Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Локальные изменения концентрации ионов водорода, связанные с поверхностью бислойной липидной мембраны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Локальные изменения концентрации ионов водорода, связанные с поверхностью бислойной липидной мембраны"

^ л

.-Л л '

Л. \ V4- ЯОСШВСШ ОРДЕНА ЛЕНИНА

и

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ ШОЕГДО ГССУДАРСТШПГЯ! УНИВЕРСИТЕТ*Ш9НИ Н.В. ЛОМОНОСОВА

ИШОГКЧЗСШ!'ФАЮ'.ЧЬТЕТ

На правах рукссагк

КОВЕАСКПК ОЛЬГА ШчКОЛЛЕШ'Л

ЛОКАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ ИСНОЗ ВОДОРОДА, СВЯЗАННЫЕ С ПОВЕРХНОСТЬЮ БИСЛОИНОЛ ЛКЕШОй И2^7.НЫ.

(03.00.02 - биофизика)

I

Автореферат диссертации пэ сокскажз ученой степени кандидата Сеологических наук

Научные руководители :• доктор биологических наук, главный паучшга сотрудник Ягушнскай Л.С. кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Антонекко Ю.Н.

Москва - 1593

Работа Быполнепа п секторе биоэнергетики НИИ Фвздао-Хншчэской Биологии имени А.П.Бежпврского МГУ.

. Нэдчвуй руководитель: доктог (Экологических наук, главный научный

сотрудник Л.С. Ягукшский

Офицкялшк. оппонента:

доктор биологических наук БерастовскиЯ Г.Н.

к&ыдадат биологических наук Булычев Л.А.

Ведущая, организация:

Кдститут алектрохкмии июни А.И. Фрумкина РАН

Ег^та состоится "/£'' u. L&-1-L 1993 года в /¿¿пасов кл заседании спеуиэльсгрованиого совета К.058.05.68 по адресу: Москва II9899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией мокло ознакомиться в библиотеке Еиологического факультета МГУ- * Автореферат рхослсп ''_/V ЛлеЯ__1993 г.

Учсг-гй секретера спещалжированнсго совета доктор '0ио^о1"1чсс1си;; паук

Б.А. Гуляев

ОПЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ Лктуэльность_темы. Согласно теория йитчела (нисЬох, 1966), сопряжение электронного транспорта с спстсмоЯ синтеза АТФ в уигохоняри&х , хлоропластох и бактериях осуществляется зз счет рпсогн двух типов щютотшх помп, ко тор»; в осуществляют трзисмембрвтшй ворепос ионов водорода. Это ТоК пазипзеюю дыхательные помпы и ЛТР-стгатлзя. Альтернативная теория Вильямов также предполагает, что в сспряячгос! участвуют иош водорода. Однако, согласно этой пптотэг.с перенос протонов, обладая®« избытком стботоп энергии, от якателъвой цепи к АТФ-синтазе осуществ-мется пегосредстЕонко внутри или гю поверхности мембраны. Такси механизм предполагает существование высокого кинетического барьера, препятстпуппего быстрому' переносу конов водорода с поверхности мембоаны в водную флзу.

Ключевым в этой связи является определение литтиругоей стадии процесса переноса протонов через мембрану. Если скорость трансмомб-ранного перенос иоесв водорода ограничена транспортом протопэ гидрофэбкый слой мембраны, то квввтаческиП барьер для переноса иске г. водорода в интерфазе мембрана/вода ют значительный по сравнение с кинетическим барьером самой мембраны. При этом устанавливается равновесие между ионама водорода, находящимися на границе раздела мембрана/вода и в объеме буферного раствора.

Если хинетичестиш барьер для переноса ионов водорода через межфазную границу болысой, транспорт протоков штат быть' ограничен скоростями гетерогенных реакций отрыва-присоединения ионов Еодородэ на поверхности мембраны. В таком случае при трансмембрзином переносе протонов образуется пул связанных с поверхностью мембраны лоно в водорода, обладающих избытком свободной энергии.

На протяжении многих лет вопрос о судествовэяая "мембранного пуло протонов" широко обсуадоется в литературе (пе коиедкоувку,:ээ5;

Dilley,l989i. В носледаое. время появляются экспериментальные работа, свидетельствукдах о том, что и определенных условиях лиюпируюцей стадией в процессах транспорта ионов водорода через мембрану являются ре.акюти протошрования-депротонпрования функциональных груш ИОНСфоров (Riddel, 1908; Decker,1988) ИЛИ фарМвНТОВ (Drachev,1984; Silverman, 1969; Denchcr, 199.1 ¡¡¡а границе раздела фаз мембрана/вода .

_Uai-b____ВЭЗотк - на модельной ОкслоШюГ: дииидной меадирз-

ке получить экспериментальные данные,подтворвдопяиа возможность локального сопряжения процессов электронного транспорта и фосфэрили-рораняя, протекающих в мембранах митохондрии к хлоропластов. В этой связи ш попытались продемонстрировать возг.смюсть образования пула связанных с поверхностью мембраны ионов водорода, обладавших избытком сбооодпой энергии в условиях стационарного потока протонов через бислойную липвдную мембрану.

