Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотодинамическая инактивация ионных каналов, образованных мини-грамицидином в бислойной липидной мембране

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотодинамическая инактивация ионных каналов, образованных мини-грамицидином в бислойной липидной мембране"

□□347743 7 На правах рукописи

Дуцева Елена Андреевна

ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ ИОННЫХ КАНАЛОВ, ОБРАЗОВАННЫХ МИНИ-ГРАМИЦИДИНОМ В БИСЛОЙНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЕ

Специальность 03.00.02 - «Биофизика»

2 4 СЕН 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003477437

Работа выполнена в Научно-исследовательском Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В .Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Антоненко Юрий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Щагина Людмила Владимировна

доктор биологических наук, профессор Булычев Александр Александрович

Ведущая организация: Институт физической химии и

электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН

Защита состоится 15 октября 2009 года в 15ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 14 сентября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.501.001.96, доктор биологических наук, профессор

Т.Е.Кренделева /

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Взаимодействие пептидов с мембранами вызывает огромный интерес в связи с изучением антибактериальных пептидов как новых высокоэффективных антибиотиков, а также как модельная система для изучения процесса фолдинга мембранных белков. Антимикробный пентадекапептид грамицидин А (гА) был открыт и выделен в чистом виде более полувека назад. Показано, что при добавлении в водный раствор, омывающий бислойную липиднуто мембрану (БЛМ), грамицидин А самопроизвольно встраивается в БЛМ, образуя ионный канал, селективный к моновалентным катионам (Andersen and Коерре, 2007). Структура этого канала формируется двумя одиночными правозакрученными спиралями с шагом 6,3 аминокислотных остатка на виток, N-концы которых соединяются между собой водородными связями, так что при этом образуется трансмембранный димер. Канал грамицидина А представляет одну из самых популярных моделей биофизических исследований. Было установлено, что помимо указанной структуры, грамицидин А способен формировать в мембранах и другие структуры, например, двойную спираль. Последняя является доминирующей в большинстве органических растворителей и кристаллах грамицидина. Свойства ионных каналов, образованных двойной спиралью, изучены слабо. Грамицидин А широко применяется в биохимии как агент, выравнивающий ионные градиенты в биологических системах, в частности, как разобщитель окислительного фосфорилирования в митохондриях и хлоропластах. В то же время в ряде работ было показано, что его действие не сводится лишь к деполяризации мембраны. Помимо изучения грамицидина как простейшей модели ионного канала, проводятся также исследования аналогов этого пептида, направленные на изучение его антибактериального действия. К сожалению, применение грамицидина А как антибиотика сдерживается его высокой токсичностью по отношению к эукариотическим клеткам. Этот недостаток теоретически может быть преодолен путем поиска соответствующего аналога грамицидина. В этом

3

плане приобретает большое значение изучение функционирования различных аналогов грамицидина. Модификации грамицидина А путем присоединения к С-концу его аминокислотной последовательности ряда группировок обеспечили возможность изучения взаимодействия ионного канала с различными лигандами и явились основой для построения высокочувствительных мембранных биосенсоров (Cornell et al., 1997). Интересны также аналоги, которые имеют измененное по сравнению с грамицидином А число аминокислот как с С-конца, так и с N-конца. В частности в группе Керта (Arndt et al., 2001) был синтезирован аналог грамицидина А, укороченный на четыре аминокислоты с N-конца, который получил название мини-грамицидин (рис. 1). Было показано, что его активность на БЛМ существенно зависит от толщины мембраны. В настоящей работе мы провели систематическое исследование механизма работы мини-грамицидина и его ковалентного димера как на бислойных липидных мембранах, так и на липосомах и митохондриях.

Ранее в нашей лаборатории был разработан новый метод изучения грамицидина и его аналогов, основанный на сенсибилизированной фотоинактивации (Rokitskaya et al., 1996). Было показано, что этот метод позволяет получать уникальную информацию о кинетике функционирования каналов.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение механизма функционирования мини-грамицидиновых каналов в бислойной липидной мембране. В этой связи ставились следующие задачи:

1. Исследовать чувствительность индуцированной мини-грамицидином проводимости плоской бислойной липидной мембраны к освещению в присутствии фотосенсибилизатора.

2. Изучить кинетику сенсибилизированной фотоинактивации каналов ковалентного димера и мономера мини-грамицидина в плоских мембранах различного липидного состава.

3. Провести систематическое исследование активности каналов ковалентного димера и мономера мини-грамицидина как на плоских БЛМ, так и на липосомах и митохондриях.

4. Изучить параметры одиночных каналов мини-грамицидина в зависимости от толщины плоской мембраны.

5. Сформулировать и обосновать модель функционирования каналов мономера и ковалентного димера мини-грамицидина.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обнаружено, что механизм функционирования мини-грамицидина сходен с таковым для грамицидина А. Показано, что каналы, формируемые ковалентным димером мини-грамицидина, обладают большей чувствительностью к фотодинамическому воздействию, чем каналы мономера мини-грамицидина, что говорит о существенно различной структуре этих каналов.

При изучении кинетики сенсибилизированной фотоинактивации ковалентного димера мини-грамицидина в ответ на вспышку света четко продемонстрировано влияние толщины мембраны на функционирование каналов мини-грамицидина. Впервые с помощью измерения тока через плоскую бислойную мембрану показано, что ионофорная активность ковалентного димера мини-грамицидина связана с формированием им каналов двух типов. Полученные результаты существенно расширяют представление о работе ионных каналов, формируемых пептидами мономером и ковалентным димером мини-грамицидина в бислойных липидных мембранах. Данные нашей работы вносят вклад в решение фундаментальной проблемы - механизма функционирования ионных каналов в биологических мембранах.

Публикация и апробация работы. По результатам исследований опубликовано 5 работ, из них: одна в реферируемом научном российском журнале («Биологические мембраны»), одна в реферируемом зарубежном журнале (Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes) и 3 в тезисах конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах текста и включает Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение результатов и заключение, Выводы и Список цитируемой литературы из 124 ссылок. В работе содержится 41 рисунок.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и указаны ее цели и задачи.

В Литературном обзоре описаны структура и свойства ионного канала грамицидина А, факторы, влияющие на его функционирование в БЛМ. Проанализированы имеющиеся в литературе данные о влиянии толщины БЛМ на работу ионных каналов грамицидина А и его укороченного аналога мини-грамицидина. Проанализирован метод сенсибилизированной фотоинактивации ионных каналов в бислойных липидных мембранах. В Экспериментальной Части описаны объекты и методы исследования.

В работе был использован пептид мини-грамицидин и его ковалентный димер, которые были любезно предоставлены нам профессором Кертом (Рис.1). Измерения активности мини-грамицидина проводили как на плоских бислойных липидных мембранах, так и на липосомах.

Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали, используя модифицированный метод Мюллера-Рудина, на отверстии в тефлоновой перегородке, разделяющей два отсека с буферными растворами. Мембраны формировали из 2% раствора дифитаноилфофатидилхолина (ДФФХ) в н-декане или сквалене. Пептиды, если не оговорено особо, добавляли в ячейку с двух сторон мембраны. Для определения электрической проводимости БЛМ применяли метод фиксации напряжения. На мембрану подавали постоянную разность потенциалов, при этом с цис-стороны был потенциал заземления. В качестве фотосенсибилизатора использовали трисульфоалюмофталоцианин, который добавляли в ячейку с цис-стороны. Эксперименты, если не оговорено особо, проводились в буферном растворе с

pH 7, содержащем 100 мМ KCl, 10 мМ Трис, 10 мМ MES, при комнатной температуре (21-25°С).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее время изучено большое количество пептидов, которые при встраивании в бислойную липидную мембрану образуют ионные каналы. В модельных системах наиболее изучен ионный канал, образуемый гА, который продуцируется Bacillus brevis. Большой объем данных о гА получен методом регистрации одиночных каналов в БЛМ. Значительную информацию о свойствах грамицидиновых каналов удалось также получить с помощью метода фотосенсибилизированной инактивации (Rokitskaya et al., 1996). Изучение структурно-функциональных свойств гА позволило существенно продвинуться в понимании влияния мембраны на конформацию и свойства ионных каналов. В частности, была выдвинута концепция о зависимости свойств канала от соотношения между толщиной мембраны и длиной канала (Andersen and Коерре, 2007). Данная работа посвящена изучению процесса фотосенсибилизированной инактивации каналов, образованных аналогом антибиотика гА, мини-грамицидином, в бислойной липидной мембране. В работе исследованы свойства мини-грамицидина, последовательность которого укорочена на 4 аминокислоты с N-конца по сравнению с гА, но сохраняет все триптофановые остатки, которые, как известно, определяют чувствительность пептида к активным формам кислорода (рис.1).

