Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов

Подшибякин, Дмитрий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов"

правах рукую

□□3491974

Подшибякин Дмитрий Васильевич

ИССЛЕДОВ АНИЕ IN VITRO И IN VIVO МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ESCHERICHIA COLIYi STAPHYLOCOCCUS AUREUS ПРИ ДЕЙСТВИИ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ВИДИМОГО И РАДИОДИАПАЗОНОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Саратов-2010

1 8 ФЕВ 2010

003491974

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет»

Научный руководитель — Официальные оппоненты -

Ведущая организация -

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович кандидат биологических наук Нечаева Ольга Викторовна

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Защита диссертации состоится » февраля 2010 г. в ■{'< часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «йО.» января 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл. 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение морфофизиологических характеристик условно-патогенных бактерий и их взаимодействия с организмом животных и человека представляет традиционно большой интерес в области прикладной микробиологии, в то же время актуальными задачами являются исследования состояния микробных популяций и их адаптационного потенциала на фоне действия стрессовых факторов различной природы (Шендеров, 1994; 1998; Белобородова, 1998; Митрохин, 2000; Доронин, Шендеров, 2002; Ильин, Воложин, Виха, 2005; Ильина, 2006; Тихомирова, 2007; Shrivastava, 2007).

В настоящее время в медико-биологических исследованиях и в клинической практике для достижения выраженного фотодинамического эффекта по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмов, равно как и с целью терапевтического воздействия на макроорганизм, широко используются электромагнитные излучения с различными длинами волн (Фрайкин и др., 1986; Зорина и др., 1988; Страховская и др., 1998; Тучин, 1998; Страховская и др., 2002а; 20026; Шумарина и др., 2003; Soukos, Ximenez-Fyvie, Hamblm, 1998; Bliss et al., 2004; Hamblin, Hasan, 2004; Lin, Chen, Huang, 2004; Maisch et al., 2005; Wong, 2005).

Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ), основанная на избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии красителя-фотосенсибилизатора и света с определенной длиной волны, рассматривается на настоящий момент как альтернатива антибиотикотерапии (Абрамова, 1978; Готовский, Вышеславцев. Косарева, 2001; Kjedstad, Johnson, 1986; Wainwright, 1998; Strakhovskaya et al., 1999; Wood et al., 1999; Meisel, Kocher, 2005). Представляется возможным использовать эффект действия излучений для коррекции численности определенного вида бактерий в составе нормальной микрофлоры (Журавлева, 2004; Тучина, 2008; Wilson, Dobson, Harvey, 1992; Wilson, 1993; Millson et al., 1996; Zeina et al., 2001; Tuchin et al, 2003). В литературе достаточно широко описаны эффекты действия на микроорганизмы ионизирующих и УФ-излучений (Владимиров и др., 1975; Цзю, Джаманова, Прохорова, 1983; Фрайкин и др., 1986; Беленикина, Фрайкин, 1989); в то время как влияние видимого света и, особенно, длинноволновых (ИК- и радиодиапазона) излучений остается практически не исследованным. При

этом следует отметить, что изучение эффектов, оказываемых излучениями на бактерии, имеет и фундаментальный характер, поскольку излучения способны оказывать как положительное, так и отрицательное влияние, механизмы которого не ясны до настоящего времени (Рубин, 1973; Тимошин, Бекер, 1990; Тимошин, Данилевич, Рапопорт, 1991; Трушин, 2002). Данных о стрессовых реакциях микроорганизмов на действие этих типов излучений, используемых в ФДТ, и оценке их адаптационного потенциала, недостаточно, а их получение представляет значительный научный интерес и может иметь прикладное значение.

Микроорганизмы и биологические препараты, созданные на их основе, могут неоднозначно действовать на макроорганизм, вызывая как местные, так и общие побочные реакции за счет различных метаболитов (Мельников, 1969; Бондаренко, 1999; Воробьев, 1999; Тихомирова, 2005; Brubaker, 1985; Isenberg, 1988; Finley, Falkow, 1989; Bhakdi, Tranum-Jenscn, 1991; Falkow, Isberg, Portnoy, 1992; Dougan, 1994). В общем случае местные патологические реакции приводят к нарушениям лимфо- и гемодинамики, прежде всего в микрососудах. Подобные изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма (Борисов, Дворкина, Корнеева, 1985; Галанжа, 2004; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007). Для оценки этого влияния в последние годы в биомедицинской практике используется спекл-микроскопия, позволяющая in vivo в режиме реального времени провести наблюдение за изменениями гемодинамики сосудов (Тучин, 1998; Федосов, Ульянов, 2001; Ульянова, 2006; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007; Aizu et al., 1990; Ulyanov, 1995; 2001; 2002).

В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение реакций популяций бактерий на действие низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов антропогенного происхождения и оценка локального влияния этих бактерий на микроциркуляцию крови макроорганизма методом спекл-мккроскопии.

волн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов Е. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оценить численность популяции клеток Е. coli Са58 под влиянием синего низкоинтенсивного светодиодного излучения.

2. Изучить культуральные свойства, морфологические характеристики и численность популяции сенсибилизированных метиленовым синим клеток Е. coli Са58 при действии красного низкоинтенсивного светодиодного излучения.

3. Определить изменения численности популяций бактериальных клеток Е. coli Са58 и S. aureus 209Р под влиянием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения с разной поляризацией и мощностью.

4. Оценить in vivo влияние бактериальных взвесей различных штаммов Е. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ex tempore методом спекл-микроскопии.

Научная новизна. Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизироваиных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов Е coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений. Определён дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов Е coli при действии красного НСИ. Впервые установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов Е. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения. Впервые показаны изменения скорости кровотока в брыжейке белых крыс ex tempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток Е coli разных штаммов. Обнаружено увеличение скорости кровотока в первые минуты после аппликации на брыжейку белых крыс супернатанта необлученных и несенсибилизироваиных штаммов £ coli, содержащего экзо- или эндотоксин.

Практическая значимость. Полученлые результаты вносят вклад в разделы микробиологии, связанные с исследованиями процессов адаптации микроорганизмов к действию стрессовых факторов антропогенного происхождения, а также в понима-

ние механизмов действия биологических препаратов на циркуляцию крови в капиллярах макроорганизма.

Выявлены параметры светодиодного и радиоизлучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности Е. coli Са58 и S. aureus 209Р. Результаты исследований MOiyr быть использованы в практике биомедицинских исследований действия разных видов излучений, а также в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодииамической и микроволновой терапии при лечении и профилактике гнойно-воспалительных заболеваний.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по общей микробиологии и экологии микроорганизмов, написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном университете имени Н.Г Чернышевского и Саратовском государственном техническом университете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий К coli Са58 претерпевают дозозависимые изменеиия под действием светодиодного красного (660 im) излучения на сенсибилизированную метилеповым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения — на несенсибилизиро-ванную культуру.

2. Популяционная численность К coli Са58 и S. aureus 209Р изменяется под действием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения различной поляризации и мощности.

3.. Аппликация бактериальных взвесей К coli, подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала Е. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки белых крыс, регистрируемых методом спехл-микроскопии.

Работа выполнена в рамках НИР СГТУ «Разработка методических подходов к комплексной оценке состояния живых организмов при действии различных экологических факторов», частично поддержала грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (СГУ, 2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка

когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики н фототерапии» (СГУ, 2009).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: Международных школах для молодых учёных и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, 2003; 2007); научных конференциях биологического факультета СГУ «Исследования молодых учёных и студентов в биологии, секция «Микробиология и паразитология» (Саратов, 2004; 2005; 2008); IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Заочной электронной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (2007 г.); ХП Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); 1-м этапе молодежного научно-инновационного конкурса «У.М.Н.И.К.» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Саратов, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 9 печатных работах, в том числе 3 - в изданиях из перечня ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных источников литературы. Работа изложена на 112 страницах, содержит 6 таблиц и 28 рисунков. Список использованных источников литературы включает 158 наименований, в том числе 54 работы зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы н методы

В качестве объектов исследования использовали микроорганизмы: Е. coli А5, Е. coli В, Е. coli В5, Е. coli Са58, Е. coli К12, Е. coli Ol и S. aureus 209Р, полученные из музея микроорганизмов кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г Чернышевского.

Во всех экспериментах использовали суточные культуры бактерий, выращенные на скошенном мясопептонном агаре (МПА) при 37 'С. Бактериальную взвесь го-

товили в стерильном физиологическом растворе по стандарту мутности №5 (500 млн. клеток в мл), путём последовательных разведений получали рабочую концентрацию 500 клеток в мл.

Для проведения экспериментов по облучению видимым излучением нами была

стоящая из источника постоянного тока, светодиодного излучателя и 18-ти ячеистой кюветы. Установка накрывалась стеклянным конусом-воронкой для создания асептических условий (рис. 1).

ный излучатель Ultra Lime 5™ с максимумом спектра испускания в синей области 467±10 нм и мощностью без фильтров порядка 700 - 800 мВт, с собирающим прозрачным фильтром - 100 мВт. В качестве источника красного НСИ - светодиод с длиной волны 660±10 нм и мощностью 6 мВт. В качестве источника радиоизлучения использовали СВЧ-излучатель Акватон - 01 (ООО «Телемак-Наука») с регулируемой мощностью, и сменными излучателями различной поляризации, длина волны испускаемого излучения составляла ~ 30 см, частота - 1 ГГц. В опытах применяли неполя-ризованное радиоизлучение мощностью 10 и 100 мкВт, а также радиоизлучение мощностью 1 мкВт с право- и левовращающей поляризацией. Во всех экспериментах использовали непрерывный режим излучения.