Ставились слодущие основные задачи: найти условия, в которых лимитирующей стадией катион/протонного обмена являятся реакции протонированпя-депротошфованяя иопофоров па поверхности раздела фаз ■мембрана/буферный раствор; показать возможность образования в данных условиях разности граничных потенциалов за счет связывания ионов водорода на поверхности мембраны; показать, что зз счет эЕергии связанных с поверхностью ионов водорода может быть совершена работа но создала® градиента ионов на ЕЯМ.

Н§23йШ-Ш833на_Еаб2ТЫ. в ходе исследований било показано, что ' ■ при еоздашш на БЛТЛ градиента попов калия ила натрия и в отсутствие градиента рН в KG' тракскембрашшй поток коков водорода, индуцированный' соответственно шгерицином или монесином, возрастает с увеличе-. нием концентрации буфера (цитрат или kesj. в этих условиях методом компенсации шутримембранного поля продемонстрировали образование разности граничных потенциалов, обусловленное тек, что в процессе

чеоликгрогешюго кошш/пготсшюго г.скека происходит срл»нвзн;гз па поверхности кембравы чопсв кодородэ. Образование разности грглиигг потенциалов зависит от лилдднего состава т.'бран. НяЛ.гзге/ усдоетя. м которых в отсутствие грздкзитэ рН я не !"-я-г^уется г •'•:- ;:а>!гта работы двух неэлектрогеитах катиоп/дротоняих '.•б«с:«глсов тогтрпц.щ.ч л мояан-сша зз счет связанных непосредственно m поверхности мембран« протонов.

• Практическое значение работе. Настояла сольдоп';н::о л:<"Т ьоау« информацию о возможности локального сопряжения процессов ?лзктрош:о-го транспорта и синтеза АТР в комбранахбэктерий, митохондрий хлохепластов. Полученные результаты могут 6ai:> дл.ч

дальнейшего изучения механизмов преврацс;жя энергии б сопрягают:; мембранных системах.

Апробация, рзботч. Резу,ньтатц диссертационной работа докладывал:! на всесоюзной конференция "Трансформация энергии в мекератнях системах" (Пушино,1991) и ыа теоретическом семинаре отдела опоэязргетйки НИИ физико-хкмическсй бюлогпи им. А.Н. Белозерского КРУ (Москва, 1993).

Публикации По материалам исследований опубликовано 4 статьи.

Структура и объем диссертация. Дисссертзция состоит из введения, обзора литературы в трех главах, списания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения з егма главах, выводов и списка цитируемой литература. Работа изложен» на 122 страницах, включая 29 рисунков. Еабдгограййя содержит Кб вззвэниа. зкепта-шаггАльнАЯ часть .■

Баслойную лишдпую мембрэну формировали на отверстии в тефлововой стенке диаметром 0,3-0,4 гам по методу Мзаллера и яр. (Kuii« et р. 1,1962). Б большинстве экспериментов ^мбрзиЮормирунщиЯ раствор СОСТОЯЛ ПЗ фССфаТИДИЛХОЛНЦЗ, выделенного ИЗ соевых бобов ("Sigma",

США), И холеоторгша ("Boehrinqer", ФРГ) в ы-деканэ. В некотрых случаях использовали фосфатидилсерин -sigma", фосфтгидилэтаноламин "Пика" И ДИфИТаИОИЛфОСфаТйЦИЛХОЛ1Ш "Avanti Polar Lipido".

В процессо работы использовали буферы цитрат ("Реахиы") и mes ( T.erva" ). Протонофор тетрахлортрифторметилбензимидазол (ТТФБ) и моненсин сcalbiochem")добавляли к растворам с двух сторон мембраны в концентрации Ю~6М и 10~?М соответственно, Ионофор нигерицин ( "Caibiochem" ) добавляли непосредственно в мем0раифор?.шрувдий раствор в концентрации 180 мкМ.

Трансмембрашшв потенциалы измеряли методом разомкнутой цепи, используя усилитель Keithey 301.

Граничные потенциалы на БЛМ при адсорбции ионов водорода измеряли мз'годом компенсации впутримембранного шля (Соколов,1930). Метод измерения граничного потенциала состоит в том, чтобы найти величину' постоянного напряжения мс::;ду водными растворами, при котором электрическое поле внутри мембраны отсутствует. Эта величина (компенсационный потенциал) совпадает с разностью граничных . потенциалов БЛМ. Блок-схема установки для измерения компенсационного потенциала мембраны состоит из: ячейка, генератора ГЗ-112 с используемой циклической частотой 395 Гц, фильтра второй гармоники типа 1617 (Германия) .усилителя тока Б5-8, активного- фильтра основной гармоники (разработка инженера Лебедева E.H.), селективного усилителя второй гармошки тина 237 (Польша).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава I. Влияние буферных растворов на велшпшу трансмембранного потока ионов водорода, индуцированного Мз+/Н* обменциками нигершшном и монэнсином.

