Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стационарные и переходные процессы на бислойной липидной мембране и в неперемешаваемых слоях, связанных с работой ионофоров

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Стационарные и переходные процессы на бислойной липидной мембране и в неперемешаваемых слоях, связанных с работой ионофоров"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДЗЕКУНОВ СЕРГЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

СТАЦИОНАРНЫЕ И ПЕРЕХОДНЫЕ ПРОЦЕССЫ НА БИСЛОЙНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЕ И В НЕПЕРЕМЕШИВАЕМНХ СЛОЯХ, СВЯЗАННЫЕ С РАБОТОЙ «ОМОФОРОВ

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москоа - 1996

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-химической Биологии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Ю.Н.Антоненко. Доктор биологических наук, профессор В.Ф.Антонов. Кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник В.С.Соколов.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Защита состоится "_"_1996 года в __ часов

на заседании диссертационного совета К.058.05.68 по адресу: Москва, 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ. С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_".__1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Ионный транспорт через клеточные и субклеточные

мембраны является важной составной частью метаболизма клетки, вахным

элементом как биологических, так и модельных мембран является наличие неперемешиваемых слоев вблизи их поверхности, массоперенос d которых затруднен и осуществляется преимущественно диффузией. При протекании потока ионов через мембрану в неперемешиваемых слоях образуется градиент концентрации ионов, который может существенно влиять на скорость работы транспортной системы (Barry,Diamond,1984 ) . В настоящее время хорошо изучены закономерности образования стационарных градиентов pH на BJ1M. Локальные изменения концентрации ионов могут быть измерены различными экспериментальными методами, что дает возможность оценивать величину ионных потоков через мембрану (Антоненко,Булычев,1991) . Существенный прогресс в изучении кинетики ионного транспорта связан с применением релаксационных методов, и я особенности тех из них, которые основаны на измерении электрических величин (Benz, 1984). Однако эти методы, дающие представление о динамике процессов, не применимы напрямую для изучения неэлектроген-ных потоков из-за отсутствия потенциал-зависимых стадий транспорта. Поэтому ионофоры семейства нигерицина, осуществляющие электронейтральный Mef/Hf обмен, изучались на плоских бислойных липидных мембранах только стационарными методами и, соответственно, имеется лишь скудная информация о кинетических константах отдельных стадий работы таких переносчиков. В то же время известно, что благодаря наличию неперемешнваемых слоев, объемные градиенты слабых кислот или градиенты pH на мембране, содержащей различные типы переносчиков, могут трансформироваться в градиенты концентрации катионов щелочных металлов, и наоборот. Электронейтральные ионные потоки, создавая локальные сдвиги pH в неперемешиваемых слоях, могут влиять на работу

электрогенных протонофоров. Таким образом, изучение нестационарных процессов в неперемешиваемых слоях позволяет разрабатывать подходы к исследованию кинетических параметров электронейтрального транспорта ионов. С другой стороны, асимметрия ионного окружения мембраны, возникающая при образовании локальных концентрационных градиентов у ее поверхности, служит одной из причин существенной нелинейности вольт-амперных характеристик электрогенного ионного транспорта (Маркин,Чизмадкев,1974). Несмотря на высокую информативность (АБ^ппап,1993), эффекты, связанные с нелинейностью потенциал-зависимых стадий транспорта до недавнего времени подробно не изучались.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось экспериментальное изучение на модельной бислойной липидной мембране особенностей работы ионофоров в нестационарных условиях, в частности, при образовании и диссипации локальных градиентов ионов в примембранных неперемешиваемых слоях. Основное внимание было уделено взаимодействию электрогенных и электронейтральных ионных потоков в неперемешиваемых слоях в различных нестационарных условиях: при переходных процессах и периодическом изменении электрогенного потока. В число основных задач входила также разработка методов, позволяющих получать информацию о неэлектрогенных ионных потоках путем электрических измерений на БЛМ. Научная новизна работы. В ходе исследований была найдена и теоретически обоснована зависимость профиля концентрации вещества у поверхности мембраны от времени при диффузионном механизме релаксации. Показано, что электронейтральный обмен может изменять проводимость системы мембрана - неперемешиваемый слой при взаимодействии с электрогенным потоком, что дает возможность изучения электронейтральных ионных потоков простыми электрическими методами. Этот методический прием был успешно опробован на примере обмен-

