Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Неэлектрогенный транспорт ионов водорода через бислойную липидную мембрану, индуцированный карбоновыми кислотами с различным химическим строением

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Неэлектрогенный транспорт ионов водорода через бислойную липидную мембрану, индуцированный карбоновыми кислотами с различным химическим строением"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.ВЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

НЕЭЛЕКТРОГЕННЫЙ ТРАНСПОРТ ИОНОВ ВОДОРОДА ЧЕРЕЗ БИСЛОЙНУЮ ЛИПИДНУЮ МЕМБРАНУ, ИНДУЦИРОВАННЫЙ КАРБОНОВЫМИ КИСЛОТАМИ С РАЗЛИЧНЫМ ХИМИЧЕСКИМ СТРОЕНИЕМ.

(03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Научные руководители:: Доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Ю.НАнтоненко. Доктор биологических наук, главный научный сотрудник Л.С.Ягужинский.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

профессор Г.Н.Берестовский. Кандидат биологических наук, доцент А. А.Булычев.

Ведущая организация:

Институт электрохимии им.Фрумкина РАН.

Защита состоится "_"_1997 года в_часов

на заседании диссертационного совета К.058.05.68 по адресу: Москва, 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан"_"_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Общая характеристика работы.

Актуальность темы: Карбоновые кислоты являются одним из важнейших метаболитов в клетке. Монокарбоновые кислоты с длинной углеводородной цепью (жирные кислоты) служат важным энергетическим субстратом клеток, а также выполняют регуляторную функцию в организме (Hannigan et at., 1991). В качестве регуляторных компонентов жирные кислоты включены ва многие процессы, протекающие в клетке. Так, например, жирные кислоты принимают участие в трансмембранной передаче сигналов в клетке, а также способны вызывать разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях. В этой связи изучение процесса транспорта карбоновых кислот через биологические мембраны имеет большое значение для понимания механизма работы и регуляции внутриклеточных систем. Жирные кислоты могут проникать через мембраны в нейтральной и в анионной форме. Вопрос о проницаемости нейтральной формы жирных кислот через липидную часть мембран остается спорным: в некоторых системах наблюдается быстрая диффузия (10-20 мсек) жирных кислот через мембрану (Kamp et al., 1995), тогда как в других регистрируемое время флип-флопа составляло секунды (Klainfeld & Storch, 1993). Существуют также противоречивые литературные данные, касающиеся транспорта анионной формы жирных кислот через липидные мембраны. В ряде работ был показан электрогенный перенос анионной формы жирных кислот через липидные мембраны (Gutknecht, 1988), тогда как в других работах .возможность такого транспорта отрицается (Антонов, 1973). Кроме того ряд авторов предполагает участие белковых переносчиков в транспорте анионной формы жирных кислот через мембрану (Andreyev et al., 1988). В работах Гуткнехта и соавторов (Walter & Gutknecht, 1984) было показано, что при описании транспорта слабых монокарбоновых кислот через БЛМ необходимо учитывать наличие неперемешиваемых слоев (НС) , а также химические реакции протонирования-

депротонирования, протекающие в НС. В работах Антоненко и соавторов (АШопепко & Yaguzhinsky, 1984) наблюдалось возникновение градиента рН на плоской бислойной липидной мембране при транспорте ацетата через мембрану. Возникновение градиентов рН связано с трансмембранным переносом ионов водорода, сопряженным с транспортом нейтральной формы монокарбоновой кислоты через липидный бислой. Изучение этого процесса представляется достаточно важным, т.к. снижение рН внутри клетки, индуцированное входом слабой кислоты, может играть существенную роль в регуляции внутриклеточных процессов (Оуе1ек е( а1., 1996). Механизм возникновения локальных градиентом рН, индуцированных градиентом карбоновых кислот, может меняться в зависимости от химического строения кислот, в частности от строения (размеров) гидрофобного фрагмента, а также от размеров полярного фрагмента. Вопрос о влиянии структуры карбоновых кислот на механизмы транспорта ионов водорода требует более детального изучения.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение механизмов транспорта ионов водорода через бислойные липидные мембраны, индуцированного потоком моно- и дикарбоновыми кислотами с разной длиной углеводородной цепи. В этой связи ставились следующие конкретные задачи: 1) изучить влияние длины углеводородной цепи на механизмы транспорта моно- и дикарбоновых кислот; 2) построить модели процесса индукции локальных градиентов рН в НС при транспорте моно- и дикарбоновых кислот; 3) дать оценку величины проницаемости мембраны для нейтральной формы кислот с длинной углеводородной цепью; 4) установить связь параметров структуры кислот с механизмом их проникновения через мембрану.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований удалось показать, что размер углеводородной цепи и число карбоксильных групп в полярном

