Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические основы защиты хлопчатника от вилта с использованием полиеновых антибиотиков

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биологические основы защиты хлопчатника от вилта с использованием полиеновых антибиотиков"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЗАЩИТИ РАСТЕНИЙ

На. правах рукописи

Ходжибаева Санабар Мирзаезна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТЫ ХЛОПЧАТНИКА ОТ ВИЛТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИЕНОЗЫХ АНТИБИОТИКОВ

06.01.11 - Защита растений от вредителей и болезней

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

г.Санкт-Петербург - 1992

herwerti.

I БИ5 TS

а««- -а I ^ТДвУ!

Работа выполнена в Институте микробиологии АН РУз|диссертш на кафедре биологии'почв Московского государственного университета им,М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

- доктор биологических наук, профессор, член-корр.АН СССР j Красильников H.A.

- доктор биологических наук, профессор,, заслуженный деятель науки УзССР Аскарова С.А.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- доктор биологических наук, профессор ГУСЕВА H.H.

- доктор биологических наук, профессор. ЗВЯГИНЦЕВ Д.Г.

- доктор биологических наук, профессор, НИКИТИНА Е.Т.-

• Ведущее учреждение - Среднеазиатский НИИ защиты растений

Защита состоится 23 апреля 1992 г.на заседании специализированного совета Д.020.01.01 во Всесоюзном НИИ защиты растений по адресу: 189620, г.Санкт-Петербург, Пушкин-8, шоссе Подбельского,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ защиты растений.

Автореферат разослан марта 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета ЗИЗР

Г.А.Наседкина

Актуальность проблем

Поражение хлопчатника УегМсИИиы ЗаЬИае К1оЬаЬп ежегодно является серьезной проблемой для всех хлопководческих регионов, е том числе для Узбекистана. На отдельных полях з годи сильного развития вертициллезного увядания бывает поражено до 80-90 * растений, а потери урожая на таких участках, при относительно раннем проявлении болезни, могут достигать 50-60 % (Эргадев,1990 г). На больных растениях снижается не только количество урожая, но и качество продукции. Уменьшаются длина волокна, его крепость и растяжимость,всхожесть и энергия прорастания семян, понижается масличность. Большинство работ по защите хлопчатника от вилта посвящено агротехнике, химическим средствам защиты и выведению устойчивых сортов. Агротехнические приемы, как видно из. литературы, имеют свою положительную сторону: они сокращают потери от вилта, но пока не приводят к значительному снижения количества больных растений. Химические методы защиты растений долгие годы оставались основными, хотя известны их недостатки, связанные с вредным действием на растение, окружающую среду и здоровье хлопкоробов. Центральным звеном защиты является выращивание устойчивых сортов. Однако, как правило, устойчивость к вилту у всех ранее известных вилтоустойчивых сортов хлопчатника /108-$, Ташкент и др./ со временем пада-г ет, отмечается отбор и накопление в почве вирулентных изоля-тов, уже имеющихся в. пределах популяции, поражающих культивируемый сорт. В последние десятилетия того внимания, особенно за рубежом, уделяется антибиотикам микробного происхождения, как лечебному средстзу в растениеводстве, в том числе хлопководстве. Среди этих препаратов наибольшее применение находят антибиотики, образуемые актикомицетами (Ас^потузез). Нашими исследованиями (1961-1991 гг.) доказана эффективность антибиотиков полиеновой природы, являющихся, как оказалось, не только'активными фунгицида:® против возбудителя вилта, ко и индукторами /элиситорами/ защитных реакций самих растений, т.е. синтеза фитоалексинов, выполняющих защитную функцию^

Показано, что устойчивость хлопчатника к вилту корре-

-г -

лируег с изменением метаболизма пояифенольнкх соединений, окислительных ферментов, белков, нуклеиновых кислот, фито-гормонов, пектиновых веществ. Однако, в литературе отсутствует информация о роли лип.идных соединений в формировании устойчивости растений к вертициллезному зилту, возможности индукции их синтеза. Становится все более очевидным, что именно скорость сюразованик фунгитоксических веществ и накопление их в токсических для-возбудителя болезни У.йаЬНае концентрациях, является существенным фактором, определяющим исход взаимоотношения патогена и растения.

Вопрос о заболевании хлопчатника вилтом, в целом, широко освещен в литературе. Но многие аспекты проблемы не до конца выяснены. Так, до настоящего времени вопрос о природе увядания остается спорным. Не выявлены причины изменчивости возбудителя, быстрой адаптации к различным химическим и биологическим препаратам. До настоящего времени в практике хлопководства широко не используется ни один экологически чистый эффективный препарат для защиты растений хлопчатника от вилта.

Цель у. задачи исследований

Цель настоящей работы заключалась в выделении и изучении актиномицетов-продуцектов полиеновых антибиотиков, в выяснении механизма их действия на возбудителя вилта -гриб У.ааЬПае и на хлопчатник, изыскании возможных путей индуцирования синтеза фунгитоксических соединений в тканях, растений, снижения заболеваемости и увеличения урожайности хлопчатника.

Исходя из поставленной цели определены следующие задачи исследования:

- поиск и изучение актиномицетов-продуцентов полиенознх антибиотиков с резко выраженной активностью к грибам;

- установление механизма действия полиеновых антибиотиков на возбудителя вилта хлопчатника - гриб У.с1аЫ1ае;

- выделение и выяснение механизма действия индуцирозан-ных фунгитоксических липидов /фитоалексинов/ хлопчатника на гриб У.ЗаЬИае}

- создание математической модели взаимоотношения патоге-

на и растения, в частности,, гриба v.dahiiae и хлопчатника:

- выявление возможных путей индуцирования защитных реакций хлопчатника против вилта;

- создание микробиологических препаратов для защиты хлопчатника ст вилта и повышения урожайности, испытание и использование выявленных препаратов в практике хлопководства.

В настоящей работе представлена результаты исследований, выполненных лично ззтором и под его руководством ка кафедре биологии почв и лаборатории антибиотиков биофака МГУ, лабораториях антибиотиков и физиологии микроорганизмов Института микробиологии АН РУз по заданиям ГКНТ СССР и тематическим планам.

Научная новизна

Впервые показано, что среди продуцентов полиеновкх антибиотиков наибольшей фуигицидной активностью, з том числе против V.dahiiae , обладают актиномщеты, образующие тетра-еновые антибиотики. Основную часть продуцентов полиеновых антибиотиков составляют непигментирозанные акгиномицеты из белой, глобиспориновой и серой групп. Первичный механизм действия полиеновых антибиотиков ка гриб V.dahiiae связан с повышением проводимости мембран клеток и полным их разрушением при увеличении концентраций. Проводимость искусственных бислойных фосфолипвдных мембран не зависит от числа сопряженных двойных связей в молекуле антибиотика: тетрае-новые и гептаенозые антибиотики увеличивают ее в одинаковой степени.

Для выделения и изучения токсинов V.dahiiae впервые использовался специально подобранный микробный тест /iiicro-aonospora vulgaris, ит.1005/, чувствительный к токсину, выделяемому грибом в культуральну» жидкость. Экспериментально установлена идентичность действия токсических веществ возбудителя вилта на хлопчатник и на микробный тест. Токсин возбудителя вилта не является строго специфичным для хлопчатника. В качестве антитоксинов подобраны полиеновые антибиотики, продуцируемые актиномицетами.

Получены новые сведения о наличии внехромосокных элементов в клетках v.dahiiae. Выделены и очищены вирусные

частицы диаметром гЮ им, участвующие, возможно, в формировании вирулентных свойств патогена.

Впервые показано, что в защитных реакциях хлопчатника к вилту наряду с госсиполоподобными фитоалексинами принимают участие соединения липидной природы. Наибольшей активностью обладают оксиацклглицерины, а также сумма эпокси-и кетоацилглицеринов.

Обнаружен блокируюаий эффект рицинолевой кислоты и антибиотиков на пентакетидный путь биосинтеза меланина у гриба У.ааЬНае,

Построена математическая модель взаимоотношения патогена и растения, в том числе, гриба У.аапНае к хлопчатника, позволяющая рассчитать изменение, во времени концентраций фунгитоксических веществ и токсинов в растении и грибе и определить исход взаимоотношения партнеров.

Показано, что полиеновые антибиотики не только угнетают рост и развитие гриба У.йаЬНае, но.и инактивируют токсины патогена.

Практическая ценность

Результаты проведенных исследований являются научной основой для разработки эффективных, экологически чистых биологических мер защиты хлопчатника от вилта. Установлены группы актиномицетоз, содержащие наибольшее количество продуцентов полиеновых антибиотиков, выявлены наиболее активные из них в отношении возбудителя вилта, что значительно ускоряет поиск и отбор перспективных биологических препаратов. Разработан экспресс-метод выявления токсинов У.йаЬНае. Найдены пути индукции синтеза фунгитоксических липидов в хлопчатнике, повышающих устойчивость к вилту. Разработанная математическая модель взаимоотношения патогена и растения позволяет ускорить отбор перспективных форм хлопчатника в селекционной работе. Создана. и передана е прси-тику хлопководства эффективная, экологически чистая биологическая композиция "Биополан", включавшая антибиотик ИМ-1 для защиты хлопчатника от ви...а, используются такке предложенные нами биологические композиции с включением лиофильно высушенных культур актиномицетов.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены в виде научных докладов и стендовых сообщений на республиканской конференции по микробиологии, альгологии и микологии /Ташкент, I97V, У.У1.Ш съездах Всесоюзного микробиологического общества/Ереван, 1975, Рига,1980, Алма-Ата,1985/, XII Международном ботаническом конгрессе /Ленинград,1975/, У1,УП конференциях по споровым растениям республик Средней Азии и Казахстана /Душанбе, 1978, Алма-Ата,IS8V, II и III'конференциях 'биохимиков республик Средней Азии и Казахстана /Фрунзе,1976, Душанбе,1981/, Всесоюзной конференции "Грибы-возбудители болезней растений /Чернигов,1976/, симпозиуме "Микотоксинк"/0ренбург,1977/, Всесоюзном научно-метсдичес-ком совещании "Фитотоксические свойства почвенных микроорганизмов" /Ленинград,1978/, Всесоюзном координационном совещании по вилту хлопчатника /Ташкент,1981/, Всесоюзной конференции "Мицелиальные грибы" /Пущино,1983/, 1У Закавказской конференции по споровым растениям / 1983 /, III конференции "Изучение грибов в биогеоценозах / 1985 /, Научном симпозиуме микологов и лихенологов Прибалтийских республик и Беларусси / Рига,1985 /, Всесоюзной конференции "Микроорганизмы-стимуляторы роста растений и животных" / Ташкент, 1989 /, У Международном симпозиуме по вертицшглу / Ленин- • град,1990 /, заседаниях Ученого совета Института микробиологии АН РУз / Ташкент, 1965-1991 /, а также подставлены на международном конгрессе по бактериологии и микологии /' Япония, Осака,1990 /. Результаты исследований отражены в-118 публикациях, включая монографии, 2 авторских свидетельства, научную брошюру.

- б -

Глава I. Актиномицеты-антагонисты -

продуценты полиеновых антибиотиков

Полиеновые антибиотики по спектру поглощения в УФ-свете разделяются в зависимости от числа сопряженных двойных связей на группы (Ветлугика,НикитинаД980):

Группа Максимумы, нм

Триены 257-268 267-278 278-288

•Тетраены 290-293 303-505 312-320

Пентаены . 317-32.5 331-341 348-359

Гексаены ' :335-342 356-362 376-380

Гептаены 358-369 376-384 399-408

Октаены 375-380 397-402 420

Из 1563 выделенных нами из почв Западного Памира штам-. мов актином^иетов выявлено 428 (36 %) с активностью к У.ааЬНае.

В исследованиях мы.концентрировали внимание на культурах, образующих полиеновые антибиотики, среди которых выявлены : а) стаммы, образующие тетраеновые, б) пентаеновые, в) гексаеновые и г) гептаеновые антибиотики. Некоторые продуценты образуют одновременно другие антибиотики, максимумы спектра поглощения которых не соответствуют известным поли-еновым антибиотикам.

Кроме того, обнаружены актиномицети, образующие как смесь полиеновых, так и смесь полиеновых и неполиеновнх антибиотиков. Среди полиеновых самыми активными в отношении У.йаЬНае оказались тетраеновые (табл.1).

Продуценты полиеновых антибиотиков составляют 16 % от общего количества актигрибных актиномицетов. Наибольшее количество (25,3 %) продуцентов полиеновых антибиотиков обнаруживается среди самой активной первой и наименьшее (II,8#) - среди штаммов третьей малоактивной группы. Первую группу составляют в основном тетраеновые антибиотики. Группа умеренной активности продуцирует пентаеновые и смесь гексае-нових и гептаеновкх антибиотиков. Малоактивные культуры продуцируют в основном гексаеновые .и гептаеновые антибиотики и их смеси.

Таблица I.

Количественное распределение продуцентов полиеновых антибиотиков в зависимости от активности к У.йаЬНае

Группа ! Зона ¡Число ¡Продуценты по-! Типы полиеновых актино-! угнэ- ¡антигр-¡лиенових анти-! антибиотиков мицетов ! тения, !ибных ¡биотиков__!___

(по ак-; тивнсс-! ти) ! мм в радиусе ¡актико—! ¡мице- ! ! тов ! абс. ! % ! тетра-! еновые ! .'пента-! еновые 1 ¡гекса-!и геп-¡таеиоз.

I 10-20 91 23 25,3 13 9 3 .

