Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование фотолиза мероцианина 540 методом резонансного светорассеяния, иммуносупрессорное действие фотопродуктов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование фотолиза мероцианина 540 методом резонансного светорассеяния, иммуносупрессорное действие фотопродуктов"

00306434Б

На правах рукописи

Кожинова Елена Анатольевна

«ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОЛИЗА МЕРОЦИАНИНА 540 МЕТОДОМ РЕЗОНАНСНОГО СВЕТОРАССЕЯНИЯ, ИММУНОСУПРЕССОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФОТОПРОДУКТОВ»

03.00.02 - биофизика 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

О 2 АВГ 2007

003064346

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и

социальному развитию»

Научные руководители.

Доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич Доктор медицинских наук, доцент Кягова Алла Анатольевна

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, профессор Осипов Анатолий Николаевич Доктор медицинских наук, профессор Дидковский Николай Антонович

Ведущее учреждение1 Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится « 12 » сентября 2007 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 057 01 при ФГУ «НИИ Физико-химической медицины Росздрава», по адресу 119992, г Москва, ул Малая Пироговская, д 1-а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ Физико-химической медицины Росздрава»

Автореферат разослан « »_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета.

доктор биологических наук

МА Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор (ФС), применяемый в фотодинамической терапии (ФДТ) При проведении ФДТ с МЦ540 протекают два типа фотодинамических реакций- тип I - перенос электрона между электронновозбужденным красителем и биосубстратом, тип II — перенос энергии с электронновозбужденного красителя на молекулярный кислород с генерацией синглетного кислорода, который и окисляет биомолекулы Кроме того, сам ФС под действием света разрушается, и образуются его стабильные фотопродукты, которые могут взаимодействовать с биомолекулами, что приводит к повреждению последних [Gulhya, 1990]. В литературе показано, что фотопродукты МЦ540 обладают противовирусной [Gulliya, 1990, Tran, 1992] и противоопухолевой активностью [Grabbe, 1998, Sieber, 1987, Pervaiz, 1998; Perv"'7, 1999] in vitro и in vivo Фотолиз МЦ540 сильно зависит от агрегатного состояния красителя [Bilski, 1999] Существует метод, позволяющий обнаруживать агрегаты красителей - метод резонансного светорассеяния (PCP). Этот метод применялся для исследования агрегации хлоринов, порфиринов и др [Pasternak, 1995, Bornsevich, 1997; Yang, 2003] Для изучения агрегатных свойств МЦ540 данный метод ранее не применялся В этой связи, является актуальным использовать метод PCP для выяснения влияния растворителей на агрегатное состояние МЦ540 и скорость его фотолиза

Известно, что ФДТ с красителями порфиринового и хлоринового ряда инициируют супрессию Т-клеточного звена иммунитета m vivo Известно также, что супрессорное действие ФДТ с порфиринами, хлоринами и псораленами реализуются через стадию образования фотопродуктов [Kyagova, 2005; Potap-enko 1998] Однако в литературе нет данных о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему В этой связи исследование влияния фотопродуктов МЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo является актуальным

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследовать фотолиз и фотовыцветание мероцианина 540 в различных агрегатных состоя-

1

ниях и оценить иммуносупрессорное действие фотопродуктов данного красителя

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1 Разработать методику получения неискаженных спектров резонансного светорассеяния красителей

2 Изучить методами резонансного светорассеяния, спектрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540

3 Изучить действие предоблученного МЦ540 (пМЦ540) на Т-клеточный иммунный ответ m vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей

Научная новизна исследования. В диссертационной работе разработана методика получения неискаженных спектров PCP агрегатов красителей Введено понятие "резонансного фактора" (РФ), величина которого определяется только размерами и структурой агрегатов красителя, и не зависит от неспецифического рэлеевского светорассеяния Предложено строить спектры PCP как зависимость РФ от длины волны Показано, что добавление солей к водным растворам МЦ540 приводит к возникновению крупных надмолекулярных агрегатов, обладающих интенсивным PCP При этом в спектрах поглощения и PCP МЦ540 появляется индуцированная солями спектральная полоса комплексиро-вания с максимумом около 517 нм Эти агрегаты начинают формироваться при концентрациях солей одновалентных катионов выше критической (ККС) Величина ККС обратно пропорциональна концентрации МЦ540 Обнаружен другой тип крупных надмолекулярных агрегатов, образующихся при концентрациях соли ниже ККС, характеризующийся максимумом в спектре PCP при 420 нм и никак не проявляющийся в спектрах поглощения

Исследовано фотовыцветание МЦ540 в водных и водно-солевых смесях методами PCP и спектрофотометрии Разработан флуориметрический метод оценки фотолиза МЦ540 Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. В водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих

отрицательно заряженную группу SO3" и таким способом способствующих образованию крупных агрегатов Выявлено, что из всех присутствующих агрегатных форм МЦ540 в водно-солевых растворах, наиболее фотолабильны крупные надмолекулярные агрегаты, характеризующиеся максимумами спектров PCP при 517 и 420 нм, тогда как димеры и мономеры фотолизируют значительно медленнее Обнаружено, что в растворах МЦ540 в дистиллированной воде квантовый выход фотолиза зависит от длины волны действующего света При облучении светом 436 нм (поглощают преимущественно димеры) квантовый выход фотолиза в 2 раза выше, чем при облучении около 546 нм (поглощают преимущественно мономеры) Таким образом, доказано, что фотолабильность разных агрегатных форм МЦ540 убывает в ряду крупные агрегаты > димеры > мономеры

Впервые обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ ut vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Впервые показано, что супрессия КЧ, вызванная пМЦ540, адоптивно переносится другим животным Выявлено, что в основе иммунного механизма супрессорного действия пМЦ540 на КЧ лежит угнетение функций клеток - эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ

Практическая значимость. Работа является фундаментальным исследованием, направленным на выяснение механизма фотолиза мероцианина 540 и изучение иммуномодулирующих свойств его фотопродуктов Отдельные ее положения имеют прямое практическое приложение для совершенствования ФДТ. Исследование спектральных свойств МЦ540 и закономерностей его фотолиза позволяют предложить оптимальные условия для получения продуктов фотоокисления МЦ540, обладающих иммуносупрессорными свойствами

Внедрение в практику. Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики и кафедры фармакологии педиатрического факультета ГОУ ВПО "РГМУ" Росздрава

Положения, выносимые на защиту.

1. Скорость фотолиза мероцианина 540 увеличивается в водно-солевых растворителях, которые способствуют агрегации данного красителя.

2 Продукты фотолиза мероцианина 540 способны влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo

3 Иммуносупрессорное действие продуктов фотоокисления мероцианина 540 является системным и обусловлено активацией клеток с супрессорным потенциалом

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Пиро-гобской студенческой научной конференции (2004, Москва), 1П Съезд биофизиков России (2004 г, Воронеж), 1st International Conference Skin & Environment (Moscow-St Petersburg, Russia, 2005), IV Съезде фотобиологов России (2005 г, Саратов)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 страницах, содержит 41 рисунок, 7 схем, 1 таблицу Состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы " Список литературы включает 168 источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы В работе использовались коммерческие препараты мероциа-нин 540, протопорфирин IX (натриевая соль), 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ), оксазолон («Sigma», США), фосфатный буферный солевой раствор («ICN», США), псорален синтезирован в Институте химии растительных веществ (Узбекистан), ацетон («VEB Laborchemie Apolda», Германия), среда Хенкса (Институт полиомиелита, Москва), хлорид калия и дигидрат хлорида кальция («Acros Orgamcs», США)

Методы исследования. Спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, метод резонансного светорассеяния, реакция КЧ к гаптенам у мышей, методы адоптивного переноса реакции КЧ и ее супрессии

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка методики получения неискаженных спектров резонансного светорассеяния (PCP") агрегатов красителей.

Явление PCP - это усиление рэлеевского светорассеяния в области поглощения красителей, которое возникает при сильном электронном (экситонном) взаимодействии между молекулами хромофора в агрегате [Pasternack and Collmgs, 1995] Спектры PCP принято регистрировать на спектрофотометрах путем одновременной развертки возбуждающего и регистрирующего монохро-маторов, настроенных на одинаковую длину волны Однако измеренные спектры бывают сильно искажены как регистрирующим прибором, так и самим объектом исследования [Bonssevitch, 1997] Известно, что протопорфирин IX (ПГОХ), как и многие другие порфирины, сильно агрегирует в водных растворах [Bonssevitch, 1997], поэтому ПГПХ был выбран нами для разработки данной методики

Спектр светорассеяния раствора ПГПХ до внесения в него поправок представлен на рис 1А (кривая 2) Видно, что светорассеяние раствора ПГПХ значительно интенсивнее, чем растворителя (кривая 3), и находится в области поглощения ПГПХ (кривая 1) Это свидетельствует о том, что рассеяние является резонансным и происходит на агрегатах красителя. Однако форма измеренных на спектрофлуориметре спектральных кривых 2 и 3 (рис 1А) искажена, как прибором, так и самим исследуемым объектом

Сначала учтем искажения, вносимые прибором Для этого внесем исправления в измеренный спектр светорассеяния растворителя (кривая 3, рис 1А), т к известно, что он описывается законом Рэлея 7J~1A,4 (кривая 3, рис 1Б), а все отклонения от этой зависимости обусловлены только чувствительностью прибора [Bonssevitch, 1997] Разделив кривую 3 (рис 1А) на кривую 3 (рис 1Б) по-

