Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование механизма фотодинамических реакций мероцианина 540 в биологических системах

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизма фотодинамических реакций мероцианина 540 в биологических системах"

005050359

На правахрадсописи

ШМИГОЛЬ ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ФОТО ДИНАМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ МЕРОЦИАНИНА 540 В БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

б ПАР 2013

Москва-2013

005050359

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждение

высшего профессионального образования «Российском национальном исследовательском медицинском университете имени Н.И. Пирогова» Минздрава

России

Научный руководитель:

Потапенко Александр Яковлевич - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой, физики и математики в государственном бюджетном образовательном учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Официальные оппоненты:

Страховская Марина Глебовна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник кафедры биофизики биологического факультета в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Сороковой Вячеслав Иванович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клинической лабораторной диагностики в Государственном казенном учреждение здравоохранения города Москвы «Центр медицинской и социальной реабилитации с отделением постоянного проживания для подростков и взрослых инвалидов с тяжелыми формами детского церебрального паралича, самостоятельно не передвигающихся и себя не обслуживающих Департамента здравоохранения города Москвы»

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Защита состоится "0~>> £¿/¿00, 2013 года ъ/Р сов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки « Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 119435, Москва, Малая Пироговская улица, дом 1А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки « Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»по адресу: 119435, Москва, Малая Пироговская улица, дом 1А

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.А. Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Данная работа посвящена изучению фотофизических, фотохимических и фотобиологических свойств анионного фотосенсибилизатора мероцианина 540 (МЦ540).

МЦ540 нашел применение как флуоресцентный зонд, используется в фотодинамической инактивации микроорганизмов (ФДИ-МЦ540) - бактерий и вирусов, в фотодинамической терапии опухолей, что говорит о высокой практической значимости этого красителя. Существует много работ, в которых рассматривались перечисленные свойства МЦ540, но либо предложенные теоретические положения в этих работах не были доказаны, либо уже известные физико-химические закономерности фотопревращений МЦ540 в растворах не учитывались и как следствие не применялись в работах с биологическими объектами.

Ранее количественное описание переходов ионизированных форм красителя в агрегаты при добавлении солей содержали слишком большие упрощения, связанные с тем, что использовавшияся для этого спектрофотометрия не является специфическим и избирательным методом для регистрации агрегированных форм красителя. В то же время в литературе уже было описано явление резонансного светорассеяния (PCP) агрегатами красителей. Регистрация спектров PCP позволяет избирательно и с большой чувствительностью выявлять агрегаты красителей даже в присутствии большого количества его мономерных форм или других красителей. Метод PCP для исследования эффектов солей на агрегатное состояние МЦ540 в литературе не применялся. Первые работы на эту тему недавно появились только в нашей лаборатории. Отсутствие ясного описания процессов агрегации МЦ540 в водно-солевых растворов привело к тому, что при проведении антибактериальной ФДИ-МЦ540 не проверяли, как изменение агрегатного состояния красителя может повлиять на его фотобиологическую активность. При выборе условий фотосенсибилизированной инактивации бактерий применялись те среды, которые обычно используются в микробиологии, и не было сделано попыток изменить в них агрегатное состояние МЦ540 путем варьирования концентрации солей. Исходя из изложенного выше, были сформулированы цели и задачи настоящей работы.

Цель работы: Исследовать механизмы фотодинамических реакций мероцианина 540 и возможность их регулирования с помощью изменения агрегатного состояния МЦ540 в водных растворах путем добавления солей, а

также оценить роль различных агрегатных форм МЦ540 в фотосенсибилизированной инактивации бактерий

Задачи работы.

1) Разработать модификацию метода регистрации спектров резонансного светорассеяния в водно-солевых растворах МЦ540 и разработать способы введения поправок на спектральную чувствительность прибора и эффекты экранировки возбуждающего света и реабсорбции рассеянного света.

2) Изучить качественные и количественные закономерности процессов агрегации МЦ540 в присутствии солей одно-, двух- и трехвалентных катионов используя методы спектрофотометр™, резонансного светорассеяния и динамического рассеяния света (ДРС).

3) Изучить влияние агрегатного состояния МЦ540 на его фотохимические превращения. Использовать полученную информацию для повышения эффективности фотосенсибилизированной МЦ540 инактивации бактерий.

Научная новизна работы.

Впервые было установлино существование критической концентрации соли (ККС), начиная с которой происходит формирование плотноупакованных агрегатов МЦ540. Обнаружено, что величина ККС одинакова для катионов Ка+ и К+ и гиперболически зависит от концентрации МЦ540 в растворе. Показано, что произведение ККС на концентрацию МЦ540 является постоянной величиной, представляющей собой произведение растворимости диссоциированных форм красителя в воде. Методом ДРС обнаружено, вызванное добавлением солей формирование не плотноупакованных агрегатов диаметром 20-40 нм, когда концентрация соли ниже ККС. При концентрации соли в несколько раз выше ККС размеры агрегатов достигают диаметра 500-700 нм.

Фотосенсибилизированная МЦ540 инактивация бактерий зависит от агрегатного состояния МЦ540. В солевых растворах эффективность инактивации значительно увеличивается по сравнению с дистиллированной водой и приводит к гибели как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Фотовыцветание агрегированных форм МЦ540 может происходит по свободнорадикальному механизму. На это указывают ингибирующие эффекты Ь-аскорбиновой кислоты и ионола, которые не оказывают влияние на фотовыцветание мономерных форм, осуществляющиеся с участием синглетного кислорода.

Практическая значимость.

Фотосенсибилизированная МЦ540 инактивация бактерий зависит от агрегатного состояния МЦ540. Добавление солей в концентрациях, превышающих величину ККС и вызывающих формирование плотноупакованных агрегатов МЦ540, приводило к резкому увеличению эффективности инактивации как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, по сравнению с дистиллированной водой, где МЦ540 находится в ионизированном состоянии.

Фотовыцветание агрегированных форм МЦ540 происходит по свободнорадикальному механизму. На это указывают ингибирующие эффекты L-аскорбиновой кислоты и ионола, которые не оказывают влияние на фотовыцветание мономерных форм, осуществляющемуся с участием синглетного кислорода.

Разработаный подход для фотосенсибилизированной МЦ540 фотодинамической инактивации микроорганизмов, может быть применен в медицинской практике для стерилизации медицинских инструментов и поверхностей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Добавление солей в растворы анионного фотосенсибилизатора мероцианина 540 приводит к изменению его агрегатного состояния и влияет на его фотофизические, фотохимические и фотобиологические свойства.

2. Исследования количественных закономерностей агрегации МЦ540, вызванной солями одно-, двух- и трехвалентных катионов, методами PCP и ДРС позволили установить существование критической концентрации соли (ККС), начиная с которой происходит формирование плотноупакованных агрегатов мероцианина 540, методом ДРС выявлено формирование рыхлых агрегатов при концентрациях солей ниже величины ККС.

3. Скорость фотовыцветания плотноупакованных агрегатов мероцианина 540 значительно выше, чем мономеров и димеров данного красителя.

4. Определение закономерностей процессов агрегации мероцианина 540 позволило повысить его антибактериальную фотодинамическую активность на суспензиях бактерий.

Внедрения результатов исследования. Результаты исследования используются в лекционном курсе кафедры физики и математики педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Международном фотобиологическом конгрессе в Дюссельдорфе, Германия (2009 г.), на Европейских фотобиологических конгрессах во Вроцлаве, Польша (2009 г.) и Женеве, Швейцария (2011 г.), Съезде Российского фотобиологического общества в Шепси (2011 г.), 4-м Съезде биофизиков России в Нижнем Новгороде (2012 г.).

Результаты работы были обсуждены 13 июня 2012 г. на заседании кафедры физики и математики педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 13 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций.