Создание на мембране градиента ионов калия в присутствие неэлек-трогешюго К' Л Г оОмзнника нигеркцина и цротонофора ТТФБ приводит к

ЯЧР —1-> и*

образованию разности потенциалов, обусловленной трансформацией градиента ионов калия в градиент ионов водорода в неперомешиваегл« пркмембрашмх слоях. Это позволяет по значении трлясмембрзнового потенциала определить величину неэлектрогопного потока коков водорода через БЛМ. Недостаток такого способа состоит в то и, что образующийся в нвперемепвпзземнх слоях градиент рК частично скижют скорость К+/Н+ обмена. Нага разработан компенсэциошш метод рения Ja, позволяющий определять величину потока ионов водорода при нулевых

значениях градиента рН на БЛМ.

м м и с

Согласно этому метода (ргс.1), ив мембране создавали градиент KCJ. в ячейку ' добавлял! протонофор ТКБ, нигеряцин добавляли непосредственно в меыйрэнформируотий раствор. После установления стационарного значения потенциала в отсек ячейки, содержащий высокую концентрации ионов калия, добавляли возрастающие концентрации ацетата натрия нлк лития до тех пор, пока потенциал яа мембране не становился равным пулю (рис.2). Поток протонов через БЛМ пропорционален концентрации добавленного ацетата (Antonenko,i984). Контрольные опыты показали, что такие ке концентрации хлорида натрия, добавленные вместо ацетата натрия заметно не влияют на величину потенциала в условиях экспериментов.

Абсолютную величину потока протонов рассчитали из конечной величины градиента концентрации ацетата по величине проницаемости мембраны ДЛЯ вцвтата (Antonenko and Ynguzhinsky,1984).

ь ц £ i ti---

И*

— [Jiff

Рис.1. Схема измерения трансмембранного потока протонов- в отсутствие градиента рН j¡ НС.

15 мМ CU,СО.

Рис .?. Пример тмаре кия транс-мешбрэшюго потока протонов в

/

/

\

(3 uU СМ,tO,jH.

\ 1

отсутствие градиента

\

рН В НС.

) мМ си.'.О.'.-

На рис.3 дана зависимость потока ионов водорода через КЯМ, индуцированного пигерицином, от концентрации цитрата и MES оуферов.

Вядпо.что увеличение концентрации цитрзтногобуфора с I ММ до 100 мМ приводит к возрастания ионных потоков в 5 - 7 раз, В этих усло-ш характер зависимости величины потока от концентрации буфера зависит от химической пкрпроды буфера .¿кривые 1,2). В случав цитрата происходит быстрое увеличение потока с ростом его концентрации: начиная с 10 мМ, поток выходит на насыщение. увеличивает поток цра существенно Оолое высоких концентрациях ( 60 мМ). При этом

to -

20 «п ел ню

кгч-.чнтрацич ьт' ¡'а. t.t;

№0.3. Зависимость потока ионов водорода через КВД, индуцированного шгеришном от концентрации цитрат-тюго (кривая I) к неб (кривая 2) буферов,рН 6;5. Градиент концентрации ионов калия 190мМ:100мМ. Концентрацию холинллорида варьировали так, чтоб общая концентрация буфера и холинхдорида составляла 100мМ.

видимого насыщения потока не наблвдаотся дахз щи 100 !дМ ятого буфера. Следует еще раз подчеркнуть, что дашше рззульгата били получены г/о то дом, исключающем образование градиента рН в непэрвмзш-ваемнх примэмбраншх слоях.

Существенно, что использованная наш система нз?л:?рвния скорости К+УН+ обмена включает трансмомбранный шток уксусной гасло ты, которая, в принципе, сама обладает буфоряюм свойствами. Однако, в данной работе ацетат не является буфером, поскольку его рК=4,7Г), а рН использовании; наш буфорпых растЕоров равно 6,5.

На рис.4 приведена запись потенциала на КЧМ в условиях измерения

скорости К/ТН4" обмена при добавлении цитрзт-ного буфера с цис и транс стороны мембраны (сторона добавления ионов калия - цис ). Видно, что цитрат, добавленный с транс стороны СЯМ не влияет на поток, тогда как его добавление с цис стороны существенно увеличивает поток. .

Л ] .-ЧСН/^Тл

I

90 и.» га чиг

I СмМ ЦИТРАТ«

ГЬА*1)МГРА7А з ИС

0 1Л"<Х,ОТ№ „ис

1

со «м га иие

10 им ЦИТРАТА ГГ> НС

Замена Н^О на о20 в случае I мМ нитратного буфера приводит к уменьшению потока протоноз в 1,5 раза, для 100 иМ цитрата - в 5 раз.