лучим спектральную зависимость чувствительности флуориметра Kj. Используя спектральную зависимость К*, получаем исправленный на чувствительность прибора спектр светорассеяния раствора 111 ИХ {ipJKx, кривая 2, рис 1Б) Видно, что этот спектр (рис 1Б, кривая 2) имеет провал около 400 нм, т е вблизи максимума поглощения ПГПХ Этот провал возникает вследствие проявления эффектов внутреннего светофильтра Оптическая плотность в максимуме равна 0,35 (кривые 1, рис 1), что соответствует ослаблению луча возбуждающего света на 55% Естественно, что такое значительное экранирование интенсивности возбуждающего PCP света самим исследуемым веществом должно привести к ослаблению интенсивности рассеянного света Если учесть, что рассеянный свет имеет ту же длину волны, что и возбуждающий, то это должно привести к дополнительному снижению интенсивности PCP вблизи максимума поглощения за счет эффекта реабсорбции рассеянного света Варианты поправки на эффект внутреннего фильтра предлагались в работе [Yang, 2003] Мы, неза-

« tpa In2 10 D2 висимо от авторов этой работы, вывели данную поправку г = —-—

кг (1-10" )

(1)

Уравнение (1) позволяет ввести поправку как чувствительность прибора, так и на эффекты внутреннего светофильтра На рис 1Б (кривая 4, iucnp) представлен исправленный на чувствительность прибора и эффекты внутреннего фильтра спектр светорассеяния раствора 111 ИХ Известно, что интенсивность

рассеяния света {iucnp) зависит от длины волны по закону imnp где а-

Л

поляризуемость агрегата [Pasternack and Collmgs, 1995] Таким образом, информацию об aiperare несет только второй сомножитель |аг|2, тогда как сомножитель -i- - отражает неспецифическую информацию о рэлеевском светорас-

/V

сеянии. Мы назвали |а(2 - резонансным фактором (РФ) и на рис. 1В (кривая 2)

дана зависимость РФ от длины волны, определяемая размерами и упаковкой агрегатов

Разработанную нами методику получения неискаженных спектров РФ красителей, мы применяли для изучения физико-химических и фото - химических свойств МЦ540

1200

200 300 400 500 6С0 700 800 длина волны (нм)

40 04

35 I 1 I л'*1

п 30 \ 1Л1 \ /' 03

О = 25 \ ' ' \ 1 I1 ' \ 4

о Vo \1 L \ 02

У 15 л\

10 й Щ 2 i\\A л 01

5 00

0

200 300 400 500 600 700 800 длина волны (нм)

В Рис. 1 Отработка метода резонансного

светорассеяния на растворах прото-пофирина IX (ШПХ).

А: Спектры поглощения (1) и зарегистрированные спектры светорассеяния раствора ППГХ (2) и растворителя (3) [0,4% этанол, 0,6% ПЭГ (полиэтилен гликоль 400) в ФБР]

Б: Спектр поглощения (1), исправленный только на чувствительность прибора (кривая 2), а также эффекты внутреннего фильтра (см формулу (1)) спектр резонансного светорассеяния (iuaip) раствора ПП1Х (кривая 4) Кривая 3 - светорассеяние Рэлея растворителя (г^ЖО

В: Спектральная зависимость резонансного фактора раствора ПП1Х (кривая 2), полученная по данным рисунка 1 Б путем деления кривой 4 на кривую 3 (рис 1 Б) (1) - спектр поглощения, (3) - спектр возбуждения флуоресценции раствора ПП1Х (к^ = 480 нм)

2. Изучение физико-химических свойств МЦ540 методом PCP и спектрофотометрии.

Молекула МЦ540 - является статическим диполем и имеет анионную группу (рис 2А) Схематически ее можно представить, как показано на рис. 2Б Известно, что в воде МЦ540 присутствует только в форме мономеров и диме-

300 400 500 600 700 длина волны(нм)

ров [Sikurova, 1995, Cunderhkova, 2001] В спектрах поглощения в чистой воде (рис 2В) димеры имеют максимум около 500 нм, а мономеры - 533 нм Димеры формируются таким образом, чтобы анионные группы мономеров были максимально удалены (рис 2Б) В результате, присоединение к димеру дополнительного мономера невозможно из-за возникновения при этом электростатического отталкивания

Ситуация меняется, при добавлении солей, например IM KCl (рис 2В). появляется новый максимум поглощения 517 нм, который называют «полосой комплексирования», индуцированной солями [Sikurova, 1995, Ademer and Aaron, 2002] Механизм возникновения «полосы комплексирования» и способ упаковки молекул МЦ540 в присутствии солей в литературе не описан Ответить на этот вопрос может помочь метод PCP (рис ЗБ)

Рис. 2. А: Химическая формула мероцианина 540, - статический дипольный момент, Б: Схематичное изображение мономеров и димеров мероцианина 540, В: Мероцианин 540 (0,8*10'5 М) в воде и 1 M KCl.

В отсутствие солей в регистрируемом спектре (кривая 0, рис ЗБ) явление PCP отсутствует Видна только небольшая полоса около 550 нм, обусловлен-

нал, по-видимому, флуоресценцией МЦ540 при переходе между нижними колебательными уровнями электронно-возбужденного и основного состояний (О'—* 0 переход) В присутствии 0,1 M KCl появляется широкая полоса PCP с максимумом около 420-460 нм, никак не проявляющаяся в спектрах поглощения, где в присутствии такой концентрации соли в этой части спектра происходит только уменьшение оптической плотности (рис ЗА) При более высоких концентрациях соли 0,28-1 M видно, что эта полоса PCP растет мало, но возникает новая более интенсивная полоса PCP, близко соответствующая "полосе комплексирования" в спектре поглощения МЦ540 в 1 M KCl. Одновременно с увеличением сигнала PCP при повышении концентрации соли уменьшается, как этого и следовало ожидать, полоса флуоресценции около 550 нм, т.к известно, что в присутствии солей происходит тушение флуоресценции МЦ540 [Sikurovâ, 1995, Adenier and Aaron, 2002] Т.к. интенсивность PCP пропорциональна квадрату объема агрегатов [Pasternack and Collings, 1995], то можно утверждать, что максимумы в спектрах РФ при 420-460 нм и 517 нм принадлежат крупным индуцированным добавлением солей агрегатам Причем, если агрегаты с максимумом 517 нм выявляются как методами PCP, так и спектрофотометрии, то агрегаты с максимумом 420-460 нм выявляются только методом PCP

Рис.3 МЦ 540 (0,8*10"5М) в присутствии KCl. Цифры у кривых- концентрация KCl, М А: Спектры поглощения, Б: Спектры резонансного светорассеяния

3. Фотолиз МЦ540 в водно-солевых растворах.

Изучение фотолиза МЦ540 представляет большой интерес, т к при фотодеградации данного красителя образуются фотопродукты, способные влиять на иммунную систему, что может быть очень важным при проведении ФДТ. Мы изучали фотолиз МЦ540 в водно-солевых растворах Соотношения красителя и солей подбирали таким образом, чтобы в одном случае присутствовали оба типа агрегатов (с максимумами PCP при 420-460 нм и 517 нм, рис. 4А), а во втором - только один тип (420-460 нм, рис 4Б) Как происходит фотолиз разных типов агрегатов МЦ540 ранее не изучалось

300 400 500 Б00 длина волны (нм)

200 300 400 500 600 длина волны (нм)

700

018 Фотолиз

медленный^, быстрый

012

S крупные

о агрегаты

£

0 06 мономеры

и димеры

0 00 ......

0 10 20 30

Концентрация МЦ ( цМ)

Рис. 4 Фотолиз мероцианина 540, измеренный по убыли оптической плотности (.D) и резонансного светорассеяния (PCP) Сплошные линии - спектры до облучения, пунктирные - после 30 минут облучения (546 нм, 304 Вт/м2) Облучение в 1 см кварцевой кювете, объем облучаемого образца 3 мл А: МЦ540 (0,8 1(Г М) в 1 M КС1 Б МЦ (0,93* 10"5 М) в 0,1 M КС1 В: Зависимость ККС от концентрации МЦ540 Стрелочка показывает уменьшение концентрации МЦ540 в ходе фотолиза График позволяет определить, какая доля красителя вовлечена в формирование крупных агрегатов (максимум PCP и поглощения 517 нм), а также димеров и мономеров при любой концентрации соли

На рисунке 4А видно, что в результате облучения МЦ540 в 1 M растворе КС1 качественно меняется форма спектра поглощения Исчезает "полоса ком-плексирования" с максимумом около 517 нм. В то же время в облученном образце отчетливо проявляются "водные" максимумы, принадлежащие димерам и мономерам МЦ540 Параллельно резко ослабляется PCP и качественно меняется форма спектра PCP После облучения сохраняется коротковолновая полоса PCP с максимумом около 420-460 нм Эти данные указывают на то, что наиболее фотолабильны крупные агрегаты МЦ540 с максимумами поглощения и PCP 517 нм

Рассмотрим теперь случай когда при добавлении соли (0,1М КС1) к МЦ540 еще не образовалось крупных агрегатов 517 нм, но уже появились агрегаты 420-460 нм (рис 4Б) Видно, что коротковолновая полоса PCP убывает быстрее, чем оптическая плотность Это говорит о том, что агрегаты с максимумом PCP 420-460 нм более фотохимически лабильны, чем димеры и мономеры

