Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой полости и кожи человека
ВАК РФ 03.00.16, Экология
Автореферат диссертации по теме "Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой полости и кожи человека"
На правах рукописи
Тучина Елена Святославна
ОЦЕНКА ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ IN VITRO НА БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ И КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
03.00.16-экология 03.00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
0 5 ДЕК 2008
Саратов - 2008
003454253
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» на кафедре микробиологии и физиологии растений
Научный руководитель -
доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна
Официальные оппоненты -
доктор биологических наук, профессор Коннова Светлана Анатольевна
доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович
Ведущая организация •
ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет Росздрава», г. Саратов
Защита состоится «18» декабря 2008 г. в 12.00 ч. на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83; E-mail. biosovet(ai,ssii ru
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «СГУ им. Н Г. Чернышевского».
Автореферат разослан «Г7» ноября 2008 г. Ученый секретарь ¿я» Л
диссертационного совета С.А. Невский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Нормальная микрофлора представляет собой неотъемлемую часть макроорганизма и играет важную роль в поддержании его гомеостаза (Шендеров, 1994, 1998; Белобородова, 1998; Грачева и др., 2006). Большинство имеющихся в современной литературе работ посвящены детальному изучению микробного сообщества желудочно-кишечного тракта человека и животных в норме и при различных патологических состояниях (Доронин, Шендеров, 2002; Ильина, 2006). Не менее значимо состояние микрофлоры таких биотопов как ротовая полость и кожа, индивидуальная и анатомическая специфичность состава микроорганизмов которых способствует обеспечению колонизационной резистентности организма в целом (Митрохин, 1998; Ильин и др., 2005) Изменения в видовом составе и количественных показателях микробного сообщества под влиянием внешних или внутренних факторов могут привести к нарушению функционирования макроорганизма (Нетрусов, 2004; Тихомирова, 2007). Разработка методических подходов к оценке адаптационного потенциала бактерий, в том числе и представителей микробоценозов организма человека, а также выбор параметров и характеристик, наиболее полно отражающих состояние отдельных микробных популяций на фоне действия стрессовых факторов различной природы являются актуальными задачами экологии микроорганизмов (Митрохин, 2000; Нетрусов, 2004). Для оценки действия стрессовых факторов физической природы (в том числе антропогенного характера) на микроорганизмы многие авторы исследуют изменение их жизнеспособности: по количеству колониеобразующих единиц - КОЕ, оптической плотности бактериальных суспензий, хемилюминесценции микробных клеток (Фомичев др., 1991; Страховская и др , 2002, Malik, 1992; Shrivastava, 2007). В то же время использование традиционных микробиологических методов (описание морфологии клеток и колоний, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств) в экологических исследованиях позволяет объективно оценить w vino состояние микробных популяций.
В настоящее время в клинической практике и биомедицинских исследованиях широко используется оптическое излучение различного спектрального состава (400 - 420, 600 - 660, 800 - 850 нм) для лечения гнойно-воспалительных заболеваний бактериальной природы, а также при физиотерапевтических и косметических процедурах (Тучин, 1998; Ovchinnikov et al., 2000; Hamblin, Hasan, 2004). Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ) является альтернативой антибиотикотерапии и заключается в избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии красителя - фотосенсибилизатора и света с определенной длиной волны. Контролируемый эффект действия светового и лазерного излучения может быть использован и для коррекции численности определенного вида бактерий в составе нормальной микрофлоры при явлениях дисбиоза, поскольку применение антимикробных препаратов в таких случаях не допустимо. Однако данные о реакциях нормальной микрофлоры на действие различных типов излучений, используемых в ФДТ, практически отсутствуют, а их по-
лучение представляет значительный научный интерес и может иметь прикладное значение.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в оценке действия светодиодного синего, красного и лазерного инфракрасного излучений в сочетании с фотосенсибилизаторами на бактерии, представляющие нормальную микрофлору кожи и ротовой полости.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.
1. Определить оптимальные условия применения фотосенсибилизаторов (необходимую концентрацию, время инкубации и облучения) при фотодинамическом воздействии на бактерии, представляющие нормальную микрофлору макроорганизма.
2. Изучить влияние светодиодного синего (405 нм), красного (660 нм) и лазерного инфракрасного (810 нм) излучений в сочетании с фотодинамическими красителями (метиленовым синим, индоцианином зеленым) на жизнеспособность, относительную численность популяций, культуральные свойства и морфологические характеристики бактерий ротовой полости.
3. Выявить чувствительность бактерий микробоценоза кожи к действию светодиодного синего (405 нм), красного (625 нм), комбинированного (405, 625 нм) и лазерного инфракрасного (805 нм) излучений в сочетании с фотодинамическими красителями (метиленовым синим, индоцианином зеленым) и оценить изменения их морфологических и физиологических характеристик.
4. Отобрать наиболее информативные показатели изменения w vitro состояния популяций бактерий, представляющих нормальную микрофлору, и характеристики их адаптационного потенциала при фотодинамическом воздействии.
Научная новизна Впервые проведено исследование in vitro влияния на бактерии, представляющие нормальную микрофлору организма человека, лазерного и светодиодного излучения с параметрами, используемыми при ФДТ в медико-биологической практике. Показано изменение жизнеспособности, относительной численности популяций, морфологии клеток и культуральных свойств бактерий микробоценоза ротовой полости под влиянием светодиодного синего (405 нм), красного (660 нм) и лазерного инфракрасного (810 нм) излучения. Исследованы изменения количественных показателей, морфологических и физиологических характеристик бактерий микробоценоза кожи под действием этих излучений. Выявлены особенности действия света на бактериальные клетки, обработанные фотосенсибилизаторами (метиленовым синим и индоцианином зеленым). Впервые разработан комплекс наиболее информативных показателей, позволяющий объективно оценить in vitro состояние микробных популяций кожи и ротовой полости на фоне действия разных типов излучения.
Практическая значимость Разработаны и методически обоснованы подходы к изучению влияния различных типов излучения на бактерий - представителей нормальной микрофлоры, которые могут быть рекомендованы к применению в практике биологических и медицинских исследований Определены условия обработки бактериальных клеток растворами фотосенсибилизаторов, их концентрация и длительность предварительной инкубации. Выявлены парамет-
ры светодиодного и лазерного излучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности определенных микроорганизмов. Предложен комплекс микробиологических тестов, позволяющих оценить адаптационный потенциал бактерий нормальной микрофлоры организма при действии различных типов излучения. Результаты исследований могут быть использованы в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при ФДТ в сочетании обычных косметических процедур с профилактикой гнойно-воспалительных заболеваний. Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих (микробиология, экология микроорганизмов, общая биология) и специальных (актуальные проблемы микробиологии) курсов студентам биологического и физического факультетов Саратовского госуниверситета.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: 2-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004); съездах фотобиологов России (Саратов, 2005; Пущино, 2008), 1-й конференции молодых ученых медико-биологической секции ПАГУ (Ульяновск, 2007); 11-й Пущин-ской школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); Всероссийских форумах «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); международных симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2004 - 2008); научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2004 - 2006, 2008).
Декларация личного участия автора Автор лично участвовал в проведении экспериментов по фотодинамическому воздействию на бактерии из микро-боценозов кожи и ротовой полости. Анализ полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад соискателя составил 70 - 90% Ряд исследований выполнен в рамках НИР СГУ «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» на кафедре оптики и биомедицинской физики при финансовой поддержке гранта CRDF RUB1-570-SA-04 Palomar Medical Technologies, Burlington, USA.
Публикации По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 в изданиях перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов. Работа изложена на 140 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 15 таблиц. Список использованных литературных источников включает 170 наименований, в том числе 90 работ зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Фотодинамическое воздействие светодиодного красного или лазерного инфракрасного излучения на бактериальные клетки, обработанные мети-леновым синим или индоцианином зеленым, приводит к гибели большей части
микробной популяции представителей нормальной микрофлоры организма человека.
2. Жизнеспособность, относительная численность популяций, культу-ральных свойств и морфологических характеристик бактерий, представляющих нормальную микрофлору кожи и ротовой полости, под действием используемого при фотодинамической терапии излучения, находятся в пределах нормы реакции и позволяют судить об адаптационном потенциале микроорганизмов.
3. Селективный эффект действия каждого типа оптического излучения проявляется в угнетении или стимуляции роста определенного вида или штамма бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры кожи и ротовой полости.
Содержание работы
Во введении обосновывается актуальность исследования, сформулированы основная цель и задачи, научная новизна, теоретическая и практическая значимость исследования.
Глава 1. ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ И КОЖИ И АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ (обзор литературы)
В обзоре отечественной и зарубежной литературы рассматриваются свойства и функции нормальной микрофлоры организма человека и животных, даются характеристики микробиоценозов ротовой полости и кожи, описываются наиболее типичные микроорганизмы данных микробоценозов, освещаются аспекты применения антимикробной фотодинамической терапии и различных классов фотосенсибилизаторов в клинической практике и медико-биологических исследованиях
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования проводили на базе кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского; научной бактериологической лаборатории НИЧ СГУ; лаборатории восстановительной стоматологии Национального университета Сингапура в период с 2003 по 2008 год.
В качестве объектов исследований использованы типичные представители микробоценозов кожи и ротовой полости' Streptococcus mutans, Staphylococcus lugdunensis, S epidermidis метициллин-чувствительный (MS), 5 epidermidis метициллин-устойчивый (MR), 5 aureus 209 P, S aureus 69. S hominis, S warnery, Haemophilus actionomycetemcomitans, Pi opiorubactermm acnes, Rothia mucilaginosa. R dentacanosa. Curtobacterium albidum. Flavobcicternim gleum. Культуры были получены из коллекций и музеев микроорганизмов (ИБФМ РАН, СГМУ, НУС); микроорганизмы ротовой полости были выделены от паци-
ентов стоматологического отделения 3-й клинической больницы г. Саратова, микроорганизмы кожи - от пациентов клиники «Семейный доктор». Отбор проб и подготовку их к исследованию проводили общепринятыми методами (Артемьева, 1989). Посев осуществляли на плотные (ГРМ, MPC, Эндо, желточ-но-солевой агар, кровяной агар) и жидкие (тиогликолиевая среда) питательные среды. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили на основании фенотипических свойств, а также с помощью стандартных диагностических систем (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород).
При постановке экспериментов использовали излучение в видимом синем (405 нм; 23, 5 - 80 мВт/см"), красном (625, 660 нм; 33, 40 мВт/см2) и инфракрасном (805, 810 нм; 50, 45 мВт/см~) диапазонах, генерируемое световыми и лазерными диодами. В качестве фотосенсибилизаторов использовали индоциа-нин зеленый (ИЗ) с максимумом поглощения 770 - 800 нм и метиленовый синий (MC) с максимумом поглощения 660 нм. Работали с концентрациями мети-ленового синего - 0.005, 0.025, 0.05 и 0.25%; индоцианина зеленого - 0.05, 0.1, 0.25 и 0.5%. Растворы фотосенсибилизаторов готовили на основе смеси глицерина, этанола и воды (в соотношении 25:25:50 - для метиленового синего, 25.45:30 - для индоцианина зеленого) или дистиллированной воды.
