Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe

Федянина, Ольга Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe"

На правах рукописи

ФЕДЯНИНА Ольга Сергеевна

Исследование роли тубулинового кофактора Б в митозе у делящихся дрожжей ЗсМгоъассИаготусеь ротЬе

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003456619

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Гематологический Научный Центр РАМН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов ФГУП «ГосНИИгенетика»

кандидат биологических наук, М.А. Эршлер Гематологический Научный Центр РАМН

Ведущая организация: Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН

со

.защита диссертации состоится « » 2008 года

о7 7

на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекц промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан « /3 » И-ОЛ^/ъЖ. 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук —Г.Г. Заиграева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Понимание механизмов клеточного деления - это одна из важнейших задач современных биомедицинских исследований. Одной из ключевых фаз клеточного цикла является митоз. В процессе митоза происходит разделение генетической информации. Это осуществляется путем конденсации хроматина, "созревания" кинетохоров и образования веретена деления из микротрубочек. Взаимодействие микротрубочек с кинетохорами обеспечивает правильное закрепление и сегрегацию хромосом в процессе митоза. Неправильная сегрегация хромосом может привести к возникновению тяжелых заболеваний или гибели. Поэтому во время клеточного деления процесс сегрегации хромосом тщательно контролируется системой митотического контроля, называемой чекпойнтом веретена деления. Функция этой системы заключается в задерживании стадии расхождения хромосом до тех пор, пока все хромосомы не будут правильным образом прикреплены к микротрубочкам и биориентированы относительно полюсов деления. Микротрубочки являются важнейшим компонентом цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании формы клетки, в транспорте органелл и становятся жизненно необходимы в митозе. Именно поэтому они являются одними из главных мишеней для противоопухолевых препаратов. Микротрубочки это динамичные биополимеры, состоящие из сф-гетеродимеров тубулина. Повышение уровня свободного а- и (3-тубулина токсично для клеток и жестко регулируется (Cleveland et al. 1981). В формировании аР-гетеродимеров тубулина участвует пять кофакторов: А, В, С, D, Е (Szymanski 2002). Кофакторы сборки тубулиновых сф-гетеродимеров это эволюционно консервативные белки у эукариот от дрожжей до человека (Lewis et al. 1997; Szymanski 2002). Было показано, что мутации в гене, кодирующем кофактор Е, который является партнером кофактора D в пути сборки тубулиновых димеров, приводит к возникновению у человека тяжелых синдромов, приводящих к гипопаротироидизму, задержке умственного развития и лицевому дисморфизму (Parvari et al. 2002). Эти заболевания вызваны нарушениями димеризации тубулина и недостатком микротрубочек. Лучше всего биохимический путь формирования димеров изучен in vitro на выделенных белках быка (Tian et al. 1996; Tian et al. 1997; Tian et al. 1999). Кофакторы действуют на финальном этапе образования третичной структуры а- и (3-тубулинов, способствуя формированию собственно сф-гетеродимера. Кофакторы В и А связываются с а- и Р-тубулином соответственно (Tian et al. 1996), затем они передают а- и р-тубулины кофакторам Е и D (Tian et al. 1997) соответственно, которые вместе с тубулинами образуют тетрамерный комплекс. Присоединение кофактора С и последующий гидролиз ГТФ завершают сборку димера (Tian et al. 1999).

Изучение пути свертывания тубулиновых димеров у различных организмов показало, что есть вариации в работе этого пути. Например, у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), как и у высших эукариот, кофакторы жизненно необходимы для сборки тубулиновых димеров. А у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) путь сборки тубулиновых димеров не является жизненно необходимым и это указывает на то, что пути формирования димеров у высших эукариот и у делящихся дрожжей S. pombe имеют больше общего, чем у S. cerevisiae. Основным отличием пути формирования у делящихся дрожжей S. pombe от высших эукариот является ведущая роль кофактора D в сворачивании тубулиновых димеров (Radcliffe et al. 1999). Достоинством делящихся дрожжей, как объекта исследования, является простота различных генетических манипуляций, в отличие от клеток высших эукариот. Хотя у S. pombe путь формирования димеров жизненно необходим, однако были получены мутации в генах, кодирующих кофакторы сборки тубулиновых димеров, приводящие к температурочувствительности клеток: клетки с такими мутациями жизнеспособны в определенном диапазоне температур и не жизнеспособны либо при повышении (температурная чувствительность), либо при понижении (холодочувствительность) температуры. Подобные мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к исчезновению микротрубочек в клетках при росте на запрещающей температуре (Grishchuk and Mcintosh 1999; Hirata et al 1998; Radcliffe et al.l 999; Radcliffe et al. 2000a). Есть основания думать, что тубулин-свертывающие кофакторы помимо сворачивания димеров, обладают и рядом других функций в клетке. Так было показано, что кофакторы D, Е и В в клетках животных при переизбытке обладают способностью разрушать димеры тубулина (Kortazar et al. 2006, 2007). Также, температурочувствительная мутация alpl-tl в гене, кодирующем кофактор D у S. pombe, генетически взаимодействует с мутациями в генах, кодирующих компоненты Комплекса Инициирующего Анафазу и протеасомы (Grishchuk et al. 1998). Мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к разрушениям структур микротрубочек, что впоследствии приводит к неправильному делению клетки. Однако какие стадии митоза нарушаются при отсутствии функции кофакторов до настоящего времени не было известно. Этот вопрос являлся целью данной работы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа делалась с целью выявить возможную роль кофактора D, участвующего в формировании нативной конформации тубулинового димера, в митозе.

Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач: 1. Определить частоту возникновения дефектов сегрегации хромосом в клетках S. pombe с мутациями кофактора D при помощи минихросомы, и определить, зависит ли она от условий роста клеток и функционального состояния кинетохорных комплексов.

2. С помощью генетических методов определить возможных "партнеров" кофактора Б в клетке среди белков кинетохорного комплекса.

3. С помощью методов флуоресцентной микроскопии определить какие митотические процессы нарушены в клетках с мутациями кофактора Б.

4. Исследовать причины, приводящие к медленному развитию митотических нарушений в клетках с мутациями, используя различные методы синхронизации клеточного цикла.

Научная новизна. В работе показано, что клетки с мутациями кофактора О а1р1-1315 и <з/р/-// имеют повышенную частоту потери минихромосомы. Мутанты кофактора Б генетически взаимодействует с компонентами кинетохора Мас12, МрЫ, АЬр1, что предполагает существенную роль кофактора О в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой. Оба мутанта кофактора Б имеют дефекты в прохождении метафазы. Также показано, что температурочувствительный фенотип а1р1-1315 не связан с прохождением определенной фазы клеточного цикла при запрещенной температуре, белок А1р1-1315 перестает выполнять свою функцию уже после 2 часов пребывания при 36°С независимо от стадии клеточного цикла. Это означает, что в клетках с мутацией в гене, кодирующем кофактор, Б сф-губулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла при 36°С.

Практическая значимость. Сбой в контроле клеточного деления приводит к патологическим событиям для клетки, таким как гибель или неконтролируемый рост. Исследование различных аспектов клеточного деления позволяет продвинуться в понимании фундаментальных механизмов, обеспечивающих правильность клеточного делениям. Кроме этого, было показано, что нарушение димеризации тубулина и недостаток микротрубочек приводит к возникновению у человека тяжелых заболеваний, таких как синдромы Бащас^ЗакаИ и Кеппу-СаГГсу (Рагуап е1 а1. 2002). Поэтому исследование функции шаперонов тубулина является важной задачей, которая может иметь практическое значение для лечения подобных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Мутации в кофакторе Б приводят к повышению частоты потери минихромосомы. Степень этого эффекта зависит от условий роста клеток, от нарушений функционирования кинетохора, вызванного изменением уровня СЕЫР-В-подобного белка АЬр1р, а также от нормального функционирования митотического чекпойнта.

2. Генетические взаимодействия мутантов кофактора Б указывают на то, что возможными партнерами кофактора Б среди белков кинетохорного комплекса являются белки АЬр] и ЕЯб! .

3. Нарушение функции кофактора D приводит к неправильной сегрегации хромосом скорее всего из-за отсутствия нормальной метафазной конфигурации. Этот дефект может быть вызван проблемами с поддержанием метафазной структуры веретена и/или нарушениями кинетохор-микротрубочковых взаимодействий.

4. Гибель мутантов кофактора D через 4 часа после перевода клеток в условия, нарушающие работу этого белка, скорее всего, связана с тем, что при отсутствии функции кофактора D, aß-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении только одного клеточного цикла.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описаиия материалов и методов, главы 3 — описание экспериментальных результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 152 источников. Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.).

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН "Биохимия, биофизика и реология крови" 20 марта 2008 года, а также на заседании секции "Молекулярная Биология" Ученого Совета ФГУП "ГосНИИгенетика" 13 октября 2008 года.

Материалы диссертации докладывались на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, октябрь 2001 г.), на международной конференции "Molecular genetics of eucaryotes" (Москва, февраль 2003 г.), на Ш-м Съезде биофизиков России (Воронеж, июнь 2004 г.), на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, ноябрь 2002 г.).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в сборниках трудов 4 конференций и 2 статьи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Среды и условия роста S. pombe. Все штаммы использованные в данной работе описаны в Таблице 1. Все среды и условия роста S. pombe описаны в (Moreno et al. 1991): YES (Yeast Extract with Supplements) - богатая среда; EMM (Edinburg Minimal Medium) - минимальная среда; MEA (Malt Extract with Agar) - среда для проведения скрещиваний делящихся дрожжей. Для получения твердой среды добавлялся 2% агара Difco (Detroit). Для оценки жизнеспособности клеток в среду добавляли флоксин В (сокращенно PhB), Sigma (St. Louis) в концентрации 5 мг/л, который окрашивает нежизнеспособные клетки в красный цвет. Штаммы с температурочувствительными

мутациями ( такие как alpI-1315, alpl-tl) выращивали при температуре 25°С. Штаммы дикого типа, штаммы с холодочувствительными мутациями (такой как Aclis 1+) выращивали при температуре 32°С Концентрация клеток в жидкой культуре определялась посредством подсчета под микроскопом в камере Горяева.

Генетические методы.

В работе использовались стандартные генетические методы, описанные в (Moreno et al. 1991). Для получения двойных мутантов были использованы методы тетрадного анализа и метод случайных спор.

Метод случайных спор. Свежие клетки, имеющие разные типы спаривания смешивали с добавлением стерильной воды на MEA. Чашку со смешанными штаммами инкубировали 2 дня при 25°С. Через два дня образуются конъюгаты из двух клеток разного типа спаривания, которые спорулируют и превращаются в аски. Образование асков визуально контролировали под микроскопом. Далее с чашки отбирали ~ 10-50 мкл материала,ресуспендировали в 1 мл воды и инкубировали с 2и фермента глусилазы в течение 2 суток для лизиса оболочки аска. Далее споры проращивали на питательной среде на 25°С или 32°С и анализировали потомство при помощи отпечатков на разные среды и температуры.