В экспериментах использовали культуры бактерий, не сенсибилизированные и сенсибилизированные метиленовым синим (МС) в качестве фотосенсибилизатора (Лабинская, 1978), обладающего максимумом поглощения при длинах волн 650 -670 нм. Перед постановкой опытов с сенсибилизированными культурами взвесь бактерий обрабатывали водно-спиртовым 2% раствором фотосенсибилизатора в соотношении фотосенсибилизатор к взвеси 1:15 в течение 30 минут при 37 'С, конечная

разработана схема опытной установки для облучения бактериальных взвесей, со-

Рис. 1. Схема экспериментальной установки

При проведении экспериментов использовали низкоинтенсивные светодиодные излучения (НСИ) видимого синего (467 нм) и красного (660 нм) диапазонов, а также дециметровое сверхвысокочастотное (СВЧ) радиоизлучение (30 см). В качестве источника синего НСИ использовали светодиод-

концентрация составляла 0,15%. Бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносили в ячейки кюветы и подвергали действию видимого НСИ, последовательно увеличивая экспозицию с 1 до 4 с и с 10 до 100 с в случае синего НСИ, атакже с 1 до 14 мин и с 6 до 84 с в случае красного НСИ. Контролем служили взвеси бактерий, не подвергнутые облучению. После облучения производили высев бактерий па МИЛ или среды Гисса. Через 24 -48 часов после инкубации при 37 'С определяли морфологические и физиологические характеристики: численность популяции бактерий и число КОЕ, морфологию колоний и клеток, особенности роста на питательных средах (Методы..., 1984; Темпер. Шильпикова, Переверзева.. 2004; Нетрусов, Егорова, Захарчук, 2005). Для изучения биохимической активности изучаемых штаммов использовали стандартные методики (Сидоров, Скородумов, Федотов, 1995). Определение чувствительности культуры Е. coli Са58 к антибиотикам - стрептомицину, тетрациклину, левоми-цетину, олеандомицину и гентамицину - осуществляли с помощью диско-диффузного метода. Учёт чувствительности к антибиотикам проводили путём измерения зоны задержки роста культуры (Ланчини, Паренти, 1985) и дальнейшей статистической обработки полученных данных.

Для анализа морфологии отдельных бактериальных клеток готовили микропрепараты из отдельных колоний и окрашивали генцианвиолетом, разведённым карболовым фуксином, либо по методу Грама. Микропрепараты изучали путём световой микроскопии под масляной иммерсией при помощи цифровой камеры-окуляра для микроскопа SCOPETEK® DCM 35 с выведением изображения на экран компьютера (увеличение 900х).

Для проведения экспериментов по воздействию низкоинтенсивного СВЧ-излучения дециметрового диапазона бактериальные взвеси предварительно высевали на МПА в чашки Петри и затем подвергали облучению. Во всех случаях излучатель аппарата Акватон - 01 помещали на расстоянии 10 см над поверхностью питательной среды и проводили воздействие поляризованным и неноляризованным радиоизлучением на бактерии в течение 10 мин. Учёт результатов проводили через двое суток для Е. coli Са58 и через сутки - для 51. aureus 209Р.

Исследования микроциркуляции крови методом спекл-микроскопии проводили в Научной бактериологической лаборатории НИЧ СГУ имени Н.Г. Чернышевского. При постановке экспериментов использовали микроскоп «Виолам», в который был

введен дополнительный источник когерентного света - He-Ne лазер с максимумом спектра испускания 633 нм и мощностью 1 мВт (Илларионов, 1994; Ульянова, Гани-лова, Ульянов, 2007).

В качестве экспериментальных животных использовали 46 беспородных белых крыс двух-, трёхмесячного возраста массой 180 - 200 г, без различия пола Для наркоза применяли внутримышечную инъекцию натриевой соли 5-этил-5-(1-метилбутил)-2,4,6-триокси-пиримидина (нембутал) из расчёта 0,5 мг на 1 г массы тела. Эксперимент проводился во время глубокого наркоза, адекватность анестезии оценивалась по частоте дыхания и зрачковому рефлексу (Чернух, Александров, Алексеев, 1984). Ла-паротомию выполняли по средней линии тела на протяжении ~1 - 1,5 см, после чего животное помещали на специальный термостабилизированный столик (t = 38 °С) и извлекали петлю тонкого кишечника с брыжейкой для наблюдения микроциркуляции. Регистрацию параметров микроциркуляции осуществляли через 10 - 15 минут после вскрытия брюшной полости для уменьшения послеоперационных изменений.

В исследованиях на петлю брыжейки наносили взвеси исследуемых штаммов Е. coli или супернатант культуры в объеме 0,5 мл и по истечении 1 мин проводили регистрацию исходящего сигнала спекл-микроскопа в течение 10 с. Супернатанты культур Е. coli А5 и Е. coli В6 получали путем центрифугирования при 600g. При изучении их влияния на кровоток повторные регистрации проводили через 2, 3, 4 и 5 мин для изучения динамики процесса; при изучении влияния бактериальных взвесей Е. coli В., Е. coli Са58, Е. coli К12, Е. coli Ol - регистрацию осуществляли в течение I минуты каждые 5 мин на протяжении 30 мин. В качестве ко1Ггроля использовали значения скорости кровотока до нанесения исследуемого материала Выходящий сигнал оцифровывался, записывался в wav-файл и затем обрабатывался при помощи оригинального алгоритма для прикладного пакета программ MathCAD 2001. Полученные данные представлены как изменения ширины полосы спектра (ШПС) флуктуации интенсивности сигнала для каждого временного периода регистрации.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стыодента Достоверными считали различия при вероятности ошибки Р<0.05 (95% доверительный интервал). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде М±т, где М - среднее арифметическое зна-

чение из выборки, m - стандартная ошибка средней (Ойвин. i960; Ашмарин, Воробьев. 1962; Ашмарин. Васильев. Амбросов. 1974; Урбах. 1975; Афифи. Эйзен, 1982).Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Microsoft Excel 2002 (for Windows).

Изменения морфофизиологических характеристик t. coli Ca58 при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений

В первой серии экспериментов проводили облучение бактериальной взвеси Е. coli Са58 (несенсибилизированной МС) синим НСИ в экспозиции 1 - 4 с и 10 -100 с. чему соответствовали дозы от 23 до 2300 Дж/см2. На основании полученных результатов были построены графики зависимости изменения числа КОЕ от экспозиции (рис. 2).

g 1400

g 1200 " 1000 soo 600 400 200 о

Рис. 2. Значения КОЕ при облучении взвеси Е. coli Са58 синим НСИ в экспозициях 1 — 4 с и 10 — 100 с

Выявлена стимуляция роста и наиболее благоприятный для изучаемого штамма Е. coli Са58 диапазон экспозиций 10 - 40 с (дозы 230 - 920 Дж/см2). причём устойчивый рост числа КОЕ относительно контроля наблюдался и при облучении в экспозициях 1 - 4 с, и в экспозициях 10 — 40 с На фоне общего увеличения численности популяций бактерий (по числу КОЕ) при воздействии светом с длиной волны 467 нм были отмечены следующие особенности: при облучении в экспозициях 10 - 40 с наблюдался дозозависимый эффект стимуляции клеточного деления, в результате происходило увеличение числа КОЕ; облучение в экспозициях 1 4 с характеризовалось

1 2 3 4 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

экспозиция, с

О опыт □ контроль

постепенным снижением угнетающего действия синего НСИ на бактерии: при облучении экспозициями дольше 50 с однотипной динамики не выявлено (см. рис. 2).

Далее были изучены особенности влияния красного НСИ в экспозициях от ' до 14 мин (дозы 342 - 4788 Дж/см") на бактериальную взвесь Е. coli Са58, сенсибилизированную MC (рис. 3).

ы О

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14

экспозиция, мин

ES опыт □ контроль

Рис. 3. Значения КОЕ при облученин взвеси Е. coli Са58 красным НСИ в экспозициях 1-14 мин

Установлены выраженные различия в численности популяций бактериальной культуры в зависимости от дозы облучения: стимуляция роста отмечена только при действии красного НСИ в экспозициях 7. 8 и 12 мин. которым соответствовали дозы облучения 2394. 2736 и 4104 Дж/см' соответственно. Показано, что действие красного НСИ с вышеуказанными дозами приводило к достоверному изменению размеров облучённых клеток по сравнению с контролем (рис. 4). Для изучения корреляции между численностью бактериальных популяций и размерами клеток нами было введено определение «площадь проекции клетки», представляющее собой произведение видимой длины клетки на её ширину (рис. 5).

а б

Рис. 4 Морфология и размеры клеток Е. coli Са58, сенсибилизированных метиленовым синим и облучённых красным НСИ (8 мин), - а; контрольных - б (отрезок соответствует 3 мкм)

экспозиция, мнн

средняя численность —Ö—"площадь проекции" клеток

Рис. 5. Корреляция между числом KOF и «площадью проекции» клеток при облучении взвеси Е. coli Ca 58 красным НСИ в экспозициях 1 - 14 мин

При действии на бактериальную взвесь красного НСИ в экспозициях 6 - 84 с. что соответствовало диапазону доз 34,2 - 478,8 Дж/см*. происходило достоверное и довольно резкое снижение численности популяции Е. coli Са58 (рис. 6). В отличие от предыдущих серий экспериментов, было отмечено достоверное угнетение роста культуры Е. coli Са58 при действии НСИ в присутствии сенсибилизатора.

экспозиция, с

Ej опыт □ контроль

Рис. 6. Значения КОЕ при облучении Е. coli Са58 красным ПСИ в экспозициях 6 - 84 с

Выраженный пессимум численности бактериальной культуры проявлялся при экспозициях дольше 36 с. При этом зависимости размеров клеток от численности популяции Е. coli Са58 не отмечено.

Исследование морфологических и культуральных особенностей Е. coli Са58 на фоне действия синего и красного НСИ не выявило принципиальных отличий по сравнению с аналогичными показателями контрольной культуры (табл. 1).

Таблица 1 - Морфология колоний Е. coli Са58 на фоне действия видимого НСИ

Морфологический признак Характе ристика

опыт контроль

Форма Прозрачность Характер поверхности Цвет Выделение пигмента в среду Характер края колонии Видимая структура колонии Консистенция Средние размеры круглые полупрозрачные, к центру почти непрозрачные гладкая, блестящая слабопигментированные нет гладкий однородная аморфная маслянистая вязкая до 3 - 4 мм круглые полупрозрачные гладкая слабопигментированные нет гладкий однородная вязкая не более 5 мм

Результаты исследований биохимической активности подвергнутых облучению

красным НСИ в экспозиции 8 мин (доза облучения, наиболее благоприятная для роста популяции) бактерий Е. coli Са58 показали (табл. 2). что происходила активизация

сахаролитических свойств в отношении сахарозы, дульцита и маннита. В то же время

протеолитическая активность не изменялась.