ника нигерицина. Показано также, что другим экспериментальным

подходом, позволяющим получать информацию о кинетике работы ионофора, ятзлястся измерение постоянного тока при воздействии на мембрану переменным электрическим полем различной частоты. Изменение постоянного тока в этих условиях связано с нелинейностью проводимости мембраны а присутствии ионофора. Сделан вывод о существовании локальных нестационарных сдвигов рн, которые распространяются на существенно меньшие расстояния, чем толщина неперемешиваемого слоя, и оказывают заметное влияние на работу ионофора п нестационарных условиях.

Нрактиче екая значимость работы. Построенная модель диссипации локальных сдвигов рН может использоваться в дальнейших исследованиях транспорта ионов в неперемешиваемых примембранных слоях, а также работы неэлектрогенных ионофоров. Результаты воздействия переменным

электрическим полем на работу ионофоров могут быть использованы при разработке методов изучения ионного транспорта через модельные и природные мембраны, а также механизмов превращения энергии в мембранных системах.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на всероссийском совещании "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1494) и на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им . Л.H.Белозерского MJУ (Москна, 1994).

Публикации. По материалам исследований опубликованы 3 печатные

работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литература и трех главах, описания материалол и методов исследования, изложения результатов в трех главах, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включая 22 рисунка, библиографический список содержит 107 наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для формирования БЛМ использовались растворы фосфолииидов в н-декане (20 мг/мл): азолектин ("Sigma") с добавкой холестерина ("Serva") 1:2 по весу; 1,2-дифитаноил-зп-глицеро-3-фосфохолин ("Avanti"). В ходе работы использовалась эквимолярная буферная смесь из трис, MES, и р-аланина ("Fluka"). В качестве фонового электролита использован холинхлорид ("Fluka"). Протонофорытетрахлортрифторметил-бензимидазол (ТТФБ), карбонилцианидхлорфенилгидразон (СССР) ("Fluka") и ионофор нигерицин ("Calbiochem") добавлялись симметрично в ячейку с БЛМ в виде спиртовых растворов.

Ag-AgCl электроды в 1М растворе КС1, соединенные с ячейкой агаровыми мостами, применялись для измерения трансмембранной разности потенциалов; Ag-AgCl электроды из серебряной проволоки, или из пористого серебра, погруженные в раствор буфера, применялись для регистрации тока. Профили рН в неперемешиваемых слоях (НС) измерялось стеклянным микроэлектродом, заполненным протон-селективным коктейлем ("Fluka"). Микроэлектрод перемещался гидравлическим приводом со скоростью 2,5 цм/сек. Использовались усилители фирмы Keiíhley (модели 428 и 617).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Образование и релаксация протонного потенциала на бислойной липидной мембране, сопряженная с неэлектрогенными ионными потоками, индуцированными нигерицином.

Для создания сдвигов рН вблизи БЛМ к ней прикладывался импульс разности потенциалов в присутствии протонофора. В условиях малой

и0,тВ

40

Рис.1 Зависимость начальной разности

потенциалов и0 на мембране от длительности

30

20

6

импульса потенциала Тд при различной кон-

2 центрации буфера: (1) 1 мМ; (2) 10 мМ; (3)

3 100 мМ. 2*10"' М ТТФБ, рН 7,0.

10

о

0 2 4 6 8 10

Т», сек

буферной емкости поток протона сопровождался сдвигами рН у поверхностей мембраны. После формирования стационарных профилей рН в НС цепь размыкали и регистрировали релаксацию потенциала, который в присутствии протонофора отражал градиент рН на БЛМ. На рис.1 представлена

зависимость величины разности потенциалов на 15ЛМ, измеряемой непосредственно после размыкания цени, от времени приложения к мембране внешнего напряжения. При поддержании тока более 20 с величина максимального потенциала достигает стационарно го

значения. При увеличении концентрации буфера величина ¡/^ уменьшается . Таким образом, в релаксационных опытах потенциалы разомкнутой цепи соответствовали градиенту рП на мембране, образующемуся из-за изменения рН в неперемешиваемых слоях с двух сторон БЛМ.