фрагменте могут качественно изменять механизм образования локальных градиентов рН в НС при транспорте карбоновых кислот через липидные мембраны. Показано, что монокарбоновые и дикарбоновые кислоты могут транспортироваться через мембрану только в нейтральной форме. Разработана теоретическая модель для описания транспорта ионов водорода через мембраны, индуцированного трансмембранным переносом моно- и дикарбоновых кислот. Показано, что в случае монокарбоновых кислот с короткой углеводородной цепью транспорт ионов водорода можно описать с помощью разработанной теоретической модели, согласно которой поток протонов, индуцированный градиентом этих кислот при кислых рН лимитирован переносом анионной формы через НС, при щелочных рН переносом нейтральной формы через мембрану. Для дикарбоновых кислот (моноалкилмалонатов) с длинной углеводородной цепью получены качественно сходные результаты, которые также согласуются с моделью транспорта ионов водорода, сопряженного с трансмембранным переносом дикарбоновых кислот. Вычислены величины проницаемости мембраны для нейтральной формы этих кислот. Найдены качественные отличия в транспорта ионов водорода, индуцированного монокарбоновыми кислотами с длинной углеводородной цепью и короткоцепо-чечными монокарбоновыми кислотами. Показано, что во всем изученном диапазоне рН лимитирующей стадией этого процесса является перенос анионной формы этих кислот через НС. Сделан вывод о том, что проницаемость мембраны для нейтральной формы жирных кислот существенно выше проницаемости НС для этих кислот.

Практическая значимость работы. Построенные модели для описания потока ионов водорода через липидные мембраны при транспорте монокарбоновых и дикарбоновых кислот могут использоваться при изучении трансмембранного переноса карбоновых кислот через модельные и биологические мембраны. Получен-

ные результаты имеют важное значение для понимания механизмов регуляции внутриклеточных процессов жирными кислотами, а также для более детального исследования процессов превращения энергии в мембранных системах. Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на всероссийском совещании "Мембранный транспорт и функции клетки" (Санкт-Петербург, 1994) и на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ (Москва, 1996). Публикации. По материалам исследования опубликованы 3 печатные работы. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы в двух главах, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и обсуждения в трех главах, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков, библиографический список содержит 120 наименований.

Экспериментальная часть. В большинстве экспериментов бислойную плоскую липидную мембрану формировали из раствора, содержащего 20 мг фосфолипида и 10 мг холестерина ("Boehringer", Германия) в 1 мл декана. Использовали фосфатидилхолин, выделенный из соевых бобов (азолектин) ("Sigma", США) и дифитаноилфосфатидил-холин ("Avanti Polar Lipids", США). В работе использовались водные растворы солей монокарбоновых кислот: ацетата лития ("Sigma", США), бутановой (С4), капроновой (С6), каприловой (С8), каприновой (СЮ), ундекановой (СП) и лаури-новой (С 12) кислот ("Sigma", США). Свободные моноалкилмалонаты были любезно предоставлены сотрудниками института биохимии им. А.Н. Баха РАН Шольцем Х.Ф. и Бондаренко Д.И. Эти кислоты получали гидролизом их сложных

эфиров 35%-ным водным раствором №ОН. Содержание основного вещества, определенного методом газовой хроматографии, было около 98%. Потенциалы разомкнутой цепи и проводимость мембраны регистрировались обычными методами (Лев, 1974). Измерения разности граничных потенциалов БЛМ проводились компенсационным методом по второй гармонике емкостного тока (Соколов и Кузьмин, 1980). Для измерений ДрН в НС использовали два метода. Первый метод основан на измерение градиентов рН на мембране по величине трансмембранных потенциалов, возникающих на БЛМ в присутствии протоно-фора ТТФБ (АШопепко & Yaguzhinsky, 1984). Профили распределения рН в НС регистрировали прямым методом с помощью торцового сурьмяного рН микроэлектрода (АпЮпепко & Ви1усЬеу, 1994). Управление микроэлектродом осуществлялось с помощью гидравлического микроманипулятора. В большинстве опытов скорость подведения к мембране была равна 5 мкм/с. Для фиксации

1кОм

момента касания электрода мембраны использовали визуальное наблюдение и новый электрический метод, позволяющий определить момент касания мембраны по снижению амплитуды переменного сигнала между микроэлектродом и электродом сравнения. Блок схема установки для измерения профилей рН возле мембраны приведена на рис.1.

