Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь структуры и функции полиеновых антибиотиков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь структуры и функции полиеновых антибиотиков"

ТБИЛИССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Ив. ДЖАВЛХИШВИЛИ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи САМЕДОВА А РИФА АЛИ ГАСАН кызы

УДК 577.37

взаимосвязь структуры и функции полиеновых антибиотиков

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тбилиси — 1991

Работа выполнена в Институте ботаники АН Азербайджанской республики.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ст. научн. сотр. Касумов X. М. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. Ониани Д. А. кандидат биологических наук, ст. научн. сотр. Сорокина А. Д.

Ведущая организация: Институт биохимии АН республики Грузии.

Защита состоится «ц^ » 1991 г. в

часов

на заседании специализированного Совета Д. 057.03.19 по защите докторской диссертации по специальности «биофизика» при Тбилисском государственном Университете по адресу: 380043, Тбилиси, ул. Университетская, 2, ТГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тбилисского государственного Университета.

Автореферат разослан у?.** 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, .з,/?^

д. б. н„ проф. ]] ТРИКАДЗЕ Н. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАНОТЫ.

Актуальность гс.мк Исследование молекулярной организаций и функционирования ионных каналов биологических мембран является однеЛ из фундаментальных проблем биофизики клетки. Одним.из путей решения этой проблемы является образование конных каналов на бислойных липидных мембранах (ЕДМ) о введенными в них веществами-каналоформераш о известной структурой молекул. Успехи, достигнутые в этом направлении, обусловлена, в основном, антибиотиками природного происхождения. К числу таких относятся полиеновпе антибиотики (ПА), продуцированные актиномицета-ма, для многих из которых установлена химическая структура (Нат111;оп-Ш.11ег, 1973). Молекула ПА представляет собой лак-тонное кольцо, содержащее сопряженную систему двойных связей, заряженные аминную, карбоксильную к гидроксилы'ше группировки в гидрофильной части молекулы.

ПА представляет собой большой класс мвмбраноактнвных соединений, в основе биологического действия которых лежат увеличение проницаемости клеточных и модельных мембран по механизму образования ионных каналов (Касумов, 1986). Полиеновыо каналы имеют два основных состояния: проводящее и непроводящее. Время пребывания канала в проводящем состоянии зависит от структуры молекул ПА. Так, например, модификация молекулы амфотершшна В по полярным группам, резко сокращает время нахождения канала в проводящем состоянии. Избирательная проницаемость мембран также зависит от структуры молекул ПА. Так, уменьшение числа гидроксильных групп в гидрофильной цепи молекул полиенов меняет избирательную проницаемость с анионной (амфотврицяи В) на катионнув (леворин). Исследование свойств каналов в зависимости от структуры молекул ПА дает большую информацию о структуре канала, молекулярных процессах, протекающих в нем, и позволяет установить связь между их структурой и функцией в ли-пидякх мембранах.

Важность исследования ПА обусловлена.еще и тем, что они являются основными лекарственными соединениями, используемыми в клинической медицине для лечения грибковых инфекций. Однеко токсичность указанных антибиотиков резко ограничивает их приме-

ненке и требует создания новнх лекарственных фор"« Этому спо-собопюиало рясши'1ронкз химической структуры ПА и разработка нуте'-/ ?/одг<|.иквцги полиеновой молекулы. Исследование интегральной проводимости мембран и свойств одиночных ионных каналов в прнсутстри, НА и их производных на 1Ш создает уникальную возможность для икрвботки практически обоснованных рекомендаций .целенаправленного синтеза новых ПА с заданными свойствами.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла р. том, чтобы экспериментально установить взаимосвязь мезду структурой колекул ПА и их функцией в липидных мембранах путем исследования интегральной проводимости, избирательной проницаемости мембран, а также сролстн одиночных ионных каналов.

Задача исследования:

1. Исследовать интегральную проводимость бксложных мембран в присутствии полкеновых антибиотиков с различной структурой молекул (тетраены, пентаены, гептаены).

2. Изучить свойства одиночных ионных каналов ПА с известной структурой г.-олекул.

3. Определить избирательную проницаемость БЛМ для ионов в присутствии ПА.

4. Изучить э'йект-вм^отерицина В, вводимого с одяоЛ стороны мембраны и взаимодействие двух разных по селективности ПА. •

Научная новизна работы. Бпервне проведено исследование мембраногропной активности большой группы нолкеновых антибиотиков - тетраены, пентаены, гептаены на бислойных липидных мембранах, содержащих холестерин. Обнаружено,.что все изученные ПА увеличивают проводимость бвслойных лгогеднкх мембран по механизму образования ионных каналов.

Нейтральный поливковый антибиотик - филипин, в отличие от ранее существующих представлении, резко увеличивает проводимость кембран по канальному механизму. Проводимость филипн-нсаого канала примерно в 3,-4 раза выше проводимости амфотери-цинового канала; Проводимость комбинированных каналов, формируемых в БЛМ филипином с одной стороны, и емфотерицстном В с другой стороны составляет 30 пС. Время жизни канатов 25 с.