HCOU'aWl-Ala-DUu-LAM-^ Грамицидин А

bA!^l>V¿llA'i]D-V^-I^Tr¡bD-Lfil-t-Tr^D-Uu-L-Trp-D-lj:u-L-Trp-KÍ!Gí:O(_r0S¡ ¡lBy)[% Миии-грмшцкдин

L-Ah-D-Vá-L.Vjl-D-Vsl-bT^D-Uii-l-Ttp-D-LíitUT^D-UíMijhNllO^CHjOSi (tBu) ft.

Мини-грамицидин кооленпшв ликер

Рис.1. Пептиды, изученные в настоящей работе.

Изучение ионофорной активности мини-грамицидина в БЛМ на уровне одиночных каналов

Для исследования проводящих свойств димера и мономера мини-грамицидина были поставлены опыты по измерению одиночных каналов. На рис. 2 (А) представлена типичная запись одиночных каналов димера мини-грамицидина в мембране, сформированной из дифитаноилфосфатидилхолина в декане. Одиночные каналы димера мини-грамицидина имели характерное время жизни около 10 мс. Проводимость одиночных каналов составляла 27 пС в 1 М KCl. При этом амплитуда каналов варьировала очень мало, что говорит о гомогенности проводящего состояния мини-грамицидина в этих условиях. При добавлении в мембрану холестерина время жизни каналов димера мини-грамицидина снижалось.

В аналогичных условиях (мембрана сформирована из раствора дифитаноилфосфатидилхолина в декане) время жизни каналов грамицидина А составляло около 1 с, проводимость 18 пС.

| ' и

Рис.2. Запись одиночных каналов ковалентного димера мини-грамицидина в БЛМ. Мембрана сформирована из раствора ДФФХ в декане (А) и ДФФХ в декане с холестерином (1:1) (Б). Приложенный потенциал 100 мВ.

Таким образом, время жизни каналов грамицидина А было в 100 раз больше времени жизни каналов димера мини-грамицидина.

Варьируя толщину мембраны путем использования различных

растворителей, мы попытались обнаружить другие проводящие формы пептидов на уровне одиночных каналов. Как известно, мембраны,

сформированные из раствора ДФФХ в декане, имеют большую толщину по сравнению с мембранами,

сформированными из раствора ДФФХ в сквалене, за счет того, что молекулы декана образуют прослойку между двумя монослоями липида (White, 1978). На рис. 3 приведены типичные записи каналов мини-грамицидина и его ковалентного димера в мембранах различного состава. Большой разброс в амплитудах как у димера мини-грамицидина, так и у мономера мини-грамицидина говорит о том, что пептиды в мембране формируют несколько различных проводящих состояний. Видно, что время жизни

Рис.3. Одиночные каналы

ковалентного димера мини- одиночных каналов ковалентного

грамицидина (записи А и Б) и димера мини-грамицидина в мономера (запись В).

Приведены записи каналов в скваленовых мембранах существенно

мембране, сформированной из больше> чем в декановых мембранах ( ДФФХ в декане (А) и ДФФХ в

сквалене (Б, В). время составило 6,5 е.).

Приложенный потенциал 100

мВ.

Обращает на себя внимание также наличие медленных флуктуаций тока, которые не вполне соответствуют представлениям о «поведении» тока при записи одиночных каналов. Это может быть связано с присутствием очень медленных проводящих состояний пептида, которые напоминают дестабилизирующее действие некоторых детергентов. По-видимому, в этих условиях встраивание пептида ведет к локальной нестабильности мембраны.

Кошцир гцня, юМ

Рис.4. Зависимость тока от

Рис. 4 показывает зависимость трансмембранного тока через БЛМ, сформированную из раствора ДФФХ в декане, от концентрации димера мини-грамицидина. Видно, что ток растет с ростом концентрации и в двойных логарифмических координатах данные хорошо аппроксимируются прямой с наклоном 1,8 ± 0,2. Этот результат свидетельствуют о том, что проводящая форма ковалентного

не

концентрации ковалентного

димера мини-грамицидина. ДимеРа мини-грамицидина

БЛМ сформирована из раствора мономер, а димер ковалентного ДФФХ в декане. Напряжение на мембране 30 мВ. димера.

Изучение свойств ионных каналов мини-грамицидина методом сенсибилизированной фотоинактивации

Ранее было показано, что освещение бислойной липидной мембраны видимым светом в присутствии фотосенсибилизатора приводит к уменьшению индуцированного грамицидином А электрического тока через БЛМ (Яокивкауа е1 а!., 1993). Поскольку в последовательности мини-грамицидина сохранены все триптофановые остатки грамицидина А,

следовало ожидать, что этот пептид также будет обладать фоточувствительностью.

На рис. 5 приведены кривые фотоинактивации для пептида мини-

грамицидина (кривая 1) и его ковалентного димера (кривая 2) в ответ на действие постоянного света. Оба пептида имеют выраженную фоточувствительность в присутствии алюмофталоцианина (А1Рс53). В случае ковалентного димера мини-грамицидина быстрый спад тока 250 завершался разрывом мембраны и (панель А на Рис.5). При освещении лампой меньшей мощности в случае димера мини-грамицидина

наблюдался спад тока без разрыва мембраны (панель Б). В этих условиях

фоточувствительность мономера мини-грамицидина уже была

О 20 40 60 80 100 120 140

I, с выражена слабо (кривая 1 на панели Б

Рис.5. Фоточувствительность мини- рИС'5)' Согласно полученным

грамицидина и его ковалентного данным, ковалентный димер

димера. Спад индуцируемого мини- _ ,

, Д обладает существенно большей

грамицидином (кривая 1) и его димером '

(кривая 2) тока через БЛМ при фоточувствительностью по

освещении мощной лампой (А) и при „

„ сравнению с мономером. Этот использовании лампы меньшей г г

мощности (Б). Мембрана сформирована результат резко контрастирует с

из раствора ДФФХ в сквалене

Напряжение на мембране 30 мВ.

1999), где было показано, что

полученным для гА (Котова и др., 1999), где было показано, что ковалентный димер грамицидина А

обладает существенно меньшей фоточувствительностью, чем мономер. Обнаруженное различие может объясняться различной глубиной расположения наиболее чувствительных триптофановых остатков гА и мини-грамицидина по отношению к границе раздела фаз мембрана-вода, поскольку генерация синглетного кислорода происходит преимущественно внутри мембраны (Lavi at al., 2002).

Исследование влияния толщины мембраны на характерное время фотоинактивации мини-грамицидина и его ковалентного димера

В наших экспериментах способность мини-грамицидина формировать каналы в мембране существенно зависела от толщины мембраны, в соответствии с данными Arndt et al. (2001).

А Б

Рис.6. Кинетика подавления тока, индуцированного гА (А) и мини-грамицидином (Б), в ответ на вспышку света в нулевой момент времени. Мембрана сформирована из раствора ДФФХ в сквалене. Серые линии соответствуют экспоненте с характерным временем 2,9 с (А), 2,6 с (Б). Потенциал на БЛМ 30 мВ.

Так, добавление даже очень высоких концентраций мономера мини-грамицидина (более 10 мкМ). не приводило к сколько-нибудь заметному увеличению тока в случае мембраны, сформированной из ДФФХ в декане, в отличие от данных, приведенных на Рис.6, где мембрана формировалась из раствора ДФФХ в сквалене. На рисунке 6 приведены кинетические кривые

А

В

Рис.7. Сенсибилизированная фотоинактивация каналов, образованных ковалентным димером мини-грамицидина (А, Б, В). Мембрана сформирована из раствора ДФФХ в декане (А), ДФФХ в гексадекане (Б), ДФФХ в сквалене (В). Серые линии соответствуют экспоненте с характерным временем 0,32 с (А), 1,5 с (Б), 21,8 с (В). Приложенный потенциал 30 мВ.

уменьшения тока, наблюдаемого после вспышки света, в случае гА (верхняя панель) и мономера мини-грамицидина (нижняя панель) в одинаковых условиях. Обращает на себя внимание существенно большая амплитуда фотоинактивации мини-грамицидина (около 20 %) по сравнению с полным пептидом (около 4 %). Кроме того, кинетика в случае мини-грамицидина была моноэкспоненциальной, тогда как в случае гА кинетика содержала две фазы, одна из которых имела характерное время существенно короче 1 с, и, по-видимому, соответствовала фазе повреждения димерных форм грамицидина в мембране. Вторая фаза имела характерное время 2,9 с, которое было близко к характерному времени фотоинактивации мини-грамицидина в этих условиях (2,6 с). На Рис. 7 приведена зависимость кинетики фотоинактивации

трансмембранного тока от толщины мембраны при ее модификации ковалентным димером мини-грамицидина.

Видно, что эта кинетика существенно зависела от толщины мембраны. В случае декановой мембраны кривая хорошо описывалась одной экспонентой с характерным временем 0,32 с (Рис.7, кривая 1). В случае мембраны, образованной из ДФФХ в сквалене, кинетика фотоответа содержала две компоненты: быструю фазу, которая составляла около 20% фотоответа и не разрешалась нашей установкой, а также медленную компоненту с характерным временем 21,8 с (Рис.7, кривая 3). На Рис.7, кривая 2, приведена кинетика фотоинактивации для мембраны, образованной из ДФФХ в гексадекане. Сравнение Рис.бБ и Рис.7В показывает, что кинетика фотоответа в случае ковалентного димера мини-грамицидина существенно медленнее по сравнению с мономером мини-храмицидина.