В отсутствие нигерицина величина градиента рН, образующегося на БЛМ, определяется, с одной стороны, током через мембрану, а с другой - скоростью утечки протонов в неперемешиваемые слои (или диффузией молекул буфера к мембране). В стационарных условиях величины протонных потоков через мембрану и через неперемешиваемые слон должны быть

На рис.2 изображена зависимость потенциала разомкнутой цепи от

равны.

UR,mB 40

30

20

10

0

Рис.2 Зависимость потенциала разомкнутой цепи от квадратного корня из времени при различной концентрации нигерицина. Сверху вниз: О, N, 10N, 100N, (N = 4*10"® М);

2*10* М ТТФБ, 60 мМ КС1, рН 7,0.

0 12 3 4 t, сек1/2

времени для различных концентраций нигерицина в условиях избытка КС1.

1/2

Выбор масштаба по горизонтальной оси в виде V определяется тем, что, как было показано в теоретическом разделе работы, временной ход релаксации разности потенциалов на БЛМ, связанной с диффузией молекул в неперемешиваемых слоях, на малых временах (до 10 с) линеаризуются именно в данных координатах. Как видно из рис.2, наиболее близка к линейной зависимость, соответствующая отсутствию нигерицина (верхняя кривая), что говорит о диффузионном механизме релаксации градиента рН в НС.

Введение в систему нигерицина в первом приближении можно представить как открытие дополнительной утечки протонов из непереме-шиваемого слоя, способствующей релаксации протонного потенциала. Эта утечка должна зависеть от параметров, определяющих скорость работы нигерицина - его концентрации, рН, концентрации и вида катиона. На рис.3 дана временная зависимость потенциала при различных концентрациях ионов калия в среде в присутствии нигерицина. Данные, соответствующие различным концентрациям калия, были нормированы относительно максимума начальной величины потенциала. При увеличении концентрации К* происходит снижение величины £Л и одновременное ускорение релакса

и, %

80 60 40 20 0

Рис.3 Зависимость потенциала разомкнутой

цепи Ц) от времени при различной концентрации КС1 (2*10"4 И ТТФБ, 1,34»10~7 М нигерицин, рН 7,0). Сверху вниз: 0, 1,2, 4, 8, 16 мМ КС1. Данные перестроены в процентах от начальной величины и0 потенциала.

0 12 3 4 г, сек1/2

ции потенциала. Таким образом, создание обменного потока приводит к снижению величины начального потенциала и к ускорению процесса его релаксации, при этом также наблюдаются значительные отклонения зависимости потенциала от линейной в указанных координатах. Этот результат, согласующийся с разработанной математической моделью, может быть использован I! качестве критерия тоге, что процесс релаксации имеет не только диффузионную природу.

Стационарный ток через БЛМ при наличии н ней элсктрогенного протонофора и малой буферной емкости омывающих растворов лимитируется диффузией протонов череп НС, Естественно предположить, что обменный протонный поток на фоне электрогенного потока, снижая ДрН на БЛМ, может также снижать градиент рН и п неперемешиваемых слоях и, следовательно, препятствовать диффузионной поляризации.

На рис.4 приведена зависимость от времени величины тока через БЛМ во время "генерации градиента рН" при различных концентрациях ионов калия в среде в присутствии нигерицина. Видно, что при увеличении концентрации К4" происходит упеличение стационарной величины тока. На вставке данные перестроены в координатах: нормированный ток -обратный квадратный корень из времени. Такая зависимость тока от времени указывает на то, что диффузионная поляризация играет

1Ж" а* 8.» и и.

