правомерности этого постулата мы провели эксперименты, в которых по каналу одновременно могли двигаться катионы двух видов с различными транспортными Характеристика.®: ионы рубидия и натрия. Отношение констант связывания нь+ и На+ о катион-связывавдими местами канала равно~5, отношение провода-мостей одиночных каналов для них (в диапазоне концентраций от 0.01 до 0.1 И) равно примерно трем, отношение индексов ■

= 1.7. Модифицированные антибиотиком мембраны разделяли симметричные по составу водные растворы хлоридов и На различных суммарных концентраций (от 0.04 до 0.4 М). Отношение концентраций сйъ/ойа варьировалооь в диапазоне от 0.07 до 160. Результаты исследований приведены на рис.10 и в таблице 5.; Приведенные данные показывают, что во всех изученных системах независимо от суммарных концентраций солей и их соотношения в растворах,

2,0 1,5

"яь

ПМо

Л

Ц. «Ь |

N0 |

Рис;10.п3анаоимоеть величин Пиь И П2уа от соотношения,ЛЪС1 и НаС1 (моль») в растворах, окружающих липидные би-слойные мембраны, модифицированные грамиццди-ном А, при «0.16М.

''"о 50 100 Скь-С,

100 моль % 0 СМаС1

Таблица 5

Велидины индекса а![ а (Рнь/1> )" для липидных бислоев, модифицированных грамицидином А, в растворах различных • суммарных концентраций ньох я ыаС1 при с,,/окь « э

°Rbpi^Na01 » "Rb ■i % "Rb^a <РНЬ/РНа>"

0.04 I.44±0.I5 1.62*0.16 0.9 4.9±I.I

0.16 I;5I±0.I4 I.42±0.I2 I.I 4.5^0.8

0.40 I.52±0.I3 I.5IÍ0.I4 í.o 4.5±0.9

^ " " * 1 -г,

окружающих мембраны, выполняется равенство nRb ■ njja . В то же время значения п^ и n¡ja зависят от отношения CRb/CHa (рис.10): величина n"Rb при увеличении отношения аЫа/Снь приближается к значения:.! п^ в системе, содержащей только HaCl, а величина njjft при повышении отношения cR./си стремится к значению nRb в системе, содержащей только Rbci /28,§9/.

В рамках основных положений 2-х ямной 3-х барьерной модели грамицидинового канала Айтьян /1986/ рассмотрел все теоретически возможные варианты ее модификации, но удовлетворительного объяснения найденной наш зависимости величин п^ от отношения 0Rb/Cjja им получено ко было. Путем варьирования глубины ям и высоты барьеров для ионов н^и Na автор нашел условия, при которых одновременное присутствие в поре ионов Rb+ и iía+ может приводить к равенству п^ ■ njja , но при тех же условиях значения и nRb , и njja даяжны возрастать по сравнению с соответствующими величина:,ш nlt что противоречит результатам наших экспериментов (табл. 4 и 5). 5-ти барьерная 4-х ямная модель Энзенмана с соавтора:,® /1978,1980/ предполагает,, что локализация двух внутренних мест свлзивгигая ионов с. грамицидиновым капало:.: зависит от вида катиона: расстояние ме.тду энергетическими ямами для ионов «а+ меньше,

15ндепс (") относится величина:.;, определенным в растворах, ■ дга т,?.да катионов.

у

}

- 35 -

чем для конов въ+. Эта модель позволяет объяснить равенство ПдЬ = пИа = 1.6 в случае, когда вероятность одновременного присутствия в канале ионов нъ+ а Иа+ шого выше, чем только нъ+ или Иа+, что реализуется при сца/Онь = 3. Однако, с помощью этой модели нельзя понять равенство з наблвдажшееся при высоких величинах отношений и 0дь/0;;а (рас.10). Действи-

тельно, если, например, в системе °й1/ат[а3> I и 0Нь + <?На =0.16 М, то вероятность одновременного присутствия в канале двух понев рубидия много больше, чем ионов разных видов (ЕЬ+ и Ла+), в результате величина индекса ПдЬ должна приближаться к значению, соответствующему присутствию в растворе только НЪС1: 13

£ 2. Вероятность же нахождения в канале двух ионов натрия шого меньше, чем пари: На+, нь+, а поэтому величина индекса должна стремиться к значению, соответствующему присутствию в канале ионов двух видов: п^ -»1.6. При оКа/анъ^> I а 0;1а + онь = =0.16 М следует ожидать 1.6, ^ 5 1.2. Таким обра-