Личное участие автора в получении научных результатов

Шмиголь Т.А. проделала значительный экспериментальный и аналитический объем работы. Также диссертантом были освоены методы культивирования бактерий и проведения на них фотодинамической инактивации, измерения резонансного рассеяния света, метод ультрафильтрации, а так же хемолюминесцентные, флуоресцентные и спектрофотомстрические методы. Лично автором проведен статистический анализ результатов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах, содержит 33 рисунка и 7 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, насчитывающего 151 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы.

В экспериментах использовали: мероцианин 540 (Sigma-Aldrich, Швейцария). КС1, NaCl, MgCl2, СаС12, А1С13 (ACROS, США), бычий сывороточный альбумин 96-98% (Sigma, США). Антиоксиданты: ионол (Aldrich, США) растворяли в 96% этаноле до концентрации 0,1 мМ, L-аскорбиновую кислоту (Aldrich, США) растворяли в дистиллированной воде до концентрации 0,1 мМ.

Маточный раствор МЦ540 (1x10"3 М) готовили в 96% этаноле в день опыта. В экспериментах использовались концентрации МЦ540 7,6, 8 и 25 мкМ. Перед

спектральными измерениями маточный раствор разводили дистиллированной водой или водными растворами KCl, NaCl, MgCl2, СаС12, А1С13.

Изучение агрегатного состояния и фотолиза фотосенсибилизатора.

Спектры поглощения МЦ540.

Спектры поглощения МЦ540 измеряли в 1 см кварцевой кювете на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC (Япония). Все растворы готовили в день проведения эксперсмента и перед измерением инкубировали в течении 10 минут в темноте при температуре 24 ± 1 °С.

Спектры резонансного светорассеяния (PCP).

Спектры PCP регистрировались под углом 90° в 1 см кювете на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (Япония) с использованием синхронного режима сканирования настроенных на одну длину волны монохроматоров.

Динамическое рассеяние света (ДРС).

Размер агрегатов МЦ540 в дистиллированной воде и водно-солевых растворах определяли методом динамического рассеяния света (ДРС) на приборе Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Англия) с лазером мощностью 50 мВт и длиной волны испускания 532 нм. ДРС регистрировали в одноразовых кюветах малого объема при температуре 25°С и угле измерения 173° в режиме обратного рассеяния с автоматическим определением положения измерения и установки аттенюатора. Для образца проводилось 6 повторов по 10 измерений в течение 10 секунд для каждого образца. Дистиллированная вода и водно-солевые растворы перед измерением фильтровали через Millipore 0.2 (im Durapore PVDF (Millipore, Франция) для удаления загрязняющих частиц и пыли из растворов. Для анализа результатов измерений и получения кривых распределения частиц по размерам был применен алгоритм CONTIN. Измерение ДРС было сделано совместно с Решетовым В.А. в Научно-исследовательском центре Нанси, Центре Алексиса Вотрен, CNRS, Франция.

Подготовка фотосенсибилизатора к облучению.

Маточный раствор МЦ540 (1*10"3 М) готовили в 96% этаноле в день опыта. Пробы готовили в концентрации МЦ540, равной 25 мкМ, путем разведения маточного раствора в воде или в 0.25 M растворе NaCl. Растворы МЦ540 и суспензии микроорганизмов облучали светом ртутно-кварцевой лампы ДРШ-250 (Зеленоград, Россия) с выделенным при помощи стеклянного светофильтра монохроматическим светом с длиной волны 546 нм. Интенсивность света измеряли при помощи измерителя мощности Newport 1916 С (Newport Corporation,

США), калиброванного для 546 нм и была равна 5 мВт/см2. Растворы МЦ540 облучали при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке в 1 см кюветах при боковом освещении и температуре 24±1°С. Дозовые зависимости фотовыцветания ФС оценивали по уменьшению оптической плотности при 518 нм.

Культуры клеток микроорганизмов.

В работе использовали клинический изолят штамма 78 Staphylococcus aureus (Sa78) и штамма 104 Pseudomonas aeruginosa (РаЮ4) из коллекции микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России.

S. aureus и Р. aeruginosa инкубировали в течение 12 ч при 37°С в питательном бульоне Brain Heart Infusion («Difco», США), разводили в фосфатно-солевом буфере до достижения оптической плотности (Z?6oo)5 равной 1, что соответствует концентрации 109 КОЕ/мл. Бактериальную суспензию (1 мл) дважды отмывали центрифугированием в стерильной дистиллированной воде (7000 об/мин, 3 мин) и ресуспендировали в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Для получения облучаемых проб 50 мкМ раствор МЦ540 в дистиллированной воде смешивали в соотношении 1:1с бактериальной культурой в дистиллированной воде. Пробы, содержащие 25 мкМ МЦ540 в солевых растворах готовили, смешивая 100 мкМ МЦ540, 1 M NaCl и суспензию бактерий в соотношении 1:1:2, соответственно. До облучения суспензии клеток инкубировали с МЦ540 в течение 10 и 40 минут в темноте при комнатной температуре. После облучения делали серию десятикратных разведений проб на агаризованной среде ГРМ-1 (Оболенск, Россия) и разливали в чашки Петри. Облученные и контрольные пробы инкубировали в термостате при 37°С. Выросшие колонии подсчитывали через 24 ч. Бактерицидный эффект определяли как соотношение выживших бактерий в опыте и в контроле.

Кинетика фотовыцветания МЦ540 и фотоинактивации бактерий.

Анализ кинетики фотовыцветания 25 мкМ МЦ540 в дистиллированной воде и в растворе 0,25 M хлорида натрия как без антиоксидантов, так и в присутствии 0,1 мМ ионола или L-аскорбиновой кислоты, проведен по начальному участку дозовой зависимости уменьшения оптической плотности (описываемому моноэкспоненциальной функцией), построенному в полулогарифмических координатах. Константа фотовыцветания (м2/кДж) определялась по формуле: к = -In (D/Do У F , где D0 и D - оптическая плотность при длине волны 518 нм в начальный момент времени и при дозе облучения F (кДж/м2) соответственно. Анализ кинетики фотоинактивации бактерий Р. aeruginosa и S. aureus в

присутствии 25 мкМ МЦ540 был проведен по начальному участку дозовой зависимости, построенной в полулогарифмических координатах. Константу фотоинактивации бактерий определяли по формуле:

P = -ln (KOE/KOE0)IF,

где КОЕо и КОЕ - способность к колониеобразованию в начальный момент времени и при дозе облучения F (кДж/м2), соответственно.

Статистический анализ.

Рассчитывали средние значения определяемых величин и стандартную ошибку среднего: SEM = ^/j-, где s - выборочное среднее квадратичное

отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние солей одновалентных катионов на спектры поглощения МЦ540.

МЦ540 - анионный краситель, который в водной среде диссоциирует на катион Na+ и анион красителя с локализацией отрицательного заряда на SO^ группе. Молекула МЦ540 представляет собой статический диполь. Молекулы воды ослабляют силы отталкивания между анионными группами, что способствует агрегации красителя. Таким образом, сама структура молекул МЦ540 способствует образованию димеров. Образование трехслойных агрегатов или более крупных структур в водных растворах затруднено из-за электростатического отталкивания анионных групп. Добавление солей к водным растворам МЦ540 уменьшает электростатическое отталкивание между анионными группами красителя, способствуя тем самым агрегации.

Рисунок 1. Спектры поглощения 7,6 мкМ МЦ540 в воде (1) и в водных растворах

КС1: (2) - 0,24 M, (3) - 0,4 M, (4) -1 M.

На рис. 1 представлены спектры поглощения растворов 7,6 мкМ МЦ540 в дистиллированной воде (кривая 1) и в водных растворах 0,24 М, 0,4 M, 1 M КС1 (кривые 2, 3,4, соответственно).