Рис.4 Зависимость тока 1й через мембрану от времени при различной концентрации КС1 (2*10"4 М ТТФБ, 1,34*10"7 М нигерицина, рН

I, нЛ

400

600

200

-1

-и "

-15 -3

-2.3 Л

2

7,0). Снизу вверх: О, 1, 2, 4, 8, 12 мМ

КС1. На вставке: те же зависимости в координатах 1(1)/15( от ■Г1''2.

О

0 2 4 6 8 г, сек

определяющую роль в релаксации трансмембранного тока (Кеитске,1971). Видно, что при I > 1 с экспериментальные данные хорошо линеаризуются.

Такие же эксперименты были поставлены при различной концентрации натрия. С ростом концентрации этих катионов в присутствии нигерицина наблюдается рост причем ионы калия являются более эффективными, чем ионы натрия. В теоретической части работы было показано, что увеличение стационарного тока через БЛМ, измеряемого в условиях поляризации, пропорционально стационарному потоку протонов, переносимых нигерицином. На основании этих данных были рассчитаны величины констант Михаэлиса для нигерицина по калию и натрию, которые составили 6,4 мМ (калий) и 30 мМ (натрий). Эти значения хорошо согласуются с катионной селективностью катион/Н* обменного транспорта, осуществляемого нигерицином, и литературными данными, полученными при непосредственном измерении стационарных потоков. Тем самым на примере нигерицина была продемонстрирована возможность применения данного метода для оценки кинетических констант работы неэлектроген-ного обменника.

Существенно при этом, что электронейтральный поток может изменять электрические параметры системы мембрана - неперемешиваемый

слой при взаимодействии с электрогетшм потоком.

Глава 2_,_ Транспорт ионов, индуцированный переносчиками"а условиях периодического изменения разности потенциалов на мембране. Известно, что неперемешиваемым слоям принадлежит существенная роль и создании асимметричных условий на БЛМ и увеличении нелинейности. Измерения, проведенные в этой работе, показали, что искажения переменного тока под влиянием неперемешиваемых слоев могут достигать значительной величины. В условиях сильной поляризации коэффициент второй гармоники тока изменялся от 1-2 до 30 процентов на частотах до 30 Гц. Одним из проявлений нелинейности также является выпрямление переменного тока.

На рис.5 представлен типичный результат воздействия переменного электрического поля на стационарный ток через БЛМ в присутствии нротонофора СССР. Изначально к мембране была приложена постоянная разность потенциалов, что вызвало постоянный ток через нес. Е! момент времени, отмеченный стрелкой, на мембрану было подано синусоидальное напряженке, которое суммировалось с постоянным напряжением. Результатом этого явилось быстрое возрастание постоянного тока через БЛМ до

I, пА

1500 ' Рис.5 Запись увеличения тока вследствие

наложения переменного напряжения с частотой 1 кГц и амплитудой 50 мВ. 50 цМ СССР, рН 7,0. Постоянная разность потенциалов на мембране 50 мВ.

1000 2000 1, сек

1400

значения, отмеченного на рисунке буквой "А", затем медленная фаза возрастания до уровня "В". После выключения переменного поля значение постоянного тока возвращалось к исходному. Контрольные эксперименты показали, что эффект возрастания тока исчезал, когда вместо мембраны в схему включалась модельная ЯС цепь с параметрами, близкими к электрическим параметрам БЛМ в данных условиях. Возрастание тока под воздействием переменного поля наблюдалось также, когда ток через мембрану в присутствии протонофора индуцировался разностью химических потенциалов по протону с двух сторон БЛМ при защелачивании одного из растворов.

Рис.6 демонстрирует описанный эффект возрастания постоянного тока при различных амплитудах переменного напряжения (частота 1 кГц). Хорошо видно, что возрастание тока пропорционально постоянной разности потенциалов при фиксированной амплитуде переменного поля, а также амплитуде ПЭП при неизменном постоянном напряжении.