В литературе существует понятие «критической концентрации соли» (ККС), выше которой начинает формироваться «полоса комплексирования» МЦ540 с максимумом 517 нм Мы нашли, что величина ККС обратно пропорциональна концентрации МЦ540 (4В). График представленный на рис 4В и данные об агрегатах МЦ540, полученные методом PCP, позволяют объяснить особенности кинетики фотолиза в водно-солевых растворах Нами обнаружено, что кривая фотолиза МЦ540 в водно-солевых растворах не является моноэкспоненциальной При малых дозах фотолиз идет быстро, а при больших - замедляется На рис 4В стрелочкой показано уменьшение концентрации красители в ходе фотолиза. Пока в растворе присутствуют крупные надмолекулярные агрегаты с максимумами поглощения и PCP 517 нм фотолиз идет достаточно быстро В тот момент, когда концентрация МЦ540 настолько уменьшается, что при данной концентрации соли образование "полосы комплексирования" становится невозможным, фотолиз замедляется и фотодеградации подвергаются надмолекулярные агрегаты с максимумом PCP 420-460 нм, а также димеры и мономеры Когда содержание красителя уменьшается до концентрации, при которой

МЦ540 может находиться, независимо от присутствия солей, только в форме мономеров и димеров, фотолиз замедляется еще сильнее В специальных опытах (данные приведены в диссертации) нами показано, что скорость фотолиза димеров значительно выше, чем мономеров Таким образом, фотолабильность МЦ540 зависит от агрегатного состояния и убывает в ряду крупные надмолекулярные агрегаты (характеризующиеся максимумами спектров PCP при 517 и 420-460 нм) » димеры > мономеры

На следующем этапе работы мы изучали как влияют фотопродукты данного красителя, накопленные в водно-солевых смесях, на иммунную систему животных

4. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на реакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей.

Известно, что фотопродукты МЦ540 способны in vivo замедлять рост привитых опухолей у мышей [Gulliya, 1990] и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в культурах in vitro [Gulliya, 1990, Pervaiz, 2001] Однако не изучено, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему

Нами изучено влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на модели реакции КЧ к 2,4- динитрофторбензолу (ДНФБ) у мышей - Т-клеточный иммунный ответ m vivo [Samt-Mezard, 2004]

Известно, что развитие реакции КЧ опосредуется специфическими CD8+-лимфоцитами [Samt-Mezard, 2004] Данная реакция проявляется в виде локального воспаления (отека) в месте повторного нанесения гаптена, например, ДНФБ, и часто используется в качестве модели для оценки влияния различных агентов на Т-клеточный иммунный ответ m vivo [Simkin, 1997; Simian, 2000]

4.1. Супрессорное действие предоблученного МЦ540 (пМЦ540) на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей

Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно работам [Kim, 1990; Yee, 1990] с незначительными модификациями (схема 1) Мышей линии СВА (самцы весом 18-20 г, возраст 8-10 недель) сенсибилизировали пу-

тем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне Через 144 ч после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2% раствора в ацетоне) На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя (ацетона) в качестве контроля Через 24 часа оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека опытного (аппликация ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле

% супрессии = [1-(Е-К")/(К+-К")]*100%, где Е, К+ и К" - отек уха у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно

Схема 1. Влияние предобпуценного МЦ540 на реакцию контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ. (Схема эксперимента).

сенсибилизация 50 мкл 0,3% ДНФБ накожно

120 ч

+ в/в 0,5 мл

- ФБР (положительный контроль) или - МЦ540 без облучения • облученный МЦ540

24 ч

^регистрация

24 ч отека уха

5 мкл 0,2% ДНФБ накожно

Раствор МЦ540 в ФБР (1,76 10"5М, с 0,5% этанола) облучали разными дозами света 546 нм (173 Вт/м2) Процесс фотолиза МЦ540 контролировали спек-трофотометрически Облученный раствор МЦ540 вводили внутривенно по 0,5 мл мышам через 120 часов после сенсибилизации последних ДНФБ, т.е за 24 часа до повторного нанесения гаптена (схема 1) В группе положительного контроля (К+) сенсибилизированным ДНФБ мышам вводили по 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола без МЦ540. В качестве отрицательного контроля (К") служила группа интактных (несенсибилизированных ДНФБ) мышей, получивших аппликацию разрешающей дозы ДНФБ (5 мкл 0,2 % раствора в ацетоне) Результаты экспериментов представлены на рис 5.

О 36

Рис. 5. Влияние предоблученного МЦ540 на КЧ к ДНФБ у мышей.

0 30

МЦ540 (1,76 10"5 М в ФБР, содержащем 0,5% этанола) облучали разными дозами (546 нм, 173 Вт/м2) при 7°С, сверху в стеклянном стакане с плоским дном, толщина облучаемого образца составляла 1,6 см, объем 50,5 мл К+ -положительный контроль, К" - отрицательный контроль Каждая точка на кривой - среднее для 5 мышей ± SEM *р<0,001 #р<0,03 по сравнению с К

5 0.10

_ 0 25 £

0 05

0.00

0 500 1000 1500 2000 доза (кДж/м 2)

Видно, что МЦ540 без облучения не влияет на КЧ Напротив, пМЦ540 обладает зависимым от дозы супрессорным действием Таким образом, облучение МЦ540 приводило к накоплению фотопродуктов, вызывающих супрессию реакции КЧ

Эти данные показывают, что фотопродукты МЦ540 способны влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей. Следующие серии экспериментов были направлены на выяснение иммунных механизмов супрессорного действия пМЦ540

4.2. пМЦ540 ослабляет функции эффекторов КЧ

Известно, что развитие КЧ к ДНФБ опосредуется эффекторными АГ-специфическими CD8+ Т-лимфоцитами и супрессия реакции КЧ может быть следствием повреждения агентом функций данных клеток [Kobayashi, 2001] В этой связи нами была изучена возможность реализации супрессорного действия пМЦ540 через угнетение функций АГ-специфических эффекторов КЧ

Хорошо известно также, что реакция КЧ, в отличие от других видов гиперчувствительности, может быть перенесена от сенсибилизированного животного несенсибилизированному не сывороткой, а АГ-специфическими Т-клетками [Black, 1999, Grabbe and Schwarz, 1998] Для выявления действия различных

агентов, включая фотосенсибилизаторы, на АГ-специфические эффекторные Т-лимфоциты, общепринятым подходом, являются опыты по адоптивному переносу эффекторов КЧ [Simkm, 1997, Musser and Oseroff, 2001] Данный подход был использован нами для выявления действия пМЦ540 на эффекторные Т-лимфоциты КЧ

Мы изучили влияние in vivo фотопродуктов МЦ540 на сохранение способности клеток-эффекторов КЧ адоптивно переносить данную реакцию (схема 2) Для этого МЦ540 (1,7610'5 М в ФБР, содержащем 0,5% этанола) облучали светом 546 нм в течение 2 ч (176 Вт/м2), затем 0,5 мл раствора пМЦ540 вводили внутривенно мышам-донорам линии СВА через 120 ч после сенсибилизации животных ДНФБ Через 24 ч после инъекции пМЦ540 у мышей-доноров выделяли клетки селезенки, отмывали суспензию спленоцитов путем центрифугирования, после чего вводили 108 клеток внутривенно сингенным интактным мышам-реципиентам. Через 1 ч после инъекции мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 5 мкл 0,2% ДНФБ В группах сравнения мышам-донорам вводили внутривенно 0,5 мл раствора необлученного МЦ540, либо 0,5 мл растворителя (ФБР с 0,5% этанола, группа положительного контроля К+)

Результаты данных экспериментов отражены на рис 6 На рисунке видно, что перенос спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ доноров интактным мышам-реципиентам приводит к иммунизации последних, что проявляется в развитии у мышей-реципиентов реакции КЧ при повторной аппликации на ухо ДНФБ (группа К+) Этот факт свидетельствует об успешном переносе интактным мышам-реципиентам пула специфически сенсибилизированных ДНФБ эффекторных Т-лимфоцитов КЧ Видно также, что перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540, достоверно не влиял на КЧ мышей-реципиентов (р>0,05 по сравнению с К+) Напротив, перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию пМЦ540, приводил к полной супрессии реакции КЧ мышей-реципиентов (р<0,01 по сравнению с К+)

Схема 2. Влияние предоблученного МЦ540 на перенос эффекторами реакции КЧ.

сенсибилизация 50 мкл 0,3% ДНФБ накожно

+ в/в 0,5 мл

- ФБР (положительный контроль) или - МЦ540 без облучения

- облученный МЦ540

». регистрация отека уха

реципиент

интактный

5 мкл 0,2% ДНФБ накожно

Полученные результаты указывают, что пМЦ540 in vivo угнетал способность клеток-эффекторов КЧ переносить данную реакцию другим животным Это может быть следствием 2-х процессов, прямого воздействия пМЦ540 на эффекторные лимфоциты или инициации клеток с супрессорным потенциалом

Рис.б. Ослабление способности эффекторов к переносу реакции КЧ in vivo под действием пМЦ540

Условия проведения эксперимента отражены на схеме 2. МЦ540 (1,7610"5 М в ФБР, содержащем 0,5% этанола) облучили светом 546 нм в дозе 1300 кДж/м2. К+ - положительный контроль, перенос сплено-цитов от мышей-доноров, получивших внутривенно инъекцию ФБР с 0,5% этанола, К" - отрицательный контроль Каждая группа состояла из 5 пар сингенных мышей-доноров и мышей-реципиентов Представлено среднее ± SEM #р<0,01 по сравнению с К

под действием пМЦ540

0 20

015

"i"

ж о ь о

0 05

0 00

В!

