Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронейтральные потоки ионов водорода через фосфолипидные мембраны и локальные изменения рН в примембранных слоях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электронейтральные потоки ионов водорода через фосфолипидные мембраны и локальные изменения рН в примембранных слоях"

Р Г Б ОД

2 . "•] мсскозскии государственный университет

ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

на правая рукописи

АНТОНЕНКО Юрий Николаевич

ЗЛЖЕРОНЕШБАЛЬНЫЕ ПОТОКИ ИОНОВ ВОДОРОДА ЧЕРЕЗ ФОСФОЛИПЩЩЬЕ ЖИЕРАШ И ЛОКАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ рН В ПРИМЕИБРАННЬЕ СЛОЯХ (03.00.02 - биофазика)

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1594

Работа вшолнена в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ

ОЗши&льнне ошонзнты:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Ю.А.Чизмадеев,

доктор биологических наук, профессор Б.Ф.Антонов

доктор биологических наук, профзссор И.И.Иванов

Ведущая организация - Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита состоится " " 1994 г. в часов миг

на заседании специализированного совета Д.053.05.53 по адресу: 119899, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ Автореферат разослан " " 1994 г.

УченнЗ! секретарь специализированного совета доктор Око логических наук профессор

т.1

Т.Е.Кренделева

<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

исследования. Биологические

Убраны содержат различные типы транспортных систем, такие как иные каналы, белки-транслокаторы, транспортные АТЗазк, различные тжгортеры. При этом транспортные системы могно разделить на два новных класса: злектрогенные и неэлектрогенные. Электрогенный онспорт ионоз предполагает дерзкое ионов через мембрану вместе с : зарядом, тогда как неэлектрогенный перенос ионов происходит без ¡реноса заряда через мембрану, что достигается путем организации хзцесса антипорта и/или симпорта. Соответственно злектрогенные )тски сопровождайся протеканием электрического тока через змбрану, в то время как неэлектрогенные штоки не сопровождаются рансмембранвым электрическим током.

Исследования механизмов функционирования транспортных систем, зторые прозодились на модельных бислойвнх лшшдных мембранах, граничнзались, как правило, изучением электрогеЕннх ионофэров и аналоформероз. Это связано с простотой измерения электрогенннх онных. потоков через мембраны - с помощью измерения электрических ■оков чзрзз мембрану. При этом остазались в стороне такие ваяные Транспортные системы, как неэлектрогенные переносчики. Механизм их заботы мсг-эг быть изучен з модельной системе - на искусственных ¡ислойных липидных мембранах на примере пзреносчикоз семейства шгерицина, а такне слабых кислот и оснований. Разработка новых высокочувствительных методез измерения элэктронейтралъных потокоз ;юнов через фосфолппидныз мембраЕЫ стала осеовой настоящего исследования.

Вазным аспектом данной работы было исследование обрззоваЕия локальных изменений концентраций ионоз водорода з яеперемешизаемых примембраЕЕЫХ слоях. Лело з том, что работа мембранных неэлектрогенннх переносчзшоз, так не как и других мембранных

г

ферментов, определяется не только объемной концентрацией, но i локальной концентрацией веществ, в первую очередь ионов. С друго! стороны, фунз-оионирование самих мембранных белкоз моает вызывай локальные изменения концентраций, например, в примеябранных слоях что приведет к слоеной регуляции биологических процессов, биологической литературе имеются лень фрагментарные указания н существование локальных изменений концентраций веществ, а имеЕЕ концентрация метаболитов вблизи кишечного эпителия (Winne, 1973), также примембранной активности воды в процессе набухай расТСТелЬЕЦХ клеток (Barry and Diamond, 1984).

Разрабатываемая нами коЕцегптя локальных изменений концентрас катионов может быть распространена не только на облас непеременгваемых пршембранных слоев, но и на область сам-поверхности мембраны. Следует сказать, что возможность локально изменения концентрации юноз водорода, связанного с поверхност мембраны, представляет собой физико-химическую основу шире обсуждаемого в литературе локализованного механизма окислительнс

ФОСфОрИЛИРОВаНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ (СМ. Например ОбЗОр Westerhoff ai., 1984). Б теории Митчелла утверждается, что злектронпереносш цепи митохондрий, хлоропластов и бактерий сопряжены с систе: синтеза АТФ посредством разности электрохимических потенциалов ио: водорода на сопрягахиих мембранах. В теориях локального сопрянж протоны передаются от дыхательной цепи к АТФ-синтазе прямо вну мембраны, что возможно только при наличии кинетического барьера векторного переноса ионов водорода в водную фазу. Выход их в ос раствора в этом случае мог Сыть лишь побочной реакцией. Т; образом, вопрос о существование или отсутствии барьера пере: ионов водорода на границе раздела имеет принципиальное значена настоящее время в литературе представлены экспериментальные дан свидетельствушше как в пользу существования кинетического бар

ереносу протонов, так и з пользу его отсутствия.

В связи с вышесказанным было выбрано следующее направление :сследований - изучение механизмов неэлзктрогенного транспорта ионов :ерез мембраны. Это направление взаимосвязано с другим юесторонним изучением феномена локзльеых изменений концентрации гонов водорода б примембранных слоях при их неэлектрогенинх тэансмембрзннкх потоках, а таете изучением роли локальных изменений зН в процессах транспорта. Для этого репались следующие основные ¡адачи исследования:

1. Разработать метода измерешя наэлектрогеЕных потокоз юеов водорода через мембрану путем регистрации локальных изменений ?Н в примембраЕНЫх слоях

2. Разработать адекзатную математическую модель процесса щцуцированЕого неэлектрогенного транспорта ионов водорода, зключающую локальные изменения концентрации катиоиов в примембранных :лоях

3. На примере неэлектрогенных ионофоров семейства Еигерицина изучить влияние локальных изменений концентраций катионов на 1роцессы ионного транспорта

4. Провести скрининг продуцентов неэлектрогенных ионофоров среди культур стрептомщэтоз

5. Изучить феномен локальных изменений концентраций ионов водорода, связанных с поверхность!) фосфолипидной мембраны, которые проявляются при неэлектрогеиных трансмембраЕНых потоках протоиоз

6. Исследовать возмокность существования кинетического 5арьера для векторного переноса ионов водорода от поверхности «ембраны з водную фазу в связи с изучением механизма окислительного фосфзрилирования 'в митохондриях

Настоящая работа проводилась в НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского КГУ с 1979 г.

Научная возгзнз и научно-практическая ценность работа. Разлнчшми методами показан феномен локальных изменений концентраций катионов в веперемешиваемцх цриыембраЕных слоях при незлектрогенноы транспорте шоии-'Бзщрояа через мембраны. Экспериментально показано, что при высоких величинах потоков отклонения рН от объемных значениг могут достигать дзух единиц, при этом образуется еще более зысокиг градиент рЕ с дзух сторон мембраны. Это естественно оказываем драматическое влияете на поток тонов водорода через мембрану I сопряженные с еим потоки. Разработан высокочувствительный мето; регистрации неэлектрогеЕЗЫх потоков ионоз водорода через мембрану, основанный на измерении протонофор- зависимого потенциал; разомкнутой цепи. Этим методом подробно изучены иое- транспортны! свойства ионофоров семейства нигершхина, в частности сделан количественные оценки их ионной селективности. Новый метод позволп провести широкий скрининг продуцентов антибиотиков- ионофоров сред многочисленных штаммов ~ гсгер^шусег, в результате был обнаруже: новый оригинальный антибиотик кафамшшн.

Был обнаружен феномен связанного с поверхностью образована локального градиеита ионов водорода в отсутствие объемных градиенто рН с дзух сторон мембраны. Заполнение поверхности ионами водород влияет на кинетику трансмембранного переноса протонов и мохе совершать работу по . сопряжению дзух потоков ионов водорода индуцированных различными ионофорами. Это наблюдение" может имет существенное значение для выяснения механизма окислительног фэсфэрилцроБания в митохондриях и хлоропласта!.

Все изложенные результаты получеиы впервые и часть из не подтверждена в позднейших исследованиях ряда лабораторий мирг ПолучеЕЕые данные имеют большое теоретическое значение для выяснеш механизмов работы кое-транспортных систем в биомембранах. Ваян, практически?,: результатом работы явилось внедрение техники измереш

1Электрогенннх ионных потоков для скрининга продуцентов иибиотиков- ионофоров.

Апробация. Результаты диссертационной работы были доложены на зяреспублгканскЕХ нколах-гсонфзрендаа по биоэнергетике 1981,1934-1988), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1932). а цикл работ "Поиск и изучение антибиотиков-ионофоров" в 1990 году втору была присувдена премия Ленинского Комсомола.

ЗШШШШТАЛБНАЯ ЧАСТЬ Большинство экспериментов в настоящей работе было выполнено на хлоской бислойной липидесй мембране (ЕЛИ), сформированной по методу Миллера а Рудана (1952). Часть экспериментов выполнена на липосомах я митохондриях печени крысы.

Потенциалы разомкнутой цепи и проводимость мембраны регистрировались обычными методами (Лев, 1974). Измерения разности граничных потенциалов БЛМ проводили компенсационным методом по второй гармонике емкостного тока (Соколов и Кузьмин, 1980).