зом, допущения о катион-зависимом положении энергетических ям в канале не достаточно для объяснения полученных экспериментальных денных. Можно было надеяться найти объяснение экспериментальных фактов, используя другие модели, например, модели канала о флуктуирующими энергетическими профилями Даивег,1980; 01ап1,1984/. Однако, более целесообразным нам представлялся безмодельный подход, основанный на применешш линейных уравнений неравновесной термодинамики /Койеа, Вэа1з,1965/. В соответствии о результатами этой работы для какого вида диффу1щирукщих через мембрану частиц можно записать: ,

■г-^а-т*«';' (ю)

где 1=нъ,1Га; 3=НЪ,Иа; ^; И1*= ) -обменный! коэффици-

ент сопротивления для частиц 1, если - изотопные метки вещества 1, Д х - толщина мембраны, Н^- ^г^^йл. - интегральное ии-противлешю частиц 1 нетто потоку этих частиц з^, й^ - интегральное сопротивление частиц 1 нетто потоку частиц 3 (л^). Сопряжение частиц 1 и 3 представлено только через коэффициент со-протикгения т.е. сопротивления п не зависит от присутствия б системе другого "она 3,1. Использовав соотношпь'яе между движуще:'; с;по;' У и пото;:амг. трпнспоргпрус-ггс чпгггп^ / ,

и

J3 :

у - i ♦ B1s J; (IV)

находим n^ = R^ (R.. - K^i/te.jR.j - R2i;j) . Величины n^ характеризующие транспорт частиц i в системе, содеряащей один вид проникающих через мембрану катионов в соответствии с результатами работы /Kedem , Easig,I365/ записываются: n^ R^ /Ri# При написании этого соотношения и уравнения (16) сопряжение потоков ионов и воды'не учитывалось, т.к. для грамицидинового канала число молекул воды, увлекаемых катионами Rb+ и Na+ одинаково /Levitt et al.,I978; Rosenberg, ?inkelstein,I978/. Продпсшшш независимость конформационного состояния канала от вида прошедшего по нему катиона получим: Вз(п^ - п^/Сп^' - ) J± > О. Положительное значение в не согласуется с полученными нами экспериментальными данными: из представленных в таблицах 4 и 5 зна-

н , п ^ ,, н . ,

чений индексов п± и п.. следует: в = (nRb - прЛ)/(пКа - аКа) < О. Таким образом, безмодельное описание взаимодействия встречных потоков катионов разных видов в грамицидиновом канале не привело к согласованию экспериментальных и теоретических результатов.

Поскольку в уравнении (17) единственным ограничением является линейность соотношений меаду потоками ^ , Jj и силами Р , то полученный результат следует связывать с некорректностью сделанного наш предполс: ■.ония относительно величин Ri и R^. Поэтому было вздвинуто предсг:вление о том, что в результате взаимодействия иона данного вида с местом его связывания в канале происходят изменения конформации места связывания, которые сохраняются в течение времени, превышающего среднее время низнп вакантного состояния места, т.е. к моменту попадания в него иона другого вида место связывания сохраняет конформациониый "след" ("память") о взаимодействии-с предыдущим ионом. В это:.: случао энергетический профиль какала для катионов одного ь:аа оказывается зависящшл от вода катиона, ранее взаимодействовавшего с лигаццами какала, что возможно в случае, если скорость релаксации лигандн'к групп меньше скорости дегпэния ионов в канале. «:р;: скорости ДЕП.7.ен::я катксног по грамицидиногому канату Ю6 - I07 исков в сезгткду,

время релаксации мест связывания ионов в канале должно быть больше или порядка 10"° с.

В рамках выдвинутого наш представления равенство величин "нь и ана • найлк®аемое при совместном движении по каналу ионов Rb и Па , мажет интерпретироваться как установление характерного для данного соотношения катионов Rb+ и На+ состояния энергетического профиля канала.

Изменение энергетического профиля канала, вызванное движением по нему катионов разного вида по сравнению с профилем, присущим каналу при движении по нему ионов каждого типа в отдельности, должно приводить к изменению избирательности грамицидкнового канала (PRb/PKa) пб сравнению с катионной избирательностью, определяемой из сопоставления проводимости бислоев в растворах, содержащих один вид катионов: PRb/PHQ. На рис.11 приведена полученная нами зависимость (от мойьной доли катионов Rb+ и На+ в окруяащих мембраны растворах при постоянной суммарной их концентрации, равной 0.16 М. В табл.5 приведены значения (Рнъ/РКа)" при постоянном отношении Оце/°йь 3 ' но ПРЯ различных суммарных концентрациях ионов в растворах, разделяемых мэм-браной. Результаты наших исследований показали, что для всех изученных систем выполняется соотношение:

(М

10

8

6 4

2

п

о

ICO

моль %

-L'O Rb О На

Рис.11. Зависимость Rb/Ha избирательности ОТ КОЛЬ% RbCl И NaCl

в растворах, окрукаяцих модифицированные грамицидином А бислойные мембраны. Суммарная концентрация хлоридов рубидия и натрия -0.16 М. I - экспериментальная кривая, 2 -твот>в?ичоокял кгивая.