к- к+

МЦ540 ПМЦ540

4.3. пМЦ540 активирует клетки с неспецифическим супрессорным действием на КЧ

Известно, что ФДТ с использованием таких классов фотосенсибилизаторов, как порфирины и псоралены, может ограничивать развитие КЧ путем активации клеток с супрессорным потенциалом Выявить клетки с супрессорным действием на КЧ можно в опытах по адоптивному переносу супрессии КЧ [Эпикт, 2000] Для фотопродуктов МЦ540 таких исследований не проводилось В этой связи были проведены эксперименты по влиянию пМЦ540 на адоптивный перенос супрессии реакции КЧ (схема ЗА)

Мышей-доноров линии СВА сенсибилизировали накожно ДНФБ Через 120 ч после сенсибилизации животным-донорам вводили внутривенно по 0,5 мл необлученного раствора МЦ540 (1,76 10'5 М в ФБР, содержащем 0,5% этанола) либо 0,5 мл пМЦ540 (облучение светом 546 нм, 176 Вт/м2, 140 мин) Через 24 ч после инъекции МЦ540 или пМЦ540 мышей-доноров забивали и выделяли спленоциты Сингенным мышам-реципиентам, предварительно за 144 часа сенсибилизированным ДНФБ, вводили внутривенно по 1 мл суспензии сплено-цитов (108 кл/мл) мышей-доноров Через 1 ч после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем накожной аппликации на внутреннюю поверхность уха ДНФБ Через последующие 24 ч регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов (схема ЗА)

Были поставлены следующие иммунологические контроли (рис 7А, схема

3)

К+1 - положительный контроль с переносом спленоцитов Мышам-донорам через 120 часов после сенсибилизации 0,3% ДНФБ вводили внутривенно 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола Через 24 часа выделяли селезенки мышей-доноров и 108 спленоцитов переносили внутривенно мышам-реципиентам, которые были предварительно за 144 часа сенсибилизированы 0,3% ДНФБ. Через 1 час после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 0,2% ДНФБ

К+4 - положительный контроль без переноса спленоцитов. Мышам через 120 часов после сенсибилизации 0,3% ДНФБ вводили внутривенно 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола Через 24 часа мышей тестировали путем аппликации на ухо 0,2% ДНФБ

К 1 - отрицательный контроль Интактных мышей тестировали, нанося 5 мкл 0,2% ДНФБ на ухо

Результаты данных экспериментов представлены на рис. 7А. Видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию необ.'¡ученного МЦ540, незначительно подавлял (супрессия 30% ± 18%) реакцию КЧ мышей-реципиентов. При этом введение мышам-реципиентам клеток мы шей-доноров, получивших инъекцию пМЦ540, приводило к значительной супрессии реакции КЧ (69% ± 4%).

Таким образом, после введения пМЦ540 сенсибилизированным мышам-донорам в популяции спленоцитов появлялись клетки, угнетающие развитие КЧ при их адоптивном переносе сенсибилизированным мы щам-реципиентам, т.е. предоблученный МЦ540 in vivo вызывал появление клеток, обладающих

' аМЦ540 Рис, 7. П редиб лученный

ЕЭПМЦ540 МЦ540 вызывает здоптив-

п 4 1 т2 но переносимую супрессию

— х реакции КЧ. Эта супрессия

4 К+ а является не спец и фи ческой,

0.3 - r~rjn МЦ540 вводили внутривенно

g 1 Щ сенсибилизированным

ДНФБ мышам-донорам через

ф 0.2 * Щ !20 ч после сенсибилизации

^ iiî (схема 3).

, * р * А - перенос спленоцитов ре-

0,1 - ¿л _L ципиентам, сеисибилизиро-

Ц; :: Ц ванным ДНФБ.

■ 1 р- Щ Б - перенос спленоцитов ре-

q о EU_-___13а__rilr^l |г 1!Ш1 ципиентам, сенсибилизиро-

А; ДНФБ Б: оксазолон ванным оксазожшон.

К | - отрицательный контроль на ДНФБ без переноса спленоцитов; К , - положительный контроль на ДНФБ в переносе; К^ - положите л ьный контроль на ДНФБ без переноса спленоцитов; К j - отрицательный контроль на оксазолон fi переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизироваршых допоров на интактных реципиентов с последующим разрешением реакции КЧ оксазолоном); К э - отрицательный контроль на оксазолон без переноса клеток; К+3 - положительный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизировапных доноров к сенсибилизированным оксазолоном реципиентам); <0,0001 по сравнению с К ь *р<0,001 по сравнению с К 2.

[

сулрессорнои активностью.

г

г о

«

X >.

и

0.2

0.1

0.0

QWIU.54Q ^пМЦ540

к; +

т<

rifíi.

к;

м

А; ДНФБ

К

£

_пЬ

зК.

Б: оксазолон

t.

Полученные результаты позволяют сделать следующие заключения: во-первых, супрессия реакции КЧ, вызванная действием пМЦ540 может быть адоптивно перенесена другим животным, во-вторых, предоблученный МЦ540 способен т vivo активировать клетки с супрессорным потенциалом.

В литературе известно, что, например, ФДТ с фотофрином подавляет КЧ путем активации С04+-лимфоцитов, обладающих специфическим супрессорным действием на КЧ [Simkm, 1997, Musser and Oseroff, 2001] Напротив, супрессия КЧ обусловленная действием ФДТ с гематопорфирином неспецифична, и клетками-регуляторами КЧ являются макрофаги [Lynch, 1989]

В этой связи в следующей серии экспериментов мы оценили специфичность супрессорного действия пМЦ540 на КЧ Для этого были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ с использованием двух разных гаптенов ДНФБ и оксазолона (схема ЗБ). Мышей-доноров линии СВА сенсибилизировали путем накожного нанесения ДНФБ. Через 120 часов вводили по 0,5 мл МЦ540 без и после его облучения, и через последующие 24 ч выделяли спленоциты. Сингенным мышам-реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном за 144 ч до этого, вводили внутривенно 108 спленоцитов мышей - доноров Через 1 ч после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем накожной аппликации на ухо оксазолона Через последующие 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов

Были поставлены следующие иммунологические контроли (Схема ЗБ, рис

7Б)

К+2 положительный контроль на оксазолон с переносом спленоцитов Сенсибилизированным ДНФБ мышам-донорам вводили внутривенно 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола Через 24 часа выделяли селезенки, 108 спленоцитов мышей-доноров переносили внутривенно сенсибилизированным оксазолоном мышам-реципиентам Через 1 час после переноса мышам-реципиентам повторно наносили на ухо 0,5 мкл 0,4% оксазолона

К г отрицательный контроль на оксазолон в переносе Мыши-доноры были сенсибилизированы ДНФБ и вместо пМЦ540 получили внутривенно 0,5%

20

ФБР с 0,5% этанола Через 24 ч были выделены селезенки этих животных и 108 спленоцитов были перенесены внутривенно интактным мышам-реципиентам Через 1 ч после переноса спленоцитов мышам-реципиентам была проведена аппликация на ухо 5 мкл 0,4% оксазолона

К'з: отрицательный контроль на оксазолон без переноса спленоцитов Ин-тактных мышей тестировали, нанося на поверхность ушной раковины 5 мкл 0,4% раствора оксазолона

Результаты данных экспериментов представлены на рисунке 7Б Видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, сенсибилизированных ДНФБ, к интактным мышам-реципиентам с последующей аппликацией реципиентам оксазолона не приводил к развитию реакции КЧ (К'з) Видно также, что уровень отрицательного контроля в переносе (К"2) не отличался от уровня отрицательного контроля на оксазолон без переноса (К"3) При этом у мышей-реципиентов, сенсибилизированных оксазолоном, повторная аппликация оксазолона приводила к развитию реакции КЧ (К%) Эти данные свидетельствуют о том, что гаптены ДНФБ и оксазолон не являются перекрестными, т е эффекторы КЧ, специфические к ДНФБ не отвечали на аппликацию чужеродного гаптена оксазолона

На рис 7Б видно также, что перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540, не повлиял на уровень реакции КЧ у сенсибилизированных оксазолоном мышей-реципиентов Напротив, перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию пМЦ540 - привел к достоверному угнетению на 75% ± 7%

** +

реакции КЧ на оксазолон мышей-реципиентов ( р<0,001 по сравнению с К г)

Таким образом, пМЦ540 инициировал в селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров появление клеток, которые подавляли КЧ на чужеродный гаптен - оксазолон Эти данные позволяют заключить, что супрессорное действие фотопродуктов МЦ540 является неспецифическим и пМЦ540 т vivo активирует клетки с неспецифическим супрессорным потенциалом

ВЫВОДЫ:

1 Разработана методика исправления измеренных спектров резонансного светорассеяния (PCP) агрегатов красителей: на 1) спектральную чувствительность прибора, 2) эффекты внутреннего светофильтра (экранировка возбуждающего света и реабсорбция рассеянного света в исследуемом образце) Введено понятие резонансного фактора (РФ), который зависит только от размеров и структуры агрегатов и не зависит неспецифического рэлеевского светорассеяния Предложено строить спектры PCP как зависимость РФ от длины волны