В спектрах поглощения водных растворов МЦ540 присутствуют два пика около 534 нм и 500 нм, которые относят к мономерной и димерной формам красителя, соответственно. Это «водные» формы МЦ540. При добавлении солей в низких концентрациях (рис. 1, кривая 2), наблюдается гипохромный эффект без изменения формы спектра. Дальнейшее увеличение концентрации соли (рис. 1) сначала приводит к сближению «водных» максимумов (рис. 1, кривая 3), а потом к появлению новой трехкомпонентной полосы комплексирования с одним интенсивным максимумом поглощения около 518 нм и двумя слабыми плечами около 570 и 620 нм (рис. 1, кривая 4). Спектрофотометрия не является специфическим методом для изучения агрегации. Есть более специфический и чувствительный метод обнаружения агрегатов - это метод резонансного светорассеяния.

Измерение и исправление спектров PCP.

На рис. 2 представлены измеренные спектры светорассеяния (кривые 1-3),. на которых видно, что ни димеры, ни мономеры МЦ540 в дистиллированной воде не обладают светорассеянием (рис. 2, кривая 1). Возникающее в растворах 0,45 M и 1 M КС1 светорассеяние обусловлено вызванным добавлением соли формированием крупных агрегатов МЦ540 с экситонным взаимодействием между я-электронными системами молекул красителя. Форма измеренных на спектрофлуориметре спектральных кривых не соответствует истинным спектрам светорассеяния из-за искажений, вносимых как прибором, так и самим исследуемым объектом.

с о

Z н о г с к

я *

О Ф У

s; с: О

Рисунок 2. Измеренные спектры светорассеяния (1-3) и поглощения (4-6) 7,6 мкМ МЦ540 в водно-солевых растворах. Концентрация KCl 1 M (3, 6)3 0,45 M (2, 5), 0 M (1=4).

Данные спектры нуждаются во введении поправок на эффекты внутреннего светофильтра и на чувствительность прибора. Измеренный спектр светорассеяния М1Д540 исправлялся на эффекты внутреннего светофильтра. Затем из него вычитался спектр светорассеяния соответствующего растворителя, и в полученный разностный спектр вносилась поправка на чувствительность прибора.

РСР(Х)=[/«и&) " 10DW-Vm(X)]/K(X,),

где величину К(л.) поправочного коэффициента на спектральную чувствительность прибора находили по формуле:

К(Л) = 1днс(Л)/Однс(Л),

Где /ДНС(А) - спектральная зависимость светорассеяния 0,125% водного раствора додецилсульфата натрия (ДНС), измеренная на спектрофлуориметре , Dm-(X) - истинный спектр светорассеяния ДНС, измеренный на спектрофотометре.

Влияние солей одно-, двух-, трехвалентных катионов на спектры PCP МЦ540.

На рис. 3, 4, 5 представлены исправленные спектры PCP (кривые 1-3) и поглощения (кривые 4-6) 7,6 мкМ МЦ540 в присутствии различных концентраций KCl. Спектр PCP МЦ540 в дистиллированной воде (рис. 4, кривая 1), показывает, что ни мономеры, ни димеры резонансным светорассеянием не обладают. При добавлении 0,45 M KCl в спектрах PCP (рис. 3 кривая 2) появляются два пика оеоло 504 нм и 530 нм (рис. 3 кривая 5), со слабым плечом около 580 нм и

длинноволновым хвостом. В присутствии 1 M KCl виден один максимум поглощения при 520 нм и два слабых плеча при 580 нм и 620 нм (рис. 3, кривая 6). В то же время в спектрах PCP в 1 M KCl два близко расположенных максимума наблюдаются при 516 нм и 528 нм с плечом при 580 км и длинноволновым хвостом (рис. 3, кривая 3).

Длины волн, ии

Рисунок 3. Спектры PCP (1-3) и поглощения (4-6) водных растворов 7,6 мкМ МЦ540 в присутствии 1 M (1, 4), 0,45 M (2, 5) и 0 M (3, 6) KCl.

Изменения формы спектров поглощения и PCP МЦ540 при добавлении

двухвалентных катионов Ca"1"*" (рис. 4) очень похожи на таковые, вызванные

добавлением KCl (рис. 3). Основным отличием является то, что концентрации

Са++, при которых возникают спектральные изменения, значительно ниже, чем для

К+ (см рис. 3).

Длины волн,нм

Рисунок 4. Спектры поглощения (4, 5, 6) и PCP (1, 2, 3) водных растворов 7,6 мкМ МЦ540 в присутствии СаСЬ Кривые (1, 4) соответствуют дистиллированной воде, (2, 5) - 0,03 M СаСЬ и (3, 6) - 0,2 M СаСЬ.

На рисунке 5А представлены спектры поглощения 7,6 мкМ МЦ540 в воде (кривая 1) и в присутствии А1С13. При добавлении 0,4 мМ А1СЬ форма спектра резко изменяется (кривая 2). Наблюдается выраженный гипохромный эффект в области «водных» максимумов и появляется новая интенсивная полоса при 478 нм с широким длинноволновым хвостом. При более высокой концентрации AICI3 (рис. 5А, кривые 3-6) форма спектров поглощения становится похожей на спектры поглощения в присутствии одновалентных и двухвалентных катионов. В 1 мМ AlClj наблюдается два основных близких максимума, похожих на «водные» (рис. 5А, кривая 3), которые постепенно сближаются с увеличением концентрации А1С13. В присутствии 100 мМ А1С13 появляется одна симметричная полоса поглощения с максимумом 520 нм и двумя слабыми плечами при 580 нм и 620 нм (рис. 5А, кривая 6). Спектры PCP (рис. 5Б) существенно отличаются по форме от спектров поглощения. При добавлении 0,4 мМ А1С13 появляется интенсивный пик около 474 нм со слабым плечом при 534 нм и широким длинноволновым хвостом (рис. 5 Б, кривая 2). В 1 мМ растворе А1С13 пик около 474 нм падает и появляется широкий спектр PCP с несколькими максимумами при 416 нм, 474 нм, 544 нм, 600 нм и 654 нм (рис. 5 Б, кривая 3). В присутствии 5 мМ А1С13 амплитуда PCP увеличивается во всем диапазоне длин волн, с самым высоким максимумами при 500 нм, и менее интенсивными максимумы при 536 нм, 590 им и 650 нм (рис. 5Б, кривая 4). При добавлении 20 мМ А1С13 остаются два основных максимума при 514 нм и 532 нм со слабым плечом около 584 нм. Дальнейшее увеличение концентрации А1С13 до 100 мМ мало влияет на форму спектра по сравнению с 20 мМ раствора, но приводит к снижению амплитуды сигнала PCP (рис. 5Б, кривая 6).

А

Б

Рисунок 5 Спектры поглощения (А) и спектры PCP (Б) водных растворов 7,6 мкМ МЦ540 в присутствии AlCb. Концентрация Л1С13 0 мМ (1), 0.4 мМ (2), 1 мМ (3), 5 мМ (4), 20 мМ (5) and 100 мМ (6)

Определение величины критической концентрации соли (ККС) методом PCP.

Зависимость интенсивности сигнала PCP от концентрации KCl приведено на рис 6 А (кривые 518 нм и 580 нм). При концентрациях ниже 0,3 M KCl сигнал PCP практически отсутствует. При концентрации KCl выше 0,3 M происходит резкий рост интенсивности PCP с постепенным выходом кривой на плато.

в

1.0001 O.OOI

0,01 0,1 1 AICI3, м M

Рисунок 6. Зависимость интенсивности PCP (сплошные линии) и оптической плотности при 580 нм (пунктирная кривая 580 им (D)) в водных растворах 7,6 мкМ МЦ540 от концентрации KCl (А), СаСЬ (Б), и А1С13(В). Стрелкой показаны значения критической концентрации соли (ККС).