Результаты и обсуждение. Глава 1. Теоретическое описание модели транспорта ионов водорода через плоскую бислойную липидную мембрану, индуцированного градиентом моно- и дикарбоно-вых кислот.

В данной работе изучался транспорт ионов водорода через бислойные мембраны, сопряженный с трансмембранным переносом моно- и дикарбоновых кислот. На рис. 2 показана схема транспорта слабой кислоты, которая учитывает диффузию аниона и нейтральной формы кислоты через НС и реакции диссоциации кислоты в растворе. При этом через мембрану может проходить только нейтральная форма кислоты. В представленной работе была построена теоретическая модель,

Рис. 2. Модель транспорта моно-карбоновой кислоты через непе-ремешиваемые слои (НС) и мембрану (М).

НС, м нс2

тн-

IHC,

-X,

н

гНС,.

\

-тн,

гНС,

н /

тн-

г НС,.

которая основывается на двух основных предположениях: во-первых, считается, что в системе устанавливается стационарное состояние; во-вторых, предполагается, что в условиях, когда скорости в реакции ассоциации-диссоциации кислоты в объеме достаточно велики, в растворе успевает установиться квазистационарное равновесие между ТН- и Т" -формами кислоты.

Поскольку перенос ТН-формы кислоты через НС не сопровождается поглощением или выделением протона, поток Н+-ионов Ун) будет определяться потоком Т" -формы через НС (1т). Учитывая введенные выше предположения можно получить выражение для потока Н+-ионов через мембрану, индуцированного градиентом слабой кислоты:

1И. = У"'" = С^Р^а / (1 + а)(Р;,с(1 + а) + Р») (1),

где У"С(|) = 2РДС([Г"]0-[Г"]1М), Со - общая концентрация добавленной кислоты в растворе; а=1()Р^"Р^=К/[Н+]. Данное уравнение получено при условии, что Р^ « и концентрация ионов водорода в НС меняется мало по сравнению с концентрацией Н+-ионов в объеме.

Уравнение 1 определяет зависимость 1н от рН раствора, которая имеет вид колокола и достигает максимального значения У™ при рН=рНщах:

(2),

= (3)-

Аналогичные рассуждения можно провести для транспорта протона через мембрану, индуцированного дикарбоновыми кислотами, моноалкилмапонатами. В случае транспорта дикарбоновых кислот необходимо учитывать два значения рК этих кислот. При этом уравнение для потока Н+-ионов через мембрану, индуци-

рованного созданием градиента дикарбоновой кислоты будет иметь следующий вид:

, =_ТМ

«* (а,аг +а2 + 1)(а,а2 + а, +1 + Р£/Р£) (

где То - полная концентрация добавленной кислоты; а, = 10рН"рЛ' = К, /[ЛГ] аг = 10?"~'к' = К2 /[/Г]. Данное уравнение получено при условии, что Р^аР^к Р^ • Это уравнение, как и уравнение 1, описывает колоколообразную рН-зависимость потока протонов, индуцированного градиентом моноалкилмапоната. Соответствующее значения потока (/^Г ) и рНщах равны:

1Т рМ

г|Я__*уо Гтн

~ /I ■ ¡г>м/т,нсл2

+ (6).

Приведенные уравнения для потока протонов через мембрану были использованы для сравнения с экспериментальными данными, а также для расчета проницаемо-стей нейтральной и анионной форм карбоновых кислот через мембрану и НС.

Глава 2. Транспорт ионов водорода, сопряженный с трансмембранным переносом монокарбоновых кислот.

В первой части работы исследовались две группы монокарбоновых кислот: моно-карбоновые кислоты с короткой углеводородной цепью: (уксусная (С2), масляная (С4) и капроновая (С6) кислоты) и монокарбоновые (жирные) кислоты с длинной углеводородной цепью: (каприловая (С8), каприновая (СЮ), н-ундекановая (СП) и лауриновая (С 12) кислоты).