*R*b aRb = *®Rb CHa CRb 5 <W*Ha>" (I8)

'где Л<fRb ; = ^ • Величина (PRb /

РНа)" не зависит от приложенной.к Meiлбране разности потенциалов (по крайней мере в диапазоне от 0 до 50 t."B) и характеризует Rb/Ыа избирательность мембран, модифицированных грамицидином, в растворах, содержащих два вида катионов: Rb+ и На+. Из приведенных на рис.11 результатов(кривая I) можно видеть, что къ/на избирательность возрастает с увеличением мольной доли Rb+ в растворе и, как следует из табл.5, в пределах погрешности эксперимента не зависит от суммарной концентрации ионов. На рис.11 также приведена теоретическая кривая (2), рассчитанная нами по формулам, полученным Колером и Хекманом /1980/ для однорядного транспорта ионов в двухместной поре с постоянным для данного иона энергетическим профилем при совместном движении по ней катионов двух видов.' Кривая 2 рисунка II показывает, что Rb/Ыа избирательность, в отличие от неблюдаемой экспериментально (кривая I), не зависит От мольной доли Rb+ и На+ в растворах, окружающих мембрану, и значение (pRb/PHa)" совпадает с величиной PRb/PIJa =3.2, определенной нами из проводимостей одиночных грамицидиновых каналов в 0.1 М растворах /30/. Следовательно, как и в случае индексов , Rb/Na избирательность модифицированных грамицидином А липидных бислоев ке может быть описана в рамках представлений о неизменности энергетического профиля канала для данного вида иона, если через канал движутся катионы различных видов.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить изменетя "архитектуры" канала в зависимости от "состава" проходящего по нему ионного потока, своего рода "подстраивание" кон-формации канала к движущемуся по нему потоку различного вида ионов.

Исследование изотопной катионной проницаемости модифицирован нкх грамицидином А эритроцптарных мембран в симметричны:: по концентрации одновалентных катионов условиях при различных отношениях этих катионов в окруззщях мембран:; раствора:: показало, что и в случае клеточных мембран наблюдается катпон-зазисимые изменения кок?орлацая. гра&азасшового канала при движении по кому

потока различных ионов /30/.

Инактивация гоамипидин-индупированной проводимости эритро-питавных и модельных мембран

Введение грамицидина А в суспензию эритроцитов вызывает увеличение потоков радиоизотопов ЛЬ, 137Св, 42к и 22на через мембраны клеток. Скорость выхода этих изотопов возрастает с увеличением концентрации антибиотика в окружающем эритроциты растворе (рис.12) /25/. В отличие от валиномицина, индуцированный грамицидином А выход радиоизотопов из клеток при концентрациях антибиотика, соответствующих менее чем 10^ молекул на один эритроцит ¿ не описывается одноэкспоненциальной зависимостью. Экспери-

2.7-10-3 М 1.35'Ю-9 М

2.7»Ю-10 М

Рис.12. Влияние грамицидина А на выход

из эритроцитов. Цифры у кривых - концентрации антибиотика в водном растворе, окружающем эритроциты. н-о.об, г°«20°с.

юо ^ мин

ментальные результаты в этих случаях мокно удовлетворительно аппроксимировать по крайней коре двухэкспоненциальной кривой.. При этом скорость выхода радиоизотопов через 40-60 минут после введения в среду модификатора мало отличается от скорости, наблюдаемой в отсутствие антибиотика. Эти результаты можно трактовать в

пррлчолохтпи О чяттичтт В СИС?™'1 ЮТПТПТГ тгвуг популяц??: С ПОДН-

фицированнтзыи и немодифкцировакнили мембранами, причем соотнопе-ние этих популяций зависит от концентрации антибиотика. Эти предположения были использован:: для определения величин "ъ" - доли клеток с модп-1 шшрозслшсл! :лембрана.я по отноазнио г. об-ли.*:; 'птсл; эритроцитов в суспензии (фор:!ул:т 14,15) /26/. При расчетм.гп-чип ь, црпвздсннш: в :;пт:?руо:дс:1 работ'.-, мы лрздподаг.гта, тп V.