Для прямых измерений цримембранных рН использовали торцовый сурьмяный рН микроэлектрод, изготовленный согласно Ремш и др. (1990). Плавный подход электрода к мембране осуществлялся с помощью гидравлической системы шаговой подачи микроэлектрода с шагом около I мкм. При количественных измерениях профилей рй возле ЕЛЫ была разработана программа автоматизированной передачи величин потенциала на рН миктоэлектроде с электрометра в персональный компьютер. В этих опытах подведение микрозлектрода осуществлялось сверху через водный раствор в задней половине ячейки. Наблюдение за формированием мембраны и подведением рН электрода осуществляли через прозрачное окно в передней стенке измерительной кюветы. Регистрация измеряемых потенциалов велась на цифровом электрометре ке1сыеу 617 • с последующей передзчей з кс!.:пъзтер с использованием интерфейса 1еез и

программного пакета а^т. При обработке данных использовал; графический пакет г^дж^сс. Потенциалы обычно снимались чер-кз2дую еехунцу щж скорости движения иикрозлекгродз 4 мкм в сек.

Митохондрии из печени крысы выделяли по стандартной методиз (бсгвац, 1Э49). Концентрацию белка измеряли биуретозым методо: Концентрацию ионов калия и тетрафеншфзсфоЕия измеряли ио: селективными электродами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Измерения незлектрогеншх трансмзмбранзых потоков ионоз зодоро с использованием феномена изменений рН в неперемешзаемых слоях.

Для измерения локальных изменений концентраций ионов водоро вблизи поверхности КЛЫ был разработан и применен метод измерен потенциала на БШ в присутствии протонофора в условиях индуш злектронейтрального трансмембранного потока ионов водорода чег мойрану. Суть этого подхода заключается в том, что потенш разомкнутой цепи в присутствии протонофора определяется градиент концентрации ионов водорода с двух сторон от поверхности мембрах Поскольку поток протонов через мембрану во всех случаях измере* носил не электрогенный характер, то этот поток не вносил погрешо! при измерении градиента концентрации ионов водорода нг мембране. рис.1 дана кривая образования такого потенциала на ЕЛМ в у слов: создания потока ионов водорода под действием добавления ацет; натрия с одной стороны мембраны. Схема процесса представлена рис.1,Б. Уксусная кислота проходит через мембрану в незаразен протоннрованной форме, а возле поверхности мембраны протек реакции протонирозания- децротоЕпровангя так, что со стор мембраны, где добазлен ацетат, происходит защелачиззние, а щютезополоеной - закисление. В случае проннкащего слаб оснозания (например аммония) знаки сдзигоз рК противополс

валтшокицин I

валпномиппн

ТТФБ.

НС

НС

ТН-

* 3 "

л гч

{{

/

Н+

та*

-тн-

г-

■Зг-

/

it

-тн

'ТН'

-тн

0.2 рН

Рис.I. Образование потенциала на ИИ прп создании на мембране градиента концентрате: ацетата

натрия (А) и хлорида аммония (Б) в присутствии ЕТЗБ. В - модель транспорта слабой кислоты ТН через неперемешиваемые слои (НС) и мембрану (И).

Рис.2. А - схема взаимного расположения рН микроэлектрода (I) и мембраны (2). 3 - тефлоновая ячейка, 4 - магнитные непалки, 5 - вращающийся магнит. Нзпрг^яня

дзинения электрода ооозв-зчены стрелками. Б -экспериментальные рН профили вблиса мембраны,' измеренные прп подведении электрода к мембране (левая часть до стрелки) и при отведении электрода Сдвиги рЯ пндушфовэлись . добавлением 20 мМ KCI с противоположной от электрода стороны мембраны з присутствии 0.1 мкМ нктерштна. Сдвиг рН в щелочную сторону. Кривая Z снята в присутствии гереыеилванкя среды. Скорость движения электрода была 6 мкм/сек.

260 мюд

I--

(Рис.1,В). Контрольше эксперименты показали, что в объем растворов рН не менялся в условиях, как ва рис.1.

Была проведена также другая серия экспериментов, в которых д доказательства сдвигов рН в неперемешиваемых слоях был использое рН микрозлектрод. Торцовый сурьмяной рН микрозлектрод чувствителен рН в плоскости нахождения скола пипетки, заполненной сурьмой. I размера (порядка 10 мкм) позволяет регистрировать профили рН нарушая гидродинамические условия возле мембраны и тем самым изменяя толщины неперемешивазмого слоя. На рис.2,а дана схе взаимного расположения рН злектрода и мембраны - электрод подвода через отверстие в боковой стенке ячейки, выполненной из оргстек: Для предотвращения вытекания раствора просвет отверстия и электрс заполняли вазелином. На рис.2,б показан профиль рН возле БЛМ х добавлении 20 ММ ко. с одной сторош БЛМ в присутствии 0.1 к нигерицина. Кривая 2 отличается от I наличием перемешивания. рис.1 видно, что при приближении к БЛМ ( скорость приближения был: мкм/сек) рН начинает повышаться, в соответствии со схемой К+/ -обмена, однако начиная с некоторого момента происходит рез; . снижение потенциала на рН электроде. В случае дальнейш? продвижения рН электрода часто происходит разрыв мембраны. Ф; кажущегося снижения рН -наблюдается также в отсутствие градиз-концентрации ионов, калия на мембране (данные не приведены). < позволяет заключить, что фаза снижения потенциала соответств: взаимодействию злектрода с мембраной и не связана с реалы изменением рН вблизи мембраны. В момеит времени, отмечен стрелкой, начинается отведение злектрода от мембраиы с той скоростью. Видно, что профиль имеет симметричный вид, 1 свидетельствует о малом возмущении неперемешиваемого слоя ] движении рК электрода. Из рис.2 видно, что при включе: перемешивания толшина Ееперемешиваемого слоя суаестЕенно снижаете:

Бали также проведены опыты по количественному сравнению величин потенциалов на БЛМ в присутствии протонофорз и потенциалов на макроэлектроде. Для этого одновременно регистрировали потенциалы в присутствии протонофора и сдвиги рН, измеряемые микроэлектродом. Оказалось, что суша сдвигов рН с двух сторон мембраин количественно соответствовала градиенту рН, регистрируемому по потенциалу мембраны (различие не более 5%). Этот результат также подтверждает наш'вывод о том, что резкий ответ микроэлектрода происходит в непосредственной близости от мемо'раш, поскольку потенциал на КЯМ в присутствии протонофора должен отражать сумму сдвигов рН с двух сторон возле поверхности мембраны.

2. Теоретическая модель, описывающая распределение локальных сдвигов рЯ в неперемешиваемых слоях при транспорте ацетата через БЛМ

Рассмотрим стационарный транспорт нейтральной формы ацетата через БЛМ, помешенную между двумя буферными растворами. Предполагается, что оба раствора идеально перемешиваются за исключением слоев толпиеы s, прилегавших к мембраие с двух ее сторон. Объемы растворов содержат слабую кислоту ацетат, два буфера мез (а) и Tris (в) (или 0-аланин и mes) л соль Choci, причем концентрации ацетата различны, а объемные значения рН и концентрация всех остальных компонентов одинаковы по обе стороны мембраны. Поток нейтральной формы ацетата через мембрану определяется заражением:

J - Р-([AceHJL - [AcqH](1)

где ? - проницаемость, [AceH]L и [Асен]R - локальЕые концентрации нейтральной формы ацетата в растворах вблизи двух поверхностей

бислоя.

Предположим, что:

(П.1) возникновением диффузионного электрического потенциала в неперемешиваемых слоях раствора можно пренебречь;

(П.2) химические реакции ассоциации-диссоциации воде, буферов ацетата протекают очень быстро, так что локально в НС поддергивает химическое равновесие меаду растворенными компонентами.

Рассмотрим сначала перенос растворенных компонентов через од иг к:, для определенности - левый. Введем координату х, о < х < отсчитываемую от левой границы ЕС в направлении бисло Предполагается, . что транспорт через КС осуществляется за сч диффузии, . сопровождаемой химическими реакциями диссопиацк рекомбинации ацетата, воды и буферов

Кг

Н* + Асе" Z АсеН; Н* + ОН" Î НО; (2)

Кг

к,

H* + Mes2' t MesH"; H* + Tris t TrisH*. (3)

k , * , ♦ 3

Потоки растворенных веществ через ЕС будем описывать приближении Фика,

Ji = - J^dc/dr, i = 1.....8 (4)

Здесь J - плотность потока, d - коэффициент диффузии, с1 (х, концентрация, I = Е"\ 2 = Асе", 3 « АсеЕ, 4 = он", 5 = Агг е « А 7 = В, 8 « BH*, 9 = Cho*, 10 » Cl*.

Уравнения непрерывности для потоков имеют вид:

dJ/dx « RJC); i r J, .... 10; С - fCj, ---- Cio), (SJ

где (с) - локальная удельная скорость расхода i-ro кошонент химических реакциях (2) - (5). Из (6) ж конкретных выражений ли (с), вытекающих из закона действующих масс:

R,fc; - Rz(c) . Rt (с) . RS(C) + R7fcj; BJc) —jycj <=

■ " Яю(с) *

(6) и (5) следует:

<1 а — (3 - з - а - 1 - з )--(3 * з ) -

<3г 2 4 5 5 йх 3

а а

— г^ + з ) ' — гз + з ) - о, ах 5 4 йг 7 8

С7-)

а

Ох 9

Предположение о локальном химическом равновесии означает, что

в *е-*.,/ / *„/ к.,'«»1'V

4 константы равновесия.

Итак, система уравнений массопереноса через левый НС вкличает в 1бя: (8 компонентов): 4 уравнения (9) н 4 уравнения (7) (з >торых потоки J выранзнн через концентрации с помощью формул (4));

В качестве граничных условий при х « о задаются объемные шнентраша компонентов з левом рзстворе,

с1(0} * са- (10}

з при х ■ а ~ условия непроницаемости для всех компонентов за яишченнвм Асен, дяя которого поток выражается формулой (I):

Л ~ Зг~ ■•■ " Ло" 0; '

Уравнения и граничные условия для правого НС формулируется нелогичным образом.