Изучение зависимости характерного времени фотоинактивации от величины индуцированного тока через мембрану для мини-грамицндина

На рисунке 8 показана зависимость характерного времени фотоинактивации от величины трансмембранного тока, индуцированного мономером мини-грамицидина (верхняя панель) и ковалентным димером мини-грамицидина (нижняя панель). В случае димера мини-грамицидина наблюдается увеличение т при увеличении тока, то есть замедление скорости процесса. Следует сказать, что естественным ответом системы, включающей несколько стадий, является ускорение реакции при увеличении концентрации реагента, поскольку увеличение концентрации приводит к увеличению скоростей протекания парциальных процессов.

Мы говорим об увеличении концентрации, поскольку увеличение трансмембранного тока связано с встраиванием все большего количества пептида в мембрану. В этой связи увеличение г в случае ковалентного димера мини-грамицидина говорит о том, что по мере роста тока происходит изменение самого механизма процесса индукции тока, что может быть

связано с формированием проводящих олигомеров пептида по мере роста его концентрации в мембране. В отличие от ковалентного димера мини-грамицидина, значение т для мономера мини-грамицидина падает с ростом концентрации. По аналогии с гА, было предположено, что механизм данной зависимости связан с димерной природой проводящего состояния пептида.

о

8 В

6fy> #<?°оо О <ь

0 1 L мкА з 4

Рис. 8. Зависимость характерного времени фотоинактивации от электрического тока через мембрану, сформированную из раствора РОРС и холестерина в декане для мини-грамицидина (А) и его ковалентного димера (Б). Буферный раствор содержал 1 M CsCl, 10 mM Tris, 10 тМ MES, рН=7. Приложенный потенциал 30 мВ.

На основе полученных нами данных мы вычислили константы формирования (kD) и распада (kR) и константу равновесия реакции димеризации мини-грамицидина (К) (таблица 1). Величина К мини-грамицидина (2,7*1013 моль"1 см2), рассчитанная из экспериментальных

данных, по порядку величины согласуется с литературными данными для грамицидина А (К = 12*1013 моль"1 см2).

Одиночные каналы для исследованных нами пептидов в мембранах сформированых из РОРС и холестерина, были измерены в работе Арндта и соавторов: одиночные каналы мини-грамицидина, которые регистрировались при низкой концентрации пептида, имели характерные времена жизни 210 мс. Время фотоинактивации, регистрируемое в наших опытах (при существенно больших концентрациях пептида), имело характерную величину 200 мс.

Таблица 1

kD, с' кц, с" моль' см К, моль"1 см'1

6.25 1,7*1014 2,7*101J

Сравнивая значение kD, которое можно оценить как величину, обратную времени жизни одиночного канала, с константой диссоциации димеров мини-грамицидина, оцененной из данных по фотоинактивации, можно видеть, что эти величины имеют близкие значения. Данные результаты указывают на тесную взаимосвязь характерного времени фотоинактивации и времени жизни канала мини-грамицидина и подтверждают димерную модель функционирования каналов мини-грамицидина.

В случае ковалентного димера мини-грамицидина время фотоинактивации существенно отличалось от времени жизни каналов, Одиночные каналы димера мини-грамицидина в этих условиях имели характерные времена жизни 245 мс (Arndt et al., 2001), в то время как т фотоинактивации имело характерную величину 30 мс (Рис.8.Б).

Ионофорная активность мини-грамицидина и грамицидина А в липосомах и митохондриях

Я 800

Представлялось важным

сравнить эффективность

формирования каналов для двух форм мини-грамицидина и грамицидина А. С этой целью сравнивали концентрации пептидов, необходимые для индукции одиночных каналов. Однако, такая оценка носит скорее качественный характер, поскольку процесс встраивания пептида в мембрану очень медленный и зависит от множества малоконтролируемых факторов, в частности, от условий перемешивания. Поэтому были поставлены опыты на липосомах, где

Рис.9. Зависимость мембранного

потенциала К+-нагруженных перераспределение пептида между

липосом, регистрируемого по раствором и мембранами везикул изменению флуоресценции

сафранина О (1 мкМ) при 580 нм, происходит сравнительно быстро.

от концентрации пептидов. А. Наши данные показывают, что Пример измерения потенциала

липосом при добавлении 0,01 мкМ способность пептидов индуцировать грамицидина А. Буферный раствор поток ионов калия через мембрану содержал 0,34 M сахарозы, 10 мМ

MES, 10 мМ Tris, pH 7. Длина уменьшается в ряду грамицидин А,

волны возбуждения 520 нм. Б. ковалентный димер мини-грамицидина Зависимость относительного

изменения флуоресценции и мономер мини-грамицидина.

сафранина от концентрации Большая эффективность гА по грамицидина А (кривая 1),

ковалентного димера мини- сравнению с мини-грамицидином

грамицидина (кривая 2) и мини- представляется вполне естественной, грамицидина (кривая 3).

ю-' ю-« [пептид], M

поскольку, как ранее указывалось, условием эффективного формирования проводящего состояния каналоформера в БЛМ является соответствие длины канала и гидрофобной толщины мембраны. Ковалентный димер мини-грамицидина проявляет меньшую эффективность индукции калиевой проводимости по сравнению с гА несмотря на то, что его первичная последовательность длиннее, чем последовательность гА. Этот результат свидетельствует о том, что природа проводящего состояния ковалентного димера мини-грамицидина отличается от таковой для гА и мини-грамицидина.

Также нами было изучено действие пептидов на мембранный потенциал митохондрий, измеряемый по флуоресценции сафранина (рис.10).

Рис.10. Действие грамицидина А (кривая 1), мини-грамицидина (кривая 3) и его ковалентного димера (кривая 2) на мембранный потенциал митохондрий, измеренный по тушению флуоресценции сафранина О (10 мкМ). Возбуждение 520 нм, регистрация 580 нм. Грамицидин А 0,2 мкМ, ковалентный димер мини-грамицидина 0,3 мкМ, мини-грамицидин 1,1 мкМ.

Сравнение полученных данных позволяет сказать, что мини-грамицидин более активен в липосомах, чем в митохондриях, что может быть связано с структурой внутренней мембраны митохондрий, в частности, с большей толщиной ее гидрофобной части по сравнению с мембранами липосом, приготовленных из яичного лецитина.

Обсуждение результатов и заключение

Основываясь на результатах зависимости характерного времени фотоинактивации от концентрации пептида (Рис. 8А), можно заключить, что проводящее состояние мини-грамицидина является димером как и в случае гА. Наиболее вероятной моделью формирования такого димера является структура, аналогичная канонической структуре ионного канала самого грамицидина А (трансмембранный димер из двух одиночных спиралей, соединенных водородными связями голова к голове). На это указывает, в частности, требование меньшей толщины гидрофобного слоя мембраны при индукции ионной проводимости данным пептидом.

Наши данные показывают, что механизм формирования проводящего состояния ковалентным димером мини-грамицидина существенно отличается как от формирования канала гА, так и формирования каналов ковалентным димером гА. Действительно, на это указывает:

1). Квадратичная зависимость трансмембранного тока от концентрации ковалентного димера мини-грамицидина (димер гА имеет линейную зависимость).

2). Высокая фоточувствительность ковалентного димера мини-грамицидина (в отличие от димера гА).

3). Рост времени фотоинактивации с увеличением концентрации ковалентного димера мини-грамицидина.

4). Большое различие времени жизни одиночного канала и времени фотоинактивации для ковалентного димера мини-грамицидина в одних и тех же условиях.

5). Зависимость проводимости от спонтанной кривизны липидов, формирующих мембрану.

6). Снижение времени жизни каналов при добавлении в мембрану холестерина.

7). Значительно меньшая чувствительность проводимости мембраны с встроенным каналоформером гА, но большая чувствительность, чем у димера гА.

Одиночные каналы димера мини-грамицидина, которые регистрировались при низкой концентрации пептида, имели время жизни около 10 мс, тогда как характерное время фотоинактивации, регистрируемой при существенно больших концентрациях пептида, имело величину порядка сотен миллисекунд. Можно предположить, что при низких концентрациях проводящая форма является одиночной спиралью пептида, в то время как при измерении фотоинактивации и измерении зависимости проводимости мембраны от концентрации димера (то есть при более высокой концентрации пептида) преобладающая проводящая форма - двойная спираль, которая образуется двумя ковалентными димерами мини-грамицидина (см. схему на Рис.11). Повышение времени фототоинактивации ковалентного димера мини-грамицидина можно объяснить увеличением вклада двойных спиралей в общий ток, предполагая, что двойная спираль имеет существенно большее время жизни по сравнению с одиночной спиралью. Эта модель предполагает, что одиночная спираль в мембране имеет время жизни около 0,01 с, а двойная спираль около 0,4 с. Следует сказать, что соотношение концентраций в мембране указанных форм в случае димера мини-грамицидина должно существенно зависеть от общей концентрации пептида в мембране, причем оно должно смещаться в пользу двойной спирали с ростом концентрации.