Рис.13. Зависимость отношения числа глеток, чеоез мембраны которых осуществляется граглщидин-индуци-рованный транспорт катионов, к общему числу клеток в суспензии (ь) от среднего числа молекул антибиотика, приходящихся на один эритроцит (и).

популяции с модифицированными мембранами относятся те клетки, через мембраны которых осуществляется граьшцвдин-индуцированный транспорт катионов. Эту популяцию для краткости назвали "модифицированные эритроциты". Рис.13 представляет зависимость величин Ь от числа молекул грамицидина А, приходящихся в среднем на один эритроцит. В расчетах использовался определенных наш коэффициент распределения грамицидина иежду мембранами эритроцитов и средой равный Ю4. Наблвдаемая э-образная зависимость величин ь от концентрации антибиотика говорит 'о кооперативном характере модификации эритроцитарных мембран грамицидином А. Для модификации ! мембран всех клеток необходимо приблизительно 10^ молекул кана-лоформера в раочете ::а один эритроцит.

Альтернативное объяснение отклонения кинетики индуцировашо-го грамицидином А распределешш радиоизотопа моцду внутриглеточ-ной и наружной' средой от моноэкспоненциальной молю дать, если предположить, что иодифивдрувдее действие антибиотика уменьшается во времени, т.е. происходит своеобразная "инактивация" каналофор-мерной активности грашцпдина А. Для доказательства этого предположения была изучена зависимость входа 86аь и 22ыа в эритроциты от времени введения радиоизотопов в эрлтроцитарную суспензию, инкубируемую о грамицидином (рис.14). Из криБых, представленных на рис.14, следует, что константа с:-:орости входа метки падает во времени. Сравнение констант скорости входа 8°яь и 22На, соответ-ствупдих начальной, быстрой кинетике распределения изотопа, показало, что яъ/На избирательность мембран сохраняется ка протяжении

100

200

Рис¿14. Зависимость изотопных потоков НЬ-8б (О И Яа-22 через эритроцитарные мембраны от времени, проведшего после введения в суспензию клеток грамицидина А С I ег). Стрелками (**) указаны моменты введения в суспензию изотопов. Величина изотопного потока пропорциональна тангенсу угла наклона прямой к оси абсцисс.

1; °=20°С, Н=0 Л, Срр=Ю~®М.

опыта: (%ь/%а)^40 глш » ^Ч^иЧО мш • Этот Г0В0" рит о том, что во времени происходит падение именно грамицидин-индуцированной проницаемости /33/. Удаление из мембран эритроцитов части Н0%) холестерина приводит к существенному уменьшению скорости инактивации (рис.15). Это наблкдение позволило высказать предположение, что инактивация гршлицидин-шиуцировшшой катионной проницаемости обусловлена присутствием в мембранах холестерина.

—Вп Ы~ — 1)

Ь, мин

Рис.15. Зависимость изотопных потоков иь-8б через эритроцитарные мембраны от времени, прошедшего после введения в суспензию эритро-ртов грамицидина А , к i &с). Стрелка!,и (г ) указаны моменты введения в суспензию изотопа. (•) - клетки с нормальным содйилакием холос— теряна, (©) - клетки с уменьшенным на ^ 40% содержанием холестерина.

*°=20°С,Н=0.4,СГ «Ю'%.

- 42 -

Эксперименты, проведенные на модельных липидных бислоях подтверждают это предположение. Проводимость модифицированных грамицидином А мембран, приготовленных из фосфатидилэтаноламина, диолеоклфосфатидилхатана, глицеролмоноолеата, азолектина не изменяется на протяжении опыта (до 120 мин). Добавление в мембра-нообразушций раствор холестерина приводит к уменьшению проводимости мембран во времени (рис.16), которое происходит по экспоненциальному закону. Константа скорости 1/гг" инактивации грами-цидин-индуцированноЕ проводимости липидных бислоев зависит от мольной доли холестерина в мембранообразующем растворе (рис.17).

"в (псм)

Рис.16. Зависимость гра-0 мшщдин-индуцированноа

проводимости (с) диоле-оилбосшатидилхолиновых мембран с различным содержанием холестерина от времени. ¿¡оль% холестерина указан цифрами у кривых. Антибиотик добавлен в водные растворы непосредственно перед формированием мем-

Рис.17. Зависимость константы скорости инактивации Ц/яг) шщтцированно:; грамицидином а пгюеодимости липидных бислоев' от мольной доли холестерина в мембоа-нообразушем раствопе. 5ос-йолспид - диолеоилйссхати-дклхолт. с~„,=0.1 1.1; 1;°=22°е . ло>'1