Помимо простого объяснения, состоящего в том, что переменное поле увеличивает поток протонов через мембрану, существует также возможность того, что под воздействием ПЭП происходит изменение площади поверхности мембраны при неизменном удельном токе. Для того,

I, пА ~ 1500 -

Рис.6Вольт-ампернью характеристики. Снизу

вверх: 0, 25, 50, 75 мВ переменного напря-

1000

жения. 50 цМ СССР, рН 7,0. Частота переменного поля 1 кГц.

500

0

0 20 40 и, тВ

О 500 1000 1500

г, сек

О 500 1000 1500

рН

5,4

5,3 5,2 5,1 5,0

Рис.7 а) Влияние переменного поля на концентрацию протона в примембранном слое на различных расстояниях от поверхности БЛМ. Ь) Профиль рН в неперемешиваемом слое (транс-сторона). Условия: 1 мМ буфер, 50 цМ СССР, рН^^б.О; рЦ^в.ЗБ; х1-хЗ обозначает расстояние от поверхности мембраны до микроэлектрода. Амплитуда

переменного напряжения 100 мВ. Толщина НС: 486 +/- 7 мкм.

чтобы исключить такую возможность, были поставлены специальные опыты, в ходе которых поток протонов через БЛМ измерялся другим способом, а именно путем регистрации цримембракных сдвигов рН с помощью протонселективного микроэлектрода.

Рис.7 иллюстрирует изменения концентрации протона в НС под воздействием переменного поля, измеренные на различных расстояниях от поверхности мембраны с транс-стороны. Так как амплитуда профиля рН пропорциональна величине протонного потока через неперемешиваемый слой, изменения рН на фиксированном расстоянии от поверхности мембраны отражают увеличение протонного потока через неперемешиваемые слои. Поскольку локальные изменения рН контролируются процессами диффузии, характерные времена этих процессов значительно больше, чем

время описанного выше нарастания тока. Кинетика изменений рН свидетельствует о действительном возрастании удельного тока в системе электрогенного транспорта под действием переменного поля.

Естественным образом данный результат может быть связан с нелинейностью вольт-амперной характеристики (ВАХ) ионофора. Если предположить, что ВАХ имеет отличную от ноля вторую производную при данной величине постоянного потенциала, то при наложении периодической разности потенциалов будут отличаться вклады в суммарный ток от положительного и отрицательного полупериода тока (рис.8). С целью выяснения применимости такого подхода к описанию экспериментально регистрируемого выпрямления тока, вольт-амперные характеристики протонного транспорта с участием протонофора СССР были реконструированы в форме полиномов на основании измерений величины Л1/1|). Расчетные зависимости показали хорошее соответствие с экспериментальными данными. Приведенные в работе результаты иллюстрируют возможность реализации достаточно простого метода регистрации эффектов нелинейности в системе БЛМ, модифицированной протонофором, и точного измерения параметров, характеризующих эту нелинейность.

При щелочных значениях рН накопление аниона СССР у границ мембраны с раствором вызывает спад тока при фиксации потенциала, и,

Рис,8 Схема, иллюстрирующая выпрямление переменного тока за счет искажения формы колебаний. Стрелками отмечены значения тока, смещенные в сторону его возрастания из-за нелинейности вольт-амперной характеристики.

тем самым, различие между стационарными и мгновенными ВАХ. При рН <

7 релаксация тока отсутствует, и вольт-амперная характеристика работы СССР не изменяется со временем. В этих условиях наблюдается хорошее соответствие стационарных вольт-амперных характеристик и расчетных зависимостей, полученных а результате независимых измерений величины выпрямлении. Такое соответствие является иллюстрацией факта того, что лимитирующей стадией в работе СССР при низких рН является перенос ашюна через объем мембраны.

В то же время, даже в условиях поляризации выпрямление переменного тока должно определяться мгновенной ВАХ транспорта, если период переменного тока не превышает характерных времен релаксации при фиксации потенциала. Например, время релаксации тока для СССР при рН=7 составляет 4-5 мс (О'ЭЬа^Ьпеэзу,Н1 а(1ку, 1983) , период переменного поля при измерении ДI/равнялся 1 мс. Таким образом, выпрямление тока позволяет рассчитать мгновенную вольт-амперную характеристику. Экспоненциальная зависимость кинетических констант от потенциала позволяет характеризовать систему электрогенпого транспорта величиной нелинейности Д1/10, не зависящей от постоянной разности потенциалов.