Появление сигнала PCP говорит о формировании плотно упакованных агрегатов красителя, а концентрацию, начиная с которой начался резкий рост сигнала PCP, мы приняли за величину критической концентрации соли (ККС). Для KCl величина ККС составляет 0,3 М, такая же величина ККС получена для NaCl (данные не приведены). Для солей двухвалентных катионов СаС12 (рис. 6 Б) и MgCI2 (данные пе приведены) форма кривой зависимости интенсивности PCP от концентрации соли была похожа на таковую для одновалентных катионов (рис. 6 А), только значения ККС были значительно ниже и составляли 0,015 M в 7,6 мкМ растворе МЦ540. При добавлении к 7,6 мкМ МЦ540 А1С13 значение ККС было еще ниже и составляло около 0,01 мМ. Кривая зависимости интенсивности PCP от концентрации А1СЬ (рис.6 В) становилась двухфазной с двумя максимумами. Первый максимум наблюдался в диапазоне 0,04-0,1 мМ, около 2 мМ наблюдался минимум, после чего интенсивность PCP опять начинала расти (рис. 6 В). Ниже ККС как хлористый алюминий, так и мерацианин 540 полностью ионизированы. По-видимому, с увеличением концентрации А1СЬ может происходить стадийное, постепенное заполнение валентностей алюминия анионами МЦ540. Скорее всего поэтому и возникает многообразие перестраивающихся друг в друга агрегатов МЦ540 с разными спектральными свойствами. Метод PCP позволяет определять ККС при любой длине волны, где PCP регистрируется. В тоже время данные спектрофотометрии коррелируют с данными PCP в длинноволновой части спектра

поглощения (около 580 нм). Но чувствительность спектрофотометрического метода оказалась в десятки и сотни раз ниже, чем метода PCP.

Нами установлено, что для солей одно-, двух-, и трехвалентных катионов существует критическая концентрация соли, выше которой начинают формироваться плотноупакованные агрегаты МЦ540, обладающие сигналом PCP. Величина ККС сильно зависит от валентности катиона и убывает в ряду Na+=K+»Ca2+=Mg2+»Al3+.

Зависимость ККС от концентрации МЦ540.

В дистиллированной воде молекулы МЦ540 ионизированы и между мономерами и димерами наблюдается динамическое равновесие. При добавлении соли может наблюдаться комплексирование между анионной группой молекул МЦ540 и катионами солей. Недиссоциированные молекулы красителя могут образовывать бош.шие агрегаты из-за отсутствия сил отталкивания между анионными группами молекул МЦ540. При образовании агрегатов появляется сигнал PCP. В растворе устанавливается равновесие между ионизированными

формами красителя [м/540~]", катионами солей , и фазой агрегатов,

образуемой недиссоциированными молекулами красителя, где [КпМЦ540 концентрация недиссоциированных форм красителя в единице объема фазы агрегатов. Эта величина не зависит от того, какая доля красителя перешла в агрегированное состояние, то есть она является константой. Таким образом, получаем равновесие между агрегатами и ионами, то есть «фазовое» равновесие. Выражение для константы равновесия Кр этой реакции в присутствии одновалентных катионов в общем виде имеет следующий вид:

К JWWriK*]" об произведение Кр[МЦ540тКя] тоже

' [МЦ 540 „ К „]

является константой, которую принято называть «произведением растворимости» (Кпр), подобно произведению растворимости воды. Кгр = Кр [МЦ540 т Кп ]. Соли одновалентных катионов находятся в ионизированной форме при их концентрациях, меньших или равных ККС. Выше ККС часть катионов соли

связывается с анионами красителя [лЩ540~ ]", образуя недиссоциированные молекулы

10 12 14

МЦ540, мкМ

Рисунок 7. Зависимость критической концентрации соли (ККС) для

солей одновалентных (А)

Точки на рис. 7А соответствуют ситуации, когда и соль, и краситель ионизированы. Кривая, проходящая через точки на рис. 7А описывается

К пр

уравнением степенной функции: ККС - --— Используя метод

\МЦ 540 ]

наименьших квадратов для построения кривой на рис. 7, мы получили в используемых координатах значение Кпр=2,94 и т=1,28, коэффициент корреляции = 0,9. Так как число молекул МЦ540 в недиссоциированном комплексе может быть только целым, то ближайшее целое значение показателя степени при концентрации МЦ540 равно 1, другими словами одна молекула красителя связывает один катион (К+ или Иа+) соли. Перейдя к молярным концентрациям, получим Кпр=2,94* 10"6 М2.

Зависимость ККС для солей двухвалентных катионов от концентрации МЦ540 позволила получить константу, которая показывает сколько молекул МЦ540 связывает двухвалентных катионов.. Из данным приведенных на рисунке

7 Б эта константа имеет значение равное 3,77 с коэффициентом корреляции 0,95. Ближайшее к 3,77 целое значение для т равно 4. Таким образом, один ион Са++(М§++) связывает 4 молекулы МЦ540. Значение константы Кпр в данном эксперименте равно 2,42-10'24 М5. Значения ККС были определены в диапазоне концентраций МЦ540 от 4 мкМ до 22 мкМ. Кривая на рис. 6 отражает граничные условия образования плотноупакованных агрегатов из недиссоциированных молекул МЦ540, что является важнейшей физико-химической характеристикой красителя.

Метод динамического рассеяния света (ДРС).

Данные по определению метода ДРС диаметров агрегатов МЦ540 (взвешенным по числу частиц) сведены в таблице 1.

Таблица 1. Размер агрегатов МЦ540 в воде и водно-солевых растворах

4 , Пода 1 мкМ AlClj 0,1 мМ AlClj 50 мМ AlCb -

Значения ± SEM, нм 0,8 ±0,1 0,8 ±0,1 377 ±68 585 ± 137

5 м M M sCI2 50 м.М MgCb 5MM CaCl2 50 м.М CaCI2

Значения ± SEM, нм 0,8 ±0,1, 37,5 ±21,6 626 ±31 0,8 ± 0,1, 26,6 ± 10,4 645 ±60

10,1 M NaCl 0,6 M NaCl j 0,1 M KCl 0,6 M KCl

Значения 1 1,2 ± 0,4, ± SEM, нм 1 26,1 ±7,2 ,„,.,, 0,8 ±0,1, 652 ±162 j 23,6 ±13,4 652 ±90

Как следует из данных, приведенных в таблице 1, размер агрегатов при концентрациях солей в два раза и более раз превышающих величину ККС (KCl / NaCl = 0,6 M, MgCl2/CaCl2 = 50 мМ и А1С13 = 50 мМ) имеет один и тот же порядок и составило около 600-700 нм. Средний диаметр агрегатов до точки ККС (KCl / NaCl = 0,1 M, MgCl2/CaCl2 = 5мМ и А1С13 = 1 мкМ) составляет примерно 20-40 нм. Данные метода ДРС, таким образом, свидетельствуют об образовании рыхлых агрегатов красителя, если концентрация соли ниже ККС (сигнал PCP во всех этих случаях отсутствует) и очень крупных агрегатов с диаметром в сотни нм, когда возникают интенсивные сигналы PCP при концентрациях соли выше ККС.

Кинетика фотовыцветания МЦ540.

Добавление солей влияет не только на соотношение различных спектральных форм МЦ540, но и на его фотолабильность. В наших экспериментах быстрее всего краситель выцветал в концентрированных растворах соли, при меньшем содержании соли фотовыцветание замедлялось. Скорость

фотовыцветания МЦ540 увеличивается с ростом концентрации ШС1. Константы фотовыцветания 25 мкМ МЦ540 (к) представлены в таблице 3.