50 100 С,«* моль %

Независим^ эксперименты показали, что падение индуцированной грамицидином А проводимости холестерш-седержащих мембран во времени сопровождается уменьшением числа одиночных каналов.и их проводимости /35/. Изучение зависимости модифицирующего действия грамицидина А от содержания холестерина в мембранах продемонстрировало, что концентрация антибиотика, необходимая для наблвде-ния индуцированных им одиночных каналов, нелинейно зависит от мольной доли холестерина в бислое. З-образная зависимость, приведенная на рис.18, указывает на резкое изменение свойотв лшщц-ного бислоя при мольном отношении холестерин:фосфолипцд, лежащем в области 4. Это изменение не может быть обусловлено известным

с

-6

- -7 . -8

- -9

- -10

кг

50

хол.'

моль%

Рис.18. Зависимость концентрации грамицидина А, достаточной для формирования одиночных каналов, от содержания холестерина в мемб-ранообразущем растворе. (•} - смесь общих липидов мозга и холестерина, (о)- смесь диолеоилфос-фатидилходина и хо-

лестерина. =0.1 Й;

100

конденсирующим эффектом холестерота на липвдные бислои, т.к. замена холестерина на 7-дегцдрохолестерин или эргостерин, обладающих таким же, как холестерин, конденсирующим эффектом^ но птда-водит к инактивации каналоформерной активности грамицидина. Независимым подтвертдением специфических изменений липидного мат-рикса мембран, вызванных присутствием холестерина, является также резкое уменьпение К/Ма избирательности немодифицирозанных мембран из общего липэда мозга бш;а при увеличении мольного отнесения хоясстеран:(Тюсо,<шшзд вжэ 2 /6/. Результата, пряведанпне на

рис.17 качественно согласуются с данными о'концентрационной зависимости модифицирующего действия грамицидина А на эритроцктарные мембраны (рис.13), но полностью не исключают приведенной' выше трактовки этих результатов. Mcckho думать, что в случае эритроци-тарных мембран имеет место как не полная модификация эритроцитов изначально, так и инактивация образовавшихся грашщидиновых каналов во времени.

Исследование кинетики модифицирующего действия грамицидина А на холестерин-содержащие мембраны позволяет рассматривать процесс образования каналов и инактивацию каналоформерной активности антибиотика как результат различного лшщдного окружения полипептидных молекул в мембране. Введение холестерина в липидный бислой приводит к гетерогенности мембраны. При отношешш холестерин: фосфолипид выше 2 мембрана состоит как минимум из двух определенным образом обогащенных холестерином фаз /Presti et al., 1982; tt'achtel et al., 1987/. В обоих фазах антибиотик образует проводящие каналы различной проницаемости, которая определяется лигадашм составом фаз /Ко1Ь, Bamberg,1977; Гианик, Лапуткова, 1985/. Мсжно думать, что в обогащенной холестерином фазе грамицидин находится главным образом в непроводящем состоянии. Следует считать, что сродство грамицидина к различным фазам мембраны и скорости его входа в эти фазы и (или) перераспределения между ними различаются.

Таким образом, результаты приведенных исследований позволили сделать вывод, что грамицидиновый канал является весьма лабильной структурой, свойства которой зависят как от лидидного окружения, состава мембран, так и от ионных потоков, проходящих через канал. В ходестерин-содержащих мембранах выявлена эволюция каналоформерной активности этого антибиотика: переход от вксокопроводящей канальной структуры к Непроводящему состоянию. Этот вывод демонстрирует еще одно сходство модельных грамиццциновых каналов с ионными каналами клеточных мембран, для которых также показана зависимость параметров ион-проводящей системы от лишцного окру- . жения / Chen, 1978; Lacher et al.,1984/ И от ионного состава ореды /Костюк,1986/.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе проведено определение однойалравлен-■ ных потоков ионов через бислойные липидпые мембраны с помощью разработанного нами эффективного метода одновременного измерения параметров радиоизотопного массопереноса и электрических характеристик лппидннх бислоев.

Применение этого метода позволило б высокой степенью надежности определить характеристики транспорта ионов через немодифи-цировеннае липидные мембраны, а также степень взаимодействия встречных ионных потоков при индуцированном переносе ионов через лзшидные бислои. Обнаружение и количественные характеристики взаимодействия потоков ионов способствовали развитию модельных представлений о механизмах индуцированного истого транспорта и обоснованию его теорий.