Таблица 2 - Биохимическая активность несексибклизированной и сенсибилизированной метиленовым синим Е. coli Са58 при действии красного НСИ

Условия опыта глюкоза сахароза дулъцит маннит лактоза сорбит L _____ желатин 1 триптофан индола 1

Е. coli Са58 1 - - + ±J - - - - -

Е. coli Са58 и MC + - - - + + - - - - -

Е. coli Са58, об- + + + + + + - - - - -

лучение и MC

Примечание: 1 - признак выражен; 2 - признак не выражен; 3 - признак выражен слабо.

Для более достоверной оценки изменений клеточного метаболизма были проведены эксперименты по изучению изменений чувствительности к антибиотикам исследуемого штамма Е. coli Са58. Выбор антибиотиков был обусловлен спектром их действия (подавление биосинтеза белка) и широтой практического использования. Облучение бактериальной взвеси красным НСИ рсуществляли в экспозициях, которым соответствовала максимальное увеличение численности популяций и изменения морфологических и физиологических показателей клеток - 7, 8 и 12 мин. Установлено, что облучение красным НСИ приводит к повышению устойчивости изучаемого штамма в случае использования всех антибиотиков (сужению зоны задержки роста), кроме левомицетина (рис. 7).

Изменения численности популяций Е. coli Са58 и S. aureus 209Р при действии низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения

При исследовании влияния облучения клеток S. aureus 209Р и Е. coli Са58 дециметровым радиоизлучением было выявлено изменение численности их популяций в зависимости от мощности и поляризации излучения (рис. 8 а, б). Действие радиоизлучениями мощностью 1 мкВт с право- и левовращающей поляризацией уменьшило число КОЕ S. aureus 209Р относительно контроля. Облучение клеток Е. coli Са58 излучением с левовращающей поляризацией привело к увеличению численности популяции, действие правовращающего СВЧ не выявило каких-либо достоверных изменений числа КОЕ.

- стрептом ицин -

- тетрациклин -

- левом пае :ин -

экспозиция, мин -олеандомицин —о— гентамицин

Рис. 7. Процентное отношение зоны задержки роста культуры Е coli Са58 в эксперименте к контролю (контроль - 100%)

200 150 100 50 0

□ правая И левая О контроль

S] правая Z левая □ контроль б

^ 200

! у 150 ■

4 -г

S 100

ЮмкВт ЮОмкВт

Ш опыт □ контроль

ЮмкВт ЮОмкВт

Ш опыт Qконтроль г

Рис. 8. - Изменения популяционной численности культур S. aureus 2Ü9P и Е. coli Са58 при облучении дециметровым радиоизлучением различной мощности и поляризации: а - S. aureus 209Р, 6 - /:'. coli Са58 (поляризация. I мкВт); в aureus 209Р: г - Е coli Са58 (неполяризованное СВЧ. 10 и 100 мкВт)

Воздействие 100 мкВт СВЧ на клетки S. aureus 209Р привело к увеличению численности популяции. Изменений численности популяций S. aureus 209Р, облучённого неполяризованным дециметровым радиоизлучением мощностью 10 мкВт и К coli Са58, облучённой неполяризованным СВЧ мощностью 10 и 100 мкВт, выявлено не было (рис. 8 в, г).

Изучение влияния различных штаммов Е. coli и токсинсодержащих материалов на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии

Для оценки действия in vivo бактериальных клеток, сенсибилизированных MC и подвергнутых действию красного НСИ, на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ex tempore использовали метод спекл-микроскопии. В этих опытах исследовали штаммы Е. coli с разными характеристиками: Е. coli В (дикий тип, представитель нормальной микрофлоры кишечника); Е. coli Са58 (лактозопозитивный, продуцент колицина Н, представитель нормальной микрофлоры кишечника); Е. coli К12 (лакто-зонсгативный, продуцент колицина I) и Е. coli Ol - лактозонегативный, зоопатоген-ный. При сенсибилизации бактерий концентрация MC была уменьшена до 0,005% в связи с полученными предварительно данными о фотодинамическом повреждении наблюдаемых сосудов при нанесении бактериальных взвесей, сенсибилизированных MC в концентрации 0,15%, как в предыдущих экспериментах.

Было показано, что изменения гемодинамики в микрососудах брыжейки белых крыс происходили в течение первых секунд после аппликации сенсибилизированных и облучённых бактериальных взвесей штаммов Е. coli В, Е. coli Са58, Е. coli К12, Е. coli Ol (рис. 9) и отличались шириной полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала для каждого штамма.

При нанесении взвесей Е. coli В и Е. coli Са58, облучённых красным НСИ, отмечалось незначительное увеличение скорости кровотока. Динамика кровотока восстановилась на 15 мин наблюдения в обоих случаях. Более значительное повышение скорости кровотока было вызвано аппликацией на брыжейку взвеси Е coli К12 после воздействия на неё красного НСИ. Установлено, что через 20 мин после нанесеиия бактериальной взвеси скорость кровотока стабилизировалась, оставаясь, однако, выше, чем в контроле.

ШПС.Гн 250

—*— контроль

-Е. coll В Е. СОЙ К12 - В. coli Ca 5 В

-£ coh Ol

Рис. 9. Динамика кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс после нанесения взвесей клеток Е. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и облученных красным низкоинтенсивным светодиодным излучением

В отличие от этого, аппликация облученной взвеси Е. coli Ol приводила к значительному (более, чем в 3 раза) и продолжительному (свыше 30 мин) замедлению по сравнению с контролем.

Затем исследовали в аналогичных условиях in vivo ex tempore действие супер-натантов культур Е. coli А5 и Е. coli В6, продуцирующих экзо- и эндотоксин соответственно (Волкова, 2006), на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс. Показано, что аппликация экзотоксинсодержащего супернатанта приводила к значительному ускорению микроциркуляции крови в капиллярах, отмечено достоверное динамическое увеличение ширины полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала со среднего значения 75,97 Гц в контроле до средпего значения 135,87 Гц на 5 мин наблюдения (рис. 10а).

При нанесении эндотоксинсодержащего материала изменения скорости кровотока были менее выражены, наблюдались колебания значения ширины полосы спектра относительно контроля (рис. 106).

Таким образом, проведешше исследования позволили оценить изменения численности популяций S, aureus 209Р, а также численности популяций, морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов Е. coli при действии in vitro излучений антро-

погенной природы - некогерентного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм), дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона с разной поляризацией и мощностью. Полученные результаты вносят вклад в понимание процессов адаптации микроорганизмов к действию физических экологических факторов.

ШПС, Гц

время, с

контроль ■ 2 минута А 3 минута X 4 минута Ж 5 минута

ШПС, Гц 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 60

123456789 10

___ _ время, с

—-контроль А 2 минута 'И 3 минута * 4 минута • 5минута

Рис. 10. Динамика кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс после нанесения экзотоксинсодержащего материала Е. coli А5 (а) и эндотоксинсодержащего материала

Е. coli В5 (б)

Изучение влияния разных штаммов К coli на скорость кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс in vivo методом спекл-микроскопии позволило определить характер их взаимодействия с организмом хозяина, и обосновать возможность использования этого метода при скрининге микробиологических и фармацевтических биопрепаратов.

ВЫВОДЫ

1. Показано достоверное увеличение численности популяции Е. coli Са58 при облучении несенсибилизированной взвеси бактериальных клеток светодиодным синим излучением (467 нм) в экспозициях 10 - 40 с.

2. Выявлены изменения численности популяции Е. coli Са58, уменьшение размеров клеток, стимуляция сахаролитической активности и повышение резистентности к большинству исследованных антибиотиков при действии на сенсибилизированную метиленовым синим бактериальную взвесь красного (660 нм) низкоинтенсивного светодиодного излучения в дозах 2394, 2736 и 4104 Дж/см2; отмечено достоверное снижение числа КОЕ Е. coli Са58 без изменения размеров клеток при действии этого излучения в диапазоне доз 34,2 - 478,8 Дж/см2.

3. Установлена зависимость изменений числепности популяций Е. coli Са58 и S. aureus 209Р от поляризации и мощности низкоинтенсивного дециметрового радиоизлучения; достоверных изменений морфологических показателей исследуемых штаммов не было выявлено.

4. Выявлены изменения микроциркуляции крови при аппликации микроорганизмов, подвергнутых фотодинамическому воздействию, на капилляры брыжейки белых крыс: ускорение кровотока отмечено при нанесении бактериальных клеток Е. coli В, Kcoli Са58 и К coli К12, а также токсинсодержащих материалов Е coli А5 и Е. coli В6; замедление кровотока- при действии взвеси клеток Е. coli Ol.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ (* в журналах из списка ВАК РФ)

1. Подшибякин, Д.В. Влияние некогереэтного красного светодиодного излучения на рост сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli /Д.В. Подшибякин, Д.В. Рудик // Исследования молодых учёных и студентов в биологии: сборник научных трудов. - Саратов: Изд-во СГУ, 2005. - Выи. 3. - С.74 - 77.

2. Подшибякин, Д.В. Особенности роста и чувствительность к некоторым антибиотикам сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli при действии некогерентного красного светодиодного излучения / Д.В. Подшибякин, Д.В, Рудик, Е.И. Тихомирова, Д.Э. Попов // В сборнике тезисов докладов на IV съезде фотобиологов России. - Саратов, 2005. - С. 159 - 161.

3. Podshibyakin, D.V. The affect of low-coherent light on microbial colony forming ability and morphology of some gram-positive and gram-negative bacteria / D.Ed. Popov, E.S. Tuchina, Ju.A. Chernova, D.V. Podshibyakin, D.V. Rudik, M. Samsonova, I. Gromov, V. V. Tuchin // Proceedings of SPIE, «Optical Technologies in Biophysics and Medicine». -Washington, 2005.-V. 5771.-P. 353-356.

4. Подшибякин, Д.В. Влияние токсина Escherichia coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс / Д.В. Подшибякин, С.С. Ульянов, О.В. Ульянова, Е.И. Тихомирова, М.А. Шибаева // Фундаментальные исследования. - 2007. - №12 -С. 266-267.

5. "Подшибякин, Д.В. Оценка действия цитокинов in vivo на микроциркуляцию крови методом спекл-микроскопии / М.А. Шибаева, Е.И. Тихомирова, Д.В. Подшибякин, О.В. Ульянова, С.С. Ульянов // Российский иммунологический журнал. - 2008. -Т.2 (11), №2-3. - С. 138.