Впервые получены к были исследованы одиночные иоттне

каналы в ГЛМ в присутствии индивидуальных компонентов нистатина, отличающиеся по проводимости и временном параметра. Обнаружено, что индивидуальные компоненты нистатина Ар А£, Ад и В увеличивают проводимость ЕШ по канальному механизму. Определены времена жизни в проводящем и непроводящем состоянии.

Б присутствии нистатина А обнаружено обратимое потенциал-зависимое включение короткожйвущих каналов. Несмотря на различия структур молекул нистатина А^ и Ад со стороны гидрофобной части молекулы,' наблюдается их взаимодействие по разные стороны мембраны.

Впервые показано, что при модификации мембраны с одной сторона анион-селективншл ПА-амротерицином В,1а с другой - ка-тион-транспортирующим-лвворином А.>, происходит образование комбинированных каналов, селективность которых определяется молекулами амфотерицкна В. Проводимость комбинированного канала составляет 2-3 пС, что вдвое меньше проводимости индивидуальных амЦютерициновых каналов.

Обнаружено, что амфотерицин В, добавленный с одной сторон» мембраны в водно-солевых растворах (рН = 3,0) резко увеличивает проводимость мембран. При концентрации обнаружены долгоживущие ионные канали ( ~ 20 сек) с большой дисперсией проводимости 24-20 пС. В отличие от симметричных каналов, число асимметричных каналов при фиксированной концентрации амротерацина в не зависит от концентрации холестерина в диапазоне 2 10 иг /мл мембрансформирующего раствора.

Практическая цепкость работы; Полиеновые антибиотики являются одними из самих эффективных соединений, широко используемых в клинической медицине для лечения грибковых инфекций. Медицинская промышленность выпускает для практического здравоохранения такие препараты, как нистатин, емфотеркцин В, мпкогептин и леворин. В последнее время наметились реальные перспективы расширения среры применения противогрибковых антибиотиков для борьбы с такими широко распространенными заболеваниями человека, как вйруоные инфекции, злокачественные, доброкачественные образования, атеросклероз и т.д. Поскольку в мембране опухолевых клеток содержится больше холестерина, чем в нормальных клетках, а стероадий гоуеостаз он-

кологических больных существенно меняется, представляется целесообразным воздействовать на развитие опухолевого процесса с помощью ПА. Степень повреждения клеток антибиотиков зависит № только ст" уровня индуцированной проводимости (т.е. от концентрации интибиотике), но и от времени нахождения антибиотике в мембране, что может служить характеристикой токсичности данного антибиотика. Это время определяется в экспериментах с БПМ при удалении антибиотика из мембраны. Дакоте показали, что исходнуй ам^отериш»г В ,в зависимости от его концентрации, эффективно воздействует на клетки грибов, мембрана которых содержит эргостерин, ко нетоксичен для животных клеток, мембрана которых содержит холестерин. Подобрав соответствующую концентрацию антибиотика, можно регулироаать время функционировения антибиотика в мембране животных и растительных клеток.

Исследуя действие ПА на мембрани, содержащие различные стерйиы, разработан новый метод идентификации стерина в мембранах , заящщенний авторским свидетельством.

Апробация работа. Основные результаты были представлены на 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1382), на 2-ой научно-практической конференции молодых ученых по проблемам социально-экономического развития г.Баку в XI пятилетке в в перспективе (Баку, 1983), на III Советско-Швейцарском симпозиуме: Биологические мембраны. Структура и функции (Ташкент, 1983), не 16-оЙ конференции ФЕЮ (Федерация Европейского Биохимического Общества) (Москва, 1984), а также обсуждались на научных семинарах в институте ботаники АН АзССР.

рбъем работа. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы ( наименований). Работа изложена яа страницах машинописного текста и содержит таблиц и рисунков.

Первая глава посвящена обзору литературных данных о строении и свойствах каналообразуюпдах соединений. В главе II описаны материалы и методы исследований, использованные в ходе эксперимента. В главе III изложены собственные экспериментальные даяние и приводится их обсуждение.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая авторское свидетельство.

МАТЕРИАЛЫ И .МЕТОДЫ ИССЛЩША№Й.

Бимолекулярные липиднне мембраны получали но общих фос-фолипидах выделеншх из белого вещества бычьего мозга. Мембраны формировали на отверстии в те^лоновои ячейке диаметром 0,5 мм и толщиной стенки примерно 30 ккм по способу, описанному Мюллером с соавт. (Mueiisr et ni., 1963). Для приготовления мембран использованы Различные типы ммораннмх раствг>роя:в основном, использовался раствор обших фоо£олипидоз бычьего мозга в хлороформе с метанолом, внделенны по методу Фолч « Лиз (Polch, Хееэе, 1957) с исходной концентрацией 20 мг/мл. Обшие фосфо-липидн очищали от нейтральных липкдов, промнвая в ацетоне, и хранили в системе хлорсфорл-матанол (2:1) в концентрации 20 мг/мл при 0°С. Затем к этим липидам добавляли необходимое количество перекристаллизованного холестерина или другие стери-новые компоненты в соответствующих концентрациях.