Метод тетрадного анализа. Этот метод позволяет проследить за потомством двух конкретных клеток, что является преимуществом при получении двойных мутантов в том случае, когда их нельзя однозначно определить по фенотипу. Клетки скрещивали и получали аски, как описано в методе случайных спор. Полученные аски наносили в небольшом количестве на чашку, с богатой средой. Полные тетрады (аски, содержащие 4 споры) при помощи микроскопа с микроманипулятором (Zeicc) переносили на позиции, затем чашку инкубировали при разрешающей температуре; через 4-6 часов тетрады разваливаются на споры, после чего споры переносили на позиции в группы, соответствующие каждой тетраде. Далее споры выращивали при разрешающей температуре. Анализ потомства проводили при помощи отпечатков на разные среды и температуры.

Методы клеточной и молекулярной биологии.

Трансформация клеток S. pombe. Для трансформации плазмид pSp200, pSp200-abpl* (предоставлены L. Clarke) в клетки S. pombe использовался "ацетатно-литиевый" метод (Moreno et al 1991) в упрощенном варианте. Свежие клетки S. pombe, обрабатывали 0,1 М ацетата лития (Fluka) pH 5.0, ресуспендировали в том же растворе до конечного объема 100 мкл. и добавляли плазмидную ДНК и ДНК-носитель (Hering Sperm DNA (Promega). Затем инкубировали в присутствии 50% PEG

Таблица 1. Штаммы S. pombe, использованные в работе

Штамм Генотип Источник

SPW2 972Л" Лаб коллекция

SPW20 leul-32 ura4-DI8 h' Лаб коллекция

Мс1#468 aIpl-1315 К Эта работа

SP26 alpl-ll leul-32 ura4-D18 h" Grishchuk et al. 1998

SP 88 alpl-tl Amad2::ura4* ade6-M216 leul-32 ura-f h~ Эта работа

SP79 alpl-ll misl2:HA LEU2 leul-32 ura4-D18 К Эта работа

SPM190 alpl-ll Alisl::uraS leul-32 ura4-D18 A" Эта работа

SPM112 alpl-1315 leul-32 um4-D18 К Hirataetal 1998

SPM201 alpl-1315 Лmad2::ura-f ade6-M216 leul-32 ura-Г h~ Эта работа

SPM 155 alpl-1315 misl2:HA LEU2 leul-32 ura4-D!8 li Эта работа

SPW62 misI2:HA LEU2 leul-32 ura4-D18K Goshima et al. 1999

SPM 122 Aabpl::vra4* ade6-M216 leul-32 ura4-D18 li Halverson et al 1997

Мс№535 Msl::ura4* leul-32 ura4-D18 К Nabeshima et al. 1995

SPM 191 Amad2::ura4*ade6-M216 leul-32 ura4-DS'E h~ He et al. 1997

SPM114 mis6-302 leul-32 ura4-D18ti Takahashi et al. 1994

SPM 115 misl2-537 leul-32 ura4-D18 h" Takahashi etal. 1994

SPM 125 misl2-537 Aabp!::uraf leul-32 ura4-D18 h~ Эта работа

SPM70 nda2-52 leul-32 ura4-D18 К Toda et al. 1983

SPM64 nda3-311 leul-32 ura4-D!8 If Toda et al. 1983

SPM173 cdc25-22 leul-32 ura4-D18 h" Ogden and Fantes 1986

SPM 154 cdc25-22 alpl-1315 leul-32 ura4-D18 h~ Эта работа

SPW60 ade6-704 leul-32 ura4-D18 /i/pSp(cenl)-7L-sup3E/pSp200 Halverson etal. 1997

SPW61 ade6-704 leul-32 ura4-D18h'l pSp(cenl)-7L-sup3E/pSp200-ijb/>/* Halverson et al. 1997

SP 77 alpl-tl ade6-704 leul-32 ura4-D18 /i'/pSp(cenl)-7L- sup3E/ pSp200 Эта работа

SP 78 alpl-tl ade6-704 leul-32 ura4-D18 /i\'pSp(ccnl>7L-sup3E/ pSp200-аЬрГ Эта работа

SPM 151 alpl-1315 ade6-704 leul-32 ura4-D18 fc"/pSp(cenl)-7L-sup3E/ pSp200 Эта работа

SPM152 alpl-1315 ade6-704 leul-32 ura4-D18 /i7pSp(cenl)-7L-sup3E/ pSp200-abpl* Эта работа

3350 (Sigma) 14 часов.Далее отмывали в 1 мл !4YES (пополам с водой) и инкубировали в течение 20 минут при 25°С, инкубировали 2 часа, а затем высевали на селективную среду без лейцина.

Измерение частоты потери мннихромосомы pSp(cenl)-7L-sup3E. Штамм с минихромосомой pSp(cenl)-7L-sup3E (SPW52) предоставлен L.Clarke, (Halverson et al. 1997). Измерение частоты потери минихромосомы производилось методом,

основанном на проявлении адениновой ауксотрофности и описанном в (Hieter el al. 1985). Клетки, содержащие плазмиды, pSp200 или pSp200-abpl*, и мшшхромосому pSp(cenl)-7L-sup3E, растили в EMM без добавок при температуре 25°С до концентрации 1-5x106 клеток/мл и высевали на среду YES+l/25ade (стандартная среда YES с концентрацией зденина, пониженной в 25 раз (10 мкг/мл). Так как исходно в клетках содержится мутация adeó-704, а на минихромосоме pSp(cenl)-7L-sup3E находится ее супрессор sup3E, то при потере минихромосомы теряется и супрессор мутации adeó-704, и в клетках накапливается предшественник аденина, окрашивающий клетки без минихромосомы в красный цвет. Частота потери минихромосомы F рассчитывалась по формуле F=S/(N-R), где R — количество полностью красных колоний (ade-), S — количество колоний, красных не менее, чем наполовину, N — общее число колоний. Метод позволяет определить частоту потери минихромосомы в первом делении, так как S — это количество колоний, потерявших минихромосому как минимум в первом делении после высева.

Синхронизация клеток S. pombe в Gi/Go-фазе методом азотного голодания. Синхронизация клеток в Gi-фазе методом азотного голодания была выполнена как описано в (Goshima et al. 1999). Метод основан на физиологическом свойстве дрожжей размножаться митозом в богатой среде или мейозом при недостатке азота. В Gi-фазе клетка анализирует пищевой статус и делает выбор по митотическому или мейотическому циклу развиваться. Поскольку штаммы, используемые в данной работе не могут менять тип спаривания, благодаря специальной мутации, то при отсутствии источника азота в среде эти клетки останавливаются в Gi/Go-фазе клеточного цикла. Клетки с мутацией alpl-1315, не содержащие ауксотрофных мутаций, выращивали в жидкой среде EMM при 25°С до концентрации 5*10б кл/мл, отмывали в EMM-N (EMM без источника азота), концентрировали центрифугированием до 2 х107кл/мл в EMM-N. Полученную суспензию клеток инкубировали при 25°С в течение 22 часов. После этого клетки помещали в богатую среду YES и инкубировали при 36°С.

Процедура FACScan-анализа или проточной цитометрии была выполнена как описано в (Grishchuk et al. 1998). Примерно 1 =< 107 кл/мл дрожжевых клеток, фиксировали в 70% этаноле, охлажденном до -20°С, и хранили при 4°С в течение нескольких дней. 15-100 мкл клеточной суспензии в 70% этаноле помещали в 1 мл 50 мМ sodium citrate (Sigma) с 1 мг/мл RNAase для удаления РНК. После 2-4 часов инкубации при 37СС, 5 мкг/мл propidium iodide (Sigma) был добавлен к клеточной суспензии для окраски ДНК. Окрашенные клетки разводили в 50 мМ sodium citrate и мягко обрабатывали ультразвуком. Содержание ДНК анализировали при помощи

цитометра FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Контролем послужил гаплоидный штамм дикого типа в фазе активного роста.

Иммунофлуоресценция. Иммунофлуоресцентная покраска Misl2:HA и Sadlp, белок SPB, была выполнена как описано в (Alfa et al. 1993). Культуру клеток в log-фазе (концентрация 1-3x106 кл/мл), выращенную при 25°С, переносили на 36°С. Образцы брали каждые пол-часа в течение 4.5 часов и фиксировали в 4% формальдегиде 10 минут при 36°С. В каждой точке фиксировалось 5*107 клеток. После фиксации каждый образец обрабатывался как описано (Alfa et al. 1993) и инкубировался с первичными антителами к НА-эпитопу (Babeo, разведение 1:500) и к Sadl (kindly provided by I. Hagan, разведение 1:600). Инкубация с первичными антителами длилась 16 часов, далее следовала отмывка в буффере PEMBAL и блокировка неспецифических сайтов связывания, инкубацией в PEMBAL (40 минут). Инкубация со вторичными антителами goat anti-mouse антитела, помеченные Alexa 594, и goat anti-rabbit, помеченные Alexa 488 (Molecular probes, Inc.), (разведение 1:500) длилась 6 часов. На микроскопе Zeiss Axiophot2 с объективом ЮОх Plan Аро oil-immersion было посчитано более чем 300 клеток в каждой точке графика в каждом эксперименте. Фотографии сделаны при помощи камеры Cooke "SensiCam" CCD camera и обработаны Slidebook v. 3.0 software (Intelligent Imaging Inc., Denver, CO).

Для иммунофлуоресцентного окрашивания микротрубочек клетки фиксировали метанолом при -20°С в течение 4-8 минут. Иммунофлуоресцентная покраска микротрубочек была выполнена, как описано у (Sawin and Nurse 1998). Образцы обрабатывали ферментами zymolyase (0.9 мг/мл) и lysing enzymes (0.6 мг/мл) в течение 20 минут для удаления клеточной стенки. Для окраски использовали антитела к а-тубулину ТАТ1 (kindly provided by Keith Gull, University of Manchester Institute of Science and Technology, U.K.) в разведении 1:200 (экспозиция 17 часов), и вторичные goat anti-mouse антитела, помеченные Alexa 488 (Molecular probes, Inc.) в разведении 1:400 (экспозиция 24 часа). На микроскопе Leica DM LA с объективом ЮОх Plan Аро oil-immersion было посчитано более чем 300 клеток в каждой точке графика в каждом эксперименте. Фотографии сделаны при помощи камеры Roper Scientific Coolsnap FX camera и обработаны ImageJ v. 1.34s program (fusion Complex Wavelets method).

Для окрашивания ДНК и септума в клетках использовали флуоресцентные красители DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, Sigma) и Calcofluor white M2R (Sigma). Клетки фиксировали в 4% формальдегиде 40 минут или в охлажденном до -20°С этаноле, как для FACScan анализа (см. выше).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Часть I Сегрегация хромосом в клетках делящихся дрожжей с мутациями кофактора D.

Стабильность минихромосомы в мутантах кофактора D зависит от условий роста клеток.

У почкующихся дрожжей S. cerevisiae кофактор D не является жизненно необходимым, но мутации в соответствующем гене приводят к гиперчувствительности к веществам, дестабилизирующим микротрубочки, и к повышенной частоте потери минихромосомы (Hoyt et al. 1990; Stearns et al. 1990). Оба alpl+ мутанта имеют умеренную чувствительность к деполимеризатору микротрубочек TBZ относительно мутантной аллели nda2~r, жизненно необходимого гена, кодирующего а-тубулин. При разрешающей температуре nda2-52 клетки не способны расти в 3 мкг/мл TBZ (Umesono et al. 1983), в то время как alplts клетки способны формировать колонии, если концентрация TBZ ниже 15 мкг/мл (клетки S. pombe дикого типа формируют колонии при концентрациях TBZ ниже 20 мкг/мл).