6. Подшибякин, Д.В. Использование метода спекл-микроскопии для оценки действия токсин продуцирующих штаммов кишечной палочки на микроциркуляцию крови / Д.В. Подшибякин, Е.И. Тихомирова, О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, М.А. Шибаева // Известия Саратовского университета. Серия «Химия. Биология. Экология». -2008. - Т.8., Вып. 2. - С. 73 - 76.

7. Podshibyakin D. V., The affect of Escherichia coli toxins on blood microcirculation in ventral mesentery of white rats / D.V. Podshibyakin, S.S. Ulyanov, O.V. Ulianova, E.I. Tikhomirova, M.A Shibaeva // European Journal of Natural History. - 2009. - № 2. - P. 62 -65.

8. *Подшибякин, Д.В. Влияние низкошггенсивного длинноволнового излучения видимого диапазона на рост и жизнеспособность сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli / Д.В. Подшибякин // Естественные и технические науки. - 2009. - №5. - С. 94 - 96.

9. *Подшибякин, Д.В. Использование метода спекл-микроскопии для оценки влияния биопрепаратов на микроциркуляцию крови / О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, Д.В. Подшибякин, М.Л. Шибаева, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - №6. - С. 40 - 46.

Автор выражает искреннюю благодарность доктору физико-математических наук, профессору Ульянову Сергею Сергеевичу и кандидату медицинских наук, доценту Ульяновой Онеге Владимировне за предоставленную возможность проведения совместных исследований в Научной бактериологической лаборатории НИЧ СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Подписано в печать 21.01.2010 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гаршпура Типев. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 031/2010

Типография ОООп «Орион» 410031, г. Саратов, ул. Московская, 62 тел.: (8452) 23-60-18

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Подшибякин, Дмитрий Васильевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика действия разных типов излучений на бактериальные клетки

1.2. Механизмы действия разных типов излучений на микроорганизмы

1.3. Фотосенсибилизаторы и фотодинамическое действие излучений на микроорганизмы

1.4. Обоснование выбора микроорганизмов для исследования

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы и методы

2.1.1.Микроорганизмы

2.1.2. Источники излучения и фотосенсибилизаторы

2.1.3. Микробиологические методы исследования

2.1.4. Моделирование влияния излучений на бактерии

2.1.5. Подготовка лабораторных животных к исследованию микроциркуляции крови

2.1.6. Использование метода спекл-микроскопии

2.1.7. Статистическая обработка результатов

2.2. Собственные результаты и их обсуждение

2.2.1. Изменения морфофизиологических характеристик Е. coli Са58 при действии синего и красного низкоинтенсивного светодиодных излучений

2.2.2. Изменения численности популяций Е. coli Са58 и S. aureus 209Р при действии низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения

2.2.3. Изучение влияния различных штаммов Е. coli и токсинсодержащих материалов на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов"

Актуальность темы

Изучение морфофизиологических характеристик условно-патогенных бактерий и их взаимодействия с организмом животных и человека представляет традиционно большой интерес в области прикладной микробиологии, в то же время актуальными задачами являются исследования состояния микробных популяций и их адаптационного потенциала на фоне действия стрессовых факторов различной природы (Шендеров, 1994; 1998; Белобородова, 1998; Митрохин, 2000; Доронин, Шендеров, 2002; Ильин, Воложин, Виха, 2005; Ильина, 2006; Тихомирова, 2005; Shrivastava, 2007).

В настоящее время в медико-биологических исследованиях и в клинической практике для достижения выраженного фотодинамического эффекта по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмов, равно как и с целью терапевтического воздействия на макроорганизм, широко используются электромагнитные излучения с различными длинами волн (Фрайкин и др., 1986; Зорина и др., 1988; Страховская и др., 1998; Тучин, 1998; Страховская и др., 2002а; 20026; Шумарина и др., 2003; Soukos, Xi-menez-Fyvie, Hamblin, 1998; Bliss et al., 2004; Hamblin, Hasan, 2004; Lin, Chen, Huang, 2004; Maisch et al., 2005; Wong, 2005).

1996; Zeina et al., 2001; Tuchin et al, 2003). В литературе достаточно широко описаны эффекты действия на микроорганизмы ионизирующих и УФ-излучений (Владимиров и др., 1975; Цзю, Джаманова, Прохорова, 1983; Фрайкин и др., 1986; Беленикина, Фрайкин, 1989); в то время как влияние видимого света и, особенно, длинноволновых (ИК- и радиодиапазона) излучений остаётся практически не исследованным. При этом следует отметить, что изучение эффектов, оказываемых излучениями на бактерии, имеет и фундаментальный характер, поскольку излучения способны оказывать как положительное, так и отрицательное влияние, механизмы которого не ясны до настоящего времени (Рубин, 1973; Тимошин, Бекер, 1990; Тимошин, Да-нилевич, Рапопорт, 1991; Трушин, 2002). Данных о стрессовых реакциях микроорганизмов на действие этих типов излучений, используемых в ФДТ, и оценке их адаптационного потенциала, недостаточно, а их получение представляет значительный научный интерес и может иметь прикладное значение.

Микроорганизмы и биологические препараты, созданные на их основе, могут неоднозначно действовать на макроорганизм, вызывая как местные, так и общие побочные реакции за счёт различных метаболитов (Мельников, 1969; Бондаренко, 1999; Воробьев, 1999; Тихомирова, 2005; Brubaker, 1985; Isenberg, 1988; Finley, Falkow, 1989; Bhakdi, Tranum-Jensen, 1991; Falkow, Is-berg, Portnoy, 1992; Dougan, 1994). В общем случае местные патологические реакции приводят к нарушениям лимфо- и гемодинамики, прежде всего в микрососудах. Подобные изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма (Борисов, Дворкина, Корнеева, 1985; Галанжа, 2004; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007). Для оценки этого влияния в последние годы в биомедицинской практике используется спекл-микроскопия, позволяющая in vivo в режиме реального времени провести наблюдение за изменениями гемодинамики сосудов (Тучин, 1998; Федосов, Ульянов, 2001; Ульянова, 2006;

Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007; Aizu et al., 1990; Ulyanov, 1995; 2001; 2002).

Цель работы — изучить изменения численности популяций, морфологических и физиологических характеристик бактерий Staphylococcus aureus 209Р и Escherichia coli в условиях in vitro при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений (НСИ), дециметровых сверхвысокочастотных (СВЧ) радиоволн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов Е. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

Научная новизна

Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов Е. coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений. Определён дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов Е. coli при действии красного НСИ. Впервые установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов Е. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения. Впервые показаны изменения скорости кровотока в брыжейке белых крыс ex tempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток Е. coli разных штаммов. Обнаружено увеличение скорости кровотока в первые минуты после аппликации на брыжейку белых крыс супернатанта необлученных и несенсибилизированных штаммов Е. coli, содержащего экзо- или эндотоксин.

Практическая значимость

Полученные результаты вносят вклад в разделы микробиологии, связанные с исследованиями процессов адаптации микроорганизмов к действию стрессовых факторов антропогенного происхождения, а также в понимание механизмов действия биологических препаратов на циркуляцию крови в капиллярах макроорганизма.

Выявлены параметры светодиодного и радиоизлучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности Е. coli Са58 и S. aureus 209Р. Результаты исследований могут быть использованы в практике биомедицинских исследований действия разных видов излучений, а также в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодинамической и микроволновой терапии при лечении и профилактике гнойно-воспалительных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий Е. coli Са58 претерпевают дозозависимые изменения под действием светодиодного красного (660 нм) излучения на сенсибилизированную метиленовым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения - на несенсибилизированную культуру.

2. Популяционная численность Е. coli Са58 и S. aureus 209Р изменяется под действием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения различной поляризации и мощности.

3. Аппликация бактериальных взвесей Е. coli, подвергнутых фото динамическому воздействию, и токсинсодержащего материала Е. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки белых крыс, регистрируемых методом спекл-микроскопии.

Работа выполнена в рамках НИР СГТУ «Разработка методических подходов к комплексной оценке состояния живых организмов при действии различных экологических факторов», частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (СГУ, 2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (СГУ, 2009).

Апробация работы

Основные результаты и положения работы представлены на: Международных школах для молодых учёных и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, 2003; 2007); научных конференциях биологического факультета СГУ «Исследования молодых учёных и студентов в биологии, секция «Микробиология и паразитология» (Саратов, 2004; 2005; 2008); IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Заочной электронной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (2007 г.); XII Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); 1-м этапе молодежного научно-инновационного конкурса «У.М.Н.И.К.» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Саратов, 2009).

Публикации

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 9 печатных работах, в том числе 3 - в изданиях из перечня ВАК РФ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При изучении воздействий на микроорганизмы различных внешних факторов, в том числе и излучений, традиционно оценивают принятые в микробиологических исследованиях показатели: жизнеспособность, численность популяции бактерий, морфологию клеток и колоний, особенности роста на питательных средах и биохимическую активность. Наряду с оптической плотностью бактериальных суспензий, хемилюминесценцией микробных клеток и другими показателями они позволяют быстро и объективно оценить состояние микробных популяций in vitro (Фомичев и др., 1991; Страховская и др., 2002).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Подшибякин, Дмитрий Васильевич

ВЫВОДЫ

2. Выявлены изменения численности популяции Е. coli Са58, уменьшение размеров клеток, стимуляция сахаролитической активности и повышение резистентности к большинству исследованных антибиотиков при действии на сенсибилизированную метиленовым синим бактериальную взвесь красного (660 нм) низкоинтенсивного светодиодного излучения в дозах 2394, 2736 и 4104 Дж/см ; отмечено достоверное снижение числа КОЕ Е. coli Са58 без изменения размеров клеток при действии этого излучения в диапазоне доз 34,2 - 478,8 Дж/см2.

3. Установлена зависимость изменений численности популяций Е. coli Са58 и S. aureus 209Р от поляризации и мощности низкоинтенсивного дециметрового радиоизлучения; достоверных изменений морфологических показателей исследуемых штаммов не было выявлено.