Перед началом опыта исходные мембранные1;смеси путем испарения переводились в раствор гептана, из которого затем формировали бимолекулярные мембраны.

У работе были использованы следующие ПА: тетраены-пима-рицин, индивидуальные компоненты нистатина - Ар А2> Ад и В; пентаены - филипин, ауренин, фунгихромии, ганнибалкцин - ЛИА-0323, 0690, гептеены - флавумицины А и В, перимнция и индивидуальные компонента леворина - Aq, Aj, Ag. A3, А^, любэ.зно предоставленные Ленинградским Всесоюзным научно-исследовательским технологическим институтом антибиотиков и ферментов медицинского назначения. Их физико-химические и биологические овойстза описаны в литературе (Шенин с соавт., 1980).

Антибиотики растворяли в дим-,тилсульфоксиде в концентрации I мг/мл, я затем микрошлрицем добавляли в водно-солевой раствор, окружающий мембрану. Кинетика изменения мембранного потенциала и сопротивления регистрировалась с помогаю даух-координатного самописца "Endim". Интегральные характеристика мембран и одиночные ионные кзн&лы измеряли методом фиксации мембранного потенциала, регистрируя ток через мембрану о помощью электрометрического усилителя У5-&. фиена раствора электролита производилась с помощью перистальтического насоса в

гралгента плотности сахарозы.

ОаЮВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И Ж ОБСШЛИЕ.

I. Исследования интегрально/ проводимости мембран, коди.-'.-йпрровакккх полиеноанг/у антибиотиками с известке!: структурой молекул.

Изучено действие различных по структуре полкеновнх антибиотиков не проводимость и избирательную проницаемость бислой-ных мембран. Все исследованные антибиотики оказались мембрено-трогшыми соединениями, отличающимися по своей эффективности и избирательной проницаемости. На ризЛ показана химическая структура некоторых исследованных полиеновых антибиотиков.

Тетраеры. Полиеновы/ антибиотик-пимарипив при концентрации 4>I0~Sm приводит к слабому увеличению проводимости мембран, как при симметричной, так к при односторонней модификации мембран. Увеличение концентрации пимзрицина не приводит к дальнейшему росту проводимости. В- присутствии этого антибиотика величина мембранного потенциала при создании десятикратного градиента проникавшего иона первоначально составляет (+24,5 mV), а затем происходит реверсия знака мембранного потенциала к отрицательному значению (-40 mV), значение которого показано в таблице I.

Исходный нистатин был впервые выделен из'культуры strep-tomyces albules (Hazen, Brown, 1950). Он представляет собой сложную смесь нескольких компонентов, которые были выделен« в . чистом виде и охарактеризованы как нвстатияы Ар А2, Ад и В, близкие по своим физико-химическим свойствам, но различающиеся по структуре полиеновой молекулы (Шеяк» с соэвт., 1980). Основным компонентом этой антибиотической смеси является нистатин Aj.. Все изученные индивидуальные компоненты оказались мем-браноактивными соединениями. Они рэзко увеличивают проводимость мембран по механизму образования каналов.

На рис.2 представлены характерные записи одиночных каналов в присутствии индивидуальных ксупонэнтсв нистатина. За время жизни канала в. мембране неблэдаются обратимые переходы '

- ? -

пиыллци»

«Ч

•'W^ЛЛЛAЯ1

СН, "Л

и у" 1

£") Си, с«, 2 он »а/»

II Г Г Г " Г II О Ой Он он ои о он

НИСТАТИН А,

-Л' ■ •

но^у! он «И, с сои О ¿И СИ он о он

ЛеВОРИН А,

си, си. р^ Чл с^сн.сн, 4_-1С

он V ом "уои

О ОН О» 0« ои о

нистлчии А3

ссон

о о «Я ОК ОН 0 «1

деьоРИН А!

ю.)

о ОН ои ом ОХ О ОН

НИСТАТИН В

о*'5

«Оон «р'1 оТ*н,

« « ОИ ОИ 0 вн

лееожн Аа

Рис.1. Хим.структура исследованных полиенопых антибиотиков.

J

и

Рис.2, Одчночные каналы индивидуальных компонентов нистатина в симметричных условиях (концентрация - 2'10-?М, 2М КС1 (рН = 6,8), 1 = 22°С, и « 200 тУ, фосфолвпкд/холестерин = 2:1, I - нистатин ¿2,2- нистатин А2. 3 - нистатин А^. 4 - нистатин В.