Чтобы оценить, ведут ли мутации alpl-1315 и alpl-tl в гене alpl+ к повышению частоты потери хромосом при разрешающей температуре (повышенная частота потери минихромосомы является признаком наличия дефектов сегрегации хромосом) была определена частота потери минихромосомы в клетках с мутациями кофактора D. Штаммы с мутациями кофактора D приводят к умеренному увеличению частоты потери минихромосомы, когда растут на минимальной среде при 25°С (Рис. 1 А).

Рис. 1 Частота потери минихромосомы в клетках с мутациями кофактора D зависит от условий роста и присутствия гена тас12*. А. Частота потери минихромосомы, определенная для клеток дикого типа (SPW 60), alpl-1315 (SPM 151), и alpl-tl (SP 77). Клетки высевали на 25°С на богатую среду (YES) с пониженной концентрацией аденина (10 мкг/мл) и минимальную среду (EMM), содержащую 10 мкг/мл аденина и 250 мкг/мл урацила. В. Клетки Amad2 (SPM 191), alpl-1315 (SPM 192), alpl-tl (SP 27) и двойных мутантов Amad2 alpl-1315 (SPM 201) и Amad2 alpl- tsml (SP 88) инкубировали при 25°C пять дней на YES и на EMM с адеником, лейцином и урацилом.

Частота потери минихромосомы в клетках alpl-1315 в 7.5 раз выше, а в клетках с мутацией alpl-tl только в 2 раза выше, чем в клетках дикого типа, а в клетках дикого типа частота потери минихромосомы статистически не отличается на обеих средах.

Частота потери минихромосомы в клетках alplts сильно возрастает, если клетки были высеяны на богатую среду: alpl-1315 клетки показали увеличение в 200 раз относительно контроля (Рис. 1А ), а в клетках с мутацией alpl-tl, выросших на YES, каждая колония содержала красный сектор, что указывает на потерю минихромосомы в первом же после высева делении (Рис.1А).Таким образом, частота потери минихромосомы в клетках с мутациями в гене, кодирующем кофактор D, зависит от среды, на которой растут клетки.

Рост клеток alpl-tl на богатой среде контролируется белками митотического контроля (чекпойнта).

В настоящее время не определено, какой конкретно компонент среды YES ответственен за увеличение частоты потери минихромосомы в клетках с мутациями в гене, кодирующем кофактор D, однако было обнаружено, что рост клеток с мутацией alpl-tl на среде YES зависит от присутствия гена mad2+, кодирующего компонент митотического чекпойнта (Не et al. 1997). Двойные мутанты между клетками, несущими мутации alpltí и Amad2 были сконструированы в присутствии плазмиды с копией гена mad2+ дикого типа (любезно предоставленной S. Sazer) методом случайных спор (см. Материалы и Методы). Когда эта плазмида утрачивалась двойными мутантами на минимальной неселективной среде, полученные штаммы делились и росли при разрешающей температуре, но alpl-tl Amad2 клетки не могли расти на богатой среде YES (Рис. 1В). Под микроскопом в этой культуре было обнаружено много клеток с неправильно разделенной ДНК, что означает летальность и, по-видимому, является результатом неправильно прошедшего митоза. Выживаемость двойных мутантов alpl-tl Amadl, alpl-tl Amad3 и alpl-tl ЛЬиЬЗ на среде YES тоже оказалась сниженной (показано Е.М. Токаревой). Рост клеток на средах разного типа, вероятно, влияет и на продолжительность различных стадий клеточного цикла и на скорость метаболических процессов. Однако специфичные пути, которые требуют присутствия выше названных генов митотического чекпойнта и ответственные за наблюдаемые различия, еще не известны. Этот эффект специфичен для madl+, mad2+, mad3+, bub3+, так как двойные мутанты между alpl-tl и Abubl (Bernard et al. 1998) или cdcló-116 (в делящихся дрожжах гомолог BU В2 (Fankhauser et al. 1993)) растут при 25°С независимо от типа среды (показано А.П. Тикуновым). Споры alpl-tl Amphl (Не et al. 1998) не дали единичных колоний на обоих типах среды. Таким образом, Mphlp, который функционирует раньше Mad2p в пути митотического чекпойнта (Не et al. 1998), жизненно необходим для роста alpl-tl клеток при 25°С.

Неравная сегрегация хромосом в клетках с мутациями в гене, кодирующем кофактор D, сопровождается отсутствием метафазы в митозе.

Из опубликованных данных известно, что обе мутантные аллели alpIх* кофактора D имеют меньше микротрубочек при запрещающей температуре (36°С) (Grishchuk et al.

998; Hirata et al. 1998). Тем не менее, после входа в митоз при 36°С в существенной асти клеток alpl-tl после небольшой задержки происходит удлинение веретена еления и сегрегация хромосом (Grishchuk et al. 1998). Однако разделение масс ДНК ри этом часто происходит неравным образом. Для подробного исследования егрегации хромосом в клетках с мутациями в гене, кодирующем кофактор D, была спользована нммунофлуоресценция, чтобы визуализировать ранние стадии «правильного деления (Рис.2). Контрольная асинхронная культура дикого типа одержала меньше чем 15% клеток с двумя разошедшимися полюсами в любой момент ремени (Рис.2А). При этом кинетохоры были либо на линии между полюсами прометафаза/метафаза, Phc.2D, панель Ь) либо присоединены к полюсам (анафаза, hc.2D, панель с). В культурах клеток с мутациями в гене alpl+ после переноса на 36°С тали накапливаться клетки с двумя не разошедшимися полюсами и продолжающими онденсироваться хромасомами (Pnc.2D, панель d). На этой стадии примерно в -11% еток с мутацией alpl-1315 ив ~3 % клеток с мутацией alpl-tl хотя бы один из трёх инетохоров терял прикрепление к полюсу и предположительно к микротрубочке еретена деления (Phc.2D, панель е). Примерно после ~ 30-60 минут полюса начали асходиться (Рис. 2В и С), хотя и редко на длину анафазного веретена, как в онтрольной культуре дикого типа. В культурах клеток с мутациями alpl-1315 и alpine было обнаружено ни одной клетки, в которой кинетохоры были бы на линии ежду полюсами, даже когда расстояние между полюсами было мало как на (Рис.2Б, анель Ь). В большинстве клеток с малым расстоянием между полюсами кинетохоры ыли присоединены к разошедшимся полюсам (Phc.2D, панели f - h). В большинстве еток с малым расстоянием между полюсами кинетохоры были присоединены к азошедшимся полюсам (Pnc.2D, панели f - h). Иногда один из трёх кинетохоров казывался не связанным с полюсом, но такая конфигурация, кажется неправильной, к как оторвавшийся кинетохор располагался далеко от линии веретена деления HC.2D, панель i).

Основываясь на интенсивности кинетохор-ассоциированных сигналов в етках с разошедшимися полюсами (Phc.2D, панели f - i), было оценено, что имерно в ~ 40% клеток с мутацией alpl-1315 и в ~ 30% клеток с мутацией alpl-tl омасомы сегрегируют неравным образом (Рис.2Е). И хотя в клетках с мутациями гене alpl+ хромосомы растягиваются как в анафазе, это происходит, минуя стадии ометафазы и метафазы. То есть хромосомы в этих клетках не собираются в етафазную пластинку и не претерпевают прометафазных осцилляций (конгрессии), торые происходят в культуре дикого типа на стадии, когда кинетохоры находятся линии между полюсами (Pnc.2D, панель Ь). Так как на молекулярном уровне нетохор-микротрубочковое взаимодействие во время биориентирования

контроль

- Ранний митоз -Анафаза

- Полюса рядом

- Полюса разошлись

часов после переноса на 36°С

Е90 80 р 70 2 60 § 50 140 ¿ ЗОН 2010: 0

■■неравная сегрегация-СП равная сегрегация

IÍL

alp1-1315

alp1-t1

D Хромосомы Полюса Кинетохоры Merge

а » • *

b • » • V »

с • • f %

d ** V V

е •• V « ч

f « • » *

9 • m

h * ,

• ■ * ' 1 1 ¥

2 мкм

Рис. 2 Сегрегация хромосом в асинхронных культурах при 36°С. Контрольные клетки (панель Л SPW 62), alpl-1315 (панель В, SPM 155) и alpl-tl (панель С, SP 79) клетки инкубировали при 25°С £ YES, затем перенесли на 36°С в точке 0 часов. Все категории на каждой панели А-С вместе с_ соответствующим процентом интерфазных клеток (не показано) составляют 100%. Для каждой точю-было посчитано не менее 300 клеток не менее чем в двух независимых экспериментах. D. Фотограф!« хромосом (окрашенных DAPI), полюсов (окрашенных анти-Sadl антителами), кинетохоро! (окрашенных анти-НА антителами для визуализации Misl2p), и фото со всеми тремя сигналам! (Merge). На фото представлены характерные фенотипы клеток дикого типа и alpl-1315 проинкубированных 3 - 5 часов при 36°С. Конфигурации, показанные на панелях а - с, это нормальна последовательность митотических стадий в клетках дикого типа. Конфигурации, показанные ш остальных панелях, были найдены только в клетках с мутациями, а - удвоенные полюса рядом друг ' другом и со всеми кинетохорами; b - ранний митоз (нормальная прометафазная/метафазна конфигурация): полюса разошлись, кинетохоры расположились в линию между ними; с - анафазна' конфигурация: полюса продолжают расходится, при обоих полюсах примерно равные кинетохорны сигналы; d - полюса рядом друг с другом и со всеми кинетохорами, но хромосомь гиперконденсированы; е - некоторые кинетохоры гиперконденсированных хромосом рядом неразделенными полюсами, но по-крайней мере один кинетохор вне полюса; на панелях f -

конфигурации с разошедшимися полюсами SPBs: f, g - примерно равные кинетохорные сигналы при каждом полюсе; h кинетохоры распределены между полюсами неравным образом; i - видны все три кинетохора, но только два из них на разошедшихся полюсах. Е. Диаграмма показывает процент клеток с разошедшимися полюсами с равной (панели f, g) и наравной (панели h) сегрегацией кинетохоров.

кинетохоров изучено недостаточно (reviewed in Maiato et al. 2004; Mcintosh et al. 2002), то трудно сказать, какой аспект этого высокодинамичного процесса нарушен. Так как рост на богатой среде клеток alpl-tl зависит от присутствия Madl, Mad2, Mad3, ВиЬЗ-зависимого чекпойнта (Hardwick et al. 1996; Lew and Burke 2003), но не Bublp, то это может означать, что в клетках alpl-tl прикрепление кинетохора к микротрубочкам во время прометафазы затруднено или недостаточно, но так как веретено строится и кинетохоры прикрепляются к нему, то по-видимому, нормальное натяжение в конце концов устанавливается.