2.1. Методика проведения расчетов.

Алгоритм решения уравнений модели описан в Приложении диссертации. Этот алгоритм реализован нами в виде программы на язьп FORTRAK. Коэффициенты диффузии ионов Н , ОН и С1 Сылп оценены ; формуле Нернста-Зйнгтейна на основе известных предельных иона электропроводностей этих ионов в водных растворах (Robinson а stokes, 1959). Коэффициенты диффузии всех органических иоэ рассчитаны по эмпирическому уравнению Уилки-Чаяга (Bird et ai i960) на основе известных молекулярных масс этих веаестз.

2.2. Численные расчеты профилей рН

На рис.3, А и Б даны рассчитанные по модели I профили рН в : для объемных рН 7.5 и 5.0. Здесь и далее расчеты проводились для т условий, для которых имелись экспериментальные данны представленные в следущем разделе. рН 5.0 близок к рК ацета (4.75), а 7.5 достаточно далек от точки рК. Видно, что при низк концентрациях ацетата (и следовательно низких потоках) профили ; имеют линейный вид независимо от объемных рН. В области высок концентраций ацетата такое поведение профиля рН сохраняется п объемном значении рН 7.5, но при рН 5 профиль имеет всимметричи вид и существенно нелинеен с той стороны мембраны, где происход закисление. Интересно отметить, что при рН 5 увеличение концентрац ацетата не призодпт к росту сдвига рН возле мембраны со сторона, г происходит защелачивание (рис.3,3). По-видимому, это связано с рост буферной емкости раствора, в котором увеличивается концентрат: ацетата.

2.3. Сравнение теории и эксперимента

На рис.4, А и Б даны экспериментальные профили рН вблизи HI полученные при добавлении различных концентраций, ацетата с оде стороны мембраны. При получении профиля рН для левой части рис.4

Рис.3. Рассчитанные профили рН согласно модели. А - кривая I - I мМ ацетата с дне стороны мембраны, 2 - 70 мМ ацетата с цис стороны мембраны. Толщина неперемеппгоаемого слоя (200мкм) принята за I. вр - объемная фаза, ць -неперемеиншаемый слой, м -мембрана. Б - кривая 1-5 мМ ацетата с цис сторош мембраны, 2-20 мМ. 3 - 8? мМ.

Рис.4. Экспериментальные профили рН возле ЕЛМ, измеренные с помощью рН микроэлектрода. А - кривая I - I мМ ацетата с цис стороны мембраны, 2 - 70 мМ ацетата с цис оторопи мембраны. Б - кривая I - 5 мМ ацетата с цис стороны мембраны. 2 - 20 мМ , 3 - 87 мМ. Профили рН с цис стороны мембраны измерены в отсутствие перемешивания.

) ацетат добавляли с той жз сторош, где был рН микроэлектрод, а пя правой части - с противоположной. Сравнение рис.4 с рис.3 эказывает, что многие особенности экспериментальных профилей рН орошо списываются моделью, предложенной в теоретической части. Так еличины сдвигов рН возле мембраны хорошо соответствуют еоретическпм. Особенно хорово это видно для случая рН 5 ( в отличие г рН 7.5): величина сдвига рН с "левой" стороны мембраны слабо ависит от концентрации добавленного ацетата и суаестзенно меняется ; "правой" стороны. Теоретические кривые профилей рН при 70 мМ ¡цетата имеют выпуклый к вогнутый вид соответственно с транс и цис ¡гороны мембраны. Особенно это характерно для транс профиля, где габлюдается некое плато рН возле мембраны. Качественно это *аблядается и в эксперименте, однако выпуклость и вогнутость экспериментальных профилей рН суиественно меньше. Основное качественное отличие теоретических и экспериментальных профилей (которое проявляется суиестзенЕО сильнее при рН 7.5 (см.далее)) заключается з видпмых различиях толщин профилей рН при I и 70 мМ ацетата, наблюдаемых в эксперименте, которые не проявляются в теоретических профилях рН.

Как видно из сравнения теории и эксперимента, предложенная Еызе модель в целом качественно хорошо описывает наблюдаемую в эксперименте зависимость профилей рН от концентрации буфера при транспорте ацетата через мембраны. Наибольшие расхождения между теоретическими и экспериментальными рН профилями наблюдаются в области границ НС с объемами растворов. Бели в эксперименте нгблюдается плавная переходная кривая, которэя хорошо описывается одеой экспонентой, тс теоретические зависимости претерпевают резкий излом на границе с зоной "полного перемешивания". Это особенно отчетливо выражено при рН 7.5, где при разных концентрациях ацетата видимая толпшна НС, оцененная по экспериментально измеренному

профили рН, сильно зависит от концентрации ацетата.

Наиболее вероятная причина расхождения теории и эксперимента состоит в том, что ■ принимаемая, в данной работе идеализация, когда есть четкая граница между областями чисто диффузионного транспорта и полного перемешивания, является явным упрощением. При наличии некой зоны плавного перехода мекду ниш можно ожидать увеличения области сдвигов рН и размывания границы переходной зоне. В связи с этим дальнейшее усовершенствование предложенной теоретической модели должно быть, по-видимому, связано с решением строгих' уравнений гидродинамики и конвективной диффузии в примембранных слоях, как это было сделано, например, для случая вращащегося дискового электрода (Levich , I960) ИДИ вращавшейся мембраны (Kozinsky and Lightfoot, 1972) .

3. Наиболее существенные результаты, полученные с применением техш измерений "локальных изменений концентрации ионов водорода. 3.1. Измерение потенциала на БЛМ в присутствии протонофзра окгзалос; весьма эффективным способом измерения скорости катион/Н обмена индуцированного неэлектрогенными ионофорами типа нигерицина. Н рис.5 представлена зависимость величины потенциала на ЕЛМ о концентрации нигерициЕа, моненсша и A23I87 при создании градиенто концентраций ионоз соответствующих металлов (К+, Na+ и Са"). Виднс что в случае нигерицина и моненсина величина потенциала.практичес? линейно зависит от концентрации антибиотиков. В случае ионофо! A23IS7 величина потенциала пропорциональна квадрату концентраш антибиотика. На рис.6 дана зависимость потенциала на БШ i концентрации нигерицина для ряда одновалентных катионов, котор: соответствует ряду селективности нкгершшна, полученного пут измерения связывания катионов.

0 КИГЕРИВЯ

кокнет

Рис.5. Зависимость величины потенциала на ЕЛМ от концентрации нигершшна, шненсина и квадрата концентрации A23I87 при создании градиента

концентрации KCl, нзС1 и СаС12 (10 мМ с одной стороны мембраны и 0,3 мМ с другой) соответственно в присутствйи 10 мкМ ТИБ.

[кзгГ.игщЗ-ю8,« [ианззяа] -io8,«

[*23IS?]2-I0I4,K2

,кЗ

К га Na Cs u

-5 ^(Нгггргаа]

Рис.6. Зависимость величины потенциала на БЖ от логарифма

концентрации нигерициза (в Молях) при создании одинаковых

градиезтоз концентраций ионов калия, лагтия, натрия, рубидия и

цезия (10 ыМ протез 0.3 М) в приелствии 10 мкМ ТТФБ.

в

б

3.2. Скрининг аЕтибиотиков-ионофоров Нигерзшн и родственные ему ионофоры являются антибиотиками и широко применяются в ветеринарии как стимуляторы роста крупного рогатого скота, а также как антикокдадиозные препараты. Совместно с ВНИИ Антибиотиков была проделана работа по поиску продуцента! антибиотиков- ионофоров на основе метода измерения потенциала на Б® в присутствии лротонофора. Для этого были выбраны 104 культур! szreptcxyces по их действию ее грамм- положительные бактерии. И: литературы известно (Westiey, 19821, что антибиотики- ионофор! подавляют - рост грамм- положительных бактерий. Особое Ениыание был Уделено культурам Streptomyces hygroscopicus И Streptomyces albus поскольку они наиболее часто являются продуцентами ионофоро;

(Westiey, 1982).

Скрининг велся на стадии культуральной жидкости (к.е.) бе предварительной очистки антибиотикоз. Из 104 культур 6 (номера 2 13, es, 72, 65) оказались активны в нашей тест- системе Поскольку отбор велся в присутствии градиента ионов калия в мембране, то было предположено, что культуральные жидкости содержа калиевые ионофоры. Лве к.б. (номера 72 и 65) оказались способнь генерировать потенциал на БЛМ и в отсутствие протонофора, чтс указывает ка электрогеиность ионофоров, содержащихся в данных к.ж.,

Таблица I

а. КатиоЕнэя селективность культуральных сред определенная по мето; измерения потенциала на БЛМ в присутствии протонофо;

Культ.среда Ряд селективности

2 К > ВЬ > Na> Cs, Li

13 Na > X > Li, КЬ, Cs

24 Rb > Cs * К > Li, Na

85 Rb > Cs в К > Li, Na

в. Катионзая селективность известных неэлектрогенных ионофоров определенная по метода измерения потенциала на БЛЫ в присутствии протонофзра

Ионофор Х/ыа селективность Ряд селективности

нигеришЕ 25 К > ЛЬ > N8 > Сз > ьх

инданомицин 25 Юз ? С5 » К > > Иа

ласалоцид а 12 К - Кз > Сэ > На > Ы

монеяст 1/15 Ка ? К > Ы > Из > Сэ

салиномицин 7 к > Из = на > СЭ > Ы

наразин 8 к > Из * Иа > СБ > 1Л

Одно из преимуществ даиного метода скрининга - зто возможность определения катионной селективности ионофора на стадии к.г. без его выделения. Эта характеристика ионофора очень ванна для его идентификации и дальнейшего применения. 3 Табл.1, А представлены результаты измерений кзтиоееой селективности к.я., содержащих ионофоры. Из таблицы видно, что все ионофзры переносят ионы калия, но с разной селективностью. К.г. 13 оказалась более селективна к ионам натрия, чем к ионам калия. К.ж. 24 и 85 имели одинаковые ряды селективности и обладали наибольшей активиостьв по отношении к ионам рубидия.