между проводящим и непроводящим состоянием.

Для нистатина А3 гремя жизни каналов намного меньше, чем для других компонентов. В данном случае наблюдается потенциал-зависимая сборка и разборка ионных каналов, т.е. в ответ на изменение мембранного потенциала каналы могут обратимо включаться и выключаться. Несмотря на различия в хчжчвскоИ структуре нистатина А| и А3 со стороны гидрофобной части молекулы, они, находясь по разные стороны мембраны, взаимодействуют между собой, образуя проводящие ионные каналы. Одна полудора формируется из молекул нистатина А^, а другая' - из молекул нистатина А^, что соответствует ранее предложенной модели Се КгиуЛ (Бе Кгиу11, Веяе1, 1974).

Для всех антибиотиков отмечена преимущественная анионная

Рис.3, Кинетика приводимости ЕЛЬ' в присутствии индивидуальных компонентов нистатина. Состав мембраны: ф/х =2:1; 2М КС1 (рН = 6,8). Концентрация антибиотика = 10"5М. 1 - нистатин А|, 2 - нистатин 3 - нистатин А3, 4 - нистатин В.

Таблица I.

Избирательная проницаемость СислоГшых липидкых мембран, модифицированных полиеновими антибиотиками

Антибиотик ■Концентрация (Ы) йосфо-липид: ¡холестерин Избирательность (п7)

Ауреции Ю-5 М : I

Флавумицин А 2 «КГ 5 М 2 : I --24 г

Флавумищш В 3«IU"b М 2 : I -25 * 2

ОЗЙЗ-АИА-ган-нибалицин ¡Mü~7 Ы 2 : I +<¡4 ± 2

Иимарицин 2'Iü"ü М 2 : I -4Ü * 2

■Фунгихрошн ¿-Iü~7 М -2 : I -24 -i 2 .

Изримициы I,b«iO~b ы 2 ; I +40—3

Нистатин Aj_ 2.IÜ-5 И г : 1 -31 i .2

Кистатин А.2 ■ 1,5 «lO-0 Ii 2 ; 1 -Iü i 1

Нистатин A3 ¡¿♦кг5 м а : 1 -10 i I

Нистатин В 2'IÜ~Ö М 2 : 1 -47 ± 3

Фялятш '2*I0~5 М 2 : 1 +18 ± 2

селективность. Избирательная проницаемость мембран в присутствии нистатинов и А3 примерно одинакова, однако величина юс мембранного потенциала намного меньше, чем у нистатинов Aj я В (таблица I) .

• Пенгаены. а ) Фунгихромин. При кодификации мембран пен-xaeHQBHM антибиотиком фуагихро1шгсм heöдодается резкое увеличение сопротивления мембран ера концентрации I*I€~5 U. Мембраны в присутствии этого антибиотика, практически ш чернеют, несмотря на высокое содержание з них холестерина. Мембраны, модифицированные фунгихромином, лреимудасмешо катион-селективны (и = 24,5 mV). JIpü создания lG-крагаого градиента HCl

в присутствии (¿унгшсромина наблюдается реверсия мембранного потенциала.

б) Другой пентаеновый антибиотик - 03«3-ЛИА-ганнибали-цин при концентрации Ы увеличивает проводимость мемб-

ран на несколько порядков ( Ю 5-М 6) , когда находится по обе стороны мембраны.. При односторонней модификации мембран этим антибиотиком не наблюдается увеличения проводимости. При симметричной модификации мембран проводимость, достигнув своего максимума, быстро инактивируегся. Утот эд^кт свяьан не с разложением антибиотика, а, по-видимому, с переходом канала в менее проводящее состояние. Аналогично ганнибалицину, пенгаен 0690 при концентрации 3«1СГ5 Ы увеличивает проводимость БлМ только в симметричных условиях. Наблюдается быстрая инактивация проводимости мембраны после достижения некоторого максимального значения.

в ) Пентаеновый антибиотик - ауренин увеличивает проводимость мембраны в концентрации 2*10 М только при симметричной ее модификации. После достижения максимальной проводимости мембран наблюдается быстрая ее инактивация» Этот процесс также связан, по-видимому, с перестройкой канального комплекса за время функционирования-в мембране.