Мутации в гене, кодирующем кофактор D, чувствительны к повышению уровня экспрессии CENP-B-подобного белка Abplp.

Результаты, описанные выше, могут означать, что митотические дефекты в клетках с мутациями в гене alpl+, в большей степени обусловлены неправильной сегрегацией хромосом из-за дефектов в закреплении микротрубочек на кинетохоре, чем вследствие ошибок в формировании веретена деления. Это заключение подтверждается наличием сильных генетических взаимодействий между alpl-tl и abpl+ (Murakami et al. 1996). Abplp это один из трех гомологов в S. pombe центромер-связывающего белка CENP-B (Murakami et al. 1996). Было показано Грищук E.JL, что сверхэкспрессия аЬрГ улучшает рост клеток с мутацией alpl-tl, но не alpl-1315 на минимальной среде при 36°С. А делеция гена аЬрГ приводит к гибели alpl-tl, но не alpl-1315 клеток при разрешающей температуре.

Известно, что и удаление гена abpl+ и его сверхэкспрессия нарушают сегрегацию хромосом (Baum and Clarke 2000; Halverson et al. 1997: Irelan et al. 2001), в то же время увеличение уровня аЬрГ способствует росту клеток с alpl-tl. Чтобы подробнее

Рис.3 Влияние сверхэкспрессии abpl+ на частоту потери минихромосомы в клетках с мутациями кофактора D. На диаграмме представлено отношение значения Fpabpl" -частоты потери минихромосомы для клеток, содержащих плазмиду с геном аЬрГ (рabpl*) к Fp - значению частоты потери минихромосомы для клеток с контрольной плазмидой (р).

а. 10

w.t. alpl-1315 alp1-t1

исследовать это взаимодействие была измерена частота потери минихромосомы в клетках с мутациями alpl-tl и alpl-1315 при повышенном и нормальном уровне экспрессии abpl+ (Рис.3). На рисунке 3 показано среднее увеличение частоты потери минихромосомы в клетках, несущих многокопийную плазмиду с геном abpl+ относительно частоты потери минихромосомы в клетках, несущих контрольную плазмиду без гена abpl+. В соответствии с опубликованными результатами в (Halverson et al. 1997), было обнаружено, что сверхэкспрессия Abplp в контрольных клетках дикого типа ведет к увеличению частоты потери минихромосомы примерно в -10 раз на богатой среде YES. На минимальной среде EMM с селекцией на плазмиду минихромосома теряется в 100 раз чаще (Рис.3). В отличие от среды YES, в минимальной среде EMM отсутствует лейцин, и на ней могут формировать колонии только те клетки, которые имеют плазмиду. Однако этот факт не может объяснить разницу в 10 раз в частоте потери минихромосомы, так как было проверено, что перед высевом плазмиду теряет только -50% клеток. В клетках с мутацией alpl-tl не было различий в частоте потери минихромосомы в зависимости от уровня экспрессии abpl+ на YES, но было обнаружено увеличение частоты потери минихромосомы почти в 700 раз на EMM. Частота потери минихромосомы в клетках с мутацией alpl-1315 оказалась более устойчива к сверхэкспрессии Abplp, чем клетки дикого типа. Не было обнаружено никакого изменения частоты потери минихромосомы на богатой среде, и увеличение частоты потери минихромосомы примерно в -50 раз на минимально среде (Таблица 2, Рис.3).

Генетические взаимодействия между компонентами кинетохора и веретена деления предполагают их существенную роль в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой.

Клетки с мутацией alpl-tl характеризуются сложным набором генетических взаимодействий с различными генами, кодирующими белки, задействованные в митозе, такие как компоненты Комплекса Инициирующего Анафазу (Anaphase Promoting Complex (APC)), протеасомы и тубулины (Grishchuk et al. 1998). Но не было найдено генетических взаимодействий между alpl-tl и компонентами кинетохора, misl2-537 и mis6-302 (Grishchuk et al. 1998). Клетки с делецией abpl+ генетически не взаимодействуют ни с компонентами АРС (пис2-663 и cut4-533), ни с компонентами протеасомы (mts2-l и mts3-l), ни с nda3-311, мутацией в гене, кодирующем р-тубулин, но не жизнеспособна в сочетании с nda2-52, мутацией в гене, кодирующем а-тубулин (показано П. В. Мардановым и L. Trihn). Также Aahpl слабо супрессирует температурную чувствительность клеток с мутацией mis12-537, но не misó-302 (misl2+ и misó' - компоненты кинетохора). Это наблюдение особенно интересно тем, что мутация misl2-537 супрессирует холодочувствительность, обусловленную отсутствием

j Рис.4 Анализ генетических взаимодействий и чувствительности к TSA. A. Aabpl частично супрессирует температурную чувствительность mis12-537. На фото показывают mis¡2 (SPM 115) и misl2 Aabpl (SPM 125) клетки, выращенные на YES 4-5 дней при 36°С (сверху) и 25°С (снизу) (сделано П. Мардановым). Медленный рост двойного мутанта обусловлен присутствием мутации Aabpl (Halverson et al.1997). В. alpi-tl супрессирует холодочувствительность Adisl. Дикий тип (SPW 20), alpl-tl (SP26), Adisl (Mcl#535) и Adisl alpl-tl (два незевисимо изолированных штамма, имеющих идентичный фенотип как у SPM 190). Клетки были расстрикованы до единичных колоний на YES, чашки инкубировали при обозначенных температурах 3-6 дней. Такие же результаты были получены с мутацией disIa (не показано; Ohkura et al. 1988). С. Adisl гиперчувствителен к TSA. Дикий тип (SPW 20) и Adisl (Mcl#535) клетки были расстрикованы до единичных колоний на YES с добавлением 0.2% DMSO (сверху) или с 0.2% DMSO и TSA (10 ^g/mi) (снизу) и проинкубированы 3 дня при 32°С.

кинетохор- и микротрубочко-связывающего белка Dislp (Рис.4) (Decottignies et al. 2001; Kobayashi et al. 2007; Nabeshima et al. 1995; Nakaseko et al. 2001). Но генетических взаимодействий между Adisl и Aabpl найдено не было (показано П. В. Мардановым). В данной работе было проверено наличие генетических взаимодействий между Adisl и мутациями в гене, кодирующем кофактор D. Оказалось, что холодочувствительная мутация Adisl (а также и другая мутация disTs) супрессирует alpl-tl, но не alpl-1315. Клетки двойного мутанта alpl-tl Adisl были температурочувствительны, как alpl-tl (не росли при 36°С), но могли расти при 22°С неотличимо от клеток с мутацией alpl-tl, что означает супрессию Adisl (Рис.4В).

Мутация alpl-tl разрушает нормальное функционирование митотических микротрубочек, и это спасает Adisl: кажется правдоподобным, что нарушения сегрегации хромосом в Adisl могут компенсироваться за счет дестабилизации микротрубочек. Было проверено, нельзя ли супрессировать холодочувствительность Adisl, если добавить в среду химический деполимеризатор микротрубочек - TBZ.

Однако оказалось, что TBZ в концентрациях (1 - 20 мкг/мл) не супрессирует холодочувствительность клеток с мутацией Adisl. Это означает, что взаимодействие между мутациями в генах, кодирующих кофактор D и Dislp, специфично и может влиять на изменения в структуре кинетохора, обусловленные отсутствием Dislp. Это заключение частично базируется на том, что было обнаружено, что рост клеток с мутацией Adisl при разрешающей температуре полностью блокируется добавлением 10 мкг/мл TSA (Рис.4С), специфичным ингибитором гистоновых деацетилаз, который влияет на общую структуру центромеры (Ekwall et al. 1997). Ни одна из мутаций Aabpl, alpl-1315, alpl-tl, nda2-52, nda3-311, mis6-302, misl2-537 не чувствительны к этому веществу.

Тот факт, что abpf ген является высококопийным супрессором мутации alpl-tl, также как и кофактор Е, позволяет предположить, что уменьшение концентрации димеров в ббльшей степени влияет на кинетохор-микротрубочковое взаимодействие, чем на расхождение полюсов и формирование веретена деления. Это заключение подтверждает наличие аллель-специфичной синтетической летальности между кофактором D и Aabpl, в то время как взаимодействий с другими постоянными компонентами кинетохора, Mis6p and Misl2p, найдено не было. В клетках дикого типа и сверхэкспрессия a bp Г гена и его делеция приводят к примерно одинаковому увеличению частоты потери минихромосомы (Baum and Clarke 2000; Halverson et al. 1997). Тем поразительнее тот факт, что мутация кофактора D, имеющая дефекты в сегрегации хромосом, может быть частично супрессирована Abplp. А также тот факт, что другая мутантная аллель кофактора D, alpl-1315 более устойчива к перепроизводству Abplp, чем ген дикого типа. Таким образом, несмотря на то, что избыток Abplp вредит нормальным клеткам, он может частично компенсировать дефекты, обусловленные мутациями кофактора D.

Часть II Тубулиновые димеры при нарушении функции кофактора D остаются функциональными в течение одного клеточного цикла.

Клетки с мутацией alpl-1315 гибнут в первом митозе при 36°С после синхронизации в Сгфазе.

Если клетки с мутацией alpl-1315 или alpl-tl, синхронизовать в ранней С2-фазе клеточного цикла при 25°С, а затем перенести на 36°С, то клетки первый митоз пройдут успешно, а второй раз правильно поделиться не смогут и погибнут (результаты A. Book и Grishchuk et al: 1998). Поскольку кофактор D участвует в сборке тубулиновых димеров, то описанный выше фенотип, может означать, что кофактор D выполняет свою жизненно важную функцию до ранней вг-фазы или, что кофактор D сворачивает димеры только в определенной стадии клеточного цикла или что существует какая-то дополнительная функция кофактора D. Чтобы проверить эту

гипотезу клетки с мутацией а1р1-13!5, обладающей более сильной температурной чувствительностью, чем а/р7-/Д синхронизовали в С^Юа- фазе при помоши азотного голодания при 25°С, как описано в Материалах и Методах и перенесли на 36°С в богатую среду. Если кофактор О выполняет свою функцию в течение фаз клеточного цикла, то клетки с мутацией а!р1-]315 погибнут в первом митозе.

0 1 2 3 4 5 6 7 часов после переноса на 36°С

7" время (ч)

а1р1-131Ъ

Рис.5 Выживаемость и цитология клеток с мутацией alpl-1315 при 36°С после синхронизации в Gi-фазе. Клетки дикого типа (SPW 2) и alpl-1315 (SPM 233), предварительно остановленные в Gi-фазе при помощи азотного голодания при 25°С, перенесли в богатую среду YES на 36°С (0 часов) Анализировали концентрацию клеток (А) и их выживаемость (В) Выживаемость клеток была получена путем высевания клеток в каждой точке на среду YES, 25°С. (С) и (D) Цитология клеток дикого типа (С) и alpl-1315 (D). Все категории на панелях С, D в сумме с соответствующем процентом интерфазных клеток (не показано) составляют 100% По крайней мере по 300 клеток было проанализировано в каждой точке в 4 независимых экспериментах После 4-5 часов инкубации (время первого митоза), в культуре клеток alpl-1315 стали накапливаться неправильно поделившиеся клетки. (Е) и (F) - содержание ДНК, определенное на FACScan в 0-10 часов. Контроль -это клетки дикого типа (SPW 20) в фазе активного роста (log-фазе).