Таблица 3. Константы фотовыцветания 25 мкМ МЦ540 (к, см2/Дж) в дистиллированной воде и растворах №С1________________

растворитель вода 0,05 М NaCl 0,2 М 0,25 М NaCl ■ 0,3 м NaCl 0,4 ,М NaCl

к х10° 90±4 270±19,9 880±67 1770±70 228<Ы=190 3390±400

Скорость фотовыцветания МЦ540 в присутствии NaCl выше, чем в дистиллированной воде, и она растет при увеличении концентрации NaCl: для 0,05 М, 0,2 М, 0,25 М, 0,3 М и 0,4 М в 3, 10, 20, 25 и 38 раз, соответственно, относительно токовой в дистиллированной воде. С увеличением концентрации соли в растворе МЦ540 растет и доля молекул красителя в агрегированном состоянии, в концентрированных растворах соли агрегатам принадлежит главная доля в измеряемой оптической плотности. Соответственно, более быстрое фотовыцветание МЦ540 в солевом растворе по сравнению с дистиллированной водой может быть объяснено более высокой фотолабильностью агрегатов по сравнению с димерами и мономерами МЦ540, что согласуется с данными, ранее полученными в нашей лаборатории.

Фотоннактивации S. aureus и P. aeruginosa.

Присутствие анионной группы в молекуле МЦ540 создает препятствие для проникновения ФС в клеточную стенку бактерий. Клеточная стенка бактерий на своей поверхности имеет липополисахариды (ЛПС), несущие отрицательные заряды. Поэтому возникают силы электростатического отталкивания между клеточной стенкой и молекулами красителя, которые препятствуют сближению и проникновению молекул МЦ540 в клеточную стенку бактерий, что должно снижать эффективность фотодинамической сенсибилизированной МЦ540 инактивации (ФДИ-МЦ540) бактерий. Добавление к водным растворам МЦ540 солей приводит к образованию агрегатов красителя, которые являются электронейтральными. Из литературы известно, что проникновение МЦ540 в биологические мембраны клеток и клеточную стенку бактерий занимает около 15 минут. При этом происходит перераспределение МЦ540 на компонентах мембран клеток и клеточных стенок бактерий в виде мономеров и димеров красителя. Поэтому, учитывая длительность встраивания МЦ540 в клеточные стенки, было выбрано два времени инкубации бактерий в растворах ФС перед облучением, равные 10 и 40 минутам. Константы скорости ФДИ-МЦ540 бактерий; представлены в таблице 4. Видно, что 25 мкМ ФДИ-МЦ540 S. aureus для

инкубации 10 минут в присутствии соли происходила в 25 раз быстрее, чем в дистиллированной воде. А для образцов с временем инкубации 40 минут в солевом растворе инактивация бактерий была только в 3,6 раза выше, чем в дистиллированной воде.

Таблица 4. Константы фотоинактивации (ß, см2/Дж) для S. aureus в 25 мкМ МЦ540

МЦ540 в воде, инкубация 10 мин МЦ540 -в' воде, инкубация 40 мни МЦ540 is 0,25М NaCI, инкубация 10 мин Ml 1540 в 0,25М NaCI, инкубация '40 мнн •

(37±3)*10'5 (48±20)х10"5 (921±68)х10-5 (170±70)х10"5

Значения констант фотоинактивации для Р. aeruginosa приведены в таблице 5. В присутствии соли и при инкубации образцов 10 минут, инактивация происходит в 15 раз быстрее, чем в дистиллированной воде. Увеличение времени инкубации до 40 минут приводит примерно к 9-ти кратному ослаблению эффекта в солевом растворе, тогда как в дистиллированной воде скорость инактивации практически не зависела от времени инкубации.

Таблица 5. Константы фотоинактивации (ß, см3/Дж) для Р. aeruginosa

МЦ540 в воде, инкубация "10 мни МЦ540 в воде, инкубация 40 мни ,' МЦ540 в 0,25М NaCI, 4 инк")бамия 10 мин М11540 в 0,25М NaCI, инкубация 40 мин

(310±37)xl0"s (239,9±62)х10° (4754±748,9)хЮ"5 (540±49)х10"5

Интересным является тот факт, что, как известно, только мономеры МЦ540 способны фотогенерировать синглетный кислород, который способен повреждать бактериальные клетки, а при агрегации способность генерировать синглетный кислород '02 утрачивается. Следовательно, усиление бактерицидного эффекта в присутствии хлорида натрия не может быть объяснено действием синглетного кислорода на бактерии. Снятие электрического отталкивания при добавлении соли должно облегчать взаимодействие между клеточной стенкой и молекулами МЦ540. Так как МЦ540 в составе агрегатов не способен генерировать синглетный кислород, а фотоинактивирующий эффект при этом наивысший, то следует рассмотреть возможность осуществления других механизмов фотоинактивации бактерий. При длительной инкубации (40 минут) гибель бактерий вызывается агрегатами не столь эффективно, как при короткой инкубации (10 минут). Возможно, что при длительном взаимодействии агрегатов МЦ540 с бактериями происходит частичный переход красителя на клеточные стенки бактерий и его мономеризация. Можно предположить, что в агрегатах МЦ540 облегчаются реакции переноса электрона между электронновозбужденными и невозбужденными молекулами красителя. По-видимому, в присутствии солей в агрегатах МЦ540 активируются фотодинамические реакции, приводящие к

генерации цитотоксичных свободных радикалов, которые могут вызывать гибель бактерий. Для подтверждения гипотезы о том, что фотовыцветание в присутствии ЫаС1 происходит с участием свободных радикалов, были проведены эксперименты по изучению влияния антиаксидантов Ь-аскорбиновой кислоты и ионола на эту реакцию в ЫаС1 и дистиллированной воде. Данные антиоксиданты являются эффективными ловушками свободных радикалов, но плохими тушителями синглетного кислорода. В таблице 6 представлены константы скорости фотовыцветания 25 мкМ МЦ540 в дистиллированной воде и в растворах КаС1 с добавлением 0,1 мМ Ь-аскорбиновой кислоты (ЬАА) или ионола. Скорость фотовыцветания для 25 мкМ МЦ540 в 0,25 М ИаС1 в присутствии 0,1 мМ аскорбата и 0,1 мМ ионола уменьшалась в 5 и 4 раз, соответственно, по сравнению с солевым раствором без антиоксидантов.

Таблица 6. Влияние антиоксидантов на константы фотовыцветания 25 мкМ МЦ540 (к, см^Дж) в дистиллированиой воде и в NaCl_

MI (54011 воде МЦ540 п 0,25 М NaCl • МЦ540 в 0,25М NaCl. н н 0,1 иМ LAA МЦ540 в 0.25М NaCl н в 0,1 мМ ионоле

(90±4)х10"5 (1770±70)х10"5 (350±50)xlOJ (450±60)*10"5

МЦ540 и воде МЦ540 в 0,1 иМ NaCl АЩ540 в 0,1мМ I.AA МЦ540 в 0,1мМ ионплс

(90±4)х10~5 (89±7)хЮ"5 (100±5,7)х10"5 (110±5)х10"5

В то же время константы фотовыцветания в дистиллированной воде в присутствии антиоксидантов и без них оказались практически одинаковыми (Табл. 6). Таким образом, данные антиоксиданты не влияют на скорость фотовыцветания мономеров и димеров МЦ540. Следовательно, наши данные указывают, что в присутствии солей в агрегатах МЦ540 активируются фотодинамические реакции, приводящие к генерации свободных радикалов, которые способны вызывает гибель бактерий эффективнее, чем в реакциях с участием синглетного кислорода.

ВЫВОДЫ

1. Использование специфического для изучения агрегации красителей метода резонансного светорассеяния позволило установить существование критической концентрации соли, начиная с которой происходит формирование плотноупакованных агрегатов мероцианина 540. Для этих целей также может быть использовано измерение оптической плотности растворов мероцианина 540 около 580 нм. Но метод резонансного светорассеяния позволил, исследовать агрегацию мероцианина 540 со значительно большей специфичностью и чувствительностью, чем спектрофотометрия

2. Обнаружено, что величина критической концентрации соли сильно зависит от валентности катиона и убывает в ряду Na+=K+»Ca++=Mg++»Al+++.

3. Обнаружено, что величина критической концентрации соли одинакова для катионов Na+ и К+ и гиперболически зависит от концентрации мероцианина 540 в растворе. Показано, что произведение критической концентрации соли на концентрацию мероцианина 540 является постоянной величиной, представляющей собой произведение растворимости диссоциированных форм красителя в воде.