г) Филипин. По данным Ьан Зутфена и др. ( ХЭ6Г■) нейтральный полиен-филипин в концентрации 4»ПГ5 М не влияет на проводимость мембран и резко сокращает врет аизни БШ при эк-вимолярном количества фосфолипида с холестерином. Однако при детальном исследовании этого антибиотика удалось показать, что в концентрациях 2«Ю-6 М он эффективно увеличивает проводимость мембран ( в Ю5-10& раз). В его присутствии, на бислойных ли-пидиых мембранах, содержащих холестерин, в концентрации Х0—^^ наблюдается резкое нарастание проводимости и мембраны остаются достаточно стабильными примерно в течение I часа даке при значении мембранного потенциала 200 щУ. При малых концентрациях фидипина ( М ) на мембранах с холестерином были обнаружены одиночные каналы с проводимостью 15-20 пС, что в 3-4 раза 'превышает проводимость амфотврицииовых каналов. Экспериментальная запись одиночных филипшовых каналов приведена на рис.4. Из рис.4 видно, что фияипиновые каналы имеют два основных сос-

fäVl'fJ Ufrfr

JTT-

Рис.4. Одиночные ионные каналы филипина в фосфо-. липидных бислойных менбраяах. Состав мембраны - фосфоляпвд/холесгврин - 2U : 3. Температура = 22°С, и = UDO mV. 2 Ii KCl.

• Концентрация антибиотика - 2'IQ""3 И.

тояаия: проводящее и непроводящее. За время жизни канала в мембране наблюдаются редкие переходы в непроводящее состояние. Согласно молекулярной модели анфотерицинового канала, предложенной De Kruyfl' { 1973), можно предположить, что филипи-новый канал также, как и аыфотерициновый, собирается из двух полупор, находящихся по разные стороны мембраны. Наблюдалось также нарастание проводимости ври добавлении филипина во одну сторону мембраны, а по другую'сторону - нистатина Aj или амфо-терицина В. Были получены комбинированные ионные каналы,, вались которых представлена на рис.5. •

Фалипян при введении его с одной стороны мембрана не приводит к увеличению проводимости в концентрации Ю-5 Ы, однако

Рис.5. Комбинированные лонные каналы из филипина с внешней стороны мембраны и из аыфотерй-цина В - с внутренней.

при добавлении его с противоположной ее стороны в той ае концентрации, наблюдается резкое увеличение проводимости мембран. В ответ Ьа создание Iü-кратного градиента KCl мембрана становится избирательно проницаемой для ионов К+ ( таблица I). В присутствии филипина не набладается реверсии мембранного потенциала.

Гептаены. а ) Славуыицины А и В. Для гептаеновых антибиотиков - флавумицина А и В было обнаруаено, что при концентрация 2,5*Ю~6 М они увеличивает проводимость мембран только при ее сиккетрзчкоа кодификации. После достижения максимальной проводимости наблюдается быстрая ее инактивация. Если на фоне стецио-нарчо? проводимости ввести гот ша антибиотик с любой стороны мембраны, то наблюдается резкое нарастание проводимости без инактивации. В ответ на создание десятикратного градиента в растворе KCl набладается реверсия знака потенциала с положительного ( +30 ш7) на отрицательное ( -40 mV) ( таблица I).

б ) Перимвцин. В присутствии другого гептаенового ПА -' перимицина происходит слабое увеличение проводимости при сим-

матричной модификации мембраны. Деримицин, как ы некоторые другие ПА, индуцирует немонотонную кинетику проводимости мембран. При создании десятикратного градиента в растворах с перимицином наблюдается реверсия мембранного потенциала с отрицательного его значения к положительному. Значение мембранного потенциала •и = +48 шУ.

в ) Леворин и его компоненты. Макролидннй гептаеновий антибиотик леворин относится к подгруппе ароматических гептаонов. Как и нистатин, он представляет собой смесь нескольких компонентов - леворинов А0, А_[, Ау, А4. Изучены физико-химические и биологические свойства компонентов. Показано, что биологическая активность компонентов уменьшается в ряду А4>А3>А2> >А1>А0.

Установлена структура основного компонента антибиотического комплекса леворина А2', которая показана на рис.1 (г1еИп-вк! et а1., 1978), установлена частичная структура других компонентов (йхеНпзк! ы., 1979). Как видно на рис.1, компоненты отличаются друг от друга числом гидроксильных групп в молекуле.

На рис.6 показана зависимость проводимости мембран от концентрации исследуемых компонентов леворина.

Видно, что наибольшей эффективностью обладает леворин а наименьшей - А0. По степени изменения проводимости мембран компоненты леворина можно расположить в следующий ряд с возрастающей эффективностью А0>Ад->А2>А3>А4, что согласуется с литературными данными по биологической активности компонентов. Таким образом, существует корреляция меаду действием антибиотика на клеточные мембраны и на бислойные липидаые мембраны.

В отличие от неароматических гептаенов компоненты леворина увеличивают проводимость мембран, когда они находятся с одной стороны мембраны. При этом они обладают вашими свойствами. Эффект антибиотиков на проводимость зависит не только от их концентрации, но и от величины и направления приложенного к мембране потенциала. Если на мембрану подается до 200 мВ с минусом со стороны антибиотика, то в этом случае не наблюдается увеличения проводимости мембраны.

При обратном направлении поля эффект одностороннего дей-

Рис.6. Зависимость проводимости бимолекулярных мембран от концентрации компонентов леворина ( А^; в Раств0Ре

2М КС1 при рН = 6,7, = 25°С, и = 100 тЧ.