Представлялось ванным сравнить ряды ионной селективности к.г-, с селективностью известна ионофоров. В Табл.1, Б приведены такие ряды для антибиотиков различной отжческой природы - нигершшна, моненсша, инданомишна, ласалошш а, и двух аналогов салиномпшза а наразина (4-метил-салиномицша). Как видно из таблицы, все ряды селективности оказались различными, кроме наразина и саливомшшна. Последние два ионофора обладала несколько различной К/ма селективностью (Табл.1, Б метод определения см.далее).

Сравнение рядов селективности к.я. и известных ионофоров

показывает, что следушие ряды совпадают: к.2. 2 и ЕЕгерицина, к.к. 13 и шненснна, к.е. 24 (65) и иадавомшша. Можно Силе предположить, что к.ж. 2 содержала структурный аналог нигерицина, к.к. 13 - моненсина, г к.к. 24 и 85 - пндзномшшна.

Из слыдуадей цташгпраОотн-изте-ж. 2; 13,--24 и 65 оыж выделен иовофорн. Боло показаю, что культура номер 2 содержит нигерищн, I: - ыоненсиЕ, 24 - инданомшш. Аналога антибиотика из к.ж. 85 не снл< найдено. Большая работа, выполненная в Лаборатории изыскание продуцентов новых антибиотиков ВЕША, привела к расшифровю структуры иовофэра, который был назван кзфамишном (Рис.7). Еп структура близка к инданоыпшшу (Рис.7). Таким образом мето, измерения потенциала в присутствии протонофора оказался настоль» чувствительным и избирательным, что с его помощью были найдены еобн продуценты уже известных ионофоров и продуцент нового ионофор кафамицина.

На следующем этапе исследования было проведено сравнительно изменив ионофорных сзойств очищенных антибиотиков инданомишша : кафамицина. На рис. 7,Б представлена зависимость потока ионо. водорода при создании разности концентраций ионов калия и кальция к БЛМ от концентрации инданомишна. Видно, что эти зависимости нося нелинейный.характер. Для того, чтобы определить "порядок реакции" п иовофору, мы применили программу нелинейной регрессии аппроксимировали экспериментальные точки уравнением у«лх3. Б случа транспорта ионов калия б=1,£0+0,02, для кальция в=1,5+0,1. и рис.7,Б видно, что Енданомшш является более эффективным калиевы ионофором, чем кальциевым, что согласуется с литературными данным (эцусг: ее а1., 1Э84).

На рис.7,В приведены аналогичные данные для кафамвдина. Расчет по той же программе дали следующие величины параметра Е: кали 1,00+0,02 и кальций 1,9+0,3. Следует отметить, что в случа

не.7. А - Структурная формула антибиотиков хафамшшна и инланомишша П4547А). Б - зависимость величины готешиала иа БЛМ в присутствии ротонофора ила пропорционального ему потока ионов водорода от .онцентрации иЕданомшшна Ш4547А). На мембране создавали градиент :ошентраши ионов калия (кривая I) или калышя (криЕая 2, ГО мЧ с |ДНой сторонн и I мМ с другой). В - того для антибиотика кафамицина.

кафамишша необходимо использовать более высокие концентрации вовофсра для получения таких же величин потоков, как в присутствии ЕЕданомшина.

з.З. Количественные измерения катионной селективности неэлектрогензс вонофзров

Методика измерения потока ионов водорода с. помощью потенциала на ЕЛИ в присутствии цротонофора допускает другую модификацию, которая очень удобна при измерении катионных селективностей юнофоров. Далее приведено теоретическое рассмотрение и пример практической реализации такой модификации.

Растзор I

Мембрана

тк^

Т1 тн.

ТК2

тн^

Раствор 2 1к+з,

Схема процесса катион/Н обмена на мембране

Простейшая модель, . описывающая процесс неэлектрогенкого катион/Е обмена, представлена ва схеме. Модель показывает наличие двух существенных стадий - связывания катионов (кию с переносчиком (т) и переноса комплексов с катионами я и тн через мембрану. Предположим, что

1). только комплексы тк, та и тиа переносятся через мембрану.

2). на границах раздела фаз имеется равновесие реакций переносчика с кзтионаш.

Эти дза предположения позволяют получить простое уравнение для отношения концентрации двух катионов с двух сторон мембраны через параметры модели в условиях нулевого потока ионов водорода через

¿ембрану. Действительно:

'я "^тнíта2"таl)"wтк<^"^1+vт¡Ia(таal",ГN*a2,*0 (12>

где ик - поток конов водороде через мембрану, ^ ,

утаа - константы переноса комплексов через мембрану, символы I и 2 задают две стороны мембраны. Равновесие на границах предполагает, что

[T"31[Cationl1 IT"] 2 [Cation] 2

(13)

Catien [TCation]х (TCation]2

где cation шяет быть х,ма и н. Подставляя та, тх и таа из 13 з уравнение 12 и предполагая, что №+]j«ls+]2 мы подучим уравнение для катионной селективности ионофора при jh»c, которое, как еилео из уравнения 14, определяется комбинацией констант связывания и переноса через мембрану.

ÍKV ÍK+12 v таз к к

'Л верно такзе и для дву

[Са+]х- (Са"]2 " T2Mg

- tMg+l, * " т Са *

(14)

Уравнение 14 верно такге и для двухвалентных катионов

(15)

Т2Са

Что касается селективности одео и дзухзарядннх катионоз (сканем к и са), уравнение 16 соответствует условии jh=o

[Са+], - [Са") 2 v К

ТК Са

(15)

«v " Т2СаК К1Т ]

Концентрация 1т~з зависит от рН и концентрация катионоз.

поэтому б случав рззвозгрядных катионов ионная селективность, измеренная при условии ^«о, не является инвариантной и зависит от условий измерения .

ггяггоорззоа,-теоретическое рассмотрение показало, что в том случае, если подобрать концентрат одного катиона с одной стороны мембраны такой, что потенциал Еа БНН в присутствии протонофора будет равен нулю (условие сг_-о) при данной концентрации другого катиона на противополошэй стороне мембраны, то отношение концентраций двух катионов является хорошей мерой катионной селективности иовофора.

На рис.8,А показан пример эксперимента по измерению к/к селективности нигерицина. На рис.8,Б (кривые 1,4) представлена рК зависимость параметра селективности жшофора для ионов натрия калия. Видно, что в кислых и нейтральных средах этот параметр н зависит от рН. Для моненсина он равен 16?4, для нпгерицина - 25 Ч Была исследована тзкев зависимость параметра селективности с концентрации катионов в растворе. Сказалось, что в шцроком диапазон концентраций результат не зависит от концентрации катионоз.

На рис.В,Б (кривые 2,3) дана рН-занисзмость отношения потоке ионов водорода при одинаковых трансыембранных градиентах катионе калия и натрия. Видно, что селективность • моненсина и нигерншз; измеренная по отношению потоков, не постоянна и с пинается с рост« рН. Это отношение зависит не только от рН, но и от выбранно: диапазона концентраций калия и натрия в среде (при неизменэ отношении концентраций этих катионов по разные стороны БЛМ).

Методом измерения отношений концентраций катионов при нулев потоке ионов водорода была измерена также катионвая селективное других ионофоров - А23187 и ласалоцида А при рН 7,0 (условия см. подписи к рис.8). Лля А23187 были определены следующие значена

С.2 «М КС!

д.-чей

/3 мии

, г n0 +1 . _ г n01.

, и -> С!Б 1 -Нгопз

'9 77^1

15

1.0

0.5

-05

-10

ск +31г0п5 - с к -з

015

19 эн имо)

5 6 МОНЕНСЯН

7 8 рн

п «

1.5

1.0

0.5

-к>.5

-1.0

Рис.В. А - измерение кзтионной селективности нигеринина путем создания градиента концентрации ионов натрия Еа ЕШЛ (наС1, 10 мМ с цис- и I м!' с транс- стороны мембраны) и сведения к. нулю трансмембранного потенциала в присутствии ТТОБ при добавлении нараставших концентраций ионов калия с транс- сторона ЕЛМ. Б - рН-зависимость отношения концентраций ионов калия с натрия при нулевом потоке ионов водорода (1,4) и отношения потоков ионов водорода, индуцированных этис: катионами (2,3) в присутствии 4.3 мЫ моненсина (3,4) и 0.4 м." нигеринина (1,2) в мемОранфоркирушзм растворе фосфолипидов.

селективности (n - число измерений) гмд2+]/[Са2+з«14?2 (п-4), для лзсаяошда А - [Na+] / IK+J -12?1 (n-з; И 1Мд2*ШСа2+]-17?2 !п-3) .

Цпи работе Ееэлектрогенннх катион/н+-обмеЕнихов трансмембранный

ПОТОК уатаггеа т» птгау ст.рготу раВаН. .ПОТОКУ ИОНОВ ВОДОрОДЭ Б ДРУГУЭ.

Соответственно валичина штока катиона должна зависеть не только от его концентрации в растворе, но и от концентрации ионов водорода. Величина параметра селективности двух катиоиов, измеренная по отношения величин, потоков катионов, должна зависеть от pH среды. Из рзс.8 (кривые 2,3) видно, что измеренная таким способом селективность действительно снижается с ростом pH для Еигерищша и моненсЕна. Снижение величины отношения потоков ионов водорода, зазванное ионами натрия и калия, сзязано с уменьшением концентрации протоЕироБЗЕНой формы переносчика 32 на поверхности мембрэЕН. Б пределе при внсокпх значениях pH в условиях, когда лимитирухщей стадией транспорта является транслокация ТН-формы, это отношение потоков должно становиться равным единице.