2 Обнаружено, что добавление солей к водным растворам мероцианина 540 (МЦ540) приводит к возникновению интенсивного резонансного светорассеяния, что доказывает возникновение индуцированных солями крупных надмолекулярных агрегатов красителя Для солей одновалентных катионов показано существование критической концентрации соли (ККС), только выше которой формируются крупные агрегаты МЦ540 с максимумами поглощения и PCP около 517 нм Выявлено, что величина ККС обратно пропорциональна концентрации МЦ540 Ниже ККС обнаружено формирование агрегатов МЦ540 с максимумом PCP около 420-460нм, не выявляемых спектрофотометрически

3 Выявлено, что в водно-солевых растворах, в которых присутствуют несколько агрегатных форм МЦ540, фотолабильность убывает к ряду, крупные надмолекулярные агрегаты с максимумами спектров PCP при 517 и 420 нм » димеры (максимум поглощения около 500 нм) > мономеры (максимум поглощения около 535 нм)

4 Обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей к гаптенам 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазо-лону При этом пМЦ540 вызывал зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к гаптенам

5 Показано, что супрессия КЧ, вызванная предоблученный МЦ540, адоп-тивно переносится другим животным В основе иммунного механизма супрес-

сорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ

Практические рекомендации. Обнаруженные иммуносупрессирующие эффекты пМЦ540 могут служить основой для разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Кожинова Е А, Козырь JIА , Бездетная J1Н., Гимя Ф Супрессорное действие фотопродуктов мероцианина 540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей Пироговская студенческая научная конференция 2004 Москва Вестник Российского Государственного Медицинского университета, специальный выпуск, № 3 (34), стр 165

2 Козырь JI А, Кягова А.А., Кожинова Е А., Бездетная JI.H, Гимя Ф, Потапенко А Я Супрессия Т-клеточного иммунного ответа m vivo под действием продуктов фотолиза мероцианина 540 III Съезд биофизиков России 2429 июня 2004 г Воронеж Тезисы докладов, том II, стр 533.

3 Potapenko A Ya, Kozir L А , Mansurova G V, Kozhinova E A., Ponomarev G V, Kyagova A A Photooxidation products of photosensitizers are responsible for systemic îmmunomodulation 1st International Conference Skm & Environment Moscow-St Petersburg, Russia 1-6 June, 2005 Program and book of Abstracts Page 38

4 Kozhmova E A, Kozir L A, Tikhormrov A M, Kyagova A A , Potapenko A Ya Aggregation of Merocyanme 540 in solutions and the rate of its photolysis 1st International Conference Skin & Environment Moscow-St Petersburg, Russia 1-6 June, 2005 Program and book of Abstracts Page 67

5 Kyagova A A, Kozir L A, Kozhmova E A., Potapenko A Ya Systemic suppression of contact hypersensitivity in mice induced by products of merocyamne 540

photoproducts 11th Congress of the European Society for Photobiology ESP 2005 Aix-les-Bains, France 3-8 September 2005 Programme and Book of Abstracts PII28 Page 140

6 Кожинова E A, Козырь JIA, Тихомиров A M., Кягова A A, Потапенко А Я Влияние агрегации мероцианина 540 в растворах на скорость его фотолиза Вестник РГМУ, 2005, № 7,47-52

7 Кожинова Е А, Козырь Л А , Тихомиров А М, Кягова А. А, Потапенко АЛ Скорость фотолиза мероцианина 540 зависит от его агрегатного состояния IV Съезд фото-биологов России Материалы съезда 26-30 сентября 2005 г Саратов, 2005 Стр 72

8 Е А Кожинова, А М. Тихомиров, Л А Козырь, А А Кягова, АЛ Потапенко, Исследование агрегации и фотовыцветания мероцианина 540 методом регистрации резонансного светорассеяния, Журнал Физической Химии, 2007, том 81, №8, стр 1-7

Подписано в печать 23 07 2007 г Исполнено 24 07 2007 Печать трафаретная

Заказ № 602 Тираж 60 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495)975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кожинова, Елена Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-химические свойства мероцианина-540 (МЦ540)

1.1.1. Изменение спектральных свойств МЦ540 в зависимости от полярности растворителей

1.1.2. Изменение спектральных свойств МЦ540 в зависимости от рН растворителя

1.1.3. Влияние катионов солей на спектральные свойства МЦ

1.1.4. Изменение спектральных свойств мероцианина-540 в зависимости от микроокружения

1.2. Фотохимические реакции фотосенсибилизаторов

1.3. Фотохимические свойства мероциапина-

1.3.1. Противовирусная активность предоблученного МЦ

1.3.2. Противоопухолевая активность предоблученного МЦ

1.4. Резонансное светорассеяние (РСР)

1.5. Иммунно-регуляторные эффекты ФДТ

1.6. Механизм развития и регуляции реа1щии контактной чувствительности

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Спектры резонансного светорассеяния

3.2. Изучение спектральных свойств МЦ

3.2.1. Изменения формы спектров поглощения МЦ540 в различных растворителя

3.2.2. Резонансное светорассеяние водно-солевых растворов, агрегация МЦ540 и сопоставление спектров поглощения и РСР

3.3. Фотолиз МЦ540 в водных и водно-солевых растворах

3.3.1. Фотолиз МЦ540 в растворах КС

3.3.2. Фотолиз МЦ540 в ФБР

3.3.3. Фотолиз МЦ540 в воде

3.4. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на реакцию контактной чувствительности у мышей

3.4.1. Супрессорное действие предоблученного МЦ540 (пМЦ540) на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей

3.4.2. пМЦ540 ослабляет функции эффекторов КЧ

3.4.3. пМЦ540 активирует клетки с неспецифическим супрессорным действием на КЧ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование фотолиза мероцианина 540 методом резонансного светорассеяния, иммуносупрессорное действие фотопродуктов"

Известно, что ФДТ с красителями порфиринового и хлоринового ряда инициируют супрессию Т-клсточного звена иммунитета in vivo. Известно таклсе, что супрессорное действие ФДТ с порфиринами, хлоринами и псораленами реализуются через стадию образования фотопродуктов [Kyagova, А.А., et. al., 2005; Kyagova, A.A., et. al., 2002; Potapenko A.Ya., 1998]. Однако в литературе нет данных о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему. В этой связи исследование влияния фотопродуктов МЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo является актуальным.Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследовать фотолиз и фотовыцветание мероцианина 540 в различных агрегатных состояниях и оценить иммуносупрессорное действие фотопродуктов данного красителя.Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи; 1. Разработать методику получения неискаженных спектров резонансного светорассеяния красрггелей.2. Изучить методами резонансного светорассеяния, спектрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540.3. Изучить действие предоблученного МЦ540 (пМЦ540) на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Кожинова, Елена Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Разработана методика исправления измеренных спектров резонансного светорассеяния (PCP) агрегатов красителей: на 1) спектральную чувствительность прибора, 2) эффекты внутреннего светофильтра (экранировка возбуждающего света и реабсорбция рассеянного света в исследуемом образце). Введено понятие резонансного фактора (РФ), который зависит только от размеров и структуры агрегатов и не зависит неспецифического рэлеевского светорассеяния. Предложено строить спектры PCP как зависимость РФ от длины волны.

2. Обнаружено, что добавление солей к водным растворам мероцианина 540 (МЦ540) приводит к возникновению интенсивного резонансного светорассеяния, что доказывает возникновение индуцированных солями крупных надмолекулярных агрегатов красителя. Для солей одновалентных катионов показано существование критической концентрации соли (ККС), только выше которой формируются крупные агрегаты МЦ540 с максимумами поглощения и PCP около 517 нм. Выявлено, что величина ККС обратно пропорциональна концентрации МЦ540. Ниже ККС обнаружено формирование агрегатов МЦ540 с максимумом PCP около 420-460нм, не выявляемых спектрофотометрически.

3. Выявлено, что в водно-солевых растворах, в которых присутствуют несколько агрегатных форм МЦ540, фотолабильность убывает к ряду: крупные надмолекулярные агрегаты с максимумами спектров PCP при 517 и 420 нм » димеры (максимум поглощения около 500 нм) > мономеры (максимум поглощения около 535 нм).

4. Обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей к гаптенам 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону. При этом пМЦ540 вызывал зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к гаптенам.

5. Показано, что супрессия КЧ, вызванная предоблученный МЦ540, адоптивно переносится другим животным. В основе иммунного механизма супрессорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кожинова, Елена Анатольевна, Москва

1. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. шк., 1989.

2. Красновский А.А., мл. (2001) Синглетный кислород и механизм фотодинамического действия порфиринов в кн. Успехи химии порфиринов. Т. 3, гл. 11, с. 191-216, СПб.

3. Adenier A. and Aaron J.J. Spectrochim. Acta Part A, 2002. V. 58. № 3. P. 543-551.

4. Aggarwal L.P. and Borissevitch I.E. Spectrochim. Acta, Part A, 2006. V. 63. № l.P. 227-233.

5. Albert M.L., Sauter В., Bhardwaj N. (1998). Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature 392, No.6671, p. 86-89.

6. Askenase P.W. (2001) Yes T cells, but three different T cells (alphabeta, gammadelta and NK T cells), and also B-l cells mediate contact sensitivity. Clin. Exp. Immunol. V.125, No.3, p. 345-350.