4. Выявлены изменения микроциркуляции крови при аппликации микроорганизмов, подвергнутых фотодинамическому воздействию, на капилляры брыжейки белых крыс: ускорение кровотока отмечено при нанесении бактериальных клеток Е. coli В, E.coli Са58 и Е. coli К12, а также токсинсодер-жащих материалов Е. coli А5 и Е. coli В6; замедление кровотока - при действии взвеси клеток Е. coli Ol.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время значительно возрос интерес исследователей к взаимоотношениям живых организмов с окружающей средой и другими организмами, в том числе и взаимоотношениям микроорганизмов с организмом хозяина (Шендеров, 1994; 1998; Белобородова, 1998; Бондаренко, 1999; Воробьев, 1999; Митрохин, 2000; Доронин, Шендеров, 2002; Нетрусов и др., 2004; Ильин и др., 2005; Ильина, 2006; Тихомирова, 2005; Shrivastava, 2007). В связи с этим приобретают важное значение проблемы изучения адаптационных механизмов и стресса у бактерий (Баснакьян, 1974; 1992; Баснакьян и др., 1981, 1996; Алексахина, Баснакьян, 1999; Bhatnagar et al., 1995; Foster, Spector, 1994; Hanawa et al., 1995; Pannekoek et al., 1992; Robbe-Saule et al., 1995; Rouquette et al., 1998), синтеза ими стрессорных белков, по-видимому, играющих роль протекторов бактериальной клетки, а также, вероятно, имеющих значение в качестве протективных антигенов. Особое значение в этой проблеме имеет соотношение между стрессом у бактерий и их вирулентностью для макроорганизма (Баснакьян и др., 2001).

Понятием «стресс» определяют общий комплекс неспецифических компенсаторно-приспособительных процессов, развивающихся у организмов в ответ на воздействие раздражителей-стрессоров (Большой энциклопедический словарь, 2001). Стрессовые условия возникают, когда значения тех или иных параметров среды выходят за пределы нормы (Работнова, 1973; Работ-нова, Позмогова, 1979; Баснакьян и др., 1981; Работнова и др., 1981; Баснакьян, 1982; Мельникова, Баснакьян, 1984а; Современная микробиология, 2005). Растущие клетки испытывают множество различных стрессов, влияющих на их биохимическую активность (Мельникова и др., 1984; Мельникова, Баснакьян, 19846; Позмогова, 1983). В общем смысле любое изменение параметров окружающей среды, вызывающее значительное изменение в физиологическом состоянии клеток, можно рассматривать как стрессовое воздействие.

При этом, с увеличением влияния стрессоров на бактериальные клетки в последних могут происходить как качественные (экспрессия новых генов), так и количественные (перемены баланса уже существующих систем) изменения). Первоначальный ответ микробных клеток на любой стресс направлен на то, чтобы нивелировать вызванные им изменения внутриклеточного равновесия. Почти во всех случаях этот первый ответ основан на уже действующих биохимических активностях, которые могут быть конститутивными или индуцибельными, но на низком уровне экспрессирующимися даже в отсутствие явного стресса. Такой общий ответ не связан со специфическими для экстремальных условий функциями, но обусловлен просто стимуляцией обычных биохимических путей, поставляющих строительные блоки для процессов биосинтеза при росте клеток. Во вторую очередь могут происходить изменения в экспрессии множества генов, кодирующих синтез белков, которые не синтезируются в оптимальных условиях. Среди этих так называемых стрессорных белков есть немало общих не только для разных стрессоров, но и для различных видов бактерий. Они играют важную роль в биологии бактериальных клеток, являясь протекторами-шаперонами, защищающими клетки от вредных воздействий, повышают выживаемость клеток, благодаря чему может восстанавливаться быстрый рост культур.

Синтез микробными клетками факторов вирулентности также можно рассматривать в качестве ответа на стрессовое воздействие, развивающегося по общему принципу стрессовых реакций. Стресс-реакции играют в патогенезе две различные роли. Во-первых, типичные ответы клеток на стрессовые условия обеспечивают обход микробами механизмов защиты, которыми обладает организм-хозяин. Во-вторых, восприятие средовых стимулов позволяет бактериям экспрессировать специфические белки, способствующие развитию инфекционного процесса. Синтез этих белков, зависящий от влияния факторов среды, регулируется посредством механизмов, общих для регуляции различных стресс-реактивных генов.

Таким образом, микроорганизмы и их метаболиты могут неоднозначно действовать на макроорганизм, вызывая как местные, так и общие побочные реакции (Нетрусов, Котова, 2006; Тихомирова, 2005), которые, в общем случае, приводят к нарушениям лимфо- и гемодинамики, прежде всего в микрососудах. Подобные изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма (Борисов и др., 1985; Зайчик, Чурилов, 1999; Галанжа, 2004; Ульянова и др., 2007). В практике медико-биологических исследований в последние годы для оценки этого влияния используется спекл-микроскопия, позволяющая in vivo в режиме реального времени провести наблюдение за изменениями гемодинамики сосудов (Тучин, 1998; Федосов, Ульянов, 2001; 2006, Ульянова и др., 2007; Aizu et al., 1990; Ulyanov, 1995; 2001; 2002).

В связи с вышеизложенным, представляло интерес изучить влияние различных типов излучений на морфологические и физиологические показатели условно-патогенных бактерий, являющихся типичными представителями нормальной микрофлоры человека и животных, а также влияние облучённых и необлучённых бактерий на макроорганизм. Выбор штаммов Е. coli был обусловлен различиями в механизмах адаптации и взаимодействия с организмом хозяина.

Нами были отмечены изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метилено-вым синим клеток Е. coli Са58 при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений, а также установлен дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов Е. coli при действии красного НСИ. Также было установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов Е. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения.

Впервые показано изменение скорости кровотока в брыжейке белых крыс ex tempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток Е. coli разных штаммов. Установлено немедленное увеличение скорости кровотока при аппликации на брыжейку белых крыс су-пернатанта необлученных и несенсибилизированных штаммов Е. coli, содержащего экзо- или эндотоксин.

При изучении действия синего НСИ была выявлена стимуляция роста бактериальных клеток штамма Е. coli Са58 для изучаемого диапазона экспол зиций 10-40 с (дозы 230 - 920 Дж/см ), который оказался наиболее благоприятным. Устойчивый рост числа КОЕ относительно контроля отмечен и при облучении в экспозициях 1 - 4 с, и в экспозициях 10-40 е., для которых характерным был дозозависимый эффект стимуляции клеточного деления, а; облучение в экспозициях 1 — 4 с характеризовалось постепенным ослаблением угнетающего действия синего НСИ.

При действии красного НСИ стимуляция роста отмечена только в экспозициях 7, 8 и 12 мин, которым соответствовали дозы облучения 2394, 2736 и 4104 Дж/см2 соответственно. При этом происходило и достоверное изменение размеров облучённых клеток по сравнению с контролем. При действии на бактериальную взвесь красного НСИ в экспозициях 6 - 84 с, что соответствовало диапазону доз 34,2 - 478,8 Дж/см , отмечено достоверное и довольно резкое снижение численности популяции Е. coli Са58, а также достоверное угнетение роста культуры в присутствии сенсибилизатора. Выраженный пессимум численности бактериальной культуры проявлялся при экспозициях дольше 36 с. При этом зависимости размеров клеток от численности популяции Е. coli Са58 не отмечено.

Нами не выявлено принципиальных отличий по сравнению с морфологических и культуральных характеристиками контрольной культуры клеток Е. coli Са58 на фоне действия синего и красного НСИ. Результаты исследований биохимической активности подвергнутых облучению красным НСИ в экспозиции 8 мин бактерий Е. coli Са58 показали, что происходит активизация сахаролитических свойств в отношении сахарозы, дульцита и маннита. В то же время протеолитическая активность не изменяется.

Также были проведены эксперименты по изучению резистентности сенсибилизированной Е. coli Са58, облучённой красным НСИ, к ряду антибиотиков. Выбор антибиотиков был обусловлен их широким использованием, а также спектром их действия (подавление биосинтеза белка). Исходя из установленного факта активации клеточного размножения и соответствующих изменений метаболизма клеток, облучение осуществляли в экспозициях, которым соответствовали максимумы числа КОЕ. Установлено, что облучение повышает устойчивость Е. coli Са58, в результате чего происходит сужение зоны задержки роста облучённой культуры в случае использования всех антибиотиков, кроме левомицетина. По-видимому, облучение бактерий в указанных условиях приводит к усилению биосинтеза белка клетками, что позволяет компенсировать угнетение со стороны антибиотиков.

В результате облучения культур Е. coli Са58 и S. aureus 209Р низкоинтенсивным дециметровым СВЧ-радиоизлучения различной мощности и поляризации было установлено увеличение численности популяций Е. coli Са58 при воздействии излучением с левовращающей поляризацией мощностью 1 мкВт; воздействие 1 мкВт излучением с право- и левовращающей поляризацией привело к уменьшению численности популяций S. aureus 209Р в обоих случаях, также наблюдалось увеличение численности S. aureus 209Р при облучении неполяризованным радиоизлучением мощностью 100 мкВт. Изменений численности популяций S. aureus 209Р, облучённого неполяризованным дециметровым радиоизлучением мощностью 10 мкВт и Е. coli Са58, облучённой неполяризованным СВЧ мощностью 10 и 100 мкВт, выявлено не было.

Следует отметить, что в целом ответ изучаемых штаммов бактерий на воздействие низкоинтенсивным дециметровым СВЧ-радиоизлучением находился в пределах нормы реакции бактерий на действие радиоизлучения как физического экологического фактора антропогенного происхождения. Тем не менее, принимая во внимание особенности действия волн радиодиапазона на биологические объекты, нельзя отрицать возможности проявления отдалённых последствий такого влияния в ряду поколений микроорганизмов.

При исследовании in vivo ex tempore влияния сенсибилизированных МС и подвергнутых действию красного НСИ бактериальных взвесей штаммов Е. coli В, Е. coli Са58, Е. coli К12, Е. coli Ol на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс было показано, что изменения гемодинамики в микрососудах происходят в течение первых секунд после аппликации. При этом, аппликация взвесей Е. coli В и Е. coli Са58, сенсибилизированных МС и облучённых красным НСИ, приводила к незначительному увеличение скорости кровотока. Динамика кровотока восстановилась на 15 мин наблюдения. Более значительное повышение скорости кровотока было вызвано аппликацией на брыжейку взвеси обработанной МС и облучённой красным НСИ взвеси Е. coli К12. В данном случае через 20 мин после нанесения бактериальной взвеси происходила стабилизация кровотока, однако скорость его оставалась выше, чем в контроле. В случае же с аппликацией сенсибилизированной и облученной взвеси Е. coli Ol скорость кровотока значительно замедлялась и оставалась сниженной, по сравнению с контролем, на протяжении всего периода наблюдения.