Исследование проницаемости мембран для анионной формы монокарбоновых кислот. В связи с противоречивостью литературных данных, касающихся проницаемости анионной формы жирных кислот через мембрану, была проведена серия экспериментов по влиянию жирных кислот на проводимость мембраны. В опытах исследовали каприловую (С8), каприновую (СЮ) и пальмитиновую (С16) кислоты. В результате проведенных экспериментов было показано, что во всех исследованных условиях добавление жирных кислот не увеличивает проводимость мембраны. Из этого был сделан вывод, что анионная форма жирных кислот не проникает через липидные мембраны, поэтому во всех последующих экспериментах было принято, что монокарбоновые кислоты могут транспортироваться через мембрану только в нейтральной форме,

Исследование зависимости пеэлектрогенных потоков ионов водорода, индуцированных мопокарбоновыми кислотами, от рНраствора. В работе была изучена рН- зависимость потоков ионов водорода, индуцированных градиентом монокарбоновых кислот. Потоки ионов водорода рассчитывали по величине градиентов рН, возникающих в НС. При расчетах использовали представление о том, что поток протона через мембрану, индуцированный градиентом слабой кислоты, должен быть равен потоку молекул буфера через неперемешиваемый слои, поскольку концентрация Н+ - ионов в растворе во всем изученном диапазоне рН мала по срав-

-3 +

нению с концентрацией буфера (10 М) и диффузия Н - ионов через НС идет в

основном за счет диффузии молекул буфера через НС. Тогда, согласно работе (Antonenko et al., 1993), можно записать следующее уравнение: JH=JbuP Dbuf В ДрН/5 (7)

На рис. 3 представлена зависимость величины потоков ионов водорода, индуцированных градиентом уксусной (рис. 3, А. кривая I), масляной ( кривая 2), капроновой (кривая 3), каприловой (рис. 3, Б, кривая 1) и каприновой (кривая 2)

Лн* 10® (моль/ч^ сек)

Лн*Ю8 (моль/м2 сек)

1 - СН3С00Н

2 - сн3(сн2)2соон

3 - сн3(сн1)+соон

4 - СН3(СНг)вСООН

5 - СН3(СН2)вСООН

Рис. 3. Зависимость потока ионов водорода (1ц) через мембрану, возникающего при создании градиента концентрации кислоты, от рН раствора. А - I - уксусная (С2), 2 - масляная (С4). 3 - капроновая (С6) кислоты. Б - 4 - каприловая (С8), 5 -каприновая (СЮ) кислоты. Состав среды: 1 мМ цитрат, 1 мМ трис, 1 мМ Р-аланин, 0.5 мМ КС1, 20 мМ холинхлорида. Концентрация кислоты с "цис"-стороны мембраны ЮОмкМ. Концентрация ТТФБ в ячейке 10 мкм._

кислот. В этих экспериментах мембрана состояла из азолектина и холестерина. Видно, что все зависимости имеют вид колокола. Согласно рис. 3, изученный ряд

9 (5

кислот может быть разделен на две подгруппы. В первой подгруппе (С - С , рис. 3, А) при переходе от более коротких кислот к более длинным происходит смещение кривой рН- зависимости в более щелочную сторону и возрастание максимальной величины потенциала. Такой характер рН-зависимости хорошо описывается уравнением 1. При рН«рК возрастание потока 1н при повышении рН раствора определяется увеличением концентрации анионной формы кислоты в условиях, когда лимитирующей стадией процесса является диффузия Т " через НС. При рН >

>рК уменьшение потока при возрастании рН в щелочной области соответствует убыванию концентрации протоннрованной формы кислоты, когда лимитирующая стадия - диффузия ТН-формы через мембрану. Таким образом, появление максимума на кривой зависимости потока ,1н от рН объясняется сменой лимитирующей стадии процесса.

Сравнение экспериментальных данных по зависимости потоков ионов водорода от рН с теоретическими расчетами. Анализ уравнения (I) показывает, что повышение проницаемости нейтральной формы кислоты Р^ через мембрану при увеличении длины углеводородной цепи, приводит к сдвигу максимума в щелочную сторону и увеличению максимального потока через мембрану (рис. 4, А). Изменение Р^ не изменяет величин потоков в "кислой" области рН (рН«рК), где

1н*Ю7 моль/м2 сек А 1н*107 моль/м2 сек Б

Рис. 4, А - влияние величины проницаемости кислот (Рм) на вид рН зависимости потоков ,1н. рассчитанных по уравнению 3. Концентрация слабой кислоты с одной стороны мембраны - 100 мкМ; Р"с=1*10' см/с, рК=5. 1 - Рм=1*10-2 см/с; 2 -рм= |*ю-| см/с; 3 - Рм=1 см/с. Б - влияние рК кислот на вид рН-зависимости потоков. Концентрация слабой кислоты с одной стороны мембраны принята равной 100 мкМ. Р»с= 1М0-з см/с, Рм= 1 *IО-2 см/с. 1 - рК=5; 2 - рК=6.0; 3 - рК=7.