Данная методика измерения селективности может бнть легкс применена для количественного измерения ряда катиоееой селективносп какого-либо ионофора. В частности были получены следушие значена селективности ионофора кафамицина и инданомицина. Кафамицин: к/п, -30+15 (N=4), K/Cs -1,0, ЕЬ/к -3,0 (N=3),Li/Na- 1,5, Ca/Mg -5 Инданомашн: К/Ма -25+4 (К=4), x/cs -1,0, Rb/K -4,2 (К=3),Li/Ha 1,5, ca/Mg -4. Измерения проводились в тех же условиях, что н рис.12; вначале создавали градиеит концентрации второго катиона каждой паре 10 Ш к I мМ по разные стороны БЛЫ и затем добавляв перЕНй катион до тех пор, пока потенциал на БШ1 ев становился равЕь нули.

Таким образом получен следупшй ряд селективности кафашцс (относительно калия): Rb(3):>CS<l)»K(l)>I.i(0,019)>Na<0,013>

КНОИИШЕЭ: Sb{4, 2) >Cs (1) «K(l) >Li (0,OS)>Na(0,04) . РЯД

лекткЕносет кшгавшасана совпадает с рядом сзязнзания катионов'кь

>ы, са >«g (Boite et ai.. 1982). Качествегзо ряды селективности иг зух ионсфороз совпадают, однако даейтся количественные сличил. Наиболее сильно различается величины к/на селективности; у (фамишша она в 3 раза выше, чем у щданомицЕна, и составляет 80. :а величина сунествевно выше, чем у нигерициЕа, поэтому кафзмипин зедшчтнтелькее использозать как калиезый ионофор, чем нигерпаин. 3 îo логических системах, одаако, ионы' калышя являются как правило гень физиологически активными, а кафамшин в отличие от нигарицЕна зряду с ионами калия катализирует транспорт ионов кальция, са/мд електизность этих двух ионофороз существенно вша, чем у A23I87.

3.4. Дейстзие кафамицина Еа биологические мембраны.

За рис.9 приведены результаты опытов по измерению ионов калия t ионов тетрафенилфосфония (Ч5Ф+ ), который является индикатором ,'рэнсмеиСрэнного потеншала, з суспензии митохондрий (MX) под действием кзфамицина. Видно, что после добавления ионофора троисходгт выход ионов калия из MX. этот выход ионов калия Ее связан : разрушением мембраны И, поскольку происходит одновременное зарастание величины потеншала (рис.9, кривая 2). Нарастание потенциала связано с уменьшением АрН на мембране ИХ э результате К/5 обмена, индуцированного кафзмтшшом, кроме того, протоЕЗые псмпн дыхательной цепи MX увеличивают электрическую состазлящуг протонного потенциала. Добавление злектрогенного переносчика ионов калия валшошщиаа приводит к уменьшению д* и закачке ионов калия 2 соответствии со знаком электрического потенциала. Аналогичные ошие были поставлены с Енданомишном. Эти результаты говорят о том, что кафамипин и ишшномишш являются ее электрогенными калиевыми

Рис.9. Выход ионов калия и увеличение трансмембранного потенциала (измеренного по распределению тетрафенилфосфзния) на мембранах митохондрий под действием кафамшшна (0,2 мкМ). Концентрация белка I мг/мл. Валинодашш 0,01 мкМ, протонофор ссср 2 мкЫ.

13 Ш СН3С02Ка

Рис.10. Пример измерения трансмембранного потока протонов в отсутствие градиеита рй в неперемешизаешгх слоях.

шофорами (к/н-обменниками) не только за искусственных мембранах, ю и за природных мембранах.

Как видно из рис.7, различия в структурах кафашщина и знданомицина заключаются, во-первых, в замене метила на этил в юлокении 2 зблизи карбоксильной группы и, во-вторых, в наличии или этсутствии этильной группы в пологении 16 в тетрзгидгоянданозой Зипиклической системе. Эти структурные различия лризодят к трем основным эффектам: I). меняется к/ка селективность ионофэра, 2). меняется эффективность переноса катионов через мембрану, 3). меняется стехиометрия переноса ионоз калия.

4. Локальные изменения концентраций ионов водорода, связанные с поверхностью фосфолипидной мембраны

Как показано в группе Тессье (prats ег ai., i9S5], помимо локальных сдвигов pH в неперемешиваемых слоях существует возможность существования локзльеых отличий активности ионоз водорода, связанных с наличием кинетического барьера при реакциях присоединения- отрыза протона на поверхности мембраны. Работа в данном направлении была начата с изучения влияния концентрации и природы молекул буфера на скорость трансмембранного потока ионов водорода, индуцированного нигерицином и моЕевслном.

4.1. Влияние буферных растворов на величину трансмембранного потока ионов водорода, индуцированного Ме+/Н+ обменниками нигерицином и моненсином.

Создание на мекбраие градиента ионоз калия в присутствие Ееэлектрогенного К+/К* обменника нигеркцина ж протонофюра ТТОБ приводит к образование разности потеишалоз, обусловленной трансформацией градиента ионое калия в градиент ионов водорода в неперемеши-

ааемнх примембранных слоях. Недостаток такого способа измерения

с''

электрсЕейтральЕого трансмембранного потока протонов состоит в том, что образование градиента рН в . неперемешиваемых слоях частичнс снинает скорость Е^/ТГ* " обмена. Нами разработан модифяйированша метод измерения jh, позволяющий измерять величины потока ионог водорода цри нулевых значениях градиента рН на ЕЛИ. Согласно этом; методу, на мембране (рас.10) создавали градиент KCi, в ячейку добавляли протоЕОфэр ТТФБ, нигеришн добавляли непосредственно в мембран формирующий раствор. После установления стационарного значени потенциала в отсек ячейки, содержащий высокую концентрации ионо калия, добавляли возрастающие концентрации ацетата натрия до те пор, пока потенциал на мембране не становился равным нулю (рис. 10)

Абсолютную величину потока иоеов водорода южно рассчитать i конечной величины градиента концентрации ацетата двумя способами, перзом случае поток оценивается по величине проницаемости мембраг для ацетата, а во втором - на основании дэеных о проницаемое: неперемешиваемых слоез для буфера.

На рис.11 дана зависимость потока ионов водорода через ЕЛ индуцированного нигертшном, от концентрации цитрата и MEs условиях высокой концентрации (кривые 1,2) и низкой концентраи (кривая 3) ионов калия. Видно, что при низкой концентрации к увёличение концентрации буфера - не влияет на величи неэлектрогеЕного потока ионов водорода. Заметим, что в отсутств ацетата, величина потенциала Еа БЛМ, обусловленная возникновеЕВ локальных градиентов рН Еа БЛМ, от добавления буфера существен снижается (данные не приведены). При высокой концентрации г наблюдается качественно иная картина - увеличение концентра» буфера с I мМ до 100 мМ приводит к возрастанию ионных потоков в 5 7 раз. В этих условиях характер зависимости величины потока

Не.II. Зависимость потока ионов водорода через БЯМ, индуцированного шгеришном, от концентрации нитратного буфера (кривые 1,3) и кзэ ¡уфера (кривая 2). Измерения проводили при двух значениях градиента сонцентрапги ионов калия: 190 Ш с одной стороны и 100 мМ с другой (кривые 1,2), 30 мИ и 10 мЫ соответственно (кривая 3).

Ж

ю

(Цитрвт). *М

=110.12. Зависимость разности граничных потенциалов (л?>ь) ме-ду дзумя :торонами БЛЫ , образующейся в процессе индуцированного Еигерипином геэлектрогенного К+/Н + обмена, от концентрации цитратного буфера. ¿рь измеряли методом компенсации внутримембранного поля с использованием зторой гармошки емкостного тока. Градиент ионов К+ на мембране 95м£! : 5мМ. На вставке - влияние концентрации нигершдаа на ¿рь

концентрации: буфера меняется при изменении химической природы буфера. В случае цитрата происходит быстрое увеличение потока с ростом его концентрации: начиная с 10 мМ, наблюдается насыщение потока. tEs увеличивает поток при существенно более высоких концентрациях ( 60 мМ). При этом видимого насыщения потока не наблюдается даже при 100 мМ этого буфера. Следует еще раз подчеркнуть, что данные результаты были получены методом, исключающим образование сдзига рН возле поверхности мембраш.