Рис.П. Схема взаимодействия пептида ховалентного димера

ми н и - грам и цидина

с

А

Б

мембраной, приводящего к формированию ионных

каналов. А. Условия измерения одиночных каналов, когда концентрация пептида в мембране мала. Показаны проводящие и непроводящие состояния. Б. Условия большой проводимости мембраны, когда форма димерной двойной спирали вносит основной вклад в проводимость мембраны.

ионных

Альтернативным объяснением различий между результатами измерениями одиночных каналах и фотоинактивации в случае димера мини-грамицидина является предположение о латеральной агрегации одиночных спиралей пептида при их высокой концентрации в мембране. Наблюдение большого разброса в амплитудах каналов димера мини-грамицидина говорит о том, что пептид б мембране формирует несколько различных проводящих состояний. Основываясь на этом, можно заключить, что в тонкой мембране дим ер из двух ко валентных димеров ми ни-грамицидина (тетрамер) превалировал над мономерной формой и такая димерная форма, являющаяся двойной спиралью, имела несколько проводящих канальных состояний. Нам представляется, что гипотеза о латеральной агрегации менее вероятна по сравнению с моделью формирования двойных спиралей при высокой концентрации пептида. В пользу последней говорит квадратичная зависимость проводимости мембраны от концентрации димера. Кроме того, в пользу димера говорят данные о возможности формирования такой структуры данным пептидом (Arndt et al., 2002), а также аналогия с поведением исходного пептида гА, который при наличии сильного несоответствия между толщиной мембраны и длиной канала формирует двойную спираль.

выводы

1. Различными методами изучено функционирование ионных каналов, формируемых пептидом мини-грамицидином и его ковалентным димером, в бислойных липидных мембранах.

2. Данные, полученные с помощью метода сенсибилизированной фотоинактивации, в совокупности с другими результатами позволили заключить, что механизм функционирования мини-грамицидина сходен с таковым для грамицидина А, а именно: ионный канал в бислойной липидной мембране формируется в результате образования димера голова к голове из двух одиночных спиралей.

3. Показано, что механизм функционирования ковалентного димера мини-грамицидина качественно отличен от механизма работы как грамицидина, так и ковалентного димера грамицидина. В его основе, по всей вероятности, лежит формирование двойной спирали пептида, что приводит к целому ряду особенностей функционального поведения пептида. В зависимости от условий проводящее состояние ковалентного димера мини-грамицидина в мембране существует либо в виде димера голова к голове, либо в виде двойной спирали, соотношение между которыми, по-видимому, определяется толщиной фосфолипидной мембраны.

4. Обнаружена высокая чувствительность димера мини-грамицидина к фотодинамическому воздействию, которая, по всей вероятности, является следствием другого механизма образования каналов и определяется более глубоким погружением в мембрану остатков триптофана по сравнению с канонической моделью работы грамицидина как одиночной спирали голова-к-голове.

5. Изучение зависимости ионофорного действия пептидов от толщины искусственной мембраны позволило объяснить различия их ионофорного действия на природных мембранах (митохондрии и эритроциты).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Elena A. Dutseva, Yuri N. Antonenko, Elena A. Kotova, Jochen R. Pfeifer and Ulrich Koert (2007) Sensitized photoinactivation of mmigramicidin channels in bilayer lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1768,1230-1237.

2. E.A. Дуцева, E.A. Котова, Ю.Н. Аитоненко (2008) Иоиофорная активность укороченного аналога грамицидина А в фосфолипидных бислоях и мембранах митохондрий и эритроцитов. Биологические мембраны, Т. 25, № 1, 58-65.

3. Y.N. Antonenko, Е.А. Dutseva, E.A. Kotova, J.R. Pfeifer, U. Koert (2005) Photodynamic inactivation of ion channels formed by mini-gramicidin in bilayer lipid membranes. 11th Congress of the European Society for Photobiology, Aix-les-Bains, France, September 3-8.

4. E.A. Дуцева, E.A. Котова, Ю.Н. Антоненко (2005) Фотодинамическая инактивация ионных каналов, образованных мини-грамицидином в бислойной липидной мембране, 4-й Съезд Фотобиологов России, Саратов, 26-30 сентября.

5. E.A.Dutseva, E.A.Kotova, J.R.Pfeifer, U.Koert, Y.N.Antonenko (2006) Ion channels formed by mini-gramicidin in bilayer lipid membranes. 14th European Bioenergetics Conference, Moscow, July 22-27.

о i ^

Напечатано о готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 10.09.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 471. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дуцева, Елена Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

X ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура и функция грамицидина А

1.1.1 Структура грамицидина А в органических растворителях

1.1.2 Структура грамицидина в липидных мембранах и мембрано-подобных средах

1.1.3 Ионный канал грамицидина А в бислойных липидных мембранах

1.2 Мини-грамицидин — укороченный аналог грамицидина А

1.3 Фотосенсибилизированная инактивация ионных каналов в бислойных липидных мембранах

1.3.1 Основы фотодинамической терапии

1 .3.2 Свойства фотосенсибилизаторов при фотодинамическом воздействии

1.3.3 Изучение кинетики распада-образования канала грамицидина А методом сенсибилизированной фотоинактивации

1.3.4 Метод определения констант формирования и распада каналов грамицидина в мембране, основанный на фотодинамическом воздействии

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 Растворы фосфолипидов для формирования БЛМ

2 Буферные растворы

3 Каналоформеры

4 Фотосенсибилизаторы

5 Ячейки и электроды

6 Формирование БЛМ

7 Источники света

8 Измерение электрического тока через мембрану

9 Измерение потенциала липосом по изменению интенсивности флуоресценции сафранина

10 Приготовление липосом

11 Выделение митохондрий и эритроцитов

12 Устройство мини-экструдера 52 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Одиночные каналы мини-грамицидина в липидной мембране

3.1.1 Изучение ионофорной активности мини-грамицидина в БЛМ на уровне одиночных каналов

3.1.2 Влияние толщины мембраны на образование одиночных каналов мини-грамицидина

3.2 Зависимость электрического тока от концентрации ковалентного димера мини-грамицидина

3.3 Изучение свойств ионных каналов мини-грамицидина методом сенсибилизированной фотоинактивации

3.3.1 Сравнение фоточувствительности мини-грамицидина и его ковалентного димера

3.3.2 Исследование кинетики фотоинактивации мини-грамицидина и его ковалентного димера в БЛМ

3.3.3 Исследование влияния толщины мембраны на характерное время фотоинактивации мини-грамицидина

3.3.4 Влияние толщины мембраны на характерное время фотоинактивации ковалентного димера мини-грамицидина

3.4 Факторы, влияющие на характерное время фотоинактивации мини-грамицидина

3.5 Влияние спонтанной кривизны липидов мембраны на ионофорную активность мини-грамицидина

3.6 Изучение зависимости характерного времени фотоинактивации от величины индуцированного тока через мембрану для мини-грамицидина

3.7 Ионофорная активность мини-грамицидина и грамицидина А в липосомах

3.8 Сравнение действия мини-грамицидина и грамицидина А на выделенные митохондрии

3.9 Действие мини-грамицидина и грамицидина А на эритроциты

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотодинамическая инактивация ионных каналов, образованных мини-грамицидином в бислойной липидной мембране"

Взаимодействие пептидов с мембранами вызывает огромный интерес в связи с изучением антибактериальных пептидов как новых высокоэффективных антибиотиков. Новые антимикробные вещества могут стать альтернативой известным антибиотикам, к большинству которых бактерии приобрели устойчивость. Антимикробные пептиды, хотя и несколько уступают "традиционным" антибиотикам по эффективности, обладают большей быстротой действия. Однако применять в клинике в качестве антибиотиков и противогрибковых средств можно только те пептиды, которые не разрушают клетки млекопитающих. К сожалению, большинство природных пептидов обладают, наряду с антимикробным, некоторым гемолитическим действием. Поэтому очень важно создать искусственные аналоги природных соединений, обладающие антибактериальной, но не имеющие гемолитической активности. Однако механизм действия пептидов до сих пор неясен, и в связи с этим направленный молекулярный дизайн весьма затруднителен.

Изучение взаимодействия пептидов с искусственными мембранами представляет большой интерес для понимания процессов фолдинга и работы мембранных белков в клетках, в том числе, механизмов функционирования ионных каналов. В модельных системах наиболее изучен ионный канал, образуемый антимикробным пептидом грамицидином А, который продуцируется Bacillus brevis. Большой объем данных о грамицидине А получен методом регистрации одиночных каналов в БЛМ. Значительную информацию о свойствах грамицидиновых каналов удалось также получить с помощью метода фотосенсибилизированной инактивации. Изучение структурно-функциональных свойств грамицидина А позволило существенно продвинуться в понимании влияния мембраны на конформацию и свойства ионных каналов. В частности, была выдвинута концепция о зависимости свойств канала от соотношения между толщиной мембраны и длиной канала.