Выживаемость в культуре клеток с мутацией а1р1-1315 начала падать уже после 1 часа роста при 36°С (Рис.5В). Анализ цитологии клеток с мутацией а1р!-1315 показал, что после первого же деления в культуре стали накапливаться неправильно поделившиеся клетки, то есть неравным образом сегрегировавшие хромосомы (Рис.50). Эти результаты могут означать, что А1р1 имеет дефект в Ор или й-фазе клеточного цикла.

Клетки с мутацией а1р1-1315 не имеют дефектов в прохождении 8-фазы.

Для того чтобы определить становится ли дефектным А1р1-1315 после Ог или после Б-фазы клеточного цикла при 36°С, был выполнен анализ при помощи проточной

цитометрии (FACScan анализ) клеток с мутацией alpl-1315, предварительно синхронизованных в G| и затем перенесенных на 36°С. FACScan анализ показал, что репликация ДНК произошла через 3 часа после переноса на 36°С и освобождения после азотного голодания, то есть в то же время, что и в контрольной культуре дикого типа (Рис.5, панели Е и F). Прохождение через S-фазу в культуре клеток с дефектным кофактором D выглядит неотличимо от дикого типа. Нарушения в распределении и содержании хромосомальной ДНК появляются после первого митоза при 36°С (Phc.5F). Следовательно, клетки alpl-1315 погибают после первого же митоза, если предварительно они были синхронизованы в Gj-фазе, и после второго митоза, если предварительно они были синхронизованы в С2-фазе. Подобное поведение демонстрируют клетки с мутациями в генах, имеющих жизненно важную функцию в Gi-фазе, например, mis6-306 и mis4-242 (Furuya et al. 1998; Saitoh et al. 1997). Следовательно, эти результаты показывают, что Alpl может действовать в Gi-фазе, и невыполнение его функции в Gj-фазе приводит к неравной сегрегации хромосом в последующем митозе. Но следует заметить, что после синхронизации в Сгфазе, клетки с мутацией alpl-1315 погибают во втором митозе после 4 часов при 36°С; после синхронизации в Gi/Go-фазе, клетки с мутацией alpl-1315 погибают в первом митозе тоже после пяти часов инкубации при Зб°С. Таким образом, возможна альтернативная гипотеза: если время инактивации Alpl-1315 и последующей диссоциации тубулиновых димеров составляет 2-4 часа, то клетки с мутацией alpl-1315 будут умирать после четырех часов независимо от того, в какой фазе клеточного цикла они предварительно были синхронизованы. Следовательно, вышеописанный фенотип может быть обусловлен диссоциацией тубулиновых димеров при 36°С до митоза вследствие отсутствия кофактора D, способного сворачивать тубулиновые димеры, а не ошибкой в выполнении какой-либо функции в Gi-фазе. Время диссоциации тубулиновых димеров в S. pombe не известно, но димеры млекопитающих in vitro диссоциируют медленно с Td,s~20 часов (Caplow and Fee 2002). То есть по этой оценке, они могут существовать более 5 часов.

Микротрубочки в клетках с мутацией alpl-1315 становятся сильно поврежденными через 3 часа инкубации при 36°С независимо от прохождения Gi-фазы.

Для выбора между двумя гипотезами, описанными выше, мы оценили степень повреждения микротрубочек в клетках cdc25-22 alpl-1315 с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания микротрубочек в фиксированных клетках при помощи антител к а-тубулину ТАТ-1(см. Материалы и методы).

В течение первых двух часов инкубации при 36°С в культурах cdc25-22 alpl-1315 и alpl-1315 почти все клетки имели полный набор довольно длинных микротрубочек, после двух часов при 36°С число и длина микротрубочек в клетке в культурах cdc25-22

cdc25-22 alpl-1315

Неповрежденные

Редуцированные

-О-Отсутствуют

012345678 чгсов после переноса на 36°С

012345678 часов после переноса на 36°С

Неповрежденные в cdc25-22

Редуцированные в alpl-1315 ва1р1-1315

Рнс.6 Состояние мякротрубочек в клетках cdc25-22 alpl-1315 во время cdc2S-22-зависимой блокировки клеточного деления. Культуры клеток в фазе активного роста cdc25-22 (SPM 173), alpl-1315 (SPM 112), cdc25-22 alpl-1315 (SPM 154), выращенные на YES при 25°C, были перенесены на 36°С (точка 0 часов). (А), (В) На графиках нанесен процент клеток, имеющих 5-8 цитоплазматических микротрубочек (Неповрежденные), процент клеток с редуцированными микротрубочками по длине и по количеству (Редуцированные), процент клеток, в которых отсутствует покраска на тубулин (Отсутствуют) в культурах cdc25-22 и alpl-1315 (А); и в cdc25-22 alpl-1315 (В). Для каждой точки по крайней мере 300 клеток было проанализировано не менее, чем в трех независимых экспериментах. (С) Фотографии структур микротрубочек после 10 часов при 36°С.

alpl-1315 и alpl-1315 быстро сокращалась. Через три часа в культурах cdc25-22 alpl-1315 и alpl-1315 не было найдено клеток, содержащих неповрежденные микротрубочки (Рис.6, панели А и В). После пяти часов инкубации при 36°С, как и в предыдущем эксперименте клетки в культуре cdc25-22 alpl-1315 начали ветвиться (Рис.бС). В целом после трех часов состояние микротрубочек в культурах cdc25-22 alpl-1315 и alpl-1315 менялось медленно (Рис.6, панели А и В). Хотя в культуре cdc25-22 alpl-1315 довольно длинные куски цитоплазматических микротрубочек были видны в 50% клеток даже после 10 часов инкубации при 36°С (Phc.6D, правая панель). Эти результаты хорошо согласуются с предыдущими исследованиями цитоскелета в alpl-tl и alpl-1315 при 36°С (Grishchuk et a!. 1998; Hirata et al. 1998). Из полученных результатов можно заключить, что: 1) Alpl-1315 инактивируется и перестает формировать димеры уже через два часа инкубации при 36°С независимо от прохождения Gi-фазы; 2) микротрубочки в клетках с мутацией alpl-1315 становятся сильно поврежденными через 3 часа инкубации при 36°С, то есть запаса тубулиновых димеров при нарушении функции кофактора D хватает только на один клеточный цикл; 3) без кофактора D, микротрубочки могут существовать в клетке, но их недостаточно

для успешного прохождения через митоз после четырех часов при 36°С. Что и приводит к гибели клеток в ближайшем митозе и/или к ветвлению в cdc25-22 alpl-1315. Известно, что низкая концентрация димеров in vitro приводит к уменьшению скорости роста микротрубочек, увеличеншо частоты катастроф и уменьшению средней длины микротрубочек (Walker et al. 1988). Это хорошо согласуется с вышеприведенными результатами. Эксперименты с покраской микротрубочек позволяют грубо оценить in vivo время функционирования димеров тубулина. В клетках с мутацией в гене, кодирующем кофактор D, при 36°С оф-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла.

Часть III Клетки cdc25-22 alpl-1315, освобожденные после cdc25-22-зависимой блокировки митотического деления, имеют примерно часовую задержку в инициации митоза.

Появление на полюсе Plol-GFP задерживается и имеет медленную кинетику в клетках cdc25-22 alpl-1315, освобожденных после cdc25-22-зависимой блокировки митотического деления.

Результаты, полученные выше, говорят о том, что у клеток cdc25-22 alpl-1315, заканчиваются функциональные димеры тубулина, но при этом выживаемость клеток во время cdc25-22-зависимой блокировки клеточного деления при помощи мутации cdc25-22 остается высокой в течение более чем 6 часов (данные не показаны). Это означает, что после переноса на 25°С у клеток должна быть задержка либо перед митозом, либо в митозе, что даст им возможность пополнить запас димеров. Было исследовано прохождение через митоз клеток cdc25-22 alpl-1315 и кинетика появления на полюсе Plol киназы (самое раннее событие митоза) (Báhler et al. 1998; Mulvihill et al. 1999). В литературе описано, что для инициации митоза после блокировки клеточного цикла при помощи cdc25-22 и появления на полюсе Plol нужны микротрубочки и/или димеры тубулина (Alfa et al. 1990; Mulvihill and Hyams 2002). Нами было показано, что в клетках cdc25-22 alpl-1315, во-первых, задерживается вход в митоз примерно на 30 минут, а, во-вторых, все события митоза протекают гораздо медленнее, чем у клеток cdc25-22 (данные не приведены). Это означает, что инициация митоза в отсутствие микротрубочек и, тубулиновых димеров затруднен, что замедляет рост активности Cdc25 и продвижение митоза (Mulvihill et al. 1999). Эти результаты и указывают на то, что для инициации митоза после снятия cdc25-22-зависимой блокировки клеточного цикла важны либо тубулиновые димеры, либо микротрубочки.

В клетках cdc25-22 alpl-1315, освобожденных после cdc25-22-зависимой блокировки митотического деления, не наблюдается изменений ни в количестве, ни в длине микротрубочек, но есть изменения в их яркости.

Для того чтобы разобраться, что важно для инициации мптоза после снятия cdc25-22-зависимой блокировки клеточного цикла - микротрубочки пли тубулиновые димеры, было исследовано построение веретена в клетках cdc25-22 alpl-1315 при помощи окраски антителами к тубулину (данные не показаны). Если дело в микротрубочках, то перед инициацией митоза должен быть момент, когда произойдут изменения в структурах микротрубочек, например, они увеличат свою длину и/или количество. Покраска антителами к тубулину, показала, что сначала в клетках видны остатки цитоплазматических микротрубочек. Яркость цитоплазматических трубочек сначала падает что, по-видимому, обусловлено распадом цитоплазматических микротрубочек перед митозом, а потом возрастает (данные не показаны). Причиной возрастания яркости скорее всего является появление новых димеров. Таким образом, в клетках cdc25-22 alpl-1315 после снятия еЛ25-22-зависимой блокировки клеточного цикла не наблюдается изменений ни в количестве, ни в длине микротрубочек, но есть изменения в их яркости. Эти результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что для инициации митоза после снятия с&25-22-зависимой блокировки клеточного цикла важно присутствие тубулиновых димеров.

ВЫВОДЫ

1. Кофактор D необходим для правильной сегрегации хромосом, и, возможно, имеет дополнительную функцию, связанную с установлением оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой.

2. Возможными партнерами кофактора D среди белков кинетохорного комплекса являются белки Abpl и Disl.

3. Причиной гибели клеток с мутацией кофактора D alpl-1315 после переноса на 36°С во втором клеточном делении (через 4-5 часов) является исчезновение неповрежденных микротрубочек (через 3 часа) вследствие инактивации мутантного белка Alpl-1315 (через 2 часа).

4. аР-тубулиновые гегеродимеры при нарушении функции кофактора D способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Федянина О.С. и ЕЛ. Грищук (2004) Влияние сверхэкспрессии ДНК-связывающего белка гетерохроматина Abplp на частоту потери минихромосомы и рост клеток Schizosaccharomyces pombe с мутациями гена, кодирующего кофактор D. Генетика, том 40, № 1, с. 1-11.