Итак, выпрямление тока легко объяснить нелинейностью стационарной ВАХ, если она не отличается от начальной зависимости мембранного тока от потенциала - например, в случае транспорта с участием СССР в условиях описанных экспериментов. Однако в большинстве случаев трактовка эффекта усложняется. Так как различные части пространственной структуры липидного бислоя обладают различной емкостью, а проводимость различных стадий имеет, очевидно, разную нелинейность, на разных частотах будут отличаться вклады отдельных стадий в суммарный эффект. С другой стороны, □ отличие от статической модели, требуется учет конечной скорости перемещения ионов в электрическом поле. Таким образом, выпрямление тока обнаруживает зависимость от

-0.05 -0.1 -0.15

0.1 0.05

0

Рис.9 Изменение постоянного тока под воздействием переменного поля. 10 рМТТФБ, рН 6,0 (1), 6,7 (2), 7,4 (3); 50 мМ буфера. Проводимость мембраны [М0м"'см~2]: 640 (1), 460 (2), 240 (3). Постоянное напряжение на мембране 50 мВ, амплитуда перем-

енного 50 мВ.

102 ю3 ю4

[, Гц

частоты переменного напряжения, подаваемого на мембрану, при постоянстве его амплитуды.

На рис.9 показана зависимость относительного изменения тока от частоты для ТТФБ, полученная при различных рН. При этом изменение постоянного тока может иметь как положительный, так и отрицательный знак, в зависимости от частоты переменного. Такое поведение частотной зависимости было проанализировано в рамках теоретической модели, представленной далее.

В условиях малой буферной емкости, несмотря на то, что падение потенциала на НС, как правило, пренебрежимо мало, неперемешиваемые слои могут оказывать влияние на выпрямление тока путем создания асимметричных условий на БЛМ. Так как в контексте этой работы представляет значительный интерес роль неперемешиваемых слоев в наблюдаемых процессах, частотная зависимость выпрямления была измерена в условиях малой буферной емкости раствора. Результаты представлены на рис.10, светлые символы. Снижение концентрации буфера от 50 до 1 мМ вызывает заметное изменение частотной зависимости выпрямления. Существенно, что воздействие переменным полем снижает постоянный ток во всем диапазоне частот вплоть до 30 кГц. Этот

Al

1,0

0,9

0,8

А 2 ....., оэоо ■ ■ В

....... ¿у J&ооо^Р t ■ i ■ I*|J • « II ttatl » а • IMI¿ . ■ > 1 lili« -, J-LIMU>l,..| ,t ,1 liuil . . 1 .11 iAluL,. I 1.1 muí

Ai I

o

1,0

0,9

0,8

2 3 4 lg(f),rií 2 3 4

Рис.10 Влияние буферной емкости на частотную зависимость выпрямления тока. Концентрация буфера: 1 мМ (А), 50 мМ (В); Светлые символы: зависимость в отсутствие нигерицина. Темные символы: 0.67 jtM нигерицина. Остальные условия: 10 рМ ТТФБ, 10

мМ КС1, рН 6,0. Проводимость мембраны [кОм"'см"г]: 0,124 (1); 0,86 (2); 1,14 (3);

1,68 (4). Постоянное напряжение на мембране 50 мВ, амплитуда переменного 50 мВ.

результат может быть объяснен на основании модели, предполагающей возникновение нестационарных сднигон рН вблизи от поверхности мембраны и распространяющихся на существенно меньшие расстоянии, чем толщина НС, но однако достаточных для оказания заметного влияния на нелинейность ВАХ ионофора. Такая модель существенно расширяет наши представления о неперемешиваемых слоях и может оказаться полезной при анализе процессов ионного транспорта на природных мембранах.