Таким образом, было установлено, что изменения показателей скорости кровотока в капиллярах брыжейки белых крыс находятся в зависимости от свойств действующих взвесей штаммов Е. coli — бактерии, являющиеся типичными представителями микрофлоры кишечника человека и животных, приводили лишь к незначительным и обратимым в рассматриваемом интервале времени изменениям скорости кровотока в капиллярах брыжейки, даже если они обладали колициногенной активностью. В то же время, аппликация бактериальных взвесей штаммов, не входящих в состав нормальной микрофлоры, приводила к устойчивым изменениям параметров кровотока, не возвращающимся к норме за время наблюдения. Так, в случае действия взвеси зоопатогенного штамма Е. coli Ol отмечено резкое замедление микрогемо-циркуляции, причём параметры движения крови значительно отличались от контрольных на всём протяжении эксперимента; а также характеризовались относительной нестабильностью, что выражалось в резком (в 1,5 раза) ускорении кровотока на 25 - 30 мин наблюдения.

Подобные изменения микроциркуляции крови при аппликации на брыжейку бактериальных взвесей различных штаммов Е. coli можно рассматривать как комплекс реакций взаимоадаптации между микро- и макроорганизмом, направленных на установление симбиотических взаимоотношений различного спектра - от кооперации до паразитизма и определяющий соответствующую стратегию поведения.

Изучение in vivo влияния токсинсодержащих материалов культур Е. coli А5 и Е. coli В6 на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс ех tempore методом спекл-микроскопии выявило более резкую реакцию организма экспериментального животного. При аппликации экзотоксинсодержа-щего супернатанта Е. coli А5 происходило увеличение скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки почти в два раза, на протяжении пяти минут было отмечено достоверное динамическое увеличение ширины полосы спектра (ШПС) флуктуации интенсивности сигнала со среднего значения 75,97 Гц в контроле до среднего значения 135,87 Гц на 5 мин наблюдения. Нанесение эндотоксинсодержащего супернатанта Е. coli В6 не привело к однозначным изменениям скорости кровотока: наблюдались колебания значения ШПС относительно контроля, т.е. параметры микроциркуляции крови оказались дестабилизированы и колебались относительно среднего значения ШПС ~75 Гц, что примерно соответствовало контролю.

Таким образом, полученные результаты на отдельных популяциях модельных микроорганизмов обосновывают необходимость дальнейших исследований в условиях in vivo и in vitro адаптационного потенциала микроорганизмов, влияния на них физических факторов окружающей среды, а также их взаимодействия с организмом животных и человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Подшибякин, Дмитрий Васильевич, Саратов

1. Абрамова, Н.В. Влияние маломощного когерентного излучения на выживаемость дрожжей Saccharomyces cereviae штамм 14 / Н.В. Абрамова // Электронная обработка материалов. 1978. - №1. — С. 65 - 66.

2. Айсон, Х.Х. Лимфообразование / Х.Х. Айсон // В кн.: Физиология кровообращения: физиология сосудистой системы. — Л.: Наука, 1984. — С. 307 -317.

3. Александров, М.Т. Применение лазеров в медицине / М.Т. Александров, А.С. Федоров. М.: изд. ЦНИИ «Электроника», 1986. - 234 с.

4. Афифи, А. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ / А. Афифи, С. Эйзен. М.: Мир, 1982. - 488 с.

5. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, Н.Н. Васильев, В.А. Амбросов Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. - 76 с

6. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л.: Изд-во мед. лит-ры, 1962.- 180 с.

7. Байбеков, И.М. Морфологические основы низкоинтенсивной лазеротерапии / И.М. Байбеков, А.Х. Касымов, В.И. Козлов. Ташкент: Изд-во им. Ибн-Сины, 1991.-223 с.

8. Баснакьян, И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами /И.А. Баснакьян. — М.: Медицина, 1992. 189 с.

9. Баснакьян, И.А. Стресс-индуцибельные бактериальные белки и вирулентность / И.А. Баснакьян // Журнал микробиологии. 2001. - №5. - С. 101-108.

10. Баснакьян, И.А. Стрессорные белки у бактерий / И.А. Баснакьян, В.А. Мельникова // Журнал микробиологии. 1996. - №6. — С. 99 - 103.

11. Беднов, А.А. Оптический мониторинг движения лимфы в микрососудах / А.А. Беднов, Е.И. Захарова (Галанжа) // В сб.: Проблемы оптической физики. Саратов, 1997. - С. 152 - 153.

12. Беленикина, Н.С. Эффект фотосинергизма при действии длинноволнового УФ-излучения и видимого света на клетки дрожжей / Н.С. Беленикина, Г.Я. Фрайкин // Биофизика. 1989. - Т.34, Вып.4. - С.627 - 629.

13. Белобородова, Н.В. О микрофлоре хозяина и ее участии в ответе на инфекцию / Н.В. Белобородова // Антибиотики и химиотерапия. 1998. — № 9. - С. 44 - 48.

14. Бондаренко, В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии. 1999. - №5. - С. 34 - 39.

15. Борисов, А.В. Влияние воздействия лазера на пути лимфо- и ге-моциркуляции и тучные клетки в эксперименте / А.В. Борисов, М.И. Дворки-на, Н.Т. Корнеева // Влияние лазерного излучения на здоровье человека. Л.: Медицина, 1985. - С. 118

16. Брилль, Г.Е. Молекулярные аспекты биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения / Г.Е. Брилль // Актуальные проблемы патологии. — Саратов, изд-во Саратовского ун-та, 2001. С. 124 - 136.

17. Васильев, Н. Е. Антимикробная фотодинамическая терапия / Н.Е. Васильев, А.П. Огиренко // Лазерная медицина. 2002. - Т.6, №1 - С. 32 - 38.

18. Влияние стафилококкового токсина на систему микроциркуляции / Г.Е. Брилль, и др. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1992. - №1. - С. 21 - 23.

19. Возможности применения фотосенсибилизаторов, производных хлорина е6 в дерматологической практике / Ю.В. Алексеев, и др. // В сборнике тезисов докладов на IV съезде фотобиологов России. Саратов, 2005. — С. 5-7.

20. Волкова, М.В. Разработка экспериментальной живой вакцины для профилактики колибактериоза свиней: дис. . канд. биол. наук / М.В. Волкова. Саратов: СГАУ. - 2006. - 154 с.

21. Воробьев А.А. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов / А.А. Воробьев // Журнал микробиологии. 1999. - №5. - С. 16-21.

22. Воробьева, Л.И. Внеклеточный белок Luteococcus japonicus subsp. casei реактивирует клетки, инактивированные ультрафиолетовым облучением и нагреванием / Л.И. Воробьева, Е.Ю. Ходжаев, Г.М. Пономарева // Микробиология. 2003. Т. 72, №4. - С. 482 - 487.

23. Галанжа, Е.И. Микролимфодинамика в норме и патологии. Оптические методы исследования: дис. . докт. мед. наук / Е.И. Галанжа. Саратов: СГУ, 2004.

24. Гамбарян, П.П. Крыса / П.П. Гамбарян, Н.М. Дукельская. М.: Советская наука, 1955. — 220 с.

25. ГОСТ Р 50723-94: Лазерная безопасность. Общие требования безопасности при разработке и эксплуатации лазерных изделий. М.: Издательство стандартов, 1995. — 34 с.

26. Готовский, Ю.В. Цветовая светотерапия / Ю.В. Готовский, А.П. Вышеславцев, Л.Б. Косарева. М.: ИМЕДИС, 2001 - 231 с.

27. Гримблатов, В.М. Современная аппаратура и проблемы низкоинтенсивной лазерной терапии // В сб.: Применение лазеров в биологии и медицине. Киев, 1996. - С. 123 - 127.

28. Громов, Б.В. Экология бактерий: Учебное пособие / Б.В. Громов, Г.В. Павленко. Л.: Изд-во ЛГУ, 1989. - 248 с.

29. Давыдов, А.С. Солитоны в молекулярных системах / А.С. Давыдов. Киев: Наукова думка, 1984. - 288 с.

30. Дерябин, Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность / Д.Г. Дерябин. Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - 238 с.

31. Джоунс, Р. Голографическая и спекл-интерференция / Р. Джоунс, К. Уайкс. М.: Мир, 1986. - 286 с.

32. Доронин, А.Ф. Функциональное питание / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров. -М.: ГРАНТЪ,2002. 296 с.

33. Журавлева, JI.A. Светотерапия при тонзиллитах / JI.A. Журавлева, И.И. Чанков, Т.В. Коннова // Сборник научно-практических материалов первого межрегионального совещания. — Томск, 2004. С. 29 - 32.

34. Зайчик, А.Ш. Основы общей патологии. Часть 1. Основы общей патофизиологии (Учебное пособие для студентов медВУЗов) / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов СПб.: ЭЛБИ, 1999. - 624 с.

35. Илларионов, В.Е. Техника и методики процедур лазерной терапии: Справочник / В.Е. Илларионов. М.: Наука, 1994. - 180 с.

36. Ильин, В.К. Колонизационная резистентность организма в измененных условиях обитания / В.К. Ильин, А.И. Воложин, Г.В. Виха. — М.: Наука, 2005.-251 с.

37. Ильина, Н.А. Микробиоценоз кишечника человека при бластоци-стной инвазии и воздействие Blastocystis hominis на макроорганизм: автореф. дис. . д-ра биол. наук / Н.А. Ильина. Саратов, 2006. - 41 с.

38. Инактивация дрожжей Candida guillermondii видимым светом при индуцированном синтезе эндогенных порфиринов / М.Г. Страховская, и др..- 1998. Т. 67, №3. - С. 360 - 363.

39. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник / В.И. Покровский, и др.. 2-е изд. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 816 с.