Для создания асептических условий иммунологический полистирольный планшет помешали в стеклянный или пластиковый корпус. Источник света располагали над ячейками планшета на расстоянии, необходимом для формирования определенной плотности мощности излучения. Воздействие проводили на бактериальные клетки во взвеси (5><103 мк/мл), находящейся в соответствующих ячейках, последовательно увеличивая дозу излучения. После воздействия взвеси бактерий переносили на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 - 72 ч инкубации при 37°С. Контролем служили взвеси бактерий, не обработанные сенсибилизатором и не подвергнутые облучению; контрольные значения принимали за 100%. Каждый эксперимент проводили в десятикратной повторности.
При изучении адаптации бактерий к действию разных типов излучений определяли общепринятые в экологических исследованиях показатели: жизнеспособность, численность популяции бактерий, морфологию колоний и особенности роста на питательных средах (Теппер и др., 2004). Для анализа морфологии бактериальных клеток через 24 - 72 ч после облучения готовили микропрепараты и окрашивали по методу Грама; просматривали препараты путем световой микроскопии с объективом х90 под масляной иммерсией, а также с помощью цифровой микрофотокамеры ScopeTek и программ компьютерной обработки изображений Для статистической обработки данных использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки Р<0.05 (Ашмарин и др., 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6 0, MS Excel 2003.
Глава 3. ВЛИЯНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ - ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ
Однозначных сведений об оптимальных параметрах обработки клеток растворами фотосенсибилизаторов в литературе нами найдено не было, поэтому на предварительном этапе работы отбирали наиболее эффективные сочетания длительности преинкубации клеток и концентрации красителей для каждого исследованного микроорганизма. Показано, что для клеток Р acnes длительность преинкубации с красителями составляет 10 мин, оптимальная концентрация водного раствора метиленового синего - 0.025%, водного раствора индо-цианина зеленого - 0.1%. Для эффективной фотосенсибилизации клеток S epi-dermidis достаточно времени обработки метиленовым синим (концентрация не более 0.025%) в течение 5 мин, индоцианином зеленым (концентрация не более 0.1%) в течение 10 мин (табл. 1).
Таблица 1
Оптимальные параметры обработки бактериальных клеток фотосенсибилизаторами
Вид бактерий Краситель
метиленовый синий пндоциании зеленый
время обработки М1111 концентрация. % время обработки, мин концентрация, %
Р acnes 1 10 0 025 10 0 1
S eptdeimidis 5 0 025 10 0 1
Н actmomvceiemcomüans 5 0 005 10 05
S mutans 5 0 005 5 0 5
Установлено, что для достижения фотодинамического эффекта необходимо обрабатывать клетки Н actinomycetemcoimtans метиленовым синим на протяжении 5 мин, индоцианином зеленым - 10 мин. Концентрация метиленового синего в этом случае может достигать 0.005%, а индоцианина зеленого - 0.5%. Оптимальное время обработки клеток 5 mutans красителями составляет 5 мин, концентрация водных растворов метиленового синего 0.005%, индоцианина зеленого - 0.1 % (см. табл. 1).
Глава 4 ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ НА БАКТЕРИИ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ
Проведен сравнительный анализ действия различных типов излучения на бактерии микробоценоза ротовой полости. Установлено, что фотодинамическое воздействие с использованием светодиодного синего (405 нм, 23 мВт/см"), красного (660 нм, 40 мВт/см") или лазерного инфракрасного (810 нм; 45 мВт/см") излучения приводит к изменению жизнеспособности, численности
популяции и морфологических характеристик исследованных микроорганизмов.
При оценке влияния светодиодного синего излучения на микроорганизмы ротовой полости было показано его подавляющее действие на колониеобра-зующую способность основных представителей данного микробного сообщества, таких как Н actmomycetemcomitans, R maalaginosa, R dentacariosa, F gleum, С albidum, S mutans, S htgdunensis При этом кокковые формы (S mutans, S htgdunensis) оказались более чувствительны к влиянию излучения, чем палочковидные микроорганизмы Н actmomycetemcomitans, F gleum. Наименьшее влияние синее излучение оказывало на грамотрицательные виды F gleum и Н actmomycetemcomitans, в то время как уменьшение численности грамположительных видов R mucilaginosa, R dentacariosa, С albidum было более выраженным (табл. 2).
Таблица 2
Изменение числа КОЕ бактерий ротовой полости под действием светодиодного синего излучения, %
Вид бактерий Время обручения, мин
0 (контроль) i 1 1 5 i I 10 1 15 i
Rothia mucilaginosa 97 56 ±2 32 70 54 ± 1 23* 63 33 ± 3 30* 60 22 ± 2 22* 54 61 ±0 13*
Rothia dentacai i osa 97 88±2 12 80 40 ±2 14* 75 95 ±2 28* 72 03 ± 3 12* 70 55 ±2 49*
Curtobacteriiini albidum 96 72 ±3 21 71 91 ±2 84* 50 36 ± 2 96* 45 71 ± 3 21* ; 37 43 ± 2 37*
Flm o bacterium фит 95 85 ±4 15 81 57±2 75* 80 62 ±3 41* 82 14 ±4 96* j 79 70±0 ¡7*
Haemophilus actmomycetemcomitans 97 26 ±2 86 78 75 ± 3 14* 75 45 ±4 10* 75 72 ± 3 92* 71 41 ±2 42*
Staphylococcus htgdunensis 97 78 ± 2 22 66 58 ±3 73* 62 83 ± 4 6* 31 24 ± 2 81* 15 93 ±2 48*
Streptococcus mutans 97 S3 ± 0 17 60 79 ±0 16* 24 47 ± 0 19* 16 20± 0 15* 36 62 ± 0 15*
Примечание * - наличие достоверных различий по отношению к контролю при уровне значимости Р<0 05
Известно, что чувствительность к фотовоздействию грамотрицательных и грамположительных бактерий имеет несколько разную природу ввиду строения клеточной стенки (Васильев, Огиренко, 2002, Malik et al., 1992; Wilson, Pratten, 1995), что согласуется с полученными нами данными. Восприимчивость микроорганизмов к действию того или иного типа излучения во многом определяется наличием в их клетках особых молекул - эндогенных фотосенсибилизаторов, в частности, порфиринов Клетки условно-патогенных и патогенных бактерий, за счет использования ими гемоглобина, характеризуются повышенным содержанием порфиринов. В клетках представителей нормальной микрофлоры
количество этих молекул значительно ниже, вследствие чего они менее чувствительны к действию синего излучения (Hamblin, Hasan, 2004).
Известно, что стратегия выживания микроорганизмов под действием экологических факторов во многом зависит от их морфологических признаков, которые определяют их нахождение внутри сообщества с его определенной архитектурой (Заварзин, 2004). Поэтому для более полной оценки действия различных типов излучении на бактерии нормальной микрофлоры нами были проведены исследования морфологии их клеток и колоний. Для всех палочковидных бактерий, за исключением С. albidum, было отмечено изменение морфологии клеток и культуральных свойств под действием синего излучения. Микроско-пирование препаратов показало, что клетки S mutans, подвергнутые воздействию, имели размеры меньше (15 мин - 0.61 ± 0.04 мкм, Р<0.05), чем в контроле (0.70 ± 0.01 мкм), и располагались парами, реже короткими цепочками. У клеток 5 lugditnensis увеличивался диаметр (контроль - 0.51 ± 0.02, 1 мин - 0.53 ± 0.01, 5 мин - 0.55 ± 0.02, 10 мин - 0.60 ± 0.03,15 мин - 0.61 ± 0.01 мкм, Р<0 05). Изучение морфологии колоний показало изменение характера пигментации с преобладанием бежевого оттенка.
Анализ действия светодиодного красного излучения выявил его незначительное влияние на колониеобразующую способность бактерий вида И actmomycetemconntans. Длительность предварительного облучения в течение 1 и 15 мин приводила к снижению числа КОЕ, а к облучению в течение 5 и 10 мин исследуемый вид был более устойчив (контроль - 95.02 ± 4.05, 1 мин -70.13 ±4.34, 5 мин- 82 31 ±4.78, 10 мин - 76.52 ± 3.58, 15 мин-69.35 ± 4.13%, Р<0.05). Предварительная обработка клеток Н actinomycetemconntans метиле-новым синим в концентрации 0.005 % приводила к более выраженному угнетающему эффекту действия красного излучения (контроль - 96.72 ± 3.21, 1 мин -30.16 ±4.11,5 мин-21.41 ±4.81, 10 мин - 17.33 ± 3.52, 15 мин - 3.15 ± 5.81%, Р<0.05). Показано, что красное излучение также подавляло размножение бактерий вида S mutans: число КОЕ достоверно уменьшалось по сравнению с контрольным значением (контроль - 92.22 ± 3.67, 1 мин - 63 59 ±4.36, 5 мин -41.31 ±2.22, 10 мин - 25.78 ±4.47, 15 мин - 22.24 ±4.52%, Р<0.05). При использовании 0.005 % раствора метиленового синего в качестве фотосенсибилизатора угнетающий эффект действия красного излучения на S mutans сохранялся, но приобретал более выраженный характер. Изменение времени облучения от 1 до 15 мин приводило к снижению показателя КОЕ относительно контроля (контроль - 93.47 ± 4.68, 1 мин - 55.76 ± 3.87, 5 мин - 38.82 ± 4.07, 10 мин -23.08 ±3.82, 15 мин-4.82 ±4.57%, Р<0.05).
При микроскопировании препаратов облученных и необлученных бактерий Н actinomycetemcomitans установлено изменение морфологии клеток после облучения они имели более правильную палочковидную форму и большие размеры, чем полиморфные мелкие клетки в контроле (табл 4). При изучении морфологии клеток S mutans, подвергнутых воздействию, выявлено изменение тинкториапьных свойств (вариабельная окраска по Граму) и характера расположения клеток. Колонии облученных рактери» имели большие размеры (15 мин - 0.51 ±0 17 см) по сравнению с контролем (0.3 ±0.13 см, Р<0.05)
Таблица 4
Изменение размеров клеток под действием светодиодного красного излучения, мкм
Время облучения, мин И actmomycelemcomitans 5 mutans
длина ширина диаметр
0 (контроль) 1 10 ±0 08 0 42 ± 0 02 о 69 ± о о г
1 1 21 ±0 06 0 42 ± 0 02 0 69 ± 0 07
5 1 24 ± 0 04* 042 ± 0 01 0 72 ± 0 02*
10 1 27 ± 0 05* 0 45 ± 0 02* 0 73 ± 0 0!*
15 1 30 ± 0 04* 0 49 ± 0 01* 0 75 ± 0 02*
Примечание * - наличие достоверных, различий по сп ношению к контролю при уровне значимости Р-'О 05.
Изучение влияния лазерного инфракрасного излучения на Н aclmomycetemcomiians и S mutans позволило сделать сходные выводы. Ни одна из использованных доз облучения не вызвала стимуляции развития исследуемых микроорганизмов. Применение 0.5% раствора индоцианина зеленого в качестве фотосенсибилизатора приводило к выраженному подавляющему эффекту (табл. 5). Установлено, что инфракрасное излучение изменяет размеры бактерий, подвергнутых воздействию: для палочек и кокков показано увеличение длины облученных клеток (табл 6).