Теоретически возможны два осноевых кинетических варианта транспорта ионов ннгерицшюм. В первом случае лимитирует стадия переноса ионов через объем мембраны, в другом - стадия взаимодействия катионов с переносчиком нз границе раздела мембрана- вода. В настоящей

работе найдены условия, при которых скорость К+/Н4 обмана ччриз ШИ существенно изменяется под действием факторов, которое сиецкфачески направлено на стадию отрыва ионов водорода от молекулы ипгврашша на границе раздела мембрана-вода. В качество таких фзкторов в дашюй глззй представлены буферная емкость растворов и замена протопоп водя на дейтрон«. Этот результат позволяет нам сделать завод о том. что и условиях изких измерений лимитирующей стадией: процесса является стада взаимодействия иопов водорода с иигерицшюм. Разное действие цитратпого оуфора с двух противоположных сторон мембраны позволяет нам уточнил лш^тяруюаую стада» - отрыв коков водорода от молекула нигеридша на гралацо раздела мембрана - вода.

Увеличение потока протонов через БЛМ при варьироваани концентра-щ'.тт цитратного буфера наблюдали к в случае пеэл&ктроганкого из*/II4 обмена, индуцированного монексином. В дапнем случае для измерения трэъемзморанноге потока исков водорода использовав ацетат лития, так как моиенкш слабо переносят ионы лития через мембрану.

На основе полученных экспериментальных данных мы пришли к заключению, что при работе любого неэлектрогенного катион/протонного обменника возможны условия, когда лимитирующей стадией процесса транспорта ионов через мембрану являются реакции цретонгровавзя-дещютонирозания переносчика в интерфазэ ЕЯЫ/буфаргай раствор. Глаза 2. Математическое моделирование процесса нзэлектрогешгого К' /К4 обмена, индуцированного нкгарицином.

Для ооле полного понимания механизма эффекта концентрации бугров (цитра? и МЕ8) на скорость К+Л1+ ойаена, индуцированного нигерици-гюм, предложена модель, основанная на том, что реакции прот'ояирова-кия-д'лгрохонирования переносчика идут по только за счет его взаимодействия с молекулами боды, яо и с молекулами буфера, причем молекулы буфера образуют с гшгерпциюм промежуточный коропсоиивущЕй кош-

леке вз поверхности мембраш. В таком .случае уравнение .для переноса протояироэашой Форш пиге рицина через мембрану имеет бил:

" " 27тн> {к2 Л_,> + к1>г2[П3

где к1,к_1,к2,к_2 - копстанты скорости образования и распада комплекса ионофора и буфера; утя - копстзнты скорости переноса протопиро-ванной формы ионофора через мембрану.

Уравнение выведено для условий стационарного трзпемомбрашгаго потока протоков и в предположении, что переносчик но похидает ЕЛИ.

Наша задача заключалась в том, чтобы на основе дэной модели построить теоретические кривые, хорошо согласущиеся с данными, полученными в эксперименте. Для этого мы путем варьирования констант скоростей реакций подобрали такой их набор, который позволил нем получить теоретическую зависимость штока ионов водорода от концентрации буфера, соответствующую качественно и количественно конкретной экспериментальной кривой (рис.5).

3:

20, И I

1/

Рис.5. Теоретическая зависимость потока протонов от .концентрации цитратного (кривая

1) и мез (кривая

2), рН 6,5. Градиент ионов кэлня -190мМ:1С0нМ.

»г_____

га 'Ш ев «в

концентрация бУФерл

—1 ¡м

Используя такой подход мн установили,что наиболее модлошюйста-

даей процесса IlVlI* обмена, индуцированного нигерицином, в случав нитратного буфера растворенного в Н20 (кривая I), является стадия распада комплекса буфера с нигерицином до аниона переносчика и протонированпой молекулы буфера. Увеличение концентрации буфера ускоряет эту реакцию и приводит к росту потока протонов через БЛМ с ростом концентрации цитрата в среде. Скорость определявшими стадии K'VlÎ4" обмена в случае водных растворов MES Оуфсзра (кривая 2) является два процесса: процесс распада комплекса шгерщщна с буфером до аниона переносчика и протонироваяной молекула буфера, и уменьиение скорость образования нейтральной Форш нигерищша путем присоединения протона. Эти факторы и определяют характер зависимости потока ионов водорода от концентрации mes буфера.

На величину потока ионов водорода через БЛМ влияет лшшданй состав бислоя. В случае замени в мембранфэрмпрупдем растворе аэолек-тша, который, как известно, является природной смесью фосфолкпвдов с преобладанием фосфзтащшолша, ка синтетический липид дифятаноил-фосфатядвшолия трансмембракный поток ионов водорода, индуцированный йигеришшом практически не зависит от концентрации цитрата. Глава 3. Образование разности граничных потенциалов на БЛМ при работе ноэлактрогешшх Mef/H+ обменкиков. . На рис.6 приведена зависимость разности граничных потенциалов на БЛМ (1><рь) от концентрации цитрата в водных растворах в условиях работе К+/Н+ оСменнихз - нигеришша при наличии градиента концентра' цие ионов каляя на мембране. Величина дрь падает с ростом концентрации нитратного буфера. Знак плюс« как и в предыдущих экспериментах, локализован на "цпс" стороне КШ ( которая омывается более концентрированным раствором хлорида калия). Следует подчеркнуть, что измерения ¿fb проводок в условиях, когда на мембране отсутствовал градиент рН, который возникает при К+/Н* обмене (Antpnenko and

«

И ! '

. -'""51

хадигЫпэку, 1390). Градиент рН компенсировали цуток ДОбаВЛОНЕЯ ацетата натрия с -цис" стороны мембраны. Необходимо сказать, что добавление ацетата натрия о цис стороны БЗМ в концентрациях, при которых градиент рн на ЕЧМ район нулю, практически да изменяло величины лрь. Качественно аналогичные результат балл получены при использовании других буферных растворов - фосфата или

в РИС.7А.