Ка рис.12 приведена зависимость разности граничных потенциалов иа ЕШ (Дрь) от концентрации цитрата в водных растворах в условиях работы К/Н обменника -нкгерицена при наличии градиента концентрации ионов калия на мембране. Величина Дрь падает с ростом концентрации цитратного буфера. Знак плюс локализован на лцис» стороне ЕШ (на стороне мембраны, которая омывается более концентрированным раствором хлорида калия). Следует подчеркнуть, что измерения л<рь проводились в условиях, когда на мембране отсутствовал градиент рК, который возникает при К/Н обмене. Градиент рН убирали путем добавления ацетата натрия с -цис" стороны мембраны. Добавление ацетата натрия с цис стороны EJM в концентрациях, при которых градиент рН на ЕМ раЕен нулю, практически не изменяло величины л<рь. Уменьшение Дрь, наблюдаемое при увеличении концентрации цитратного буфера (рис.12), не связано с ростом ионной силы раствора, поскольку при увеличении концентрации цитрата мы пропорционально сникали концентрацию холин хлорида в среде. Качественно аналогичные результата были получены при использовании других буферных растворог - фосфата или MEs (данные не приведены). Снижение дрь при росте .концентрации цитрата наблюдалось также при использовании Na/I обменника моиенсина (вместо к/Н обменника нигерицина) при наличиз градиента концентрации ионов натрия на БЛЫ (3.5 мВ при I мЫ цитрат;

1.7 мЗ при 10 ММ). На вставке к Рис.12 приведена зависимость д?>ь т концентрации Еигершина, полученная э средах, приготовленных на 20 и ю^О. Видно, изотопный аффект наблюдается только при высоких оЕцеЕтргпиях ионофора. Все описанные зеле опыты проводились на ¡ембранах, сформированных из азолектинэ - природной смеси £>сфэлилидов выделенных из соевых бобов. При формировании БЛМ из ¡юсфатидилхоЛЕна, точнее синтетического липида дифитавоил {осфзтидилхолина разность граничных потенциалов дрь в таких ге условиях не образуется ( ошибка эксперимента -0.5 мВ). В то хе время на БЛМ, сформированной из смеси фэсфатидилсерина и дифктаноил фзсфатидилхолина (1:1) в стандартных условиях (как на рис.12) опытов удается наблюдать достаточно высокую разность граничных потенциалов (дрь=5.5 мВ при I мМ цитрата).

При обсуждении полученных результатов следует рассмотреть дза пути образозаЕия л?>ь на мембране. I). Ситуация, когда нет быстрого процесса переноса иоеоз водорода кекду карбоксильной группой нигерицила и кислотно- основными грушами фосфолипидов. В атом случае величина д<рь определяется разницей стационарных концентраций заряженной анионной формы нигерицина иа разных сторонах мембраны в условиях рециркуляции в мембране этого переносчика. 2) Ситуация, когда существует быстрый перенос ионов водорода ленду нигерицином и фосфояпшдамп еэ поверхности БЛМ. Такой процесс возмохен в том случае, если его скорость существенно выше, чем скорость переноса ноноз водорода от нигерицина в водную фазу. В этом случае дслзно происходить заполнение одной из поверхностей мембраны ионами водорода и/или гидроксила с другой в условиях трансмембранного потока ионоз водорода, индуцированного нигерицином. Решить вопрос о том, какая из этех двух ситуаций реализуется в условиях эксперимента, позволяет сопоставление результатов опытов на КШ-1,

сформпрозанных из разных классов липидов. В случае фосфатшзышшна нз поверхности мембраны локализованы только слабые основания -фэсфаЕЕыа.. граотпфпвки. .сродства,которых:к. прогоЕу низа,„чем. сродство карбоксильной грунш нигерицина. В этой ситуаши возможность переноса протонов с молекулы нагеришна на поверхность мембргны сильно ограничена. Соответственно в эксперименте на такой мембране образование разности граничных потенциалов практически не наблюдается. Величина рК .карбоксильной группы фосфащдилсерина близка к рК нигерицина, при этом присутствие этого липида в ЕЛИ коррелирует с эффектом образования ¿<рь- Поскольку фосфэлипшшый состав мембраны, при прочих равных условиях, не должен оказывать существенного влияния на скорость переноса Еигерицина через гидрофобную фазу, можно с уверенность!) говорить о том, что образование д?>ь связано с быстрым латеральным переносом ионов водорода с молекулы нигерицина на кислотно- основные группировки фзсфолшшдов, в частности на карбоксильные группы фосфатидилсерина. Снижение дрь, которое происходит при увеличении концентрации цитрата (рис.12), фосфата или МЕв, и одновременное увеличение потока через ЕЛЫ непротиворечиво объясняется тем, что эти соединения катализируют процесс отрыва- присоединения иоеов водорода между кислотно-оснозными группами фзсфэли*тдов на границе раздела фаз и водой в примембранном слое.

Была поставлена независимая серия опытов, в которой на БЖ, сформированной из азолекгина, в отсутствие нигерицина регистрировался деь при изменении рН с одной стороны мембраны. Былс показано, что дрь= 9 мВ достигается при сдвиге рН с 6.5 до 5.1 I кислую сторону и Дрь= 7.5 мВ при сдвиге рН до 8.3 в щелочнув. Таки. образом эти эксперименты показывали, что поверхность БЖ имае: достаточно кислотно- основных групп, чтобы вызвать образование

разности граничных потенциалов наблюдаемой величины. В аналогичных опытах с БЛМ, сформированной из дифитаноил фосфатидилхолина, образования дрь з указанном диапазоне рН не наблюдается. Лееь при сдвиге рН с 5.5 до 9 был зарегистрирован небольшой потенциал лрь=1.5 мВ.

4.2. Сопряжение потоков ионов калия и натрия через образование разности поверхностной концентрации ионов водорода на мембране.

Вам представлялось ванным показать возможность совершения работы за счет градиента поверхностной концентрации ионов водорода. При создании градиента концентрации ионов натрия на БЛЫ в присутствии моненсина и нигерицина происходит образование градиента концентрации ионов калия в неперемешиваешх примембранных слоях. Возникновение этого градиента регистрировалось по образованию потенциала на БЛМ при добавлении валнномицина. Условием сопряжения работы двух обменников язлялось образование градиента рН в неперемешиваемых цримембраннах слоях при работе моненсина. Эти опыты Он® повторены в присутствии ацетата лития (моненсин и Еигерилгн очень плохо переносят ионы лития через БЛМ), который добавляли с "шс" стороны мембраны, чтобы убрать локальные градиенты рН в неперемешизаемых слоях. Концентрация ацетата лития подбиралась в независимых экспериментах таким образом, чтобы электрический потенциал в присутствии протонофэра и моненсина был равен нулю. При такой постановке эксперимента источником эцергии для образования градиента концентрации иоеов калия на 5ЛЫ при К/Н обмене на нпгерицине может быть только разность поверхностной концентрации ионов водорода на разных поверхностях БЛМ.

На рис. 13 дана типичная запись кинетики образования потенциала на БЛМ, возникающего з присутствии валиномицина в указанных высе

Рис.13. А - пример генерации потенциала на БШ при создании градиента концентрации ионоз натрия: 90 мМ : 5 мМ в присутствии валиношщвна, нигерицина и моненсина и с отсутствие градиента рН в неперемепшваемых слоях. Концентрация буфера иа кривой 2 увеличена в 50 раз (при неизменной ионной силе). Б - схема процесса сопряжения ионных потоков.

5 7

условиях. Видно, что в условиях полного титрования ацетатом лития градиента £3 в примембранных слоях до нулевого значения, объемный градиент иопоз натрия продолжает трансформироваться в локальней градиент ионов калпя на мембране. Величина градиента ионоз калия, как и следовало ожидать, падает с ростом концентрации цитрата в среде, сяижапцего градиент поверхностной концентрации ионов водорода на БЛМ. Параллельно были прозедзны опыты по измерению разности поверхностных потенциалов в отсутствие валшомнцина при прочит равных условиях,- оказалось, что при I мМ цитрата д<рй составил 7 мВ, при 50 мМ оставалось 1-2 мЗ. Наблюдаемая корреляция между величиной д(?ъ и градиентом ионов калия, возникающего в данной системе, еще раз показывает, что источником энергии образования градиента ионов калия на Eli яздяется рззность поверхностных концентраций ионоз водорода на разных поверхностях мембраны, возникающая за счет ка/Н обмена, индуцированного моненсином, и градиента ионов натрия. Контрольные опиты с мембранами из дифитаноил фосфатидилхолина, на которых не индуцируются поверхностше градиенты ионов водорода (см. bkes), показали, что на таких НШ сопряжение работы моненсина и ЕИгеринЕна не реализуется (данные не приведены).

На рис.14 дана схема процесса создания разности поверхностных концентраций ионов водорода (протоны, обведенные в кружки) в условиях равенства объемтг-д концентраций ионов водорода (протонк без кружков) с двух сторон мзмбраЕЫ при наличии трансмембранного потока протонов, индуцированного нигерицином (или моненсином). Ацетат переносит ионы водорода из одной объемной фазы в другую (точнее областей неперемешиваемого слоя) через мембрану, Ее затрагивая поверхностных протонов. Схематически обозначен также процесс трансформации градиента поверхностной концентрации ионов водорода в объемный градиент ионов калия в присутствии К/Н обменнлка нигерицина

5g

ClljCOO' H*

/ - ncpawoiHK irpoTtmoe

г^ШТШШРЩШЬ,

иелсрсмсцмвземик

^ ООН /

. "'•Л V I гинети'ксшл

(п.) _яшлц>фах

мембрана

CtbCOO

Чвсрсмс™« .'ÍTeieMO*.*.--

j в интерфазс

N непсремездюнсмый f сдой

Рис.14. Схема процесса заполнения поверхности мембраны иоЕами водорода при трансмембраЕном потоке протонов, индуцированием нигерицином. Сзободные и связанные с молекулами буфера цротоны в растворе подаются з раствор на противополоаной стороне мембраны с помощью ацетата, так, что рН в объемах с двух сторон мембраны одинаков.

А

19«ЛЛСН,С0СИооз

биМОШХХи« 1

Г Ч ' i

MwMKJos I а им Otra» tro»

в им o'rote о»

ь

иМ CUjCOCHa Oí

5 uMO^COONoos

SObMKQä* { t

10 MM otn>« Ob вам alpoi« Irans

Рис.15. Влияние цктратного буфера, добавляемого с различных сторон мембраны, на поток иоеое водорода, пшгушрованный нигершшном а -добавление 10 мМ цитрата с цке сгорает и затем 10 мМ с транс стороны. Б - обратный порядок добавок.

!