лимитирующей стадией процесса является диффузия депротонированной формы через НС (рис. 4,А). С другой стороны, изменение рК без изменения проницаемости приводит к сдвигу всей кривой зависимости потока от рН, в том числе и ее "кислой" ветви (рис. 4,Б).Сравнивая экспериментальные кривые, отражающие зависимость ДрН на мембране (которые пропорциональны 1н) от значения рН растворов, можно видеть (рис. 3,А), что у первой группы кислот с более короткой углеводородной цепью с ростом длины цепи происходит увеличение максимальной величины градиента рН и сдвиг максимума в щелочную область. Следовательно в случае монокарбоновых кислот с короткой углеводородной цепью с ростом длины цепи наблюдается рост проницаемости этих кислот через бислой. Нелинейная регрессия данных, приведенных на рис 3,А, по уравнению (1) приво-

ттр 'У ^

дит к следующим значениям параметров Р и Р : 2.5*10" см/сек и 0.17*10"

3 -3 -3

см/сек для ацетата, 55*10 см/сек и 0.16*10 см/сек для бутирата, 455*10 см/

сек и 0.17*10 см/сек для капроновой кислоты. Значения проницаемости для ацетата через неперемешиваемый слой и через мембрану, полученные в результате

приведенных расчетов хорошо согласуются с литературными данными. Как пока-

НС

зали расчеты, проницаемость кислот через НС (Р ) не меняется с ростом длины углеводородной цепи, тогда как проницаемость через мембрану (Р^) увеличивается. Таким образом было показано, что зависимость потоков ионов водорода от рН в присутствии короткоцепочечных карбоновых кислот удовлетворительно описывается теоретической моделью транспорта монокарбоновых кислот: при кислых значениях рН (рН<рК) процесс лимитирован переносом аниона кислоты через НС, при щелочных рН (рН>рК) - переносом нейтральной формы через ли-пидный бислой.

Сравнение механизмов транспорта монокарбоновых кислот с короткой и длинной углеводородной цепью. При изучении транспорта второй группы кислот с более

длинной углеводородной цепью от каприловой (С8) до лаурнковой (С 12) кислоты (жирные кислоты), были обнаружены качественные отличия в транспорте протонов, индуцированные этими кислотами и монокарбоновыми кислотами с короткой углеводородной цепью. В этом случае, в отличии от короткоцепочечных кислот, увеличение длины цепи не приводит к заметным изменениям рН-зависимости. Сравнение данных рис. 3,Б с теоретическими кривыми рис. 4 показывает, что в этом случае не наблюдается увеличения проницаемости нейтральной формы кислоты (Р^) через бислой с ростом длины углеводородной цепи. В результате проведенных экспериментов было сделано предположение, что в случае жирных кислот поток протонов, индуцированный этими кислотами, определяется качествен но иным механизмом транспорта по сравнению с монокарбоновыми кислотами с короткой углеводородной цепью. Для проверки этого предположения были проведены два теста, позволяющие определить лимитирующую стадию процесса. На рис. 5,А показаны профили рН, возникающие при создании градиента уксусной кислоты на мембранах, сформированных из азолектина в присутствии (кривая 1) и в отсутствии (кривая 2 ) холестерина. В данном опыте при рН раствора 6.5, транспорт ацетата лимитирован переносом нейтральной формы кислоты через мембрану. Присутствие холестерина в составе бислоя снижает проницаемость ТН-формы ацетата через мембрану и тем самым уменьшает поток Н -ионов. На рис. 5,А можно видеть снижение ДрН в НС в присутствии холестерина. На рис. 5,Б показано влияние холестерина на трансмембранный потенциал в присутствии протонофора, возникающий на мембране при создании градиента уксусной (а, б) и капрнн овон (в, г) кисло г, в зависимости от рН раствора. Видно, что в случае ацетата присутствие холестерина вызывает снижение величины потенциала при рН>5, где лимитирующей стадией процесса является перенос нейтральной

9> (мВ)

о II

6 7 8 9 рН

Рис.5. А - зависимость профилей рН в НС, индуцированных переносом уксусной кислоты через мембрану, от состава мембраны: мебраноформирующий раствор содержал: 1 - азолектин, 2 - азолектин в смеси с холестерином (2:1). Концентрация ацетата с одной стороны мембраны 200 мкМ. Б - влияние холестерина на трансмембранный потенциал, возникающий на БЛМ при создании градиента уксусной (1, 2) и каприновой (3, 4) кислот в присутствии ТТФБ. Раствор для формирования мембраны: 20 мг азолектина (2, 4) или 20 мг азолектина и 10 мг холестерина (1. 3) в I мл декана. Состав среды: см. рис. 3._

формы уксусной кислоты через бислой. В случае, когда потенциал индуцировался градиентом каприновой кислоты (СЮ), холестерин не оказывал заметного влияния на величину этого потенциала. Такая ситуация может реализоваться в том случае, если холестерин не влияет на проницаемость кислот с длинной цепью через гидрофобный барьер мембраны, либо, если перенос вещества через НС является лимитирующей стадией процесса при всех значениях pH.