Грамицидин А был выделен более полувека назад. Это пентадекапептид, формирующий в мембранах ионный канал, селективный к моновалентным катионам. Канал грамицидина А, представляющий по своей структуре димер голова к голове, является одним из самых популярных моделей биофизических исследований. Менее известно, что помимо данной структуры, грамицидин А способен формировать в мембранах и другие структуры, например двойную спираль, которая является доминирующей формой грамицидина в большинстве органических растворителей и в кристаллах. Свойства ионных каналов, имеющих такую структуру, изучены слабо.

Грамицидин А широко применяется в биохимии как агент, выравнивающий ионные градиенты на биологических мембранах, в частности как разобщитель окислительного фосфорилирования в митохондриях и хлоропластах. В то же время в ряде работ было показано, что его действие не сводится лишь к деполяризации мембраны. Так Ягужинский и соавторы на грамицидине, а Роттенберг и Кеппе на его аналоге показали, что грамицидин в определеных условиях способен разобщать окисление и фосфорилирование без воздействия на мембранный потенциал. Помимо изучения грамицидина как простейшей модели ионного канала, проводятся также исследования аналогов грамицидина, направленные на изучение его антибактериального действия. К сожалению, его применение как антибиотика сдерживается его высокой токсичностью по отношению к эукариотическим клеткам. Этот недостаток теоретически может быть преодолен путем поиска соответствующего аналога грамицидина. В этом плане приобретает большое значение изучение функционирования различных аналогов грамицидина.

Интересными модификациями грамицидина А являются его аналоги с измененным числом аминокислот как с С-, так и с N-конца. В частности в группе Керта был синтезирован аналог грамицидина, получивший название мини-грамицидин, который имел на четыре аминокислоты меньше с N-конца.

В экспериментах на бислойной липидной мембране было показано, что этот 7 укороченный аналог обладает большей активностью по сравнению с грамицидином А в мембранах меньшей толщины. Данный результат достаточно интересен, поскольку известно, что толщина мембраны может регулировать активность природных каналов.

В настоящей работе мы провели систематическое исследование механизма работы мини-грамицидина и его ковалентного димера как на бислойных липидных мембранах, так и на липосомах и митохондриях. Для достижения этой цели было проведено всестороннее изучение реконструированных в искусственные бислойные липидные мембраны ионных каналов мини-грамицидина и его ковалентного димера.

1 Обзор литературы

Исследования биологических мембран представляют собой одно из важнейших направлений современной биологии. Играя ключевую роль в регуляции потоков вещества, энергии и информации в клетке, мембраны вовлечены во все без исключения стороны ее жизнедеятельности. Важная функция мембраны заключается в осуществлении взаимодействия клеток с внешней средой, что выражается в переносе ионов и молекул через мембрану. Ионные каналы, обеспечивающие транспорт ионов через биологические мембраны, играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток и тканей организма.

Согласно жидко-мозаичной модели Сингера и Николсона (рис.1), мембрана состоит из бислоя липидных молекул, в который погружены белки, способные свободно диффундировать в нем.

Наше понимание функционирования биологических мембран во многом обязано методу моделирования биологических мембран, предложенному в 1962 году Мюллером и коллегами [1] (рис.2). Плоские липидные мембраны формируют в маленьком отверстии между двумя отсеками, заполненными водным раствором. В противоположных отсеках 8 размещают электроды. Этот метод позволяет формировать плоские липидные бислои макроскопических размеров, изучать их физические свойства и фиксировать изменения проводимости мембраны, индуцированные одиночными молекулами каналоформера.

Углевод

Гидрофобная область

Гидрофильная

Рис. 1. Схематическое изображение липидной мембраны, окружающей клетку. (Согласно жидко-мозаичной модели Сингера и Николсона [2]).

Огромное количество полученных к настоящему моменту данных свидетельствует о том, что природные ионные каналы представляют собой встроенные в липидную мембрану белковые структуры, в которых каждый домен выполняет определенную функцию. Ионные каналы - один из наиболее распространенных видов интегральных белков биологических мембран [3]. Их важной структурной особенностью является то, что, находясь в мембранном окружении, они формируют трансмембранные поры, существенно облегчающие перенос ионов и небольших полярных молекул в 9 область

Липидный бислой

Интегральный белок

Периферический белок клетку и из нее. Физиологическая значимость такого переноса, прежде всего, определяется обеспечением постоянного химического состава внутренней клеточной среды (гомеостаз), различных видов рецепции, сокращения мышц, генерации и распространения нервного импульса и др.

Тефлон к ^ . шОС тч ^

OCJf-p^Q

IX) <f ш ее

W\ ос

ОС ^Q ам ос ^о ОС ^о

БЛМ

Торус

ОС

Рис. 2. Образование плоской бислойной мембраны по методу Мюллера и др.

Калиевые и натриевые каналы играют огромную роль в функционировании возбудимых клеток, в том числе в генерации потенциала действия в нервных и мышечных волокнах, в обеспечении сердечной деятельности, поэтому нарушение их работы является причиной распространенных патологий, таких как многие наследственные заболевания.

Развитие представлений о функционировании мембранных каналов за последние десять лет в большой степени обусловлено фундаментальными открытиями, касающимися аквапориновых и ионных каналов. Открытие Питером Агрэ аквапориновых каналов и детальные структурные исследования калиевого канала KcsA из бактерий Streptomyces lividans Родериком МакКинноном являются выдающимися достижениями. Актуальность исследования ионных каналов была отмечена Нобелевским комитетом, который присудил Нобелевскую премию в 2003 году Питеру Агре и Родерику Маккиннону «за открытие структуры и механических свойств ионных каналов, а также за открытие водных каналов».

В 1998 году Родерик МакКиннон добился успеха в получении первой структуры высокого разрешения. Полученная картина структуры канала очень хорошо соответствовала многочисленным функциональным данным по работе калиевых каналов и впервые давала возможность понять, каким образом природа научилась пропускать ионы с высокой скоростью, сохраняя при этом высокую ионную селективность. Калиевый канал состоит из ионного фильтра (рисунок 3), который в каждый момент времени занят двумя ионами калия. Размеры фильтра точно соответствуют размерам ионов калия, и вследствие этого происходит их достаточно прочное связывание. Ионы проходят через канал по механизму эстафеты, когда связывание третьего катиона в фильтре приводит к высвобождению иона калия с противоположной стороны. Описанный механизм позволяет совместить высокую скорость с высокой избирательностью работы канала.

Вороги ыГг искан >им

Рисунок 3. Калиевый канал KcsA из бактерий Streptomyces lividans

1 I

Как было видно из полученной структуры, дизайн селективного фильтра приспособлен для ионов калия, не пропуская меньший по размеру ион натрия, что объясняет высокую калиевую селективность и высокую скорость транспорта. При более высоком разрешении гидратированный ион калия мог быть даже виден в «захваченном состоянии» с обеих сторон селективного фильтра, и стало ясно, что селективный фильтр состоит из непрерывного ряда К+-связывающих мест [4].

Рис. 4. Стереомодель полного KvAP канала и одной субъединицы. Тетрамер изображен с внутренней стороны мембраны (1) и повернутым на 90° относительно горизонтальной оси (2); каждая субъединица показана своим цветом. Одна из них представлена отдельно (3) и дана также в виде схемы (4), чтобы были отчетливее видны топология спиральных сегментов (S1-S6), соединяющих петель (83-петли, 54-55-линкера), поры (Р) и фильтра. Здесь же приведены остатки аргинина (R117, 120, 123, 126, 133), четыре из которых находятся в "лопасти" сенсора. Буквами С и N обозначены карбоксильный и аминный концы полипептидной цепи.

Последующие работы, выполненные в этой группе и еще нескольких группах, позволили понять структурные аспекты регуляции работы, т.е. открывания и закрывания, ионных каналов. За это свойство отвечает расположенная на противоположной стороне от ионного фильтра часть молекулы белка, которая имеет возможность осуществлять механические движения в ответ на приложение трансмембранного электрического поля или связывание молекулы лиганда. Самым подробным образом МакКинноном был изучен канальный белок KvAP, выделенный из архебактерии Аегоругит pernix. Его четыре одинаковые субъединицы окружают центральную проводящую ионы пору, стенки которой «облицованы» двумя гидрофобными спиральными сегментами - S5 и S6 - каждой субъединицы. Таких сегментов-спиралей, гибко соединенных между собой петлями, шесть. Вместе они составляют два разных функциональных участка - селективный фильтр (S5 и S6), определяющий ионную избирательность, и сенсор (S1-S4), реагирующий на изменение потенциала (рис.4). В этом структурном элементе особенно важны первые четыре остатка аргинина, несущие положительные заряды. За счет гибкости сочленения спиралей вся конструкция способна менять конформацию, чем обеспечивается закрытое или открытое состояние ворот и быстрый, избирательный перенос катионов. Мак-Киннон, исходя из своей структурной модели, предположил, что «лопасти», находящиеся на внутренней стороне мембраны, перемещаются к внешней стороне без какой-либо выстланной белком полости и переносят таким образом заряды через мембрану по направлению электрического поля.