II 5-10 134 21 15,7 - 11 3

III 1-5 ,203 23 11,7 3 - 20

Всего 428 67 16 16 20 31

Антигрибные актиномицеты (428 штаммов), зыращенние на среде Чапека с глюкозой, по культурально-морфологически'м и биохимическим свойствам разделили на группы. Основную часть продуцентов полиеновых антибиотиков составляют непигменти-розанные актиномицеты, причем, наибольшее количество их обнаруживается среди белых, серых и глобиспориновых итаммов (табл.2). Почти все глобиспориновые актиношцеты продуцируют гексаеновые и гептаеновые антибиотики.

Таблица 2.

Количественное распределение продуцентов полиеновых антибиотиков среди различных групп акгиномицетов

'.Общее коли-¡Продуценты¡Продуценты Г !чество анти-!полиенозых!неполиено-

р у ¡грибных ак-!антибиоти-!вых анти-

!тиномицетов!ков !биотиков

Белая 130 17. ИЗ

Глобиспориновая ' 86 20 бб

Серая . 81 15 бб

Без воздушного мицелия 60 • 8 52

Фиолетовая 48 5 43

Хромогенная 23 2 21

Всего 428 67 351

- 8 -.

Таким образом, существование значительного количества антагонистов к грибу у.йаЬНае среди актиномицетов делает этот класс микроорганизмов более перспективным для дальнейшего изыскания активных продуцентов антибиотиков, эффективных в борьбе с вилтом хлопчатника.' Особенно перспективны акткномицеты, относящиеся к белой, серой и глобиспориновой группам.

Особый интерес представляют актиномицеты, образующие тетраенозые антибиотики и характеризующиеся очень'высокой активностью в отношении возбудителя вертициллезного вилта. В связи с этим наши исследования проводились в основном с. группой тетраеновых антибиотиков ( 18-45, 18-80, Р-42Б), антибиотиком 2129 и имбрицином.•

Химическое изучение антибиотиков 18-80, 18-45 показало, что. первый препарат сходен с антибиотиком римоцидином, а ■второй - с антимикоином, отличаясь от него лишь наличием максимумов в УФ-спектре и слабой устойчивостью к щелочной среде.

В кислотных гидролизатах антибиотиков обнаружили непредельные органические кислоты и продукты окисления саха-•ров типа 5-кетогексоновой кислота, что позволяет отнести их к макролидным полиеновым антибиотикам.

Из культуральной жидкости АсЪшоиусзз Ъишетасегапэ шг.Р-42 экстракцией н-бутанолон выделен тетраеновкй антибиотик Р-42Б, не имеющий определенной точки плавления, но при температуре выше 130° начинающий темнеть и разлагаться. По растворимости в воде и низших спиртах он близок к анти-микоину и протоцидину, но отличается от первого неустойчивостью в шелочной среде, от второго-отрицательной реакцией с нингидрином. От римоцидина и нистатина он отличается подвижностью в дистиллированной воде. Вещество поглотает. УФ--сзет в области '¿14, 290, 304, 318 нм, хорошо растворимо в воде, водном ацетоне, этаноле, метаноле, пиридине, диметил-формамиде, плохо- в н-бутаноле, изопропаноле, совсем нерастворимо в ацетоне, эфире, хлороформе, диоксане.

В кислотном гидролизате этого антибиотика обнаружен а;-:;:;;ссах2р-микозямин. Наличие этого сахара и тетраеновогс

хромофора позволяет отнести его к группе антибиотиков типа нистатина. Антибиотик 2129 растворим в диметилфсрмамиде и не растворим в эфире и ацетоне. Ультрафиолетовый спектр поглощения антибиотика указывает на присутствие тетраена, пента-ека и гептаена. Данные хроматографического изучения антибиотика 2129, его УФ-спектра поглощения аналогичны результатам, полученным для полиенового антибиотика микогептина, выделенного из АсйЗ-ПотусеБ пейгорз1з.

Антибиотик имбрицин, . продуцируемый Ас^пощусез 3.тЪг1-са^иэ, растворим в метиловом, изопропиловом спирте, диие-тилформамиде, теряет активность в кислых (рН 3,0) и щелочных ( рН 9,0) средах, состоит из 4х компонентов. Один из компонентов имеет первый максимум поглощения, принадлежащий диеновому хромофору, 236 нм, 240,5 нм, 269 нм, а второй -диену,, сопряжённому с карбоксильной группой. Судя по молекулярному весу (1100-1300) он, очевидно, язляется одноосновным. Предполагается, что имбрицин представляет собой макролидный' антибиотик необычного структурного типа, обладает широким спектром действия:' в концентрации 1-25 ммг/мл подавляет многие грамп сложи тельные бактерии, грибы,- дрожжи и некоторые простейшие.

Глава 2. Механизм действия полиеновнх антибио-' тиков на гриб Уег-Ьз-сИНиш ёаЬНае К1еЪаЬп_

а). Действие полиеновых антибиотиков на рост . • и развитие гриба У.ДаЫхае

По установлению характера действия, антибиотиков на рост и развитие грибов, в частности, фитопатогенных, опубликовано незначительное количество работ.

Наш исследовано влияние наиболее активного в отношении возбудителя вилта хлопчатника тетраенового антибиотика 18-80 на мицелий, микросклероции и ядерный аппарат клеток У.йаЬНае, используя конидии гриба, в процессе прорастания которых производились кариолсгические наблюдения. Исследования проводились на обычном и фазово-контрастном микроскопах.

- 10 -

Примененные наблюдения с использованием витальной окраски метиленовым синим (I '.10000 и 1:1000) использовали для обнаружения в культуре мертвых клеток.

Ядерное вещество окрашивали по Фельгену, акридиновым оранжевым, по Романозскому-Гимзе с использованием HCl или рибонуклеазы.

Контролем служили препараты,'обработанные дезоксирибо-нуклеазой (I мг/мл). Ферменты ДНК-аза и РНК-аза использовались в кристаллическом виде. Препараты фиксировали жидкостью Карнуа. При окраске белкоз фиксированные препараты погружали на 2 часа в I #-ный спиртозый насыщенный HgCIg раствор бром-феноловый синий (Б$С) или в I %-тй раствор HgCIg и 0,05 %-кШ раствор Б$С в 2 $-ном водном растворе уксусной кислоты. Далее после промывания в течение 5 мин в 0,5 £-ной уксусной кислоте препараты.переносили в третичный бутиловый, спирт. Утим методом белки окрашивались в темно-синий цвет. При этом оказалось, что обработка рибонуклеазой и ДНК-азой не сказывается на интенсивности окраски БФС.

Для одновременной идентификации местоположения ядер и клеточных белков использовали'модифицированный яами метод: предварительно окрашивали по Романозскому-Гимзе, а затем . докрашивали белки Б$С. Интересно, что красная окраска ядер не .исчезает при окраске 5ФС, но приобретает темно-красный цвет, если не воздействовать уксусной кислотой. При обработ-:е уксусной кислотой окраска ядер слегка слабеет, но не исчезает.

Для наблюдения за состоянием мицелия и микроскдероциев на газон испытуемой 3-х суточной культуры гриба были наложены стерильные цилиндры, в которые вносили по 2 капли раствора испытуемого антибиотика 18-80 в следующих концентрациях: 6,5,^,3,2,1 мг/мл. На третьи сутки опыта вокруг цилиндров образовались четкие,видимые невооруженным глазом зоны лизиса гриба. По мере снижения концентрации антибиотика радиус зоны соответственно уменьшался. Наблюдали и за постепенным лизисом микросклероциевтриба. Для этого на участки мицелия с большим количеством микрссклероциев наносили капли растворенного антибиотика в концентрации 6 мг/мл, находили под

микроскопом определенный участок и в течении 3-х суток наблюдали в одном и том же поле зрения за постепенным лизисом микросклероциев.

По истечении 2-х суток после нанесения антибиотика на газон 3-х суточной культуры, гриба У.йаЬИао в. центральной его части, куда был внесен антибиотик, образовались четкие зоны лизиса до 4 см в диаметре. В центре зоны мицелий гриба был полностью лизирован. На растоянии 0,5-1,0 см от центра зоны при микроскопическом изучении можно было обнаружить остатки разрушенных спор, микросклероциев и куски оболочек клеток. По мере приближения к зоне нормального рсста гриба в поле зрения микроскопа встречается все большее количество полуразрушенных гиф и клеток. Далее следует промежуточная • зона между нормальным ростом мицелия и лизисом. Особенности строения ее в том, что воздушный мицелий в ней хорошо развит и похож на белый пушистый.поясок, состояний из гиф и конидиеносцев, поднимающихся над субстратом. Субстратный же мицелий, расположенный под этим пояском, полуразрушен. Здесь видны лишь отдельные морфологически нормальные гифы и островки не до конца разрушенных склероциев, в то время как нормальный субстратный мицелий характеризуется большими скоплениями микросклероциев и окрашен поэтому в черный цвет. Граница разрушения мицелия и микросклероциев чрезвычайно резка, при этом они имеют вид гроздьев и веточек, как бы "таюших" с концов.

Для выявления характера действия антибиотика 18-30 изучали тонкое строение грибной клетки и, в первую очередь, превращение ядерного аппарата: исследовалось поведение ядра в покоящихся и прорастающих конидиях и растущих гифах гриба в норме и под воздействием антибиотика. Поскольку мицелий состоит из чрезвычайно гетерогенных клеток, модельные опыты по влиянию- антибиотика -необходимо было из методических соображений проводить на однородных по качеству, строению- и возрасту клетках. В качестве таковых были выбраны ко-.нидии гриба.

Через 2 часа после высева на питательную среду конидии выглядели несколько увеличенными, набухшими, округлой формы.

- 12 -

В протоплазме живых клеток видны в то же Еремя светлые вакуоли и .блестящие зернышки, окрашивающиеся прижизненно ме-тиленовым синим (1:10000). Через 4 час. конидии, сильно набухшие, часто с одного конца заостренные, либо с "носиками", начинали прорастать. Через б час подавляющее большинство конидий прорастало и происходило нозое деление клеток. Второе деление наступало обычно к 8-му, а иногда к 10-му часу развития культуры. После 16-17 час проросшие конидии превращались в гифы, состоящие из 5-7 и оолее клеток. Боковое ветвление клеток начиналось обычно после третьего (иногда второго) деления в одном направлении.

У-зрелых конидий гриба У.даЬНае одно округлое компактное ядро, расположенное посередине »ли периферически. После высева на питательную среду конидии набухают и прорастают, ядро в это время делится, причем одна из половинок его'постепенно мигрирует в росток новой клетки, она отделяется от материнской перегородкой. Ео время деления ядро может быть локализовано в центре конидии и на периферии, но в последнем случае оно обязательно будет расположено в месте роста новой молодой клетки. Вторичное деление ядра конидии затормаживается, вследствие чего замедляется появление второй (боковой) новой клетки. Время покоя ядра материнской клетки между первым и вторым делением равно времени, в течение которого происходит 1-2, иногда даже 3 деления ядра первой молодой дочерней клетки. В периоды покоя между деле- -ниями ядра в молодых клетках компактные, округлые.с однородно окрашивавшимся на ДНИ телами, около 6,2-0,3 ми в диаметре. Во время деления ядра распадаются на четко различимые хроматиновые зерна, в которых сконцентрирована ДгК. При делении ядер зерна расходятся и скапливаются по двум полюсам, образуя два полушария. Клетки молодого мицелия, состоящего из 10-15 клеток, все еще содер хат по одному ядру, з то время как клетки 2-3 суточного мицелия - много- ■ ядерны.

На среде с 0,5 мл антибиотика концентрации I мг/мл конидии набухали и увеличивались з размере. Поскольку нарастание протопласта продолжалось I условиях 'задерганного

- 13 -

прорастания, конидии разбухали, приобретали огромные по сравнению с нормальными размеры. Эти конидии оставались ¿сивыми в течение 8-10 час-,так как прижизненно они не окрашивались слабыми растворами метиленовой сини (1:1000), и продолжали расти. Затем наступала гибель конидий, клеточная оболочка при этом разрывалась и содержимое конидий выходило наружу.

Расположение ядерного вещества у обработанных антибиотиком 18-80 конидий резко .отличается от нормальных. Уже после 2 и 4 час пребывания конидий на среде с антибиотиком отдельные компактные ядра в них не обнаруживались. Вся' цитоплазма окрашивалась'в красноватс-фиолетовый густой,цвет. . Лишь.в некоторых клетках в темно-фиолетовой цитоплазме были видны тонкие ниточки хроматинового вещества. Оболочка сильно утолщена, протоплазма сжата в центре клетки и сильно- отстает от оболочки, в результате, чего между клеточной мембраной и оболочкой образуется очень толстый "пустой" слой.

При внесении б среду 0,4-0,3 мл антибиотика (концентрация та же) картина в основном не изменялась. Возрастало лишь количество конидий, способных прорастать. Однако клетки погибали после первого или второго деления. Ядерное вещество сильно диспергировано и похоже на хроматиновую сеточку.

В случае внесения в среду 0,2 мл антибиотика наблюдалась несколько иная картина развития конидий. Как и в контроле, конвдии набухали и готовились к прорастанию, однако деление проросией из.конидии ¡слетки задерживалось после, третьего или четвертого деления. Далее,проросшие конидии жили б-Ю час, после чего погибали, приобретая способность . хорошо^окрашиваться разбавленными витальными красками (метил еновая синь 1:10000).

