Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных циклофосфаном и гамма-радиацией

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Участие экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных циклофосфаном и гамма-радиацией"

На правах рукописи

0034Э4561

Лихачева Анастасия Сергеевна

УЧАСТИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК В РЕПАРАЦИОННЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ЦИКЛОФОСФАНОМ И ГАММА-РАДИАЦИЕЙ

03.03,04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 МАР 2010

Новосибирск 2010

003494561

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН в лаборатории молекулярной биологии клетки, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Богачев С.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН. г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Демаков С.А.

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. г. Новосибирск

кандидат биологических наук Елисафенко Е.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН. г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, г. Москва

Защита диссертации состоится «7»а-пу>слр 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

пр. академика Лаврентьева 10. г. Новосибирск. 630090 тел/факс: (383) 363-49-06 (1321): e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «¿.».мд-рмлt. 2010 г.

Ученый секретарь ^ у

диссертационного совета. \ Дм

доктор биологических наук VP Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. История вопроса воздействия экзогенной ДНК на соматическую клетку и организм в целом относится к середине прошлого века. До настоящего времени в научной литературе имеется разрозненная информации о том, какие процессы в клетке вызывает проникновение фрагментов экзогенной ДИК во внутриклеточное пространство.

Судьба экзогенной ДИК, оказавшейся во внехромосомиом пространстве ядра, принципиально имеет три исхода: (I) деградация фрагментов до мономеров, которые используются клеткой для синтетических процессов, (2) образование экстрахромосомных стабильно существующих и реплицирующихся вместе с геномом структур ДИК, (3) интеграция фрагментов в геном клетки.

В результате протекания первого пути - использование чужеродного генетического материала в качестве мономеров для синтетических процессов, протекающих в эукариотической клетке, - в структуре реципиентного генома не появляются молекулы чужеродного происхождения, несущие какую-либо генетическую информацию.

Второй путь - появление в клетке стабильно существующих, несущих структурно и функционально значимый генетический материал экстрахромосомных единиц, образованных объединением фрагментов экзогенной ДИК, доставленных в ядерное пространство. Процедура получения трансгенных как стабильно, так и транзитно трансформированных культур клеток широко используется в современной молекулярно-биологической практике. Экстрахромосомпые структуры транзитно трансформированных клеток несут специфические вирусные последовательности, селективные и маркерные гены, позволяющие им реплицироваться и определенное время сохраняться в рециниентпых клетках. Внехромосомная структура должна обладать последовательностью Ori репликации, воспринимаемой молекулярной синтетической машиной реципиентной клетки. При пролиферации определенной популяции клеток, содержащих такой стабильный автономно реплицирующийся генетический материал, он может выявляться в молекулярных экспериментах как структура, обладающая уникальными молекулярными характеристиками (размер, рестрикциоиная карта, содержание определенных специфических последовательностей).

Интеграция чужеродного генетического материала в реципиентнын геном в форме индивидуальных, пришедших извне фрагментов ДНК является третьей из возможностей поведения чужеродной ДНК. Известно, что экзогенная ДНК экстрачромосомной локализации может интегрировать в геном клетки-реципиента двумя способами: гомологичной и негомологичной (незаконной) рекомбинацией (Wurtele et al., 2003). Интеграция с использованием механизма гомологичной рекомбинации зависит от репаративных факторов и достаточной гомологии между экзогенной ДНК и ДНК хромосомы (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Wilrtele et al., 2003). При интеграции no механизму незаконной рекомбинации экзогенная ДНК внедряется в негомологичные районы хромосом, используя объединение разорванных концов (Takata et al, 1998; Smith, 2001; Lee et al., 2005). Интеграции и появлению в геноме информации, исходно экзогенной локализации, путем гомологичной или незаконной рекомбинации, способствует

наличие н клетке двухцепочечных разрывов (ДЦР) хромосом (Paques, Haber, 1999; Johnson, Jasin, 2000; Rodrigue et al., 2006).

В неповрежденной клетке с нормально функционирующими системами контроля прогрессии клеточного цикла интеграция экзогенной ДНК, по-видимому, происходить не может (Bergsmedh et al., 2002). Тем не менее, эксперименты по горизонтальному переносу генетического признака свидетельствуют о принципиальной возможности интеграции экзогенной ДНК в геном реципиентных клеток (Anker et al., 1980; Pulcian! et al, 1982; García-Olmo el al., 1999; Holmgren et al., 1999; García-Olmo et al., 2000; Bergsmedh et al., 2002).

Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК могут интегрировать в геном в двух случаях. Во-первых, при нарушениях в системе, контролирующей прогрессию клеточного цикла, как, например, в случае неотрансформированных клеток (Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002; Yakubov et al., 2007). А во-вторых, при активированном состоянии репарациошю-рекомбинационной машины клетки, например, при появлении ДЦР в молекуле ДНК хромосомы или при интеграции вирусной ДНК.

Цели и задачи работы. Целью данной работы является:

Характеристика явлений, связанных с участием фрагментов экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных у-радиацией и кросслинкирующим цитостатиком циклофосфаном (ЦФ). В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать радиопротекторное действие экзогенной ДНК при ее введении в организм экспериментальных животных после летальных доз у-облучения.

2. Исследовать совместное действие на организм мышей цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК.

3. Определить возможность поглощения экзогенной ДНК стволовыми клетками, растущими в культуре.

4. Изучить проникновение экзогенной ДНК в клетки костного мозга при введении в организм экспериментальных животных.

5. Провести молекулярно-генетический анализ геномной ДНК экспериментальных животных после совместного воздействия ЦФ и экзогенной ДНК.

Научная новизна. Впервые обнаружено, что экзогенная ДНК проявляет радиопротекторное действие при ее введении в организм экспериментальных животных в строго определенный момент времени после летальных доз у-облучения. Этот промежуток времени составляег 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора организмом летальной дозы у-радиации. Впервые показано, что инъекции экзогенной ДНК человека мышам, подвергшимся сублетальной дозе у-облучения, приводят к формированию селезеночных колоний, которые являются потомками стволовых клеток крови.

Впервые обнаружен феномен гибели мышей при введении цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК в определенный момент времени. Максимальный летальный эффект наблюдается при введении ДНК каждый час в период 18-30 ч после ЦФ.

С-

Практическая значимость. Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейших исследований воздействия экзогенной ДНК на организм высших эукариот, включая человека, а также для изучения участия экзогенной ДНК в репарационных процессах. Обнаруженный феномен истинного или транзитного трансгснеза чужеродным генетическим материалом при совместном воздействии экзогенной ДНК и агента, вызывающего появление ДЦР хромосомы, может стать новым направлением в генной терапии человека и животных.

Положении, выносимые на защиту.

1. Экзогенная ДМК в виде фрагментов доставляется в стволовые клетки костного мозга мышей и депонируется во внехромосомном пространстве ядра.

2. Инъекции экзогенной ДНК смертельно облученным мышам приводят к спасению экспериментальных животных. Радиопротекторное действие экзогенной ДНК проявляется при ее введении в организм экспериментальных животных в течение 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора летальной дозы у-рздиации и связано с формированием селезеночных колоний.

3. Введение мышам цитостатика ЦФ и следующие за этим в определенный момент времени инъекции экзогенной ДНК приводят к гибели экспериментальных животных. Во фракции геномной ДНК некоторых соматических тканей погибших мышей обнаруживаются стабильно присутствующие фрагменты чужеродной ДНК.

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-лстию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V Съезда Вавиловского общества генетикой и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - и рецензируемых журналах из списка ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) проводилась совместно с к.б.н. М.А. Прохорович. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. В.П. Николииа и к.б.н. НА. Поповой. Подсчет форменных элементов крови проводился совместно с Т.Д. Дубатоловой.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 26 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препарат ДНК человека

Препарат человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц, результаты анализа крови которых отрицательны на наличие ВИЧ, сифилиса,

гепатитов В и С. Для выделения ДНК использовали безфенольный метод (раздел промышленного регламента производства препарата «Панаген»). Фрагментацию ДНК осуществляли ультразвуковым дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали набор фрагментов ДНК, большая часть которых имела размеры от 200 до 6 000 п.н. Препарат ДНК хранили при -20°С. Данный препарат является фармакопейным препаратом (патентованное название «Панаген», регистрационное свидетельство J1CP №004429/08 от 09.06.2008) н в качестве объекта промышленной собственности принадлежит ООО «Панаген».

Экспериментальные животные

В экспериментах использовали трехмесячных мышей линии CBA/Lac разводки вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в пластиковых клетках по 10 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде. Мыши получали гранулированный корм ПК 120-1 (Лабораторснаб, Москва).

Эксперименты по радиопротекции

В экспериментах по радиопротекции мышей облучали на 7-установке ИГУР-1 (Cs137). Дозы облучения составляли 9,5-9,6 Гр, мощность 1,3-1,4 Гр/мин. ЖивотнЕле получали внутрибргашинные (в/б) инъекции 0,5-1 мг препарата ДНК человека или ДНК мышей СВА в различное время до и после облучения. Контрольные группы получали инъекции физиологического раствора по тем же схемам. В экспериментах регистрировали продолжительность жизни мышей.

В одном из экспериментов мыши получали сублетальпую дозу облучения 8,21 Гр при мощности 1,3 Гр/мин и инъекции 1 мг ДНК человека за 30 мим до облучения и по 0,5 мг ДНК через 30 мин и следующие 2 дня после облучения. На 10-й день после облучения животные были забиты. Выделенные селезенки помещали в фиксатор (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 90 мл 70% этилового спирта) и считали количество селезеночных кроветворных колоний.

Введение мышам ЦФ и ДНК человека

ЦФ вводился в/б мышам (п=20) из расчета 200 мг/кг веса. Одной группе мышей (п=10) за 30 мин до введения препарата в/б вводили 1 мг ДИК человека, через 30 мин после инъекции ЦФ вводили еще по 0,5 мг ДНК и столько же на 2-н и 3-й день. Аналогично контрольным мышам (п=10) вместо ДНК вводили физиологический раствор.

Схемы дальнейших экспериментов по введению мышам ЦФ совместно с экзогенной ДНК приведены на рисунке 3.

Статистическая обработка данных выживаемости мышей в проведенных экспериментах по совместному введению ЦФ и экзогенной ДНК, выявляющая достоверные различия между группами мышей, проводилась при помощи однофакторного дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера.

Культивирование ЭСК человека

Колонии ЭСК человека линии hESMOl культивировали на желатннизированиых 35 мм чашках Петри (Costar) при 37°С в атмосфере 6,5% С02 в среде KODMEM (Invitrogen) с использованием фидера из митотически инактивнрованных мышиных эмбриональных фибробластоп. Количество клеток, находившихся в одной чашке Петри, составляло в среднем 0,5 х 106.

В чашку Петри с клетками линии hESMOl добавляли 5 мкг меченой ,2Р ДНК гшазмиды плазмиды Carnegie 20-/J ,4(хХ> (Baricheva et al., J 996). Время инкубации клеток с меченой ДНК составляло 0, 1, 2 и 3 часа.

Из клеток выделяли ядра путем центрифугирования на ступенчатом градиенте 10% сахарозы (Drosophila..., 1986). Из цитоплазматпческой фракции осаждали ДНК. Ядра заливали в блоки легкоплавкой агарозы (1%, ТЛЕ буфер) объемом 80 мкл и хранили в 20 мМ ЭДТА в течение нескольких дней (Schwartz, Cantor, 1984). В одном агарозном блоке содержалось порядка 250 ООО ядер. Перед электрофорезом ядра, фиксированные в агарозе, обрабатывали 1% SDS, 20 мМ ЭДТА и 200 мкт/мл протсиназы К в течение 2 часов при 37°С и отмывали в ТЕ буфере трехкратно по 10 мин. Материал ДНК цитоплазмы и ядра фракционировали в 1% агарозном геле. Агарозный гель высушивали под струей горячего воздуха и экспонировали с рентгеновской пленкой.