Таблица 5
Изменение числа КОЕ бактерий ротовой полости под действием лазерного инфракрасного излучения, %
Время облучения, мин Н actmotnyceiemcomuans 5. mutans
без фого-сенсибилизатора с фотосенсибилизатором без фото-сспспбилизаюра с фотосенсибилизатором
0(контроль) 96 51 ±2 75 96 88 ± 4 24 98 26 ±4 20 97 64 ± 5 74
1 69 68 ± 3 92* 32 64 ± 5 61* 93 69 ±5 05 45 80 ± 5 27*
5 58 85 ± 4 15* 50 61 ±4 94* 85 83 ±5 21* 30 52 ±4 55*
10 73 53 ± 2 75* 60 92 ±4 68* 82 71 ±4 35* 27 77 ±3 87*
Г- -,5 - 71 62 ± 3 41 * 18 09 ± 5 07* 84 47 ±4 36* 23 55 ± 4 09*
Примечание * - наличие достоверных различил по отношению к котро.чю при уровне значимости Р<0 05
Таблица 6
Изменение размеров бактерий под действием лазерного инфракрасного излучения, мкм
Время облучения, мин H actmomycetemcomitans S mutans
длина ширина длина ширина
0 (контроль) 1 09±0 07 0 41±0 05 0 67±0 03 0 68±0 04
1 1 1 32±0 05* 0 40±0 03 0 69±0 07 0 69±0 07
5 1 34±0 Об* 0 42±0 02 0 75±0 05* 0 70±0 05
10 1 37±0 08* 0 43±0 04 0 75±0 02* 0 69±0 02
15 1 39±0 03* 0 42±0 02 0 78±0 03* 0 68±0 03
Примечание * - наличие достоверных различий по отношению к контролю
при уровне значимости Р<0 05
Глава 5. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ НА БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБОЦЕНОЗА КОЖИ
Кожные покровы являются первым барьером на пути проникновения инфекции в макроорганизм. Сохранение определенного микробного состава из числа резидентных бактерий имеет важное физиологическое значение для поддержания здоровья всего организма Поэтому на следующем этапе работы было изучено влияние светодиодного синего (405 нм; 31.5, 5 - 80 мВт/см'), красного (625 нм; 33 мВт/см"), комбинированного (405, 625 нм) и лазерного инфракрасного (805 нм; 80 мВт/см2) излучения на бактерии микробиоценоза кожи.
Установлено, что комбинированное излучение незначительно подавляло развитие бактерий Р acnes, S epidermidis MS, 5 hominis, S aureus 209 P. и стимулировало размножение 5 aureus 69 и S1 warnery (рис. 1). Обработка клеток 0.005% раствором метиленового синего приводила к резкому сокращению численности всех исследованных видов после фотовоздействия. При анализе микропрепаратов бактерий, подвергнутых облучению, было показано, что размеры клеток S aureus 209 Р, 5 epidetmidis MS, Р acnes были меньше, чем в контрольных образцах. Отмечено также изменение культуральных свойств, колонии микроорганизмов, предварительно обработанных комбинированным излучением, имели более интенсивную кремово-желтую окраску, чем в контроле. Существенных изменений в морфологии облученных клеток S wameiy и S hominis, их расположении или культуральных свойствах выявлено не было, в отличие от клеток S aureus 69, диаметр которых увеличивался (табл. 7). Установлено усиление пигментации колоний этого вида по сравнению с контрольными образцами.
Щ 160
2 140
120
100
ВО
60
40
20
0
О 1 10
Время, мин
S 5, epidermidis 0 5. hominis И S. warnery
В 5 aureus 209 Р SS. aureus 69 P. acnes
Рис. 1. Изменение числа КОЕ бактерий из микробоценоза кожи под действием комбинированного излучения
Таблица 7
Изменение размеров бактерий под действием комбинированного излучения, мкм
Время облучения, мин iu 'о о о; § 5. и ь? S. hominis С' SU с з со S. aureus 209 Р S. aureus 69
длина ширина диаметр диаметр диаметр диаметр диаметр
0 (контроль) 1.47± 0.07 0.51± 0.02 0.65± 0.05 0.70± 0.02 0.53± 0.03 0.73± 0.02 0.63± 0.01
1 1.21± 0.06* 0.48 ± 0.02 0.55± 0.03* 0.70± 0.04 0.54± 0.03 0.68± 0.03* 0.69± 0.02*
10 1.20t _0.08* 0.45± 0 05 0.47± 0.07* 0.71± 0.01 0.55± 0.01 0.б5± 0.04* 0.74± 0.02*
Примечание: * - наличие достоверных различий по отношению к контролю при уровне значимости Р0.05.
В ходе наших экспериментов показано, что микроорганизмы Р. acnes чувствительны к действию светодиодного синего излучения. Исследуемые штаммы S. epidermidis. напротив, были устойчивы к подобного рода воздействию. Полиморфизм клеток Р. acnes после облучения значительно усиливался; изуче-I ние культуральных свойств через 72 ч после облучения выявило уменьшение
диаметра колоний данных бактерий по сравнению с контролем. Для обоих исследованных штаммов S. epidermidis MR и S. epidermidis MS изменение морфологии клеток отмечено лишь после облучения дозами 70 и 144Дж/см2. При анализе микропрепаратов установлено, что кокки, подвергнутые облучению, имели меньшие размеры, чем в контроле. Изучение культуральных свойств через 24 ч после воздействия выявило усиление пигментации колоний. Известно, что клетки Р. acnes содержат большое количество порфиринов (Kjeldstad, Johnsson, 1986). Сложноорганизованные молекулы порфиринов имеют максимум поглощения в пределах от 400 до 420 нм и выступают в качестве эндогенных фотосенсибилизаторов. Именно этой физиологической особенностью можно объяснить подверженность Р. acnes влиянию синего излучения. X проявлениям адаптации следует отнести изменения морфологии данных бактерий: уменьшении размеров, усилении полиморфизма. В клетках стафилококков содержание порфиринов ниже, а защитные реакция против активных форм кислорода более выражены, поэтому эти бактерии устойчивы к действию синего света. Косвенно об активизации антиоксидантных систем можно судить по изменению пигментации колоний облученных бактерий (Нетрусов, 2004; Ермилова, 2007).
Полученные данные свидетельствуют о подавляющем действии светодиодного красного излучения на микроорганизмы Р. acnes (рис. 2). Использование водного или глицерин-спиртового раствора метиленового синего усиливало угнетающее влияние данного излучения вплоть до полного подавления роста бактериальных клеток.
% 160 -
ы
8 140120 -100 -80 -60 -40 -20 -
О -.
О 5 10 15 30
Время, мин
ИР. acnes OS. epidermidis MS £}S. epidermidis MR
Рис. 2. Действие светодиодного красного излучения на бактерии из мнкробоценоза кожи
Установлено, что красное излучение стимулировало рост и размножение бактерий S. epidermidis - в меньшей степени метишплин-устойчивого штамма, а в большей степени - метициллин-чувствительного (см. рис. 2). Применение 0.025% водного раствора метиленового синего обусловливало угнетающий эф-
фект действия излучения на жизнеспособность этих штаммов стафилококка, который был еще более выраженным при использовании глицерин-спиртового раствора фотосенсибилизатора. Известно, что метициллин относится к классу бета-лактамных антибиотиков, мишенями для которых являются ферменты трансептидазы, завершающие синтез пептидогликана клеточной стенки. Устойчивость к метициллину в основном обусловлена слабой проницаемостью клеточной стенки и продукцией бета-лактамаз, разрушающих антибиотик (Егоров, 2004). Вероятно, неодинаковый эффект фотодинамического воздействия на ме-тициллин-чувствительный и метициллин-устойчивый штаммы S. epidermidis объясняется различиями в строении клеточной стенки.
Показано, что инфракрасное излучение с определенными дозами незначительно стимулировало рост и размножение Р. acnes и метициллин-устойчивого штамма S. epidermidis и не оказывало воздействия на жизнеспособность мети-циллин-чувствительного штамма (рис. 3). Использование 0.1% водного раствора индоцианина зеленого не влияло на численность популяции метициллин-чувствительного штамма S. epidermidis и стимулировало метициллин-устойчивый штамм. Применение глицерин-спиртового раствора индоцианина зеленого приводило к значительному подавлению всех исследованных микроорганизмов.
1
О
5
10
15
30
Время, мин
UP. acnes OS. epidermidis MS OS. epidermidis MR
Рис. 3. Действие лазерного инфракрасного излучения на бактерии из микробоценоза кожи
Сравнительный анализ чувствительности различных видов бактерий-симбионтов кожи к действию комбинированного, светодиодного красного и лазерного инфракрасного излучений показал, что наиболее восприимчивыми были клетки Р. acnes, однако существенных изменений таких параметров как морфология и характер пигментации колоний, размеры и форма обличенных клеток исследованных микроорганизмов выявлено не было.
Видовое разнообразие, свойства и нормальное функционирование микробных сообществ в составе нормальной микрофлоры во многом зависит от состояния макроорганизма. Сокращение численности определенного представителя резидентной микрофлоры может привести к снижению устойчивости организма-хозяина и проникновению в свободную экологическую нишу транзи-торных микроорганизмов, в том числе и патогенных (Шендеров, 1998; Шуб и др., 2001). Нарушение физиологических процессов, протекающих в макроорганизме, в свою очередь, способно спровоцировать возникновение воспалительных реакций, ассоциированных с увеличением числа условно-патогенных микроорганизмов, входящих в состав нормальной микрофлоры. Для устранения негативных последствий таких нарушений может быть использовано фотодинамическое воздействие с применением различных типов излучения, поскольку его эффект, вероятно, обусловлен индивидуальными характеристиками вида или штамма микроорганизма (Demidova, 2005). Более глубокое понимание механизмов действия оптического излучения, обеспечивающих подобную селективность, позволит в дальнейшем использовать метод ФДТ для коррекции численности того или иного вида бактерий в составе микробоценозов макроорганизма, профилактики заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании нормальной микрофлоры. Например, синее излучение с длинами волн 400 - 420 нм приводит к сокращению числа КОЕ различных видов бактерий и, в частности, находит применение при лечении такого заболевания как угревая сыпь, связанного с избыточной обсемененностью кожи Р acnes.
Как показано в наших экспериментах, излучение с определенной длиной волны и плотностью мощности способно вызвать уменьшение или увеличение численности, изменение жизнеспособности, морфологии, культурапьных и тинкториапьных свойств бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры. При этом необходимо отметить, что данные изменения в большинстве случаев были незначительными или слабо выраженными и находились в пределах нормы реакции бактерий на действие оптического излучения, как экологического фактора антропогенной природы. Это позволило нам отобрать комплекс информативных показателей для характеристики влияния различных типов излучения на бактерии из микробоценозов кожи и ротовой полости, который может быть использован и для оценки действия других экологических факторов антропогенного характера на различные микробные сообщества макроорганизма Из изученных характеристик резидентных бактерий наиболее показательными являются: численность популяции, форма и размер клеток, морфология и пигментация колоний. Их определение не требует дорогостоящей аппаратуры и сложных методических приемов и может проводиться при экологических исследованиях в лабораториях различного профиля.