4. Метод динамического рассеяния света позволяет обнаруживать, вызванное добавлением солей формирование не плотноупакованных агрегатов диаметром 2040 нм, когда концентрация соли ниже критической концентрации соли. При концентрации соли в несколько раз выше критической концентрации соли размеры агрегатов достигают диаметра 500-700 нм.

5. Скорость фотовыцветания зависит от агрегатного состояния мероцианина 540 в солевых растворах, агрегаты мероцианина 540 значительно более фотолабильны, чем мономеры и димеры.

6. Фотовыцветание агрегированных форм мероцианина 540 происходит по свободнорадикальному механизму. На это указывают ингибирующие эффекты L-аскорбиновой кислоты и ионола, которые не оказывают влияние на фотовыцветание мономерных форм, осуществляющемуся с участием синглетного кислорода.

7. Фотосенсибилизированная мероцианином 540 инактивация бактерий зависит от агрегатного состояния мероцианина 540. В солевых растворах эффективность инактивации значительно увеличивается по сравнению с дистиллированной водой и приводит к гибели как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Потапенко А., Кожинова Е., Шмиголь Т., Тихомиров А., Малахов М. Агрегация

мероцианина 540 приводит к увеличению фотолабильности красителя // Материалы 5-го Конгресса российского фотобиологического общества, Пущгаю, Россия. Тезисы докладов, 8-13 июня 2008 года, - с. 154

2. Потапенко А., Шмиголь Т., Кожинова Е. Резонансное светорассеяние (PCP) агрегатов красителей: мероцианина 540 (МЦ540) // Материалы 5-го Конгресса

российского фотобиологического общества, Пущино, Россия. Тезисы докладов, 8-13 июня 2008 года, - с.213

3. Potapenko Л., Shraigol Т., Kozhinova Е., Tikhomirov A., Kyagova A., Malakhov М. Effects of salt-induced aggregation on the rate of photolysis of merocyanine 540 photosensitizer monitored by resonance light scattering. // Book of abstracts, 15th International Congress on Photobiology, Düsseldorf, Germany. 18-23 June, 2009, - p. 162163

4. Potapenko A., Shmigol Т., Kozhinova E., Tikhomirov A., Kyagova A., Malakhov M. Resonance light scattering (RLS) study of salt-induced aggregation and photolysis of photosensitizer merocyanine 540 // Book of Abstracts, 13th Congress of European Society for Photobiology, Wroclaw, Poland. 5-10 September, 2009, - p. 75 A.

5. Тихомиров А., Шмиголь Т., Кожинова E., Кягова А., Бездетная JI., Потапенко А. Исследование агрегатов красителей методом резонансного светорассеяния: получение исправленных спектров // Биофизика. - 2009, - Т. 54, N 5. - с.824-830

6. Reshetov V., Shmigol Т., Zorin V., Bezdetnaya L. mTHPC aggregation in conventional and PEGylated liposomes // Book of abstracts, ESP 2010 Photobiology school, Brixen, Italy. 22-26 June 2010, - p.15.

7. Решетов В., Шмиголь Т., Потапенко А., Болотина JI., Зорин В Спектры резонансное светорассеяние мета-тетра (гидроксифенил) хлорина в липосомах // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем, Минск, Беларусь. 23-26 Июнь 2010, Том 1, - с.295

8. Reshetov V., Kachatkou D., Shmigol Т., Zorin V., D'Hallewin M.-A., Guillemin F., Bezdetnaya L. Redistribution of meta-tetra(hydroxyphenyl)chlorin (m-THPC) from conventional and PEGylated liposomes to biological substrates // Photochem. Photobiol. Sei., 2011, - Т. 10. №6. - p. 911-9

9. Shmigol Т., Sysolyatina E., Bekhalo V., Nagurskaya E., Ermolaeva S., Potapenko A. Effect of merocyanine 540 aggregation on the photosensitized inactivation of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa I I Book of abstracts, 14th Congress of the European Society for Photobiology, Geneva, Switzerland. 1-6 September 2011, - p. 125

10. Potapenko A., Shmigol Т., Kozhinova E., Kyagova A., Malakhov M. Aggregation of Merocyanine 540 in the presence of salts of mono-, di-, and trivalent cations // Book of

abstracts, 14th Congress of the European Society for Photobiology, Geneva, Switzerland. 16 September 2011, - p. 84

11. Потапенко А., Шмиголь T, Кожинова E, Тихомиров А, Кягова А, Малахов M Применение резонансного светорассеяния для регистрации агрегатов красителей: агрегация и фотохимия Мероцианина 540 // VI Съезда фотобиологов России, пос. Шепси, Краснодарский край. 15-22 сентября 2011 года, - с. 126

12. Шмиголь Т., Сысолятина Е., Бехало В., Нагурская Е., Ермолаева С, Потапенко А Влияние солей на агрегацию мероцианина 540 и на фотосенсибилизированную этим красителем инактивацию Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa //VI Съезда фотобиологов России, пос. Шепси, Краснодарский край. 15-22 сентября 2011 года, - с. 144

13. Шмиголь Т., Бехало В., Сысолятина Е., Нагурская Е., Ермолаева С., Потапенко А. Влияние хлорида натрия иа агрегацию мероцианина 540 и фотосенсибилизированную инактивацию Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus // Acta Naturae. 2011, T -3№4(ll)-c.ll2-18.

14. Шмиголь Т., Сысолятина E., Бехало В. Влияние агрегации Мероцианина 540 на фотосенсибилизированную инактивацию Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa II Вестник РГМУ, материалыЛЩ Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых 2012 года, - с. 324-4

15. Шмиголь Т.А., Решетов В.А., Кожинова Е.А., Малахов М.В., Потапенко А.Я Изучение агрегации мероцианина 540 в присутствии солей методами резонансного и динамического светорассеяния // Материалы докладов, IV СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года, - с. 248.

16. Шмиголь Т., Малахов М., Потапенко А. Влияние агрегатного состояния мероцианина 540 на его фотовыцветание и антибактериальные фотодинамические эффекты // Материалы докладов, IV СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ Нижний Новгород, 20-26 августа 2012 года, - с. 249

17. Kimani SG, Shmigol ТА, Hammond S, Phillips JB, Bruce JI, Macrobert AJ, Malakhov MV, Golding JP. Fully Protected Glycosylated Zinc (П) Phthalocyanine Shows High Uptake and Photodynamic Cytotoxicity // Photochemistry and Photobiology 2013 года, 89(1), - p. 139-49.

Подписано в печать: 25.02.2013

Заказ № 8191 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шмиголь, Татьяна Анатольевна, Москва

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»

Минздрава России

04201354947

Шмиголь Татьяна Анатольевна

Исследование механизма фотодинамических реакций мероцианина 540 в

биологических системах

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.01.02 - Биофизика

Научный руководитель

д.б.н., профессор А.Я. Потапенко

Москва 2013

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Физико-химические свойства мероцианина 540 9

1.1.1. Изменение спектральных свойств мероцианина 540 в зависимости 9 от полярности растворителей

1.1.2. Изменение спектральных свойств мероцианина 540 в зависимости 11 от рН растворителей

1.1.3. Влияние катионов солей на спектральные свойства мероцианина 13 540

1.1.4. Изменение спектральных свойств мероцианина 540 в зависимости 13 от микроокружения

1.2. Рассеяние света агрегатами красителя 15

1.2.1. Резонансное светорассеяние (PCP) 15

1.2.2. Динамическое рассеяние света 17

1.3. Фото динамическая терапия (ФДТ) 24

1.3.1. История фото динамической терапии (ФДТ) 24

1.3.2. Механизмы фотохимических реакций 25

1.3.3. Антимикробная фото динамическая терапия. 27

1.3.4. Способы защиты бактерий 28

1.3.5. Механизмы повреждения бактерий при фотодинамической 31 терапии

1.3.6. Свойства идеального фотосенсибилизатора 31

1.3.7. Основные фотосенсибилизаторы 32

1.3.8. Противовирусная и бактериальная активность мероцианина540 41 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 47 3.1. Влияние солей одновалентных катионов на спектры поглощения 47 мероцианина 540

3.2. Измерение и исправление спектров резанансного светорассеяния 52

3.2.1. Поправки на эффекты внутреннего светофильтра 53

3.2.2. Поправки на чувствительность прибора 56

3.2.3. Исправленные спектры резонансного светорассеяния мероцианина 63 540

3.3. Влияние солей одновалентных катионов на спектры резонансного 64 светорассеяния мероцианина 540

3.3.1. Зависимость критической концентрации солей одновалентных 69 катионов от концентрации мероцианина 540.