Первое деление ядра конидии морфологически не отличалось от деления в контроле, хотя иногда оно наступало позже и одно из ядер переходило уже в почти.полностью сформировавшуюся дочернюю клетку. Второе деление ядра (дочерняя клетка!) значительно отличается от контроля, ядро при этом сильно дробилось на многочисленные мелкие глыбки, окраска

ка ДНК у которых скачала слабо положительная, а затем отрицательная.' Далее ядерные участки не выявлялись. Ядро материнской клетки конидии оказывается более устойчивым и несколько дольше сохраняет компактную форму и способность окрашиваться на ДНК. При делении ядра первой дочерней клетки' часть ядеркогс материала часто может "теряться" и не включаться ни в одно из двух ядер. Эти "утерянные" участки имеют вид копотких толстых палочек, хорошо окрашивающихся на ДНК и расположенных между двумя дочерними ядрами. Эти палочки, вероятно, представляют собой группы хромосом.

Многие кз этих изменений в прорастании и дальнейшем развитии конидий можно наблюдать на живых клетках как в обычном, так и фазово-контрастном микроскопах.

Окраска белков показала, что отличий между конидиями в контроле и с антибиотиком не обнаруживается. Иногда сильно разбухшие хонидии (0,4 мл антибиотика) более интенсивно окрашиваются на белки. Белковые вещества конидий, развившихся на среде с 0,2 мл антибиотика, распределены в многочисленных гранулах, в то время как цитоплазма контрольных клеток окрашивается на белки однородно. Метод одновременной окраски ядерного вещества и белков позволяет регистрировать изменения хроматина и белков на одном препарате. Ядерные участки менее интенсивно окрашиваются ка белки, чем цитоплазма.

Рг.зличий в накоплении и распределении РНК цитологическими методами обнаружить не удалось.

Определенный интерес вызывает способность антибиотика 18-80 лизировать микросклероции гриба У.йаЬИае, которые по литературным данным, являются основной формой приспособления организма для сохранения вида, размножения и расселения, а. путь передачи инфекции через зараженную почву является основным. Возрастает и практическая значимость антибиотика 18-80 в связи с его способностью разрушать источник инфекции непосредственно в почве.

- 15 -

Действие полиеновых антибиотиков на физиологию гриба Verticiiliua dahliae Klehahn_

Все процессы в клетке прямо или косвенно связаны с биологическим окислением. Интенсивность этаго процесса зависит от видовых особенностей микроорганизма, условий культивирования, наличия в среде различных химических и биологических фунгицидов.

Установлено, что нистатин, амфотерицин В, трихомицин. и другие антибиотики полиенозой природы сильно тормозят дыхание и гликолиз у дрожжей и плесневых грибов.

Интенсивность дыхания V.dahliae при воздействии на него полиенового антибиотика 18-80 исследовалась в процессе развития гриба. Рост У.dahliae находился в прямой зависимости от концентрации антибиотика: небольшая концентрация (0,001 %) оказывала стимулирующее действие, более высокие (0,04 % и особенно 0,08 тормозили рост гриба (рис.1).

При наличии в среде высоких концентраций антибиотика темного пигмента, характерного для У.dahliae, не обнаружено. Через 5 суток роста при концентрации 0,08 5 интенсивность дыхания гриба снизилась почти вдвое по сравнению с контролем. Дозы антибиотика 0,001 и 0,04 % несколько стимулировали интенсивность дыхания V.dahliae. Через 10 суток культивирования интенсивность дыхания гриба при концентрациях 0,04 и 0,08 % снижалась в 3-3,5 раза (рис.2).

Корреляция между скоростью роста и интенсивностью дыхания в первые 5 суток роста гриба отсутствует: наблюдается угнетение роста "/.dahliae, под влиянием антибиотика 18-80 з концентрациях 0,04 и 0,08 %, в то время как интенсивность дыхания гриба снижалась лишь при концентрации 0,08 %. В дальнейшем через 10 суток культивирования, обе концентрации антибиотика 18-60 резко икгибкруют как скорость роста, так и интенсивность дыхания V.dahliae.

Таким образом, при добавлении полиенсвого антибиотика IS-80 к У.dahliae подавлению дыхания предшествовала фаза стимуляции. Появление или исчезновение фазы стимуляции зависело от концентрации антибиотика. Репаюпим Фактором, по-видимому, оказывается количество антибиотика, абсорбиро-

сб чо к

О.

и

о 0) ю

- 16

0,516

0,232

0,135

К ' 0,0/$ 0,08$ 5 суток

а

43

К а, и

о ф Ю

0,865

0,355

'

0,215

К 0,04$ 0,08;? 10 суток

Рис.1. Влияние антибиотика 18-80 на рост гриба V.dahiiae

а к о а. о

4 о

5 «

<и г» к

ID В О Ч Гч О

С

915

956

. 520

К 0,04% 0.0Q% 5 суток

х

(D

ЕГ О Ч (-, О

С

3379

588'

513

0,04? 0,08$ 10 суток

Рис.2. Влияние антибиотика 18-80 на интенсивность дыхания гриба V.dahiiae

ванного клеткой.

Углеводы. Сахароза входит в состав питательных сред, используемых при выращивании грибов, в частности, V.dahliae. Изучение скорости ее распада на глюкозу и фруктозу в норме и под воздействием антибиотиков имеет важное значение для понимания биохимических процессов, т?отекающих в клетках возбудителя.

Известно, что инзертаза совместно с другими гидролитическими ферментами, продуцируемыми грибами, может привести к резкому нарушению углеводного обмена растения-хозяина, поэтому показатель активности инвертазы гриба V.dahliae имеет важное значение.

Для выяснения способности V.dahliae использовать сахарозу питательной среды в присутствии антибиотика 18-80 гриб выращивали на среде Чапека с 2 $-ным содержанием сахарозы. Антибиотик вносили одновременно с посевом в количестве 10 мл.

Остаточный сахар в среде, а-также глюкозу и фруктозу определяли в динамике: через 5,10,15,20,25,30 суток роста V.dahliae. Определения велись в мицелии и культуральной жидкости гриба по Бьерри.

С первых же дней роста гриба в среде убывала сахароза и накапливались мсносахара (табл.3,4). Эта закономерность наблюдалась и в контроле, и в вариантах с антибиотиком, причем, под действием антибиотика интенсивность усвоения сахарозы значительно снижалась.

Таблица 3. Влияние тетраенового антибиотика 18-80 на усвоение сахарозы грибом V.dahliae, ( % )

Возраст культуры, суткл 1 j В контроле i !Под воздействием ! антибиотика !

5 90,0 97,0

10 76,5 83,2

15 60,0 71,5

20 47,5 55,4

25 38,5 46,8

30' 26,3 37,4

Таблица 4.

Изменение содержания Сахаров в мицелии и культуральной жидкости у.ДапИае под действием полиенового антибиотика 18-80

Мицелий, % на I г | Культуральная жидкость, % на 100 мл

___£_едуци|)уюшие__!__сахароза___!___ред^цирзгюшие !___сахароза___

конт- ! анти- . | конт- ! анти- кокт- ! анти- ; конт- ! антироль ! биотик } роль ! биотик | роль ! биотик )• роль- ! биотик

5 0,004 ' 0,0002 0,016 0,0009 . 0,037 0,021 1,80 1,94

10 0,007 . 0,00009 . 0,019 0,001 0,050 0,039 1.53 1,66

15 0,003 0,002 0,02 0,003 0,1 0,087 1,2 1,42

20 ' 0,01 • 0,003 0,04 0,007 ■ 0,26 0,11 .0,95 • 1,18

25 0,02 0,005 0,06 0,008 0,43 0,21 ' 0,77 0,93

30. 0,02 ' 0,006 0,05 0,008 0,52 0,39 0,52 0,74

Возраст

гриба,

сутки

- 19 -

Так, в первые 5 суток роста в варианте с антибиотиком усвоение сахарозы незначительное - 3 в контроле - 10 %. В обоих вариантах к 30-м суткам роста гриба в питательной среде определялась неиспользованная сахароза. Если в .первые дни роста гриба сахароза убызает, а моносахара накапливаются, то к 30-м суткам опыта количества остаточного сахара и моноз уравниваются. Причем, в контроле содержание моноз • всегда выше, чем в варианте'с антибиотиком. Это можно объяснить ингибирующим влиянием изучаемого антибиотика на инвер-тазную активность гриба.

Таблица 5. Злияние тетраенового антибиотика 18-60 и" активность инвертазы гриба У.йааНае С мг глюкозы )

В присутствии антибиотика 18-80

5 142,7 . 51,1

10 154,2 56,4

15 152,4 70,2

20 176,7 82,3

25 130,1 60,4

30 • 90,2 52,3

Возраст культуры. j 3 контроле

дни !

I

Содержание моноз и сахарозы в мицелии гриба в контроле зыше, чем в варианте с антибиотиком.18-80. Это, вероятно, объясняется ослабленным состоянием У.ааЬНае, в клетках которого зсе процессы обмена веществ находятся в угнетенном состоянии.

Нуклеиновые кислоты. Содержание нуклеиновых кислот у микроорганизмов изменяется в зависимости от условий культивирования, штаммовой принадлежности и внешних, воздействия (те;/пература, радиация, химические вещества и антибиотики).

Исследования по изучению влияния антибиотиков на син-

тез нуклеиновых кислот микроорганизмов приобретают все большее значение в связи с широким применением их-в медицине, ветеринарии, растениеводстве.

Мы проверили действие антибиотика 18-80 на содержание нуклеиновых кислот в клетках гриба v.dahliae слабо (I группа) и сильно вирулентных (II группа) форм. (Разделе-кие на группа, Панфилова, Рамазанова, 1962).

Для спехтрофотометрического определения количества нуклеиновых кислот во фракциях РНК к ДНК, полученных по Шмидту и Танхаузеру, использовали методы Спирина, а также Цанева и Маркова в модификации Галкина и Бердыпева,

Получены данные о количественном содержании РНК и ДНК в клетках V.dahliae I и II групп в динамике в контроле и под действием антибиотика 18-80, вносимого в питательную среду одновременно с посевом гриба в концентрациях 0,01 t и 0 >05 %, Максимум накопления РНК отмечался на 15 сутки роста. Далее, на 25-: и 30-сутки количество РНК в обоих вариантах снижалось. Б течение всего периода роста гриба (10, 15,25,30-е сутки) I группа характеризовалась большим содер-' жанием РНК (табл.6). Наибольшее накопление ДНК в клетках отмечалось на 15 сутки роста гриба. В дальнейшем, на 25- и 30-сутки содержание ДНК несколько снизилось. Обе группы V.dahliae характеризовались примерно одинаковым количественным содержанием ДНК. Небольшая доза антибиотика (0,01 %) стимулировала синтез РНК и ДНК в клетках, более высокая концентрация (0,05 %) снижала его.

Таким образом, антибиотик 18-80 действует на количественное содержание РНК и ДНК v.dahliae.

■ Мы изучили влияние антибиотика 13-80 на нуклеотидный состав РНК и ДНК V.dahliae . Полученные данные по нуклео-тидному составу РНК гриба, выведенные из 4-6 определений в двух параллельных гидролизатах каждого варианта, представлены в табл. 7.

Г + У/А + Ц в молекулах РНК в контроле и вариантах о антибиотиком близко к единице, что является основным критерием нативности изучавшейся РНК.

Отношение Г + Ц к А + У больше единицы позволяет отнести

Влияние антибиотика 18-РНК и ДКК У.ааШао , -80 на количественное а! /0 Таблица 6 содержание

Группа | Возраст] ,• гриба, | сутки | 5 Контроль | _____Р_ н _к___ конц-я антибиотика 0,01 % ! 0,05 % 1 ; | Контроль) ~ ! ! Д конц-я ан 0,01 % Н К гибиотика ! 0,05 %

II 1,96 2,31 1,86 1,35 1,68 1,20

I 10 2,64 2,70 2,22 1.42 1.71 1,15 "

II 2,58 3,01 2,18 1,51 1,92 1,38 ^ нч

I 15 3,63 3,78 3,46 1,50 1,96 1,40 .

II 2,11 2,31 - 1,93 1,45 1,60 0,94

I 25 3,44 2,38 1,80 1,38 1,05 0,75

II 1,96 2,06 1,74 1,35 1,55 0,87 .

I 30 3,01 2,25 1,62 1,35 0,95 0,78

Таблица 7.

Влияние антибиотика 18-80 на нуклеотидный состав РНК гриба У.йаЬНае.

Группа 1 ВозРаст. У.йаЪНае { СУТКИ I I Вариант | ! Содержание оснований, мол^__ Пур Г 1- 7 | Г + ц

аденин 1 ¡гуанин 1 урацшп цитозин Пир А + Ц ! ! А + У

II Контроль 26,9 28,7 22,0 22,4 1,25 1,03 1,05

0,01 % 23,1 31,6 . 21,5 23,8 1,21 1,13 1,24

0,05 % 26,1 30,7 19,3 . 23,9 1,32 1,00 1,20

" I Ю Контроль 27,3 29,8 21,9 21,0 1,33 1,07 • 1,03

0,01 % 25,7 31,1 19,1 24,1 1,32 1,01 1,23

0,05 % 26,0 30,7 19,1 24,2 -1,31 0,99 1,22

II Контроль 25,7 28,5 22*4 23,4 1,18 1,04 1,08

. .0,01 % 25,2 29,6 23,6 21,6 1,21 1,05 1Д4

0,05 % 24,5 29,0 20,8 25,7 1,15 0,99 1,21

I 15 Контроль 25,5 28,1 23,3 23,1 1,16 1,06 1,05

0,01 % 24,8 28,2 . 22,0 25,0 1ДЗ 1,01 1,14

0,05 % 23,5 29,0 25,2 21,3 1,11 1,01 1,23

Таблица 8.