В работе установлен ряд принципиальных особенностей движения ионов через мембраны, позволяющих определить тип транспортирующей системы. Так показано, что при движении катионов через модельные и эритропдтарные мембраны, модифицированные валиноми-цином, реализуются закономерности транспорта, осуществляемого с помощью подвижного переносчика. Трансмвмбранный перенос катионов через модельные и эритроцитарные мембраны в присутствии антибиотика грамицидина А характеризуется типом взаимодействия встречных потоков, присущи:.: движения частиц в узкой поре: однорядной диффузией в канале, имеющем два места связывания ионов.

Результаты определения катионной избирательности модифицированных грамицидином А мембран и взаимодействия ионных потоков при двияетя по каналу катионов разных видов • позволили обосновать представление об изменении энергетического профиля канала от "состава" проходящего по нему потока ионов. При этом скорости релаксации указанных изменений структуры канала должна быть соизмерима со скоростями прохождения через него ионов, что дало нам возможность пролпаюжить сзг:;сстзование своеобразно:'! "памяти" гра-!.п:ц:;".::::ового канала.

Показано, что обпартженно'з нают явление инактивации канало-".ор::с-р;гого э-Т^кта гра'.пг::пина А, прэятшгацееся в изменения ха-ра.-:?-т.::':тп:: :::—,;т:::рова::ного переноса катионов чор<?з модельные

и клеточные мембраны, связано с присутствие!.! в них хместерина.

Совокупность полученных данных позволила предложи ть концепцию механизма транспорта ионов через грамшщдиновьш канал, в которой ^вчитывается высокая: лабильность транспортирующей системы, влияние на которую оказывают липидное окружение и особенности движения по каналу ионов разного вида.

основняз вывода

1. Разработана методика одновременного определения встречных изотопных потоков и тока через модельные бкелойнне липидные мембраны, позволившая надело определять параметры массопереноса веществ как для немодифпцированных бислоев, так и в случае индуцированного траксмембранного переноса ионов, а также провести сравнительный анализ особенностей массопереноса и электрических характеристик мембран.

2. В результате сравнения величин изотопной пронвдаемости немодифпцированных липидннх мембран для катионов щелочных металлов и аниона хлора со значениями их проводимости на постоянном токе было доказано, что прй транспорте ионов через липидный мат-рикс бислойных мембран преобладает электронейтральный перенос, т.е. движение через мембрану ионных пар, образующихся в фазе мембраны.

3. Показано, что при индуцированном антибиотиками валиноми-цином и грамицидином А транспорте катионов щелочных металлов через липидные бислои шлет место взаимодействие встречных потоков катионов, что выражается в отклонении от единицы значений индекса в уравнении Уссинга-Ходжкина-Кейнеса. Причем эти отклонения различны для упомянутых модификаторов: в случае валиномицина обнаружено взаимодействие потоков, характерное для обманно;: диффузии, тогда как при модификации шмбран грамицидином А взаимодействие потоков отвечает теоретическим предсказаниям для транспорта ионов по узким каналам, тлеющим не сколы, о мест связывания (энергетичос?за ям),

4. Б случае индуцнрованного грамицидином А транспорта катионов через ллпакке бислои степень взаимодействия встречных потоков для катионов нь+ характеризуется величиной пдь = 2, тогда как при движении по каналу ионов Иа+ а,. =1.2. Зти факты свидетель-

- 47 -

ствуют о выраженных различиях энергетических профилей каналов для различных катионов щелочных металлов.

5. Исследования зависимости величин я^ от концентрации хлорида рубидия в примыкающих к мембране растворах позволило ■обосновать модель энергетического профиля канала, включающего 3 барьера и 2 яш.

6. Экспериментальные данные о зависимости значений пйь и n.Ja и катяонной избирательности от соотношения ионов нъ+ и На+ в водных растворах, разделенных модифицированной грамицидином А бислойной мембраной, позволили сделать вывод о существовании ка-тионзависимых трансформаций энергетического профиля канала, времена релаксации которых соизмеримы с временам прохождения ионов по каналу.

7. Сопоставление параметров индуцированного йалиномицином

и грамицидином А переноса ионов через модельные и эритроцитарные мембраны показало, что в случае эритроцитарных мембран транспорт катионов подчиняется закономерностям, присущим модельным липкд-ннм бислоям, что позволяет направленно использовать эти антибиотик:! в качестве химических инструментов при исследовании проницаемости клеточных мембран.

8. Обнаружено новое явление - инактивация каналоформерной активности грамицидина А. Установлена вырааенная зависимость скорости инактивации индуцированной грамицидином А ионной проницаемости от концентрации холестерина в мембранах.

ШССК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щагина Л.В., Наумов Ю.В. Использование Ое(ы) детектора три исследовании моделей биологических мембран // Тая. XXII созидания по ядерно;: спектроскопии и структуре атомного ядра: Киев. ■ 1972. - Т. 2. - С. 95.