г--------—....."............Зависимость

ыевду

" двумя сторо-

нами ПЛМ. образующейся в процесса . .. - - —т.--' индуцирована ого нигери-

цином неэлектрогонного К+/Н+ обмена, от концентрации цитратного буфера (рН 6,5), измеренная методом компенсации внугримембрашю го поля. Градиент ионов калия не К1М 95мМ:5мМ. На вставке - влияние концентрации нигерицина на дрь в условиях М цитратного буфера, рН 6,5. Кривая I - среда й Н20, кривая 2 - среда с

Рис. 7Б. Зависимость потока ионов водорода через БЧМ от концентрации цитратного буфера. Градиент ионов калия 95мЧ:5мй. Измерения проводили в условиях нулевого градиента рН нз КЯМ путем добавления ацетата натрия с цис-стороны мвмбрэпи. Кояцентрацаю ходасхлорида варьировали так, чтоб общая концентрация буфера п холшхлорила составляла 100.1И.

Уменьшение л?>ь, наблюдаемое при увеличении концентрации цитратного буфера, (рис.7Л) не связепо "с ростом лонной силы раствора, поскольку при увеличении концентрации цитрата ш пропорцЕоя*»льяо

'С

! 1КТР»Т!

снижали концентрацию холшшюрида в среде.

Образование разности граничных потенциалов на мембране наблюдали и в случае работа неэлектрогешюго ыа+/Н4 обменникэ моненсина при создании на БЛМ градиента иопов натрия. В случае 1мМ цтратного буфера Д'рь равен 3,5 ст. При росте концентроции цитата также наблюдали снижение дрь. Так для 10 мМ буфера Дрь=1.7 мВ.

На рис.7 (вставка) приведена зависимость от концентрации нигерицина, полученная в средах с Н20 и с п^О. Видно, что максимальный изотопный эффект наблюдается для 1В0-200мкМ ионофора.

Все описанные выше опыты проводили на мембранах, сформированных из азолектина - природной смеси фосфолипидов, выделенных из соевых бобов. При формировании БУШ из дифитаноилфосфатадилхолина, разность граничных потенциалов лрь в таких же условиях не образуется (ошибка эксперимента - 0.5 мВ). В то же время на БЛМ, сформированной из смеси фзсфатидилсерина и дахфитапоилфосфатидилхолина (1:1) в стандартных условиях (как на рис.7) нэбдвдали достаточно высокую разность граничных потенциалов (йрь=6.5 мВ при I мМ цитрата).

При обсуждении полученных результатов следует рассмотреть' два нута образования л«>ь на мембране.

1) Ситуация, когда существует быстрый обман протонами мзвду молекулами нигерицина и водной фазой. В этом случае величина Д<еь определяется разницей стационарных концентрацией заряженной анионной формы нигерицина на разных сторонах мембраны в условиях рециркуляции

• в мембране этого переносчика.

2) Ситуация, когда существует быстрый латеральный перенос ионов водорода между Еигерициком и фосфолипидами на поверхности ЕШ. Такой процесс, возможен в том случае, осли его скорость существенно выше, чем скорость переноса ионов водорода от нигерицина в водную фазу. В таком случае, в условиях трансмембранного потока протонов должно

иртсколиь эткмгасюте одной из поверхностей мембраны иоаэмп водоро-дз, которое овязанч с кислотао-осЕСВШШи грушами липйдой из поверхности БЛМ.

Гвяптть вопрос о том, кркзя из этих двух ситуаций р'гзлзпуотся а условиях эксперимента позволяет сопостаглелкс 'результатов опытов яг. БПМ, сформированных из разных классов лзтадсв. п случае ф?сфатвдил-холинэ на поверхности мембраны .тжэлпзовзш! только слабые основания - фосфатные группировки, сродство которых к протону iBisca. чем сродство карбоксильной груяды КИГ'ЗрйЦПЕЗ (Toto et al.l9G7) . В ЭТОЙ ситуация возможность переноса протонов с шлекуда ккгершвзна на поверхность мемпренн сильно ограничена. Соответственно в зкеперимен-те на такой мембезне образование разности граничных потошнюлоз практически не наблюдается. Великана рК карбоксильной группы фосфз-тидилсерина близка к рК кигершдша, присутствие этого лизядч з БЛМ коррелирует с зфЭехстсм образования ¿рь. Поскольку фссфэлшшдныя состав мембраны, при прочих равных условиях, не должен оказывать существенного влияния на скорость переноса кигерицина через гидрофобную Фазу, «окно с уверенностью говорить о том. что образование f\rb связано с быстрым латеральным переносом ионов водорода с молекулы нигершинз на кислотно-основные группировки фосфолипидов, в частности - ив карбоксильные группы фэсфатидилсерпна. Скгаютше Дрь, которое пропехрдат при увеличении концентрации цитрата (рзс.7). фосфата или MEs и одновременное увеличен!« потока через ЕЯМ (рм. далее) непротиворечиво объясняется тем, что эти соедиошгя катализирует процесс отрыва - присоединения ионов водорода мезду кислотно -основными группами фосфоляпидов по границе раздела фаз и водой в прпмеыбрэнвом слое.