2. Fedyanina O.S., P.V. Mardanov, Е.М. Tokareva, J.R. Mcintosh and E.L. Grishchuk (2006) Chromosome segregation in fission yeast with mutations in the tubulin folding cofactor D. Curr Genet, 50: 281-294.

3. Федянина О., Ф.И. Атауллаханов и E.JI. Грищук (2001) Влияние переэкспрессии Abplp CENP-B-подобного белка S. pombe на частоту потери минихромосомы в мутантах кофактора D. Труды конференции "От современной науки к новым наукоемким технологиям" Пущино, 24-26 октября, с. 104.

4. Федянина О.С., Ф.И. Атауллаханов и E.JI. Грищук (2002) Исследование фенотипа и генетических взаимодействий мутантов кофактора D S. pombe. Труды конференции "От современной науки к новым наукоемким технологиям" Пущино, 11-14 ноября, с. 137.

5. Fedyanina O.S., Georgiev P.G. and E.L. Grishchuk (2003) Determination of the execution point of mutant allele of the S. pombe gene, encoding tubulin-folding cofactor D. International conference "Molecular genetics of eucaryotes", Москва, 4-7 February, c. 21.

6. Федянина O.C., A.B. Пивоварова и E.JI. Грищук (2004) Анализ генетических взаимодействий мутантов кофактора D S. pombe с различными мутантными аллелями МАР-белка Disl. Материалы III Съезда биофизиков России, Воронеж, 2429 июня, т.2, с. 800-801.

Подписано в печать 10.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1150 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федянина, Ольга Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Schizosaccharomyces pombe как модельный объект исследований.

1.2 Клеточный цикл делящихся дрожжей S. pombe.

1.3 Регуляция клетбчного цикла у S. pombe.

1.4 Митотическое деление клетки.

1.4.1 Особенности митотического деления S. pombe.

1.4.2 Инициация митоза у S. pombe.

1.4.3 Система клеточного контроля (checkpoint) и инициация анафазы.

1.5 Строение микротрубочек.

1.5.1 Формирование тубулиновых димеров. Роль тубулин-свертывающих кофакторов.

1.5.2 Кофактор D высших эукариот.

1.5.3 Мутации alpl-1315 и alpl-tl/tsml-512.

1.6 Центромера-связывагощие белки (CENPs).

1.6.1 CENP-B и CENP-B-подобные белки.

1.6.2 Abplp - CENP-B подобный белок.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Среды и условия роста S. pombe.

Генетические методы.

Метод случайных спор.

Метод тетрадного анализа.

Тест на определение температурной чувствительности.

Тест на определение типа спаривания.

Методы клеточной биологии.

Трансформация клеток S. pombe.

Измерение частоты потери минихромосомыpSp(cenl)-7L-sup3E.

Обработка результатов теста по определению частоты потери минихромосомы.

Синхронизация клеток S. pombe в Gi/Go-фазе методом азотного голодания.

Иммунофлуоресценция.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

Часть I Сегрегация хромосом у делящихся дрожжей с мутациями кофактора

Сравнение температурочувствительности alpl-1315 и alpl-tl, мутантыых аллелей кофактора D.

Стабильность минихромосомы в мутантах кофактора D зависит от условий роста клеток.

Рост клеток alpl-tl на богатой среде контролируется белками митотического контроля (чекпойнта).

Мутации в гене, кодирующем кофактор D, чувствительны к повышению уровня экспрессии CENP-B-подобного белка Abplp.

Клетки с мутациями cdclOи клетки alpl-1315 имеют похожую кинетику гибели.

Клетки с мутацией alpl-1315 гибнут в первом митозе при 36°С после синхронизации в Gi-фазе.

Выживаемость клеток с мутацией alpl-1315 остается высокой на протяжении сс/с25-22-зависимой блокировки митотического деления.

Микротрубочки в клетках с мутацией alpl-1315 становятся сильно поврежденными через 3 часа инкубации при 36°С независимо от прохождения Gi-фазы.:.

Часть III Клетки cdc25-22 alpl-1315, освобожденные после cdc25-22-зависимон блокировки митотического деления, имеют примерно часовую задержку в инициации митоза.

В клетках cdc25-22 alpl-1315, освобожденных после cdc25-22- зависимой блокировки митотического деления, не наблюдается изменений ни в количестве, ни в длине микротрубочек, но есть изменения в их яркости.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

Генетический анализ функции кофактора D S. ротЪе.

Анализ сегрегации хромосом в клетках с мутациями кофактора D.

Продолжительность функциональности тубулиновых димеров при нарушении функции кофактора D.

Инициация митоза после cdc25-22 - зависимой блокировки митотического деления.".

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe"

Понимание механизмов клеточного деления - это одна из важнейших задач современных биомедицинских исследований. Одной из ключевых фаз клеточного цикла является митоз. В процессе митоза происходит разделение генетической информации. Это осуществляется путем конденсации хроматина, "созревания" кинетохоров и образования веретена деления из микротрубочек. Взаимодействие микротрубочек с кинетохорами обеспечивает правильное закрепление и сегрегацию хромосом в процессе митоза. Неправильная сегрегация хромосом может привести к возникновению тяжелых заболеваний и гибели. Поэтому во время клеточного деления процесс сегрегации хромосом тщательно контролируется системой митотического контроля, называемым чекпойнтом веретена деления. Функция этой системы заключается в задерживании стадии расхождения хромосом до тех пор, пока все хромосомы не будут правильным образом прикреплены к микротрубочкам и биориентированы относительно полюсов деления.

Микротрубочки являются важнейшим компонентом цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании формы клетки, в транспорте органелл, и становятся жизненно необходимы в митозе. Именно поэтому они являются одними из главных мишеней для противоопухолевых препаратов. Микротрубочки это динамичные биополимеры, состоящие из сф-гетеродимеров тубулина. Повышение уровня свободного а- и р-тубулина токсично для клеток и жестко регулируется (Cleveland et al. 1981). В формировании оф-гетеродимеров тубулина участвует пять кофакторов: А, В, С,

D, E (Szymanski 2002). Кофакторы сборки тубулиновых сф-гетеродимеров это эволюционно консервативные белки у эукариот от дрожжей до человека (Lewis et al. 1997; Szymanski 2002). Было показано, что мутации в гене, кодирующем кофактор Е, который является партнером кофактора D в пути сборки тубулиновых димеров. приводит к возникновению у человека тяжелых синдромов, приводящих к гипопаротироидизму, задержке умственного развития и лицевому дисморфизму (Parvari et al. 2002). Эти заболевания вызваны нарушениями димеризации тубулина и недостатком микротрубочек. Лучше всего биохимический путь формирования димеров изучен in vitro на выделенных белках быка (Tian et al. 1996; Tian et al. 1997; Tian et al. 1999). Кофакторы действуют на финальном этапе образования третичной структуры а- и Р-тубулинов, способствуя формированию собственно сф-гетеродимера. Кофакторы В и А связываются с а- и Р-тубулипом соответственно (Tian et al. 1996), затем они передают а- и р-тубулины кофакторам Е и D (Tian et al. 1997) соответственно, которые вместе с тубулинами образуют тетрамерный комплекс. Присоединение кофактора С и последующий гидролиз ГТФ завершают сборку димера (Tian et al. 1999).

Изучение пути свертывания тубулиновых димеров у различных организмов показало, что есть вариации в его работе. Например, у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), как и высших эукариот, кофакторы жизненно необходимы для сборки тубулиновых димеров. А у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) шапероны сборки тубулиновых димеров не является жизненно необходимым и это указывает на то, что формирование димеров у высших эукариот и у S. pombe имеют больше общего, чем у S. cerevisiae. Основным отличием пути формирования у S. pombe от высших эукариот является ведущая роль кофактора D в сворачивании тубулиновых димеров (Radcliffe et al. 1999). Достоинством делящихся дрожжей, как объекта исследования, является простота различных генетических манипуляций, в отличие от клеток высших эукариот. Хотя у S. pombe путь формирования димеров жизненно необходим, однако были получены мутации в генах, кодирующих кофакторы сборки тубулиновых димеров, приводящие к температурочувствительности клеток: клетки с такими мутациями жизнеспособны в определенном диапазоне температур и не жизнеспособны либо при повышении (температурная чувствительность), либо при понижении (холодочувствительность) температуры. Подобные мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к исчезновению микротрубочек в клетках при росте на запрещающей температуре (Grishchuk and Mcintosh 1999; Hirata et al 1998; Radcliffe et al.1999; Radcliffe et al. 2000a). Есть основания думать, что тубулин-свертывающие кофакторы помимо сворачивания димеров, обладают и рядом других функций в клетке. Так было показано, что кофакторы D, Е и В в клетках животных при переизбытке обладают способностью разрушать димеры тубулина (Kortazar et al. 2006, 2007). Также, температурочувствительная мутация tsml-512 в гене, кодирующем кофактор D у S. pombe, генетически взаимодействует с мутациями в генах, кодирующих компоненты Комплекса Инициирующего Анафазу и протеасомы (Grishchuk et al. 1998). Мутации в генах, кодирующих кофакторы, приводят к разрушениям структур микротрубочек, что впоследствии приводит к неправильному делению клетки. Однако какие стадии митоза нарушаются при отсутствии функции кофакторов до настоящего времени не было известно. Этот вопрос являлся целью данной работы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа выполнялась с целью выявить роль кофактора D, участвующего в формировании нативной конформации тубулинового димера, в митозе.

Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач:

1. Определить частоту возникновения дефектов сегрегации хромосом в клетках S. pombe с мутациями кофактора D при помощи минихросомы, и определить, зависит ли она от условий роста клеток и функционального состояния кинетохорных комплексов.

2. С помощью генетических методов определить возможных "партнеров" кофактора D в клетке среди белков кинетохорного комплекса.

3. С помощью методов флуоресцентной микроскопии определить какие митотические процессы нарушены в клетках с мутациями кофактора D.

4. Исследовать причины, приводящие к медленному развитию митотических нарушений в клетках с мутациями кофактора D, используя различные методы синхронизации клеточного цикла.

Научная новизна. В работе показано, что клетки с мутациями кофактора D имеют повышенную частоту потери минихромосомы. Мутанты кофактора D генетически взаимодействует с компонентами кинетохора Disl, Mad2, MpHl, Abpl, что предполагает существенную роль кофактора D в установлении оптимального соединения кинетохора с микротрубочкой. Оба мутанта кофактора D имеют дефекты в прохождении метафазы. Также показано, что температурочувствительный фенотип alpl-1315 не связан с прохождением определенной фазы клеточного цикла при запрещенной температуре, белок Alpl-1315 перестает выполнять свою функцию уже после 2 часов пребывания при 36°С независимо от стадии клеточного цикла. Это означает, что в клетках с мутацией в гене, кодирующем кофактор D ар-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла при 36°С. Практическая значимость. Сбой в контроле клеточного деления приводит к таким событиям для клетки, как гибель или неконтролируемый рост. Исследование различных аспектов клеточного деления позволяет продвинуться в понимании фундаментальных механизмов, обеспечивающих правильность клеточного делениям. Кроме этого, было показано, что нарушение димеризации тубулина и недостаток микротрубочек приводит к возникновению у человека тяжелых заболеваний, таких как синдромы Sanjad-Sakati и Kenny-Caffey (Parvari et al. 2002). Поэтому исследование функции шаперонов тубулина является важной задачей, которая может иметь практическое значение для лечения подобных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мутации в кофакторе D приводят к повышению частоты потери минихромосомы. Степень этого эффекта зависит от условий роста клеток, от нарушений функционирования кинетохора, вызванного изменением уровня CENP-B-подобного белка Abplp, а также от нормального функционирования митотического чекпойнта.

2. Генетические взаимодействия мутантов кофактора D указывают на то, что - возможными партнерами кофактора D среди белков кинетохорного комплекса являются белки Abp 1 и Dis 1.

3. Нарушение функции кофактора D приводит к неправильной сегрегации хромосом скорее всего из-за отсутствия нормальной метафазной конфигурации. Этот дефект может быть вызван проблемами с поддержанием метафазной структуры веретена и/ или нарушениями кинетохор-микротрубочковых взаимодействий.

4. Гибель мутантов кофактора D через 4 часа после перевода клеток в условия, нарушающие работу этого белка, скорее всего, связана с тем, что при отсутствии функции кофактора D, оф-тубулиновые гетеродимеры способны функционировать на протяжении только одного клеточного цикла.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Федянина, Ольга Сергеевна

выводы

2. Возможными партнерами кофактора D среди белков кинетохорного комплекса являются белки Abpl и Dis 1.

4. ар-тубулиновые гетеродимеры при нарушении функции кофактора D способны функционировать на протяжении одного клеточного цикла.

Благодарности

За предоставленные штаммы и плазмиды благодарю: Т. Toda, М. Baum and L. Clarke, К. Gould, P. Russel, Т. E. Patterson and S. Sazer, M. Yanagida, I. Hagan. 3a помощь в выполнении генетических скрещиваний к.б.н. Е. JI. Грищук, к.б.н.П. Марданов, А. Тикуиов, А. Пивоварова, L. Tran, Е. Токареву, A. Book за выполнение эксперимента по синхронизации alpl-1315 в Ог-фазе, Е. Токареву за помощь в обработке фотографий клеток. За критическое прочтение манускрипта к.б.н. Пантелеева М.А., к.б.н. Молодцова М.И., к.б.н. Сударикова А.Б. Благодарю к.б.н. Куренную О.Н. и к.б.н. Бериташвили Д.Р. за поддержку, предоставление рабочего места и оборудования в ИБГ РАН. Огромная благодарность научным руководителям к.б.н. Е. JI. Грищук и д.б.н.Ф.И.

Атауллаханову.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федянина, Ольга Сергеевна, Москва

1. Alberts В., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, К. Roberts and J. D. Watson (1994) Molecular Biology of Cell. Garland publishing, USA.

2. Alfa C, Fantes P, Hyams J, Mcleod M, Warbrick E (1993) Experiments With Fission Yeast. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

3. Amor DJ, Kalitsis P, Sumer H, Choo KH (2004) Building the centromere: from foundation proteins to 3D organization. Trends Cell Biol 14:359-368

4. Armas-Portela R, Kremer L, Avila J (1991) The centromere protein CENP-B behaves as a microtubule-associated protein. Acta Histochem Suppl 41:37-43

5. Balczon RD, Brinkley BR (1987) Tubulin interaction with kinetochore proteins: analysis by in vitro assembly and chemical cross-linking. J Cell Biol 105:855-62

6. Baum M, Clarke L (2000) Fission yeast homologs of human CENP-B have redundant functions affecting cell growth and chromosome segregation. Mol Cell Biol 20:28522864

7. Bahler J, Steever AB, Wheatley S, Wang Y, Pringle JR, Gould KL, McCollum D (1998) Role of polo kinase and Midlp in determining the site of cell division in fission yeast. J Cell Biol. 143:1603-16.

8. Bernard P, Hardwick K, Javerzat JP (1998) Fission yeast bubl is a mitotic centromere protein essential for the spindle checkpoint and the preservation of correct ploidy through mitosis. J Cell Biol 143:1775-1787

9. Bhamidipati A, Lewis SA, Cowan NJ (2000) ADP ribosylation factor-like protein 2 (Arl2) regulates the interaction of tubulin-folding cofactor D with native tubulin. J Cell Biol 149:1087-1096

10. Booher RN, СЕ Alfa, JS Hyams and DH Beach (1989) The fission yeast cdc2/cdcl3/sucl protein kinase: regulation of catalytic activity and nuclear localization. Cell. 58(3):485-97

11. Brenner S, Pepper D, Berns MW, Tan E, Brinkley BR (1981) Kinetochore structure, duplication, and distribution in mammalian cells: analysis by human autoantibodies from scleroderma patients J Cell Biol. 91(1):95-102.

12. Caplow M, Fee L (2002) Dissociation of the tubulin dimer is extremely slow, thermodynamically very unfavorable, and reversible in the absence of an energy source. Mol Biol Cell 13:2120-2131

13. Chen C, Hong YK, Ontiveros SD, Egholm M, Strauss WM (1999) Single base discrimination of CENP-B repeats on mouse and human Chromosomes with PNA-FISH. Mamm Genome. 10(1): 13-8.

14. Chretien D, Flyvbjerg H, Fuller SD (1998) Limited flexibility of the inter-protofilament bonds in microtubules assembled from pure tubulin. Eur Biophys J. 27(5):490-500.

15. Ciosk R, Zachariae W, Michaelis C, Shevchenko A, Mann M, Nasmyth K(1998) An ESP1/PDS1 complex regulates loss of sister chromatid cohesion at the metaphase to anaphase transition in yeast. Cell. 93(6):1067-76.

16. Clarke L, Baum MP, 1990 Functional analysis of a centromere from fission yeast: a role for centromere-specific repeated DNA sequences. Mol Cell Biol 10:1863-1872

17. Cleveland DW, Lopata MA, Sherline P, Kirschner MW (1981). Unpolymerized tubulin modulates the level of tubulin mRNAs. Cell. 25:537-546.

18. Craig JM, Earnshaw WC, Vagnarelli P (1999) Mammalian centromeres: DNA sequence, protein composition, and role in cell cycle progression. Exp Cell Res. 246(2):249-62. Review.

19. Cunningham LA, Kahn RA. 2008. Cofactor D functions as a centrosomal protein and is required for the recruitment of the gamma -tubulin ring complex at centrosomes and organization of the mitotic spindle. J Biol Chem. Epub ahead of print.

20. Decottignies A, Zarzov P, Nurse P (2001) In vivo localization of fission yeast cyclin-dependent kinase cdc2p and cyclin В cdcl3p during mitosis and meiosis. J Cell Sci 114:2627-2640

21. Dhonukshe P, Barqmann BO, Gadella TW (2006) Arabidopsis tubulin folding cofactor В interacts with alpha-tubulin in vivo. Plant Cell Physiol. 47(10): 1406-1411.

22. Ding R, West RR, Morphew DM, Oakley BR, Mcintosh JR (1997) The spindle pole body of Schizosaccharomyces pombe enters and leaves the nuclear envelope as the cell cycle proceeds. Mol Biol Cell 8:1461-1479

23. Earnshaw WC, Machlin PS, Bordwell В J, Rothfield NF, Cleveland DW (1987) Analysis of anticentromere autoantibodies using cloned autoantigen CENP-B. Proc Natl Acad Sci USA. 84(14):4979-83.

24. Ekwall K, Olsson T, Turner BM, Cranston G, Allshire RC (1997) Transient inhibition of histone deacetylation alters the structural and functional imprint at fission yeast centromeres. Cell 91:1021 -1032

25. Elledge SJ (1996) Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. Science. 274(5293):!664-72. Review.

26. Fankhauser С, Reymond A, Cerutti L, Utzig S, Hofmann K, Simanis V (1995) The S. pombe cdcl5+ gene is a key element in the reorganization of F-actin at mitosis. Cell 82:435-444

27. Fankhauser C, Marks J, Reymond A, Simanis V (1993) The S. pombe cdcl6* gene is required both for maintenance of p34cdc2 kinase activity and regulation of septum formation: a link between mitosis and cytokinesis? EMBO J 12:2697-2704

28. Fitzgerald-Hayes M, Clarke L, Carbon J (1982) Nucleotide sequence comparisons and functional analysis of yeast centromere DNAs. Cell. 29(l):235-44.

29. Forsburg SL, Nurse P (1991) Cell cycle regulation in the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Annu Rev Cell Biol. 1991;7:227-56. Review.

30. Fowler KJ, Hudson DF, Salamonsen LA, Edmondson SR, Earle E, Sibson MC, Choo KH (2000) Uterine dysfunction and genetic modifiers in centromere protein B-deficient mice. Genome Res. 10(1):30-41.

31. Furuya K, Takahashi K, Yanagida M (1998) Faithful anaphase is ensured by Mis4, a sister chromatid cohesion molecule required in S phase and not destroyed in Gi phase. Genes Dev. 12(21):3408-3418.

32. Gao Y, Thomas JO, Chow RL, Lee GH, Cowan NJ (1992)A cytoplasmic chaperonin that catalyzes beta-actin folding. Cell. 69(6): 1043-50.

33. Gao Y, Vainberg IE, Chow RL, Cowan NJ (1993) Two cofactors and cytoplasmic chaperonin are required for the folding of alpha- and beta-tubulin. Mol Cell Biol. 13(4):2478-85.

34. Glover, D.M., Hagan, I.M., and Tavares, A. (1998). Polo kinases: a team that plays throughout mitosis. Genes Dev. 12,3777-3787

35. Gordon С, McGurk G, Dillon P, Rosen C, Hastie ND (1993) Defective mitosis due to a mutation in the gene for a fission yeast 26S protease subunit. Nature. 366:355-357

36. Gordon C, McGurk G, Wallace M, Hastie ND (1996) A conditional lethal mutant in the fission yeast 26 S protease subunit mts3+ is defective in metaphase to anaphase transition. J Biol Chem 271:5704-5711

37. Goshima G, Saitoh S, Yanagida M (1999) Proper metaphase spindle length is determined by centromere proteins Mis 12 and Mis6 required for faithful chromosome segregation. Genes Dev 13:1664-1677

38. Grishchuk EL, Mcintosh JR (1999) Stolp, a fission yeast protein similar to tubulin folding cofactor E, plays an essential role in mitotic microtubule assembly. J Cell Sci 112:1979-1088.