Предыдущие опыты с релаксацией потенциала на БЛМ и измерения тока в услониях поляризации показал» , что полирн.чацня в неперемешиваемых слоях может быть устранена созданием обменного протонного потока, осуществляемого нигерицином в присутствии калия. В данном эксперименте введение в раствор нигерицина при достаточном количестве

калия позволило и получить частотную зависимость выпрямления, практически совпадающую с кривой, которая соответствует условиям большой буферной емкости. При 50 мМ буфера и прочих равных условиях введение нигерицина практически не сказывается на зависимости постоянного тока от частоты переменного поля.

Снижение нелинейности может означать, что скорость работы нигерицина не уступает ТТФБ. Исходя из величин констант скорости, характеризующих работу нигерицина, можно заключить, что нигерицин даже на высоких частотах влияет на протонный баланс на поверхности мембраны и в примембранных областях. В этом случае контроль нелинейности может служить дополнительным методом косвенного изучения работы неэлектрогенных переносчиков. Не исключена также возможность влияния нигерицина на электрогенные стадии переноса иона через межфазную границу, несомненно дающие вклад в общую нелинейность.

Глава 3. Моделирование аффектов, обусловленных нелинейностью проводимости БЛМ в присутствии электрогенного переносчика.

Рассмотрение статической вольт-амперной характеристики объясняет изменение постоянного тока посредством искажений формы подводимого К БЛМ гармонического напряжения. Расчеты нелинейных искажений обычно проводятся при упрощающих предпосылках о том, что характеристики системы не зависят от времени и частоты. Однако учет реактивных (емкостных) свойств БЛМ может дополнить трактовку эффекта выпрямления. В качестве основы такого рассмотрения была взята простая модель работы протонофора по механизму малой карусели, хорошо описанная в литературе. На основе модели четырех состояний было получено выражение для проводимости из системы уравнений мембранного транспорта, предусматривающих экспоненциальную зависимость констант скоростей от разности потенциалов. Полученная система уравнений преобразуется

к следующему безразмерному виду:

= + агг| + а^-Н

С?С

(П

= Ь0 аЦ * Ь, ПсЬ| + ЬД

(2)

где константы а- и связаны с кинетическими константами ионофора, ц означает разность поверхностных концентраций аниона ионофора, и -рааность потенциалов на КЛМ, I. - ток через нее. Величину и(1) можно определить в виде суммы постоянной и переменной составляющих:

Уравнение (1) может быть решено численным методом относительно г), а значения тока получены из (2) при заданных пяти параметрах. Качественный анализ уравнений (1)-(2) показывает, что зависящий от

частоты эффект выпрямления тока должен наиболее сильно проявляться при больших кд. Уравнение (1) было решено методом Рунге-Кутта четвертого порядка точности аппроксимации при значениях параметров, соответствующих протонофору СССР и мембране из дифитаноилфосфатндил-холина: кА = 200 с"! , ки = 5000 с"1, = 2,8 пМ/см' ¡1 |1М СССР в растворе), Кс„ = 1,0 (рН = рК = 6.09), Сш = 0,5 цИ/см*.

Рис. 11 и 12 иллюстрируют протекание внутримембранных процессов, вызванных переменным полем. По оси абсцисс отложена величина безразмерного потенциала, подводимого к мембране: и=0+в81п(2я£г), а-р=2. Отношения ЛЫ и взяты к начальным величинам А^ и I,

соответствующим постоянному потенциалу на мембране: и=/} (на диаграммах начальные положения точек изображены знаком "+"). Замкнутые контуры соответствуют траекториям предельного цикла, на который с течением времени выходят изображающие точки.