Влияние антибиотика 18-80 на нуклеотидный состав ДНК гриба У.йаЬНае

Группа |в°зраст, ! сутки Вариант | Содержание оснований, мол • % А/Т Г/Ц Пур 1 г + ц

[аденин .'гуанин ¡цитозин! тимин Пир ! А + Т 1

II контроль 23,1 27,6 27,8 21,5 1,07 1,0 1,03 1.24

0,01 % 23,6 28,5 27,0 20,9 1,12 1,05 1,08 1,24

0,05 % 24,7 29,1 26,2 20,0 1,23 1,11 1,16 1,23

I 10 контроль 23,3 27,3 28,1 21,3 1,09 0,99 1,02 1,24

0,01 % 23,9 28,2 27,8 20,1 1,16 1.01 1,08 1,27

0,05 % 24,5 29,1 27,0 19,4 1,26 1,01 1.15 1,28

II контроль 23,8 26,0 26,9 23,3 1,02 0,96 0,99 1,12

0,01 % 24,1 26,9 26,0 23,0 1,04 1,03 1,04 1,12

0,05 % 24,0 27,0 26,3 22,7 1,06 1,02 1,04 1,1.4

I 15 контроль 22,9 27,8 27,6 21,7 1,05 1,00 1,02 1,21

0,01 % 23,4 28,1 27,4 21,1 1,10 1,02 1,06 1,24

0,05 % 23,6 27,9 27,1 21,4 1,10 1,02 1,06 1,22

- 24 -

суммарную РНК У.ЗаЬНае к ГЦ-типу. 1 и II группы не имеют существенных различий в нуклеотидном составе РНК.

Присутствие антибиотика 18-80 в питательной среде увеличивает количество гуанина и цитозина и уменьшает аденина и урацила и в I, и во II группах. \

По соотношению оснований ДНК У.йаЬНае относится к выраженному ГЦ-типу: количество гуанина и цитозина преобладает над количеством аденина и тимина. Отношения А/Т и Г/Ц близки к единице. Групповые различия в соотношении оснований не обнаружены: обе группы ■ У.ЗаЬНае относятся к ГЦ-типу.

Антибиотик 18-80, внесенный в питательную среду, несколько изменяет соотношения оснований ДНК: содержание аденина и гуанина незначительно увеличивается, цитозина, тимина - уменьшается, отношения Пур/Пир и соответственно А/Т и Г/Ц увеличиваются, причем, в наибольшей степени эти изменения Еыражены на 10-е сутки роста гриба и характерны для обеих групп (табл. 8). Следовательно, тетраеновый антибиотик 18-80 ингибирует образование РНК и ДКК у возбудителя вилта хлопчатника.

В литературе есть сведения, что полиэновые антибиотики нистатин и амфотерицин В влияют на синтез нуклеиновых кислот дрожжей. По данннм других исследователей, полиенн не обладают избирательным влиянием на синтез белка или.нуклеиновых кислот. Лучшее объяснение этому факту дают Дэвис и Рейнгольд: "Отток метаболитов из поврежденной клетки влечет за собой целый ряд последствий и, значит, не приходится удивляться тому, что в клетках, у которых (как мы теперь знаем) были повревдекы мембраны или оболочки, наблюдалось много различных метаболических дефектов'.'

Влияние полиеновых антибиотиков на проницаемость искусственных и клеточных мембран У.даЬНае__

Доказано, что полиеновые антибиотики адсорбируются на клеточных мембранах чувствительных к ним иикроорганизмоз, реагируют со стеаринами и тем самым нарушают избирательную

- 25 -

проницаемость мембран.. Данных о процессах, протекающих после того, как антибиотик вступил во взаимодействие со стери-нами мембран, еще очень мало. Изучение действия полиеновых антибиотиков на клеточную проницаемость проводили на искусственных бимолекулярных фосфолипидных мембранах ( БМ$ ). Раствор фосфолипидов в н-декане наносили на отверстие в стенке тефлонозого сосуда, погруженного в раствор, содержащий 10 мМ KCl, 10 мМ HaCI, при pH - 6,5 и комнатной температуре + 20°С. Сопротивление мембран и разность потенциалов на них измеряли с помощью электрометрического усилителя и • неполяризующихся электродов Ag -Ag CI, соединенных с растворами, окружающими-мембрану, агароЕНми мостиками с 3 М KCl. Антибиотики, растворенные в диметилформамиде, добавляли в водную фазу. Перед началом каждого опыта приготовляли свежий раствор используемого антибиотика. Растворы перемешивали магнитной мешалкой.

Установили, что микопентин резко снижает сопротивление искусственных мембран, при повышении его концентрации до 8,3 мкг/мл, логарифм сопротивления уменьшается по нелинейному закону. Микопентин проявляет активность даже если находится по одну сторону мембраны. Введение одной дозы антибиотика вначале очень быстро понижает сопротивление, затем в течении часа наблюдается возрастание сопротивления, которое далее стабилизируются на уровне ниже первоначального.

Можно предположить, что изменение сопротивления во времени, а именно, резкое падение в первый момент, объясняется образованием пор в мембране за счет частичного ее разрушения, а также из-за временного увеличения числа ионов в растворе в результате диссоциации антибиотика. Дальнейшее повышение сопротивления до определенного уровня, повидимому, связано с ассоциацией ионов на мембране.

Наши опыты показывают, что влияние полиенових антибиотиков на сопротивление ВМФ существенно не зависит от числа двойных связей. Существует мнение, что действие полиенов связано с перегруппировкой липидов внутри клеточной мембраны. Это согласуется с данными электронной микроскопии. Однако, вымывание из клеток жизненно важных компонентов:

Рис. 3. Градуировочный график для определения содержания гп++ в мицелии У.йаЬНае

0,12

0,10 А о 4

. ■ 1\ и\

К ... 1 . 1 . ' 1 ! 1 1 1

1

1 гч 0,06 0,02 "Л \ N. 3 111111

л_I__I_I , . I I_1.1. I_I, I_I_1_

7 8 ■ 9 10 II 12 7 8 9 10 II 12

возраст сутки

Рис. 4. Влияние антибиотика 18-45 (слева) и нистатина

.(справа) на зыход 2п++из мицелия у гриба 7.баЬИае I-антибиотик с активностью 50 ед/мл; 2-то же 25 ед/мл; 3-нистаткн с активностью 50 ед/мл; 4-коктроль

- 27 -

аминокислот, Сахаров, фосфорсодержащих соединений, микроэлементов и др.,а также понижение или полное снятие эффекта действия полиеновнх антибиотиков в присутствии повышенных концентраций К+ или НН^ указывает на конкурентные эффекта, возникавшие в местах взаимодействия полиенов со стеринами клеточной мембраны микроорганизмов. Мы рассматривали влияние полиеновых антибиотиков (тетраены: 18-45 и нистатин) на сорбцию ионов мицелием У.йапНае . Концентрацию

гп в среде определяли полярографически на лолярографе гайе1к1з ОН,101/1 по градуировочному графику.(рис. 3). Ошибка опытов не более 5 %. Известно, что Яп - активный стимулятор роста У.ДаЫхае и эффективно сорбируется мицелием гриба до ОД %. Столь высокий сорбцисннпП эффект гп при значительном стимулировании роста не может объясняться его участием только как Ко - фактора в энзиматических реакциях и указывает на вероятность его роли в мембранных процессах. Исследования показали, что ионы гп сорбируются мицелием гриба на ранних стадиях развития, максимальная же концентрация в течении 12 суток ке изменяется (рис. 4). Добавление антибиотика 18-45 в концентрации 25 и 50 ед/мл, а также нистатина 50 ед/мл вызывает быстрый выход

из мицелия гриба. В течении первого часа концентрация его в мицелии практически не меняется, резкое (в 2 раза) снижение концентрации Зп отмечается через 3-6 час. К концу суток процесс диффузии Яп из шцелия практически прекращается и концентрация его внутри клеток уравновешивается с концентрацией в культуральной 'жидкости. Факт^ уравновешивания подтверждает предположение об участии Яп с+ в мембранных процессах гриба У.йаЬНае, где, видимо сосредоточивается основная масса микроэлемента. Не исключено, что полиены специфично' взаимодействуют с компонентами клеточной мембраны, освобождая данный микроэлемент из реакционных центров. Это вызызает быстрый отток микроэлемента из клеток гриба, нарушение функции ;:ембракы и гибель микроорганизма. Специфических особенностей в действии антибиотика 18-45 и нистатина установлено ке было.

Влияние полненовых антибиотиков на токсические вещества Y.dahliae

Поскольку проявление хромагограмм при выделении токсинов y.dahliae вперЕке проводилось методом биоавтографии по микробному тесту, предварительно подбирался микробный тест, чувствительный к токсину V.dahliae, Для этого были использованы микроорганизмы иг различных систематических групп. Всего било испытано 125 видов: 47 видов дрожжей, 30 видов бактерий и микобактерий, 14 видов грибов, 33 вида актиномицетоз и I вид водорослей. Только одна культура Hicroaonospora vulgaris, штамм 1005 оказалась чувствительной к токсину, выделяемому в культуральную жидкость грибом V.dahliae. Сравнительное изучение показало, что к хлопчатнику токсичность сохранялась до разведения 1:10000, а к-микробному тесту - 1:20, т.е. побеги растений более чувствительна к токсину, чем микроорганизмы, что характерно для типичных фитотоксинов (Гойман,1954; Красильников,1958). При обработке хлопчатника токсином проводящие пучки и окружающие участки древесины стебля буреют, листья теряют тур-гор. Обнаружена прямая корреляция между вирулентностью и активностью токсина гриба: токсин наиболее вирулентной расы вызывал более сильное увядание растений и кнгибирование роста тест-культуры. Выявлены различия в скорости увядания в зависимости от возраста и сорта хлопчатника. Взрослые растения начинают увядать значительно раньше, чем молодые. Относительно устойчивый к вилту сорт 153-§ менее чувствителен к действию токсина, чем неустойчивый сорт 2034. Токсин возбудителя вилта не является строго специфичным для хлопчатника. Он угнетает бобовые растения (фасоль, горох), сильно действует на листья герани. Злаковые растения (пшеница, кукуруза) к действию токсина вертицилла не чувствительны. Изучали влияние полиеновых антибиотиков (нистатина, Р-42, 18-45, 18-80) на содержание низкомолекулярных токсических метаболитов гриба v.dahliae, описанных Руновым и Бородиным ( 1983 ' ). Об изменении токсина вертициллина судили по оптической плотности при 420 нм. Количество вертициллина А оценивалось по изменению полосы поглощения

- 29 -

260 нм, которую рассчитывали ка основании оптических плотностей при 225, 260, 290, 320 нм. Содер>лание вертициллина резко снижалось и коррелировало с изменениями скорости роста гриба. Одновременно возрастало содержание продуктов распада вертициллина Л (вертициллина В, сильноподвикного жёлтого пигмента, Х-пигмента). Добавление к токсину У.<ЗаЫ1ае полиеновых антибиотиков снижает или полностью снимает его токсическое действие на растения хлопчатника и микробный тест. Следовательно, изучаемые антибиотики не только подавляют развитие возбудителя вилта, ко и разрушают выделяемый им токсин. Нарушая функцию клеточкой мембраны, они ингибиру-ют жизненно важные процессы в клетках патогена, что приводит, с одной стороны, к снижению содержания вертициллина, а с другой - к усилению распада вертициллина А. При этом можно предположить, что вертициллин, не разрушаясь, выводится из мицелия У.йаЬНае, тогда как вертициллин А вначале разрушается и только потом выводится из клетки. Другим важным предположением, следующим из данных экспериментов, является вероятность того, что механизм действия полиеновых антибиотиков определяется взаимодействием полнена с верти-циллином В в клеточной стенке гриба, что нарушает целостность мембраны и вызывает еыход наружу протоплазмы клетки.

Глава 3. ' Некоторые аспекты взаимоотношений.

патогена У.<1аЫ1ае с растением-хозяином.

Особенности специализированных к различным соотам хлопчатника рас У. с!аЫ1ае_

1'сследоЕание проводили с авирулентным мутантом I расы ( Р-177 ), I и 2 расами У.йаЫ1ае, выделенными и любезно предоставленными д. б.н.Касьяненко А.Г. I раса ( ХЛ-1-3 ) гриба, выделенная иг хлопчатника сорта 108-$, поражала на 90 % сорт 108-Ф и крайне незначительно - "Ташкент-1". 2 раса ( ХЛ-17 ), выделенная из хлопчатника сорта "Ташкент',' поражала на 80-90 % оба сорта хлопчатника.

Известно, что фитопатогены хоропо развиваются на растительных субстратах, образуя активные пектиназы и целлюла-

зы.

Опыта показали, что целлюлотические и пектолитические ферменты V.dahliae следует отнести к категории адаптивных, так как в отсутствии индуктора (ткани хлопчатника)'содержание их незначительно. На рост, содержание целлюлаз и петстиназ гриба существенное влияние оказывавт сортовые особенности хлопчатника. Патоген значительно лучше растет и ферментатквно более активен при культивировании на ткани хлопчатника того ке сорта, из которого он выделен.

Целлюлслитическая активность у 2-х изучаемых рас и мутанта V.dahliae достигала максимума к 10-м суткам после добавления индуктора. Во всех сроках определения наиболее высокую целлвлазнуп, ксиланазную и гемицеллюлазнув активность проявляла 2 раса (рис. 5).