Положение и передвижение «лопастей» было экспериментально подтверждено их связыванием с антителами, а также с помощью авидина, соединенного с биотином. Авидин, как гирька, подвешивается через ниточку биотина к «лопасти» и оттягивает ее (рис.5). Удалось измерить путь, который преодолевает каждая из них во время открывания ворот: он составляет примерно 20 А. Когда мембрана деполяризована (т.е. положительно заряжен ее внутренний слой), «лопасти» поворачиваются вверх, к внеклеточной жидкости, и канал открывается.

Рис. 5. Схема движения «лопастей» калиевого канала и их положение внутри мембраны, когда его ворота закрыты и открыты, и изменение структуры канала.

Если же этот слой приобретает отрицательный заряд, «лопасти» отгибаются в сторону, сжимая вход в пору, и канал оказывается закрытым. Следовательно, сенсор с его «лопастями» работает по весьма необычному принципу, основанному на присоединении гидрофобных катионов к рычагам, которые дают возможность мембранному электрическому полю выполнять механическую работу - открывать и закрывать проводящую ионы пору [5

В настоящее время исследования механизмов проводимости мембранных каналов находятся в центре внимания ведущих

10]. исследовательских групп различных стран мира. Несмотря на определенные успехи, достигнутые в этой области за последние годы, прежде всего, благодаря появлению современных методов структурного анализа, выделения и кристаллизации мембранных белков, фундаментальная проблема построения адекватной биофизической теории проводимости ионных каналов биологических мембран остается окончательно нерешенной.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дуцева, Елена Андреевна

Выводы

1. Различными методами изучена работа ионных каналов, формируемых пептидом мини-грамицидином и его ковалентным димером, в бислойных липидных мембранах.

2. Данные, полученные с помощью метода сенсибилизированной фотоинактивации, в совокупности с другими результатами позволили заключить, что механизм функционирования мини-грамицидина сходен с таковым у грамицидина А, а именно: ионный канал в бислойной липидной мембране формируется в результате образования димера голова к голове из двух одиночных спиралей.

3. Показано, что механизм функционирования ковалентного димера мини-грамицидина качественно отличен от механизма работы как грамицидина, так и ковалентного димера грамицидина. В его основе лежит формирование двойной спирали пептида, что приводит к целому ряду особенностей функционального поведения пептида. В зависимости от условий проводящее состояние ковалентного димера мини-грамицидина в мембране существует либо в виде димера голова к голове, либо в виде двойной спирали, соотношение между которыми, по-видимому, определяется толщиной фосфолипидной мембраны.

4. Обнаружена высокая чувствительность димера мини-грамицидина к фотодинамическому воздействию, которая, по всей вероятности, является следствием другого механизма образования каналов и определяется более глубоким погружением в мембрану остатков триптофана по сравнению с канонической моделью канала грамицидина как одиночной спирали из двух мономеров голова к голове.

5. Изучение зависимости ионофорного действия пептидов от толщины искусственной мембраны позволило объяснить различия их ионофорного действия на природных мембранах (митохондрии и эритроциты).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дуцева, Елена Андреевна, Москва

1. Mueller, P., Rudin, D.O., Tien, H.T., Wescott, W.C. (1963) Methods for the formation of single bimolecular lipid membrane in aqueous solution. J. Phys. Chem., 67, 534-535.

2. Singer, S.J., Nicolson, G.L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 720-731.

3. Твердислов, B.A., Тихонов, A.H., Яковенко, JI.B. (1987) Физические механизмы функционирования биологических мембран. М.: Изд-во МГУ, 350.

4. Антоненко, Ю.Н. (2004) Работы по структуре канальных белков увенчаны нобелевской премией. Биохимия, 69, 283-284.

5. MacKinnon, R. (2004) Potassium channels and the atomic basis of selective ion conduction (Nobel Lecture). 43, 4265-4277.

6. MacKinnon, R. (2003) Potassium channels. FEBS Lett., 555, 62-65.

7. Ruta, V., Chen, J., MacKinnon, R. (2005) Calibrated measurement of gating-charge arginine displacement in the KvAP voltage-dependent K+ channel. Cell, 123, 463-475.

8. Lee, S.Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. (2005) Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 15441-15446.

9. Lee, S.Y., MacKinnon, R. (2004) A membrane-access mechanism of ion channel inhibition by voltage sensor toxins from spider venom. Nature, 430, 232235.

10. Белянова, JI.П. (2004) Лауреаты Нобелевской премии 2003 года по химии. Природа, 1, 9-15.

11. Kelkar, D.A., Chattopadhyay, А. (2007) The gramicidin ion channel: a model membrane protein. Biochim. Biophys. Acta, 1768, 2011-2025.

12. Sarges, R., Witkop, B. (1965) Gramicidin A. V. The Structure of Valine- and Isoleucine-gramicidin A. J. Am. Chem. Soc., 87, 2011-2020.

13. Katz, E., Demain, A. L. (1977) The Peptide Antibiotics of Bacillus: Chemistry, Biogenesis, and Possible Functions. Bacteriological Reviews, 41, 449^74.

14. Овчинников, Ю.А., Иванов, B.T., Шкроб, A. M. 1974. Мембрано-активные комплексоны. «Наука», Москва, 40-47.

15. Wallace, В.А. (1990) Gramicidin channels and pores. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 19, 127-157.

16. Sarkar, N., Langley D., Paulus, H. (1977) Biological function of gramicidin: Selective inhibition of RNA polymerase. Biochemistry, 74, 1478-1482.

17. Myers, V.B., Hay don, D.A. (1972) Ion transfer across lipid membranes in the presence of gramicidin A. II. The ion selectivity. Biochim. Biophys. Acta, 274, 313-322.

18. Duax, W.L., Pletnev, V., Burkhart, В. M. (2003) Mechanism of ion transport and gating in gramicidin nanotubes. J. Mol. Struct., 647, 97-111.

19. Veatch, W.R., Fossel, E.T., Ovchinnikov, Y.A., Boult, E.R. (1974) A 13C nuclear magnetic resonance study of gramicidin A in monomer and dimer forms. Biochemistry, 13, 5264-5275.

20. Veatch, W.R., Fossel, E.T., Boult, E.R. (1974) The conformation of gramicidin A, Biochemistry, 13, 5249-5256.

21. Veatch, W. R., Blout, E.R. (1974) The aggregation of gramicidin A in solution. Biochemistry, 13, 5257-5263.

22. Braco, L., Abad, C., Campos, A., Figueruelo, J.E. (1986) Time-Dependent monomerization of gramicidin A, enhanced by phosphatidylcholine in non-polar solvents. An HPLC and spectro-fluorometric study. J. Chromatogr., 353, 181-192.

23. Salom, D., Abad, C. (1996) Chromatographic purification and characterization of the synthetic tryptophan-substituted gramicidin A analogs. J. Chromatogr., 725, 315-322.

24. Chen, Y., Wallace, B.A. (1997) The effects of calcium ions on double helicalforms of gramicidin. Eur. Biophys. J., 26, 299-306.105

25. Arseniev, S., Barsukov, I.L., Bystrov, V.F. (1985) NMR solution structure of gramicidin A complex with Cs+. FEBS Lett., 180, 33-39.

26. Sychev, S.V., Sukhanov, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1996) Structural Polymorphism of Gramicidin A Channels: Ion Conductivity and Spectral Studies. J. Pept. Sci.,2, 141-156.

27. Kovacs, F., Quine, J., Cross T. A. (1999) Validation of the single-stranded channel conformation of gramicidin A by solid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7910-7915.

28. Wallace, B.A., Veatch, W.R., Boult, E.R. (1981) Conformation of gramicidin A in phospholipid vesicles: circular dichroism studies of effects of ion binding, chemical modification, and lipid structure. Biochemistry, 20, 5754-5760.

29. Weinstein, S., Durkin, J.T., Veatch, W. R., Boult, E.R. (1985) Conformation of the gramicidin A channel in phospholipid vesicles: a fluorine-19 nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 24, 4374-4382.

30. Weinstein, S., Wallace, B.A., Boult, E.R, (1979) Conformation of gramicidin A channel in phospholipid vesicles: a 13C and 19F nuclear magnetic resonance study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4230-4234.

31. Weinstein, S., Wallace, B.A. (1980) Conformation of the gramicidin A transmembrane channel: A 13C nuclear magnetic resonance study of 13C-enriched gramicidin in phosphatidylcholine vesicles. J. Mol.Biol., 143, 1-19.