7. Basu S., De S., Bhowmik B.B. (2007) Photophysical studies of Merocyanine 540 dye in aqueous micellar dispersions of different surfactants and in different solvents.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc; 66(4-5): 1255-60.

8. Banchereau J., Briere F., Caux C., Davoust J., Lebecque S., Liu Y.J., Pulendran B., Palucka K. (2000) Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. V.18, p. 767-811.

9. Bernik DT ymczyszyn ED araio M .E., N egri R .M. (1999) F luorescent dimmers of merocyanine-540 (MC540) in the gel phase of phosphatidylcholine liposomes. J Photochem Photobiol V.70, No. 1, p.40-48.

10. Bilski P., McDevitt T., Chignell C.F. (1999). Merocyanine 540 solubilized as a n i on p air w ith c ationic su rfactant i n nonpolar so lvents: s pectral a nd photochemical properties. JPhotochem Photobiol. V.69, No6, p.671-676.

11. Black C.A. (1999) Delayed type hypersensitivity: current theories with an historic perspective. Dermatol. Online J. 5, No.l, p. 7.

12. Brown S.B., Shillcock M, Jones P. (1976) Equilibrium and kinetic studies of the aggregation of porphyrins in aqueous solution.i?/0c/zew «/.; 153(2):279-85.

13. Borissevitch I.E., Tominaga T.T., Imasato H. and Tabak M. Analit. Chim. Acta, 1997. V. 343. № 3. P. 281-286.

14. Bouloc A., Cavani A., Katz S.I. (1998) Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. J. Invest. Dermato 1. V.lll, No.l, p. 44-49.

15. Cella M., Sallusto F., Lanzavecchia A. (1997) Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr. Opin. Immunol. V.9, No.l, p.10-16.

16. Chanh T., Allan J., Pervaiz S., Matthews J., Gulliya K. (1992). Preacktivated MC540 inactivates HIV-1 and SIV-1: potential therapeutic and blood banking applications. J. ofA.I.D.S. No.5 p.188-195.

17. Chen J., Mak N.K., Leung W., Cheung N., Peng Q. (2006) Comparison of merocyanine 540-mediated photodynamic action on leukemia cells between pulsed and continuous wave light sources. J Environ Pathol Toxicol Oncol; 25(l-2):217-22.

18. Chen X., Cai C., Zeng J., Liao Y., Luo H. (2005) Study on bromocresol green-cetyltrimethylammonium-deoxyribonucleic acids system by resonance light scattering spectrum methods. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc-, 61(8):1783-8.

19. Chen J.Y., Cheung N.H., Fung M.C., Wen J.M., Leung W.N., Mak N.K. (2000) Subcellular localization of merocyanine 540 (MC540) and induction of apoptosis in murine myeloid leukemia cells.Photochem Photobiol\ 72(1): 114-20.

20. Collings P.J., Gibbs E.J., Starr T.E., Vafek 0.5 Yee C., Pomerance L.A., Pasternack R.F. II J. Phys. Chem. B. 1999. V. 103. P. 8474-8481

21. Cunderlikova B., Sikurova L. (2001) Solvent effects on photophyzical properties of merocyanine 540 Chemical Physics V.263, p. 415-422.

22. Dall'Acqua F., Martelli P. (1991) Photosensitizing action of furocoumarins on membrane components and consequent intracellular events. J. Photochem. Photobiol. B. V.8, No.3, p. 235-254.

23. Davila J., Guliya K., Harriman A. (1989) Inactivation of tumors and viruses via efficient photoisomerisation. J. Chem.Soc Chem Commun. No. 17, p. 1215-6.

24. Davila J., Harriman A., Gulliya K.S. (1991). Photochemistry of merocyanine 540: the mechanism of chemotherapeutic activity with cyanine dyes. J. Photochem Photobiol V.53, Nol, p.1-11.

25. Dearman R.J., Kimber I. (2000). Role of CD4(+) T helper 2-type cells in cutaneous i nflammatory responses induced by fluorescein i sothiocyanate. Immunology V. 101, No. 4, p. 442-451.

26. Demidova T.N., Hamblin M.R. (2004). Macrophage-targeted photodynamic therapy. Int J. Immunopathol Pharmacol. V. 17, No. 2, p. 117-26. Review.

27. Dougherty T.J. (2002). An update on photodynamic therapy applications. J. Clin Laser Med Surg. V. 20, No. 1, p. 3-7.

28. Edelson R.L. (1991). Photopheresis: present and future aspects. J. Photochem. Photobiol. B.V. 10, No. 1-2, p. 165-174.

29. Feng S.L., Liu X.P., Fan J. (2004). Determination of deoxyribonucleic acids based on the enhanced effect of resonance light scattering of malachite green sensitized by cetyltrimethylammonium bromide Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. May;24(5):606-9.

30. Feix J.B., Kalyanaraman B. (1991 b). An electron spin resonance study of merocyanine 540-mediated type I reactions in liposomes. J. Photochem Photobiol. V.53, No.l, p.39-45.

31. Foote C.S. (1991). Definition of type I and type II photosensitized oxidation. J. Photochem Photobiol. V.54, No. 5, p.659.

32. Franck B., Schneider U. (1992). Photooxidation products of merocyanine 540 formed under preactivation conditions for tumor therapy. J. Photochem Photobiol. V. 56, No. 2, p. 271-276.

33. Gandini S.C., Yushmanov V.E., Tabak M. (2001) Interaction of Fe(III)-and Zn(II)-tetra(4-sulfonatophenyl) porphyrins with ionic and nonionic surfactants: aggregation and binding. JInorg Biochem. Jul;85(4):263-77.

34. Girolomoni G., Sebastiani S., Albanesi C., Cavani A. (2001) T-cell subpopulations in the development of atopic and contact allergy. Curr. Opin. Immunol. V.13, No.6, p. 733-737.

35. Gorbachev A.V., Fairchild R.L. (2001a) Induction and regulation of T-cell priming for contact hypersensitivity. Crit. Rev. Immunol. V.21, No.5, p. 451-472.

36. Gorbachev A.V., Fairchild R.L. (2001b) Regulatory role of CD4+ T cells during the development of contact hypersensitivity responses. Immunol. Res. V.24, No.l, p.69-77.

37. Grabbe S., Schwarz T. (1998) Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity. Immunol. Today V. 19, No.l; p. 37-44.

38. Grossweiner L. I. Singlet Oxygen: Generation and Properties. Статья в Интернете: www.photobiology.com/educational/len2/singox.html

39. Guan H., Zu G., Slater M., Elmets С., Xu H. (2002) gammadeltaT Cells Regulate the Development of Hapten-Specifïc CD8+ Effector T Cells in Contact Hypersensitivity Responses. J. Invest Dermatol. V.119, No.l, p. 137-142.

40. Guarcello V., Stern A., Rizza V. (1987) Fluorescent properties of merocyanine 540 in solutions of sialogangliosides.Z?/oc/zwz Biophys Acta; 917(2):318-23.

41. Gulliya K.S., Chanh T., Harriman A., Aronoff B.L., Matthews J.L. (1992). Preactivation: a new concept for generation of photoproducts for potential therapeutic applications. Semin Surg Oncol. V.8, No.4, p.250-253.

42. Gulliya K.S., Chanh T., Newman J., Pervaiz S., Matthews J.L. (1990 b). Preactivation-a novel antitumour and antiviral approach. Eur J. Cancer. V.26, No.5, p.551-553.

43. Gulliya K.S., Franck В., Lester J., Scheider U. (1994 a) Photooxidation products and derivatives thereof of merocyanine-540, their preparation and uses. Patent of US, No.5312919,

44. Gulliya K.S., Franck В., Schneider U., Sharma R., Arnold L., Matthews J.L. (1994 b). Topoisomerase II-dependent novel antitumor compounds merocil and merodantoin induce apoptosis in Daudi cells. Anticancer Drugs. V.5, No.5, p.557-566.

45. Gulliya K.S., Pervaiz S. (1989). Elimination of clonogenic tumor cells from HL-60, Daudi, and U-937 cell lines by laser photoradiation therapy: implications for autologous bone marrow purging. Blood. V.73, No.4, p.1059-65.

46. Gulliya K.S., Pervaiz S., Dowben R.M., Matthews J.L. (1990 a). Tumor cell specific dark cytotoxicity of light-exposed merocyanine 540: implications for systemic therapy without light. J. P hotochem P hotobiol. V.52, No.4, p.831-838.

47. Gulliya K.S., Sharma R.K., Matthews J.L., Benniston A.C., Harriman A., Nemunaitis J.J. (1994 c). In vitro and in vivo growth suppression of MCF-7 human breast cancer by novel photoproducts and tamoxifen. Cancer. Y.74, No. 6, p. 1725-1732.

48. Heald P.W., Kim H.Y., Perez M., Edelson R.L., Berger C.L. (1995) T-cell responses in photoimmune therapy. J. Clin. Apheresis V.10, No.3; p. 144149.

49. Huang C.Z., Li Y.F., Huang X.H., Li M. (2000) Interactions of Janus Green B with double stranded DNA and the determination of DNA based on the measurement of enhanced resonance light scattering. Analyst., 125(7): 1267-72.