40. Исследование динамики лимфотока методами спекл-интерферометрии / А.А. Беднов, и др. // Прикладная нелинейная динамика.- 1996. Т.4, №3.- С. 42 - 52.о

41. Кару, Т.И. Первичные и вторичные клеточные механизмы лазерной терапии / Т.Й. Кару // Низкоинтенсивная лазерная терапия / Под ред. С.В. Москвина и В.А. Буйлина. — М.: ТОО «Фирма «Техника», 2000. — С.71 -94.

42. Конев, С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы / С.В. Конев. Мн.: Наука и техника, 1987. - С. 139154.

43. Конев, С.В. Фотобиология / С.В. Конев, И.Д. Волотовский. Мн.: Изд-во БГУ, 1974. - 348 с.

44. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. Вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. СПб.: СпецЛит., 2002.-591 с.

45. Красновский, А.А. Первичные механизмы фотодинамического действия: развитие представлений и современное состояние исследований / А.А. Красновский // В сборнике тезисов докладов на IV съезде фотобиологов России. Саратов, 2005. - С. 94 - 96.

46. Кузьмин, В.А. Когерентные эффекты при рассеивании света в случайных системах. / В.А. Кузьмин, В.П. Романов // Успехи Советской физики. 1996. - Т. 166.-С. 247-271.

47. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. — М.: Медицина, 1978 394 с.

48. Мельников, Н.И. «Ферменты патогенности» и токсины бактерий / Н.И. Мельников, В.Н. Мельников, М.Г. Гимранов. — М.: Медицина, 1969. -252 с.

49. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. В 3 томах / Под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1984. - 472 с.

50. Механизм фотоинактивации дрожжевых клеток видимым светом / Г .Я. Фрайкин, и др.. // Доклады АН СССР, Сер. Биофизика. 1986. - Т. 291, №6.-С. 1502- 1504.

51. Морозов, Е.И. Снижение частоты индукции фага X под действием лазерного излучения / Е.И. Морозов, М.С. Морозик, В.Д. Шклярова // Вестник Белорусского университета, серия II «Химия, биология, география». — 1981.-№3.-С. 62-64.

52. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии: Учеб для студ. высш. учеб заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук. М.: Академия, 2005. - 608 с.

53. Нетрусов, А.И. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко / Под ред. А.И. Не-трусова. М.: «Академия», 2004. - 272 с.

54. О специфике действия лазерного у.-ф. излучения на выживаемость микроорганизмов / А.Г. Гаврилов, и др. // Доклады АН СССР. — 1978. Т.239, №5. - С. 1238 - 1240.

55. Облучение почвенных образцов ультрафиолетом как модель действия стрессовых факторов на разнообразие бактерий в почвенных экосистемах / В.А. Романовская, и др. // Микробиология. 1999. - Т.68, №4. - С.540 -546.

56. Ойвин, В.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований / В.А. Ойвин // Журнал патологической физиологии и экспериментальной терапии. 1960. - № 4. - С. 84—95.

57. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта. М.: Мир, 1997.-Т.1.-432 с.

58. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта. М.: Мир, 1997.-Т.2.-368 с.

59. Пивоваров, Ю.П. Санитарно-значимые микроорганизмы / Ю.П. Пивоваров, В.В. Кролик. М.: ИКАР, 2000 - 268 с.

60. Позмогова, И.Н. Воздействие физико-химических факторов на микроорганизмы / И.Н. Позмогова // Итоги науки и техники, Сер. Микробиология. -М.: ВИНИТИ, 1991.-Т. 24.-С. 5-14.

61. Пресман, А.С. Электромагнитные поля и живая природа / А.С. Пресман. М.: Наука, 1968. - 288 с.

62. Ринкевичюс, Б.С. Лазерная диагностика потоков / Б.С. Ринкеви-чюс. М.: МЭИ, 1990. - 287 с

63. Ройт, А. Иммунология: Пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 с.

64. Роскин, Г. И. Микроскопическая техника / Г. И. Роскин, Л. Б. Ле-винсон. -М.: Советская наука, 1957. 257 с.

65. Рубин, Л.Б. О регуляторном действии света на метаболизм микроорганизмов: автореф. дис. .докт. биол. наук / Л.Б. Рубин. М., 1973. — 61 с.

66. Рубин, Л.Б. Свет и развитие низших организмов / Л.Б. Рубин. -М.: Знание, 1975. 64 с.

67. Рябухо, В.П. Спекл-интерферометрия / В.П. Рябухо // Соросов-ский Образовательный Журнал. 2001. - №5. - С. 43 - 49.

68. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, и др. // Итоги науки и техники, Сер. Биофизика, Т.29 Свободные радикалы в живых системах. - М.: ВИНИТИ, 1991. - 252 с.

69. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов. -М.: Колос, 1995 319 с.

70. Скулачев, В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Ску-лачев // Соросовский образовательный журнал. 1996. -№3. - С. 4-10.

71. Странадко, Е.Ф. Исторический очерк развития фотодинамической терапии / Е.Ф. Странадко // Лазерная медицина. 2002. - Т. 6, № 1. - С. 4-8.

72. Супотницкий, М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии / М.В. Супотницкий. — М.: Вузовская книга, 2000. 376 с.

73. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. М.: Дрофа, 2004. - 256 с.

74. Тимошин, А.А. Влияние низкоинтенсивного излучения гелий-неонового лазера на образование этанола при культивировании бактерий Zy-momonas mobilis / А.А. Тимошин, М.Е. Бекер // Доклады АН СССР, Сер. Биофизика. 1990. - Т. 312, №4. - С. 990 - 992.

75. Тимошин, А.А. Влияние низкоинтенсивного излучения гелий-неонового лазера на бактерии Zymomonas mobilis / А.А. Тимошин, А.Ф. Да-нилевич, А.И. Рапопорт // Микробиология. 1991. - Т.60, Вып.6. - С. 12- 78.

76. Тихомирова, Е.И. Эколого-иммунологические аспекты резистентности при инфекции и иммунизации (экспериментальные исследования на моделях лабораторных и диких грызунов): дис. док. биол. наук / Е.И. Тихомирова. Саратов, 2005. - 420 с.

77. Трушин, М.В. Влияние красного и инфракрасного излучения на рост клеток Escherichia coli и продукцию рекомбинантного белка барстара // Микробиология. 2002. - Т. 71, №4. - С. 452 - 454.

78. Тучин, В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов: СГУ, 1998. - 384 с.

79. Тучина, Е.С. Оценка фотодинамического воздействия in vitro на бактерии из микробоценозов ротовой полости и кожи человека: дис. . канд. биол. наук / Е.С. Тучина. Саратов, 2008. - 139 с.

80. Ульянов, С.С. Динамика спеклов и эффект Доплера / С.С. Ульянов // Соросовский Образовательный Журнал. — 2001. — №10. С. 89 - 95.

81. Ульянов, С.С. Что такое спеклы? / С.С. Ульянов // Соросовский Образовательный Журнал. 1999. - №5. - С. 24 - 32.

82. Ульянова, О.В. Использование спекл-микроскопии при тестировании токсичности бактериальных препаратов / О.В. Ульянова, Ю.А. Гани-лова, С.С. Ульянов // Вестник Саратовского государственного аграрного университета. 2007. - №2. - С. 18 - 20.

83. Ульянова, О.В. Оценка токсичности бактериальных взвесей методом биотестирования / О.В. Ульянова // Сб. статей конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Саратов, 4-8 декабря. 2006). - Саратов, 2006. - С. 97 - 100.

84. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических исследованиях /В.Ю. Урбах. -М.: Медицина, 1975. 259 с.

85. Федосов, И.В. Особенности проявления эффекта Допплера при дифракции сфокусированного когерентного излучения в рассеивающем потоке / И.В. Федосов, С.С. Ульянов // Оптика и спектроскопия. 2001. - Т. 91, №2. - С. 325 - 329.

86. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения / Н.Д. Девятков, и др. // Успехи современной биологии. — 1987.-Т.103.-Вып. 1.-С. 31-43.

87. Фотодинамическая инактивация дрожжей Candida guillermondii в присутствии фотодитазина / М.Г. Страховская, и др.. // Микробиология. -2002. Т. 71, №3. - С. 349 - 353.

88. Фотодинамическое повреждение субклеточных структур с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX / А.О. Шумарина, и др.. // Микробиология. 2003. - Т. 72, №4. - С. 488 - 492.

89. Фотоиндуцированное подавление биолюминисценции генно-инженерного штамма бактерий Escherichia coli TGI (pXen 7) в присутствии фотодитазина / М.Г. Страховская, и др.. // Микробиология. 2002. - Т. 71, №3. - С. 345-348.

90. Фотоповреждение грамположительных и грамотрицательных бактериальных клеток в присутствии производных хлорина / А.Ю. Фомичев, и др.. // Микробиология. 1991. - Т.60, №3. - С. 507 - 511.

91. Фотосенсибилизированное хлорином е6 повреждение бактерий с различными дефектами систем репарации ДНК / Т.Е. Зорина, и др. // Микробиология. 1988. - Т. 57, Вып.6. - С. 1007 - 1009.

92. Хаитов, P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. — М.: Медицина, 2000. 432 с.

93. Холл, Д. Фотосинтез: Пер. с англ. / Д. Холл, К. Рао. М.: Мир, 1983.- 134 с.

94. Чернух, A.M. Микроциркуляция / A.M. Чернух, П.Н. Александров, В.В. Алексеев М.: Медицина, 1984. - 432с.

95. Чувствительность к стрессовым факторам почвенных бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС / В.А. Романовская, и др. // Микробиология. 1999. - Т.68, №4. - С.534 - 539.

96. Шендеров, Б.А. Иммунология инфекционного процесса. Руководство для врачей / Б.А. Шендеров / Под ред. В.И. Покровского, С.П. Горди-енко, В.И. Литвинова. М.: Медицина, 1994. - 318 с.

97. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции / Б.А. Шендеров. М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

98. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. — М.: Мир, 1987. -С. 291-292.

99. Эдварде, Дж. Фотосинтез С3- и С4-растений: механизмы и регуляция: Пер. с англ. / Дж. Эдварде, Д. Уокер. М.: Мир, 1986 - 590 с.

100. Ярилин, А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин. М.: Медицина, 2000. - 608 с.

101. Bhakdi, S. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus II S. Bhakdi, J. Tranum-Jensen // Microbiological Review. 1991. - № 55. - P. 733 - 751.