32. Urry, D.W. (1971) The gramicidin A transmembrane channel: a proposed % (L,D) helix. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 672-676.

33. Urry, D.W., Trapane, T.L., Prasad, K.U. (1983) Is the gramicidin A transmembrane channel single stranded or double stranded helix? A simple unequivocal determination. Science, 221, 1064-1067.

34. Venkatachalam, C.M., Urry, D.W. (1983) Theoretical conformational analysis of the gramicidin A transmembrane channel. I. Helix sense and energetics of head-to-head dimerization. J. Comput. Chem., 4, 461-469.

35. Wallace, B.A. (1986) Structure of Gramicidin A. Biophys. J., 49, 295-306.

36. Bystrov, V.F., Arseniev, A.S. (1988) Diversity of the gramicidin A spatial structure-two-dimensional H*-NMR study in solution. Tetrahedron, 44, 925-940.

37. Veatch, W. R., Mathies, R., Eisenberg, M., Stryer, L. (1975) Simultaneous fluorescence and conductance studies of planar bilayer membranes containing a highly active and fluorescent analog of gramicidin A. J. Mol. Biol., 99, 75-92.

38. Veatch, W.R., Styer, L. (1977) Effect of cholesterol on the rotational mobility of diphenylhexatriene in liposomes: a nanosecond fluorescence anisotrophy study. J. Mol. Biol., 117, 1109-1113.

39. Purrucker, O., Hillebrandt, H., Adlkofer, К., Tanaka, M. (2001) Deposition of highly resistive lipid bilayer on silicon-silicon dioxide electrode and incorporation of gramicidin studied by an impedance spectroscopy. Electrochim. Acta, 47, 791798.

40. Pascal, S.M., Cross, T.A. (1993) High-resolution structure and dynamic implications for a double-helical gramicidin A conformer. J. Biomol. NMR, 3, 495-513.

41. Andersen, O.S., Koeppe, R.E. (1996) Engineering the gramicidin channel. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 25, 231-258.

42. Arseniev, A.S., Barsukov, I.L., Bystrov, V.F., Lomize, A.L., Ovchinnikov Yu.A. (1985) H-NMR study of gramicidin A transmembrane ion channel. Head-to-head right-handed, single-stranded helices. FEBS Lett., 186, 168-174.

43. Cotten, M., Tian, C., Busath, D.D., Shirts, R.B., Cross, T.A. (1999) Modulating dipoles for structure-function correlations in the gramicidin A channel. Biochemistry, 38, 9185-9197.

44. Hladky, S.B., Haydon, D.A. (1984) Ion Movements in Gramicidin Channels. Curr. Topics inMembr. Transport, 21, 327-372.

45. Ring, A. (1996) Gramicidin channel-induced lipid membrane deformation energy: influence of chain length and boundary conditions. Biochim. Biophys. Acta, 1278, 147-159.

46. Hu, W., Lee, K.C., Cross, Т.A. (1993) Tryptophans in membrane proteins: indole ring orientations and functional implications in the gramicidin channel. Biochemistry, 32, 7035-7047.

47. Ни, W., Cross, T. A. (1995) Tryptophan hydrogen bonding and electric dipole moments: functional roles in the gramicidin channel and implications for membrane proteins. Biochemistry, 34, 14147-14155.

48. Mukherjee S., Chattopadhyay A. (1994) Motionally restricted tryptophan environments at the peptide-lipid interface of gramicidin channels. Biochemistiy, 33, 5089-5097.

49. Finkelstein, A., Andersen, O.S. (1981) The gramicidin A channel: a review of its permeability characteristics with special reference to the single-file aspect of transport. J. Membr. Biol., 59, 155-171.

50. Schagina, L.V., Grinfeldt, A.E., Lev, A.A. (1978) Interaction of cation fluxes in gramicidin A channels in lipid bilayer membranes. Nature, 273, 243-245.

51. Rosenberg, P.A., Finkelstein, A. (1978) Interaction of ions and water in gramicidin A channels: streaming potentials across lipid bilayer membranes. J. Gen. Physiol., 72, 327-340.

52. Etchebest, C., Pullman, A. (1986) The gramicidin A channel: energetics and structural characteristics of the progression of a sodium ion in the presence of water. J. Biomol. Struct. Dynamics, 3, 805-825.

53. Sychev, S.V., Barsukov, L.I., Ivanov, V.T. (1993) The double тете5,6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes. Eur. Biophys. J., 22, 279-288.

54. Galbraith, T.P., Wallace, B.A. (1998) Phospholipid chain length alters the equilibrium between pore and channel forms of gramicidin. Faraday Discuss. Ill, 159-164.

55. Hladky, S.B., Haydon, D. A. (1970) Discreteness of Conductance Change in Bimolecular Lipid Membranes in Presence of Certain Antibiotics. Nature, 225, 451-453.

56. Hladky, S.B., Haydon, D. A. (1972) Ion Transfer across Lipid-Membranes in Presence of Gramicidin A. I. Studies of Unit Conductance Channel. Biochim. Biophys. Acta, 274, 294-312.

57. Neher, E., Eibl, E. (1977) The influence of phospholipids polar groups on gramicidin channels. Biochim. Biophys. Acta, 464, 37-44.

58. Frohlich, O. (1979) Asymmetry of the gramicidin channel in bilayer of asymmetric lipid composition: I. Single channel conductance. J. Membrane Biol., 48, 365-383.

59. Frohlich, O. (1979) Asymmetry of the gramicidin channel in bilayer of asymmetric lipid composition: II. Voltage dependence of dimerization. J. Membrane Biol., 48, 385-401.

60. Bamberg, E., Lauger, P. (1973) Channel formation kinetics of gramicidin A in lipid bilayer membranes. J. Membrane Biol, 11, 177-194.

61. Elliott, J.R., Needham, D., Dilger, J.P., Haydon, D.A. (1983) The effects of bilayer thickness and tension on gramicidin single-channel lifetime. Biochim. Biophys. Acta, 735, 95-103.

62. Subczynski, W.K.,Wisniewska, A., Yin, J.J., Hyde, J.S., Kusumi, A. (1994) Hydrophobic barriers of lipid bilayer membranes formed by reduction of water penetration by alkyl chain unsaturation and cholesterol. Biochemistry, 33, 76707681.

63. Dumas, F., Lebrun, M.C., Tocanne, J.F. (1999) Is the protein lipid hydrophobic matching principle relevant to membrane organization and functions? FEBS Lett., 458, 271-277.

64. Killian, J.A. (1998) Hydrophobic mismatch between proteins and lipids in membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1376, 401-416.

65. Mobashery, N., Nielsen, C., Andersen, O. S. (1997). The conformational preference of gramicidin channels is a function of lipid bilayer thickness. FEBS Lett., 412, 15-20.

66. Szabo, G., Urry, D.W. (1979) N-acetyl gramicidin: single-channel properties and implications for channel structure. Science, 203, 55-57.

67. Cornell, B.A., Braach-Maksvytis, V.L., King, L.G., Osman, P.D., Raguse, В., Wieczorek, L., Pace, R.J. (1997) A biosensor that uses ion-channel switches. Nature, 387, 580-583.

68. Rokitskaya, T.I., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A. (2003) Tandem gramicidin channels cross-linked by streptavidin. J. Gen. Physiol., 121, 463-476.

69. Krylov, A.V., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A., Rokitskaya, T.I., Yaroslavov, A.A. (1998) Polylysine decelerates kinetics of negatively charged gramicidin channels as shown by sensitized photoinactivation. FEBS Lett., 440, 235-238.

70. Antonenko, Y.N., Borisenko, V., Melik-Nubarov, N.S., Kotova, E.A., Woolley, G.A. (2002) Polyanions decelerate the kinetics of positively charged gramicidin channels as shown by sensitized photoinactivation, Biophys. J., 82, 1308-1318.

71. Antonenko, Y.N., Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Reznik, G.O., Sano, Т., Cantor, C.R. (2004) Effect of streptavidins with varying biotin binding affinities on the properties ofbiotinylated gramicidin channels. Biochemistry, 43, 4575-4582.

72. Arndt, H.D., Knoll, A. Koert, U. (2001) Synthesis of minigramicidin ion channels and test of their hydrophobic match with the membrane. Chembiochem., 2, 221-223.

73. Arndt, D., Bockelmann, D., Knoll, A., Lamberth, S., Griesinger, C. (2002) Cation control in functional helical programming: structure of a D,L-peptide ion channel. Angew. Chem. Int. Ed., 41, 4062-4065.

74. Arndt, D. (2002) Oligo-Pyrrolidine und Cyclohexyl-d-Aminosauren-Potentielle chemische Nukleasen und Sekundarstruktur-bildende Baueinheiten ftir ionenselektive Kationenkanale. Doktorarbeit, Humboldt-Universitat, Berlin.