ствия леворина А-, зависит от величины электрического потенциала. При напряжении до 75 ыВ не наблюдается изменения проводимости мембраны, однако при более высоких потенциалах (выше 75 мВ ) наблюдается резкое нарастание проводимости мембраны. Изменение потенциала вдвое ( 11)0^200 мВ.) при постоянной концентрации антибиотика приводит к росту проводимости в 16 раз. Удвоение же концентрации антибиотика приводит к росту проводимости в 4 раза. В отличие от неароматических антибиотиков сборка каналов компонентами леворина зависит от величины и направления электрического поля. Этот процесс необратим.

Для компонентов леворина наблюдается два вида сборки ионных каналов: потенциал-зависимый и концентрационный. Первый тип сборки осуществляется за счет величины приложенного электрического поля при концентрациях леворина от 10"^ до &»10~^М. При концентрациях больших, чем 5М появляется второй сип сборни, зависящий от концентрации антибиотика.

Молекула леворина, в отличие от других полиенов., содер-

жит в своем составе ароматическую группировку, благодаря которой молекула приобретает дополнительный положительный заряд: один расположен у входа в канал, другой - с гидрофобного конца молекулы. Следовало ожидать, что компоненты леворина будут создавать в мембране анионную избирательность. Однако в эксперименте мы наблюдали катионную селективность. Этот факт подтвера-дает предположение, что система селективности локализована на гидрофильной част лактонного кольца молекулы.

При исследовании взаимодействия двух разных по структуре антибиотиков - амфотерицина В и деворина и избирательной проницаемости, обнаружено, что при введении с одной стороны мембраны анион-специфичных молекул амфотерицина В ( либо нистатина), а с другой стороны катион-специфичных молекул леворина А, наб-лвдается их взаимодействие и образование проводящих каналов, селективность которых определяется молекулами амфотерицина В. Проводимость комбинированного канала составляет 2-3 пС, что вдвое меньше проводимости индивидуальных амфогарициновых каналов. Предполагается, что при взаимодействии разных по селективности двух полупор, происходит изменение потенциала внутри канала и в зоне контакта даух полупор.

2. Э&йект одностороннего действия амаотври-цина В, Взаимодействие двух разных по селективности полиеновых антибиотиков -амфотерицина В и леворина.

Амфотерицин В увеличивает проницаемость биологических и модельных мембран для ионов и неэлектролитов. Наблюдаемая ка-тионная селективность на клетках и анионная на бимолекулярных липидных мембранах (БЛМ), а также односторонний эффект на плазматических мембранах и только двусторонний - на БЛМ заставили более детально изучить на бислойных липидных мембранах механизм одностороннего действия амфотерицина В.

Введение амфотерицина В в- концентрации 2«Ю-8 М с одной мембраны приводит к появлению аа мембране долгожиаущих ионных каналов.

На рис.8 показала запись работы одиночных каналов, фор-

^"Т^ГГГГГГТ^ТТГ^

|Ч *■.»>...

^рп-

Рис.7, Декретные изменения проводимости мембрана в

присутствии антибиотиков ароматической и неароматической группировок.

I - амфотерицин В в симметричных условиях, концентрация 2'10~8 Ы в растворе ¿M KUI; рН = 7,0; t° = ¿4°C; ф/х = ¿ : I. 2 - амфотеряцин В с одной стороны мембраны, концентрация 2»Ю-8 М в растворе 2 М KGI; рН = 3,0; ¿5°ü; ф/х = =1:1. 3 - леворин A^v с одной стороны мембраны, концентрация 5.10-9 М в растворе 2М KGI; рН = 7,0; t° = 25°С; ф/х = 2 : I. 4 - комбиниро- • ванные каналы, состоящие из амфотерицина В с внешней стороны мембраны, концентрация 5«I0~® М и леворина ¿¿х с внутренней стороны мембраны, концентрация 2-10"^ U в растворе 2М KCI; рН = 7,0; t°= 25°С. Потенциал на мембране 200 мВ.

5nGL

Юсек

№

Рис.8. Запись работы одиночных каналов ам^отерицина В с одной стороны мембраны в концентрации 2'10~s M при мембранном потенциале +200 mV (+ со стороны антибиотика). Состав водного раствора: Щ KCI; рН = 3,0; t°= 22°С, Состав мембранного раствора: 10 ыг фосфолипидов + 4 ыг холестерина в I мл гептана.

ыируемых амфотерицином В с одной стороны мембраны. Среднее время жизни канала в активном состоянии Т0 = ¿0 сек., а в открытом и закрытом сбстояниях соответственно Т0 = 2,9 сек., Тэ = 0,08 сек.

,11а рис.9 приведена гистограмма распределения проводимости одиночных каналов. На ней видна большая дисперсия проводимости каналов, от 2 до 20 вСы. С наибольшей вероятностью появляются каналы от 7 до 10 пС. Время сборки каналов не зависит от величины и направления электрического поля.