Полученные нами данные на отдельных популяциях микроорганизмов, представляющих нормальную микрофлору, обосновывают необходимость дальнейших исследований в условиях т vivo для установления характера изменений биоцснотических связен в микробных сообществах при действии излучений
ВЫВОДЫ
1. Оптимальными условиями применения фотосенсибилизаторов при фотодинамическом воздействии являются- время преинкубации бактериальных клеток с красителями - 5 - 10 мин; допустимая концентрация метиленового синего - 0.005 - 0.025%; индоцианина зеленого - 0.1 - 0.5%.
2. Жизнеспособность бактерий микробоценоза ротовой полости - кокков Streptococcus mutans и Staphylococcus lugdunensis и палочек Rothia mucilaginosa, R. dentacariosa, Curtobactermm albidum, Flavobacte-rium gleum, Haemophilus actionomycetemcomitans - под действием светодиодного синего (405 нм) излучения снижается на 30 - 80 и 5 - 20% соответственно. Уменьшение числа КОЕ S. mutans после воздействия красного (660 нм) излучения происходит на 40 - 77%, Н actionomycetemcomitans на 20 - 25% в зависимости от длительности облучения; в то же время клетки 5 mutans оказываются устойчивы к воздействию лазерного инфракрасного (810 нм) излучения.
3. Культурапьные свойства и морфологические характеристики бактерий ротовой полости изменяются под влиянием различных типов излучения: в популяциях выживших бактерий преобладают формы с интенсивной пигментации колоний.
4. Относительная численность популяций бактерий микробоценоза кожи S epidenmdis и Р acnes уменьшается на 15 - 85% после облучения синим (405 нм) светом; без использования фотосенсибилизаторов плотность популяции 5 eptdermidis увеличивается под влиянием красного (625, 805 нм) излучения на 20% относительно контроля.
5. Форма и размеры клеток бактерий микробоценоза кожи изменяются при фотодинамическом воздействии - у S eptdermidis изменяется диаметр клеток: уменьшается после облучения синим (405 нм) светом, увеличивается - после действия инфракрасного (805 нм) излучения
6. Наиболее информативными показателями изменения экологического состояния популяций бактерий, представляющих нормальную микрофлору кожи и ротовой полости, при действии разных типов излучения являются: число колониеобразующих единиц, размеры и форма клеток, размеры и пигментация колоний.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ (* - публикации в печатных изданиях Перечня ВАК РФ)
1. Тучина Е.С., Чернова Ю.А., Рудик Д.В., Попов Д.Э. Влияние некогерентного синего излучения на численность популяции грамположительных кокков // Студенческие исследования в биологии. - Саратов, 2004. - Вып. 2. -С. 65-69.
2. Тучина Е С., Чернова Ю.А., Рудик Д.В , Попов Д.Э. Изменение численности бактерий под влиянием некогерентного синего излучения // Материалы 2-й регион, конф. молод, ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» - Саратов, 2004. - С. 52 - 53.
3. Popov D., Tuchina Е., Chernova J., Podshibyakin D., Rudik D., Sam-sonova M., Gromov I., Tuchin V. The affect of low-coherent light on microbial colony forming ability and morphology of some gram-positive and gram-negative bacteria // Proceedings of The International Society for Optical Engineering. - USA, Washington, 2005. - Vol. 5771 - P. 353 - 356.
4. Тучина E.C., Рудик Д В. Изменение численности популяций грамположительных и грамотрицательных палочковидных бактерий под действием некогерентного синего излучения //Исследования молодых ученых и студентов в биологии - Саратов, 2005. - Вып. 3. - С 103-107.
5. Тучина Е.С., Рудик Д В., Еременко A.M., Тучин В.В. Влияние широкополосного света на условно-патогенные микроорганизмы, фотосенсибили-зированные образцами наночастиц Ti02, Ag-Si02 // Тез. докл. IV Съезда фотобиологов России. - Саратов, 2005. - С. 219 - 221
6 Рудик Д.В.. Тихомирова Е.И., Тучина Е.С. Функциональная активность нейтрофилов крови человека при действии различных доз инфракрасного лазерного излучения II Тез. докл. IV Съезда фотобиологов России - Саратов, 2005.-С. 171 -174.
7. Tuchina E.S , Rudik D.V., Tikhomirova ЕЛ. Biochemical activity changing of opportunistic microorganisms under the influence of low-coherent blue light
// Proceedings of The International Society for Optical Engineering. - USA, Washington, 2006. - Vol. 6163. - P. 278 - 281.
8. Tuchina E.S., Rudik D.V., Krylova G V., Smirnova N.P., Ere-menko A M., Tuchin V.V. Broadband light action on opportunistic microorganisms photosensitized by Ti02 and Ag-Si02 nanoparticle films // Proceedings of The International Society for Optical Engineering - USA, Washington, 2006. - Vol 6163. — P. 281 -285
9 Тучина E С. Фотодинамическое влияние красного и инфракрасного лазерного излучения на бактерии Haemophilus actionomycetemcomitaiis II Исследования молодых ученых и студентов в биологии. - Саратов, 2006. - Вып. 4. -С 97- 100.
10* Тихомирова Е И., Рудик Д В., Тучина Е.С Оценка некоторых показателей киллинга бактерий нейтрофилами периферической крови человека под
влиянием инфракрасного низкоинтенсивного лазерного излучения // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2 - 3. - С. 35 - 36.
11. Рудик Д.В., Тучина Е.С., Тихомирова Е.И., Сенотов А.С. Оценка функционально-метаболического статуса фагоцитирующих клеток под действием низкоинтенсивного лазерного излучения ИК-диапазона (850 нм) // Фундаментальные исследования. - 2006.-№ 5. - С. 100- 101.
12. Rudik D.V., Tikhomirova E.I., Tuchina E.S. The cytokine production by neutrophils and macrophages in time of phagocytosis under the influence of infrared low-level laser irradiation // Proceedings of The International Society for Optical Engineering. - USA, Washington, 2006. - Vol. 6163. - P. 273 - 278.
13. Тучина E С., Пермякова Н.Ф. Воздействие некогерентного светодиодного излучения на бактерии рода Staphylococcus, фотосенсибилизированные метиленовым синим и наночастицами Ag-Si02 // Материалы 1-й конф. молод ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск, 2007. - С. 70 - 72.
14. Tuchina Е. S., Permyakova N. F., Tuchin V. V The effect of LED-light action on microbial colony forming ability of several species of Staphylococcus II Proceedings of The International Society for Optical Engineering - USA, Washington, 2007. - Vol. 6535. - P. 301 - 306.
15*. Тихомирова Е.И., Тучина E.C., Рудик Д.В., Водянова Т.В., Емельянова Н.В. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на цитокиновую активность макрофагов и нейтрофилов in vitro при фагоцитозе бактерий // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2 - 3. - С. 165.
16. Тучина Е С Использование наночастиц Ag-SiO?H метиленового синего при фотодинамическом воздействии светодиодного излучения на некоторые виды стафилококков // Материалы 11-й Путинской школы-конференции молодых ученых - Пущино, 2007. - С. 285.
17. Тучина Е С. Фотодинамическое воздействие светодиодного красного излучения на микроорганизмы кожи человека // Тез. докл. V Съезда фотобиологов России. - Пущино, 2008. - С. 236.
18. Тучина ЕС., Пермякова Н.Ф., Алексашин А.В. Экологический аспект действия красного некогерентного светодиодного излучения на микроорганизмы кожи человека // Вестник Российской военно-медицинской академии -2008.-№3 (23).-С. 337.
19*. Тучина Е С , Тучин В В , Альтшулер Г Б., Ярославский И.В Фотодинамическое воздействие красного (625 нм) излучения на бактерии вида Propionibactenuni acnes, обработанные фотосенсибилизатором // Естественные и технические науки. - 2008. - № 2 (34). - С. 90 -93.
Тучина Елена Святославна
ОЦЕНКА ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ IN VITRO НА БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ И КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
03.00.16 - экология 03 00.07 - микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Подписано в печать 13 11 2008 г. Формат 60*84 '/к, Бумага офсетная Гарнитура Тайме Печать офсетная Объем 1 печ л Тираж 100 экз Заказ Л» •
Типография Издательства Саратовского j киверсигста 410012, Caparon. Астраханская 83
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тучина, Елена Святославна
Список условных сокращений.
Введение.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Нормальная микрофлора организма человека.
1.2. Свойства микробоценоза ротовой полости.
1.2.1. Ротовая полость как среда обитания микроорганизмов.
1.2.2. Микроорганизмы ротовой полости человека.
1.3. Свойства микробоценоза кожи.
1.3.1. Особенности кожи как среды обитания.
1.3.2. Микроорганизмы кожи человека.
1.4. Антимикробная фотодинамическая терапия.
1.4.1. Механизмы фотоповреждения.
1.4.2. Внутриклеточные механизмы защиты.
1.4.3. Вещества, применяемые при фотовоздействии.
1.4.4. Фотодинамическое воздействие на микроорганизмы.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Источники излучения и фотосенсибилизаторы.
2.3. Постановка эксперимента.
2.4. Методы статистической обработки результатов.
Глава 3. ВЛИЯНИЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
НА ОТНОСИТЕЛЬНУЮ ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИЙ
ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ.
Глава 4. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ
НА БАКТЕРИИ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ.
4.1. Действие светодиодного синего (405 нм) излучения на бактерии ротовой полости.
4.2. Влияние светодиодного красного (660 нм) излучения на бактерии ротовой полости.
4.3. Чувствительность бактерий ротовой полости к действию лазерного инфракрасного (805 нм) излучения.
Глава 5. ДЕЙСТВИЕ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ИЗЛУЧЕНИЯ
НА БАКТЕРИИ ИЗ МИКРОБОЦЕНОЗА КОЖИ.
5.1. Влияние светодиодного комбинированного (405, 625 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи.
5.2. Чувствительность микроорганизмов кожи к действию светодиодного синего (405 нм) излучения.
5.3. Действие лазерного инфракрасного (805 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи.
5.4 Действие лазерного инфракрасного (805 нм) излучения на бактерии микробоценоза кожи.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой полости и кожи человека"
Актуальность исследования. Нормальная микрофлора представляет собой неотъемлемую часть, макроорганизма и играет важную роль в поддержании его гомеостаза (Шендеров, 1994, 1998; Белобородова, 1998; Грачева и др., 2006). Большинство имеющихся в современной литературе работ посвящены детальному изучению микробного сообщества желудочно-кишечного тракта человека и животных в норме и' при различных патологических состояниях (Доронин, Шендеров, 2002; Ильина, 2006). Не менее значимо состояние микрофлоры таких биотопов, как ротовая полость и кожа, индивидуальная и анатомическая специфичность состава микроорганизмов которых способствует обеспечению колонизационной резистентности организма в целом (Митрохин, 1998; Ильин и др., 2005). Разработка методических подходов к оценке адаптационного потенциала бактерий, в том числе и представителей микробоценозов> организма человека, а также выбор параметров и характеристик, наиболее^ полно отражающих состояние отдельных микробных популяций на фоне действия стрессовых факторов различной природы являются актуальными задачами экологии микроорганизмов (Митрохин, 2000; Нетрусов и др., 2004; 8Ьпуаз1ауа, 2007).