102. Bhatnagar, N.B. Heat stress alters the virulence of a rilampin-resistant mutant of Francisella tularensis LVS / N.B. Bhatnagar, K.L.Elkins, A.H. Fortier // Infectology and Immunology. 1995. - V. 63, №1. - P. 154 - 159.

103. Bhatti, M. A study of the uptake of toluidine blue О by Porphyromo-nas gingivalis and the mechanism of lethal photosensitization / M. Bhatti, et al. // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1998. - № 68. - P. 370 - 376.

104. Blank M. Electromagnetic fields: Biological Interactions and Mechanisms / M. Blank // Advances in Chemistry Series. 1995. - V. 250. - P. 38.

105. Briers, J.D. Capillary blood flow monitoring using laser speckle contrast analysis (LASCA) / J.D. Briers, G. Richards, X. W. He // Journal of Biomedical Optics. 1999.-V.4. - P. 164- 175.

106. Briers, J.D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging / J.D. Briers // Physiological Measurement. -2001.-V.22.-P. 35-66.

107. Brubaker, R.R. Mechanisms of bacterial virulence. — Annual Review of Microbilogy. 1985. - № 39. - P. 21 - 50.

108. Demidova, T.N. Photodynamic therapy targeted to pathogens / T.N. Demidova, M.R. Hamblin // International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 2004. - № 17. - P. 245 - 254.

109. Dougan, G. The molecular basis for the virulence of bacterial pathogens: implication for oral vaccine development // Microbiology. 1994. - № 140. -P. 215-224.

110. Dougherty, T.J. Photodynamic therapy // Medical radiology innovations in radiation oncology. 1988. — № 1. - P. 175— 188.

111. Dougherty, T.J. Studies on the structure of porphyrins contained in Photofrin II // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1987. - V. 46, № 5. -P. 569.

112. Evaluation of flow volume in a capillary using dynamic laser speckles based on the photon correlation / Y. Aizu, et al. // Optics Communications -1990. V.80, №2. - P. 1-6.

113. Falkow, S. The interaction of bacteria with mammalian cells / S. Falkow, R.R. Isberg, D.A. Portnoy // Annual Review of Cell Biology. 1992. - № 8.-P. 333-363.

114. Finley, B.B. Common themes in microbial pathogenecity. / B.B. Finley, S. Falcow // Microbiological Review. 1989. - № 53. - P. 210 - 230.

115. Foster, J.W. How Salmonella surviveagainst the odds / J.W. Foster, M.P. Spector // Annual Review of Microbiology. 1995. - V.49. - P. 145 - 174.

116. Hamblin, M.R. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? / M.R. Hamblin, T. Hasan // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2004. - № 3. - P. 436 - 450.

117. Hanawa, T. Listeria monocytogenes can grow in macrophages without the aid of proteins induced by environmental stresses / T. Hanawa, T. Yamamoto, S. Kamiya // Infectology and Immunology. 1995. - V.63, №12. - P. 4595 -4599.

118. Henderson, B.W. How does photodynamic therapy work? / B.W. Henderson, T.J. Dougherty // Journal of Photochemistry and Photobiology. — 1992.-№55.-P. 145-157.

119. Indocianine green and laser irradiation induce photooxidation / C. Abels, et al. // Archives of Dermatology. 2000. - № 292. - P. 404 - 411.

120. Isenberg, H.D. Pathogenecity and virulence: another view // Clinical Microbiological Review. 1988. - № 1. - P. 40 - 53.

121. Itzkan, I. Laser wound healing can be explained by the photodissocia-tion of oxyhemoglobin / I. Itzkan, S. Tang // Lasers in Surgery and Medicine. -1988.-№ 8.-P. 175.

122. Jakeman, E. Speckles with a small number of scatterers. // Optical Engineering- 1984.-Vol. 23.-No. 4. P. 453.

123. Karu, T. Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells // Journal of Photochemistry and Photobiology. -1999. V. 49, №1.-P. 1-17.

124. Konig, K. Red light kills bacteria via photodynamic action / K. Konig, M. Teschke, B. Sigusch et al. // Cellular and Molecular Biology. 2000. - № 46. -P. 1297- 1303.

125. Liboff, A.R. Mechanistic Approaches to Interactions of Electric and Electromagnetic Fields with Living Systems / A.R. Liboff, S.D. Smith, B.R. McLeod Plenum Press: New York, 1987. - 109 p.

126. Lin, H.-Y. Use of Merocyanine 540 for Photodynamic Inactivation of Staphylococcus aureus Planktonic and Biofilm Cells / H.-Y. Lin, Ch.-T. Chen, Ch.-Ts. Huang // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70. - № 11.-P. 6453-6458

127. Maisch, T. Photodynamic Effects of Novel XF Porphyrin Derivatives on Prokaryotic and Eukaryotic Cells / T. Maisch, C. Bosl, R.-M. Szeimies, N. Lehn, C. Abels // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2005. - V. 49. - №4. -P. 1542-1552.

128. Meisel, P. Photodynamic therapy for periodontal diseases: state of the art / P. Meisel, T. Kocher // Journal of Photochemistry and Photobiology. 2005. -№79.-P. 159-170.

129. Millson, C.E. The killing of Helicobacter pylori by low-power laser light in the presence of a photosensitiser / C.E. Millson, M. Wilson, A.J. Macrobert et al.// Journal of Medical Microbiology 1996. -№ 44. -P. 245 - 252.

130. Mishina, H. Laser Doppler microscope. / H. Mishina, T. Asakura, S. Nagai // Optics Communications. 1974. - Vol. 11. - P. 99 - 102.

131. Pannekoek, Y. Identification and molecular analysis of a 63-kilodalton stress protein from Neisseria gonnorrhoeae / Y. Pannekoek, J.P.M. Van Putten, J. Dankert // Journal of Bacteriology. 1992. - V. 174, №21. - P. 6928 - 6937.

132. Photodynamic inactivation of Escherichia coli by rose bengal immobilized on polystyrene beads / S.A. Bezman, et al. // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1978. - № 28. - P. 325 - 329.

133. Riva, C. Laser Doppler measurements of blood flow in capillary tubes and retinal arteries / C. Riva, B. Ross, G. Benedek // Investigative Ophthalmology & Visual Science, 1972.-V. 11.-P. 936-944.

134. Robbe-Saule, V. The live oral typhoid vaccine Ty21a is a rpoS mutant and is susceptible to various environmental stresses / V. Robbe-Saule, C. Coynault, F. Norel // FEMS Microbiological Letters. 1992. - V. 126. - P. 171 - 176.

135. Shah, H.N. Biochemical and chemical analyses of black-pigmented gram-negative anaerobes / H.N. Shah, S.E. Gharbia // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 1993. - № 6. - P. 89 - 96.

136. Shah, H.N. The porphyrin pigmentation of subspecies of Bacteroides melaninogenicus / H.N. Shah, R. Bonnett, B. Mateen et al.// Biochemical Journal. 1979. — № 180.-P. 45-50.

137. Shrivastava, S. Integrated Magnetic Bionanocomposites through Nanoparticle-Mediated Assembly of Ferritin / S. Shrivastava, B. Samanta, B.J. Jordan et al. // Journal of the American Chemical Society 2007. - V. 129, № 38. -P. 11776- 11780.

138. Soukos, N.S. Targeted antimicrobial photochemotherapy / N.S. Soukos, L.A. Ximenez-Fyvie, M.R. Hamblin // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1998. - № 42. - P. 2595 - 2601.

139. Susceptibility of Candida Species to Photodynamic Effects of Pho-tofrin / J.M. Bliss, et al. // Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 2004. -V. 48. - №6. - P. 2000 - 2006.

140. Tuchin, V.V. A pilot study of ICG laser therapy of acne vulgaris: Photodynamic and photothermolysis treatment / V.V. Tuchin, E.A. Genina, A.N. Bashkatov et al. // Lasers in Surgery and Medicine 2003. - V. 33, № 5. - P. 296 -310.

141. Ulyanov, S. Principles of high-resolution speckle microscopy: analysis of bioflows // Proceedings of SPIE. 2002. - № 4607. - P. 374 - 380.

142. Ulyanov, S.S. Fundamentals and Applications of Dynamic Speckles Induced by Focused Laser Beam Scattering. / S.S. Ulyanov, D.A. Zimnyakov, V.V. Tuchin//Optical Engineering. 1994. - V. 33, № Ю.-Р. 3189-3201.

143. Ulyanov, S.S. High resolution speckle-microscopy: study of the spatial structure of a bioflow // Physiological Measurements. — 2001. V. 22. -P. 681 -691.

144. Ulyanov, S.S. New type of manifestation of the Doppler effect: an applications to blood and lymph flow measurements // Optical Engineering. 1995-№34 (10). -P.2850 -2855.

145. Ulyanov, S.S. Speckle-interferometric Method in Application to the Blood and Lymph Flow Monitoring in Microvessels // Lasers in Medical Sciences. 1997. - V. 12.,-№ l.-P. 31 -41.

146. Wainwright, M. Photodinamic antimicrobial chemotherapy // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1998. - № 42. - P. 13 - 28.

147. Wilson, M. Photolysis of oral bacteria and its potential use in the treatment of caries and periodontal disease // Journal of Applied Bacteriology — 1993.-№75.-P. 299-306.

148. Wilson, M. Sensitisation of oral bacteria to killing by low-power laser irradiation / M. Wilson, J. Dobson, W. Harvey // Current Microbiology 1992. -№25.-P. 77-81.

149. Wong, T.-W. Bactericidal Effects of Toluidine Blue-Mediated Photo-dynamic Action on Vibrio vulnificus / T.-W. Wong, Y.-Y. Wang, H.-M. Sheu, Y.-Ch. Chuang // Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 2005. - V. 49, №3. - P. 895-902.

150. Wood, S. An in vitro study of the use of photodynamic therapy for the treatment of natural oral plaque biofilms formed in vivo / S. Wood, B. Nattress, J. Kirkham et al. // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1999. - № 50. -P. 1 - 7.

151. Zeina, B. Killing of cutaneous microbial species by photodynamic therapy / B. Zeina, J. Greenman, W.M. Purcell, B. Das // British Journal of Dermatology. 2001. —№ 144. - P. 274 - 278.

Информация о работе

Подшибякин, Дмитрий Васильевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы