Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотосенсибилизированные фурокумаринами модификации мембран эритроцитов и иммунокомпетентных клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотосенсибилизированные фурокумаринами модификации мембран эритроцитов и иммунокомпетентных клеток"

ь Ц 3 ¿<

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи удк 612.014.4:314.14

КЯГОВА АЛЛА АНАТОЛЬЕВНА

ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫЕ ФУРОКУМАРИНАМИ МОДИФИКАЦИИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ И ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1992

** i

/

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского Государственного Медицинского Университета.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор А.Я.Потапенко

Научный консультант кандидат биологических наук, ст.н.с. В.Д.Бехало

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Д.И.Роцупкяв доктор химических наук, вд.н.с. Н.Г.Храпова

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «...» .............1992 г.

в « ...» часов на заседании специализированного совета К.084.14.04 при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869, г.Москва, ул. Островитянова, д. I.

• с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке- Российского Государственного Медицинского Университета. .

Автореферат разослан «.................1992 г.

УчениЯ секретарь специализированного совета

К.064.14.04 миип медиане нд наук

доцент Н.В.БурлмскнЯ

0К11АЯ ХАРАКТЕРКОКЗСЛ РАБОЙ

Актуальность проблемы.

Для лечения многих кокных заболеваний. таких как псориаз

)ег1аих et а1- 1981] , КОЖНЭЯ Т-КЛвТОЧНаЯ ЛИМ$ОМа СГс)еист ¡£■7} И других [Роок а1. 19901 В КЛИНИК9 УСП8ШЮ ПрИМвНЯвТСЯ

У'ЕА-терапия - комбинированное воздойствие псорилэнов |>урокумаринов) и ближнего УФ-А-излучения (320 - 400 нм).

Считается, что фурокумарины в коже ведут два вида отохимических реакций. Первый вид фотореакций не нуждается в рисутствии кислорода и в ходе таких реакций фурокумарины гшалентно фотоприсоединяются к пиримидиновым основаниям уклеиновых кислот, и ненасыщенным жирным кислотам гро<пчмего ег I.. 19883. Фотохимические реакции фурокумаринбв второго вида вляются кислород-зависимыми и мишенью фотоокислительных одификаций служат мембраны клеток и некоторые компоненты

ИТОПЛаЗМЫ [РоЬаоепка еЬ а1- 19901 . ВКЛЭД ЭТИХ 2-Х ВИДОВ рвЭКЦИЙ В

ерапевтический эффект до конца не ясен. Есть косвенные указания а то, что реакции 1-го вида ответственны за терапевтические ф$екты гЕьеиоп еъ а1. 1991] тогда как фогоокислитвльные реакции -го вида приводят к побочным, токсическим эффектам, ■ например, ритэме [АуегЬеск 1989] . ОДНЭКО, МОГУТ ЛИ рваКЦИИ 2-ГО ВИДЭ

бладать терапевтическим-действием, не известно.

В последнее время возникло предположение, что . в основе еханизма ПУФА-терапии может лежать иммуномодулирущее действие урокумаринов в комбинации с УФ-А-излучением на организм. Так, звестно, что ПУФА-воздействие способно гагибировать реакции иперчувствительносги замедленного типа (ГЗТ) и контактной иперчувствительносга (КЧ) гдимп et »1. 199ц . Клетки ангерганса, являющиеся антиген-презентирущими клетками в коже, лукат первичной мишенью при проведении ПУФА-терапш гдиаиу «ь 1. 19893 . Есть указание на то, что супрессирукщие Еффекты ПУФА а реакции ГЗТ и КЧ обусловлены прямым фотоповреждением нтиген-презентирупщп клеток ГПоП5оп еЬ а]. 19811 или индукцией упрессорных Т-КЛОТОК ГРегег еЪ а1-, 1989] При ПУФА-В03Д6ЙСТВИИ. днако, влияние продуктов фотоокисления на реакции ГЗТ я КЧ не зучалось.

В литературе, в основном, оценка эффектов ПУФА-воздействия по ¡агоцитирувдио клетки проводилась с использованием одного теста:

увеличения проницаемости их мембран для красителя трипановоп

ОИННГО [Meff-ert et al. 1981] . ТОГДа К8К НЭ ВаЖНВЙШИЭ ЭффвКТОрНЫв

Функции фагоцитов, например, генерацию последними активных фор кислорода, влияние ПУФА-воздэйствия вообще не исследовалось.

Для изучения биологически активных фотопродукго фурокумаринов удобным объектом исследования являются эритроциты Ьшо показано, что фотосенсибилизированный фурокумаринам фОТОГвМОЛИЗ На 100% Нуждается В ПРИСУТСТВИИ КИСЛОрОДа CPotaoenko et al-, 1986] . Т.О. фОТОГЭМОЛИЗ ЯВЛЯ0ТСЯ • МОДвЛЬЮ ДЛЯ ИЗУЧбНИ

именно фотоокислительных реакций фурокумаринов.. Кроме того, был обнаружено, что для индукции повреждения эритроциты не обязательн облучать в присутствии '* фурокумаринов. Можно предварительн фотоокислить сами фурокумарины в отсутствие эритроцитоЕ Добавление к клеткам продуктов такого фотоокисления вызывав гемолитический Эффект [Potaeenko et al., 1988]

Было выявлено, что свойства продуктов . фотоокислеш фурокумаринов В этаноле (Ф0Пэт) [Potaeenko et al-, 19881 И ВОДНЫХ растворах (ФОПц) CVedaldi et al., 1988] СЩвСТВвЫ

отличаются. Если свойства продуктов Ф0Пзт были деталью охарактеризованы, то продукты ФОП^ практически не изучены.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: изучение токсических и иммуномодулируювд СВОЙСТВ продуктов фотолиза фурокумаринов in vivo И in vitro . Всвязи с этим поставлены следующие задачи:

1. Изучить мембрано-токсические эффекты ФОПц на эритроцит! человека и перитонеалышх фагоцитах крыс.

2. Исследовать влияние' ПУФА-воздействия на 'способное1 фагоцитов генерировать активные формы кислорода. Изучить ро. фотоокислительных реакций фурокумаринов- и различных продукт! фотоокисления фурокумаринов в этом процессе.

3. Исследовать иммуномодулирунцее действие продукт« фотоокисления фурокумаринов на шшотнцх на примере реакц гиперчувствительности замедленного типа.

Научная новизна работа.

Показано, что при фотоокислении псоралена в этанольн растворе образуется два типа фотопродуктов: ' разрушаемые вод (tOIlj) в не разрушаемые водой (ФОГ^). Продукты типа £0

раздают как мембраны эритроцитов, так и мембраны фагоцитов: в чае эритроцитов фотопродукты типа ФО^ вызывают гемолиз, в чае фагоцитов - индуцируют каналы проницаемости для трипанового его и ингибируют продукции фагоцитами активных форм кислорода К). Продукты типа ФОП2 также обладают биологическим действием оба типа клеточных мембран. Эти фотопродукты увеличивают ницаемость эритроцитарных мембран, но не изменяют проницаемости коцитарных мембран. При низких концентрациях продукты типа ФОП2 ывают активацию продукции фагоцитами АФК.

Обнаружено, что фотопродукты ФОП2 обладают ишуномодулируищш ствием 1п луо : при малых концентрациях они вызывают активацию кции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к :троцитам барана (ЗБ) у мышей, при больших - ее ингибирование. дполагается, что, иммуномодулирующие эффекты ФОП могут щвствляться за счет изменения активности антиген-презентирупдих ток (АПК).

Продукты-гемолитики типа ФОТ^ образуются в ходе 2-х фотонной кции, где первый фотон поглощается молекулой псоралена, а затем •рой фотон поглощается лабильным фотопродуктом А*.

Практическая значимость.

В терапии дерматозов используется УФА-излучение относительно «ой интенсивности (менее 80 Вт/м2), В настоящей работе [аружено, что ПУФА повреждение АПК (макрофагов и ПМН) резко ■тируется при повышении интенсивности УФА-излучения до 180 'м2. Т.к.скитается, что АПК являются первичной мишенью ■охимических реакций псораленов и модификация АПК можат служить ювой терапевтического эффекта, можно предполагать, что 1личение интенсивности при проведении' ПУФА-тералии дерматозов 1волит резко увеличить эффективность лечения.

Апробация работы.

Основные положения диссертации обсуждались на га и IV прессах Европейского фотобиологического общества (Будапешт 39, Амстердам 1991), школе молодых ученых "Свободные радикалы в ии, биологии и медицине" (С.-Петербург 1991), на заседаниях !вдры биофизики и кафедры медицинской и биологической фазики ¡сийского Государственного Медицинского Университета.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объеи диссертации.

Работа изложена на 169 страницах машинописи и состоит введения (3 стр.), обзора литературы (47 стр.), описания ма риалов и методов исследования (6 стр.), излокения полученных зультатов и их обсувдения (70 стр. ), заключения (4 стр. '), шве и 0иблиогра$ического указателя. Работа содержит 35 рисунков, таблица, список цитированной литературы (244 источника).

СОДЕРЕАШВ РАБОТЫ

НАТЕРШИ И ШЮДЫ НССВДОВШЙ »

В работе использованы фурокумаринн: псорален, ангет (Институт химии растительных веществ АН Узбекистана, Ташке! 8-метоксзшсорален ("Giema США); пейцеданин, оксщэйцеда! императорин» остол (Ботанический институт АН, С.-Петербург), n«

Na2HP04. NaH^>04 , ЭТ8Н0Л, СрОДЭ ХвЕКСа - 0Т6ЧЭСТВ9Ш

производства ХЧ или ЧДА. -Лшинол ("sioma", США). Кварцевая I люберецкого месторождения.

• Источником УФА-излучения • служили ртутно-кварцэвиэ si ДРШ-250 (УФА-область выделяли с помощью светофильтра. "на-иоп з-(К.Цейсс, Германия) и uvs 40-2 (veb -narva" , Германия, 306-428 ыакскыуы излучения 340 ил, 7% У®). Интенсивность свата изш] иетодом фэрриоксалатной актинометрии по Паркеру или калиезроваз фотодиодов "ФД-7К".

Гемолиз регистрировала турбидикотрически на фотоэлектрон! риметра ЮЕК-2Ш1 в красном свете (630 ш).

Генерации активных форм кислорода фагоцитами измеряли изт< лгыинол-зависимой, стимулированной sîo2 хеглалшинэ сденшш cvu îtadj , используя фагоцитирущие клетки горитонеального акссу, крыс. Суспензию клеток готовили по методу., описанному в ра> с Величковский 1984] . Регистрацию ХЛ проводили на хешлшиногл ■txß-iiso- (Швеция) и ШЛ.

Реагош) 1БТ к ЭБ изучали на гщзах линии (сба^-р^ методу rue» ' 19773 . Раствор вОП вводЕЛи гдйаа вяутроЕз: Интенсивность рвакшш ГЗГ оценивала по рззница отека tossy on s контрольной дапкаш.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСЩЕНИЕ

I.ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПСОРАЛЕНА, вОТООКИС-ЛЕННОГО В ЭТАНОЛЬНЫХ РАСТВОРАХ (ФОПдТ).

.Изучение стабильности гешхштически-активных фотопродуктов псоралена прз их хранении в этанольных растворах.

На рис. I представлена зависимость гемолитической ективности (ГЭ) ( ГЭ = 1/Д50, где Д^ - доза облучения ралена, при которой за 2 часа инкубации индуцируется лизис 50% ток) от времени хранения псоралена, фотоокисленного в яольном растворе. Из данных рис.1 следует, что ГЭ уменьшается с личением времени хранения Ф0Пэтпричем кривая убили гемолитика поит как минимум из двух экспонент. Можно предположить, что при

Время хранения ФОП„, мин

Этанольный раствор псоралена (10-2 м) облучали в ОД си кювете. 50 мкл ФОПэт добавляли к 5 мл суспензии эритроцитов (10^ кл /мл). Интенсивность УФ-излучения - 25,7 Вт/ц2.

фотоокислени псоралена в этанольном растворе образуется к минимум два типа гемолитиков: нестабильный, распадающийся г хранении в этанольном растворе (т 24 мин), и стабильный (т нес часов). Полученные данные согласуются с результатами рабе сЛысенко 1991} , в которой исследовалась стабильность Ф0Пэт метот регистрации хемилюмш;есценции, возникающей при смешивании ФОПэт водой.

1.2.Изучение гемолитического эффекта ФОПат при раз!

последовательности смешивания облученного раствора ncopanoi

суспензии эритроцитов и буферного раствора.

Существует гипотеза о механизме ФОП-гемолиза, заключающая« том, что продукты фотоокисления псоралена относительно устойчивь этанольных растворах, но быстро распадаются в водной среде генерацией - свободных радикалов с Бездетная и др. 1987] . результате атаки мембран свободными радикалами индуцирует

ГеМОЛИЗ CPotaoenko ft al- 19881 . НвДаВНО обнаружено [Vedaldi et

ai. 1989] , что гемолитическим . эффектом обладает псорале облученный непосредственно в водном растворе (ФОГу, т.е. условиях, когда нестабильные в воде 'фотопродукты псорале распадались еще до смешивания ФОГ^ с Зслетками.

Наш исследована возыозкность образования не разрушаемых во; фотоцродуктов-гемолитиков при фотоокислении псоралена в этанолы растворе. Для зтго проводились опыты по прямому и альтеркатнвне смешивании суспензии эритроцитов и ётанольного' раствора ФОП (pj 2)..При прямом смешивании (эритроциты + ФОПдТ + буфер) кле-подвергаются атаке свободными радикалами, образуодимися. з гидролизе Ш1ЭТ. При альтернативном смешиванйи (буфер + ФОПдТ и минуты инкубации + эритроциты) клетки не подвергались радикалы атаке, т.к. по данным регистрации хемилюминесценции свободнора, ка/ный распад Ф0Пзт в воде происходил быстрее, чем за I мин: с Лысенко 1991] , т.е. задолго до смешивания с эритроцитами. Из р 2 видно, что независимо от типа смешивания гемолиз индуцировал! Однако, наблюдалось существенное снижение геыолитичеа эффективности при альтернативном смешивании по сравнению с прям) Так при альтернативном смешивании ГЭ по критерию амшшт; ^молиза снижалась в 2,6 раза, наблюдалось тайке снигение скора лизиса. Гемолитический эффект пр*л альтернативном смешивании мо; быть объяснен участием в процессе неразрупаеыых во,

в .•,..-'..'-

топродуктов псоралэна, т.е. ФОП^. Тогда как при прямом вшивании действие ФОГ^ усиливается свободнорадикалъной атакой итроцитов продуктами распада ФОП._ в воде.

оТ

100 -,

а га

о Я и

и 50 -<а

0-]

г 0.2

я я а

а га Я

Г0.1§

Я

«

и

А Ь

и

о §•

м а

ь0.0

—I—

40

50~

1 2 3 4. 5 10 20 30

Длительность облучения псоралена, иин

60

Рис. 2 Дозовые зависимости амплитуды ФОП-гемолиза п скорости ФОП-гемолнза при разной последовательности смешивания ФОП^ суспензии эритроцитов и буферного раствора

1 - 100 ш ФОПэ,, добавляли к 10 мл суспензии эритроцитов (6x10^ кл/мл) (прямое смешивание).

2-100 ыкл ФОП добавляли к 8 мл буферного раствора, затем инкубировали в точение 4 мин. К этой смеси добавляли 2 мл суспензии эритроцитов (3x10^ кл/мл).

Интенсивность действующего света - 25,7 Вт/м2. [.З.Гешхгаз, индударованннй псорэлевои» облученные в водных растворах (ФОПд-гемодаз) В работе вt а1. и<э8<п было показано, ЧТО

гемолитическим эффектом обладает псоралэн, облученный в водных растворах. Наш изучены дозовые зависимости ФОГ^-гемолиза. Показано, что они ■ похожи на дозовые зависимости ФОП,

ЭТп

высокоинтенсивного ПУФА- (интенсивность УФА-излучения > 150 Вт/ьг

и активированного fe2+ или сбн низкоинтенсивного ПУФА-гемолиз (интенсивность < 40 Вт/Ы2) CPotajieiiko et al. 1991] , ЧТО уКЗЗЫВав на участие в перечисленных типах гемолиза одних и тех а фотопродуктов псоралена.

Закон взаимозаменяемости интенсивности и длительност облучения при ФШ^-гемолизе не выполнялся. Гемолитическа эффективность при интенсивности 26 Вт/к2 уменьшалась в 9 раз г сравнению с ГЭ при интенсивности 180 Вт/м2. Невыполнимость закок взаимозаменяемсти при ФСЯ^-гемолизе мохаг быть объяснен двухфотонным механизмом образования молекул гемолитика по схеме 1 Cxeua I:

hV.

По

.В

hi>„

son

где Пс - молекула псоралена, А - лабильный промекуточш фотопродукт псоралена, расходующийся при низкой интенсивное: УФА-излучения в ходе темновой ' реакции (к2), а при высокс интенсивности А* успевает поглотить фотон и превращсется

ФОП.

*

2.СОГОСЕНСИБШБШРОВАННОЕ ПСОРАЛЕНОУ ПОВИВДИШЕ КЛЕТОК ПЕШ-ОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА КРЫС.

2Л.Эффекта ПУФА-Еоздействля на "кислородна рзрив" фагоцитов.

Известно, что макрофаги и нейтрофилы в коке и крови мог; служить первичной мшгеныо при проведении ПУФА-терашш и фотофере; CEde' on 199П . Однако, в литературе нет данных о влиян: ПУФА-воздействия на одну из вакнейшх зф&зкторных функц фагоцитов - генерацию активных форм кислорода (ASK) в твет ] стимулирующий агент. На рис. 3 видно, что амплитуда ХЛ-отве перитонеалышх фагоцитов в ответ на добавление бш2 монотоя уменьшается с увеличением дозы ПУФА-воздействия '(кривая I). Ц «озах, больших 100 кДе/ы2 ХЛ-отвэт клеток был полност ингибирован. ■ Наблюдаемый эффект - следствие протекай фотохимических реакций псоралена в фагоцитах, т.к. УФА-облучен

1вток без псоралена (кривая 2> и воздействие псоралвна без Е>А-облучения (3) не влияло на Х1-ответ клеток.

Рис.3 Зависимость амплитуды ХЛ-ответа клеток перитонеального экссудата крыс при добавлении БК^ .от дозы ПУФА-воздействия (кривая 1 ) или УФА-облучения (кривая 2). Интенсивность УФА-излучения 1543 Вт/м2.

3 - клетки+псорален (Ю"4 М) без У ФА-об лучения.

4 - клетки без псоралена, без УФА-облучения.

К 800 мкл среды Хенкса без красителя, содержащей 10-5 од люшшола, РН-7,4, добавляли 100 мкл суспензии клеток (конечная концентрация 10^ кл/мл. Через 5 шш терыостатирования впрыскивали БЮ^

2.2.Зависимость аффектов ПУФА-зэздеАЛТвкя от ^етена^косчи

Для выяснения механизма фотохимических реакций псоралз:

приводящих к ингибированию ХЛ-ответа фагоцитов, изуч

выполнимость закона взаимозаменяемости интенсивности ,

длительности облучения. Показано, что ПУФА-ингибирование ^М-отв

фагоцитов сильно зависело . от интенсивности. Так, при д

облучения 37 кДз/м2 ингнбирукаий эффект ПУФА-воздейстЕНЯ :

интенсивности действующего света 154,3 Вт/м2 был в 2,6 р

больше, чем при интенсивности 20 Вт/м^. Параллельно с регистрац

ХЛ повреждение клеток оценивалось по проницаемости их ыембреа

трипановому синему. И в этом тесте закон Бунзена-Роско

выполнялся (при интенсивности 154,3 Вг/г,Г тршан-голояигель:

клетки (Т+-клетки) составляли при интенсивности 20 Вт/к

13-1Ж. Т.о. по обоим тестам видна невыполнимость закона Бунзе:

Роско. Такая невыполнимость могет быть объяснена, как и в" слу

ФО^-гемолиза, протеканием фотохимических реакций псоралена по

квантовому механизму (см. схем;/ I). Ингибирование ХЛ-ответа кле

при ПУФА-воздействии не монет быть связано с.повреждением их Д

т.к. известно, что для рзакций фоголрисоедпнения к ДНК 1£лэ

закон . Бунзона-Роско выполняется вплоть - до интенсивное

тт ?

действухщего света 10 Вт/ьг с-зоьт^оп 198П . Т ПУФА^шгибнрованиэ ХЛ-ответ.а фагоцзтов моеэт быть обусловл модификациями «акбран или компонентов цитоплазмы.

г.Э.Вгаяшгэ температура посг-дучэвоа шщбацпп па по:х.*.2

трш2е-по£с13жш>шх клзтся.

Известно,, что в магдбранах эритроцитов осуществляются та фотореакции, которые приводя? к скрытыгл повроЕдена цревращапдаюя в каналы проницаемости только в ходе последа терсявсхоА (37°С) инкубации [Рогаоепг<о е* «г. 198ьз . В даа раздела изучала влияние температура пост-лучевой инкубации (Э ели 4°с) па фотосонсибилЕзнроЕсшое псоралоноа гоявлз тршан-гшхэтельшх'клэгок. На рас. 4 представлена типичны» кр2 появления !Г+-клзток. Видео, что з процессе инкубации ча Т*-клеток росло, причел при 37°С (кривые 1-3) этот рост значительно более йастрш, чей при «°С (кривые 4-6). У5-обяу^е газ исорагала (кривая 7) было сусзстьзшо ^онее эффоюавигл, че присутствии псоралена (кривая I).

:о

Нвия кокязаио, что средняя скорость гостлучового развития рведения :слеток (ч = где с до - врать янкубоцяи,

орое 50« клеток становилось трипан-положительными) линейно исела от дозы облучения. Одновременная зависимость процесса, зываодая на двухнвантовость образования фотопродукта, и прямая порциональность от дозы облучения (V = у + оД1 ) может бить яснэна схемой I, при условии, что каждый канал проницаемости трипапового синего формируется при участии одной молекулы ФОП.

100

%

<Г2'

/ *

1100

п - п,

< ^

С /

J "00 -п0

а-ЮО, %

о/

/

п л I

г/

И— -1- ......-----

150

х

И*

0Ц_

^ < 1

^^^ -I

А

-0

1

х

0

. о

К мин

:':»г. 4 пологгительпмх

Тииичние кригиз появления трнпан-гслэток перитонсзлыгсго экссудата ¡сркс посла их УФ-сблучегшя (обо км) в присутствии 10,4 М вссргукиа (1-е) или без пего (73). Дозы облучения: З.б - 6; 2,5 -ЮД 1, !,7Д - 36 кДг.г/ы2. Температура го грэмя постлугкяЯ зяку&здпи &2Д7) шн (4£Д8), з - гамшчегтао тепгспголег-ительтк: злэгек, а - п., - о гтэобпу^екаоя туспеязпл.

3.ШИШКЕ ПСОРАЛЕНА, ПРЕДВАРИТЕЛЬНО «ОТООКИСЛЕННОГО Б 35

НОЛЬНШ (СОПдт) ШШ ВОДНШ (®0ПВ) РАСТВОРАХ, НА ПШй ШАЛЬНЫЕ ФАГОЦИТЫ КРЫС.

3.1. Эффекта ®ОПэт.

На рис. 5 представлена зависимость амплитуда ХЛ-отв< перитонеальных фагоцитов, стимулированного бш2, от дозы облуче] этанольного раствора псоралена (кривая I). За 100% принята клеток, к которым был добавлен наоблученный псорален. Облуче: псоралена" в дозах менее 20 кДж/м2 приводило к активации ХЛ-отВ! фагоцитов, подобной известному эффекту предстимуляции СКашл et а 199П . Дальнейшее увеличение дозы приводило к монотонному сниже хемилшинесценцяи. По тесту с трипановым синим (кривая 2) зфф воздействия Ф0Пэт на фагоциты коррелировал с ингибированиэм Возможно, что ингибирование ХЛ-ответа фагоцитов 'являе следствием увеличения проницаемости мембран клеток. .

Появление трипан-полокительных клеток вызывал тол фотоокисленный псорален, тогда как ангелицин, 8-метоксипсорал пейцеданин, оксипейцеданин, императорин, изоимператорин, ос были в этом процессе не эффективны.

3.2.Изучение вклада разрупаешх водой фотопродуктов всоралзн: повреждение иеибран фагоцитов.

В разделе 1.2. настоящей работы в опытах по альтернатив* смешиванию было показан?, что Ф0Пэ<1-гемолиз шел более эффект! при прямом типе смешивания раствора Ф0ПдТ с суспензией клеток.

В настоящем разделе работы ставились опыты по альтернатив! смешиванию Ф0Пэт с суспензией перитонеальных фагоцитов. Оце действия ФОПдт проводилась по тесту окраски клеток трипанс синим. Установлено, что ФОПэт вызывал появление трипан-полс тельных клеток только при прямом смешивании его с сусленг фагоцитов. Следовательно, в образовании каналов проницаемост мембранах фагоцитов (в отличие от эритроцитов) участвуют тем разрушаемые водой с генерацией свободных радикалов продукты 1 Ф0Пэт, тогда как продукты типа ФОПд в этом процессе не эффекта

50 -i

00

50-

0J

г 100

50

i-1-,-,-,-1-1-1-1 i

О ' 20 40 60 80 2

. Доза облучения псоралена, кДяш

100

К м s<

а К И

ш ь я й о С о

к

й К

Л

Р.

н

Рис. 5 Повреждение клеток перитонеального экссудата крыс псораленом, фотоокислешшы в этанольноы растворе.

1 - лвиинол-зависимая SiC^-cTinry ли ро ванная хешшюшшесцснция клеток. . 2 - трипан-положительные клетки. Интенсивность излучения 154,3 Вт/ц2.

К 800 мкл среды Хепкса без красителя, еодеращей люшшол (5x10-5 М), добавляли ICO мкл исследуемой пробы. Псорален (10"2 М) облугали в 3 мы гдавете при шгттнсишости света 154,3 Вт/к2. К 500 ккл суспеазш! фагоцитоз (30x10® ил/ил) добавляли 5 мкл ФОП, после чего 100 шел пробы вяоеялл в геезету хешшюиЕзюметра. В контролышх пробах к фагодапте: добавляли 100 мкл этанола, или ICO мкл псоралена.

о

з.з. зффжга Ш1Й.

Отмечено, что ФОП^, в малых, концентрациях (дозк облучения < кДж/м2), такке как и ФОПэт, вызывал активацию хвмилшинасцен фагоцитов, стимулированную зш2. При дальнейшем увеличе: концентрации ФОПд интенсивность хемилшинесценции снач снижалась до уровня контроля (доза 180 кДж/м2). При дозе I кДж/м2 XI слегка ингибировалась (на 2756). В отличив ФОПэт-воздействия, ФОГ^-воздеЙствие не приводило к появле каналов проницаемости для трипанового синего даже при максималь использованных дозах (1285 кДж/м2). Можно предположить, активация ХЛ-ответа фагоцитов при воздействии как Ф0Пэт, тш ФО^, обусловлена только не разрушаемыми водой фотопродукт псоралена, тогда как увеличение проницаемости и ингибированиэ X главным образом разрушаемыми водой фотопродуктами.

4.ВЛИЯНИЕ ПСОРАЛЕНА, ФОТООКИСЛЕННОГО В ВОДНОМ РАСТВОРЕ

РЕАКЦИЮ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСта ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА (ГЗТ) ЭРИТРОЦИТАМ БАРАНА (ЭБ).

Известно, что ПУФА-воздействие может ингибировать реакции И контактной гиперчувствительносги (КЧ) CPerez et al- 1989i Edelson et al. 1986] . ABTOpH Прб ДПОЛЭГаЮТ, ЧТО CHKE6

интенсивности реакций ГЗТ и КЧ связано с изменением йктвдне антиген-презетирупцих клеток за счет повреждения их ДНК ПУФА-воздействии. Наши данные по влиянию . ПУФА-воздействия фагоцитирующие клетки in vitro свидетельствуют о том, что г эфЕект может быть бусловлен не повреждением ДНК клеток, осуществляться через стадию образования ФОП, который модийици] их мембраны.

Для проверки этого предположения были поставлены опыты влиянию eOUg на реакцию ГЗТ к ЭБ у мышей линии (свах^7 в^ ) Установлено (рис. 6), что СОГ^ при малых дозах облучения псора. (0,36 и 1,08 кДж/м2) вызывал активацию реакции ГЗТ. Дальне] увеличение дозы приводило к монотонному снижению интенсив» реакции ГЗТ почти до уровня отрицательного'контроля (при дозе кДж/м2). В специальных опытах нами было показано, что ингибирование реакции ГЗТ ответственны только прод фотоокисления псоралена, тогда как продукты фотолиза, получены атмосфере азота, были не эффективны. Помимо фотоокислеи

ралэна рэакции . ГЭТ также ингибяровали фотоокиолвтпшга етоксшсорален и пэйцедаяин. Можно предположить, что ¡n vivo рален, облученный в малых дозах, приводил к активации игон-презентирующих клеток.

1.5 л

3 1-0

5

í

р

5 0.5

0.0 J

г 200

100 «

QJ

к-

О

L о

г-* fr-0 10

-Г"",т ' Г' Т" ? г I J 10

Доза облучения псоралена, кДж/м2

Рис. 6 Дозовая завис!шость влияния Ф0Пв наГЗТкЭБ.

Псоралеи (10*4 М) в физ-растворе, фотоокисленный различными дозами УФА-света, вводили в/в по 0,5 мл ыьшам через 72 часа после сенсибилизации ЭБ.

.ЬЕшушлогичвский цаханизы супрессии ГЭТ под дейстшен - вОПд ингибировал реакцию ГЗТ как на афферентной г (через 24 аса после сенсибилизации мышей ЭБ), так и эфферентной (через 72 аса после сенсибилизации ЭБ). Это позволяет предположить, по НаЛОГШ с ПУФА-возд8йстви6м саиып еъ ли 199и е4с1»ап 1991] , то эффекта ФОЯд осуществляются за счет или яндуквди -супрессорных клеток, или/и поврежддения Тгзт-эФ1ектсрных клеток.

Данные, полученные нами методом переноса гмлунокомпетентшх

клеток от кивотных—доноров к реципиентам cAicaiav 19893 , указав: на то, что flOIIg in vivo преимущественно вызывает индум. Т-супрессорных клеток и в меньшей степени повреждает ТГ£ эффекторные клетки.

4.2.Зависимость реакции ГЗТ к ЭБ от времени хранения SOI^.

Было обнаружено, что за супрессию ГЗТ к ЭБ отвечают несколз фотопродуктов окисления псоралена не разрушаемых водой, часть которых спонтанно распадается не менее чем за 2 часа хранен! тогда как другие продукты при комнатной температуре сохраняют ci активность, как минимум., до трех суток. Эти данные хоре согласуются с результатами, полученными нами в опытах по- изуче] стабильности гемолитически эффективных продуктов фотоокисл?] псоралена. ■

ВЫВОДЫ

1. Показано, что при фотоокислении псоралена в этаноль: растворах образуется несколько фотопродуктов-гемолитиков, кото] могут быть подразделены на два типа: разрушаемые водой (Ф0П|) и разрушаемые водой (ФОП^). Оба. типа в свою очередь ' содер: лабильные фотопродукты, спонтанно распадающиеся за 20 - 30 мин; и стабильные, сохраняющие активность в течение нескольких часов

2. Обнаружено, что продукты типа ФОП^- способны наруш барьерные функции мембран клеток перигонеального экссудата к (КПЭК), что проявляется в увеличении их проницаемости красителя трипанового синего. ' Существует пороговая концентра ФОПт, ниже которой повреждения клеток не наблюдалось, надпороговых концентрациях число тршан-полокительных кле линейно росло с увеличением концентрации ФОПр В образова каналов проницаемости участвуют высокореакционно-способныв, видимому, свободно радикальные продукты распада Ф0П| в воде.