Изменения в- видовом составе и количественных показателях микробного сообщества под влиянием внешних или внутренних факторов могут привести к нарушению функционирования макроорганизма' (Нетрусов и др., 2004). Для оценки действия стрессовых факторов физической природы (в том числе антропогенного характера) на микроорганизмы современные исследователи оценивают изменение их жизнеспособности: по количеству колониеобразующих единиц - КОЕ, оптической плотности бактериальных суспензий, хемилюминесценции микробных клеток (Фомичев др., 1991; Страховская и др., 2002). В то же время использование традиционных микробиологических методов (описание морфологии клеток и колоний, исследование тинкториальных, культуральных и биохимических свойств) позволяет быстро^ и объективно оценитъ т уШо состояние микробных популяций.
В настоящее, время; в клинической практике и биомедицинских исследованиях широко используется', оптическое излучение различного спектрального состава (400; - 420; 600 - 660, 800 - 850 нм) для; лечения гнойно-воспалительных- заболеваний; бактериальной природы, а также, при физиотерапевтических и косметических! процедурах (Тучин,; 1998; НашЬНп, Наэап, 2004). Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ) является альтернативой антибиотикотерапии и заключается' в избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном^ воздействии, красителя? - фотосенсибилизатора и света с определенной! длиной- волны. Контролируемый эффект действия» светового и лазерного излучения может быть использован и для» коррекции численности определенного- вида бактерий» в составе нормальной; микрофлоры при явлениях дисбиоза;. поскольку применение антимикробных препаратов- в таких случаях не допустимо? Однако данные: о? реакциях нормальной; микрофлоры на действие различных типов излучений; используемых в ФДТ, практически, отсутствуют, а их получение представляет значительный; научный интерес и может иметь прикладное значение.
Цель и? задами? исследования; Цель, работы заключается в оценке действия« светодиодного синего, красного и лазерного инфракрасного излучений в сочетании-: с фотосенсибилизаторами на бактерии, представляющие нормальную микрофлору кожи и ротовой полости. Для достижения указанной цели решались следующие задачи::
Г. Определить оптимальные условия* применения фотосенсибилизаторов (необходимую концентрацию, время: инкубации и облучения): при фотодинамическом воздействии: на бактерии, представляющие'нормальную микрофлору макроорганизма.
2. Изучить влияние светодиодного синего (405 нм), красного (660 нм) и лазерного инфракрасного (810 нм) излучений в сочетании с фотодинамическими, красителями? (метиленовым синим,, индоцианином' зеленым) на жизнеспособность, численность популяций; культуральные свойства и морфологические характеристики бактерий ротовой полости.
3; Выявить чувствительность бактерий' микробоценоза кожи при действии светодиодного синего (405 нм), красного (625 нм), комбинированного (405, 625 нм) и лазерного инфракрасного (805 нм) излучений^ в сочетании с фотодинамическими красителями (метиленовым синим, индоцианином зеленым);
4. Отобрать наиболее информативные показатели изменения состояния in vitro популяций, бактерий, представляющих нормальную микрофлору, и характеристики их адаптационного потенциала при 'фотодинамическом воздействии.
Научная новизна. Впервые проведено исследование in vitro- влияния на бактерии, представляющие нормальную микрофлору организма человека, лазерного и; светодиодного излучений с параметрами, используемыми при; ФДТ в медико-биологической практике. Показано; изменение жизнеспособности, численности популяций, морфологии клеток: и культуральных свойств, бактерий микробоценоза ротовой полости под влиянием светодиодного' синего (405 нм), красного (660 нм) . й лазерного инфракрасного (810 нм) излучений. Исследована чувствительность бактерий микробоценоза кожи к действию, этих излучений. Выявлены особенности действия света на: бактериальные: клетки, обработанные фотосенсибилизаторами; (метиленовым синим и индоцианином зеленым). Впервые разработан комплекс наиболее информативных показателей, позволяющий объективно оценить in vitro состояние микробных популяций кожи и ротовой-полости на фоне действия разных типов излучения.
Практическая значимость. Были разработаны ■ и методически обоснованы подходы к изучению влияния различных типов излучения на бактерии — представители нормальной микрофлоры, которые могут быть рекомендованы к применению в практике биологических и медицинских исследований. Определены условия обработки бактериальных клеток растворами фотосенсибилизаторов: их концентрация и длительность предварительной инкубации. Выявлены параметры светодиодного и лазерного излучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности ряда микроорганизмов. Предложен комплекс микробиологических тестов, позволяющих оценить адаптационный потенциал бактерий нормальной микрофлоры организма при действии различных типов излучения. Результаты исследований могут быть использованы в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодинамической терапии при сочетании обычных косметических процедур с профилактикой гнойно-воспалительных заболеваний. Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций общих и специальных курсов студентам биологического и физического факультетов СГУ; полученные результаты использованы при подготовке курсовых и дипломных работ студентами этих факультетов.
Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: 2-й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004); съездах фотобиологов России (Саратов, 2005; Пущино, 2008); 1-й конференции молодых ученых медико-биологической секции ПАГУ (Ульяновск, 2007); 11-й Пущинской школе - конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2007); Всероссийских форумах «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); международных симпозиумах по оптическим технологиям в биофизике и медицине «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2004 - 2008); научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета СГУ им. Н.Г. Чернышевского (Саратов, 2004 - 2006, 2008).
Декларация личного участия автора. Автор лично участвовал в проведении экспериментов по фотодинамическому воздействию на бактерии из микробоценозов кожи и ротовой полости. Анализ полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад соискателя составил 70 — 90%. Работа выполнена в рамках гранта CRDF RUB1-570-SA-04 при финансовой поддержке Palomar Medical Technologies, Burlington, USA. Исследования проводились в рамках НИР «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» тематического плана научно-исследовательских работ СГУ по заданию Федерального агентства по образованию РФ № 1.4.06
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 в изданиях перечня ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 15 таблиц. Список использованных литературных источников включает 170 наименований, в том числе 90 зарубежных авторов.
Заключение Диссертация по теме "Экология", Тучина, Елена Святославна
122 ВЫВОДЫ
1. Оптимальными условиями применения фотосенсибилизаторов при фотодинамическом воздействии являются: время преинкубации бактериальных клеток с красителями - 5 - 10 мин; допустимая концентрация метиленового синего - 0.005 - 0.025%; индоцианина зеленого - 0.1 - 0.5%.
2. Жизнеспособность бактерий микробоценоза ротовой полости -кокков Streptococcus mutans и Staphylococcus lugdunensis и палочек Rothia mucilaginosa, R. dentacariosa, Curtobacterium albidum, Flavobacterium gleum, Haemophilus actionomycetemcomitans - под действием светодиодного синего (405 нм) излучения снижается на 30 - 80 и 5 — 20% соответственно. Уменьшение числа КОЕ S. mutans после воздействия красного (660 нм) излучения происходит на 40 - 77%, Н. actionomycetemcomitans на 20 — 25% в зависимости от длительности облучения; в то же время клетки S. mutans оказываются устойчивы к воздействию лазерного инфракрасного (810 нм) излучения.
3. Культуральные свойства и морфологические характеристики бактерий ротовой полости изменяются под влиянием различных типов излучения: в популяциях выживших бактерий преобладают формы с интенсивной пигментацией колоний.
4. Относительная численность популяций бактерий микробоценоза кожи S. epidermidis и P. acnes уменьшается на 15 - 85% после облучения синим (405 нм) светом; без использования фотосенсибилизаторов плотность популяции S. epidermidis увеличивается под влиянием красного (625, 805 нм) излучения на 20% относительно контроля.
5. Форма и размеры клеток бактерий микробоценоза кожи изменяются при фотодинамическом воздействии - у S. epidermidis изменяется диаметр клеток: уменьшается после облучения синим (405 нм) светом, увеличивается — после действия инфракрасного (805 нм) излучения.
6. Наиболее информативными показателями изменения экологического состояния популяций бактерий, представляющих нормальную микрофлору кожи и ротовой полости, при действии разных типов излучения являются: число колониеобразующих единиц, размеры и форма клеток, размеры и пигментация колоний.
Заключение
С современных позиций нормальную микрофлору рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых человека и животных (Шендеров, 1998). Микроорганизмы, присутствующие в организме хозяина, находятся между собой в разнообразных отношениях (нейтрализм, конкуренция, мутуализм, синергизм, комменсализм, паразитизм и др.) Недостаток или избыток того или иного метаболита, так же как и изменения окружающей среды, служат сигналом для адаптивных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы (Шендеров, 1998; Нетрусов и др., 2004). Неся в себе элементы саморегуляции, эта система способна противостоять, по крайней мере, в известных пределах, изменениям условий среды и колебаниям плотности микробных популяций (Шендеров, 1998). Влияние внешних стрессовых факторов может иметь самые разнообразные последствия для функционирования нормальной микрофлоры (рис. 18). В первую очередь, изменения в качественном и количественном составе резидентных микроорганизмов затронут обмен веществ, происходящий при их участии. Следствием подобных процессов будет накопление несвойственных данному биотопу метаболитов и смещение рН. Совокупность данных изменений может привести к снижению устойчивости организма-хозяина и проникновению в свободную экологическую нишу транзиторных микроорганизмов, в том числе и патогенных (Шендеров, 1998; Шуб и др., 2001). В итоге, действие стрессового фактора может стать причиной снижения колонизационной резистентности, подверженности макроорганизма различным инфекционным заболеваниям.
Рис. 19. Схема влияния стрессовых факторов на функционирование нормальной микрофлоры
Но необходимо отметить, что видовое разнообразие, свойства и нормальное функционирование микробных сообществ в составе нормальной микрофлоры во многом зависит от состояния макроорганизма. Нарушение физиологических процессов, протекающих в макроорганизме, в свою очередь способно спровоцировать возникновение воспалительных реакций, ассоциированных с увеличением числа условно-патогенных микроорганизмов, входящих с состав нормальной микрофлоры.
Недооценка экологической гибкости и потенциала изменчивости микроорганизмов в природе - причина периодических сенсаций, связанных с появлением «новых» возбудителей инфекционных заболеваний. Можно предвидеть, что по мере дальнейших изменений в экологической обстановке и иммунном статусе человека круг потенциально патогенных микроорганизмов с «непрофессиональным» паразитизмом будет расширяться.
Для устранения негативных последствий таких изменений может быть использовано фотодинамическое воздействие с применением различных типов излучения, поскольку его эффект, вероятно, обусловлен индивидуальными характеристиками вида или штамма микроорганизма (Demidova, 2005). Влияние света является одним из абиотических факторов. Его действие на клетки живых организмов лежит в основе фотодинамической терапии - лечении различных заболеваний светом определенной длины волны (Hamblin, Hasan, 2004). Широкое внедрение подобных методов стало возможным в связи с развитием лазеров и других источников монохроматического излучения.