50. Huang C.Z., Liu Y., Wang Y.H. and Guo H.P. (2003) Anal. Biochem.,. V. 321. №2. P. 236-243.

51. Jiang X.Y., Chen X.Q., Dong Z., Xu M. (2007) The application of resonance light scattering technique for the determination of tinidazole in drugs. JAntom Methods Manag Chem.; 2007:86857.

52. Jie N., Jia G., Hou S., Xiong Y., Dong Y. (2003) Determination of deoxyribonucleic acids by a resonance light scattering technique and its application. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. Dec;59(14):3295-301.

53. Jie N., Hou S., Du F., Zhang C., Qin G. (2004) The determination of deoxyribonucleic acids with triadimenol based on the enhancement of resonance light scattering. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.', 23(4):725-34.

54. Joshi P.C., Pathak M.A. (1984) The role of active oxygen ('02 and 02) induced by crude coal tar and its ingredients used in photochemotherapy of skin diseases. J. Invest Dermatol. Jan; V.82, N.l, p. 67-73.

55. Ikegami K. (2004) J Chem Phys; 121(5):2337-47. Spectroscopic study of J aggregates of amphiphilic merocyanine dyes formed in their pure Langmuir films.

56. Itoh T, Messner HA, Jamal N, Tweeddale M, Sieber F. (1993) Merocyanine 540-sensitized photoinactivation of high-grade non-Hodgkin's lymphoma cells: potential application in autologous BMT. Bone Marrow Transplant; 12(3): 191-6.

57. Kalyanaraman B., Feix J.B., Sieber F., Thomas J.P., Girotti A.W. (1987). Photodynamic action of merocyanine 540 on artificial and natural cell membranes: involvement of singlet molecular oxygen. Proc Natl Acad Sci USA., V. 84, No. 9, p. 2999-3003.

58. Kapsenberg M.L., Hilkens C.M., Wierenga E.A., Kalinski P. (1998). The role of antigen-presenting cells in the regulation of allergen-specific T cell responses. Curr. Opin. Immunol. V.10, No.6, p. 607-613.

59. Kaschny P., Goni F.M. (1992) The components of merocyanine-540 absorption spectra in aqueous, micellar and bilayer environments .Eur J Biochem; 207(3): 1085-91.

60. Kehren J., Desvignes C., Krasteva M., Ducluzeau M.T., Assossou O., Horand F., Hahne M., Kagi D., Kaiserlian D., J.F. Nicolas (1999) Cytotoxicity is mandatory for CD8(+) T cell-mediated contact hypersensitivity. J. Exp. Med. V.189, No.5, p. 779-786.

61. Kobayashi K., Kaneda K., Kasama T. (2001). Immunopathogenesis of delayed-type hypersensitivity. Microsc. Res. Tech. V.53, No.4, p. 241-255.

62. Krasnovsky A.A. Jr., Foote Ch.S. (1993) Time-resolved measurements of singlet oxygen dimol-sensitized luminescence. J. Am. Chem. Soc. V.115, No.14, p. 6013-6016.

63. Krieg M. (1992). Singlet oxygen production and fluorescence yields of merocyanine 540: a comparative study in solution and model membrane systems. Biochim Biophys Acta. V. 1105, No.2, p.333-5.

64. Krutmann J. (2000) Phototherapy for atopic dermatitis Clin. Exp. Dermatol V. 25, No.7, p. 552-558.

65. Kuroda S. (2004) J-aggregation and its characterization in Langmuir-Blodgett films of merocyanine dyes. Adv Colloid Interface Sci\ 111(3):181-209.

66. Larina N., Kozlov I., Andina E., Gorlina N., Potapenko A. Adam W., Saha-Moller C.R.,Kyagova A.A. (2001) Products of Alloimperatorin Photooxidation Suppress the Cell-Mediated Immunity in Mice. Scand. J. Immunol. 54, supp.l, Fri. 510.

67. Li Z.P., Li Y.K., Wang Y.C. (2005) Study of the interaction of hexa-amine cobalt (III) ion with DNA by a resonance light scattering technique and its analytical application. Luminescence; 20(4-5):282-6.

68. Li L., Elliott J.F., Mosmann T.R. (1994) IL-10 inhibits cytokine production, vascular leakage, and swelling during T helper 1 cell-induced delayed-type hypersensitivity. J. Immunol. V.153, No.9, p. 3967-3978.

69. Li L., Song G., Fang G. (2006) Determination of bovine serum albumin by a resonance light-scattering technique with the mixed-complex La(Phth)(phen)(3+). JPharm Biomed Anal, 40(5): 1198-201.

70. Liu X, Yuan H, Pang D, Cai R. (2004) Resonance light scattering spectroscopy study of interaction between gold colloid and thiamazole and its analytical application. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 60(l-2):385-9.

71. Lum L.G., Yamagami M., Giddings B.R., Joshi I., Schober S.L., Sensenbrenner L.L., Sieber F. (1991). The immunoregulatory effects of merocyanine 540 on in vitro human T- and B-lymphocyte functions. Blood. V.77, No. 12, p. 2701-6.

72. Lytle C.D., Budacz A.P., Keville E., Miller S.A., Prodouz K.N. (1991). Differential inactivation of surrogate viruses with merocyanine 540.

73. J. Photochem Photobiol. V. 54, No. 3, p. 489-493.

74. Mateasik A., Sikurova L. and Chorvat D. Jr. Bioelectrochem., 2002. V. 55. № 1-2. P. 173-175.

75. Matthews J.L., Sogandares-Bernal F., Judy M., Gulliya K., Newman J., Chanh T., Marengo-Rowe A. (1992). Inactivation of viruses with photoactive compounds. Blood Cells., V. 18, No. 1, p. 75-88; discussion 88-89.

76. McPhie P. II Analyt. Biochem. 2006. V. 348. P. 157-159

77. Micali N, Mallamace F, Castriciano M, Romeo A, Scolaro LM. (2001) Separation of scattering and absorption contributions in UV/visible spectra of resonant systems. Anal Chem., 73(20):4958-63.

78. Moreno G. (1986) Photosensitization of mammalian cells by psoralens and porphyrins. Biochimie. Jun V. 68, No.6, p. 869-73.

79. Mosmann T.R., Sad S. (1996) The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more. Immunol. Today. V.17, No. 3, p. 138-146.

80. Musser D.A., Oseroff A.R. (2001). Characteristics of the immunosuppression induced by cutaneous photodynamic therapy: persistence, antigen specificity and cell type involved. J. Photochem Photobiol. V. 73, No. 5, p. 518-524.

81. Nasorri F., Sebastiani S., Mariani V., De Pita O., Puddu P., Girolomoni G., Cavani A. (2002) Activation of nickel-specific CD4+ T lymphocytes in the absence of professional antigen-presenting cells. J. Invest. Dermatol. V. 118, No. l,p. 172-179.

82. Nowak-Sliwinska P, Karocki A, Elas M, Pawlak A, Stochel G, Urbanska K. (2006) Verteporfm, photofrin II, and merocyanine 540 as PDT photo-sensitizers against melanoma cells .Biochem Biophys Res Commun; 20; 349(2):549-55.

83. O'Brien J.M., Gaffney D.K., Wang T.P., Sieber F. (1992) Merocyanine 540-sensitized photoinactivation of enveloped viruses in blood products: site and mechanism of phototoxicityii/ooi/; 80(l):277-85.

84. O'Brien J.M., Singh R.J., Feix J.B., Kalyanaraman B., Sieber F. (1991) Action spectra of the antileukemic and antiviral activities of merocyanine 540. J. Photochem Photobiol V. 54, No. 5, p. 851-4.

85. O'Brien JM, Sieber F. (1989) Mutagenicity of merocyanine 540-mediated photosensitization. Exp Hematol\ 17(2):166-70.

86. Ochsner M. (1997). Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours. J. Photochem Photobiol B. V. 39, No. 1, p. 1-18.

87. Park B.K., Pirmohamed M., Kitteringham N.R. (1998) Role of drug disposition in drug hypersensitivity: a chemical, molecular, and clinical perspective. Chem. Res. Toxicol. V. 11, No. 9, p. 969-988.

88. Parkash J., Robblee J.H., Agnew J., Gibbs E., Collings P., Pasternack R.F. and de Paula J.C. Biophys. J., 1998. V. 74. № 4. P. 2089-2099.

89. Pasternack R.F. and Collings P.J. Science, 1995. V. 269. № 5226. P. 935939.

90. Pasternack R.F. Chirality, 2003. V. 15. № 4. P. 329-332.

91. Pathak M.A., West J.D. (1982) Porphyrias: office procedures and laboratory tests for diagnosis of porphyrin abnormalities. Acta Derm Venereol Suppl (Stockh).N. 100, p. 91-105. Review.

92. Pervaiz S. (2001). Reactive oxygen-dependent production of novel photochemotherapeutic agents. FASEB J. V.15, No.3, p. 612-617.

93. Pervaiz S., Battaglino M., Matthews J.L., Gulliya K.S. (1993). Biodistribution and toxicity of photoproducts of merocyanine 540. Cancer Chemother Pharmacol., V. 31, No. 6, p .467-474.

94. Pervaiz S., Harriman A., Gulliya K.S. (1992). Protein damage by photoproducts of merocyanine 540. Free Radic Biol Med. V. 12, No. 5, p. 389-96.

95. Pervaiz S., Hirpara J.L., Clement M.V. (1998). Caspase proteases mediate apoptosis induced by anticancer agent preactivated MC540 in human tumor cell lines. Cancer Lett V. 128, No. 1, p. 11-22.