Избирательная проницаемость мембран при одностороннем введении амфотерицина В преимущественно анионнай и не зависит от концентрации холестерина в мембране. В таблице приведены значения разности:потенциалов, возникающих на мембране при создании 10-кратного градиента проникающего иона как со сторо-

N

N

20

ао

io

ю

, ЛпО. л.п рс

а/

ю ао

1п лс

'| 1 I "|—I—г-

Ю . 20

Рис.9. Гистограмма распределения проводимости (.пС) одиночных каналов при одностороннем действии амфотерицина В (2«ПГ8 Ы ) при мембранном потенциале 200 мВ. Мембраны формировали яэ общего яипидного раствора, содержащего 10 мг холестерина и 10 мг фосфолипида в I мл гептана в растворах 2М KCl; pH = 3,0; t°= 22°С. I - соответствует в раствора с антибиотиком. 2 - соответствует rt+" в растворе о антибиотиком.

ны антибиотика, так и с противоположной его стороны.

Иа приведенных данных видно, что наибольшая величина потенциала достигается, в том случае, когда градиент проникающего иона создается со стороны антибиотика. При обратном направлении градиента величина мембранного потенциала вдвое меньше. ■

Эффект одностороннего действия амфотерицина В зависит от концентрации фосфолипидов в липидном бислое, Если мембраны формируются из липидного раствора, содеравдехю 10 мг/мл гептана, то всегда наблюдается односторонний эффект амфотерицина В и он полностью воспроизводим. При более высоких концентрациях фосфолипидов аффект одностороннего действия не воспроизводится. Сборка одиночных ионных каналов происходит при концентрациях амфотерицина В, позволяющих получить симметричные каналы ( 2*Ю М ).. В отличие от симметричных каналоЕ, число асимметричных каналов при фиксированной концентрации-амфотерицина А не зависит от концентрации холестерина в диапазоне 2 + 10 мг/ мя мембраноформирующего раствора.

Ьа рис.10 приведена зависимость проводимости мембран от концентрации амфотерицина В с одной стороны мембраны. Эта зависимость степенная и при разных концентрациях холестерина в мембране имеет одинаковый показатель степени = 4. Дастиад- • ние стационарной проводимости при действии амфотерицина В с ■одной стороны мембраны происходит в интервале времени 25-35 мин. За время порядка 20 мин, амфотерицин В практически не отмывается из мембраны.

Асимметричные амфотерициновые каналы блокируются тетра-этиламмонием ( ТУА) только со стороны антибиотика. Эффект уменьшения интегральной проводимости мембран вдвое наблюдается при концентрации ТЭА М. Эта концентрация в Ю раз боль-

ше, чем та, которая необходима для блокирования симметричных каналов.

Приведенные результаты показывают, что в основе одностороннего действия амфотерицина В лемт увеличение проницаемости мембран по канальному типу. Проводящий канал, -по-видимому, представляет .собой полупору. В пользу этого предположения говорят данные по измерению величины разности потенциалов на градиент проникающего иона, блокированию тетраэтиламмониеы асимметричных каналов только со стороны антибиотика, а так&е несимметричная вольт-амперная характеристика мембран при односторонней модификации амфотерицнном В.

Независимость чиола каналов от концентрации холестерина, в мембране при фиксированной концентрации.амфотерицина В пока-

Рис.10. Зависимость проводимости мембран от концентрации аыфэгерицина В с одной стороны мембраны в растворе 2М КС1; рН = 3,0; 1;° « 22°С. Состав мембранного раствора: 10 мг фосфоляпидов + 4 мг холестерина в' I мл гептана.

зываег, что молекулы холестерина по-видимому, не формируют проводящие каналы в комплексе с антибиотиком, а создают необходимые условия для сборки каналов из нескольких молекул амфо-терицина В.

Роль фосфолипида и рН в одностороннем эффекте амфотери-цина В не совсем ясна. Изменение концентрации фосфолипидов и величины рН может влиять на физическое состояние липидного би-слоя и тем самым на пространственную ориентацию и упаковку молекул антибиотика относительно плоскости мембраны.

ВЫВОДЫ.

1. 11а молекулярном уровне проведено исследование большой группы полиенових антибиотиков: тетраены, пентаены, гептаены, отличающиеся по структуре. Все изученные соединения увеличивают ионную проницаемость липидных мембран, содержащих в своем составе холестерин. Впервые показано, что нейтральный ПА. - фишшмн индуцирует в мембранах ионную проводимость по канальному механизму. Обнаружены одиночно-функционирующие фидипиновые каналы с проводимостью 15-20 пС. Проводимость комбинированных каналов филипина и амфотерицина В при введении их по разные сторона мембраны составляет 25-30 цО.