В основе антибактериальной фотодинамической терапии лежит окислительная деструкция патогенных микроорганизмов при совместном воздействии красителя - фотосенсибилизатора и оптического излучения соответствующего спектрального состава. Комбинация "краситель + свет + кислород" является, как правило, необходимым признаком этой реакции. Сочетания "краситель + свет" и "свет + кислород" чаще всего неэффективны, хотя в литературе и описаны отдельные примеры сенсибилизированных красителем фотобиологических реакций в анаэробных условиях: летальное действие фурокумаринов на бактерии, инактивация ДНК-вирусов, инактивация ферментов in vivo и in vitro (Hamblin, Hasan, 2004).
To, какие молекулярные структуры повреждаются в первую очередь, определяется, с одной стороны, природой красителя, с другой — особенностями биологического объекта: проницаемостью клеток для хромофора и его микрораспределением внутри клетки (комплексирование с макромолекулами). Иными словами, в каждом конкретном случае (определённый краситель и определённый биологический объект) могут первично повреждаться самые различные молекулярные структуры: структурные белки мембран, различные ферменты, фосфолипиды, РНК и ДНК (Dougherty, 1988).
Природа акцептора фотодинамически активного света очевидна. Это проникший в клетку хромофор (краситель) (Дуванский, 2003). Поэтому спектры действия фотодинамического повреждения должны совпадать со спектрами поглощения красителя, что и наблюдается в эксперименте. Механизмы фотосенсибилизированного повреждения клеток могут быть с. весьма различными (Hamblin, Hasan, 2004) и определяться следующими параметрами.
1. Видом сенсибилизатора и его способностью взаимодействовать с теми или иными компонентами клетки. Так, порфирины преимущественно взаимодействуют с мембранными системами клетки и сенсибилизируют фотоповреждение как плазматической мембраны, так и мембран внутриклеточных органелл. Акридины же могут избирательно связываться с нуклеиновыми кислотами и повреждать клетки через нарушения в генетическом аппарате. Связывание сенсибилизатора с клеточными компонентами зависит от его заряда, гидрофобности и стерических свойств.
2. Видом клеток и взаимодействием их различных компонентов с красителем. При непродолжительной инкубации клеток с сенсибилизатором светом повреждаются преимущественно плазматические мембраны клеток, t при более длительной инкубации сенсибилизатор входит в клетки и происходит повреждение различных внутриклеточных органелл.
3. Способностью сенсибилизатора генерировать и другие токсические агенты.
4. Общим несенсибилизированным действием на клетки лазерного излучения.
Более глубокое понимание механизмов селективного действия оптического излучения позволит в дальнейшем использовать метод ФДТ не только для уничтожения патогенных микроорганизмов, но и для коррекции численности того или иного вида бактерий в составе микробоценозов макроорганизма, профилактики заболеваний, связанных с нарушениями в функционировании нормальной микрофлоры. Например, синее излучение с длинами волн 400 — 420 нм приводит к сокращению числа КОЕ различных видов бактерий и, в частности, находит применение при лечении такого заболевания как угревая сыпь, связанного с избыточной обсемененностью кожи P. acnes (Ross, 2005).
В связи с вышеизложенным, представляло интерес оценить действие светодиодного синего, красного и лазерного инфракрасного излучений на бактерии, представляющие нормальную микрофлору кожи и ротовой полости. Как показано в наших экспериментах, излучение с определенной длиной волны и плотностью мощности способно вызвать уменьшение или увеличение численности, изменение жизнеспособности, морфологии, культуральных и тинкториальных свойств бактерий, входящих в состав нормальной микрофлоры (табл. 15).
Изменение относительной численности популяций бактерий под действием разных типов оптического излучения было отмечено нами для всех исследованных микроорганизмов. Характер этих изменений во многом определялся индивидуальными особенностями вида или штамма микроорганизма.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тучина, Елена Святославна, Саратов
1. Абрамова Н.В. Влияние маломощного когерентного излучения на выживаемость дрожжей Saccharomyces cereviae штамм 14 // Электронная обработка материалов. — 1978. №1. - С. 65-66.
2. Анфимова Н.А., Потекаев Н.Н., Ткаченко С.Б. и др. Фотодинамическая терапия: патогенетическое обоснование эффективности при вульгарных угрях // Эксп. и клин, дерматокосметология. 2005. - № 5. — С.125-130.
3. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ М.: Мир, 1982. - 488 с.
4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях Л.: Изд-во мед. лит-ры, 1962. - 180 с.
5. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов — Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. 76 с.
6. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. и др. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Рос. хим. журнал. 1994. - Т. 28, №6. - С. 66-78.
7. Багмет А.Н., Шаповалова О.В. Коррекция нарушений микробиоценоза кожи при легкой форме угревой болезни // Дерматолопя та венеролопя. — 2003. №1(19). - С. 44-46.
8. Безрукова А. П. Пародонтология. М.: Медицина, 1999. - С. 67-74.
9. Белобородова Н.В. О микрофлоре хозяина и ее участии в ответе на инфекцию // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - № 9. - С. 44-48.
10. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Бондаренко В.Ш. и др. Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus II Журн. микробиол. 1995. - № 4. - С. 19-23.
11. Боровский Е. В., Леонтьев В. К. Биология полости рта. Н. Новгород: НГМА, 2001.-304 с.
12. Бриль Г. Е. Молекулярные аспекты биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения // Актуальные проблемы патологии. Саратов, из-во Саратовского ун-та, 2001. — С.124—136.
13. Васильев Н. Е., Огиренко А. П. Антимикробная фотодинамическая терапия // Лазерная медицина. 2002. - Т.6, №1 - С. 32-38.
14. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т.29. -С. 27-32.
15. Высоцкий В.В. Биологическое значение и структурные основы адгезивных свойств микроорганизмов. — В кн.: Медицинские аспекты микробной экологии. / Под. ред Б.А. Шендерова. М., 1993/1994, вып. 7/8. -С. 24-28.
16. Гельфонд Б.Р. О проблеме устойчивости патогенных микроорганизмов к анитбактериальным препаратам // Инфекции и антимикробная терапия. -2001. Т. 3, № 3. - С. 3-4.
17. ГОСТ Р 50723-94: Лазерная безопасность. Общие требования безопасности при разработке и эксплуатации лазерных изделий.
18. М.: Издательство стандартов, 1995. 34 с.
19. Готовский Ю.В., Вышеславцев А.П., Косарева Л.Б. Цветовая светотерапия. М.: ИМЕДИС, 2001 - 231 с.
20. Громов Б.В. Строение бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1985. - 187 с
21. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Изд-во ЛГУ, 1989.
22. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. М.:Академия, 2003. -464 с.
23. Девятков Н.Д. и др. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения // Успехи современной биологии. — 1987. — Т. 103, № 1.-С. 31-43.
24. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000.-238 с.
25. Доронин А.Ф, Шендеров Б. А. Функциональное питание. -М. :ГРАНТЬ,2002. 296 с.
26. Дрожжина В.А., Федоров Ю.А., Петрова А.Г. и др. Опыт проведения сочетанной местной профилактики кариеса зубов у школьников
27. Стоматология 1998. - Спец.вып. - С. 47.
28. Дуванский В. А. Фотодинамическая терапия в комплексном лечении больных с острыми гнойными заболеваниями мягких тканей // Лазерная медицина. 2003. - Т. 7, № 4. - С. 41-45.
29. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. 6-е изд. -М.:Изд-во МГУ; Наука, 2004. 528 с.
30. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. -СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2007. 299 с.
31. Журавлева Л.А., Чанков И.И., Коннова Т.В. Светотерапия при тонзиллитах // Сборник научно-практических материалов первого межрегионального совещания. Томск, 2004. — С. 29-32.
32. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. — М.: Наука, 2004.-348 с.
33. Иванов A.A. Микроэкология кожи человека и ее взаимосвязь с иммунным статусом организма // Материалы научно-практической конференции «Микрофлора кожи человека — клинико-диагностическое значение».-М., 1989.-С. 3-11.
34. Иванов B.C. Заболевания пародонта. М.: Медицина, 1989. - 272 с.
35. Изменения в таксономии и номенклатуре бактерий. От редакции.
36. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2004. - Т. 6, № 1.-С.4-9.
37. Ильин В.К., Воложин А.И., Виха Г.В. Колонизационная резистентность организма в измененных условиях обитания. — М.: Наука, 2005. — 251 с
38. Ильина H.A. Микробиоценоз кишечника человека при бластоцистной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм: автореф. дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 2006. - 41 с.
39. Кару Т.Й. Первичные и вторичные клеточные механизмы лазерной терапии // Низкоинтенсивная лазерная терапия / Под ред. C.B. Москвина и В.А. Буйлина. — М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. — С.71-94.
40. Клемпарская H.H. Изменение микрофлоры кожи при действии на организм экзогенньих и эндогенных факторов. // Материалы научно-практической конференции «Микрофлора кожи человека — клинико-диагностическое значение». М., 1989. - С. 12-23.
41. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. Вузов. 3-е изд., испр и доп. - СПб.: Спец Лит., 2002. - 591 с.
42. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник. 2-е изд., перераб. и доп. - Минск: Асар, 1999. — 399 с.
43. Красновский A.A. Первичные механизмы фотодинамического действия: развитие проблемы и современное состояние исследований // Тез. докл. IV Съезда фотобиологов России. Саратов, 2005. — С. 94-96.
44. Куваева И.Б., Кузнецова Г.Г. Антагонистическая активность микробных популяций защитной флоры и ее связь с характеристикой микробиоценоза и факторам питания. // Вопросы питания. 1993. —№ 3. - С. 12-16.
45. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. - №1. — С. 10-17.
46. Кутасевич Я.Ф., Маштакова И.А., Багмет А.Н. и др. Микробиоценоз кожи у больных угревой болезнью и пути его коррекции // Укр. журнал дерматологи, венерологи, косметологи. — 2003. №1(8). — С. 43-47.
47. Ламли Ф., Адаме Н., Томсон Ф. Практическая клиническая эндодонтия. -М.: Медпресс, 2007. 128 с.
48. Медицинская микробиология / Под ред. Покровского В.И., Поздеева O.K. M., 1999. - С. 210-221.
49. Медицинская микробиология / Под ред. A.M. Королюка и В.Б. Сбойчакова. СПб.: Элби-СПб, 2002. - 267 с.
50. Методы частной бактериологии / Под ред. Васильева Д.А. и др. -Ульяновск: Ветеринарная медицина, 1995. — С. 6-9.
51. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза: автореф. дис. . д-ра мед. наук. М, 1998.-36 с.
52. Митрохин С.Д. Значение представителей рода Haemophilus в инфекционной патологии человека // Инфекции и антимикробная терапия. -2005.-Т. 7, № 1. С. 56-60.
53. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / Под ред. А.И. Нетрусова. — М.: «Академия», 2004. 272 с.
54. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук JI.M. Практикум по микробиологии: Учеб для студ. высш. учеб заведений. М.: Академия, 2005. - 608 с.
55. Нетрусов А.И., Котова И.Б. Микробиология. — М.: «Академия», 2006. -352 с.