Авкрулентный мутант I, расы характеризовался самой низкой ферментативной активностью, которая обнаруживалась через 15-20 суток, когда начинался лизис мицелия. В мицелии гриба отмечали незначительное увеличение содержания целлюлаз, максимум которых приходится на 3-й сутки. Затем наблюдали некоторое снижение их содержания, т.к. часть ферментов во время лизиса мицелия ( что видно и при микроскопировании) выделялась в окружающую среду, где содержание фермента быстро увеличивалось. Следует отметить, что все изучаемые расы V.dahliae значительно лучше росли на средах с тканью, нежели на яблочной кислоте (контроль). В первом случае видимый рост патогена отмечался уже на 2-3, а во втором - только на 5-6 сутки. Прорастание конидий через 4-5 и 9-10 часов соответственно. Таким образом, ткань хлопчатника почти в 2 раза ускоряет прорастание конидий и рост v.dahliae.

В процессе специализации патогена к растению у последнего вырабатывается специфичность обмена веществ (пркспосо- • бительные реакции к субстрату), в результате чего растительные остатки хозяина используются лучше других субстратов. Так, нами показано, что рост и пектолитическая активность V.dahliae на ткани хлопчатника - хозяина в б раз выше, чем на сахарозе, в 3 раза выше, чек на пшеничной соломе и значительно выше по сравнению с фильтровальной бумагой.

Сх - (гермент гемицеллалаза ксиле-наза

Сутки после добавления индуктора (стебли хлопчатника)

Рис. 5. Активность целлюлаз з мицелии (зерхниГ; ряд) и кудь-туральной жидкости (нижний ряд) у различных рас возбудителя вертициллезного вилта хлопчатника

- 32 -

От'.-еченнач загисимость обнаружена в содеряанш; и составе суммарного белка, отдельных белковых котонентов и ¡¡искомо-л е к у л яр !П !.< соединения.

¡'эучснг.е состава белковых компонентов и аминокислотного состага селкоьих фракций мицелия у представителей спе-циали?;;розакных рг.с даёт основание полагать, что специализация сопря>.:е.на с модификациями регуляторных участков ДНК и, в основном, не затрагивает областей структурных генов. Формирование рас протекает путем отбора из природы растением-дифференциатором биотипов с обменом веществ, наиболее пригодным для развития внутри культивируемого сорта растения.

Выявление Бнехромосомных~ элементов в клетках У.ааЬИае_

Важное место в раскрытии механизмов взаимодействия хлопчатника и патогена занимают молекулярно-генетические подходы: поиск генетических элементов, ответственных за такие признаки как адаптивность, вирулентность, устойчивость. Внимание исследователей направлено на изучение природы факторов внехромосомной наследственности.

Установлено, что наличие плаз ми ц или вирусов обычно давт патогену дополнительные шансы на выживание.

Для выделения лизогенного фактора использовали различ- . нне по вирулентности штаммы гриба У.йаЬНае, любезно предоставленные Черкасовой Г.В. и Сафиязовым К. Наиболее лизо-генными оказались штаммы 77- и 68с, которые дают большие зоны лизиса в виде негативных колоний или дорожек, свидетельствующие о наличии в лизате литкчеокого фактора. Метод избирательной преципитации вируса охлазденным этанолом выявил, что наибольшая преципитация происходит при концентрациях этанола 50 % и 60 %. Однако, электрснномикроскопические исследования показали, что в полученных осадках вирусные частицы разрушены, о чем свидетельствовали и спектрофотометри-ческие исследования: увеличение отношения максимума к минимуму и при 40 содержании этанола оно составляло 1,90.

- 33 -

Метод осаждения вируса различными концентрациями поли-этиленгликоля ( ПЭГ-6000 ) непригоден для выделения вируса из клеток гриба V.dahliae.

Эффективным оказался метод с использованием моноэтилового и монобутилового эфира этиленгликоля. Препарат характеризовался максимумом поглощения при длине волны 260 нм и минимумом при 240 нм, соотношение ^260 t ^280 составляло 1,4. Электронная микроскопия очищенных препаратов выявила вирусные частицы диаметром 40 нм.

Для выделения плазмидной ДНК использована 10-ая генерация гриба V.dahliae, у которой обнаружены изменения в • структурной организации ДНК, появление новых фракций белков, ранее отсутствовавших у исходной формы (культура любезно предоставлена д.б. н. Гусевой Н,Н. ). Методом ультрацентрифугирования и ферментативной обработки тотальных препаратов ДНК обнаружена внехромосомная ДНК. С целью стабилизации структурной организации выделенной ДНК перед ферментативной обработкой биомассу гриба расстирали в жидком азоте. Реактивы для приготовления буферог и растворов перекристал-лизовывали в абсолютном этаноле. В результате внехромосомная ДНК сохранялась до одного месяца. Для доказательства, что она не является остатками участков хромосомной ДНК, связанными с гистоновыми белками, часть препарата обрабатывали протеиназой ( 500 мкг/мл ). Молекулярный вес внехромо-сомной ДНК был равным 89.I-I02 кв.

На основании аналитических экспериментов внехромосомная ДНК, фиксирующаяся над хромосомной, отнесена к плазми-дам. Из литературы известно, что плазмиды с молекулярной массой от 87 до .140 кВ относятся к Р- или R - плазмидам.

Изучение взаимоотношения растения-хозяина и гриба-патогена с помощью математической модели

Результаты исследований по токсинам гриба и ¡*итоалек-синам хлопчатника, были взяты в основу математической модели, количественно описывающей принципы взаимоотношения растения-хозяина и гриба-патогена. Исход взаимоотношения гиб-

- 34 -

нет растение, гибнет гриб, растение и гриб остаются живыми) зависит от скорости образования фитоалексинов и токсинов, от накопления их в токсических концентрациях. Нами осуществлена попытка изучить динамику взаимоотношения патогена и растения с помощью математической модели, которая исходит из следующего. Патогенный гриб выделяет токсины ( Т ), вызывающие зпболезание растения. В ответ на действие гриба растение синтезирует фитоалексины (фунгитоксические вещества) ('!£), подавляющие рост и развитие гриба. Обозначим через 11-х концентрацию фунгитоксических веществ в растении, через ц ц - то же в грибе. Пусть Тх - концентрация токсинов гриба в растении, Т-^ - то же в грибе, ТуХ -поток токсинов из гриба в растение, а ТХу - поток фунгитоксических веществ из растения в гриб. Индекс "х" обозначает принадлежность к растению, индекс "у" - к грибу (рис. б ).

ГК и 1 у аспьенае „х -их. Тх * 1

Рис. 6. Схема взаимоотношения растения-хозяина и гриба-патогена.

3 растении даже при отсутствии гриба имеется небольшая фоновая концентрация фунгитоксических веществ Их • Аналогично в грибе существует фоновая концентрация токсинов Т у . Если по каким-либо причинам концентрации Их и Т-^ окажутся отличными от их фоновых значений, то при отсутствии факторов, постоянно вызывающих такое отклонение, величины Их к' 'Гсо временем будут стремиться к ^и 7',/ , т.е. и '

^ 3 растении активизируется синтсз фунгитоксических веществ, если концентрация токсинов в них Тд; меньше фито-

- 35 -

токсической Сх • При увеличении же концентрации токсинов выше порога их фитотоксичности происходит подавление синтеза фунгитоксических веществ, так как нарушается нормальное развитие клеток растений. Аналогично действие фунгитоксических веществ на клетки гриба-паразита. Поступление небольших концентраций фунгитоксических веществ в гриб стимулирует биосинтез токсинов грибом. Концентрация же фунгитоксических веществ выше порога токсической концентрации С-и угнетает этот процесс.

Переход токсинов гриба в растение происходит при их концентрации в грибе больше фоновой, т.е.

h-'lу'Ь о

v <1 I 0 . для Ту + т-у

где - параметр,. имеющий размерность, обратную времени. Аналогично фунгитоксические вещества, образующиеся в растении, поступают в гриб при их концентрации в растении больше фоновой - . ^

п 1Uz>tlx

'Y"xflO- для 11* ¿Ü* (2)

где Jk-%. - параметр, имеющий ту же размерность, что и Дифференциальное уравнение, описывавшее изменение концентрации фунгитоксических веществ в растении во времени:

Ch-x (Их-Uz)ответственен за поддержание концентрации 7/ т •на фоновом уровне. J$x Тсс(Сх-Тх) описывает влияние концентрации токсинов в растении на синтез -фунгитоксических веществ. При Ос Тх Сх. происходит стимуляция синтеза фунгитоксических веществ, а при Tai ?Сх- угнетение этого процесса. Величина описывает отток фунгитоксических веществ

из растения в гриб, йх jb'Z являются параметрами.

Дифференциальное уравнение, описывающее изменение концентрации токсинов в грибе:

~ - .Эй -

Г^ и осулествляет поддержание концентрации /^ на

фонозом уровне, Я-у/¿у-^у/списывает влияние концентрации фунгитоксических веществ на синтез токсинов в грибе. При 'Ну ¿V процесс угнетается. Величина описываа

отток токсинов из гриба в растение. П-у и - параметры.

Изменение концентрации токсинов в растении описывается следующим дифференциальным уравнением:

с1 Тх

<5>

О ТуХ учитывает приток токсинов из гриба в растение.

описывает убыль токсинов в растении за счет детокси-кации. /'.с - параметр, имевший размерность, обратную времени.

Изменение концентрации фунгитоксических веществ в грибе выражается дифференциальным уравнением:

Иху Учиты:ва5т приток фунгитоксических веществ из растения в гриб,^ описывает убыль фунгитоксических веществ в грибе за счет его детоксикации.

Система уравнений ( I ) - ( б ) является замкнутой и полностью описывает рассматриваемый процесс

[■Их Ш, Тх [Ь), Ну Ц), 7у (1)> ртут, при заданных начальных условиях.

Сорт растений и раса гриба в рамках составленной модели определяются соответствующим каждому из них набором из семи параметров.

Для растений - 11 к, С1я^ Як, Сх.^ Ц -л, ;

Для гриба - Л у, Ту; ¿1 у. Яд, '11-%*-

Если модель использовать для другой пары патогена и хозяина, то каждому растению и грибу будут соответствовать свои числовые значения этих параметров.

'3 численном эксперименте при расчете взаимодействия хлопчатника и гриба У.еа'аНае использованы параметры, найденные с помощью оптимизации.

0,72

120 сутки

Рис. 7. Динамика концентраций токсинов Тх и фунгиток-

сических веществ И'х в' растении

0,100,08 0,06 0,04 0,02

Ю~2мг/г

Ту

Кук

120 сутки

Рис. 8. Динамика концентраций токсинов Ту и фунгиток-сических веществ Иу в грибе

- 38 -

Параметры хлопчатника Параметры гриба

А = 0,05 А-у = 0,15

Л сутки < СУТКИ

/7х= 0,05-Т0"2мг/г йд» 0,03 Ю~2мг/г

= °»1 5у1кй 0,2 су!кй

Вх= ЮО----£----------В-и = 200 -----■

мг/г сутки ^ мг/г.сутки

Сх= 0,18 Ю-2мг/г Су = 0,50 Ю~2мг/г

Тхк= 0,12 10"^ мг/г 0,0510~2мг/г

Начальные условия Растение Гриб

11 не 0,07 10~2мг/г Туе = 0,04 Ю~2мг/г

Тлс= 0,02 Ю~2мг/г 0,01 10~2мг/г

Наг по времени Ъ принят равным одним суткам.

При выбранных параметрах хлопчатника И'гриба У.йаЬНае растение погибает на 78 день после его заражения грибом У.йаЬПае (рис. 7 ), что согласуется с фактически наблюдаемой длительностью жизни растений хлопчатника на вилтовом фоне в условиях полевого опыта. Выведение вилтоустойчивых сортов хлопчатника в рамках данной модели означает увеличение у этих сортов параметров "Я по ер331*6111110 с их значениями у исходных сортов, а борьба с вилтом-таким воздействием на гриб У.й&ЬПае, . которое бы уменьшало его параметры ^ ^ и

Индуцирование синтеза Дитоалексинов хлопчатника

Работами ряда исследователей показано наличие госсипо-ла и его производных в различных сортах хлопчатника, инфицированных грибом V. саЬНаз. В езоих исследованиях мы исходили кз того, что в защитные механизмы растений включается значительно большее число гукгитоксических веществ, при-

надлежащих к различным классам органических соединений, чем это было известно до сих пор. Е связи с этим провели поиск, выделение и идентификацию веществ хлопчатника негоссиполь-ной природы, подавлявших рост и развитие гриба У.<5аЬ11ае и участвуюиих в формировании устойчивости растет:." к зилту. Исследования проводили со здоровыми и инфицированными растениями хлопчатника сорта "Талкент-1". Активность хлороформных .экстрактов (0,2 мкл/диск) из инфицированных проростков хлопчатника оказалась значительно более высокой к грибу У.йаЫхае, чем из здоровых растений: 3,17±0,58 мм и 1,17±0,39 мм соответственно. Для выяснения химической природы веществ, обуславливающих фунгитоксичность инфицированных тканей, экстракты хроматогр&фировали на пластинках "5ИиГо1" в системе бензол-метанол' (-9:1 ). Оказалось, что фунгитоксичные соединения локализованы в зонах сН£ 0,6 и 0,3. Используя качественные реакции, мы установили, что в зоне с 0,3 сконцентрированы госсиполоподобные вещества, а в зоне с н£ 0,6 - соединения липидной природы.