3.Обнаружено, что продукты типа EOIIg не меняют проницаемо мембран клеток перитонеального экссудата крыс для трипанов синего. Но при малых концентрациях (дозы облучения псоралена ме 45 кДж/м^) продукты типа tOIIg активируют "кислородный взр перитонеальных фагоцитов крыс, стимулированный двуокисью кремн В более высоких концентрациях flXHIg практически не влияют "кислородный взрыв" перитонеальных фагоцитов.

4. Показано, что УФА-облучение клеток перитонеалыюго ссудата крыс в присутствии псоралена (ПУФА-воздействие) приводит зависимому от дозы янгибированию "кислородного взрыва" и ^явлению тркпан-положительных клеток. ПУФА-поврекдение фагоцитов рактеризуется следующими особенностями: а) не выполняется закон аикозаченяемости интенсивности и длительности • облучения, ■вревдащий эффект растет с . увеличением интенсивности "А-излучеяия; б) повревдения мембран носят латентный характер и «вращаются в каналы проницаемости для тршанового синего при ст-лучевой термической инкубации.

б.Обнарувено, что псоралея, пейцеданин и в-метонсипсорален, тоокисленные в водных растворах, способны при их внутривенной секции мышам ' модулировать реакцию • таперчувстЕительности медленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барайа. Фотопродукты ораленов, модулирующие реакцию ГЗТ, стабильны в водо и сохраняют ою активность не менее 3-х суток после их получения. Продукты -толиза псоралена, полученные в отсутствие кислорода, не влияли | реакцию ГЗТ.

6. Зависимость эффектов модуляции реакции ГЗТ от дозы 'лучонил псоралена имеет экстремальный характер. При низких дозах 1,18 кДк/м^) ФОП активирует реакции ГЗТ примерно в 2- раза. При ■сличении дезы реакция ГЗТ угнетается. Практически полиоо тибпрование реакции- наблюдается при дозе 10 кЦтУм*'. ¡едтолзгаэтея, что активация реакции ГЗТ фотспродуктами псоралена 'Г!эт быть обусловлена активацией макрофагов, тогда как подавление акции ГЗТ может быть связано с индукцией Т-супроссоряых клетск.

Практические рекскепдацки Результаты исследования могут быть использованы в медчцинской >актпке для улучшения терапевтического эффекта путем увеличения .тенсцЕнастп УФА-излучедия при проведении' ПУФА-терапии или тофзреза дерматозов.

СЛИСОК РАБОТ, ОППУЗКОВЛНШП ПО ТЕ.2 ДКССЕРТАЩП!

I. А.А.Кягоса, Ч.Й.Исмаилова, А.Я.Потапенко. Сансибилизиро-шш» псорэленсгл термоактивируекые фотоповрокяения мембран йкошггов.// Биофззика.- 199Г.-Т.36.- 5 6.- С. ГС61-Г063.

2 A.A.Kyagova, LOKorkina, • T.V.Sniglreva, E.PX.y«enl S.K.Tomashaeva, A.Ya.Potapenko. Psoralen-photosensltized daituss» rat, peritoneal exudate cells. // Photochem. Photoblol.- 19 91 Vol.33.- No.S.- P. 633-637.

3 A.Ya.Potapenko, L.N.Bezdetnaya, E.P.Lysenko, A.AJCyago' S.M-Saparov, A.I.Naglev, I.SMamodov, M.I.Israailova. Furocoumai sensitized photomodlficatlon of biomembranes. // Fourth Concre of the European Society for Photoblology. Abstracts. Septeml 1-6, lfril, Amsterdam RAI. The Netherlands. Elsevier Sequo Lausanns.- 1991.- P. 104.

4. A.Ya.Potapenko, VX.Sukhorukov, L.N.Bezdatna

E.P.Lysenko, M.A.ACamallova, _ A.I.Naglov, A.A.Kya^Ova, S.M.Sapar Activation and inhibition mechanisms of psoralen photosensltl: damage of biomembranes. /V Third Congress of the European Soci< for Photobiology. 27 August. - 2 September 1989, Budapest, llun^a Book of Abstracts. Elsevier Sequoia, Lausanne.- 1989.- P. 79.