75. Kourie, J.I. (1998) Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms. Am. J. Physiol., 275, 1-24.

76. Stark, G. (2005) Functional consequences of oxidative membrane damage. J. Membr. Biol., 205, 1-16.

77. Stra(31e, M., Stark, G. (1992) Photodynamic inactivation of an ion channel: gramicidin A. Photochem. Photobiol., 55, 461-463.

78. Rokitskaya, T.I., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A. (1993) The interaction of phthalocyanine with planar lipid bilayers photodynamic inactivation of gramicidin channels. FEBS Lett., 329, 332-335.

79. Rokitskaya, T.I., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A. (1996) Photodynamic inactivation of gramicidin channels: a flash-photolysis study. Biochim. Biophys. Acta, 1275, 221-226.

80. Kunz, L., Zeidler, U., Haegele, K., Przybylski, M., Stark, G.(1995) Photodynamic and radiolytic inactivation of ion channels formed by gramicidin A: oxidation and fragmentation. Biochemistry, 34, 11895-11903.

81. Strapie, M., Stark, G., Wilhelm, M. (1987) Effects of ionizing radiation on artificial (planar) lipid membranes. I. Radiation inactivation of the ion channel gramicidin A. Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med., 51, 265-286.

82. Strapie, M., Stark, G., Wilhelm, M., Daumas, P., Heitz, F., Lazaro, R. (1989) Radiolysis and photolysis of ion channels formed by analogues of gramicidin Awith a varying number of tryptophan residues. Biochim. Biophys. Acta, 980, 305314.

83. Sobko, A.A., Vigasina, M.A., Rokitskaya, T.I., Kotova, E.A., Zakharov, S.D., Cramer, W.A., Antonenko, Y.N.(2004) Chemical and photochemical modification of colicin El and gramicidin A in bilayer lipid membranes. J. Membr. Biol., 199, 51-62.

84. Pooler, J.P., Valenzeno, D.P. (1979) The role of singlet oxygen in photooxidation of excitable cell membranes. Photochem. Photobiol., 30, 581-584.

85. Dubbelman, T.M., Van Steveninck, J. (1984) Photodynamic effects of hematoporphyrin-derivative on transmembrane transport systems of murine L929 fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta, 771, 201-207.

86. Foote, C. S. (1981) In Oxygen and Oxy-radicals in Chemistry and Biology (Rodgers, M. A. J. and Powers, E. L., Eds.), Academic Press, New York, 425-440.

87. Lavi, A., Weitman, H., Holmes, R.T., Smith, K.M., Ehrenberg, B. (2002) The depth of porphyrin in a membrane and the membranes physical properties affect the photosensitizing efficiency. Biophys. J., 82, 2101-2110.

88. Oleinick, N.L., Morris, R.L., Belichenko, I. (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why and how. Photochem. Photobiol. Sci., 1, 1-21.

89. Красновский, A.A. (1990) Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения. Итоги Науки и Техники, Серия Современные Проблемы Лазерной Физики, 3, 63-13.

90. Bonnett, R. (1995) Photosensitizers of the porphyrin and phthalocyanine series for photodynamic therapy. Chem. Soc. Rev., 24, 19-33.

91. Лукьянец, E.A. (1998) Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Рос. хим. журнал, 42, 9-16.

92. Sobolev, A.S., Jans, D.A., Rosenkranz, А.А. (2000) Targeted intracellular delivery of photosensitizers. Prog. Biophys. Mol. Biol., 73, 51-90.

93. Антоненко, Ю.Н., Котова, Е.А., Рокицкая, Т.И. (2005) Фотодинамическое воздействие как основа релаксационного метода изучения грамицидиновых каналов. Биол. Мембраны, 22, 275-289.

94. Woolley, G.A., Kapral, М.К., Deber, С.М. (1987) Potential-sensitive membrane association of a fluorescent dye. FEBS Lett., 224, 337-342.

95. White, S.H. (1978) Formation of «solvent-free» black lipid bilayer membranes from glyceryl monooleat e dispersed in squalene. Biophys. J., 23, 337-347.

96. Lundbaek, J. A., Bim, P., Girshman, J., Hansen, A. J., Andersen, O. S. (1996) Membrane stiffness and channel function. Biochemistry, 35, 3825-3830.

97. Greathouse, D.V., Hinton, J.F., Kim, K.S., Koeppe, R.E. II (1994) Gramicidin A/Short-Chain Phospholipid Dispersions: Chain Length Dependence of Gramicidin Conformation and Lipid Organization. Biochemistry, 33, 4291-4299.

98. Котова, E.A., Рокицкая, Т.Н., Антоненко, Ю.Н. (1999) Две фазы фотоинактивации грамицидина в бислойной липидной мембране в присутствии фотосенсибилизатора. Биол. Мембраны, 16, 336-343.

99. Lavi, A., Weitman, Н., Holmes, R.T., Smith, К.М., Ehrenberg, В. (2002) The depth of porphyrin in a membrane and the membrane's physical properties affect the photosensitizing efficiency. Biophys. J., 82, 2101-2110.

100. Rokitskaya, T.I., Block, M., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A., Pohl, P. (2000) Photosensitizer binding to lipid bilayers as a precondition for the photoinactivation of membrane channels. Biophys. J., 78, 2572-2580.

101. Chernyshev, A., Armstrong, K.M., Cukierman, S. (2003) Proton transfer in gramicidin channels is modulated by the thickness of monoglyceride bilayers. Biophys. J., 84, 238-250.

102. Bamberg, E., Lauger, P. (1973) Temperature-dependent properties of gramicidin A channels. Biochim. Biophys. Acta, 367, 127-133.

103. Ramsammy, L.S., Brockerhoff, H. (1982) Lysophosphatidylcholine-cholesterol complex. J. Biol.Chem., 257, 3570-3574.

104. Kagan, V.E. (1989) Tocopherol stabilizes membrane against phospholipase A,free fatty acids, and lysophospholipids. AnnN.Y. Acad. Sci., 570, 121-135.113

105. Besterman, J.M., Domanico, P.L. (1992) Association and metabolism of exogenously-derived lysophosphatidylcholine by cultured mammalian cells: kinetics and mechanisms. Biochemistry, 7, 2046-2056.

106. Lundbaek, J.A., Andersen, O.S. (1994) Lysophospholipids modulate channel function by altering the mechanical properties of lipid bilayers. J. Gen. Physiol. 104, 645-673.

107. Chernomordik, L.V., Lekina, E., Frolov, V., Bronk, P., Zimmerberg, J. (1997) An early stage of membrane fusion mediated by the low pH conformation of influenza hemagglutinin depends upon membrane lipids. J. Cell. Biol., 136, 81-93.

108. Bruno, M.J, Koeppe, R. E. II., Andersen, O.S. (2004) Modification of gramicidin channel function by poly-unsaturated fatty acids. Biophys. J., 48th Annual Meeting Biophysical Society, 1988-Pos.

109. Matsuzaki, K. (1999) Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochim. Biophys. Acta, 1462, 1-10.

110. Lougheed, Т., Borisenko, V., Hand, С. E., Woolley, G. A. (2001) Fluorescent gramicidin derivatives for single-molecule fluorescence and ion channel measurements. Bioconjug. Chem., 12, 594-602.

111. Rottenberg, H., Koeppe, R.E. (1989) Mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation by gramicidin. Biochemistry, 28, 4355-4360.

112. Bunting, J.R. (1992) Influx and efflux kinetics of cationic dye binding to respiring mitochondria. Biophys. Chem., 42, 163-175.

113. Pratap, P.R., Novak, T.S., Freedman, J.C. (1990) Two mechanisms by which fluorescent oxonols indicate membrane potential in human red blood cells Biophys. J., 57, 835-849.

114. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. (1975) Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers. Biochim. Biophys. Acta, 394, 323-334.

115. Samsonov, A.V., Mihalyov, I., Cohen, F.S. (2001) Characterization of cholesterol-sphingomyelin domains and their dynamics in bilayer membranes. Biophys. J., 81, 1486-1500.

116. Killian, J.A. (1992) Gramicidin and gramicidin-lipid interactions. Biochim. Biophys. Acta, 1113, 391-425.

117. Partenskii, M. В., Miloshevsky, G. V., Jordan, P. C. (2004) Membrane inclusions as coupled harmonic oscillators: effects due to anisotropic membrane slope relaxation. J. Chem. Phys., 120, 7183-7193.

118. Harroun, T.A., Heller, W.T., Weiss, T.M., Yang, L., Huang, H.W. (1999) Theoretical analysis of hydrophobic matching and membrane-mediated interactions in lipid bilayers containing gramicidin. Biophys. J., 76, 3176-3185.

119. Goforth, R. L., Chi, A. K., Greathouse, D. V., Providence, L. L., Koeppe, R. E., Andersen, O. S.(2003) Hydrophobic coupling of lipid bilayer energetics to channel function. J. Gen. Physiol., 121, 477-493.

120. Rokitskaya, T.I., Antonenko, Y.N., Kotova, E.A. (2003) Tandem gramicidin channels cross-linked by streptavidin. J. Gen. Physiol., 121, 463-476.