Ранее в работе Pohl, Р. и соавт. (1993) был введен тест, который позволяет определить, какая из стадий лимитирует общий процесс транспорта кислоты через БЛМ - сама мембрана или неперемешиваемый слой. Тест основан на влиянии скорости перемешивания растворов, омывающих мембрану, на толщину НС. В случае, если транспорт карбоновой кислоты лимитирован переносом нейтральной формы кислоты через мембрану, перемешивание не влияет на поток кислоты и при этом ускоряет поступление буфера в прнмембранный слой, поэтому локальный гради-

ент рН снижается. Когда поток Н -ионов лимитирован переносом анионной формы кислоты через НС, перемешивание в одинаковой степени ускоряет перенос буфера и аниона кислоты, в этом случае локальный градиент рН не меняется. На рис. 6 приведены эксперименты по влиянию скорости перемешивания на величину потенциалов на БЛМ, индуцированных добавлением с одной стороны мембраны ацетата (кривые а, б) и каприновой кислоты (кривые в, г) при кислых (кривая а, в) и щелочных (кривая б, г) значениях рН. Видно, что при кислых значениях рН в случае ацетата потенциал не зависит от скорости перемешивания. Это говорит о том, что лимитирующей стадией процесса транспорта является непере-мешиваемый слой. При щелочных значениях рН повышение скорости перемешивания приводит к значительному снижению потенциала, что в соответствии

рН—4.5 рН-8.0 Г~

2 мВ

10 мин

т т

выкл выкл

т т

выкл вкл

рН—6.5

выкл 1

т

вкл

рН—8.0

выкл выкл

I I

т

вкл

УКСУСНАЯ КИСЛОТА

УКСУСНАЯ КИСЛОТА

КАПРИНОВАЯ КИСЛОТА

КАПРИНОВАЯ КИСЛОТА

Рис. 6. Влияние скорости перемешивания растворов на величину трансмембранного потенциала, возникающего при создании градиента кислоты в присутствии ТТФБ: а - 200 мкМ уксусной кислоты (С2), рН=4.5; 6-5 мМ уксусной кислоты, рН=8.0; в - ЮОмкМ каприновой кислоты (СЮ), рН=6.5; г - 100 мкМ каприновой кислоты, рН=8.0 Состав Среды: см. рис 3.

с указанным выше свидетельствует о том, что лимитирующей стадией транспорта является диффузия кислоты через мембрану. Аналогичные эксперименты с каприновой кислотой (СЮ) дали качественно иную картину - они показали, что как и при кислых, так и при щелочных значениях рН перемешивание не влияет на потенциал в присутствии протонофора (рис. 6, кривые в, г). В совокупности с результатами предыдущего эксперимента можно сделать вывод, что во всем изученном диапазоне рН транспорт протона, индуцированный жирными кислотами, лимитирован переносом вещества через НС во всем изученном диапазоне рН. Проведенный анализ показал ряд несоответствий между теоретическими представлениями и экспериментальными данными в транспорте ионов водорода, индуцированного длинноцепочечными кислотами. С одной стороны, рН-зависимосгь потока протона, индуцированного градиентом длинноцепочечных монокарбоновых кислот, имеет вид колокола, как и в случае короткоцепочечных кислот. При этом максимальное значение потока (У™*) и рНщах не меняются с ростом длины углеводородной цепи. Такой характер рН-зависимости свидетельствует о том, что проницаемость нейтральной формы кислоты через мембрану не должна увеличиваться при увеличении длины цепи. Согласно описанной выше теории, снижение потока Н+-ионов при рН>рНщах можно объяснить тем, что с увеличением рН раствора снижается концентрация ТН-формы, перенос которой через мембрану лимитирует. Однако, опыты по влиянию холестерина и перемеши-

Т1+

вания на потоки Н -ионов, индуцированных градиентом каприновои кислоты, показали, что при рН>рНщах поток лимитирован неперемешиваемым слоем, в то время как вышеописанная модель при этих рН предсказывает лимитирование потока переносом ТН-формы кислоты через мембрану. Следовательно, снижение 1ц нельзя объяснить уменьшением концентрации ТН-формы. Это означает, что ско-

рость переноса ТН-формы кислоты через мембрану и ее проницаемость Р^ достаточно велики по сравнению с проницаемостью этих кислот через НС. Если обычная теория, применимая для описания транспорта ацетата и других ко-роткоцепочечных кислот, не объясняет рН-зависимость 1н в случае длинноцепо-чечных кислот, возникает вопрос, с чем связано снижение потока протонов при рН>рНтах- Известно, что жирные кислоты в растворе образуют мицеллы, которые находятся в равновесии со свободной кислотой. Возможно, что отличия в транспорте протона, индуцированного жирными кислотами, связано с тем, что взаимодействие таких мицеллярных структур с мембраной качественно отличается от взаимодействия отдельных молекул, растворенных в объемной фазе.