2. Щагина Л.В., Наз^лов Ю.В;, Шкроб А.!,!., Лев A.A. Исследова-ле распределения щелочных металлов меяду водными растворами олей и гептаном в присутствии валнномкцина // Биофизика мембран: аунас. - 1972. - Т. 2. - С. 532-542.

3. Осипов В.В., вагина Д.З., Лез A.A. Сопоставленпе реэуль-атов экстракции катионов щелочных металлов с проводимостью геп-

тановых мембран, содержащих валиномицин // Тез. 1У Цеядунар. биофизического конгресса: Москва. - 1972. - Т. 3. - С. 151.

4. Шляхтер Т.А., Щагина Л.В., Лев Л.А. Изучение свойств 'границы раздела систем: водные растворы солей щелочных металлов - гептан с введенным в него комплексоном // Биофизика мембран: Каунас. - 1973. - С. 662-667.

5. Гринфельдт А.Э., Лев А.А., Щагина Л.В. Изучение потоков ионов через бимолекулярные фосфодипадные мембраны изотопным методом // Функциональная мор полотая, генетика и биохимия клетки: Л. - 1974. - С. 217-220.

6. Лев А.А., Букинский ЭЛ., Щагина Л.Е., Эрдей Л. Перестройки в бимолекулярных фосфолипидных мембранах, влияющие на их ионную селективность // Тез. Ill Всесоюзн. биохимического съезда: Рига. - 1974. - С. 104-106.

7. Schagina L.V., Lev A.A., Grinfeldt А.Е. Ion fluxes of al kaline.metals through valinoaycin modified and unmodified spheri oal lipid bilayer membranes // Materials of International bio-physios oongresss Copenhagen - 1975. - P. 112.

8. Lev A.A., Buzhinsky E.J., Qotlib V.A., Schagina L.V. Soma similarities of unmodified and valinomycin treated bilayers // Materials of International conference on carriers and channels in biological systemss N.Y. - 1975. - P. 18.

9. Соколова A.E., Щагина Л.В., ¡Лалев B.B., Лев А.А. Исследование взаимодейств;! -, валиномицина с катиона:® щелочных металлов в гептане экстра_;ионншл методом // Биоорг. химия. - 1976. -Т. 2. - й 4. - С. 498-505.

10. Соколова А.Е., Щагина Л.В., ¡ЛалевВ.В., Грачева О.А. Водно^лецитиновые. мицеллы в гептане к их модификация валиномици-ном // Биоорг. химия. - 1976. - Т. 2. - J5 5. - С. 611-620.

11. Соколова А.Ё., Щагина Л.В., ;,1алев В.В. Влияние валиномицина на структуру водно-лецктиновых липосом // Цитология. -1976. - Т. 18. - № 6.'- С. 744-746,

12. Щагина Л.В., Грккйельдт а,Э., Лев а.а. Сопоставление электрических и изотопных характеристик ионного транспорта чере: фосфолгагадные мембраны // Цитологи.'. - 1976. - Т. 18. - 2. -С. IE9-134.

13. ^"ринфельд? А.Э., Щапша Л.В. Изучение встречных потоков меченых катионов через сферические бислойные фосфолипвдные мембраны, модифицированные валиномицином // Молекулярные основы структуры и функциональной активности клеток: Л. - 1977. -

С. 54-57.

14. ЩагинаЛ.В., Гринфельдт А.Э., Лев А.А. Взаимодействие встречных потоков катионов в грамиццдиновых каналах, пронизывающих бислойные липидные мембраны // ДАН СССР. - 1978. - Т. 239.

- !i I. - С. 223-226.

15. Sohagina L.V., Grinfeldt А.В.,Lev А.А. Interaction of cation fluxes in gramicidin A channels in lipid bilayer membranes // Nature. - 1978. - V. 273. - P. 243-245.

16. Schagina L.V. Bimolecular lipid membranes modified by gramicidin A // Materials of Symposium "Energetic aspects of membrane transport"! Szeged. - 1978. - P. 17-19.

17. Щагина Л.В., Гринфельдт А.Э., Лев А.А. Исследование взаимодействия потоков катионов в бислойных фосфолипидних мембранах, модифицированных грамицидином A.'I. Определение числа ион-связываюцих мест и их положения в грамицидиновом канале // Биофизика. - 1980. - Т. 25. - & 4. - С. 648-653.

18. Гринфельдт А.Э., Малев В.В., Щагина Л.В. Изотопная проницаемость бислойных фосфслипидных мембран // Цитология. - 1980.

- Т. 22. - й 2. - С. 182-188.