в условиях сопряжения иа/Н и К/Н обмена (стрелки в правой части мембраны). На схеме показано, что буферы (штрат, НЕг, фосфат) выполняют двоякую роль в системе. Б неперемепшваемых примзмбранных слоях они выступают в роли агента, снижающего локальные градиенты рН. На границе раздела молекулы буферов выполняют роль катализатора - переносчика протонов, который ускоряет установление равновесия по протону между кислотно- основными группами поверхности БЛМ и водой.

. Наиболее наглядно каталитические свойства молекул буферов проявляются в экспериментах, представленных на рис.15. После полного титрования градиента рН на БЛМ ацетатом (градиент рН индуцируется нпгершином) была добавлена высокая концентрация буфера, после чего вновь появился градиент рН на мембране. Таким образом, вместо выравнивания градиентов рН в дэеном опыте наблюдался на первый взгляд парадоксальный эффект увеличения сдвигов рН при добавлении буфера. В опытах по измерению потоков ионов водорода через мембрану при затитровке градиента рН ацетатом молекулы буфера выступают в роли протоиного медиатора, переносящего протоны от поверхности мембраны на ацетат. Такое действие молекул буферов сходно с реакциями общего кислотно- основного катализа, известного в органической химии. Наличие такого катализа предполагает, что на поверхности мембраны суаествует некий барьер для перехода ионоз водорода от поверхности в объем.

Из схемы видно, что эффекты, наблюдаемые в настоящей работе, обусловлены тем, что два относительно гидрофильных переносчика ионов водорода через мембрану - ацетат и протонофор ТТФБ-осуществляют этот перенос иначе, чем гидрофобный нигериикн. Ацетат и ТТФБ - из объема в объем, а нигерпцин - с поверхности на поверхность.

Для осушестзленся процесса . заполнения поверхности ионами водорода константа перехода протона от нигеришша на поверхностные

группировки должна быть существенно вше, чем константа распада в в молекулы буфера, плавапцие в растворе. Такое соотношение консташ предполагает наличие кинетического барьера для переноса дротоеов от поверхности мембраны в объем. Зтот вывод согласуется с работам: {Prats et ai., 1985), выполненными другими методами И I использованием других систем (см.лит.обзор). Гутман и соавторы : своей недавней рзботе (Nachliel and Sutmaa, 1988) приводил доказательства отсутствия . такого барьера, полученные пр использовании техники быстрой генерации сдвигов рН и наблюдении э процессом релаксации. Интересно отметить, что в этих экспериментах согласии с нашими данными было показано, что БШ, сформированная i фосфатадилсерина, способна удернизать ионы водорода на поверхиос: мембраны существенно дольше, при этом имеется больше мест посад; (Nachliel and Gutroan,, 1983), ПО' сравнении С мембранам: сформированными из фзсфатшшхолана.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе изучалась электронейгральные потоки ион водорода через модельную фосфолшидную мембрану, индуцирозанные ь слабыми кислотами (основаниями), так и неэлектрогеЕНыми ионофорак

Различны?® метода;.® показан феномен локальных измене! концентраций катионов в неперемешиваемых цримембраЕных слоях j неэлектрогенном транспорте ионов водорода через мембра: Экспериментально показано, что при высоких величинах пото] отклонения рН от объемных значений могут достигать двух единиц,': этом образуется еще больший градиент рН на самой мембране, естественно оказывает драматическое влияние на шток ионов водор через мембрану и сопряженные с ним потоки.

Разработан высокочувствительный метод регистра

неэлектрогенЕых потокоз гонов водорода через мембрану, основаиный на измерении протонофор-занисимого потенциала разомкнутой цепи. Этим методом подробно изучены ион-транспортные свойства ионофоров семейстза нигеришна, в частности сделаны количественные оценки их ионеой селективности. Исследование рядов селективности не электрогенных ионофоров позволило выявить лежащий в основе механизм. Показано, что стадией, определяющей селективность, является реа::ция связывания катионов с молекулами переносчика.

На примере переносчиков семейства Еигерицина изучен механизм работы неэлектрогенЕых катион/протоЕзых обменников. Показано, что в определенных условиях лимитирувдей стадией транспорта является реакция отрыва иовов водорода от поверхности мембраЕы. Вполне вероятно, что выявленные закономерности справедливы и для функционирования природных обменников.

Козый метод позволил провести широкий скришшг продуцентов антибиотиков-ионофоров среди многочисленных штаммов зггерютусез. Это исследование, Еосизшее прикладной характер, призело к обнаружению нозых продуцентов известных антибиотиков (нигерицин, моненсин, индзномшпзн), а также и нового антибиотика-ионофора кафамшша, структура которого была определена з КИИ Антибиотиков.

Экспериментальное наблюдение и адекватное теоретическое описание локэльеых изменений концентраций ионов водорода в неперемешиваемых слоях при неэлектрогенном переносе ионов через мембрану имеет существенное значение для изучения и описания транспортных процессов на биологических мембранах, поскольку функционирование мембранных транспортных систем зависит от концентраций, ионов, непосредственно примыкающих к поверхности мембраны.

Важным вопросом является адекватность выбранной мембранной

модели природам мембранам, в частности, вопрос о величинах толще неперемеиизаешх слоев в иашей системе и в различиях биологически: мембранных системах. Как известно, толщина неперемешиваемого ело, вблизи биологических мембран варьирует от 3 дм для случая клеток : органелл до 200-600 дм для случая клеточного эпителия и поверхносте растительных тканей (Barry & Diamond, 1983). Таким образом полученные в настоящей работе оценки толщины неперемепшзземого слс 300-700 им непосредственно соответствуют некоторым тиш биологических мембранных систем, с другой стороны, как было описа; в литературном обзоре, от размера неперемешизаемого слоя завис; лишь величина локальных сдвигов pH вблизи мембраны, но не налич: самого феномена.

В настоящей работе речь идет об изменениях концентрац катионов, вызванных стационарными потоками ионов через мембран Кроме того, сами локальные сдеиги концентраций регистрировались стационарных условиях. Зтот признак отличает данный феномен локальных изменений концентраций, вызванных наличием граница разде фаз, з особенности отрицательно зарякеЕной мембраны. Такие локальз изменения такае играют существенную роль, в частности, елияют кинетику работы мембранных ферментов (wojtczak, 1979), однако ( язляэтея разновесными и не требуют штоков через мембрану.

В настоящей работе был такае обнаружен феномен образова: связанных с поверхностью локальных изменений корнцентрации ио водорода в отсутствие объемных градиентов pH с дзух сторон мембр з условиях трансмембранного потока протонов. Заполнение поверхве ионами Еодорода влияет на кинетику трансмембранного перег протонов и может совершать работу по сопряжению двух потоков ис зодорода, индуцированных различными ионофэрами. Для реализ; данного феномена необходимо присутствие кислых фосфолшп

фосфзтидилсеряза). Поскольку большинство биологических мембран ¡одержит такие фосфолипиды, то при наличии трансмембрснного потока ;ледует ожидать поязление градиента поверхностной концентрации ионов ¡одорода с двух сторон мембрана. Этот феномен может иметь важное значение для различных типов мембранных процессов, в частности, он зчень важен для понимания механизмов окислительного фосфорилирозания з митохондриях и хлоропластоз.

Все перечисленные особенности представленной работы позволяют, за наш взгляд, говорить о создании новой области з биоцпзпхе, заправленной на изучение неэлектрогеиных потоков катионов через мембраны и связанной с этим проблемы локальных изменений концентраций катионов вблизи мембран.

ВЫВОДЫ

1. Разработан нозый метод измерения Еезлектрогенных иоеных потоков через бислойные лшшдные мембраны, основанный на определении локальных сдеигов концентраций катионов вблизи мембраны. Концентрации измерялись путем измерения электрических потенциалов в присутствии электрогенннх ионофоров или прямым методоз с помощью иоЕ-селективных микрозлектродоз.

2. Вперзые измерена величина проницаемости бислойной лппедной мембраны для аммония (з.7*ю"2 см/с). Как следует из литературы, этот результат оказался весьма существенным для выяснения механизма проницаемости почечного зпителия для аммония. А именно: на основании этого результата сделан екзод о том, что для аммония не существует какой либо транспортной структуры, определявшей его проницаемость, за исключением липидной части клеточной мембраны.

3. Показано различными методами, что при неэлектрогенном транспорте ионов водорода, индуцированном различными способами, происходят

значительные сдвиги рН вблизи поверхностей мембраны. При этом градиенты рЕ на мембране существенно влияют на скорости трансмембранного переноса ионов водорода.

4. Предложена математическая модель, описывавшая стационарные проф» рН в неперемешваемых примемОранЕЫх слоях. Сделан вывод о том, 1 набладаеше количественные расхождения теории и эксперимента связа] с идеализированной моделью Ееперемежваемого слоя, предполагали существование резкой границы диффузии и конзеыши.

5. На основании регистрации локальных сдвигов рН возле БШ проведе успешный скрининг продуцентов антибиотиков- ионофоров срел многочисленных штаммов screptomyees и обнаружен новый оригинальна антибиотик кафамщин.

6. Найдены условия, при которых лимитирующей стадие катаон/цротонного обмена, индуцированного нигерипином и. моненсином, являются реакции отрыва-присоединения ионов водорода : границе раздела фаз мембрана/вода. Установлено, что молекулы буфер выступают в роли катализаторов этих реакций.

7. Показано, что в вышеуказанных условиях на мембране происхо; образование разности граничных потенциалов, обусловленное различ! количеством мембрансвязанных протонов с разных сторон НЛМ. ; данные являются еще одним доказательством того, что существ; кинетический барьер для переноса ионов водорода с поверхно' мембраны в водный раствор.