Глава 3. Транспорт ионов водорода, сопряженный с трансмембранным переносом дикарбоновых кислот. Проницаемость БЛМ для двухосновных кислот.

В следующей части работы исследовался ряд дикарбоновых кислот с разной данной углеводородной цепи (моноалкилмалонатов). Эти кислоты характеризуются большей гидрофильностью, чем соответствующие монокарбоновые кислоты. Помимо этого они характеризуются двумя рК, величины которых равны 2.85 и 5.7. Как и в случае монокарбоновых кислот, была проведена специальная серия экспериментов по изучению влияния моноалкилмалонатов на проводимость мембраны, сформированной из дифитаноил фосфатидилхолина. Эти эксперименты показали, что длинноцепочечные моноалкилмалонаты (С8-моноалкилмалонат и С11-моноалкилмалонат) не влияют на проводимость мембраны. Следовательно, можно сделать вывод, что липидная мембрана непроницаема для анионной формы моноалкилмалонатов. В дальнейших экспериментах считалось, что через моноалкилмалонаты могут проникать через мембрану только в нейтральной форме.

Jh*10® моль/м2 сек

20

1S

10

о

s

3 4 5 « 7 S

Рис. 7. Зависимость потоков ионов водорода через БЛМ, возникающих при создании градиента кислоты: 1 - С8-моноалкилмалонат, 2 - С11-моноалкилмалонат. Состав среды: 1 мМ Mes, 1 мМ трис, 1 мМ р-аланин, 100 мМ холшшюрида. Состав мембраны: 20 мг дифитаноилфосфатидилхолина (ДфФХ) в 1 мл декана.

С11-

рн

В следующей серии экспериментов при разных значениях рН измерялись трансмембранные потенциалы, индуцированные созданием градиента моноал-килмалонатов с разной длиной углеводородной цепи в присутствии ТТФБ. Значения потоков ионов водорода в этих условиях рассчитывались по уравнению б. На рис. 7 представлена рН-зависимость потока 1н. индуцированного 1радиентом моноалкилмалоната, дня С8-малоната (кривая 1) и С11-малоната (кривая 2). Видно, что рН-зависимость потока Н+-ионов для С8-малоната имеет вид колокола с максимумом при рН=4.5. В соответствии с приведенными выше уравнениями это означает, что лимитирующая стадия процесса меняется при переходе от кислых значений рН к нейтральным. В данной постановке опыта не удалось измерить потоки для С11-малоната при рН<6, т.к. ниже рН=6 эта кислота плохо растворима в воде. Однако из рис. 7 можно видеть, что при рН>6 значения потоков, создаваемых градиентом С11-малоата значительно выше, чем те же значения потоков для С8-малоната. Эти з начения рН соответствуют спадающей ветви рН-

вкл

г

ТТФБ

1

15 «В

выкл

т

Рис. 8. Влияние скорости перемешивания растворов на величину трансмембранного потенциала, возникающего при создании градиента кислоты в присутствии ТТФБ. Концентрация С11-моноалкилмалоната с одной стороны мембраны 200 мкМ, рН=6.5. Состав среды: см. рис. 7.

С11-МАЛОНАТ

зависимости как в случае С8-малоната, так и С11-малоната (см. рис. 7). Согласно приведенной выше теории транспорта моноалкилмалонатов, спадающая ветвь рН-зависимости должна соответствовать области рН, где транспорт протона лимитируется переносом ТН-формы кислоты через мембрану.