Для того, чтобы выяснить возможно ли образование на БЛМ tvb вышеуказанной величины, связанное с протоиированием поверхностных

груш лкпиков, нами было поставлена независимая серия опытов, в которой на Б.1М, сформированной из азолектша, в отсутствие нигервци-на регистрировали ь?ь при измонекии рН с одной сторона мембраны. Показано, что л?ь= 9 мЕ достигается при сдвиге рН с 6.5 до 5.1 в кислив сторону и л?>ь= 7.5 мВ при сдвиге рН до 8.3 в щелочную. Эти эксперименты показали, что поверхность БЛМ имеет достаточно кислот-но-основаых групп, чтобы вызвать образование разности граничных потенциалов наблюдаемой величины. В аналогичных опытах с БЛМ, сформированных из дифитаноилфосфатидилхолша, образования лрь в указанном дашазоне рН не наблюдается. Лишъ при сдвэте рН с 6.5 до 9 был зарегистрирован небольшой потенциал й?>ь=1.5 мВ.

Варьирование концентрации цитрата от ТмМ до 1ССмМ, когда градиент ионов калия на БЛМ равен 95:5 мМ, тою приведет к увзличешга трансмембранного потока протонов как в случае (рнс.З, криззя I). Увеличение потока под действием катализатора (цитрэтныИ бу^ер) коррелирует с падением разности граничны*. потенциалов на мембране, что позволяет говорить о том, что увеличаниз потока является результатом снижения количества связанных с поверхностью ионов водорода, поскольку буфе}) как катализатор ускоряет процесс отрыва протонов от поверхности мембраны. Значит, связанные с поверхностью протоны контролируют трансмембранный поток ионсв водорода, индуцированный нигерицином. Глава 4. сопряжение работа двух неэлектрогеняых обмешшков нигерици-ка и моненсикя в отсутствие градиента рН в НС Нам представлялось взышм показать возможность совершения работа за счет градиента связавших с поверхностью протонов. Ранее в работе (Антоненко и ЯгужинашйДЭЗЗ) было установлено, что при создании, града-тента концентрации конов натрия на БЛМ в присутствии моненсина и взгорищша происходит образование градиента концентрации ионов калия в неперемеливаемых примембрэнных слоях (НС). Возникновение этого

градиента регистрировали по образованию потягшшгяа пэ Е:М прз? добавлении вйлиномициня. Условием сопряжения работа двух оСмегаиков являлось образование градиента рН в НС при работе моненсина. В настоящей работе такого же типа опыты были повторены в присутствии ацетата лития (монвнсяи и нигерицин переносят ионы лития через БЛМ более чем на два порядка хухе, чом ионы натрия и калия соответственно), который добавляли с -цис" стороны мембраны, чтобы кскпенскро-вать локальные градиента рН в НС. Кокнентрошт зиетагз литая подбирали в независимых экспериментах таким образом, чтобы электрический потенциал в присутствии прояофора и моненсина был равен нулю. При

такой постановке эксперимзн-•

аьихл - к*с

I

1нВ|

1

/

I/'

Мои гиг ИМ

КоО чис

и

Ь'

Мои»'

Г

'та источником энергии для образования градиента концентрации ионов калия на БЛМ при К+/Н+ обмене индуцировэ-нном нигерицином была только разница в количестве поворх-ностносвязшшых ионов водорода на нро'пшонолокпкх сторонах БЛМ, которую регистрировали путем измерения разности граничных потенциалов.

На рис,7 (кривая I) дэнй типичная зишеь канатики образования потенциала на БЛМ, возникэвдая в ярисут-■" ствки валяномицина в указан-

ных вше условиях. Видно, что в условиях полной компенсации ацетатом

■ г1.'г ин II'.! -.'.* ям [¡^"I ":'

: Не--• э: V л с

:

и р <

тгй ■

Г. "И : -, -

ГТР ' V г '

лития градианта рН в НС до нулевого значения, объемный градиент ионов натрия продолжает трансформироваться в, локальный градиент ионов калия на мембране. Контрольные эксперименты показали, что в присутствие только одного иоиофора (нигерицин или моионсия) потенциалы но образуются. Величина градиента ионов калия, как и следовало ожидать, падает с ростом концентрации цитрата в среде, снижающего количество поверхшстносвязашшх ионов водорода на БЛМ (рис.8, кривея 2).