96. Pervaiz S., Seyed M.A., Hirpara J.L., Clement M.V., Loh K.W. (1999). Purified photoproducts of merocyanine 540 trigger cytochrome C release and caspase 8-dependent apoptosis in human leukemia and melanoma cells. Blood. V. 93, No. 12, p. 4096-4108.

97. Pintar T.J., Lin F., Girotti A.W. (1994). Bleaching of membrane-bound merocyanine 540 in conjunction with free radical-mediated lipid peroxidation. Free Radio Biol Med. V. 16, No. 5, p. 603-12.

98. Potapenko A.Ya. (1991) Mechanisms of photodynamic effect of furocoumarins. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., V.9, No. 1, p.1-33.

99. Prodouz K.N., Lytle C.D., Keville E.A., Budacz A.P., Vargo S., Fratantoni J.C. (1991). Inhibition by albumin of merocyanine 540-mediated photosensitization of platelets and viruses. Transfusion., V. 31, No. 5, p. 415-422.

100. Qiu K., Sieber F. (1992). Merocyanine 540-sensitized photoinactivation of leukemia cells: effects of dose fractionation. J. Photochem Photobiol V. 56, No. 4, p. 489-493.

101. Reddan J.C., Anderson C.Y., Xu H., Hrabovsky S., Freye K., Fairchild R., Tubesing K.A., Elmets C.A. (1999). Immunosuppressive effects of silicon phthalocyanine photodynamic therapy. J. Photochem Photobiol. V. 70, No.l,p. 72-7.

102. Redmond R.W., Srichai M.B., Bilitz J.M., Schlomer D.D., Krieg M. (1994). Merocyanine dyes: effect of structural modifications on photophysical properties and biological activity. J. Photochem Photobiol. V. 60, No. 4, p. 348-355.

103. Seret A., Hoebeke M., Van de Vorst A. (1990) Triplet yield of merocyanine 540 in water is wavelength dependent. Photochem Photobiol, 52(3):601-4.

104. Severino D., Junqueira H.C., Gugliotti M., Gabrielli D.S., Baptista M.S. (2003) Influence of negatively charged interfaces on the ground and excited state properties of methylene blue. J. Photochem Photobiol. V. 77, No. 5, p. 459-68.

105. Sharma M., Joshi P.G., Joshi N.B. (1997). Mechanism of photosensitization of glioblastoma and neuroblastoma cells by merocyanine 540: a lipid peroxidation study. Indian J. Biochem Biophys. V. 34, No. 4, p. 379-84.

106. Sharma M., Joshi P.G., Joshi N.B. (1997) Alterations in plasma membrane of glioblastoma cells by photodynamic action of merocyanine 5AQBiochim Biophys Acta-, 1323(2):272-80

107. Sharma R., Arnold L., Gulliya K.S. (1995). Correlation between DNA topoisomerase II activity and cytotoxicity in pMC540 and merodantoin sensitive and resistant human breast cancer cells. Anticancer Res. V. 1 5, No. 2, p. 295-304.

108. Sharma R., Gulliya K.S. (1995). Growth inhibitory effects of pMC540 and merodantoin on established MCF-7 human breast tumor xenografts. In Vivo. V. 9, No. 2, p. 103-108.

109. Sharma R., Gulliya K.S. (1996). In situ stimulation of topoisomerase II-induced cleavage sites in the c-myc protooncogene by antitumor agentpMC540 is associated with gene expression. Anticancer Drugs. V. 7, No. 3, p. 293-298.

110. Sieber F., Spivak J.L., Sutcliffe A.M. (1984) Selective killing of leukemic cells by merocyanine 540-mediated photosensitization./Voc Natl Acad Sci USA. Dec;81(23):7584-7.

111. Sieber F. (1987). Merocyanine 540. J. Photochem Photobiol. V. 46, No. 6, p. 1035-42.

112. Sieber F., Stuart R.K., Rowley S.D., Sharkis S J., Sensenbrenner L.L. (1987). Dye-mediated photolysis of normal and neoplastic hematopoietic cells. LeukRes. V. 11, No. 1, p. 43-49.

113. Sieber F. (1993) Phototherapy, photochemotherapy, and bone marrow transplantation JHematother. Spring;2(l):43-62.

114. Sikurova L., Cunderlikova B. (1997). pH dependence of merocyanine 540 absorption and fluorescence spectra. Specrtrochimica Acta Part No. 53, p. 293-297.

115. Sikurova L., Cunderlikova B., Turisova J., Waczulikova I. (1995). Interaction of MC540 with cations of physiological solutions. Analitica ChimicaActe No. 303, p. 79-83.

116. Sikurova L., Cunderlikova B., Turisova J., Waczulikova I. II Anal. Chim.

117. Acta. 1995. V. 303. P. 79-83.

118. Sikurova L., Haban I., Chorvat D. (1988). Dimers of MC540 in aqueous solution. Studia Biophysica. No. 125, p. 197-201.

119. Simkin G.O., King D.E., Levy J.G., Chan A.H., Hunt D.W. (1997). Inhibition of contact hypersensitivity with different analogs of benzoporphyrin derivative. Immunopharmacology V. 37, No. 2-3, p.221-230.

120. Simkin G.O., Tao J.S., Levy J.G., Hunt D.W. (2000). IL-10 contributes to the inhibition of contact hypersensitivity in mice treated with photodynamic therapy. J. Immunol. V. 164, No. 5, p. 2457-62.

121. Singh R.J., Feix J.B., Kalyanaraman B. (1992). Photobleaching of merocyanine 540: involvement of singlet molecular oxygen. J. Photochem Photobiol. V. 55, No. 4, p. 483-489.

122. Singh R.J., Feix J.B., Pintar T.J., Girotti A.W., Kalyanaraman B. (1991). Photodynamic action of merocyanine 540 in artificial bilayers and natural membranes: action spectra and quantum yields. J. Photochem Photobiol. V. 53, No. 4, p. 493-500.

123. Spikes J. (1982). Phofodynamic reactions in photomedicine. Plenum Press, New York. p. 113-144.

124. Tamaki K., Nakamura K. (2001). The role of lymphocytes in healthy and eczematous skin. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. V. 1, No.5, p. 455460.

125. Traidl C., Jugert F., Krieg T., Merk H., Hunzelmann N. (1999). Inhibition of allergic contact dermatitis to DNCB but not to oxazolone in interleukin-4-deficient mice. J. Invest. Dermatol. V. 112, No. 4, p. 476-482.

126. Tran C.C., Allan J.S., Pervaiz S., Matthews J.L., Trevino S.R., Gulliya K. (1992). Preactivated merocyanine 540 inactivates HIV-1 and SIV: potential therapeutic and blood banking applications. J. Acquir Immune Dejtc Syndr. V. 5, No 2, p. 188-195.

127. Tsujino I., Miyagi K., Sampson R.W., Sieber F. (2006) Potentiation of the antitumor effect of Merocyanine 540-mediated photodynamic therapy by amifostine and amphotericin B. Photochem Photobiol; 82(2) :458-65.

128. Tsujino I., Anderson G.S., Sieber F. (2001) Photochem Photobiol.

129. Feb;73(2):191-8. Postirradiation hyperthermia selectively potentiates the merocyanine 540-sensitized photoinactivation of small cell lung cancer cells.

130. Wang B., Feliciani C., Freed I., Cai Q., Sauder D.N. (2001) Insights into molecular mechanisms of contact hypersensitivity gained from gene knockout studies. J. Leukoc. Biol. V. 70, No.2, p. 185-191.

131. Watanabe H., Unger M., Tuvel B., Wang B., Sauder D.N. (2002). Contact hypersensitivity: the mechanism of immune responses and T cell balance. J. Interferon. Cytokine Res. V. 22, No. 4, p. 407-412.

132. Weigmann B., Schwing J., Huber H., Ross R., Mossmann H., Knop J., Reske-Kunz AB. (1997). Diminished contact hypersensitivity response in IL-4 deficient mice at a late phase of the elicitation reaction. Scand. J. Immunol. V. 45, No. 3, p. 308-314.

133. Wei Y.J., Kang Z.M., Qi X.J., Mo L.P., Liu C.G., Zhou Q.Z. (2003) Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi., 23(1):115-8. Resonance light scattering of aurintricarboxylic acid

134. Wei Y. J., Qi X. J., Dun H.J., Wang H.Y., Lan R. J. (2005) Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi\ 25(8): 1289-92. Resonance light scattering of 4-(2-pyridylazo)-resorcinol (PAR)

135. Yamazaki T., Sieber F. (1997) Effect of hypothermia on the merocyanine 540-mediated purging of hematopoietic cells. JHematother, 6(l):31-9.

136. Yang C.X., Li Y.F., Huang C.Z. // Analyt. Sci. 2003. V. 19. P. 211-215

137. Yow C.M., Mak N.K., Szeto S., Chen J.Y., Lee Y.L., Cheung N.H., Huang D.P., Leung A.W. (2000) Photocytotoxic and DNA damaging effect of temoporfin (mTHPC) and merocyanine 5 40 (MC540) on nasopharyngeal carcinoma cell. Toxicol Lett; 115(1):53-61.

138. Zeng M., Li S.W., Deng J.L., Li X.Y., Zhao K.Q. (2006) Resonance light scattering of quercetin. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi., 26(2):317-20.