Общие липиды из контрольных и опытных (обработанных культуральной .жидкостью У.ааЬНае ) образцов растений разделяли методом колоночной хроматографии на отдельные классы липидов (схема), которые проверяли на фунгитоксичность по отношению к грибу У.баЬИае. Зоны с ^ 0,48 и 0,35 в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусн&я кислота ( 70:30:1 ) определили как сумму эпокси- к кетоацилглицеринов, а также как оксиацилглицерины. Идентификацию проводили на основании сравнения их хроматографической подвижности (тонкослойная хроматография) с Е^ модельной смеси эпокси- и кетоацилглицеринов, оксиацилглицеринов (табл.9), а также идентичности спектральных характеристик ИК- и ПМР-спектрсв. Модельные смеси веществ и модельные соединения любезно предоставлены С.Д.Гусаковой и С.Г.Юнусовой (Институт химии растительных веществ АН РУз ). Вещества из вышеназванных классов липидов проявили активность по отношению к грибу У.йгЬИае. Выход смеси эпокси- и кетоацилглицеринов из контрольных растений составил 1,95 %, из опытных - 4,02 %, а оксиацилглицеринов соответственно 0,80 % и I,50 %.

ПРОРОСТКИ ХЛОПЧАТНИКА

сумма липидов

экстракция хлороформ-метанолом, 2:1

колоночное хроматографирование на силикагеле

препаративная ТСХ на силуфоле и силикагеле

УГЛЕВОДОРОДЫ

ТРИАЦИЛ-ГЛИЦЕРИ-НН

ЭПОлСИ-* СВОБОД- 0КСИ-*

И КЕТО- HUE ЖИР- АЦИЛ-

АЦИЛГЛИ- HUE ГЛИНЕ-

церины- КИСЛОТЫ РИШ

цепочной гидролиз•

метилирование

препаративная ТСХ на силуфоле

кислотный гидролиз

ЭПОКСИ-КИСЛОТЫ

ДИАЦИЛ-ГЛИЦЕРИНЫ

СТЕРИ-НЫ

ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ

КЕТО-КИСЛОТЫ

ОКСИ-" КИСЛОТЫ

щелочной гидролиз

метилирование

препарз.тивная ТСХ на силуфоле

кислотный гидролиз

ОБЫЧНЫЕ ЩРНЫЕ КИСЛОТЫ

* - вещества с фунгитоксической активностью

Схема. Фракционирование фунгитоксических липидов хлопчатника

Фунгитоксичность некоторых классов нейтральных липидов

из проростков хлопчатника и модальных соединений . ' Таблица 9.

Класс липидов Количество вещества на диске (мг) Зоны угнетения роста гриба • под действием липидов хлопчатника (мм) Зоны угнетения роста гриба под действием модельных соединений (мм)

I. Углеводороды , 20 0 0

2. н-Тр иацил гл и цер и ны 20 С 0

3. Эпоксиацилглицерины

Кетоацилглицерины 20 4,17 ± 0,58 4,45 ± 0,52

4. Свободные жирные

кислоты 20 1,58 ± 0,79 1,38 ± 0,84

5. Оксиацилглицерикы 20 5,00 ± 1,04 5,48 ±1,15

б. Ди ацил гл и цер и ны 20 0 0

7. Стеринн 20 0 0

8. Полярные лигшди 20 0 0

- 42 -

Выявленная фунгитоксичность 3 вышеназванных классов нейтральных липидов ( КЛ ), а также изменение их концентрации в ответ на индуцирование, позволили предположить, что они наряду с госскполоподобными веществами вносят сбой вклад в формирование устойчивости хлопчатника к вилту.

Из секи выделенных классов нейтральных липидов три проявляли фунгитоксичность к У.ааЬНае. По активности их можно поместить в следующий ряд: оксиацилглицерины, смесь эпокси- и кетоацилглицеринов, свободные жирные кислоты. По качественному■составу нейтральные липиды опытных растений не отличались от контрольных (табл.10).

Таблица 10.

Состав нейтральных липидов из опытных (образец I) в контрольных (образец 2) проростков хлопчатника . сорта "Ташкент-1" (н^ .в системе растворителей гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота,70:30:1).

» .' Классы липидов | образец I | образец 2

[ г ■%■ | г ! %

I. Углеводороды фронт 0,14 0,28 0,06 0,11

2. н-Триацилглицерины 0,80 44,40 88,80 46,05 92,10

3. Эп оксиацклглицерины 0,48 2,01 4,02 0,96 1,95

Кетоацилглицерины•

4. Свободные жирные 0,41 0,70 1,40 0,83 ' 1,65

кислоты

5. Оксиацилглицерины 0,35 0,75 1,50 0,40 0,80

0 • Диацилглицерины 0,30 -1,00 2,00 0,90 1,80

7. Стерины 0,28 0,90 1,80 0,35 6,70

8. Полярные липиды старт 0,10 0,20 0,45 0,89

Различия наблюдались лишь в количественном отноиении. Так, в опытных проростках хлопчатника концентрация фунги-тохсических классов НЛ более высокая, чем в контрольных. Поскольку в работе использовали равные навески образцов, а НЛ разделяли на классы в строго одинаковых условиях, то на

- 43 -

основании этого был сделан вывод о способности культураль-ной жидкости У.ааЬПае индуцировать синтез и накопление фунгитоксических липидс:,, что приводило к накоплению в растениях окси-, эпокси-, кетоацилглицеринсв, что, по-видимому, связано с активацией пироксидазных систем хлопчатника. В дальнейших исследованиях была установлена связь между концентрацией фунгитоксических липидов и устойчивостью хлопчатника к вертициллезному увяданию. Контрольные и опытные проростки растений заражали суспензий конидий У.ааЬНае ( ХЛ - 17 ).

Через 20 дней количество больных растений в контроле составило 94 %, в опыте - 47 %. Следовательно, одним из факторов повышения устойчивости, хлопчатника к вилту в приведенном опыте является увеличение концентрации эпокси-, кето- и оксиацилглицеринов.

Б дальнейшем мягким шелочным гидролизом получили сво-~ бодные жирные эпокси-, кето- и оксикислоты, а также обычные жирные кислоты. Проверка.показала, что жирные оксикислоты более токсичны к грибу У.йаЫЛае, чем жирные эпоксикислоты. При использовании 50 мкг препарата зона угнетения роста У.(}а1а11ае под действием оксикислот равнялась 13,25- 0,62 мм, под действием эпоксикислот - 9,17* 0,94 мм.

Фунгитоксичность модельных соединений не отличалась' от фунгитоксичности суммы эпокси- и кетоацилглицеринов, окси-ацилглицеринов из приростков хлопчатника. Свыше 80 % суммы жирных оксикислот оксиацилглицеринов из семян хлопчатника составляла рицинолевая кислота, при нанесении которой в концентрации ^0 мкг/диск, зона угнетения роста У.ааЬНае равнялась 15,33± 0,65мм. Добавление указанной кислоты непосредственно в среду культивирования гриба в концентрации 20 м'кг/мл приводило к полному подавлению прорастания спор У.ДаЬПае. В связи с этим можно предположить, что в целом фунгитоксичность оксиацилглицеринов из проростков и семян хлопчатника связана с наличием в их составе рицинолевой кислоты. Полученные результаты представляют особый интерес в связи с тем, что рицинолевая кислота входит в состав ку-тина ( КоХа^икиЗу, 1970), которой принадлежит большая

- 44 -

роль г структурном иммунитете растений. С практической точки зрения оксигеиированные шрние кислоты перспективны для использования их в качестве биохимических маркеров защитных реакций при разработке способов индуцирования естественных механизмов устойчивости хлопчатника к Еертициллсзному вилту.

Известно, что у несовершенных грибов биосинтез полике-тпдних фитотоксиноз, жирных кислот и меланина взаимосвязан и осуществляется одним и тем ке ферментным комплексом ( Маас, 1978; Simpson,1980). В связи с этим представляло интерес исследовать действие оксигенированных кислот, в частности,рицинолеЕой кислоты, на биосинтез меланина V.daЬ-liae.no некоторым литературным источникам,ответственным за вирулентность и жизнеспособность гриба. При внесении в среду культивирования гриба рицинолезой кислоты в концентрации 20 мкг/мл наблюдалось полное ингибировакие роста V.dahliae. Концентрация ниже порога фунгитоксичности приводила к нарушению процесса, обуславливающего образование черного пигмента микросклероциев гриба - меланина. Об этом свидетельствовало исчезновение черного пигмента и появление оранаево-коричневой или тёмно-вишневой окраски.

Известно, что трициклазол, пирохилон и некоторые другие препараты обладают способностью блокировать образование меланина. 3 наших исследованиях действие рицинолевой кислоты на меланиногенез V.dahliae сравнивали с трициклазолом. Установили, что при концентрации 5 мкг/мл в среде культиви-розания накапливался 2-оксиюглон, т.е. блокируется стадия превращения 1,3,8-триоксинафталина в вермелон (схема), так как 2-оксиюглон образуется в результате аутоокисления указанного нафтола. При увеличении концентрации до 10 мкг/мл рицинолевая кислота ингибировата и стадию превращения 1,3, 6,8-тетраохсикафталина в сциталон, причем фдавиолин накапливался в результате аутоокисления указанного нафтола.

Таким образом, можно сделать заключения, что по характеру блокирующего действия на биосинтез меланина V.dahliae рицинолевая кислота подобна трициклазолу. Поскольку 2-оксиюглон и флалзиолин являются фи то токсинами, то можно полагать, что они, накапливаясь под действием рицинолевой кислоты, в

ацетат (пентакетид)

рициноле-вая кислота

10 мкг/мл

рициноле-вая кислота

5' мкг/мл

1,3,6,8-тетра-оксинафталин

флавиолин

с ци тал он

1,3,8-триокси-нафталин

вермелон

2-оксиюглон

1,8-диокси-нафтапин

меланин

4=-(Л

Схема. Блокирование биосинтеза меланина гриба У.йаЬПае рицинолевой кислотой

свои очередь, индуцируют синтез фитсалексиков хлопчатника.

Разработанный нами метод выделения суммы конституционных и индуцированных фитоалексинов хлопчатника может быть использован в качестве экспресс-метода для предварительного отбора вилтоустойчивых форм растений хлопчатника при селекции, а также д.»л установления эффективности фунгицидов в лабораторных условиях.

Глава 4. Применение полиеновых антибиотиков для защиты хлопчатника от вилта

При отборе ахтиномицетов-антагонистов и продуцируемых ими полиеновых антибиотиков мы исходили из положения Кра-сильникова H.A.(1958г.)о том, что антибиотки, предназначенные для использования в растениеводстве,должны подавлять развитие возбудителей заболевания растений, обладать способностью легко проникать е ткани растений и сохраняться в них достаточно длительное время, проявляя избирательное действие на различные микроорганизмы.Лечебные дозы препаратов должны быть безвредными для растений, метод применения должен быть технически доступным, а всё мероприятие экономически приемлемым.

Исследования показали, что отобранные актиномицеты -продуценты тетраеновых антибиотиков,'несмотря на широкий антимикробный спектр, обладают избирательностью действия: угнетая многие с^итопатогенные грибы ( Verticillium dahliae, Fusarium vasini'ectum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Botrytes cinerea), дрожи ( Saceharomyces cerevisiae, Candida albicans ), слабоактивна в отношении грамположи-тельных к не действуют на грамотрицательные бактерии. На некоторые полезные формы микроорганизмов (азотобактер,клубеньковые бактерии) изучаемые актиномицеты не только не оказывают подавляющего действия, но и стимулируют их развитие. Изучена способность полиеновых антибиотиков проникать в семена к ткани хлопчатника и сохранять там свою биологическую активность.для этого использовали наиболее активные з отношении к У.йаЬНаеантибиотики 18-80, 18-45,' IS-7I.P-42, ИМ—I. При 30 минутной экспозиш :: замоч".и се-

- 47 -

мян хлопчатника в водных растворах антибиотиков их легко молено было обнаружить внутри семени, в зародышах и проросших семядольных листьях (табл. II).

Таблица II.

Проникновение антибиотиков в сечена хлопчатника ( экспозиция 3 часа )

Анти- 1 1 Часть ¡Зона уг-! Анти- I 1 Часть- ! Зона уг-

! не те ни я ! ! несение

биотик | семски ¡роста ! биотик ! семени ! роста

j ¡У.йаЬИае} ; г/.ааьизс

1 ! мм ! | ! мм

18-71. I оболочка' 12 18-80 Т оболочка 10-12

II оболочка 3-4 II оболочка ' 3-4

зародыш 2 зародыш 2

18-45 I оболочка 15-16 Р-42 I оболочка 15

II оболочка 4-5. II оболочка 8

зародыш 3-4 зародыш 5-6

ИМ-1 I оболочка 11-12

II оболочка 4-5

зародыш ' 2-3

Примечание: I оболочка -'верхняя, II - знутреняя. Проникая в семена хлопчатника, антибиотики влияют ка интенсивность расхода запасных веществ и развитие всходов, ускоряя вступление проростков в автотрофный период низни. Так, антибиотик ИМ-1 значительно повышал интенсивность расхода запасных питательных веществ б семенах хлопчатника сортов АК-402 и Юлдуз: в контроле-7,27 %, в опыте-12,03,3, наблюдался более интенсивный расход липидов, азотистых соединений, углеводов.-

Вероятно, под-действием антибиотика обмен запасного материала приобретает более интенсивный характер с привлечением в метаболический круг всех ресурсов запасных соединений прорастающего семени.

Все это и последующие исследования дают основание' ИМ - I и другие изучаемые нами полиеновые анти -

- ад -

бкстики рекомендовать для предпосевной обработки семен хлопчатника.

Экспериментально било установлено, что изучаемые антибиотики легко всасываются корневой системой и через ксилему уже через 40-50 мин. достигают стебли и листья ( табл.12,13).