Параллельно балп проведены опыта по измерению разности поверхностных потенциалов в отсутствие вэлшсмкипез при щючих равных условиях; оказалось, что при I ыМ цитрата дсоставил 7 мВ, при 50 мМ оставалось 1-2 мВ. Наблюдаемая корреляция мззду величиной д?>ь и градиентом ионов калия, возникающего в данной снстемо, еще раз показывает, что в процессе сопряжения источником энергии является образование разности связанных с поверхностью ионов водорода, возки-кавдая за счет на+/Н1 обмена, инду щгров о шю г о моненсином и ионами натрия.

Замена в мембранформкрующем растворе азолектина на дифитаноилфос-фатидилхолин, который не способен сорбировать протоны на поверхности БШ в процессе неэлектрогенного Ке+/Н+ обмена, приводит к тому., что сопряжение работы переносчиков в отсутствие градиента рН в НС становится невозможным (добавление ацетата лития приводит уменьшению потенциала в присутствии валиношшина до нуля).

Необходимо заметить, что совершение работы за счет энергазованных протонов связанных с поверхностью мембраны в наших экспериментах не является всадившем. Так в работе (Liu et pi. j •»•:•-1, используя меченый флуоресцентной меткой фосфзтидилэтано.?-; . '..роенный б мито-нласта, продемонстрировали корелляцию моя; тговнвм концентрации энергизовадаах протонов .на поверхности . лпластов с процессом

окисления сукцкнатз и синтеза АИФ. На основе полученных результатов, авторы пришли к выводу, что про тоншй ток. индуцирований работой окислительно-восстановительных и АТС-азных помп, локализован главным образом в интефазо мембрана митопласта/Оуфбрннй раствор. Синтез АТФ может быть сопряжен напрямую с протонами, локализовзшшми непосредственно на мембране митонластз з результате окисления сукнииата. Глава 5. Зависимость трзнсмембранного потока протопов от температура.

Одним из наиболее ведай доказательств сушестзозаьзш юпютичоско-го барьера при прохождении любой химической реакция является увеличение скорости процесса с ростом температуры. регали исследовать, температурную зависимость потока ионов водорода через ЕИ5 и на основе полученных результатов оценить энергию акглзацш для данного процесса. В случае мембраны, сформированной из азолектина и холестерина для 1мМ цитратного буфера наблюдали значительное увэличеиие потока протонов в 3,5 раза в диапазоне температур от 16°С до 30°С. Необходимо напомнить, что именно в случае БЯМ, сфорирсзанннх из азолектина и холестерина, разность граничных потенциалов достигает наибольшей величины. Для мембран, сформированных из дифитаиоилфосфа-—■тидилхолина трансмембранный ноток протонов, индуцированный нигеркци-ном, не возрос с ростом температуры.

При использовании 10 мМ цитрэтного буфера варьирование темпер а туры от 16°С до 45°С не приводит к заметному увеличению потока ионсв водорода через БЛМ для мембраны, сформированной из смеси азолектина и холестерина.

Сравнивая экспериментальные результаты для 1мМ и 10 мМ цитрата в случае мембран, сформированных из азолектина и холестерина, следует заметить, что возрастание потека ионов водорода происходит только при низкой концентрации буфера, что является еще одним доказатедь-

ином б пользу существования кинетического барьера для перекоса протонов с поверхности кимбраш в объем раствора при ноэлектгогенном К4"/Н1' обдано. иидуциртвашгом нигерюцгаом. Увелиадше концентрации цитрата приводит к снижению кинетического Сзрк'рз для ионов ю »догола. поскольку молвкулы Оуферэ катализируют процесс к:: водоноса г. иротоиак1;еплфуидда; групп лшидов на поесвг-йлсти ^¡/.ораны в всднуп фазу, Кгодото&гюквыс здесь экспариментг.ш1>-г ¡-.р.яуцтатн коррзлщи'-от и д,ш1Гима по изучению образования разности гттг.; ;гл.. готегцпалор на К'й, гдч всрытрованав концентрации цитрата 01 1Л1 до /о приводит к гдида'Н.л д?'ъ (рис.8), за счет увеличен.;::! кпчокулаг»:;! лу&фя скоро-ста переноса протонов с поверхности шибрага б сохем рзг.творл. Гяавз Схема процессе создания размести срлгашш? «

поверхность® номов водорода на нзморзне.

На рис.О дана схема процессе создания разности связанных с

поверхностью ионоз

Н- - I I'!'!тл-*,"

:н,соо

СП"

.н'

С-.:,ССОЧ

I

п ''л |1 I и> Г.ГКМ' 1

!; -'/'-л' > "■

водорода мгротоны, обведенные в кружки) в условиях равенства объемных концентраций ионов водорода (протопи без кружков) с двух сторон мембраны при наличии траксмам-Срашюго штока

протонов, ИЗД'ЦПРО-вашюго нигерицином

(или моноисиаом)• Ну схеме показано, что буферы (цитрат, МКз, фосфат) выполняют двоякую роль в системе. В НС они выступают в роли агента, сикжзидего локальные градиенты рН. Это свойство буферов

К ;

И

Ч'

г 1+

Н"

к «НЕ<•> баркгр

3

отлично от их действия в однофазно« гядкой системе, так как око включает диффузию через НС, и было впервые описано в (Епдаэвег, 1984) . В Н^ЗСЙ рзбОТв СИЛО ПСК033П0, ЧТО Р.З ГрЭНОТб рОЗДв-

ла молекулы буферов внетупавт в роли щлэтсеного медиатора, ноганося-щего протоны от поверхности мембраны на ацетат. Тпкое кх действие сходно с реакциями общего кислотно-основного катализа, известного в органической химии. Наличие такого катализа предполагает, что из поверхности мембраны существует некий барьер для перехода исков водорода от поверхности в объем.