56. Нобл У. К. Микробиология кожи человека. М.: Медицина, 1986. -496 с.
57. Ойвин В.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Журнал патологической физиологии и экспериментальной терапии. 1960. - № 4. - С. 84-95.
58. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига,
59. П. Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. В 2-х т. М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 432 с.
60. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. В 2-х т. М.: Мир, 1997. - Т.2. - 368 с.
61. Пивоваров Ю.П., Кролик В.В. Санитарно-значимые микроорганизмы. -М.: ИКАР, 2000-268 с.
62. Применение низкоинтенсивных лазеров в клинической практике / Под. ред. O.K. Скобелкина. М.: 1997. - 302 с.
63. Рыбаков А.И., Банченко Г.В. Заболевания слизистой оболочки полости рта. М.: Медицина, 1978. - 231 с.
64. Санитарные нормы и правила устройства и эксплуатации лазеров № 5804-91.
65. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. М.: Колос, 1995 - 319 с.
66. Современная микробиология: Прокариоты:Т.2. Пер. с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. - 496 с.
67. Соколовский Е.В. Дерматовенерология. М.: Академия, 2005. - 528 с.
68. Справочник по лазерам / Под ред. A.M. Прохорова. М., 1978. - 344
69. Справочник по лазерной технике / Под ред. A.B. Петрова. -М.: Энергоатомиздат, 1991. 544 с.
70. Странадко Е. Ф. Исторический очерк развития фотодинамической терапии // Лазерная медицина. 2002. — Т. 6, № 1. — С. 4-8.
71. Странадко Е. Ф., Рябов М. В. Новая лазерная технология в медицине -фото динамическая терапия // Анналы хирургии. 2003. - № 2. - С. 16-20.
72. Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Иванова Э.В. и др. Фотодинамическая инактивация дрожжей Candida guilliermondii в присутствии фотодитазина // Микробиология. 2002. — Т.71, №3. - С. 349353.
73. Страховская М.Г., Пархоменко И.М., Румбаль Я. В. и др. Фотоиндуцированное подавление биолюминисценции генно-инженерного штамма бактерий Escherichia coli TGI (рХеп7) в присутствии фотодитазина
74. Микробиология. 2002. - Т. 71, №3. - С. 345-348.
75. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Дрофа, 2004. - 256 с.
76. Трапезников H.H., Купин В.И., Кадагидзе З.С. Потенцирующее действие лазерного излучения на показатели клеточного и гуморального иммунитета // Вопросы онкологии. 1985. — Т. 31, № 6. - С. 115—116.
77. Тучин B.B. Лазеры и волокнистая оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: Изд. Сарат. ун-та, 1998. - 384 с.
78. Тучин В.В. Оптическая биомедицинская диагностика. В 2-х томах. Т.1 -М.: ФИЗМАТЛИТ, 2007 518 с.
79. Улащик В. С. Фотодинамическая терапия и ее применение в клинической медицине // Здравоохранение. 2006. - № 6. - С. 24-28.
80. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических исследованиях. -М.: Медицина, 1975. 259 с.
81. Утц С.Р., Волнухин В.А. Низкоинтенсивная лазеротерапия в дерматологии Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - 92 с.
82. Фомичев А.Ю., Зорин В.П., Зорина Т.Е., Черенкевич С.Н. Фотоповреждение грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток в присутствии производных хлорина // Микробиология. 1991.,- Т.60, №3, - С. 507-511.
83. Шендеров Б.А. Иммунология инфекционного процесса. Руководство для врачей / Под ред. В.И. Покровского, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинова. -М.:Медицина, 1994. 318 с.
84. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. —
85. М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. 288 с.
86. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - С. 291-292.
87. Шуб Г. М., Корженевич В. И., Лунева И. О., Швиденко И. Г. Краткий курс медицинской микробиологии: Учебник для студентов отделения „Высшее сестринское образование" медицинских вузов. Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии./ Под ред.
88. Г. М. Шуба. М.: Логос, 2001. - 403 с.
89. Abels С., Fickweiler S., Weiderer P. et al. Indocianine green and laser irradiation induce photooxidation // Arch. Dermatol. 2000. — № 292. — P. 404411.
90. Beighton D. The value of salivary bacterial counts in the prediction of caries activity // Risk Markers for Oral Diseases. 1991- № 1. - P. 313-326.
91. Bertoloni G., Rossi F., Valduga G. et al. Photosensitizing activity of waterand lipid-soluble phthalocyanines on Escherichia coli // FEMS Microbiol. Lett. -1990.-№59.-P. 149-155.
92. Bezman S. A., Burtis P. A., Izod T. P. et al. Photodynamic inactivation of Escherichia coli by rose bengal immobilized on polystyrene beads // J. Photochem. Photobiol. 1978. -№ 28. - P. 325-329.
93. Bhatti M, MacRobert A, Meghji S. et al. A study of the uptake of toluidine blue O by Porphyromonas gingivalis and the mechanism of lethal photosensitization. // J. Photochem. Photobiol. 1998. - № 68. - P. 370-376.
94. Bilski P., Ehrenshaft M., Daub M. et al. Vitamin B6 (pyridoxine) and its derivatives are efficient singlet oxygen quenchers and potential fungal antioxidants // J. Photochem. Photobiol. 2000. - № 71 (2). - P. 129-134.
95. Blank H.I. Measurement of pH of the skin surface // J. Invest. Dermatol. -1989.-№2.-P. 67-79.
96. Bowden G. W. Which bacteria are cariogenic in humans? // Risk Markers for Oral Diseases. 1991-№ 1. - P. 265-286.
97. Brankova R., Michailova M., Minkova S. Interaction between lactic acid bacteria and some harmful organisms, depending on their amount in the medium
98. Biotechnol. and Biotechnol. Equip. 1994. - № 4. - P. 19 - 24.
99. Brown S. B., Minnock A., Vernon D. I et al. Photoinactivation of bacteria. Use of a cationic watersoluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both gramnegative and gram-positive bacteria // J. Photochem. Photobiol. 1996. - № 32. -P. 159-164.
100. Burns T, Wilson M, Pearson G. Sensitisation of cariogenic bacteria in biofilms to killing by low power laser light // Proceedings of the 4-th International Conference on Lasers in Dentistry. 1994. — P. 66.
101. Chen W. R., Adams R. L., Higgins A. K. et al. Photothermal effects on mammary tumor using indocyanine green and an 808-nm diode laser: in vivo efficacy study // Cancer Lett. 1996. - № 98. - P. 169-173.
102. Ciamberlini C., Guarnieri V., Longobardi G. et al. Indocyanine green videoangiography using cooled CCD in central serous choroidopathy // J. Biomed. Opt. 1997.-№ 2.-P. 218-225.
103. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E. et al. Microbial biofilms // Anny. Rev. Microbiol. 1995. - № 49. - P. 711-745.
104. Dahl T.A., Midden W.R., Hartman P.E. Pure singlet oxygen cytotoxicity for bacteria // J. Photochem. Photobiol. 1987. - № 46. - P. 345-352.
105. Dahl T.A., Midden W.R., Hartman P.E. Comparison of killing of gramnegative and gram-positive bacteria by pure singlet oxygen // J. Bacteriol. 1989. -№ 171.-P. 2188-2194.
106. Demidova T.N., Hamblin M.R. Photodynamic therapy targeted to pathogens // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2004. - № 17. - P. 245-254.
107. Dobson J, Wilson M. Sensitization of oral bacteria in biofilms to killing by light from a low-power laser // Arch. Oral Biol. 1992. - № 37. - P. 883-887.
108. Dougherty T.J. Studies on the structure of porphyrins contained in Photofrin II // J. Photochem. Photobiol. 1987. - Vol. 46, № 5. - P. 569.
109. Dougherty TJ. Photodynamic therapy // Medical radiology innovations in radiation oncology. 1988. -№ 1. - P. 175-188.
110. Dougherty T.J. Studies on the structure of porphyrins contained in Photofrin II // J. Photochem. Photobiol. 1987. - Vol. 46, № 5. - P. 569.
111. Dzink J.L. Tanner A.R. Haffajee A.D. Socransky S.S. Gram-negative species associated with active destructive periodonltal lesions // J. Clin. Periodontol. -1982. -№ 12.-P. 648-659.
112. Ernst E., Fialka V. Low-dose laser therapy: critical analysis of clinical effects // Schweiz-Med-Wochenschr. 1993. - V. 123. - P. 949-954.
113. Feng Q. L., Wu J., Chen G. Q. et al. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus II J. Biomed. Mater. Res. 2000. - № 52. - P. 662-668.
114. Fickweiler S., Szeimies R.-M., Baumler W. Indocyanine green: Intracellular uptake and phototherapeutic effects in vitro // J. Photochem. Photobiol. 1997. -№38.-P. 178-183.
115. Geis A. Antagonistic compounds produced by lactic acid bacteria // Kieler Milchwirtsch. Forsch. Ber. 1989. -№ 41. - P. 97-104.
116. Genina E.A., Bashkatov A.N., Simonenko G.V. et al. Low-Intensity ICG-Laser Phototherapy of acne vulgaris: A Pilot Study // J. Biomed. Opt. 2004. -Vol. 9, № 4. - P. 828-834.
117. Goldmann D.A. Bacterial colonization and infection in the neonate // Am. J. Med. 1981. -№ 70. - P. 417-422.
118. Goodson J.M. Tanner A.C, Haffajee A.D. et al. Patterns of progression and regression of advanced destructive periodontal disease // J. Clin. Periodontol. -1982.-№ 9.-P. 472-481.
119. Hamblin M.R., Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? // J. Photochem. Photobiol. 2004. - № 3. -P. 436-450.
120. Hardie J.M., Thomson P.L., South R.J. et al. A longitudinal epidemiological study on the dental plaque and the development of dental caries // J. Dentl. Res. -1989.-№56.-P. 90-98.
121. Henderson B. W., Dougherty T. J. How does photodynamic therapy work? // J. Photochem. Photobiol. 1992. - № 55. - P. 145-157.
122. Henry C., Judy M., Dyer B. et al. Sensitivity of Porphyromonas and Prevotella species in liquid media to argon laser // J. Photochem. Photobiol. -1995. -№ 61. -P. 410^413.
123. Hiffajee A.D., Socransky S.S., Dzink J.L. et al. Clinical, microbiological and immunological features of subjects with destructive periodontal diseases // J. Clin. Periodontol. 1988. - № 15. - P. 240-246.
124. Hongcharu W., Taylor C.R., Chang Y. D. Topical ALA-photodynamic therapy for the treatment of acne vulgaris // J. Invest. Dermatol., 2000. - № 115. -P. 183-192.
125. Itzkan I., Tang S. Laser wound healing can be explained by the photodissociation of oxyhemoglobin // Lasers in Surgery and Medicine. 1988. -№ 8.-P. 175.
126. Jori G., Tonlorency D. Photodynamic treatment of microbial infections // Photodynamic News. 1999. - Vol. 2, № 1. - P. 2-31.
127. Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells // J. Photochem. Photobiol. 1999. - V. 49, № 1. -P. 1-17.