Таблица 12. Проникновение антибиотиков через корневую систему хлопчатника (экспозиция I час)

антибиотик ¡часть растения

!зона угнетения ро'с-!та У.йаЬИае, мм

18-71

18-45

18-80

Р-42

ИМ-1

корень

стебель

лист.

корень

стебель

лист

корень

стебель

лист

корень

стебель

лист

корень

стебель

лист

6-7 О О

8-9

2-3 О

7-8 : 4

О

7 О О

6-7

3-4 О

. При этом препараты накапливались в различных органах избирательно. Так, антибиотики 18-71 и Р-42 в основном локализуются в корнях, а 18-80, 18-45, ИМ-1 - в корнях к надземных органах хлопчатника. При опрыскивании они могут также проникать в растения и через листовую поверхность, мигрируя через Флоэму,. достигать корни растений.Скорость поступления полиенозых антибиотиков в органы хлопчатника различна и.зависит от температуры и влажности окружающей

среды,-возраста и физиологического состояния растений,способа обработки. Срок сохранения изучаемых антибиотиков в тканях хлопчатника не одинаков.Так, антибиотики 18-60,13-45, ИМ-1 обнаруживаются в течении 2-2,5 месяцев, в то время как препараты 18-71 и Р-42 значительно меньше (1,0 - 1,5 месяца).

Таблица 13

Проникновение антибиотиков через листовую поверхность хлопчатника ( опрыскивание)

антибиотик | часть растения!' ^ЖК

18-71 . листья 5

стебель 3

корень 7-8

18-45 листья ' 20

стебель 7-8

корень О

18-60 листья 4-5

стебель 1-2

корень 10-12

Р-42 листья 3-4

стебель 3

корень 6-7

ИМ-1 листья 5-6

стебель 2-3

корень 7-8

Были установлены лечебные и фитотоксическпе дозы отобранных антибиотиков для растений хлопчатника.Концентрация 1:100000 уже была эффективной и приводила к снижению заболеваемости растений вилтом.Угнетение рсхожести семян и состояния растении вызывали дозы 1:10 и 1:100.

Изучаемый нами антибиотик ИМ-1 по инициативе Ташкентского научного центра, наряду с другими сгестью препарата;;:;,

различающимися химической природой,прошёл трёхлетние испытания ь колхозах "Ленин юли" и "Ко,;чунизм" Ташкентской области.

Выявлено стимулирующие действие препаратов на энергию прорастания и ьсхожесть сечян хлопчатника сортов Тадисент-1 и С-4830 по отношению к контролю: микроводорослей - 40 -44%, ИМ-1 - 31 - препарата Т, мигуена, кубового остатка,препарата колхоза "Ленин юли" - 17 - 21%, янтарной кислоты -13,6%.Повышение всхожести семян на опытных полях позволило при прореживании отобрать для дальнейшего развития более здоровые и крепкие всходы, создать наиболее благоприятную частоту стояния растений, что положительно отразилось на дальнейшем развитии,заболеваемости и урожайности хлопчатника. При использовании антибиотика ЙМ-1 выявлено увеличение высоты растений,площади листовой пластинки,количества и длины корней, количества коробочек (на 5-6),ускорение фаз развития ( на 4-5 дней).Раскрытие коробочек, по сравнению с контролем ускоряется на 5-6 дней.Действие других изучаемых б препаратов на растения хлопчатника было неодинаковым.Урожайность по сравнению с контролем (33-34ц/га) повышалась: микроводоросли - 42 - 43ц/га, ИМ-1 - 40 - 41ц/га,. препараты Т и колхоза "Ленин юли" - 37 - 38ц/га, янтарная кислота - 36 - Э7ц/га, кубовый остаток и мигуен - 34 - 35 ц/га.

Наибольшее повышение устойчивости растений хлопчатника к. болезням отмечалось под действием антибиотика ИМ-1: заболеваемость вилтом снизилась на 35-40#, корневой гнилью на 27-32^, больных гоммозом растений не выявлено. Метод предпосевной обработки сенян хлопчатника антибиотиком ИМГ1 совместно с сотрудниками Ленинградского ВНИИ антибиотиков и ферментов МЗСССР защищен авторским свидетельством.

Учитывая положительное злияние антибиотика ИМ-1 и микроводорослей на урожайность и заболеваемость хлопчатника и;лтом, корневой гнилью и гоммозом,нами разработан,получивший признание производственников, экологически чистый биологический комплекс "Биополан", состоящий из 3-х компонентов: микроводорослей, антибиотика ИМ-1 и полимерного покрытия. 3 течение ряда лет (1385-1391 гг) комплекс опрсбирован в ряде хлопководческих хозяйств Ферганской долины (Эргашев,

- 51 -

1990), защищен авторским свидетельством.

Производственные испытания показали, что "Биополан" повышает всхожесть семян на 18-20 %, есходы появляются на 2-3 дня раньще, поражаемость хлопчатника корневый гнилью снижается на 18-25 %, вилтом на 25-30 урожайность хлопка-сырца повышается на 10-15 %, экономия посевного материала составляет 25-35 %. Использование "Биополана" исключает пересевы, позволяет производить посевы при самых неблагоприятных погодных условиях.

Расход комплекса: 2 кг пасты микрозодорослей, 30 г антибиотика (при активности 800 ед/мл ), 0,5 кг полимерной пленки на I тонну семян.Сотрудниками здравоохранения показано, что комплекс "Биополан" не загрязняет окружающую среду, положительно влияет на здоровье сельского населения (заболеваемость вирусным гепатитом снизились в 10 раз),предохраняет почву, воздух, воду.от загрязнения ядохимикатами. Перечисленные свойства "Биополана" выгодно отличают его от применяемых до настоящего времени токсичных химических препаратов (фентиурам'а,• тигама), что позволяет рекомендовать этот комплекс для широкого внедрения. Для защиты хлопчатника от вилта, наряду с использованием антибиотических веществ, наш разработаны микробиологические препараты, содержащие живые культуры актиномицетов-антагонистов,.Для оздоровления почвы, снижения инфекции вилта предложено и проходит испытание новое биоудобрение на основе аммофоса с внесением бактерий-азотфиксаторов и актиномицетов-антагонистов, выделенных из серозёмных почв Узбекистана.

Предварительно изучена приживаемость и антибиотикооб-разованиё актиномицетов-антагонистов в стерильной и нестерильной почвах. В достаточной концентрации они обнаруживаются- уже через Ь дня. Наибольшее количество активных веществ отмечено в стерильной почве. Известно, что полезные микроорганизмы перспективно вносись в почву одновременно со стимулирующим их развитие питательным субстратом (сено, жмых, торф и др.), что повышает конкурентную способность интродуцента в ризосфере растений. Так, при знесении акти-номицетно-жмыхового тука на сильном вилтовом фоне растения

- 52 -

хлопчатника лучше развивались, пораженность вертицкллезным вилтом снижалась: б контроле количество больных вилтом растений достигало 70 %, в опыте - 20-25 %. Ткани растений, выращенных в почве, обогащенной актиномицетами, обладают фунги-токсичностью по отношению к грибу V.dahliae. Растертые отдельные органы такого хлопчатника при наложении на газон гриба дают хорошо'видимые зоны отсутствие роста. В корнях растений эти свойства проявляются в большей мере, чем в стеблях и листьях. Следовательно, образуемые актиномицетами антибиотики поступают из почвы в 'растение и повышают фунгицид-ность тканей. Тонкие срезы через корни и стебли хлопчатника, •выращенного при внесении актиномицетов в почву, не обнаружили в них,в отличие ст контрольных растений, присутствия мицелия гриба. Антибиотики, продуцируемые актиномицетами-антагонистами, проникая из почвы в растения и подавляя развитие гриба, препятствовали распространению его по сосудисто-проводящей системе хлопчатника. ■

Не менее эффективным, технически более приемлемым способом внесения актикомицетов-антагонис'тов в почву явилась предпосевная замочка семян хлопчатника суспензией зеленых микроводорослей (хлореллы и сценедесмуса) совместно с лио-фильно высушенным нативным препаратом актиномицетов. Этот метод с IS88 года используется в хозяйствах Хорезмской области >: Каракалпакстана. На тонну суспензии оореллы добавляется 60 г препарата актиномицетов. Отмечается снижение заболеваемости хлопчатника вилтом на 30-33 %, повышение урожайности на 12-15 %.' Достигается это за счет снижения как общего количества пораженных вилтом растений, так и растений, пораженных в острой форме. Предпосевная обработка семян суспензий хлореллы с актиномицетами способствовала также повышению всхожести семян, ускорению развития растений, созревание коробочек по сравнению с контролем наступало на 10-12 дней раньше.

Технология приготовления препаратов, содержащих живые культуры актиномицетов-антагонистов, разработана нами на полупроизводственной установке Института микробиологии АН РУз. Технология промышленной наработки антибиотика ИМ-1

- 53 -

разработана сотрудниками ВНИИ антибиотиков и Ферментов МЗ СССР'и освоена на Пензенском заводе "Биосинтез".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мероприятия, напрвленнне на защиту хлопчатника от вил-та, могут быть успешными и эффективными, если они основаны на глубоком знании факторов, обусловливающих патогенность гриба ТГ.<За'пИае, физиолого-биохимических основ устойчивости растений к возбудителю болезни, динамики взаимоотношений патогена и-растения-хозяина.

■ Исследования показали, что возбудитель вилта хлопчатника продуцирует в окружающую среду токсины, воспроизводящие наиболее характерные симптомы вилта. Разработанный нами метод биавтографии значительно ускоряет процессы выделения фитотоксинов У.ааЬНае и увеличивает возможности более точного определения их биологической активности.

Проникая в растения, токсины \г.с1аЫ1ае нарушают проницаемость мембран,что сопровождается ингибированием фотолиза воды, циклического и нециклического фотофос'юрилиро-вакия, ассимиляционных процессов, а также падением тургори-ецентности и потерей ионоз качия растением. Выявленная способность токсических веществ. У.даЬНаепри попадении з растение индуцировать образование защитных веществ (фитоалек-синов), ингибирующих рост и развитие патогена , позволило связать эти процессы в-единую цепь взаимоотношений: патоген '- токсин - растение - фитсалексин - патоген.

Вскрытие этой цепи взаимоотношений стало возможным благодаря построенной математической модели, позволяющей количественно рассчитать концентрацию фитоалексинов в хлопчатнике и токсинов з грибе и определить исход взаимоотношения партнеров.

Достоинством модели является установленная возможность • на основании изменения показателей определенных параметров предсказать результаты предлагаемых мер защиты растений от болезней, в частности, хлопчатника от вилта.

Обнаруженная корреляция между. содержанием актигных ли-

- 54 -

пкдов и степенью устойчивости хлопчатника к вилту вызвала необходимость более глубокого изучения веществ, участвующих в защитных реакциях хлопчатника к вилту. В результате установлено, что наряду с госсиполоподобными фитоалексинами достаточно высокой фунгитоксической активностью обладают оксиацилглицерины, а такие сумма эпокси- и кетоацилглицери-. нов. Оксиккслоты,в частности,рицинолевая кислота и некоторые противогрибковые антибиотики из актиномицетов блокировали биосинтез меланина у гриба У.саЬНае.

В то не вреда известно,что меланиногенез является важным признаком,обеспечивающим адаптацию и жизнеспособность возбудителя вилта.и осуществляется в покоящихся структурах.

Следовательно, практическая значимость изучаемых нами г.'ротивовилтовых препаратов возрастает.

Поливковые антибиотики не только индукторы защитных веществ хлопчатника, но и оказывают прямое действие на гриб V.ааЬИае . 3 результате цитологических и физиолого-биохи-мических исследований установлено, что тетраеновые антибиотики проявляют ингибирующее влияние на рост и развитие гриба: конидии разбухали и приобретали огромные размеры, клеточная оболочка разрывалась и содержимое клеток выходило наружу. Отмечены также нарушения в развитии ядерного аппарата: ядерное вещество диспергируется и имеет вид хромати-новой сеточки. Особый интерес вызывает способность тетрае-новых антибиотиков лизировать микросклероции патогена, что создаёт возможность разрушать источник инфекции непосредственно в почве. ' ■

Пслизнозые антибиотики оказывали также ингибирующее влияние на физиолого-биохимические процессы возбудителя зилта хлопчатника. Особого внимания заслуживает их способность снижать или полностью подавлять действие токсических веществ патогена.на растения хлопчатника.

Изучаемые нами антибиотики ИМ-1, 18-45,х18-80, 18-71, Р-42 обладавг способностью легко проникать в семена и ткани хлопчатника и длительно сохранять там свою активность. Они обладают избирательностью действия, подавляя развитие фитопатогенных грибов, в том числе у.ааЬИае » не оказыва-

- 55 -

ют отрицательного действия на многие полезные микроорганизмы, например,азот^иксирующие.Усиливают биосинтез защитных веществ хлопчатника, тем самым повышая устойчивость к вилту, одновременно оказывают положительное действие на всхожесть семян, рост, развитие и урожайность растений.' Они проявляют не только терапевтическое, но и профилактическое действие в предупреждении развития заболевания зилтом. Для этого наиболее эффективным методом применения явилась п"-дпосевная за' мочка семян в растворах вышеуказанных антибиотиков и бактеризация их живыми культурами актинокицетов-актагонистов. Значительный эффект получен при совместном их использовании с зелеными микроводорослями и полимерным покрытием-экологи-чески чистая композиция "Биополан", что позволяет рекомендовать ее для широкого внедрения в практику хлопководства.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что актиномицеты - более перспективный класс микроорганизмов для изыскания активных продуцентов антибиотиков, эффективных в защите хлопчатника от вилта. Особый интерес представляют актиномицеты, относящееся к бело/., серой и глобиспориновой группам.