3.4. Влияние СаС12 и MgCl2 на спектры поглощения и резонансного 72 светорассеяния мероцианина 540

3.4.1. Зависимость критической концентрации солей двухвалентных 75 катионов от концентрации мероцианина 540

3.5. Влияние А1С1з на спектры поглощения и резонансного 77 светорассеяния мероцианина 540

3.6. Определение размеров агрегатов мероцианина 540 в воде и в водно- 81 солевых растворах

3.6.1. Метод динамического рассеяния света (ДРС) 81

3.6.2. Метод ультрафильтрации 89

3.7. Кинетика фотовыцветания мероцианина 540 и фотоинактивации 92 Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa

3.7.1. Кинетика фотовыцветания мероцианина 540 92

3.7.2. Фотоинактивации Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa 96 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105 ВЫВОДЫ 112 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК

аФДТ

БСА

ГП

ДНК

ДНС

ДРС

КДО

ЛПС

МЦ540

МВ

ПУВА-терапия

РСР

УФ

ФДТ

ФДИ-МЦ540

ФС т п '02 РЭ1

активные короткоживущие формы кислорода антибактериальная фотодинамическая терапия бычий сывороточный альбумин гематопорфирин

дезоксирибонуклейновая кислота додецилсульфата натрия динамическое рассеяние света

карбоксильными группами остатков 3-дезокси-£)-манно-

октулозоновой кислоты

липополисахариды

мероцианин 540

метиленовый синий

лечебное воздействие на кожу длинноволнового ультрафиолетового излучения А в комбинации с псораленами

резонансное светорассеяние ультрафиолет фотодинамическая терапия

фотодинамическая инактивация бактерий с мероцианином 540; фотосенсибилизированная мероцианином 540 фотодинамическая инактивация бактерий

фотосенсибилизатор Количество молекул мероцианина 540 Количество катионов соли синглетный кислород индекс полидисперсности

Введение

Данная работа посвящена изучению фотофизических, фотохимических и фотобиологических свойств анионного фотосенсибилизатора мероцианина 540 (МЦ540).

Существует много работ, в которых рассматривались перечисленные свойства МЦ540, но либо предложенные теоретические положения в этих работах не были доказаны, либо уже известные физико-химические закономерности фотопревращений МЦ540 в растворах не учитывались и как следствие не применялись в работах с биологическими объектами.

МЦ540 нашел применение как флуоресцентный зонд [18; 30; 63; 131], использовался в фотодинамической инактивации (ФДИ) бактерий [42; 75; 112] и вирусов [1; 8; 36; 69; 99; 110; 121], в фотодинамической терапии опухолей (ФДТ) [10; 34; 85; 90; 127], что говорит о высокой практической значимости этого красителя. В то же время существует недостаточное понимание фундаментальных механизмов, лежащих в основе практического применения этого фотосенсибилизатора.

Рассмотрим, что известно о фотофизических свойствах МЦ540. В ряде работ [18; 28; 29; 147] было обнаружено, что в дистиллированной воде МЦ540 присутствует в форме мономеров и Н-димеров с максимумами поглощения около 535 и 500 нм, соответственно. При добавлении солей анионные группы красителя экранируются катионами соли, что приводит к ослаблению электростатического отталкивания между молекулами МЦ540 и появлению новой полосы поглощения около 517 нм, которая приписывалась агрегатам красителя [4]. Сложность анализа спектрофотометрических данных заключается в том, что в солевых растворах полосы поглощения мономеров, димеров и агрегатов более высокого порядка сильно перекрываются [66; 71]. Попытки количественно описать переход ионизированных форм красителя в агрегаты при добавлении солей содержали слишком большие упрощения [66], связанные

с тем, что спектрофотометрия не является специфическим и избирательным методом для регистрации агрегированных форм красителя. В то же время в литературе уже было описано явление резонансного светорассеяния (PCP) агрегатами красителей [77; 96; 105; 106; 111]. Регистрация спектров PCP позволяет избирательно и с огромной чувствительностью выявлять агрегаты красителей даже в присутствии большого количества его мономерных форм или других красителей [17; 27; 111; 133; 134]. Однако метод PCP для исследования эффектов солей на агрегатное состояние МЦ540 в литературе не использовался. Первые работы на эту тему недавно появились только в нашей лаборатории [2; 151]. Трудности применения метода PCP заключаются в том, что измеренные спектры PCP бывают искажены как используемым прибором, так и оптическими артефактами: экранировкой возбуждающего света и реабсорбцией рассеянного света, особенно сильно выраженными в оптически плотных растворах красителей. Исправление измеренных спектров PCP требует учета всех перечисленных искажающих факторов, что является непростой и трудоемкой задачей [141].

Оценка фотохимических свойств разных агрегатных форм МЦ540 сталкивается с теми же трудностями, что и процессов агрегации. Здесь также требуется помимо спектрофотометрии применять более избирательные методы регистрации агрегатов, например, метод регистрации PCP.

Отсутствие ясного описания процессов агрегации МЦ540 в водно-солевых растворов привело к тому, что при проведении антибактериальной ФДИ с использованием МЦ540 не проверяли, как изменение агрегатного состояния красителя может повлиять на его фотобиологическую активность. При выборе условий фотосенсибилизированной инактивации бактерий применялись среды, которые обычно используются в микробиологии, и не было сделано попыток изменить в них агрегатное состояние МЦ540 путем варьирования концентрации солей.

Исходя из изложенного выше, были сформулированы цели и задачи настоящей работы.

Цель работы: Исследовать механизмы фотодинамических реакций мероцианина 540 и возможность их регулирования с помощью изменения агрегатного состояния МЦ540 в водных растворах путем добавления солей, а также оценить роль различных агрегатных форм МЦ540 в фотосенсибилизированной инактивации бактерий

Задачи работы:

1) Разработать модификацию метода регистрации спектров резонансного светорассеяния в водно-солевых растворах МЦ540 и разработать способы введения поправок на спектральную чувствительность прибора и эффекты экранировки возбуждающего света и реабсорбции рассеянного света.

2) Изучить качественные и количественные закономерности процессов агрегации МЦ540 в присутствии солей одно-, двух- и трехвалентных катионов используя методы спектрофотометрии, резонансного светорассеяния и динамического рассеяния света (ДРС).

3) Изучить влияние агрегатного состояния МЦ540 на его фотохимические превращения. Использовать полученную информацию для повышения эффективности фотосенсибилизированной МЦ540 инактивации бактерий.

Автор выражает благодарность лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ФГБУ «НИИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России за предоставление клинического изолята штамма 78 Staphylococcus aureus (Sa78) и штамма 104 Pseudomonas aeruginosa (Ра104)\ за подготовку протоколов культур клеток микроорганизмов к ФДИ, проведение ФДИ и за помощь, оказанную при работе над диссертацией автор благодарит

сотрудников ФГБУ «НИИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России м.н.с. Сысолятину Е.В. и д.б.н. Ермолаеву С.А.; автор выражает благодарность доктору философии Решетову В.А. из Научно-исследовательского центра Нанси, Центра Алексиса Вотрен, CNRS, Франция за выполнение работы и анализ данных по динамическому рассеянию света и за помощь, оказанную при работе над диссертацией.