128. Kawada A., Aragane Y., Sangen Y., Tezuka T. Acne phototherapy with a high-intensity, enhanced, narrow-band, blue light source: an open study and in vitro investigation // J. Dermatol. Sci. 2002. - № 30. - P.129-135.
129. Kjeldstad B., Johnsson A. An action spectrum for blue and near ultraviolet inactivation of Propionibacterium acnes: with emphasis on a possible porphyrin photosensitization // J. Photochem. Photobiol. 1986. - № 43. - P. 67-70.
130. Koenig K., Meyer H. Photodynamic activity of methylene blue // Akt. Dermatol. 1993. - № 19. - P. 195-198.
131. Kohler B., Andreen I., Johnsson B. The earlier colonization of mutans Streptococci, the higher the caries prevalence at 4 years of age // Oral Microbiology. 1988.-№3.-P. 14-17.
132. Konig K., Teschke M., Sigusch B. et al. Red light kills bacteria via photodynamic action // Cell. Mol. Biol. 2000. - № 46. - P. 1297-1303.
133. Lambrechts S.A., Demidova T.N., Aalders M. C. et al. Photodynamic therapy for Staphylococcus aureus infected burn wounds in mice // J. Photochem. Photobiol. 2005. - № 4. - P. 503-509.
134. Lang K., Hotz P., Gusberti F., Joss A. Longitudinal, clinical and microbiological study on the relationship between infection with Streptococcusmutans and the development of caries in humans // Oral Microbiology. 1987. -№ 2. - P. 39-47.
135. Lewin H., Bos M. E., Zusi F.C. et al. Evaluation of retinoids as therapeutic agents in dermatology // Pharmaceut. Res. 1994. - Vol. 11, № 21. - P. 192-200.
136. Malik Z., Hanania J., Nitzan Y. New trends in photobiology (ivited review). Bactericidal effects of photoactivated porphyrins an alternative approach to antimicrobial drugs // J. Photochem. Photobiol. - 1990. - № 5. - P. 281-293.
137. Malik Z., Ladan H., Nitzan Y. et al. The bactericidal activity of a deuteroporphyrin-hemin mixture on gram-positive bacteria. A microbiological and spectroscopic study // J. Photochem. Photobiol. 1990. -№ 6. - P. 419-430.
138. Malik Z., Ladan H., Nitzan Y. Photodynamic inactivation of Gram-negative bacteria: problems and possible solutions // J. Photochem. Photobiol. 1992. -№ 14.-P. 262-266.
139. Meisel P., Kocher T., Photodynamic therapy for periodontal diseases: state of the art // J. Photochem. Photobiol. 2005. - № 79. - P. 159-170.
140. Merchat M., Bertolini G., Giacomini P. et al. Meso-substituted cationic porphyrins as efficient photosensitizers of gram-positive and gram-negative bacteria // J. Photochem. Photobiol. 1996. - № 32. - P. 153-157.
141. Meulen F. W., Ibrahim K., Sterenborg H. J. et al. Photodynamic destruction of Haemophilus parainfluenzae by endogenously produced porphyrins
142. J. Photochem. Photobiol. 1997. - № 40 - P. 204-208.
143. Michel M., Gutmann L. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and vancomycin-resistant enterococci: therapeutic realities and possibilities // Lancet. -1997.-№349.-P. 1901-1906.
144. Mikx F.M., van der Hoeven J.S. Symbiosis of Streptococcus mutans and Veillonella alcalescens in mixed continuous culture // Arch. Oral. Biol. 1975. -№20. -P. 407-410.
145. Mills O., Porte M., Kligman A. M. Enhancement of comedogenic substances by ultraviolet radiation // Br. J. Dermatol. 1978. - № 98. - P. 145-148.
146. Millson C. E., Wilson M., Macrobert A. J. et al. The killing of Helicobacter pylori by low-power laser light in the presence of a photosensitiser // J. Med. Microbiol. 1996. -№ 44. -P. 245-252.
147. Mimes A.R., Bowden G.W. The microflora associated with the developing leasions in nursing caries // Caries Res. 1985 - № 4. - P. 289-297.
148. Nitzan Y., Gutterman M., Malik Z. et al. Inactivation of gram-negative bacteria by photosensitized porphyrins // J. Photochem. Photobiol. 1992. - № 55. -P. 89-96.
149. Nitzan Y., Balzam-Sudakevitz A., Ashkenazi H. Eradication of Acinetobacter baumannii by photosensitized agents in vitro II J. Photochem. Photobiol. 1998.-№42.-P. 211-218
150. Papageorgiou P., Katsambas A., Chu A. Phototherapy with blue (415 nm) and red (660 nm) light in the treatment of acne vulgaris II Br. J. Dermatol. 2000. -№ 142.-P. 973-978.
151. Perry C. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus 11 J. Wound Care. — 1996.-№5.-P. 31-34.
152. Ross E.V. Acne, Lasers, and Light // Advances in Dermatology. 2005. -№21.-P. 1-32.
153. Schafer N., Schmitz C., Horneck G. High sensitivity of Deinococcus radiodurans to photodynamically-produced singlet oxygen // Int. J. Radiat. Biol. -1998.-№74.-P. 249-253.
154. Schneider J., Quentin P., Floyd R. Photoinactivation bacteriophege Qb by methylene blue use visible light // J. Photochem. Photobiol. 1999. - Vol. 70, № 6. - P. 902-909.
155. Shah H. N., Bonnett R., Mateen B. et al. The porphyrin pigmentation of subspecies of Bacteroides melaninogenicus II Biochem. J. — 1979. — № 180. -P. 45-50.
156. Shah H. N., Gharbia S. E., Biochemical and chemical analyses of black-pigmented gram-negative anaerobes // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993. -№ 6. P. 89-96.
157. Simpson N. Antibiotics in acne: time for a rethink // Br. J. Dermatol. 2001. -№ 144.-P. 225-227.
158. Srivastava S., Samanta B., Jordan B.J. et al. Integrated Magnetic Bionanocomposites through Nanoparticle-Mediated Assembly of Ferritin // J. Am. Chem. Soc.-2007.-Vol. 129, №38. P. 11776-11780.
159. Simpson N. Antibiotics in acne: time for a rethink // Br. J. Dermatol. — 2001. -№ 144.-P. 225-227.
160. Soukos N. S., Wilson M., Burns T. Photodynamic effects of toluidine blue on human oral keratinocytes and fibroblasts and Streptococcus sanguis evaluated in vitro II Lasers in Surgery and Medicine. 1996. - № 18. - P. 253-259.
161. Soukos N. S., Ximenez-Fyvie L. A., Hamblin M. R. Targeted antimicrobial photochemotherapy // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. — № 42.1. P. 2595-2601.
162. Strakhovskaya M. G., Shumarina A. O., Fraikin G. et al. Endogenous porphyrin accumulation and photosensitization in the yeast Saccharomyces cerevisiae in the presence of 2,2-dipyridyl // J. Photochem. Photobiol. — 1999. — №49.-P. 18-22.
163. Stranadko E.F., Skobelkin O.K., Litvin G.T. et al. Photodynamic therapy of human malignant tumors: a comparative study between Photogem and tetrasulfonated aluminium phthalocyanine // Proc. SPIE 1996. - № 2625. -p. 440-448.
164. Stranadko E.F., Skobelkin O.K., Litvin G.T. et al. Clinical Photodynamic Therapy of Malignant Neoplasms // Procc. SPIE. 1995. - № 2325. - P. 240-246.
165. Sunada K., Watanabe T., Hashimoto K. Studies on photokilling of bacteria on Ti02 thin film // J. Photochem. Photobiol. 2003. - № 156. - P. 227-233.
166. Szocs K., Csik G., Kaposi A. D. et al. In situ detection of ALA-stimulated porphyrin metabolic products in Escherichia coli B by fluorescence line narrowing spectroscopy//Biochim. Biophys. Acta. 2001. - № 1541.-P. 170-178.
167. Tannock G.W. Normal Microflora: an inroduction to microbes inhabiting the human body. London: Chapman and Hall, 1995. - 78 p.
168. Tuchin V.V., Genina E.A., Bashkatov A.N. et al. A pilot study of ICG laser therapy of acne vulgaris: Photodynamic and photothermolysis treatment // Lasers Surg. Med. 2003. - Vol. 33, № 5. - P. 296-310.
169. Usacheva M. N., Teichert M. C., Biel M. A. Comparison of the methylene blue and toluidine blue photobactericidal efficacy against gram-positive and gramnegative microorganisms // Lasers in Surgery and Medicine. 2001. - № 29. -P. 165-173.
170. Valduga G., Breda B., Giacometti G. M. et al. Photosensitization of wild and mutant strains of Escherichia coli by meso-tetra (N-methyl-4-pyridyl)porphine
171. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - № 256. - P. 84-88.
172. Wainwright M. Photodinamic antimicrobial chemotherapy // J. Antimicrob. Chemother. 1998. -№ 42. - P. 13-28.
173. Wilson M., Dobson J., Harvey W. Sensitisation of oral bacteria to killing by low-power laser irradiation // Curr. Microbiol. 1992. - № 25. - P. 77-81.
174. Wilson M. Photolysis of oral bacteria and its potential use in the treatment of caries and periodontal disease // J. Appl. Bacteriol. 1993. - № 75. - P. 299-306.
175. Wilson M. Bactericidal effect of laser light and its potential use in the treatment of plaque-related diseases // Int. Dent. J. 1994. - № 44. - P. 181-189.
176. Wilson M., Pratten J. Lethal photosensitisation of Staphylococcus aureus in vitro: effect of growth phase, serum, and pre-irradiation time // Lasers Surg. Med. 1995. - № 16. - P. 272-276.
177. Wood S., Nattress B., Kirkham J. et al. An in vitro study of the use of photodynamic therapy for the treatment of natural oral plaque biofilms formed in vivo // J. Photochem. Photobiol. 1999. - № 50. - P. 1-7.
178. Zanin I.J., Goncalves R.B., Junior A.B. et al. Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy: an in vitro study // J. Antimicrob. Chemother. 2005. - № 56. - P. 324-330.
179. Zeina B., Greenman J., Purcell W.M., Das B. Killing of cutaneous microbial species by photodynamic therapy // British Journal of Dermatology. 2001. -№ 144.-P. 274-278.
180. Zharov V.P., Mercer K.E., Galitovskaya E.N. et al. Phototermal nanotherapeutics and nanodiagnostics for selective killing of bacteria targeted with gold nanoparticles // Biophysical J. 2006. - № 90 - P. 619-627.
-
Тучина, Елена Святославна
-
кандидата биологических наук
-
Саратов, 2008
-
ВАК 03.00.16
- Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов
- Клинико-морфологическое обоснование фотодинамической терапии у собак и кошек
- Методология повышения безопасности бактериальных вакцин на модели вакцинных штаммов Brucella abortus 19 BA, Francisella tularensis 15 НИИЭГ, Yersinia pestis EV НИИЭГ
- Изучение эффективности фотодинамического действия сенсибилизаторов, используемых в фотодинамической терапии, на клеточных моделях
- Особенности биологического профиля стафилококков в ассоциативном симбиозе носоглоточного биотопа в динамике нисительства