2. Впервые показано, что в присутствии флавумицинов А и В, пи-марицина, нистатина А^ и А3 наблюдается немонотонная кинетика с нарастанием проводимости и последующей быстрой ее инактивацией до .проводимости немодифицированиой мембраны. При созданий десятикратного градиента по проникающему иону на мембранах наблюдается-реверсия мембранного потенциала с положительного ее значения к отрицательному. Предполагается, что такое изменение мембранного потенциала связано с перестройкой канальных комплексов в процессе их функционирования в мембране.

3. Впервые обнару&вно, что индивидуальные компоненты нистатина Ар А^, Ад и В увеличивают проводимость БШ по канальному механизму. Определены времена вязни в проводящем и непроводящем состоянии. В присутствии нистатина А3 обнаружено обратимое потенциал-зависимое включение коротко&ивущих каналов. Несмотря на различия структур молекул нистатина А^ и А3 со стороны гидрофобной части молекулы, наблюдается их взаимодействие по разные стороны.

4. Показано, что в отлична от ыеароматическюх антибиотиков нистатина в амфотерицина В, индивидуальные компоненты левбрина увеличивают проводимость, находясь по одну сторону мембраны. По степени изменения проводимости мембран, компоненты лево-рина располагаются в следующий ряд с возрастающей зффектив-

ностыо: Aq Aj- кп A3, что согласуется с данными по биологической активности компонентов леворина.

5. Обнаружено, что амфогерицин В, добавленный с одной стороны мембраны, в водно-солевых растворах ( pli = 3,0) резко увеличивает проводимость мембран. При концентрации 2«I0~Ö M обнаружены долгоживущие ионные каналы ("20 с ) с большой дисперсией проводимости 2-20 пС. Эффект одностороннего действия амфотерицина ,В зависит от концентрации фосфолиппдов в липид-ном бислое ( 10 мг/мл). При более высоких концентрациях эффект одностороннего действия не воспроизводится. В отличие

от симметричных каналов, число асимметричных каналов при фиксированной концентрации амфотерицина В не зависит от концентрации холестерина в диапазоне 2 + 10 мг/мл мембраноформи-рувдего раствора.

6. Впервые сбнарукено взаимодействие двух разных по структуре и избирательной проницаемости антибиотиков - амфотерицина В и леворина А. При введений с одной стороны мембраны анион-специфичных молекул ( амфотерицин В), а с другой стороны -катион-специфичных молекул (леворин А ) наблюдается их взаимодействие и образование проводящих каналов, селективность которых определяется молекулами амфотерицина В. Проводимость комбинированного канала составляет 2-3 пС, что вдвое меньше проводимости индивидуальных амфогерициновых каналов.

СЛИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Касумов Х.М., Каракозов С.Д., Самедова A.A., Шенин Ю.Д. "Взаимосвязь структуры и функции полиеновых макролидных антибиотиков", Москва, 1982, I Всесоюзный биофизический съезд, Т9Э.Д0КЛ., стр.192.

2. Касумов Х.М., Малафриев O.K., Самедова A.A. "Cnocoö идентификации стерлна". Заявка на авторское изобретение ( 1983 г.). Авторское свидетельство № 1097952.

3. Самедова A.A., Багировй И.Н. "Действие полиеновых антибиотиков на проводимость бисдойних липидных мембран". 2-ая

научно-практическая конференция молодых ученых по проблемам социально-экономического развития г.Баку в XX пятилетке и в перспективе, Баку, 1983, тез.докл., стр.98,.

4. Касуыов Х.Ы., Каракозов С.Д., Самедова A.A. "Сборка каналов из разных по селективности полупор". 16-я конференция •ФЕБО (Федерация Европейского Биохимического Общества), Москва, 1984, мат.тез., ХУ-066, стр.347.

5. Касуыов Х.Ы., Каракозов С.Д., Самедова A.A., Багирова И.Н., Шенин Ю.Л. "Исследованне механизма взаимодействия различных по структуре полиеновых антибиотиков с липидными мембранами", &-л "Биофизика", Деп., 1984, стр.31.

6. Самедова A.A. "Действие филипила и индивидуальных компонентов нистатина на проводимость бислойных мембран". Ж-л "Известия АН Азерб.ССР", & 6, 1984, 1I8-I2I.

. 7. Касумов Х.М., Самедова A.A., Иенин Ю.Д. "Исследование механизма взаимодействия, индивидуальных компонентов препаратов ■ леворвна и нистатина с липидными мембранами", ü-л "Антибиотики", 1937, II, сТр.824-828.

8. Самедова'А. А., Касуыов Х.М., "Спектральный анализ полиеновых антибиотиков в клеточных культурах". "Азербайджанский

•медицинский вурнал", & 5, 1990.

9. Касумов Х.Ы., Самедова A.A. "Дейотвие амфотерипина В с одной отороны мембраны."Биофизика". ДШ ВИНИТИ (в печати).