в. Найдены условия, при которых реализуется сопряжение раб неэлектрогеншх катион/протонных обменников нигеридана и моненсив отсутствие градиента рН в неперемешиваемых слоях за счет образовг на поверхности мембраны неравновесной концентрации ионов водорс Тем самым показана возможность совершения работа за счет энер запасаемой в Еиде неравновесной концентрации поверхностно- связа:

IT0B03.

Таким образом, обнаружен феномен связанного с поверхностью )азов8Езя локального градиента ионоз водорода в отсутствие >емных градиентов pH с двух сторон мембраны. Заполнение зерхности ионами водорода влияет на кинетику трансмембранного зеносз протонов и' может совершать работу по сопряжению двух гоков ионов водорода, индуцированных различными ионофорами. Это 5лвдение может иметь существенное значение для выяснения механизма аслительЕого фосфорилирования в митохондриях.

Автор выражает свою искреннюю благодарность людям, помогавши.; лучению изложенных результатов, их осмыслении и оформлению; укинскому Л.С., Скулачезу В.П., Булычеву A.A., Денисову Г.А., вбаенкк О.Н., Котовой Е.А., Рокпшсой Т.И, Дробытевой Т.Н.

коашения: ЕЛМ - бислойная лишздная мембрана; к.ж. - культуральная дкость, ¿рь - разность граничных потенциалов с двух старой Ей! .

перечень основных работ, опубликованных по теме диссертации

Антоненко 30.Н., Ягукивский Л.С. 1932 Генерация потенциала на ;слойеой липпдной мембране при реакциях присоединения отщепления ютона в примембранных слоях Биофизика 27: 635-Б40

Антоненко D.H., Ягужпнскпй Л.С. 19БЗ Новый метод измерения ¡электрогенных потоков через ЕШ, индуцированных катион/Н ¡манниками Биофззика 28: 1022-1025

Антоненко D.H., Ягужинскпй Л.С. 1983 Образование локальных ¡меневий концентраций ионов водорода и калия в примембранных слоях Di в присутствии нигерииина и моненсина Биофизика 28: 55-60 , Антоненко D.H., Ягужгзский Л.С. 1984 Модель тра нспорта слабых ¡слот и оснований через Eli в условиях возникновения градиента pH з шеремзипзаемых примембранных слоях Биофизика 29: 232-235 . Антоненко D.H., Зебрев A.n., Гусин И.е., Войтенко в.Г., Иванппкая

Л.П., Коробкова Т.П., Кудинова М.К., Муранец Н.П., Иваноза Т.А. Дрэбызева Т.Н., Рязанцев Г.Б., Федосеев В.М. 1984 Ионофэрш< свойства и гистамиЕвысзобожданцее действие полиэфирного антибиотик; омомицина (985И) Биол.Мембраны 3: I224-I23I

6. ГорукаЯ~й-.А.-,-'А2Т029Нхо1).&.; Кочергина О.Д., Котельникова A.B. Ягужинский 1.С. 1984 Исследование трансмембранных окислительно-восстановительных реакций, связанных с переносом протона н бислойных липиднкх мембранах Биохимия: 821-826

7. Пыбульская М.В., Антоненко D.H., Тропаа А.Э., Ягужинский Л.С 1984 Кодсодержапше горюны как дапольные модификаторы фосфолипшхных мембран Биофизика 29: SOI-805

8. Антоненко D.H., Воробьева И.Л., Ягужинский Л.С. 1985 Образована локальных изменений концентраций ионов водорода вблизи БЛМ пр функционировании алкогольдегидрогеназы Биол.МембраЕЫ 2: 1087-1093

9. АЕТокеико D.H., .Зебрев А.И., Войтенко В.Г., Бережннская В,В. Долгова Г.В., Никитин' В.В., Иваницкая Л.П., Навашин С.Ы. 193 Активность ионофорного антибиотика омомицина in vivo и in vicro да СССР 301: 493-485

10. Антовенко D.H., Барский Е.Л., Назаренко A.B., Самуилов В.Д. Хакимов С.А., Ягужинский Л.С. IS3S Действие фосфолипазы А2 s бислойные липидные мембраны Биол.Мембраны 5: 658-663

11. Антоненко D.H. 1988 Катионнэя селективность ЕззлектрогеЕНК ионофоров, измеренная на БЛМ: вигерицин, моненсин, A23IS7, ласалошг А. Биол.Иембраны 5 : 992-998

12. Антоненко D.H., Ягужинский Л.С. 1988 Электронейтральнк транспорт катионов через БЛМ, индуцированный нигерининс Еисл.Кембраны 5: 718-728

13. АнтоЕевко D.H., Зебрез А.И., Иуренец Н.В., Смолкина Т.В. 198£ Ионофэрные свойства нового антибиотика кафамацина и его структурно! аналога инданомицина (2I4547A) Биол.Мембр. 5: 1326-1332

14. дробышева Т.Н., Антоненко D.H., Коробкова Т.П., Изанова Т.А. Сингал Э.М., йзанипкая Л.П., Кудинова М.К., Ыуренец Н.П. 19: Направленный поиск продуцентов антибиотиков- ионофоров i стрептомицетов Антибиотики и Химиотерапия 23: 891-895

15. Антоненко D.H., Барский Е.Л., Назаренко A.B., Самуилов Б.Д. Хакиыов С.А., Ягужинский Л.С. 1988 Способ определения активное: фзефолипаз Авторское свидетельство N1416918 от 15.4.1988

16. Антоненко D.H. 1989 Электронейтральный транспорт эеионов чвре БЛМ, индуцирозаиный трибутилоловом и триэтилсвинцом Биол.ЫембраЕЫ í

\ KoBOacHEK O.H., .--rcEeHKo B.H., HryxHHCKzE JI.C. 1990 PeaKmm 30TOHHPOBaHM roEnpoBSEZfl Enrepnmiaa - jCMSnspyjcEiafl cxariiH

)HHoro rpaEcnopxa Eho ji . MsMSpaEH 7: 1037-1044

3.Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 1982 Generation of potential in ipid bilayer meirbranss as a result of proton-transfer reactions in le unstirred layers J.Bioenerg.Biomewbr. 14: 457-455 S.Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 1983 A new method cf the »asurement of the electrically neutral fluxes of cations through ipid bilayer membranes induced by Me/H-exchangers FEBS Letters 163: 2-45

D.Antonenko Yu.K., Yaguzhinsky L.S. 1984 The use of phospholipid-itpregnated Millipore filters for recording nonelectrogenic cation lows in the presence of Me/K-exchangers Analyt.Biochem. 140: 46S-71

1.Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 1S84 The role of pK gradient in he unstirred layers in the transport of weak acids and bases hrough bilayer lipid membranes Bioelectr.Bioenerg. 13: 35-91 2 .Antonenko Yu.K., Yaguzhinsky L.S. 1S3S The peculiarities of eactions catalyzed by alcohol dehydrogenase in unstirred layers djacent to the bilayer lipid membrane Biochim.Biophys.Acta 861: 37-344

3.Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 1988 The ion selectivity of onelectrogenic ioncphoxes measured on a bilayer lipid membrane: igericin, cionencin, A23187 and lasalocid A Biochim.Biophys.Acta 39: 125-130

4.Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 198S The mechanism of the ormation of the electrical potential on the bilayer lipid membrane nduced by propranolol and verapamil Bioelectr. Bioenerg.19: 499-503

5.Antonenko Yu.H., Yaguzhinsky L.S. 1988 "The mechanism of the ormation of the electrical potential on the bilayer lipid membrane .nduced by propranolol and verapamil Bioelectr. Bioenerg. 19: 99-503

!6. Antonenko Yu.N., Yaguzhinsky L.S. 1990 Effect of changes in :ation concentration near bilayer lipid membrane on the rate of :arrier- mediated cation fluxes and on the carrier apparent selectivity. Bichim.Biophys.Acta 1026: 236-240

!7. Antonenko Yu.K. 1990 Electrically silent anion transport through jilayer lipid membrane induced by tributyltin and triethyllead.

J.Msmbr.Biol. 113, 109-113

28. Pohl P., Antonanko Y.N., Yaguzhinsky L.S. 1990 Kinetic properties of cation/H exchange: calcimycin (A23187)- mediated Ca/H exchange on the bilayer lipid membrane Biochim.Biophys.Acta 1027: 2SS-300

29. Kovbasnjuk O.K., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. 1991 Proton dissociation from nigericin at the membrane-water interface, the race limiting step of K/H exchange cn the bilayer lipid membrane ?23S Letters 239: 176-178

30. Antonenko Y. N., Bulychev# A.A. 1991 Measurements of local pK changes near bilayer lipid membrane by means of a pH microelectrode and a protonophore-dependent membrane potential.Comparison of the methods Siochim.3iophys.Aeta 70: 279-282

31. Antonenko Y.11., Bulychev A.A. 1991 Effect of phloretin on the carrier-mediated electrically silent ion fluxes through the bilayer lipid membrane: measurements of pH shifts near the membrane by pH microelectrode Biochim.Eiophys.Acta 70: 475^480

32. Antonenko Y.N., Kovbasnjuk O.N. .Yaguzhinsky L.S. 1993 Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfei at the surface of bilayer phospholipid membrane Biochim.Biophys.Acta 1150: 45-50

33. Antonenko Y.N., Denisov G., Pohl P. 1993 Weak acid transport across bilayer lipid membrane in the presence of buffers theoretical and experimental pK profiles in the unstirred layer: 3iophys.J. 64: 1701-1710

24. Pohl P., Antonenko Y.N., Rosenfeld E. 1993 Effect of ultrasour.i on the unstirred layers near planar bilayer lipid membranes measure by microelectrodes Biochim.Siophys.Acta 1152:155-150