Для транспорта НМгонов, индуцированного моноалкилмалонатами, были также проведены эксперименты по определению лимитирующей стадии процесса транспорта. На рис. 8 показано влияние скорости перемешивания раствора (а, следовательно, толщины НС) на градиенты рН в НС, возникающие в присутствии С1 моноапкилмалоната. В отличие от длинноцепочечных монокарбоновых кислот в этом случае увеличение скорости перемешивания снижает величину ДрН в НС. Это означает, что при рН> рНщах транспорт протона лимитирован переносом нейтральной формы кислоты через мембрану. Этот результат хорошо согласуется с теорией транспорта моноалкилмалонатов. Согласно теории в случае рН> рНщах

отношение потоков ( н- / н- ) должно быть пропорционально отношению про-ницаемостей ТН-форм этих кислот через мембрану (Рда(С11)/ С8)). При рН=7 это отношение равно 8. Таким образом, в случае дикарбоновых кислот удается

удовлетворительно описать перенос кислот теорией, учитывающей влияние НС и реакций кислотно-основного равновесия, протекающие в НС. По результатам экспериментов, используя уравнение 6, были рассчитаны проницаемости мембраны для нейтральной формы С8- и С11- моноалкилмалонатов. Результаты проведенного исследования суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики транспорта Н+-ионов карбоновыми кислотами разного строения

№ груп пы название вещества условия лимитирующая стадия проницаемости бислоя для ТН-формы кислоты (см/сек)

I СНз-(СН2)„-СООН п=0, 2, 4 рН«рНт« рН»рНт„ перенос Т- через НС перенос ТН через бислоя Рм(С2)=2.5*10-' Рм(С4>=55М0-3 РМ(С«)=455*10-3

II СНз-(СН2)„-СООН п=6, 8,9, 10 рН«рНт« рН»рНт« перенос кислоты через НС рм»рнс

III СООН СН3-(СН2)„-(СН) СООН п=5, 7, 10 рН«рНтм рН»рНтк перенос Т- через НС перенос ТН через бислой РМ(С«)=1*10-3 Рм(Сп)=8*10-3

Выводы.

1. Показано, что транспорт ионов водорода через бислойную липидную мембрану, индуцированный транспортом монокарбоновых кислот с короткой углеводородной цепью (Сг - С«) может быть удовлетворительно описан с помощью теоретической модели, согласно которой поток протонов, индуцированный градиентом

этих кислот, при кислых рН лимитирован переносом анионной формы через НС, при щелочных рН - переносом нейтральной формы через мембрану. Вычислены величины проницаемости мембраны для данных кислот.

2. Найдены качественные отличия в механизмах транспорта ионов водорода, индуцированного биологически значимыми монокарбоновыми кислотами с длинной углеводородной цепью (жирными кислотами) и кислотами с короткой углеводородной цепью. Показано, что лимитирующей стадией процесса переноса протона при транспорте жирных кислот является перенос кислоты через НС во всем изученном диапазоне рН. Сложный вид рН-зависимости потока протонов через БЛМ, индуцированного жирными кислотами, можно связать с процессом мицел-лообразования.

3. Показано, что монокарбоновые кислоты с длинной углеводородной цепью могут транспортироваться через мембрану только в нейтральной форме. Таким образом транспорт нейтральной формы этих кислот через липидные мембраны не требует участия белковых переносчиков. При этом не подтверждаются литературные данные, согласно которым жирные кислоты в отсутствии белковых переносчиков способны индуцировать электрогенную протонную проницаемость мембран.

4. Показано, что механизм транспорта дикарбоновых кислот с д линной углеводородной цепью (моноалкллмалонатов) качественно сходен с транспортом моно-карбоновых кислот с короткой длиной цепи. В отличии от монокарбоновых кислот с длинной углеводородной цепью, перенос ионов водорода, индуцированный дикарбоновыми кислотами при щелочных рН лимитируется диффузией нейтральной формы этих кислот через мембрану. Проницаемость мембраны для этих кислот растет с ростом длины углеводородной цепи.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Evtodienko V.Yu., Kovbasnjuk O.N., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Effect of the alkyl chain length of the monocarboxylic acid on the permeation through bilayer lipid membranes. Biochim. et Biophys. Acta 1281, (1996), 245-251.

2. Евтодиенко В.Ю., Ковбаснкж O.H., Антоненко Ю.Н., Ягужинский JI.C. Транспорт монокарбоновых кислот с разной длиной углеводородной цепи через плоскую бислойную липидную мембрану. Биологические мембраны, (1996), т.13, № 1, стр. 79-88.

3. Евтодиенко В.Ю., Ковбаснюк О.Н., Антоненко Ю.Н., Ягужинский JI.C. Реакция присоединения отщепления протона вблизи межфазной границы бислойная ли-пидная мембрана - вода. Цитология, (1995), т. 12,4, 373-374.

Подписано в печать ¿7. ОЗ• 1997 года. Заказ \\&2?. Формат 60 х 90/,,. Усл. печ. л. Тираж 60 экз. Отпечатано на ризографе. Отпечатано в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.