19. Щапша Л.В., Гринфельдт А.Э., Лев А.А. Взаимодействие изотопных потоков Rb+ и Ка+ в грамицидиновом канале // Тез. Ш Советско-шведского симпозиума "Физико-химическая биология": Тбилиси. - 1981. - С. 104-105.

20. Blasko К., Sohagina L.V., llalev V.V., Gyorgyi S. Antibiotic induced ion transport of human erithrocytes // Abstracts of conference "Molecular organization and mechanisms of membrane function": Smolenice. - 1931. - P. 8.

21. :.1ачев В.В., Иапша Л.В. Изотопная проницаемость мембран ■ia основе мачополярпых растворителей // Трз. Всесоюзной ".он^чзрен-щи "Ионосслоктивные электроды :: iioninii: транспорт": Л. - 1932, -1. 14.

22.Schagina L.Y., Grinieldt A.S., lev А.А. Concentration Jopendence of bidirectional flux aa n characteristic of trana-

membrane ioa transporting mechanism // J. Membr. Biol. - 1983. -V. 73. - P. 203-216.

23. Blaako K., Schagina L. Data of the action of the chan-hel forming antibiotics gramicidin and primicin on the cation permeability of human erythrocytes // Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. - 1983. - V. 18. - P. 27.

24. Schagina L.V., Blaako K, The mode of modification of red blood cell membranes caused by gramicidin // Abstro of Symposium "Physico-chemical aspects of membrane function": Balaton-fiired. - 1983. - P. 37.

25. Blasko K., Schagina L., Sugar J., Ualev V., Gyorgyi S. A comparative study of primicin and gramicidin induced cation transport of human erythrocytes // Acta Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. - 1984. - V. 19. - P. 389-398.

26. Blasko K., Schagina L.Y., Gyorgyi S., Lev A.A. The mode of action of s«me antibiotics on red blood cell membranes // Gen. Physiol, and Biophys. - 1986. - V. 5. - P. 625-635.

27. Blasko K., Schagina L.V., Gyorgyi S. The mode of action of gramicidin on red blood "cell membrane // Materials of Symposium "Molecular organization and mechanizms of membrane function": Eisenach. - 1986. - P. 23.

20. Щагина Л.В., Гринйельдт А.Э., Лев А.А. Нарушение прин- • щша независимости ионных потоков при движении по гра:,зтндиково-му каналу катионов лгу:: видов // ДАН СССР. - 1987. - Т. 292. -»5. - С. 1257-1260.

29. Lev A.A., Schagina L.V., Grinfeldt А.Е. Jhanges of the energy profile of gramicidin A ionic channel dependent on the ratio of cations of different spicies in the flux passing through the channel // Gen. Physiol, and Biophys. - 1988. - V. 7. -P. 547-553.

.30. Blasko К.» Schagina L.V., Grinfeldt A.E., Lev A.A. The dependence of tracer-determined permeability coefficients of gramicidin A treated red blood cell membranes and lipid bilayers on the ionio composition of the media // Bioelectroohem. and 3io-energ. w. 1988. - V. 19. - P. 127-135.

31. Grinfeldt А.Й., Korchev G.3., Sohaçina L.Y. The action of cholesterol on channel conductivity of lipid bilayers treated

with gramicidin A 11 Abstr. of International symposium "Membranes lipid metabolism and organization "j Varna. - 1988. - P. 14.

32. Гринфельд? А.Э., Лев.А.А., Щагина Л.В. Изменение энергетического профиля грамиццдиновых ионных каналов в зависимости от соотношения катионов разных видов в проходящем через каналы потоке // Тез. У Советско-шве;1царокого симпозиума "Биологические мембраны: структура и функции": Рига. - 1988. - С. 13.

33. Schagina L.V., Blasko К., Grinfeldt А.В., Korchev Yu.B., Lev A.A. Cholesterol dependent gramicidin A channel inaotivation in red blood cell membranes and lipid bilayer membranes // Bio-ohim. et Biophys. Acta. - 1989. - V. 978. - P. 145-150.

34. Blasko K., Schagina L.V., Gyorgyi S., Ronto 0. Properties of gramicidin A channels in HBO membranes // Biochiaie. -1989. - V. 71. - P. 99-104.

35. Лов А.А., Корчов Ю.Е., Гринфельдт А.Э., Фе'Лгин A.M., Щагина Л.В. Влияние холестерина на проницаемость и кинетику инактивации грамицидиновых каналов в мембранах эритроцитов и в модельных липидных бислоях // Тез. всесоюзного симпозиума "Ода-ночные ионные каналы в биологических мембранах": Пущино. -1389. - С. 22.