Диссертация была выполнена при поддержке грантов РФФИ № 07-04-01060 «Механизм фотовыцветания применяемых в медицине фотосенсибилизаторов, биологическая активность их фотопродуктов» сроки выполнения: 15.01.0715.01.09 гг. и № 12-02-00629-а «Формирование биологически активных наночастиц из молекул фотосенсибилизаторов, контролируемое по резонансному светорассеянию», сроки выполнения 2012-2014 гг.; при поддержке Государственного Контракта № 02.740.11.0310 «Отбор фотосенсибилизаторов по заданным свойствам», Заказчик НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 2009-2011 гг. на основе соисполнения договор № 062-08 ; а также в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (Договор о сотрудничестве № 56-ВА/09 от 14 мая 2009 г.).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Физико-химические свойства Мероцианина 540.

1.1.1. Изменение спектральных свойств мероцианина 540 в зависимости от полярности растворителей.

Мероцианин 540 (МЦ540) - анионный фотосенсибилизатор (ФС), который относится к группе цианиновых красителей, содержащий гетероциклические ароматические группы, соединенные полиметиновым мостиком (схема 1). Для данного ФС является характерным наличие внутримолекулярного донорно-акцепторного взаимодействия, при котором положительный заряд остатка бензоксазола взаимодействует с отрицательной группой С=0 остатка тиобарбитуровой кислоты, при этом происходит перераспределение л;-электронов, приводящее к появлению статического дипольного момента [28; 29].

Схема 1. Химическая структура мероцианина 540. -

дипольный момент.

МЦ540 - это соединение без запаха, растворимое в воде. В водных растворах МЦ540 находится в виде мономеров и димеров [71]. В других растворителях МЦ540 может образовывать агрегаты более высоких порядков, чем димеры [18; 63; 66].

На физико-химические свойства МЦ540 большое влияние оказывает его микроокружение и агрегатное состояние, в котором находится краситель [15; 48]. Влияние растворителя на положение максимумов поглощения и флуоресценции приведены в таблице 1.

Растворитель А,аЬз, нм Хет, нм фг ег п

Вода 530 573 0,04 78,39 1,333

Метанол 554 577 0,17 32,70 1,3284

Этанол 558 579 0,25 24,55 1,3614

Ацетон 559 580 0,41 20,70 1,3587

Пропанол 561 581 20,33 1,3856

п-бутанол 562 583 0,37 17,51 1,3993

Хлороформ 568 589 0,32 4,81 1,4429

Диоксан 565 584 2,21 1,4224

Таблица 1. Х,аь5 - максимум поглощения, - максимум

флуоресценции (длина волны возбуждающего света 530 нм), ^^ -квантовый выход флуоресценции, £г - диэлектрическая постоянная, п - коэфициент преломления [29] .

Как видно из таблицы, в зависимости от растворителя, в котором находится МЦ540, положение полос поглощения и флуоресценции меняется. С уменьшением полярности растворителя происходит смещение полос поглощения и флуоресценции в длинноволновую область спектра. Также чем уменьше полярность растворителя, тем меньше стоксовский сдвиг полосы флуоресценции относительно полосы поглощения.

Увеличение или уменьшение стоксовского сдвига в полярных или неполярных растворителях можно объяснить наличием дипольного момента у молекулы МЦ540. При переходе в возбужденное состояние дипольный момент МЦ540 становиться меньше, чем в основном состоянии [29]. Это происходит

благодаря тому, что энергия сольватации возбужденной молекулы становится с меньше, чем у невозбужденной [29].

Полярность растворителя также сильно влияет на соотношение мономерной и агрегированной формы красителя. Мономерная форма красителя преобладает в неполярных растворителях, хотя в небольшом количестве присутствуют димеры и агрегаты большего порядка [29].

В полярных растворителях, таких как циклогексан и триметилпентан в спектре поглощения наблюдаетсят два пика, при этом более интенсивный длинноволновый пик соответствует мономерам, а коротковолновй пик имеет интенсивность ниже и его приписывают димерам [18]. Судя по данным получаемых из спектров поглощения, наибольшее содержание димеров происходит в водных растворах. Спектральные параметры водных растворов рассмотрены в главе 3 «Результаты и обсуждение».

В таком растворителе как метанол МЦ540 присутствует в основном в мономерной форме, с максимум флуоресценции около 580 нм. Правило зеркальной симметрии спектров флуоресценции и длинноволновой полосы поглощения соблюдено не полностью. В 1989 году Гулия с соавторами [50] объяснили это тем, что есть отличия колебательных уровней возбужденого синглетного состояния и основного. Возможно и другое объяснение. На полусу поглощения мономеров, отвечающих за флуоресценцию, может накладываться полоса поглощения димеров, которые имеют слабую флуоресценцию.

1.1.2. Изменение спектральных свойств мероцианина 540 в зависимости от рН растворителя

Хорошо известно, что молекула МЦ540 в воде диссоциирует анион красителя с отрицательно заряженной группой БОз" и на катион Ыа+ [147]. При этом способность воды образовывать вокруг ионов гидратные оболочки приводит к уменьшению сил отталкивания между заряженными отрицательно ионами, тем самым способствуя агрегации красителя.

Таким образом, водные растворы МЦ540 в нейтральной среде имеют один пик флуоресценции около 577,2±2,1 нм, который приписывают мономерам красителя [71] и два пика поглощения - около 500,3±0,1 нм и 533,6±1,2 нм. Эти два пика поглощения МЦ540 в водных растворах называются «водными» максимумами [147]. Известно, что мономерной форме красителя принадлежит длинноволновый пик поглощения, а коротковолновый -димерной форме [147].

Анализ спектров поглощения и флуоресценции указывает на то, что соотношение мономерных и агрегированных форм в растворе не меняется в водной среде до рН=1,7. При этом форма спектров не меняется, только происходит незначительное тушение интенсивности флуоресценции и небольшое уменьшение амплитуды спектра поглощения. Изменение рН от 1,7 до 1,0 приводит к появлению нового пика поглощения с максимумом около 517 нм и двумя плечами около 590 нм и 635 нм и исчезновению «водных» максимумов [118]. Дальнейшее закисление водного раствора приводит к выпадению осадка. Данные изменения являются обратимыми [147].

При рН водной среды от 7,6 и выше формируется широкая полоса поглощения около 390,2±0,6 нм, интенсивность которой увеличивается с увеличением рН. Амплитуда «водных» максимумов (500 нм и 534 нм) уменьшается до полного их исчезновения. В спектре флуоресценции наблюдается исчезновение пика при 577,2±2,1 нм и формирование нового пика около 500,4±1,8 нм.

Данные спектральные изменения сопровождаются изменением цвета образца: из красного он переходит в желтый. Смена цвета соответствует появлению новых форм, которые поглощают в более коротковолновой области. Новые формы имеют более короткие я-электронные системы, по сравнению с исходной формой МЦ540 в водном растворе. Они образуются вследствие

химического воздействия на молекулы красителя гидроксильными ионами [147]. Такие спектральные изменения необратимы.

Аналогичные, как при закислении среды спектральные изменения растворов МЦ540 возникают при нейтральном рН, если увеличивать концентрацию соли. При высоких концентрациях ионов появляются такие же полосы поглощения, что и при закислении раствора от рН 1,7 до рН 1.

1.1.3. Влияние катионов солей на спектральные свойства мероцианина 540

Добавление к водному раствору МЦ540 солей одно- и двухвалентных катионов приводит к формированию новой полосы поглощения при 517 нм и исчезновению «водных» максимумов 500 и 533 нм [4; 147]. Рост интенсивности этого максимума происходит с увеличением концентрации соли до уровня насыщения, что приводит к уменьшению инте