Введение мышам ДНК

Мышам в/б вводили 0,5 мг ДНК человека, фрагментированной до размеров 200 - 6 000 п.н., каждый час в течение 12 часов. Через 8 часов мышей забивали и выделяли клетки костного мозга. Появление ДНК человека в клетках костного мозга мышей детектировали методом ПЦР на предметных стеклах (Cycling PRINS) либо ГЩР амплификацией ДНК ядерного материала клеток с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека.

ПЦР на предметных стеклах

Приготовление препаратов ядер клеток костного мозга проводили но стандартной методике (Stanyon, Galleni, 1991; Gosden, Lawson, 1995).

Реакцию проводили в 50 мкл: 0,5 мкг праймера - ДНК человека, фрагментированной до размеров 20 - 500 п.н., 0,2 мМ «1ЛТР, dGTP и dCTP, 0,02 мМ d'lTP, 0,02 мМ biolin-16-dUTP, 50 мМ КС1, 10 мМ Tris-HC! (рИ 8,3), 1,5 мМ MgCI2, 0,1% BSA, 5 ед. Тац-нолимеразы (Gosden, Lawson, 1995). На предметные стекла наносили реакционную смесь, накрывали препарат покровным стеклом и закрепляли резиновым клеем, чтобы не происходило испарения.

Дня амплификации использовался следующий температурный режим: (63°С - 3 мин, 73°С - 10 мин) - 1 цикл, (98°С - 1 мин, 63°С - 1 мин, 73°С - 3 мин) - 30 циклов. Амплификацию проводили на приборе Mastercycler personal (Eppendorf, США).

Для детекции (Pinkel et al., 1986) использовали конъюгат авидин-FITC (Vector Laboratories, США), и антитела к авидину, меченые биотипом (Vector Laboratories, США).

Флуоресцентная микроскопия проводилась на микроскопе Axioskop 2 Plus с использованием программы AxioVision в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

Полимеразная цепная реакция

Реакцию проводили в 100 мкл: 0,2 мкг ДНК-магрицы, по 40-50 пмоль праймеров, 0,2 мМ dNTPs, 1,5-2,5 мМ MgC.l2, 5 ед. Тац-полимеразы (Медиген, Новосибирск) (PCR Application Manual, 1995).

Используемые праймеры на ген каспазы 3 человека:

Pr.3 AGCACATTACTTAGCCTCA (19)

Рг.4 ТПТ AT AACTGTTGTCC AG G G А (22)

Для амплификации использовали следующий температурный режим: 94°С

- 2 мин, (52°С - 30 сек, 72°С - 30 сек, 94°С - 30 сек) - 33 цикла, 4°С - хранение. Амплификацию проводили на приборе Mastercycler personal (Eppendorf, США).

Для выявления минорных фрагментов человеческого происхождения в геномах экспериментальных мышей использовали следующий подход. На первом этапе проводили амплификацию в присутствии одного праймера Pr.ll. Далее полученный материал в новом раунде ПЦР амплифицировали с добавлением обратного праймера - в реакцию добавляли Рг.9 и Pr.l 1.

Используемые специфические для человеческого генома праймеры:

Pr.9 CGAGGCGGGAGGATCACTTGAGCCC (25)

Pr.ll GCGCGCGCCACCACGCCCGGC (21)

Для амплификации специфических фрагментов человеческого генома использовали следующий температурный режим: 94°С - 2 мин, (94°С - 30 сек, 72°С - 1 мин) - 33 цикла, 4°С - хранение. Амплификацию проводили па приборе Терцик (ДНК-Технология, Россия).

Этот же температурный режим и праймеры Рг.9 и Pr.ll использовались для наработки меченого 32Р фрагмента 280 пл., представляющего собой Alu повтор. Матрицей служил выделенный из геля фрагмент 280 п.н., полученный в ПЦР с тотальной ДНК человека (при режиме первый раунд - Pr.l 1, второй раунд

- Рг.9 и Рг.И). Меченный Alu фрагмент использовался в качестве зонда для гибридизаций.

Секвенирование ПЦР фрагментов

Из агарозного геля вырезали куски с изучаемыми ПЦР фрагментами определенной длины и после трехкратного замораживания/оттаивания выделяли ДНК. Секвенирование проводили по протоколам фирмы Applied Biosystems.

Секвенирование полученных образцов было проведено в Межинститутском центре секвенирования ДНК СО РАН с использованием 16-капиллярного автоматического секвенатора ДНК АВ13130x1.

Саузерн-блот гибридизации

Материал (продукты ПЦР или образцы геномной ДНК, гидролизованной рестриктазами) фракционировали в 0,7-2% агарозном геле, денатурировали и переносили по Саузерну на мембрану Hybond N (Amersham, США) (Мапиатис и др., 1984). Мембранные фильтры гибридизовали с ,2Р меченым в ПЦР Alu фрагментом ДНК человека при 68°С в 5х растворе Денхардта, содержащем 5xSSC, 0,1% SDS, 100 мкг/мл дрожжевой РНК. В некоторых случаях гибридизационный раствор содержал 10% декстрансульфата. Отмывку проводили в жестких условиях в 0,1% SDS и 0,1*SSC при температуре 68°С (Маниатис и др., 1984). Мембранные фильтры экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 1-7 суток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В предлагаемой работе мы попытались, используя две системы, а именно у-облучение и цитостатическую обработку кросслинкирующим агентом ЦФ, определить возможность участия фрагментов экзогенной двухцепочечной геномной ДНК в репаративном процессе при репарации ДЦР, возникающих в процессе таких обработок. Предполагалось обнаружить появление

определенных маркерных признаков, свидетельствующих об участии фрагментов экзогенной ДНК в репаративном процессе.

Радионротекториос действие экзогенной фрагментированной ДНК

Мыши получали летальную дозу у-облучения и в/б инъекции экзогенной ДНК. В серии многочисленных экспериментов показано, что на 30 сутки после летальной дозы облучения до 90% опытных животных остаются жизнеспособными (Рис. 1). При этом выжившие мыши, полностью поседев, продолжали жить до конца срока наблюдения - 1,5-2 года.

ч. ....

ДНК

\ контроль

Рис. 1. Влияние ДНК на выживаемость экспериментальных животных при ее в/б введении мышам после у-облучения по сравнению с контрольной группой, которая не получала инъекций ДНК.

О 10 20 30 40 50 60

время после облучения, сут.

Радиопротекториое действие экзогенной ДНК проявляется при ее введении и организм экспериментальных животных не позднее 30 мин после быстрого набора в течение 5-10 мин смертельной дозы у-радиации.

В классических экспериментах по радиопротекции показано, что инъекции С034+ стволовых клеток смертельно облученным животным приводят к спасению жизни мышей и появлению в селезенках селезеночных колоний, участвующих в восстановлении поврежденной иммунной системы. Предполагалось, что эффект воздействия ДНК также связан со спасением стволовых клеток крови (СКК), которые дадут селезеночные колонии. Было проанализировано появление и подсчитано количество селезеночных колоний у мышей, получивших сублетальную дозу облучения. На рисунке 2 приведены селезенки контрольной группы и группы мышей после введения ДНК, где видны многочисленные фолликулы, представляющие собой селезеночные колонии.

Рис. 2. Селезенки мышей, подвергшихся сублетальной дозе у-облучения, при терапии экзогенной ДНК (а) и без нее (б). Стрелками обозначены селезеночные колонии, появившиеся в результате обработки облученных мышей ДНК человека.

В среднем число селезеночных колоний увеличивалось в 18 раз при в/б введении ДНК по сравнению с контролем. По-видимому, экзогенная ДНК, проникая в клетку и включаясь в репаративные процессы, позволяет СКК выжить. Сохранившиеся СКК мигрируют и заселяют лимфоидные органы, лимфатические узлы и селезенку, что способствует в дальнейшем восстановлению кроветворения и сохранению жизни мышей.

Таким образом, было продемонстрировано радиопротекторное действие экзогенной ДНК, введенной в организм экспериментальных животных не позднее 30 мин после быстрого набора (5-10 мин) смертельной дозы у-радиацни. Выживаемость смертельно облученных мышей и формирование многочисленных селезеночных колоний при введении животным экзогенной ДНК свидетельствуют о спасении достаточного количества СКК, необходимого для восстановления иммунной системы.

Воздействие цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК на организм мышей

Многочисленные эксперименты по лейкостимуляции мышей свидетельствовали о том, что инъекции экзогенной ДНК стимулируют лейкопоэз. В организм экспериментальных мышей в/б были введены алкилирующий цитостатик ЦФ, индуцирующий поперечные сшивки в молекуле ДНК, и препарат фрагментнрованной ДНК человека. Неожиданно в ходе эксперимента была отмечена гибель животных. В опытной группе гибель мышей составила 80%. При этом в контрольной группе мышей, получавших только инъекцию ЦФ, гибель животных не наблюдалась.

При введении мышам только ДНК человека или ДНК мышей линии СВА по той же схеме животные оставались жизнеспособными на протяжении всего срока наблюдения.

Для подтверждения наблюдаемого феномена гибели мышей была проведена серия экспериментов с использованием различных схем введения экзогенной ДНК после ЦФ (Рис. 3).

0 6 12 113 24 30 36 42 43

время после введения циклофосфана, часы

Рис. 3. Гибель мышей при различных схемах введения экзогенной ДНК после ЦФ. Прямые отрезки обозначают различные группы мышей, числа рядом - условные номера групп. Точками на отрезках обозначено введение мышам ДНК. Нулевая точка -

момент введения ЦФ. Проекция на ось Y показывает процент смертности мышей в каждой группе. Группы 9 и 10 получали инъекции ДНК мышей СВА и ДНК спермы лосося. Все остальные группы получали инъекции ДНК человека. Группа 11 представляет собой совокупность 6 групп, которые получали инъекции ДНК человека в периоды времени 1-6, 7-12,13-18,19-24, 25-30 и 31-36 ч после ЦФ каждый час.

В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что введение мышам экзогенной ДНК в промежуток времени 18-30 часов (каждые 1-2 часа) после введения ЦФ приводит к быстрой гибели мышей в течение недели после инъекции ЦФ (группы 8, 9, 10 и 14). Если вводить ДНК в два разнесенных во времени промежутка, как для групп 4 и 13, также наблюдается гибель мышей, но растянутая во времени - гибель мышей начиналась только с 9 суток после инъекции ЦФ и продолжалась до 45 суток. При введении ДНК в период 0-11 часов после введения ЦФ (группа 5) наблюдалась гибель 25% животных.

Введение ЦФ (200 мг/кг) в виде монопрепарата мышам, а также введение ЦФ в сочетании с ДНК человека в другие временные промежутки (группы 7, 11, 12) не оказывало никакого видимого эффекта на животных. Это предполагает, что наблюдаемый эффект не является случайным и не связан с токсичностью ЦФ, которую он проявляет при метаболизме в организме животного.

При помощи однофакторного дисперсионного анализа с использованием критерия Фишера было показано, что группы мышей, смертность которых лежит выше 60%, достоверно отличаются от тех групп, смертность которых лежит в пределах от 0 до 25%. Между группами мышей, смертность которых лежит внутри этих интервалов, достоверного отличия нет.

Из всех погибших животных по возможности были взяты печень, селезенка и тимус для выделения ДНК и последующего ее анализа. При вскрытии мышей отмечались дегенеративные изменения тимуса и селезенки. Предполагалось, что обнаруженное совместное действие препарата ДНК человека и цитостагика ЦФ вызывает нарушения, связанные с серьезными генетическими изменениями в клетках опытных животных вследствие стабильного присутствия в них чужеродной генетической информации.

В экспериментах по радиопротекции было показано, что воздействие экзогенной ДНК связано со спасением СКК. Появление селезеночных колоний косвенно свидетельствовало о том, что экзогенная ДНК проникает в СКК. При этом присутствие ДНК сохраняет структурно-функциональную целостность хромосом и, как следствие, жизнеспособность СКК и мышей. Было высказано предположение, что высокая летальность, выявляемая при совместном воздействии цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК, связана с нарушениями в функционировании СКК, приводящими к их гибели.

Поглощение экзогенной ДИК стволовыми клетками

Для исследования поглощения экзогенной ДНК стволовыми клетками были использованы 2 модели: in vitro - культура ЭСК, и in vivo - клетки костного мозг а мышей.

Культуру ЭСК человека hESMOl инкубировали в присутствии меченой ДНК плазмиды Carnegie 20-?J,4(x8), гидролизованной реетриктазон Sa/Cil. Carnegie 20-11,4(х8) состоит из вектора Caniegi 20 (10,8 т.н.н.) и восьми копий

1,4 т.п.н. M/SAR фрагмента Drosophila melariogaster (Baricheva et al., 1996; Rogachev et al, 2006). Меченые ,2P фрагменты плазмндной ДИК добавляли в культуральную среду ЭСК человека и инкубировали в течение 0-3 часов (Рис. 4).

После окончания инкубации из клеток выделяли ядра и заливали их в блоки легкоплавкой агарозы. Блоки в течение нескольких дней хранились в избыточном объеме 20 мМ ЭДТА и весь материал экзогенной ДНК, если он сохранился в образце как загрязнение, с неизбежностью диффундировал в буфер хранения. После этого ядра лизировали, обрабатывали протеиназой К и фракционировали материал ДНК в 1% агарозном геле. Предполагалось, что весь клеточный хроматин останется интактным и вследствие своих линейных размеров не выйдет из геля. При этом фракция экзогенной ДНК, локализованная в ялепном поостоанстве. булет мигпиповать в геле в соответствии с ее

Рис. 4. Распределение по клеточным компартментам (цитоплазма и ядро)клеток культуры ЭСК hESMOI радиоактивно меченых индивидуальных фрагментов плазмидной ДНК (Carnegie 20-A1,4(x8)Sa/GI) размером 10,8 т.п.н. и 1,4 т.п.н. в зависимости от времени их нахождения в культуральной среде. Слева блоки агарозы, окрашенные этидиумом бромидом. Справа рентгенограммы этих же блоков после высушивания. Цифры над блоками указывают время инкубации (часы) культуры клеток с 32Р мечеными фрагментами.

В результате в ядре были выявлены меченые фрагменты, по размеру соответствующие исходным фрагментам субстрата (Рис. 4). В ядерной фракции во всех точках 0, 1, 2 и 3 часа выявляются фрагменты 1,4 и 10,8 т.п.н. и мультимерные копии фрагмента 1,4 т.п.н.

Таким образом, ЭСК человека эффективно поглощают из культуральной среды экзогенную ДНК, которая в виде фрагментов доставляется в ядерное пространство.

В рамках проводимых исследований не менее важным являлся вопрос о возможности проникновения чужеродного генетического материала в клетки организма млекопитающих и, в первую очередь, в клетки костного мозга.

Для подтверждения того факта, что экзогенная ДНК доставляется в клетки костного мозга мышей в виде фрагментов определенного размера были проведены ПЦР на предметном стекле (Cycling PR1NS) и ПЦР амплификации материала, принадлежащего ядру. Мышам в/б вводили 6 мг ДНК человека в

молекулярным весом.

0 J 2 2 3

Ц»; ■ . '1 " -гх

V » - W «

ядро

цитоплазма tii.и SZSS3» о I г г з з

течение 12 часов и через 8 часов после последней инъекции выделяли клетки костного мозга.

В нервом случае ядра клеток костного мозга фиксировались на стеклах. PR1NS анализ проводился с использованием в качестве праймера геномной ДНК человека, фрагментированной до размеров 20 - 500 п.н. На рисунке 5 представлены результаты такого анализа, где выявляются четкие сигналы,

Рис. 5. Ядра клеток костного мозга мышей, интактных (а) и после 12-кратного в/б введения 0,5 мгДНК человека каждый час (б), после ПЦР на предметном стекле с биотин-мечеными нукпеотидами и с использованием ДНК человека, фрагментированной до размеров 20 - 500 п.н., в качестве праймера. Время экспозиции составляло: а) 6 000 мсек, б) 600 мсек.

Далее был проведен П1 IP анализ с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека. При этом выявляется продукт, соответствующий фрагменту гена каспазы 3 человека (Рис. 6). Результат был подтвержден гибридизацией со специфическим зондом на ген каспазы 3 человека. Анализ полученных результатов демонстрирует присутствие фрагментов человеческой ДНК в ядерной фракции клеток костного мозга мышей, при этом размер этих фрагментов составляет не менее 300 п.н.

п.н. человек М С8А №1 человек У СВА №1

Рис. 6. Электрофореграмма (слева) и рентгенограмма (справа) продуктов ПЦР с праймерами на уникальный ген каспазы 3 человека с использованием в качестве матрицы ДНК человека, ДНК клеток костного мозга мышей СВА и ДНК ядерной фракции клеток костного мозга мышей, выделенных через 8 часов после 12-кратного в/б введения 0,5 мг ДНК человека каждый час (№1). В качестве зонда для гибридизации использовали фрагмент ~260 п.н., меченый в ПЦР с праймерами на ген каспазы 3 человека и матрицей ДНК человека. 2% агарозный гель. М - маркер молекулярного веса (100 п.н.). Стрелка обозначает гибридизующийся фрагмент, соответствующий продукту ПЦР с праймерами на ген каспазы 3 и матрицей ДНК мыши после введения большого количества ДНК человека. Это свидетельствует о проникновении ДНК человека в клетки костного мозга в виде фрагментов.

свидетельствующие о специфичности PR.INS.

Полученные в данном разделе результаты с использованием различных экспериментальных подходов подтверждают факт доставки экзогенной ДНК в форме фрагментов в ядерное пространство ЭСК человека и клеток костного мозга мышей. В связи с этим предполагалось, что поглощенные фрагменты ДНК могут при определенных условиях использоваться репаративной системой клетки в качестве субстрата при репарации индуцированных ДЦР.

Выявление фрагментов ДИК человека в» фракции геномной ДНК экспериментальных животных после воздействия ЦФ и ДНК

В следующей части работы был проведен доступный молекулярно-биологичеекий анализ геномной ДНК мышей после воздействия ЦФ и ДНК человека. В качестве маркера присутствия экзогенной ДНК человека во фракции геномной ДНК мышей был выбран А!и повтор человека.

Выл проведен ГТЦР анализ геномной ДНК экспериментальных животных. Для некоторых экспериментальных животных были обнаружены фрагменты, по подвижности совпадающие с продуктами ГИДР с использованием в качестве матрицы ДНК человека (Рис. 7, левый блок, дорожки !, 8, 12). Их электрофоретическая подвижность составляла около 300 п.н. (280 и 310 п.и.). Поскольку для синтеза были выбраны праймеры, локализованные в последовательности Alu повтора, то два мажорных ПНР фрагмента в образце, содержащем ДНК человека, вероятно, являлись двумя вариантами Alu повтора генома человека.

Гибридизация с меченым зондом, представляющим собой Alu повтор человека, выявила специфические фрагменты в геномах двух мышей - №1 и №8 (Рис. 7, правый блок).

„„. 1 2 М 3 4

ДНК человека ЦФ <- ДНК человека ДНК человека ЦФ + ДНК человека

Рис. 7. ПЦР анализ геномной ДНК экспериментальных животных на присутствие в ней последовательностей человеческой ДНК. Левый блок - электрофоретически фракционированные в 2% агарозном геле ПЦР фрагменты. В ПЦР в качестве матрицы использовались: 1 - ДНК человека, 2 - ДНК мышей СВА, 3-7 - образцы ДНК мышей, обработанных только ДНК человека, В-12 - образцы ДНК мышей, подвергшихся воздействию ЦФ и ДНК человека (8 - мышь №1, 12 - мышь №8), 13 - ДНК мыши, получившей только инъекцию ЦФ. Правый блок - Саузерн-блот гибридизация с 32Р меченым в ПЦР Alu фрагментом. Цифры слева от блоков (280 и 310) указывают на фрагменты, соответствующие двум мажорным ПЦР продуктам, выявляемым в геноме человека. М - маркеры молекулярных весов (100 п.н.).

5 i3 7 М 8 9 10 11 12 13 „„, 1 2 М 3 4 5 в 7 М В Я 10 11 52 13

При анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов, полученных в ПЦР с тотальной ДНК человека и мышей №1 и №8 (280 п.п.), была установлена их полная гомология между собой и принадлежность к семейству Alu повторов (Рис.8). Обнаружено, что секвенированный фрагмент представляет собой вторую и первую часть двух тандемно расположенных Alu повторов в хромосоме 16 человека (АС002400.1). Кроме того, была выявлена частичная гомология секвенированного фрагмента с большим количеством последовательностей ДНК, также относящихся к семейству Alu повторов человека.

Query 8

Sbjct 53767

Query 68

Sbjct 53707

Query 128

Sbj et 53647

Query 188

sbj et 53567

Query 248

Sbjct 53527

GGAGGATCACTTGAGCCCAL-GTCGAGGCTACAGTAAGTTATGATTGTGCCATGGAACTCT 67

I II I II I II I I II I I I I I II I I I I II III И I I I I II I I I II I И I II I I II II III II I

GGAGGATCACTTGAGCCCAGGTCGAGGCTACAGTAAGTTATCATTGTGCCATGGAACTCT 53708 AGCCTGGGTAACAAAATGAGACCCTGACTCTAAAAAATTAAAAMTAAAGAAACCAAGTT 127

I I I I II I II II I I I I II I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

AGCCWGGTAACAAAATGAGACCCTCACTCTAAAAAATTAAAAAATAAAGAAACCAAGTT 53618

GGGCGCGGTGGCl'CATGCCTATMrciXÄGCACTTTGGGAGGTCGAGGCAGGTGGATCAC 187

II I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I III I I I И I I I I I II I II I I GGGCGCGGTGGCTCATGCCTATAATCCCAGCACTTTGGGAGGTCGAGGCAGGTGGATCAC 53588

GAGGTCAGGAGGTCAPßATCATCCTTQCTAACACAGTGAAWrCCCG'KTCTACrAAAWkT 247

I 111 II I Mil III I II lllllllll 1)1 III I I I II I I I 11 I III II I I I I I I I I I II I

GAGGTCAGGAGGTCAAGATCATCCTTGCTAACACAGTGAAAGCCCGTCTCTACTAAAAAT 53528 ACAAAAAAACTTAGCCGGGCGTGGTGGCGCGCGC 281

I I I I II I II I II I I I II I II II I I II II I I I I I

Рис. 8. Выравнивание последовательностей секвенированного фрагмента и геномной ДНК человека. При использовании в ПЦР в качестве матрицы геномной ДНК человека и геномной ДНК экспериментальных мышей №1 и №8 синтезируются идентичные фрагменты длиной 280 п.н. Секвенированные фрагменты, выделенные из агарозного геля, оказались полностью гомологичны друг другу и последовательности из генома человека. Query - последовательность секвенированного фрагмента 281 п.н., Sbjct -последовательность хромосомы 16 человека (АС002400.1). Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров.

Следует отметить факт, что в дополнительных контрольных экспериментах с использованием только одной из двух субстанций (либо ЦФ, либо препарата фрагментированной ДНК человека) не было обнаружено каких-либо отклонений от нормы. Все мыши были живы, присутствие ДНК Alu повторов во фракции геномной ДНК" экспериментально не показано (Рис. 7. дорожки 3-7, 13).

Для подтверждения того, что полученный в ПЦР-анализе результат не является результатом контаминации, была проведена Саузерн-блот гибридизация геномной ДНК с меченым Alu повтором. Геномная ДНК экспериментальных мышей, ДНК мышей линии СВА и ДНК человека были гидролизованы рестриктазами BamHl и HindlH и фракционированы в 0,7% агарозном геле. Далее была проведена саузерн-блот гибридизация при 68°С в растворе, содержащем 10% декстрансульфата, с ,2Р меченым Alu фрагментом, синтезированным в ПЦР с ДНК матрицы генома человека (280 п.н.). Гибридизационная картина представлена на рисунке 9.

Рис. 9. Саузерн-блот анализ геномной ДНК

экспериментальных мышей №1 и №8. Левый блок -электрофоретически фракционированная в 0,7% агарозном геле гидролизованная SamHI и H/ndlil геномная ДНК экспериментальных мышей №1 и Na8, ДНК реципиентной линии мышей СВА и ДНК человека. Правый блок - геномный блот этого же геля после гибридизации с 32Р меченым в ПЦР Alu фрагментом. Стрелками в правом блоке указаны гибридизующиеся фрагменты геномов экспериментальных животных. М - маркер молекулярного веса (/-ttidlll гидролизат ДНК фага К).

Выявление дискретных бэндов свидетельствует о том, что полученный в ПЦР анализе результат не является артефактом. В случае контаминации образцов человеческой ДНК можно было бы наблюдать картину засветки, аналогичную выявляемой при гибридизации с суммарной человеческой ДНК - в виде шмера.

Неравномерные сигналы гибридизации для ДНК экспериментальных животных наблюдаются в результате «фокусированного» переноса на мембрану. Это может быть связано с тем, что не во всех клетках присутствуют фрагменты человеческого происхождения, что приводит к неравномерному распределению незначительного количества ДНК в полосе агарозного геля, и, как следствие, к искажению переноса и фокусировке.

Таким образом, во фракции геномной ДНК некоторых экспериментальных животных была обнаружена ДНК, гомологичная Alu повторам человека -наиболее просто детектируемому маркеру. По результатам молекулярного анализа, проведенного в данной работе, не возможно однозначно сказать, произошла ли истинная интеграция экзогенной ДНК человека в геном мышей, или же она присутствует в клетках как внехромосомная структура. В предложенной работе были проведены пионерские эксперименты, характеризующие некоторые молекулярные особенности обнаруженного феномена. Предполагается, что гибель экспериментальных животных связана с появлением чужеродной генетической информации в ядрах клеток их некоторых соматических тканей.

Возможные события, определяющие появление последовательностей ДНК человека в геномах, экспериментальных животных

Существует два возможных типа токсичного действия экзогенной ДНК.

Во-первых, стабильно существующие фрагменты ДНК человека могут присутствовать в клетках как впехромосомная структура. Такая структура должна быть кольцевой и содержать Ori репликации. Если помимо Ori репликации в такой кольцевой молекуле содержатся экспрессирующиеся последовательности, то продукты такого синтеза могут быть токсичными для клетки, что будет приводить к гибели подопытных животных.

Второе возможное объяснение - это произошедшая истинная интеграция чужеродного генетического материала в геном рецшшентной клетки. Такой ход событий представляется более вероятным, поскольку в многочисленных экспериментах при введении мышам только ДНК человека, без ЦФ, не наблюдались ни гибель животных, ни наличие Alu повторов при молекулярном анализе геномной ДНК этих мышей. Кроме того, инъекции сингенной ДНК мышей совместно с ЦФ также приводили к гибели. Поскольку эта ДНК не является чужеродной, то токсичность продуктов синтеза с внехромосомной структуры практически полностью исключается.

В связи с этим предполагается, что в проведенных экспериментах наиболее вероятно происходит истинная интеграция фрагментов экзогенной ДНК в рецнпиентный геном клетки-хозяина.

Возможно, интеграция произошла в нескольких СКК в костном мозге, выжившие потомки которых сформировали индивидуальные колонии в селезенке. При этом интегрированный фрагмент будет находиться в единственном месте генома, определенным родительской СКК.

В данной работе было описано и охарактеризовано 2 феномена. Первый -спасение экспериментальных животных при введении экзогенной ДНК после у-облучення, второй - гибель мышей при совместном воздействии ЦФ и экзогенной ДНК. Противоположные эффекты воздействия экзогенной ДНК, по-видимому, объясняются различными системами репарации возникающих повреждений.

В первом случае, наиболее вероятно происходит репарация по механизму SDSA (synthesis-dependent strand annealing) - гомологичное спаривание с последующим синтезом ДНК, которая протекает в течение 30 мин после возникновения повреждения (Рис. 10). При этом не происходит нарушения структурно-функциональной целостности хромосом.

ДЦР

Рис, 10. Появление в реципиентном геноме экзогенного генетического материала при репарации ДЦР, индуцированных у-обпучением, по механизму SDSA.

Во втором случае образуются МЦС, при репарации которых возникают ДЦР (Рис. И). При этом механизм восстановления ДЦР принципиально

отличается от репарации ДЦР, возникших после у-облучения. Весь процесс репарации более длительный и занимает до 48 ч. В репарации ДЦР принимает участие РЛ/ВКСЛ система, в результате активности которой осуществляется ковалентное объединение двухцепочечных концов. Можно полагать, что при участии 1;А/ВКСА системы при сшивке двухцепочечных концов хромосомы возможно негомологичное встраивание фрагментов ДНК, что приводит к нарушению структурно-функциональной целостности хромосом, гибели клеток и, в конечном итоге, всего организма экспериментальных животных.

Рис. 11. Предположительная схема интеграции экзогенной ДНК в реципиентный геном путем незаконной рекомбинации.

-1

ЯЕК

ЭКУОККШЯ

—?—

РАЩВСД

—т— У.ЛЛФГА

ВЫВОДЫ

1. Экзогенная фрагментированная ДНК при ее введении в организм смертельно облученных мышей обладает ярко выраженным радиопротекторным действием. Эффект проявляется при введении ДНК в организм экспериментальных животных не позднее 30 мин после быстрого набора (в течение 5-10 мин) смертельной дозы у-радиации.

2. Инъекции экзогенной ДНК человека мышам, подвергшимся сублетальной дозе у-облучения, приводят к формированию селезеночных колоний, которые являются потомками стволовых клеток крови.

3. Инъекции экзогенной ДНК человека в определенный момент времени после введения цитостатика циклофосфана приводят к гибели экспериментальных животных. Максимальный летальный эффект наблюдается при введении ДНК каждый час в период 18-30 ч после циклофосфана.

4. Эмбриональные стволовые клетки человека способны поглощать из культуральной среды экзогенную ДНК, которая проникает в ядерное пространство клеток в виде фрагментов.

5. Экзогенная ДНК при введении в организм мышей проникает в ядра клеток костного мозга.

6. Во фракции геномной ДНК клеток соматических тканей экспериментальных животных, погибших после введения циклофосфана и экзогенной ДНК человека, при молекулярно-генетическом анализе выявляются последовательности ДНК человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Likhacheva AS, Nikolin VP, Popova NA, Dubatolova TD, Strunkin DN. Rogachev VA, Sebeleva TE, Erofeev IS, Bogachev SS, Yakubov LA, Shurdov MA. Integration of human DNA fragments into the cell genomes of certain tissues from adult mice treated with cytostatic cyclophosphamide in combination with human DNA. Gene TherMol Biol. 2007. V. l'l.P. 185-202.

2. Likhacheva AS, Nikolin VP, Popova NA, Rogachev VA, Prokhorovich MA. Sebeleva TE, Bogachev SS, Shurdov MA. Exogenous DNA can be captured by stem cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose y-radiation. Gene Ther Mol Biol. 2007. V. 11. P. 305-314.

3. A.C. Лихачева, B.A. Рогачев, В.П. Николин, H.A. Попова, А.Г. Шилов. Т.Е. Себелева, Д.Н. Стрункин, Е.Р. Черных, Е.Л. Гельфгат, С.С. Богачев, М.А. Шурдов. Участие экзогенной ДНК в молекулярных процессах, протекающих в соматической клетке. Информационный вестник ВОГиС. 2008. Т. 12. №3. С. 426473.

4. А.С. Лихачева, В.П. Николин, Н.А. Попова, Т.Д. Дубатолова. Д.Н. Стрункин. В.А. Рогачев, Т.Е. Себелева, И.С. Ерофеев, JI.A. Якубов. С.С. Богачев. М.А. Шурдов. Включение фрагментов человеческой ДНК в геном клеток некоторых тканей взрослых мышей при одновременном воздействии цитостатика циклофосфамида и препарата экзогенной ДНК человека. II Съезд Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Инсптта цитологии РАН. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г. Цитология. 2007. Т.49. №9. С. 770.

5. С.С. Богачев, А.С. Лихачева, В.А. Рогачев, В.П. Николин. Н.А. Попова. Т.Е. Себелева, Е.Р. Черных, Е.Л. Гельфгат. М.А. Шурдов. Участие экзогенной ДНК в молекулярных процессах, протекающих в соматической клетке. Научная конференция с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008». Томск, 16-19 сентября 2008 г. Сибирский медицинский журнал. 2008. Т.23. №3. Вып. 1. С. 85-86.

6. А.С. Лихачева, Е.В. Долгова, В.П. Николин, Н.А. Попова. В.А. Рогачев. С.С. Богачев. Роль экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных кросслинкируюшими цитостатиками и гамма-радиацией. Съезд генетиков и селекционеров, посвященный 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-27 июня 2009 г. Материалы съезда. Часть II. С. 67.

Подписано к печати 17.02.2010 г.

Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. I. Уч. изд.0.7.

Тираж 100 экз. Заказ 7.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лихачева, Анастасия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1Л. Краткая история вопроса.

1.2. Экстраклеточная ДНК плазмы крови человека.

1.3. Поглощение ДНК эукариотической клеткой.

1.4. Утилизация экстраклеточной ДНК, доставленной в ядро эукариотической клетки.

1.5. Рекомбинация как возможный путь интеграции фрагментов экзогенной ДНК в реципиентный геном.

1.5.1. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации. Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации.

1.5.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК. Захват фрагментов ДНК.

1.6. ДЦР как индукторы репарационно-рекомбинационных процессов в соматической клетке.

1.6.1. Опознание повреждения и активация систем трансдуцирующих киназ

1.6.2. Функциональные ДЦР.

1.6.2.1. Перетасовка генов иммуноглобулинов и генов ТСЯ.

1.6.2.2. Реорганизация генома стволовых клеток, вступающих на путь дифференцировки.

1.6.3. ДЦР, индуцированные внешним воздействием. Действие химиотерапии и облучения на систему кроветворения.

1.6.3.1. Основные характеристики системы кроветворения млекопитающих.

1.6.3.2. Угнетение системы кроветворения облучением.

1.6.3.3. Метаболизм ЦФ в организме. Действие на систему кроветворения

1.6.3.4. Репарация возникших повреждений после облучения.

1.6.3.5. Репарация повреждений после воздействия ЦФ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных циклофосфаном и гамма-радиацией"

Актуальность. История вопроса воздействия экзогенной ДНК на соматическую клетку и организм в целом относится к середине прошлого века. До настоящего I времени в научной литературе имеется совсем немного информации о том, какие процессы в клетке вызывает проникновение фрагментов экзогенной ДНК во внутриклеточное пространство.

Судьба экзогенной ДНК, оказавшейся во внехромосомном пространстве ядра, принципиально имеет три исхода: (1) деградация фрагментов до мономеров, которые используются клеткой для синтетических процессов, (2) образование экстрахромосомных стабильно существующих и реплицирующихся вместе с геномом структур ДНК, (3) интеграция фрагментов в геном клетки.

В результате протекания первого пути - использование чужеродного генетического материала в качестве мономеров для синтетических процессов, протекающих в эукариотической клетке, - в структуре реципиентного генома не появляются молекулы чужеродного происхождения, несущие какую-либо генетическую информацию.

Второй путь - появление в клетке стабильно существующих, несущих структурно и функционально значимый генетический материал, экстрахромосомных единиц, образованных объединением фрагментов экзогенной ДНК, доставленных в ядерное пространство. Процедура получения трансгенных как стабильно, так и транзитно трансформированных культур клеток широко используется в современной молекулярно-биологической практике. Экстрахромосомные структуры транзитно трансформированных клеток несут специфические вирусные последовательности, селективные и маркерные гены, позволяющие им реплицироваться и определенное время сохраняться в реципиентных клетках. В научной литературе не описаны структуры, способные независимо реплицироваться и сохраняться в клетках на протяжении нескольких поколений, которые были бы образованы исключительно благодаря объединению фрагментов эукариотического экзогенного генома. Если предположить, что такая молекула появилась, то она должна обладать специфической последовательностью - Оп репликации, воспринимаемой молекулярной синтетической машиной реципиентной клетки. Такая структура без сформированного центромерного района должна хаотично (или в соответствии с неизвестными факторами) распределятся между дочерними клетками. При пролиферации определенной популяции клеток, содержащих такой стабильный отселектированный автономно реплицирующийся генетический материал, он может выявляться в молекулярных экспериментах как структура, обладающая уникальными молекулярными характеристиками (размер, рестрикционная карта, содержание определенных специфических последовательностей).

Интеграция чужеродного генетического материала в реципиентный геном в форме индивидуальных, пришедших извне фрагментов ДНК является третьей из возможностей поведения чужеродной ДНК. Известно, что экзогенная ДНК экстрахромосомной локализации может интегрировать в геном клетки-реципиента двумя способами: гомологичной и негомологичной (незаконной) рекомбинацией (Würtele et al., 2003). Интеграция с использованием механизма гомологичной рекомбинации зависит от репаративных факторов и достаточной гомологии между экзогенной ДНК и ДНК хромосомы (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Würtele et al., 2003). При интеграции по механизму незаконной рекомбинации экзогенная ДНК внедряется в негомологичные районы хромосом, используя объединение разорванных концов (Takata et al., 1998; Smith, 2001; Würtele et al., 2003; Lee et al., 2005). Интеграции и появлению в геноме информации, исходно экзогенной локализации, путем гомологичной или незаконной рекомбинации, способствует наличие в клетке двухцепочечных разрывов (ДЦР) хромосом (Pâques, Haber, 1999; Johnson, Jasin, 2000; Rodrigue et al., 2006).

В неповрежденной клетке с нормально функционирующими системами контроля прогрессии клеточного цикла интеграция экзогенной ДНК, по-видимому, происходить не может (Bergsmedh et al., 2002). Тем не менее, эксперименты по горизонтальному переносу генетического признака свидетельствуют о принципиальной возможности интеграции экзогенной ДНК в геном реципиентных клеток (Anker et al, 1980; Pulciani et al., 1982; García-Olmo et al., 1999; Holmgren et al., 1999; García-Olmo et al, 2000; Bergsmedh et al., 2002; Хегай и др., 2004).

Предполагается, что фрагменты экзогенной ДНК могут интегрировать в геном в двух случаях. Во-первых, при нарушениях в системе, контролирующей прогрессию клеточного цикла, как, например, в случае неотрансформированных клеток

Holmgren et al., 1999; Bergsmedh et al., 2002; Yakubov et al., 2007). А во-вторых, » при активированном состоянии репарационно-рекомбинационной машины клетки, например, при появлении ДЦР в молекуле ДНК хромосомы или при интеграции вирусной ДНК.

В предлагаемой работе мы попытались, используя две системы, а именно у-облучение и цитостатическую обработку кросслинкирующим агентом циклофосфаном (ЦФ), определить возможность участия фрагментов экзогенной двухцепочечной геномной ДНК в репаративном процессе при репарации ДЦР, возникающих в процессе таких обработок. Поскольку репарация ДЦР хромосомы предполагает объединение разорванных двухцепочечных концов молекулы ДНК, зависит от активированной репарационно-рекомбинационной машины клетки и возможна как при наличии гомологичного ДНК субстрата, так и без привлечения такового, то следствием участия фрагментов экзогенной ДНК в репаративном процессе могло бы быть появление стабильно существующих, структурно-функциональных генетических единиц чужеродного происхождения в соматических клетках взрослых экспериментальных животных (интегрированных в геном хозяина, либо существующих в форме автономно реплицирующихся молекул). Другим свидетельством появления экзогенного материала в геноме хозяина, произошедшего вследствие активации репарационно-рекомбинационной машины клетки, могло бы . быть обнаружение определенных изменений в организме, связанных и опосредованных таким появлением (репаративный процесс с использованием внешней гомологичной матрицы).

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является:

Характеристика явлений, связанных с участием фрагментов экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных у-радиацией и кросслинкирующим цитостатиком ЦФ. В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать радиопротекторное действие экзогенной ДНК при ее введении в организм экспериментальных животных после летальных доз у-облучения.

2. Исследовать совместное действие на организм мышей цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК.

3. Определить возможность поглощения экзогенной ДНК стволовыми клетками, растущими в культуре.

4. Изучить проникновение экзогенной ДНК в клетки костного мозга при введении в организм экспериментальных животных.

5. Провести молекулярно-генетический анализ геномной ДНК экспериментальных животных после совместного воздействия ЦФ и экзогенной ДНК.

Научная новизна. ,

1. Обнаружено, что экзогенная ДНК проявляет радиопротекторное действие при ее введении в организм экспериментальных животных в строго определенный момент времени после летальных доз у-облучения. Этот промежуток времени составляет 5-30 мин после быстрого (5-10 мин) набора организмом летальной дозы у-радиации. Спасение опытных животных связано с сохранением жизнеспособности стволовых клеток крови (СКК) в результате воздействия препарата ДНК.

2. Впервые обнаружен феномен гибели мышей при введении цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК в определенный момент времени.

3. Впервые высказано предположение, что для проявления в любой форме экзогенной генетической информации в реципиентной клетке необходимо присутствие фрагментов, экзогенной ДНК во внехромосомном пространстве ядер во время репарации ДЦР хромосом, вызванных у-радиацией или обработкой ЦФ.

Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют знания о роли экзогенной ДНК в репарационных процессах и могут быть использованы для дальнейших исследований воздействия экзогенной ДНК на организм высших эукариот, включая человека. Обнаруженный принцип истинного или транзитного трансгенеза чужеродным генетическим материалом при совместном воздействии экзогенной ДНК и агента, вызывающего появление ДЦР хромосомы, может стать новым направлением в генной терапии человека и животных.

Апробация работы. Результаты работы представлены в материалах II Съезда Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007 г.), Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири-2008» (Томск, 16-19 сентября 2008 г.) и Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009 г.). По теме диссертации опубликованы три работы. Две - в рецензируемом зарубежном журнале и одна - в рецензируемом отечественном журнале.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Работа с культурой ЭСК проводилась совместно с к.б.н. М.А. Прохорович. Эксперименты, связанные с лабораторными животными, проводились под руководством к.м.н. В.П. Николина и к.б.н. H.A. Поповой. Подсчет форменных элементов крови проводился совместно с Т.Д. Дубатоловой.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Лихачева, Анастасия Сергеевна

выводы

1. Экзогенная фрагментированная ДНК при ее введении в организм смертельно облученных мышей обладает ярко выраженным радиопротекторным действием. Эффект проявляется при введении ДНК в организм экспериментальных животных не позднее 30 мин после быстрого набора (в течение 5-10 мин) смертельной дозы у-радиации.

2. Инъекции экзогенной ДНК человека мышам, подвергшимся сублетальной 1 дозе у-облучения, приводят к формированию селезеночных колоний, которые являются потомками стволовых клеток крови.

3. Инъекции экзогенной ДНК человека в определенный момент времени после введения цитостатика циклофосфана , приводят к гибели экспериментальных животных. Максимальный летальный эффект наблюдается при введении ДНК каждый час в период 18-30 ч после циклофосфана.

4. Эмбриональные стволовые клетки человека способны поглощать из культуральной среды экзогенную ДНК. которая проникает в ядерное пространство клеток в виде фрагментов.

5. Экзогенная ДНК при введении в организм мышей проникает в ядра клеток костного мозга.

6. Во фракции геномной ДНК клеток соматических тканей экспериментальных животных, погибших после введения циклофосфана и экзогенной ДНК человека, при молекулярно-генетическом анализе выявляются последовательности ДНК человека.

102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ I

В предложенной работе описано 2 феномена. Первый - это спасение опытных животных после летальных и сублетальных доз у-радиации при введении экзогенной ДНК в течение 30 мин после быстрого набора в течение 5-10 мин дозы радиации. Второй - гибель мышей после воздействия цитостатика ЦФ и введения экзогенной ДНК в период времени 18-30 ч после этого.

Представлены результаты исследований, демонстрирующие участие экзогенной ДНК в репарационно-рекомбинационных процессах при повреждениях, индуцированных у-радиацией и кросслинкирующим цитостатиком ЦФ. Представлены экспериментальные доказательства появления экзогенного I генетического материала в соматических клетках организма экспериментальных мышей.

В работе показано, что радиопротекторное действие экзогенной ДНК проявляется при ее введении в организм экспериментальных животных в строго определенный момент времени после набора летальной дозы у-облучения. Спасение опытных животных связано с сохранением жизнеспособности СКК в результате воздействия препарата ДНК.

При введении экзогенной ДНК в организм экспериментальных животных после инъекции ЦФ в дозе 200 мг/кг веса отмечается более эффективное восстановление формулы крови. Инъекции экзогенной ДНК человека в определенный момент времени после введения ЦФ приводят к гибели экспериментальных животных. Мы предположили, что обнаруженное совместное действие препарата ДНК человека и цитостатика ЦФ вызывает нарушения, связанные с серьезными генетическими изменениями в клетках опытных животных вследствие трансгенеза фрагментами чужеродной ДНК.

Было определено, что экзогенная ДНК поглощается ЭСК человека, растущими в культуре, а также проникает в клетки костного мозга при ее введении в организм экспериментальных животных. Способность стволовых клеток захватывать экзогенную ДНК и транспортировать ее в ядерное пространство делает возможным участие фрагментов экзогенной ДНК в репаративном процессе при репарации ДЦР, возникающих в прогениторных клетках при воздействии жесткого у-излучения и I химического цитостатика ЦФ.

Используя в качестве ДНК зонда специфическую последовательность Alu повтора человека, был проведен молекулярно-генетический анализ фракции геномной ДНК экспериментальных животных после совместного воздействия ЦФ и экзогенной ДНК. В результате анализа было обнаружено, что фрагменты i человеческой ДНК достигают ядерного пространства клеток трех изученных органов - печени, тимуса, селезенки, и проявляются как стабильно присутствующие структурно-функциональные единицы клетки. Мы полагаем, что в проведенных экспериментах была осуществлена ЦФ-опосредованная in vivo трансгенная соматическая трансформация половозрелых мышей фрагментами экзогенной ксеногенной ДНК. При этом возможность транзитного трансгенеза не согласуется с совокупностью полученных фактов. В связи с этим мы рассматриваем только вторую возможность появления стабильно присутствующих структурно-функциональных единиц в клетке хозяине. Это истинная интеграция экзогенной ДНК в геном клеток экспериментальных животных.

Предполагается, что при проведенных обработках произошла генетическая трансформация определенной популяции клеток костного мозга. Выжившие трансформированные клетки мигрировали в соответствующие зоны тимуса или селезенки и дали дочерние колонии клеток. Геномы именно этих клеток содержат человеческую ДНК, которая и выявляется при проведенном молекулярно-генетическом анализе.

На основании полученных результатов и проведенного литературного анализа предполагается, что спасение СКК после у-облучения и интеграция экзогенной i

ДНК при введении цитостатика ЦФ связаны с активированным состоянием репарационно-рекомбинационной системы клетки, вызванным появлением ДЦР хромосом, и наличием свободно расположенных во внехромосомном пространстве ядра экзогенных фрагментов ДНК.

Мы полагаем, что принципиально противоположные эффекты влияния экзогенной ДНК на выживание экспериментальных мышей объясняются различными системами репарации, используемыми клеткой при удалении повреждений, возникающих при у-облучении и действии ЦФ. ДЦР, индуцируемые у-облучением, репарируются в S фазе с использованием механизма синтеза по гомологичной матрице (SSA). При этом не происходит нарушения структурнофункциональной целостности хромосом. В случае воздействия ЦФ образуются МЦС, при репарации которых, как обязательный интермедиат, возникают ДЦР. Восстановление ДЦР, происходящее в 8 фазе, предполагает использование как системы гомологичной рекомбинации, так и негомологичное объединение концов разорванной хромосомы. Во втором случае в клетке работает механизм с участием БА/ВЫСА лигазного комплекса, в норме предотвращающего появление транзитных ДЦР при репликации хромосом. Предполагается, что находящиеся в этот момент времени в непосредственной близости к месту ДЦР фрагменты экзогенной ДНК могут вовлекаться в процесс лигирования, что приводит к появлению в структуре хромосомы блоков чужеродного генетического материала. При такой интеграции нарушается структурно-функциональная целостность хромосом, что приводит к гибели клетки и, в конечном итоге, всего организма

Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет сделать I главный вывод из проделанной работы о том, что экзогенная ДНК принимает участие в репаративных процессах при репарации ДЦР, возникающих при у-облучении и воздействии кросслинкирующего цитостатика ЦФ.

101

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лихачева, Анастасия Сергеевна, Новосибирск

1. Акоев И.Г. Отдаленные последствия облучения в системе крови // Мед. радиол, 1968.-Т. 13. -№ 1.-С. 21-27.

2. Бриллиант М.Д., Воробьев А.И. Изменение некоторых показателейIпериферической крови при тотальном облучении человека // Проблемы гематологии и переливания крови. 1972. - № 1. - С. 7-11.

3. Гистология, цитология и эмбриология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, C.JI. Кузнецова, H.A. Юриной. М.: Медицина, 2004. - 768 с.

4. Гольдберг Е.Д., Голосов О.С., Потехин К.Г. Гематологические показатели у работников рентгенологических и радиологических отделений // Мед. радиол. 1961. - № 5. - С. 49-54.

5. Гриневич Ю.А., Демина Э.А. Иммунные и цитогенетические эффекты плотно- и редкоионизирующих излучений: Монография / Под ред. A.A. Ярилина. — К.: Здоровье, 2006. 200 с.

6. Заалишвили Г.Т., Цецхладзе З.Р., Маргиани Д.О. и др. ADP-рибозилирование усиливает расщепление петель ДНК в ядерном матриксе // Молек. биол. 2005. - Т. 39. - № 2. - С. 317-320.

7. Зайко H.H., Быць Ю.В., Атаман A.B. Патологическая физиология / М.: МЕДпресс-информ, 2007. 640 с.

8. Карибская Е.В., Матецкая Т.Э. Об изменениях в перииферической крови при лучевой терапии // Мед. радиол. 1962. - № 11. - С. 39-45.

9. Коггл Дж. Биологичеекие эффекты радиации: Пер. с англ. / М.: Энергоатомиздат, 1986.- 184 с.

10. Колчанов H.A., Шахмурадов И.А., Капитонов В.В., Омельянчук Л.В. Некоторые особенности эволюции повторов Alu , млекопитающих // Молек. биол. 1988. - Т. 22. - № 5. - С. 1335-1344.

11. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. М: Медицина, 1987. - 368 с.

12. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / М.: Мир, 1984. 480 с.

13. Муксинова К.Н., Мушкачева Г.С. Клеточные и молекулярные основы перестройки кроветворения при длительном радиационном воздействии / Под ред. А.К. Гуськовой. М.: Энергоатомиздат, 1990. - 156 с.

14. Перминова O.A. Состояние эритрона у крыс в отдаленные сроки послеtобщей лучевой тр»авмы // Радиобиология. 1985. - № 4. - С. 539-544.

15. Радиация. Дозы, эффекты, риск: Пер. с англ. / М.: Мир, 1990. 79 с.

16. Ройтберг Г.Е., Струтынский A.B. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний ¡внутренних органов / М.: Бином, 1999. 622 с.

17. Тамкович С.Н., Брызгунова O.E., Рыкова Е.Ю. и др. Циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови больных раком желудка и толстой кишки // Биомедицинская химия. 2005. - Т. 51. - С. 321-328.

18. Уманская О.Н., Юдинкова Е.С. Разин C.B., Быстрицкий A.A. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II в живых клетках стимулирует процесс незаконной рекомбинации // Докл. РАН. 2005. - Т. 405. - № 3. - С. 419-421.

19. Хегай И.И., Богачев С.С., Оськина И.Н. и др. Изменение симптоматики гипоталамического несахарного диабета после воздействия гомологическойIэкзогенной ДНК // Докл.РАН. 2004. - Т. 396. - № 4. - С. 571-573.

20. Челобанов Б.П., Лактионов П.П., Власов В.В. Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот // Биохимия. -2006. Т. 71. -№ 6. - С. 725-741.

21. Якубов Л.А., Петрова H.A., Попова H.A. и др. Роль экстраклеточной ДНК в поддержании постоянства и изменчивости клеточных геномов. // Докл. РАН. 2002. - Т. 382. - № 3. - С. 406-410.

22. Ярилин A.A. Действие ионизирующей радиации на лимфоциты (повреждающий и активирующий эффекты) // Имунология. 1988. - № 5. .— С.5-11.

23. Abaji C., Cousineau I., Belmaaza A. BRCA2 regulates homologous recombination in response to DNA damage: implications for genome stability and carcinogenesis // Cancer Res. 2005. - V. 65. - № 10. - P. 4117-4125.

24. Akkari Y.M., Bateman R.L., Reifsteck C.A. et al. DNA replication is required To elicit cellular responses to psoralen-induced DNA interstrand cross-links // Mol. Cell Biol. 2000. - V. 20. - № 21. - P. 8283-8289.

25. Amyere M., Mettlen M., Van Der Smissen P. et al. Origin, originality, functions, subversions and molecular signalling of macropinocytosis // Int. J. Med. Microbiol. 2002. - V. 291. - № 6-7. - P. 487-494.

26. Anker P. Quantitative aspects of plasma/serum DNA in cancer patients // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000. - V. 906. - P. 5-7.

27. Anker P., Jachertz D., Stroun M. et al. The role of extracellular DNA in the transfer of information from T to B human lymphocytes in the course of an immune response // J. Immunogenet. 1980. - V. 7. - № 6. - P. 475-481.

28. Anker P., Mulcahy H., Chen X.Q., Stroun M. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // Cancer Metastasis Rev. 1999.-V. 18. -№ 1. P. 65-73.

29. Ayares D., Chekuri L., Song K.Y., Kucherlapati R. Sequence homology requirements for intermolecular recombination in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986.-V. 83.-№ 14.-P. 5199-5203.

30. Bakkenist C.J., Kastan M.B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation // Nature. 2003. - V. 421. - № 6922.-P. 499-506.

31. Baricheva E.A., Berrios M., Bogachev S.S. et al. DNA from Drosophila melanogaster beta-heterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelope in situ // Gene. 1996. - V. 171. - № 2. - P. 171-176.

32. Bartsch S., Kang L.E., Symington L.S. RAD51 is required for the repair of plasmid double-stranded DNA gaps from either plasmid or chromosomal templates // Mol. Cell Biol. 2000. - V. 20. - № 4. - P. 1194-1205.

33. Bassing C.H., Swat W., Alt F.W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination // Cell. 2002. - V. 109. - P. 45-55.

34. Bennett R.M., Gabor G.T., Merritt M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA // J. Clin. Invest. 1985. - V. 76. - № 6. - P. 2182-2190.

35. Bergsmedh A., Szeles A., Henriksson M. et al. Horizontal transfer of oncogenes by uptake of apoptotic bodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - № 11.-P. 6407-6411.

36. Bergsmedh A., Szeles A., Spetz A.L., Holmgren L. Loss of the p21(Cipl/Wafl) cyclin kinase inhibitor results in propagation of horizontally transferred DNA // Cancer Res. 2002. - V. 62. - № 2. - P. 575-579.

37. Bhargava P.M., Shanmugam G. Uptake of nonviral nucleic acids by mammalian cells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1971. - V. 11. - P. 103-192.

38. Blunt T., Finnie N.J., Taccioli G.E. et al. Defective DNA-dependent protein kinase activity is linked to V(D)J recombination and DNA repair defects associated with the murine scid mutation // Cell. 1995. - V. 80. - № 5. - P. 813823.

39. Bodell W.J. Molecular dosimetry for sister-chromatid exchange induction and cytotoxicity by monofiinctional and bifunctional alkylating agents // Mutat. Res. -1990.-V. 233.-№ 1/2.-P. 203-210.

40. Bogerd H.P., Wiegand H.L., Hulme A.E. et al. Cellular inhibitors of long interspersed element 1 and Alu retrotransposition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006.-V. 103.-№23.-P. 8780-8785.

41. Bonner W.M. Low-dose radiation: thresholds, bystander effects, and adaptive responses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - № 9. - P. 4973-4975.

42. Borenfreund E., Bendich A. A study of the penetration of mammalian cells by deoxyribonucleic acids // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. - V. 9. - № 1. - P. 81-91.

43. Bredberg A., Lambert B., Soderhall S. Induction and repair of psoralen cross-links in DNA of normal human and xeroderma pigmentosum fibroblasts // Mutat. Res. -1982. V. 93. - № 1. - P. 221-234.

44. Britten R.J., Baron W.F., Stout D.B., Davidson E.H. Sources and evolution of human Alu repeated sequences // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. -№ 13.-P. 4770-4774.

45. Budker V., Budker T., Zhang G. et al. Hypothesis: naked plasmid DNA is taken up by cells in vivo by a receptor-mediated process // J. Gene Med. 2000. - V. 2. - № 2. - P. 76-88.

46. Bulavin D.V., Higashimoto Y., Popoff I J. et al. Initiation of a G2/M checkpoint after ultraviolet radiation requires p38 kinase // Nature. 2001. - V. 411. - № 6833.-P. 102-107.

47. Caspari T., Carr A.M. DNA structure checkpoint pathways in Schizosaccharomyces pombe // Biochimie. 1999. - V. 81. - № 1/2. - P. 173181.

48. Cobb J.A., Schleker T., Rojas V. et al. Replisome instability, fork collapse, and gross chromosomal rearrangements arise synergistically from Mecl kinase and RecQ helicase mutations // Genes Dev. 2005. - V. 19. - № 24. - P. 3055-3069.

49. Conner S.D., Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. -2003. V. 422. - № 6927. - P. 37-44.

50. Cortez D., Glick G., Elledge S.J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - № 27. P. - 10078-10083.

51. Cortez D., Guntuku S., Qin J., Elledge S.J. ATR and ATRIP: partners in checkpoint signaling// Science. -2001. -V. 294. -№ 5547. P. 1713-1716.

52. DAndrea A.D., Grompe M. The Fanconi anaemia/BRCA pathway // Nat. Rev. Cancer. 2003. - V. 3. - № 1. - P. 23-34.t

53. Dalbies R., Payet D., Leng M. DNA double helix promotes a linkage isomerization reaction in trans-diamminedichloroplatinum(II)-modified DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91.-№ 17.-P. 8147-8151.

54. Darby M.K., Schmitt B., Jongstra-Bilen J., Vosberg H.P. Inhibition of calf thymus type II DNA topoisomerase by poly(ADP-ribosylation) // The EMBO J. — 1985. — V. 4. -№ 8. -P. 2129-2134.

55. Dardalhon M., Averbeck D. Pulsed-Held gel electrophoresis analysis of the repair of psoralen plus UVA induced DNA photoadducts in Saccharomyces cerevisiae // Mutat. Res. 1995. - V. 336. -№ 1. - P. 49-60.

56. De Diesbach P., Berens C., N'Kuli F. et al Identification, purification and partial characterisation of an oligonucleotide receptor in membranes of HepG2 cells // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - № 4. - P. 868-874.

57. De Laat W.L., Appeldoorn E., Jaspers N.G., Hoeijmakers J.H. DNA structural elements required for ERCC1-XPF endonuclease activity // J. Biol. Chem. 1998.- V. 273. № 14. - P. 7835-7842.

58. De Silva I.U., McHugh P.J., Clingen P.H., Hartley J.A. Defining the roles ofnucleotide excision repair and recombination in the repair of DNA interstrandIcross-links in mammalian cells // Mol. Cell Biol. 2000. - V. 20. - № 21. - P. 7980-7990.i

59. Deng C., Capecchi M.R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus // Mol. Cell Biol. 1992.- V. 12.-№ 8.-P. 3365-3371.

60. Dronkert M.L., Beverloo H.B., Johnson R.D. et al Mouse RAD54 affects DNA double-strand break repair'and sister chromatid exchange // Mol Cell Biol. 2000.- V. 20. № 9. - P. 3147-3156.i

61. Drosophila: a practical approach / Edited by Roberts DB. Oxford-Washington, DC: IRL Press, 1986. - 295 pp.

62. Evans E., Fellows J., Coffer A., Wood R.D. Open complex formation around a lesion during nucleotide excision repair provides a structure for cleavage by human XPG protein // The EMBO J. 1997. - V. 16. - № 3. - P. 625-638.

63. Farzaneh F., Zalin R., Brill D., Shall S. DNA strand breaks and ADP-ribosyl transferase activation during cell differentiation // Nature. 1982. - V. 300. - № 5890.-P. 362-366.

64. Ferrari A., Pellegrini V., Arcangeli C. et al. Caveolae-mediated internalization of extracellular HIV-1 tat fusion proteins visualized in real time // Mol. Ther. 2003. -V. 8,-№2.-P. 284-294.

65. Fleming RA. An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology // Pharmacotherapy. 1997. -V. 17. - P. 146-154.

66. Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L. et al. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells // Mol. Reprod. Dev. 1993. -V. 34. -№ 2. - P. 133-139.

67. García-Olmo D., García-Olmo D.C., Ontañón J., Martinez E. Horizontal transfer of DNA and the «genometastasis hypothesis» // Blood. 2000. - V. 95. - № 2. -P. 724-725.

68. Giacona M.B., Ruben G.C., Iczkowski K.A. et al. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls // Pancreas. 1998. - V. 17. - № 1. - P. 89-97.

69. Gosden J., Lawson D. In-situ cyclic amplification of oligonucleotide primed synthesis (cycling PRINS) / In PCR Application Manual (Boehringer Mannheim Corp., ed.), Boehringer Mannheim Corp., Mannheim, Germany. 1995. P. 115118.

70. Gottlieb T.A., Ivanov I.E., Adesnik M., Sabatini D.D. Actin microfilaments play a critical role in endocytosis at the apical but not the basolateral surface of polarized epithelial cells//J Cell Biol.-1993.-V. 120.-№ 3.-P. 695-710.

71. Grenon M., Gilbert C., Lowndes N.F. Checkpoint activation in response to double-strand breaks requires the Mrel 1/Rad50/Xrs2 complex // Nat. Cell Biol. -2001. V. 3. - № 9. - P. 844-847.

72. Guo Z., Kumagai A., Wang S.X., Dunphy W.G. Requirement for Atr in phosphorylation of Chkl and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts // Genes Dev. 2000. - V. 14.-№21.-P. 2745-2756.i

73. Gupta A., Sharma G.G., Young C.S. et al. Involvement of human MOF in ATM function // Mol. Cell Biol. 2005. - Y. 25. - № 12. - P. 5292-5305.

74. Hagan C.R., Sheffield R.F., Rudin C.M. Human Alu element retrotransposition induced by genotoxic stress // Nat. Genet. 2003. - V. 35. - № 3. - P. 219-220.

75. Hall S.E. Savill J.S., Henson P., Haslett C. Apoptostic neutrophils are phagocytosed by fibroblast with participation of the fibroblast vitronectin receptor and involvement of mannose/fucose-specific lectin // J. Immunol. 1994. - V. 153.-P. 3218.

76. Hanss B., Leal-Pinto E., Bruggeman L.A. et al. Identification and characterization of a cell membrane nucleic acid channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95,-№4.-P. 1921-1926.

77. Harrington J.J., Lieber M.R. Functional domains within FEN-1 and RAD2 define a family of structure-specific endonucleases: implications for nucleotide excision repair//Genes Dev.-1994.-V. 8.-№ 11.-P. 1344-1355.

78. Hastings P.J., McGill C., Shafer B., Strathern J.N. Ends-in vs. ends-outrecombination in yeast // Genetics. 1993. - V. 135. - № 4. - P. 973-980.

79. Hebert E. Improvement of exogenous DNA nuclear importation by nuclear localization signal-bearing vectors: a promising way for non-viral gene therapy? // Biol. Cell. 2003. - V. 95. - № 2. - P. 59-68.

80. Hefeneider S.H., Bennett R.M., Pham T.Q. et al. Identification of a cell-surface DNA receptor and its association with systemic lupus erythematosus // J. Invest. Dermatol. 1990. -V. 94. - P. 79-84.

81. Helleday T. Pathways for mitotic homologous recombination in mammalian cells // Mutat. Res. 2003. - V. 532. - № 1/2. - P. 103-115.

82. Herz J., Strickland D.K. LRP: a multifunctional scavenger and signaling receptor // J. Clin. Invest. 2001. - V. 108. - № 6. - P. 779-784.

83. Holmgren L., Szeles A., Rajnavolgyi E. et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood. 1999. - V. 93. - № 11. - P. 3956-3963.

84. Ikura T., Ogryzko V.V., Grigoriev M. et al. Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis // Cell. 2000. - V. 102. - № 4. -P. 463-473.

85. Ira G., Haber J.E. Characterization of RAD51-independent break-induced replication that acts preferentially with short homologous sequences // Mol. Cell Biol. 2002. -V. 22. - № 18. - P. 6384-6392.

86. Jahr S., Hentze H., Englisch S. et al. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells // Cancer Res. 2001. - V. 61. - № 4. - P. 1659-1665.

87. Jasin M. Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases // Trends Genet. 1996. - V. 12. - № 6. - P. 224-228i

88. Johnson R.D., Jasin M. Sister chromatid gene conversion is a prominent doublestrand break repair pathway in mammalian cells // The EMBO J. 2000. - V. 19. -No 13.-P. 3398-3407.

89. Johnstone A.P., Williams G.T. Role of DNA breaks and ADP-ribosyl transferase activity in eukaryotic differentiation demonstrated in human lymphocytes // Nature. 1982. - V. 300. - № 5890. - P. 368-370.

90. Jurka J. Evolutionary impact of human Alu repetitive elements // Current. Opinion in Genetics and Development. 2004. - V. 14. - P. 1-6.

91. Kano Y., Fujiwara Y. Roles of DNA'interstrand crosslinking and its repair in the induction of sister-chromatid exchange and a higher induction in Fanconi's anemia cells //Mutat. Res. 1981. -V. 81. -№ 3. - P. 365-375.

92. Karle P., Renner M., Salmons B., Gunzburg W.H. Necrotic, rather than apoptotic, cell death caused by cytochrome P450-activated ifosfamide // Cancer Gene Ther. 2001. - V. 8.-№ 3. - P. 220-230.

93. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery // Pharmacol. Rev. 2006. - V. 58.-№ l.-P. 32-45.

94. Kimura A., Horikoshi M. Tip60 acetylates six lysines of a specific class in core histones in vitro // Genes Cells. 1998. - V. 3. - № 12. - P. 789-800.

95. Kohzaki M., Hatanaka A.j Sonoda E. et al. Cooperative roles of vertebrate Fbhl and Blm DNA helicases in avoidance of crossovers during recombination initiated by replication fork collapse // Mol. Cell Biol. 2007. - V. 27. - № 8. - P. 28122820.

96. Koulintchenko M., Konstantinov Y., Dietrich A. Plant mitochondria activity import DNA via the permeability transition pore complex // The EMBO J. 2003. -V. 22.-P. 1245-1254.

97. Kucherlapati R.S., Eves E.M., Song K.Y. et al. Homologous recombination between plasmids in mammalian cells can be enhanced by treatment of input DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. -V. 81. -№ 10. - P. 3153-3157.

98. Lambert S., Mason S.J., Barber L.J. et al. Schizosaccharomyces pombe checkpoint response to DNA interstrand cross-links // Mol. Cell Biol. 2003. - V. 23. -№ 13.-P. 4728-4737.

99. Lambert S., Watson A., Sheedy D.M. et al Gross chromosomal rearrangements and elevated recombination at an inducible site-specific replication fork barrier // Cell. 2005. - V. 121. - № 5. - P. 689-702.

100. Langston L.D., Symington L.S. Gene targeting in yeast is initiated by twoiindependent strand invasions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101. - № 43.-P. 15392-15397.

101. Lawen A. Apoptosis-an introduction // Bioessays. 2003. - V. 25. - № p. - P. 888-896.

102. Leal-Pinto E., Teixeira A., Tran B. et al. Presence of the nucleic acid channel in renal brush-border membranes: allosteric modulation by extracellular calcium // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2005. - V. 289. - № 1. - P. 97-106.

103. Ledoux L. Uptake of DNA by living cells // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. -1965.-V. 4.-P. 231-267.

104. Ledoux L., Charles P. Fate of exogenous DNA in mammals / In Uptake of Informative Molecules by Living Cells. Ed. L. Ledoux. North-Holland Publishing Company, Amsterdam. 1972. P. 397-413.

105. Lee S.H., Oshige M., Durant S.T. et al. The SET domain protein Metnase mediates foreign DNA integration and links integration to nonhomologous end-joining repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - № 50. - P. 18075-18080.

106. Lees-Miller S.P., Meek K. Repair of DNA double strand breaks by nonhomologous end joining//'Biochimie. 2003.-V. 85.-№ 11.-P. 1161-1173.

107. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M., Yaros M.J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy // Cancer Res. 1977. - V. 37. - № 3. -P. 646-650.

108. Leung W., Malkova A., Haber J.E. Gene targeting by linear duplex DNA frequently occurs by assimilation of a single strand that is subject to preferential mismatch correction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - № 13. - P. 6851-6856.

109. Li J., Read L.R., Baker M.D. The mechanism of mammalian gene replacement is consistent with the formation of long regions of heteroduplex DNA associated with two crossing-over events // Mol. Cell Biol. 2001. - V. 21. - № 2. - P. 501510.

110. Li L., Peterson C.A., Lu X. et al. Interstrand cross-links induce DNA synthesis in damaged and undamaged plasmids in mammalian cell extracts // Mol. Cell Biol. 1999.-V. 19.-№8.-P. 5619-5630.

111. Liang F., Han M., Romanienko P.J., Jasin M. Homology-directed repair is a majoridouble-strand break repair pathway in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. -№ 9. - P. 5172-5177.

112. Lin J., Krishnaraj R., Kemp R.G. Exogenous ATP enhances calcium influx in intact thymocytes // J. Immunol. 1985. - V. 135. - № 5. - P. 3403-3410.

113. Lin Y., Waldman A.S. Capture of DNA sequences at double-strand breaks in mammalian chromosomes // Genetics. 2001. - V. 158. - № 4. - P. 1665-1674.

114. Lisby M., Barlow J.H., Burgess R.C., Rothstein R. Choreography of the DNA damage response: spatiotemporal relationships among checkpoint and repair proteins // Cell. 2004. - V. 118. - № 6. - P. 699-713.

115. Liu Q., Guntuku S., Cui X.S. et al. Chkl is an essential kinase that is regulated by Atr and required for the G(2)/M DNA damage checkpoint // Genes Dev. 2000. -V. 14. - № 12. - P. 1448-1459.

116. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Characterization of oligonucleotide transport into living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - № 10.p. 3474-3478.

117. Ludtke J J., Zhang G., Sebestyen M.G., Wolff J. A. A nuclear localization signal can enhance both the nuclear transport and expression of 1 kb DNA // J. Cell Sci. 1999.-V. 112.-P. 2033-2041.

118. MacDougall C.A., Byun T.S., Van C. et al. The structural determinants of checkpoint activation // Genes Dev. 2007. - V. 21. - № 8. - P. 898-903.

119. Magnano A.R., Giordano R., Moscufo N. et al. Sperm/DNA interaction: integration of foreign DNA sequences in the mouse sperm genome // J. Reprod. Immunol. 1998.-V. 41.-№ 1-2.-P. 187-196.

120. Malkova A., Ivanov E.L., Haber J.E. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93.-№ 14.-P. 7131-7136.

121. Matveev S., Li X., Everson W., Smart E.J. The role of caveolae and caveolin in vesicle-dependent and vesicle-independent trafficking // Adv Drug Deliv Rev. -2001. V. 49. - № 3. - P. 237-250.

122. McHugh P.J., Sones W.R., Hartley J.A. Repair of intermediate structures produced at DNA interstrand cross-links in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. - № 10. - P. 3425-3433.

123. McHugh P.J., Spanswick V.J., Hartley J.A. Repair of DNA interstrand crosslinks: molecular mechanisms and clinical relevance // Lancet Oncol. 2001. - V. 2. - № 8.-P. 483-490.

124. Mu D., Bessho T., Nechev L.V. et al. DNA interstrand cross-links induce futile repair synthesis in mammalian cell extracts // Mol. Cell Biol. 2000. - V. 20. - № 7.-P. 2446-2454.

125. Mu D., Hsu D.S., Sancar A. Reaction mechanism of human DNA repair excision nuclease // J. Biol. Chem. 1996. - v. 271. - № 14. - P. 8285-8294.

126. Mu D., Park C.H., Matsunaga T. et al. Reconstitution of human DNA repair excision nuclease in a highly defined system // J. Biol. ¿hem. 1995. - V. 270. -№6.-P. 2415-2418.

127. Niedernhofer L.J., Odijk H., Budzowska M. et al. The structure-specific endonuclease Erccl-Xpf is required to resolve DNA interstrand cross-link-induced double-strand breaks // Mol. Cell Biol. 2004. - V. 24. - № 13. - P. 5776-5787.

128. O'Donovan A., Davies A.A., Moggs J.G. et al. XPG endonuclease makes the 3' incision in human DNA nucleotide excision repair // Nature. 1994. - V. 371.6496.-P. 432-435.

129. Orr-Weaver T.L., Szostak J.W., Rothstein RJ. Yeast transformation: a model system for the study of recombination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78.-№ 10.-P. 6354-6358.

130. Palom Y., Suresh Kumar G., Tang L.Q. et al. Relative toxicities of DNA crosslinks and monoadducts: new insights from studies of decarbamoyl mitomycin C and mitomycin C // Chem. Res. Toxicol. 2002. - V. 15. - № 11. - P. 1398-1406.

131. Pâques F., Haber J.E. Multiple pathways of recombination induced by doublestrand breaks in Saccharomyces cerevisiae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. -V. 63.-№2.-P. 349-404.

132. Park C.H., Bessho T., Matsunaga T., Sancar A. Purification and characterization of the XPF-ERCC1 complex of human DNA repair excision nuclease // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - № 39. - P. 22657-22660.

133. PCR Application Manual (Boehringer Mannheim Corp., ed.), Boehringer Mannheim Corp., Mannheim, Germany. 1995. P. 26-41.

134. Pedraza-Alva G., Koulnis M., Charland C. et al. Activation of p38 MAP kinase by DNA double-strand breaks in V(D)J recombination induces a G2/M cell cycle checkpoint // The EMBO J. 2006. - V. 25. - № 4. - P. 763-773.

135. Perucho M., Hanahan D., Wigler M. Genetic and physical linkage of exogenous sequences in transformed cells // Cell. 1980. - V. 22. - P. 309-317.

136. Peterson C.L., Côté J. Cellular machineries for chromosomal DNA repair // Genes Dev. 2004. - V. 18. - № 6. - P. 602-616.

137. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. -№ 9. -P. 2934-2938.

138. Pulciani S., Santos E., Lauver A.V. et al. Oncogenes in solid human tumours // Nature. 1982,-V. 300.-№ 5892.-P. 539-542.

139. Rattray A.J., McGill C.B., Shafer B.K., Strathern J.N. Fidelity of mitotic double-strand-break repair in Saccharomyces cerevisiae: a role for SAE2/COM1 // Genetics.-2001.-V. 158.-№ l.-P. 109-122.

140. Reddy Y.V., Perkins E.J., Ramsden D.A. Genomic instability due to V(D)J recombination-associated transposition // Genes Dev. 2006. - V. 20. - № 12. -P. 1575-1582.

141. Rodewald H.R., Fehling H J. Molecular and cellular events in early thymocyte development // Adv. Immunol. 1998. - V. 69. - P. 1-112.

142. Rodrigue A., Lafrance M., Gauthier M.C. et al. Interplay between human DNA repair proteins at a unique double-strand break in vivo // The EMBO J. 2006. -V. 25.-№ l.-P. 222-231.

143. Rogachev V.A., Likhacheva A., Vratskikh O. et al. Qualitative and quantitative characteristics of the extracellular DNA delivered to the nucleus of a living cell // Cancer Cell Int. 2006. - V. 6. http://www.cancerci.cOm/content/6/l/23.

144. Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo // J. Cell Biol. 1999. - V. 146. -№5.-P. 905-916.

145. Rothfiiss A., Grompe M. Repair kinetics of genomic interstrand DNA cross-links: evidence for DNA double-strand break-dependent activation of the Fanconi anemia/BRCA pathway // Mol. Cell Biol! 2004. - V. 24. - № 1. - P. 123-134.

146. Rouet P., Smih F., Jasin M. Introduction of double-stand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease // Mol. Cell Biol. -1994.-V. 14.-№ 12.-P. 8096-8106.

147. Rubnitz J., Subramani S. The minimum amount of homology required for homologous recombination in mammalian cells // Mol. Cell Biol. 1984. - V. 4. -№ 11.-P. 2253-2258.

148. Saffran W.A., Ahmed S., Bellevue S. et al. DNA repair defects channel interstrand DNA cross-links into alternate recombinational and error-prone repair pathways // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - № 35. - P. 36462-36469.

149. Savill J., Fadok V., Henson P., Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis // Immunol. Today. 1993. - V. 14. - № 3. - P. 131-136.

150. Schildkraut E., Miller C.A., Nickoloff J.A. Transcription of a donor enhances its use during double-strand break-induced gene conversion in human cells // Mol. Cell Biol. 2006. - V. 26. - № 8. - P. 3098-3105.

151. Scott S.P., Pandita T.K. The cellular control of DNA double-strand breaks // J. Cell Biochem. 2006. - V. 99. - № 6. - P. 1463-1475.

152. Shi F., Gounko N.V., Wang X. et al. In situ entry of oligonucleotides into brain cells can occur through a nucleic acid channel // Oligonucleotides. 2007. - V. 17.-№ 1.-P. 122-133. ,

153. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis // Cell. 1984. - V. 37. - № 1. - P. 6775.

154. Sinden R.R., Cole R.S. Repair of cross-linked DNA and survival of Escherichia coli treated with psoralen and ligyt: Effects of mutations influencing geneticrecombination and DNA metabolism // J. Bacteriol. 1968. - V. 136. - P. 538547.

155. Smith A.J., Berg P. Homologous recombination between defective neo genes in mouse 3T6 cells // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1984. - V. 49. - P. 171-181.

156. Smith K. Theoretical mechanisms in targeted and random integration of transgene DNA // Reprod. Nutr. Dev. 2001. - V. 41. - № 6. - P. 465-485.

157. Stanyon R., Galleni R. A rapid fibroblast culture technique for high resolution karyotypes // Ital. J. Zool. 1991. - V. 58. - № 1. - P. 81-83.

158. Stiff T., O'Driscoll M., Rief N. et al. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation // Cancer Res. 2004. -V. 64.-P. 2390-2396.

159. Storici F., Bebenek K., Kunkel T.A. et al. RNA-templated DNA repair I I Nature. -2007. -V. 447. № 7142. - P. 338-341.

160. Sun Y., Jiang X., Chen S.' et al. A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102.-№37.-P. 13182-13187.

161. Syljuasen R.G., Sorensen C.S., Hansen L.T. et al. Inhibition of human Chkl causes increased initiation of DNA replication, phosphorylation of ATR targets, and DNA breakage // Mol. Cell Biol. 2005. - V. 25. - № 9. - P. 3553-3562.

162. Symington L.S. Focus on recombinational DNA repair // The EMBO Rep. 2005. -V. 6.-№ 6. -P. 512-517.

163. Takata M., Sasaki M.S., Sonoda E. et al. Homologous recombination and nonhomologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair haveoverlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cellsi

164. The EMBO J. 1998.-V. 17.-№ 18.-P. 5497-5508.

165. Takata M., Sasaki M.S., Sonoda E. et al. The Rad51 paralog Rad51B promotes homologous recombinational repair // Mol. Cell Biol. 2000. - V. 20. - № 17. -P. 6476-6482.

166. Thomas K.R., Deng C., Capecchi M.R. High-fidelity gene targeting in embryonic stem cells by using sequence replacement vectors // Mol. Cell Biol. 1992. - V. 12. -№ 7. - P. 2919-2923.

167. Thomas K.R., Folger K.R., Capecchi M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome // Cell. 1986. - V. 44. - № 3. - P. 419428.

168. Tibbetts R.S., Brumbaugh K.M., Williams J.M. et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53 // Genes Dev. 1999. - V. 13. - № 2. -P. 152-157.

169. Van Houten В., Gamper H., Holbrook S.R., Hearts J.E., Sancar A. Action mechanism of ABC excision nuclease on a DNA substrate containing a psoralen crosslink at a defined position // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - № 21.-P. 8077-8081.

170. Vatolin S.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M. et al. Scheduled perturbation in DNA during in vitro differentiation of mouse embryo-derived cells // Mol. Reprod. Dev. 1997.-V. 47. -№ 1,- P. 1-10.

171. Wang X., Peterson C.A., Zheng H. et al. Involvement of nucleotide excision repair in a recombination-independent and error-prone pathway of DNA interstrand cross-link repair // Mol. Cell Biol. 2001. - V. 21. - № 3. - P. 713-720.

172. Ward I.M., Chen J. Histone H2AX is phosphorylated in an ATR-dependent manner in response to replicational stress // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - № 51.-P. 47759-47762.

173. Wolff J.A., Dowty M.E., Jiao S. et al. Expression of naked plasmids by cultured myotubes and entry of plasmids into T tubules and caveolae of mammalian skeletal muscle // J. Cell Sci. 1992. - V. 103. - P. 1249-1259.

174. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo // Science. 1990. - V. 247. - № 4949. - P. 1465-1468.

175. Wurtele H., Little K.C., Chartrand P. Illegitimate DNA integration in mammalian cells//Gene Ther.-2003.-V. 10. -№21. -P. 1791-1799.1. S>Jf

176. Yakubov L.A., Popova N.A., Nikolin V.P. et al. Extracellular genomic DNA protects mice against radiation and chemical mutagens I I Genome Biol. 2003. -V. 5.-P. 3.

177. Yakubov L.A., Rogachev V.A., Likhacheva A.C. et al. Natural human gene correction by small extracellular genomic DNA fragments // Cell Cycle. 2007. -V. 6. - № 18.-P. 2293-2301.

178. Yamamoto T., Horikoshi M. Novel substrate specificity of the histone acetyltransferase activity of HIV-1-Tat interactive protein Tip60 // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 49. - P. 30595-30598.

179. Yu L.J., Drewes P., Gustafsson K. et al. In vivo modulation of alternative pathways of P-450-catalyzed cyclophosphamide metabolism: impact on pharmacokinetics and antitumor activity // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999. - V. 288.-№3.-P. 928-937.

180. Zamecnik P., Aghajanian J., Zamecnik M. et al. Electron micrographie studies of transport of oligodeoxynucleotides across eukaryotic cell membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91. -№ 8. - P. 3156-3160.

181. Zou L., Elledge S.J. Sensing DNA damage through ATRIP recognition of RPA-ssDNA complexes // Science. 2003. - V. 300. -№ 5625. P. 1542-1548.