2. Среди полиеновых наибольшей противогрибковой активностью к V.dahliae характеризуются тетраеновке антибиотики, один из которых, антибиотик 18-80 влияет на рост, развитие, ядерный аппарат, физиологию гриба, способен яизиро-вась микросклероции V.dahliae — чте основной источник ин-фекции^о^крыЕает возможность разрушать его непосредственно б почве.

3. Гриб V.dahliae образует токсические вещества, выделяемые им во внешнюю среду. Подобранный микробный тест, чувствительный к токсину, позволил впервые использовать метод биоавтографии для его выделения и исследования.

В защитных реакциях хлопчатника к вилту наряду с госсиполоп-.добными фитоалексинами принимают участие соединения липидной природы, подавляющие рост гриба V.dahliae.

5. Наибольшей фунгитоксической активностью обладают оксиглицерины, а также сумма эпокск- и кетоацилглицеринов.

Оксигекированнне жирные кислота, выделенные из соответствую-цих триацилглг.иеринов, также подавляют рост гркба, при этом болез активны оксккислоти, в частности, рицинолевая кислота.

6. Выязлсна прямая корреляция между содержанием активных лнпидов и степенью устойчивости хлопчатника к вилту.

7. Обнаружен блокирующий э^ект рицинолевой кислоты, некоторых противогрибковых антибиотиков на пентакетидный путь биосинтеза меланина у гриба V.dahliae.

8. Построена математическая модель взаимоотношения патогена и растения-хозяина, гриба V.dahliae и хлопчатника, позволяющая рассчитать концентрацию фунгитоксических веществ и токсинов в растении к грибе и определить исход взаимоотношения партнеров.

9. Целлюлолитические и пектолитические ферменты V.dahliae являются адаптивными.Содержание указанных ферментов,

а также суммарного белка, отдельных белковых компонентов и. низкомолекулярных-соединений гриба зависит от сорта хлопчатника, выявлены специализированные к определенным сортам хлопчатника расы V.dahliae.

10. Полиеновые антибиотики нистатин, имбрицин, 18-45, 18-80 активно индуцируют устойчивость хлопчатника к вилту и одновременно,легко проникая в ткани хлопчатника; способны образовывать зоны собственной противогрибковой активности на путях проникновения и распространения гриба V.dahliae.

11. Рекомендуются к широкому внедрению в хлопководстве для предпосевной замочки семян биологическая композиция "Би-оп.олак" с включением антибиотике ИМ-1,микроводораслей и полимерно"] пленки, повышающая всхожить семян на 18-20^,урожайность на 10-15$ с одновременным понижением псражаемости хлопчатника корневой гнилью на 18-25#, еилтсм на'25-30/., а также препарат,содержащш! комплекс живых культур актиноми-цетов-антагоннстов и. микрозодорослей.

С II И С О К основных работ, опубликованных по теме диссертации:.

I. Ходжибаева С.М., Тохтамуродов Е., Актиномицеты-актагонисты к возбудителю вилта хлопчатника. Ж.Микробиоло-

гия, 1964, т.ЗЗ, внп.З., с.477-482.

2. Ходжибаева С.М. Действие антибиотических веществ против вилта хлопчатника. 3t.Микробиология, 1964, т.33, вып.4,

с.651-663.

3. Тохтамурадов Е., Силаев А.Б., Ходжибаева С.М. Выделе-кие противоопухолевого вещества из культуральной жидкости Act.tumeinacerans, шт.?-42Б. ¥.. Антибиотики, 1964, № 3, с. 205-208.

4. Красильников H.A., Ходжибаева С.М., Мирчинк Т.Г. Образование токсинов грибом v.dahliae - возбудителем вилта хлопчатника. Ж.Агрохимия, № 10, с.128-134.

5. Ходжибаева С.М. Актинокицеты-антагонисты и их роль' при заболевании хлопчатника вертициллёзнкм вилтом. Автореферат, 196Э, Москва, с.1-20.

6. Красильников H.A., Ходжибаева С.М., Мирчинк Т.Г. Изучение токсинов гриба V.dahliae ' - возбудителя вилта хлопчатника. Ж.Сельскохозяйственная биология,- 1966, т.1, № I, с. I07-II3.

7. Ходжибаева С.М. Оздоровление почв при помощи бактеризованных компосгов. Сб. "Вопросы микробиологии", 1965,вып. 2, Ташкент, изд."ФАН", с.ТЗб-141.

8. Ходжибаева С.М. Иолиеновые антибиотики в борьбе с вилтом хлопчатника. Сб. "Вопросы микробиологии", 1966, еып. 2, Ташкент, изд."ФАН", с.112-116.

9. Ходжибаева С.М. Действие полиеновых антибиотиков на возбудителя вилта к хлопчатник. Сб. "Вилт хлопчатника", 1967, т.1, Ташкент, изд."ФАН", с.131-139.

10. Krassilnikov Д.A..Khodjibayeva S.u. and ."irchink T.G. Properties of toxins of Vert.iciilium dahliae the causative agent of cotton with disease.J.Gen.Appl.Mic.195°,1-9.

11. Ходжибаева С.M., Аскарова С.А. Проникновение некоторых антибиотиков в различные органы хлопчатника. Узб.бнол. ж., 1970, 3, с. 56.

12. Ходжибаева С.М., Красильников H.A., Мирчинк Т.Г., Аскарова С.А. Образование токсических веществ различными по вирулентности штаммами V.dahliae 1.Сельскохозяйственная биология, 1971, т.6, № 2, с.260-264.

13. Ходжибаева С. М., Аскарова-С.А., Азимходжаева М.Н.

Влияние полиеновых антибиотиков на образование токсических веществ грибом V.dahliae Узб.биол.ж., 1971, № 5, с.60-61.

14. Ходжибаева С.М, Ингибирующее действие полиеновсго антибиотика 18-60 на рост и развитие возбудителя вилта хлопчатника. Сб."Вопросы физиологии микроорганизмов", 1972, с. 52-54.

15» Ходжибаева С.М., Аскарова С.А., Халиков Ж. Влияние некоторых полиеновых антибиотиков на содержание и нуклеотид-ный состав РНК и ДНК V.dahliae II.Микробиология, 1972, Ю, с.490-493. ' '

16. Ходжибаева С.М., Бородин Г.И.,. Нурпулатов X. Влияние полиеновых антибиотиков на образование вертициллинов в мицелии v.dahliae I.доклады АН УзССР, 1972, № 4,

17. Аскарова С.А., Ходжибаева С.М., Поляничко О.Ф. Действие полиеновых антибиотиков на возбудителя вилта и хлопчатник. Монография, Ташкент, изд.-"ФАН", 1972, 6,3 п.л.

18. Ходжибаева С.М., Бородин Г.И., Аскарова С.А. Действие полиеновых антибиотиков на рост гриба V.dahliae и содержание в нем токсических веществ. Ж.Сельскохозяйственная биология, 1973, т.8, К 3, с.431-434. ■

19. Ходжибаева С.М., Касыиова P.A., Бородин Г.И.,Рунов Б.И. Особенности действия актиномицина А и стрептомицина на синтез циклопептидов-вертициллинов В мицелии V.dahliae.

К.Микробиологическая промышленность, 1973, К 10, с.32-33.

20. Ходжибаева С.М., Бородин Г.К.,'Касимова Г.А., Нурпулатов X. Действие нистатина и антибиотика Р-42 на содержание вертициллинов в мицелии V.dahliae Сб."Биологически активные вещества микроорганизмов, и их использование",Таи- . кент, изд."fАН", 1974, с.27-30.

21. Ходжибаева С.М., Азимходжаева М.Н. Ингибирующее действие антибиотика 18-80 на усвоение углеводов грибом V.dahliae Сб."Биологически активные вещества микроорганизмов и их использование", Ташкент, изд."ФАН",1974,с.17-20.

22. Аскарова С.А., Ходжибаева С.М., Умаров Я.С.,Касымо-ва С. Поиски антагонистов против фитопатогенных грибов среди термойильных актиномицетов. Узб.биол.ж., 1974, № I, с. З-П.

"¿3. Ходжибаева С.М., Карпачёва О.Ф. О механизме про-

ницаемости фосфолипидных мембран в присутствии микопентина и микогептина. Сб.: "Структура и метаболизм микроорганизмов", Ташкент, изд."С-АН", 1975, с.53-55.

24. Ходжз'баеЕа С.М..Бородин Г.К. ,Нурпулатов X. Влияние нистатина и антибиотика 18-45 на сорбцию Zu у Verticilli-иш с& hliae . Сб. "Структурам метаболизм микроорганизмов", Ташкент, изд."ФАН", 1975, с.57-60.

25. Ходжибаева С. , Бородин Г.И. Мембранонарушающий эффект токсических веществ, обусловливающих патогекность V.dahliae, Тезисы докладов XII Международного Ботанического конгресса, "Наука.", Ленинград, 1975, с.502.

26. Ходжибаева СЛ. Влияние полиенсвых антибиотиков 18-80 и 18-45 на проникновение V.dahliae в корни хлопчатника. Сб. "Микроорганизмы-антагонисты возбудителей грибных заболеваний хлопчатника", Ташкент, изд."'IAH", 1975.

27. Ходкмбаева С.М..Бородин Г.И. и др. .Токсические вещества различных биотипов,' рас и видов v.dahliae , доклады Всесоюзного научно-методического совещания "Фитотоксические свойства почвенных микроорганизмов", Ленинград, 1978.

28. Ходжибаева-С.М..Бородин Г.И. и др. Действие токсических веществ V.dahliae на клетки листьев хлопчатника. Узб.биол.ж. ,1978, )Ь 4, с.15-18.

29. Ходжибаева С.М.,Бородин Г.И. Индуцирование иммунитета у хлопчатника. К.Хлопководство, ■ 1980, № 12, "Колос"., Москва.

30. Ходи! баева С. М. ,'Худайбердыева Р., Бородин Г.И. Особенности роста и целлюлолитическсй активности физиологически-рас v.dahliae при культивировании на древесине хлопчатника. Сб. "Биология и селекция микроорганизмов", изд."ФАН".Ташкент, 1980.

31. Ходжибаева С. ¡<1. ,Рунов Б.К. и др. Биохимические особенности, определяющие вирулентность V.dahliae, Материалы Всесоюзного координационного совещания по вилту хлопчатника, Ташкент, изд."ФАН", 1981.

32. Borodin G.J. .IChodjiüayeva S.r.i. ,Bunov V.J. Biochexi-celes .«'eohsel ,','erkung Pathogen loxin I-ylanie - Phytoallexin ty Verticilliua-.Velke der Bauninolle Eeinhardsbrunner Synp. 4- his 10 mal I9ÖO, Systemiche l'ungizide and Antifungele

Vj-гЪ injsnj. Abstracts DE*.

32. Филатова О.Ф.,Ход»5баева C.M.,Степаниченко Н. Окси-геккровакние жирные кислоты и их роль в иммунитете растений хлопчатника к вертициллэзному вилту. Узб.биол.ж., 1985,№ 3, с.17-20.

34. Филатова О.Ф..Ходжибаева С.М. и др. Действие фун-гитоксических веществ хлопчатника на метаболизм липидов и пелипептидов Verticilliun dahliao Узб.биол.ж.,1935, К 4,

с •

35. Ходжибаева С.М. .Филатова 0.§. Антифунгальные вещества хлопчатника и их индуцирование метаболитами гриба

V.öahliae Доклад на 1У конф.биохим.республик Ср.Азии и Казахстана. Ашхабад, 1986.

36. Филатова О.Ф>.,Ходжибаева С.М. и др. Исследование взаимоотношения растения-хозяина и гриба-патогена с помощью математической модели. Узб.биол.ж., 1987, К 5, с.33-37.

37. Филатова О.Ф.,Ходжибаева С.М. и др. Индукция защитных веществ хлопчатника флазиолином в условиях мелкоделяноч-ного опыта. Сб. "Бактерии, водоросли, грибы (экология, физиология, биохимия)", IS87, "§АН", Ташкент.

38. Ходжибаева С.М. Полиеновые антибиотики в борьбе с вилтом растений. Доклад на Всесоюз.конференции "Микроорга- . кизмы - стимуляторы роста растений и ¡ливотных",Ташкент,1989.

39. Филатова 0.$.,Ходжибаева C.jM. Индуцирование защитных веществ хлопчатника метаболитами возбудителя вертицил-лёзного вилта. Сб. "Биология и биотехнология микроорганизмов", 1989; "ФАН", Ташкент.

40. Ходжибаева С.М.,Мамедова С.Р..Башкозич А.П.,Ширай Л.П. . Способ предпосевной .обработки семян хлопчатника. A.c. Я 1506609, 8 мая 1989 г. ■

41. Халмурадсв А.Г.,Шток Д.А..Ходжибаева С.М. и др. Способ предпосевной обработки семян хлопчатника. A.c. A.c. № 1522447, 15 июля 1939 г.

42. Ибрагимов А.А..Ходжибаева С.И. и др. Знехромосом-нке. элементы гриба V.öahliae Тезисы докл. Международного симпозиума бактерии и грибы, 1990, Япония, Осака.

43. ДкуманиязоБ И.,Хабибуллаев X.,Ходжибаева С.М.,Кут-лиев Д.,Казиев С.,Махмудов К. Комплексное применение хлореллы в сельсксн хозяйство. Научная бришыра.З п.л.ДУУО г.