Перенос аниона при щелочных рН сопряжен со значительным накоплением его у поверхностей БЛМ. Из рис.11 видно, что на низких

иШ = р + а зало с

(3)

-3

Рис.11 Относительные изменения тока ¿1-/1 через мембрану, обусловленного переносом аниона. Частота переменного поля: а - 102, Ь - 103, с - 104 Гц; рН = рК + 2

О 3. 2 3 4

частотах в указанных условиях имеют место значительные искажения тока (форма контура заметно отличается от эллипса). Проводя касательные к каждой траектории можно получить мгновенные БАХ ионофора. Хорошо видно, насколько величина <И/<1и может отличаться от статичной ВАХ. С повышением частоты, однако, зависимость тока от напряжения стремится к одной линии (исчезает фазовый сдвиг). Это означает, что анион не пересекает объем БЛМ на высоких частотах, а перенос аниона представляет лимитирующую стадию суммарного процесса транспорта. При рН=рК и ниже фазовая траектория имеет вид экспоненты. На рис.12

Рис.12 Относительные изменения разности поверхностных концентраций Лц/щ аниона переносчика. Частота переменного поля: а - 10', Ь - 103, с - 10* Гц. рН = рК

показана зависимость разности концентраций аниона на поверхностях мембраны. С . повышением частоты амплитуда колебаний этой разности уменьшается. Существенно, что колебания несимметричны относительно, начальной точки. Хорошо видно, что на высокой частоте среднее значение разности поверхностных концентраций смещено. Таким образом, изменение постоянного тока {И/1п = 0,2462 при 10 кГц) в данном случае может быть связано со смещением Ац/ц^ распределения ионов у мембраны, в отличие от искажений формы тока. Таким образом, изменение постоянного тока под действием неременной разности потенциалов может объясняться различными механизмами. Частотная зависимость величины И/хц носит слабо выраженный характер, в отличие от ТТФБ, что соответствует экспериментальным данным.

ВЫВОДЫ

1. На примере ионов водорода проанализирована кинетика образования и диссипации градиента концентрации вещества и пеперемешипаемых цримембранных слоях. Показано, что диффузионный механизм релаксации прогонного потенциала предусматривает линейную зависимость потенциала на мембране от квадратного корня из времени.

2. Указанная зависимость протонного потенциала от времени выполняется в диапазоне времен, соответствующем диффузии протона через неперемешиваемый слой. Электронейтральный поток протона через мембрану существенно изменяет кинетику релаксации АрН.

3. Найдены условия, в которых происходит сопряжение электрогенного потока протонов через мембрану с процессом К*"/Нт-обмена, осуществляемого нигерицином. В этих условиях проводимость БЛМ в присутствии протонофора зависит от концентрации калия и среде.

4. Кинетика релаксации тока через БЛМ может быть использована для измерения скоростей К* /Н*-обмена. В частности, были измерены

величины наблюдаемых констант Михаэлиса для нигерицина по калию и натрию при хорошем согласии с известными из литературы данными.

5. Показано, что воздействие переменным электрическим полем на мембрану, содержащую протонофор, изменяет ее стационарную проводимость на время воздействия. Основой данного эффекта является нелинейность потенциал-зависимых стадий ионного транспорта.

6. Нелинейность системы электрогенного транспорта проявляется различными путями в стационарных и нестационарных условиях. Рассмотрены два возможных механизма трансформации энергии переменного электрического поля в работу по направленному переносу ионов.

7. Помимо градиентов рН, затрагивающих весь НС, существуют локальные неравновесные сдвиги рН, распространяющиеся на существенно меньшие расстояния от поверхности БЛМ, и оказывающие заметное влияние на работу ионофора в нестационарных условиях.

1. Дзекунов С.М., Денисов Г.А., Антоненко Ю.Н. Релаксация потенциала на бислойной липидной мембране, сопряженная с неэлектро-генными ионными потоками, индуцированными нигерицином. Биологические мембраны, 1995, Т.12, 4, 433-444.

2. Дзекунов С.М., Антоненко Ю.Н. Использование релаксации потенциала на бислойной липидной мембране для измерения неэлек-трогенных ионных потоков, индуцированных нигерицином. Цитология, 1995, Т.37, 4, 372-373.

3. Дзекунов С.М., Антоненко Ю.Н., Поль П. Влияние переменного электрического поля на стационарные ионные потоки, индуцированные ионофором. Биологические мембраны, 1996 (е печати).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