Из схемы видно, что пзблзздземае эффекта обусловлены тем, что два переносчика ионов водорода через мембрану - ацетат п пготозофор Т-Т-ГБ осуществляют этот перенос иначе, чем нш'еркцпз. Ацетат переносит ионы водорода через мембрану из области одного неперемзпиваемого слоя (НС) в другую , не затрагивая поверхностных протонов, в то время как нигерицин - из одной интерфазы в другую. В настоящее время причины различных путей переноса протоков этими переносчиками неясны. Обычные утверждения о том, что потенциал в присутствии иротокэ-фора отражает разность рН возле поверхности КЗ!' при наличии трансмембранных потоков ионов водорода представляется нетривиальным, поскольку теоретически протснофор мог бы чувствовать и градиент поверхностных концентраций иоаов водорода. Возможно, .что разные протопофоры могут обладать разной чувствительность» к объемным и поверхностным концентрациям ионов водорода.

Для осуществления процесса связывания коноз водорода с поверхностью мембраны константа распада протона от нигерицина па поверхностные группировки должна быть существенно выше, чем константа распада на молекулы буфера, плавающие в растБоре. Такое соотнесение констант предполагает наличие кинетического барьера для переноса протонов от поверхности мембраны в объем. В недавних экспериментальных работах

Гутман показал, что БЛМ, сформированная из фосфзтидилсерина, мояот удерживать протопи на поверхности дольше, чем мембраны, сформированные из фосфэ тидп лхолип н (яи1гаап,1968), что хорошо с0гл8су0тся с

нашим! экспериментальными данцыш.

с возможности его прямого участия в процессах переноса энергии при мембранном фосфорилировании в митохондриях и хлоропластах.

1. Найдены условия, при которых лиматирушзй стадией кати-он/цротошого обмена, индуцированного пигоряшшом или моненсиыом, являются реакции отрыва-присоедипения ионов водорода на границе раздела фаз мембрана/вода. Установлено, что молекулы буферов выступают в роли катализаторов этих реакций.

2. Показано,"что в вышеуказанных условиях на мембране происходит образование разности граничных потенциалов, обусловленное разным количеством мембрансвязашшх протонов с разных сторон БЛМ. Эти данные являются 'чще одним доказательством того, что существует кинетический барьер для переноса ионов водорода с поверхности мембраны в водный раствор.

3. Найдены условия, при которых реализуется сопряжение работы неэлектрогелных катион/протонных обмеянпков пигерицпна и монепсина в отсутствие градиента рН в нвперокошиваемых слоях за счет образования

■ на поверхности мембраны неравновесной концентрации ионов водорода.

4. Образование на ГЛМ неравновесного нули протонов, связанных с поверхностью мембраны в процессе их траяемзмбрэнного переноса показывает, что в мембранных системах митохондрий и хлороплястов сопряжение электронного транспорта и фосфорилировзшш может протекать по локальному механизму> без участия стадии переноса иопов

ВЫВОДЫ

водорода из одной объемной фззч в другую.

СПИСОК РАБОТ. ОПУЕДЖОВАННЫХ ПО ДИССЕРГЛЩГ»!

1. Ковбаснкк О.Н., Лнтоненко Я.Н., Ягуккнский JI.C. <1990) Реакции протошфовення -двпротошфования яигеряиииа - лимзтщзугзая стадия ионного транспорта. Еиол. Мембраны 7, I037--I044,

2. О.Н. Kovbasnjuk, Y.N. Antonenko nnd I..3. Yaguihinaky, (199.1) Proton diaaocintio from nigericin at the r,ewbrnno-v.:it?r intarfaoe, the rate-limiting step of K+/H+ exchange on the bil«y«r lipid cra-brane. FEBS Lett. 289, 176-178.

3. Y.N. Antonanko, O.N. Kovbasnjufc and Ь.З. Yaguzhinoky, (1953) Evidence in favor of the existence of a kinetic batri^r for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid rw»;nbrane to bulk water. Biochem. Biephye. Acta (in ргезз).

4. Ковбасшок О.Н., Антоненко Ю.Н., ЯгукотскиЯ JI.C. (IS93) Вдая-нио различных лшшдов на скорость катион/протонного ебчзяа, ипдуци--рованного неэлектрогеиными ионофэрами пигерикгаом и нокенспном. Биохимия (в печати).

Подписями t ;<вч.-.ти - ..j ¡-^ тод-з Ileuu.-ь офеггиля Уея.пвч.л. 0,9

3 > 57

Ротапринт НЛК'Л!

i/ocKta, Лвнингрл.зсний просп.

4"