39. Grishchuk EL, Howe JL, Mcintosh JR (1998) A screen for genes involved in the anaphase proteolytic pathway identifies tsml+, a novel Schizosaccharomyces pombe gene important for microtubule integrity. Genetics 149:1251-1264

40. Grynberg M, Jaroszewski L, Godzik A (2003) Domain analysis of the tubulin cofactor system: a model for tubulin folding and dimerization. BMC Bioinformatics 4:46у

41. Hagan IM (1998) The fission yeast microtubule cytoskeleton. J Cell Sci 111:16031612

42. Hahnenberger KM, Baum MP, Polizzi CM, Carbon J, Clarke L (1989) Construction of functional artificial minichromosomes in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Proc Natl Acad Sci U S A 86:577-581

43. Halverson D, Baum M, Stryker J, Carbon J, Clarke L (1997) A centromere DNA-binding protein from fission yeast affects chromosome segregation and has homology to human CENP-B. J Cell Biol 136:487-500

44. Hansen WJ, Cowan NJ, Welch WJ (1999) Prefoldin-nascent chain complexes in the folding of cytoskeletal proteins. J Cell Biol. 145(2):265-77.

45. Hardwick KG, RC Johnston, DL Smith, and AW Murray 2000 MAD3 encodes a novel component of the spindle checkpoint which interacts with Bub3p, Cdc20p, and Mad2p. J Cell Biol. 148(5):871-82.

46. Hardwick KG, Weiss E, Luca FC, Winey M, Murray AW (1996) Activation of the budding yeast spindle assembly checkpoint without mitotic spindle disruption. Science 273: 953-956.

47. He X, Patterson ТЕ, Sazer S (1997) The Schizosaccharomyces pombe spindle checkpoint protein Mad2p blocks anaphase and genetically interacts with the anaphase-promoting complex. Proc Natl Acad Sci U S A 94:7965-7970

48. He X, Jones MN, Winey M, Sazer S (1998) Mphl, a member of the Mpsl-like family of dual specificity protein kinases, is required for the spindle checkpoint in S. pombe. J Cell Sci 111:1635-1647

49. Hirano T, Hiraoka Y, Yanagida M (1988) A temperature-sensitive mutation of the Schizosaccharomyces pombe gene nuc2+ that encodes a nuclear scaffold-like protein blocks spindle elongation in mitotic anaphase. J Cell Biol 106:1171-1183

50. Hiraoka Y, Toda T, Yanagida M (1984) The NDA3 gene of fission yeast encodes beta-tubulin: a cold-sensitive nda3 mutation reversibly blocks spindle formation and chromosome movement in mitosis. Cell 39:349-358

51. Hirata D, Masuda H, Eddison M, Toda T (1998) Essential role of tubulin-folding cofactor D in microtubule assembly and its association with microtubules in fission yeast. EMBO J 17:658-666

52. Hoffmann I, PR Clarke, MJ Marcote, E Karsenti, and G Draetta (1993) Phosphorylation and activation of human cdc25-C by cdc2~cyclin В and its involvement in the self-amplification of MPF at mitosis. EMBO J. 12(l):53-63.

53. Hoffman DB, CG Pearson, TJ Yen, В J Howell, and ED Salmon (2001) Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins atPtKl kinetochores. Mol Biol Cell. 12(7):1995-2009.

54. Hoyt MA, L Totis and ВТ Roberts (1991) S. cerevisiae genes required for cell cycle arrest in response to loss of microtubule function. Cell. 66(3):507-17.

55. Hoyt MA, Маске JP, Roberts ВТ, Geiser Ж (1997) Saccharomyces cerevisiae PAC2 functions with CIN1, 2 and 4 in a pathway leading to normal microtubule stability. Genetics 146:849-857

56. Hoyt MA, Stearns T, Botstein D (1990) Chromosome instability mutants of Saccharomyces cerevisiae that are defective in microtubule-mediated processes. Mol Cell Biol 10:223-234

57. Hwang LH, Lau LF, Smith DL, Mistrot CA, Hardwick KG, Hwang ES, Amon A, Murray AW (1998) Budding yeast Cdc20: a target of the spindle checkpoint. Science. 279(5353): 1041-4.

58. Ikui AE, Furuya K, Yanagida M, Matsumoto T (2002) Control of localization of a spindle checkpoint protein, Mad2, in fission yeast. J Cell Sci 115:1603-1610

59. Irelan J T, Gutkin GI, Clarke L (2001) Functional redundancies, distinct localizations and interactions among three fission yeast homologs of centromere protein-B. Genetics 157:1191-1203

60. Izumi T, JL Mailer (1993) Elimination of cdc2 phosphorylation sites in the cdc25 phosphatase blocks initiation of M-phase. Mol Biol Cell. 4(12):1337-50.

61. Izumi T, JL Mailer (1995) Phosphorylation and activation of the Xenopus Cdc25 phosphatase in the absence of Cdc2 and Cdk2 kinase activity. Mol Biol Cell. 6(2):215-26.

62. Kim SH, Lin DP, Matsumoto S, Kitazono A, Matsumoto T (1998) Fission yeast Slpl: an effector of the Mad2-dependent spindle checkpoint. Science. 79(5353):1045-7.

63. King RW, J-M Peters, S Tugendreich, M Rolfe, P Hieter and MW Kirschner (1995) A 20S complex containing CDC27 and CDC 16 catalyzes the mitosis-specific conjugation of ubiquitin to cyclinB. Cell. 81(2):279-88.

64. Kitagawa К, H Masumoto, M Ikeda, and T Okazaki (1995) Analysis of protein-DNA and protein-protein interactions of centromere protein В (CENP-B) and properties of the DNA-CENP-B complex in the cell cycle. Mol Cell Biol. 15(3):1602-12.

65. Kitamura К, H Maekawa, and С Shimoda (1998) Fission yeast Ste9, a homolog of Hctl/Cdhl and Fizzy-related, is a novel negative regulator of cell cycle progression during Gl-phase. Mol Biol Cell. 9(5): 1065-80.

66. Kobayashi Y, S Saitoh, Y Ogiyama, S Soejima, К Takahashi (2007) The fission yeast DASH complex is essential for satisfying the spindle assembly checkpoint induced by defects in the inner-kinetochore proteins. Genes Cells. 12:311-328

67. Kovelman Rand P Russell (1996) Stockpiling of Cdc25 during a DNA replication checkpoint arrest in Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol. 16(l):86-93.

68. Kortazar D, Carranza G, Bellido J, Villegas JS, Fanarraga ML, Zabala JS (2006) Native tubulin-folding cofactor E purified from baculovirus-infected Sf9 cells dissociates tubulin dimers. Protein Expr Purif. 49(2): 196-202.

69. Kortazar D, Fanarraga ML, Carranza G, Bellido J, Villegas JS, Avila J, Zabala JS (2007) Role of cofactors В (TBCB) and E (TBCE) in tubulin heterodimer dissociation. Exp Cell Res. 313(3):425-436

70. Kumada К, T Nakamura, К Nagao, H Funabiki, T Nakagawa and M Yanagida (1998) Cutl is loaded onto the spindle by binding to Cut2 and promotes anaphase spindle movement upon Cut2 proteolysis. Curr Biol. 8(11):633-41.

71. Kumagai A, Dunphy WG. (1996). Purification and molecularcloningof Plxl, a Cdc25-regulatory kinase fromXenopus egg extracts. Science 273, 1377-1380

72. Lee Ж, Huberman JA, Hurwitz J (1997) Purification and characterization of a CENP-B homologue protein that binds to the centromeric K-type repeat DNA of Schizosaccharomyces pombe. Proc Natl Acad Sci U S A 94:8427-8432

73. Le Goff X, Woollard A, Simanis V (1999) Analysis of the cpsl gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262(l):163-72.

74. Lew DJ, Burke DJ (2003) The spindle assembly and spindle position checkpoints. Annu. Rev. Genet. 37: 251-282

75. Lewis SA, G Tian and NJ Cowan (1997) The alpha- and beta-tubulin folding pathways. Trends Cell Biol. 7(12):479-84.

76. Li R and AW Murray (1991) Feedback control of mitosis in budding yeast. Cell. 66(3):519-31.

77. Li Y and R Benezra (1996) Identification of a human mitotic checkpoint gene: hsMAD2. Science. 274(5285):246-8.

78. Locovei AM, M-G Spiga, К Tanaka, Y Murakami, and G D'Urso (2006) The CENP-B homolog, Abpl, interacts with the initiation protein Cdc23 (MCM10) and is required for efficient DNA replication in fission yeast. Cell Div. 1:27.

79. Lopez-Fanarraga M, Avila J, Guasch A, Coll M, Zabala JC (2001) Review: postchaperonin tubulin folding cofactors and their role in microtubule dynamics. J Struct Biol 135:219-229

80. Lopez-Girona А, В Furnari, О Mondesert and P Russell (1999) Nuclear localization of Cdc25 is regulated by DNA damage and a 14-3-3 protein. Nature. 97(6715):172-5.

81. Lytle BL, Peterson FC, Qiu SH, Luo M, Zhao Q, Markley JL, Volkman BF (2004) Solution structure of a ubiquitin-like domain from tubulin-binding cofactor B. J Biol Chem 279:46787-46793

82. McKay GJ and LR Cooke (1997) A PCR-based method to characterise and identify benzimidazole resistance in Helminthosporium solani. FEMS Microbiol Lett. 152(2):371-8.

83. Maclver FH, К Tanaka, AM Robertson and IM Hagan (2003) Physical and functional interactions between polo kinase and the spindle pole component Cutl2 regulate mitotic commitment in S. pombe. Genes Dev 17(12):1507-23.

84. Mallavarapu A, Sawin K, Mitchison T (1999) A switch in microtubule dynamics at the onset of anaphase В in the mitotic spindle of Schizosaccharomyces pombe. Curr Biol 9:1423-1426

85. Maiato H, DeLuca J, Salmon ED, Earnshaw WC (2004) The dynamic kinetochore-microtubule interface. J Cell Sci 117:5461-5477

86. Martin L, Fanarraga ML, Aloria K, Zabala JC (2000) Tubulin folding cofactor D is a microtubule destabilizing protein. FEBS Lett 470:93-95

87. Matsumoto T (1997) A fission yeast homolog of CDC20/p55CDC/Fizzy is required for recovery from DNA damage and genetically interacts with p34cdc2. Mol Cell Biol. 17(2):742-50.

88. Masumoto H, Masukata H, Muro Y, Nozaki N, Okazaki T (1989) A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109(5): 1963-73.

89. Mcintosh JR (1991) Structural and mechanical control of mitotic progression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 56:613-9. Review.

90. Mcintosh JR, Grishchuk EL, West RR (2002) Chromosome-microtubule interactions during mitosis. Annu Rev Cell Dev Biol 18:193-219

91. Melki R, Vainberg IE, Chow RL, Cowan nJ (1993) Chaperonin-mediated folding of vertebrate actin-related protein and gamma-tubulin. J Cell Biol. 122(6):1301-10.

92. Michaelis C, R. Ciosk, K. Nasmyth (1997) Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell. 91(l):35-45.

93. Millband DN, Hardwick KG (2002) Fission yeast Mad3p is required for Mad2p to inhibit the anaphase-promoting complex and localizes to kinetochores in a Bublp-, Bub3p-, and Mph 1 p-dependent manner. Mol Cell Biol 22:2728-2742.

94. Mitchison and Nurse (1985) Growth in cell length in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 75:357-76.

95. Mondesert О, McGowan CH, Russel P (1996) Cig2, a B-type cyclin, promotes the onset of S in Schizosaccharomyces pombe. Mol Cell Biol. 16(4): 1527-33.

96. Moreno S, J Hayles and P Nurse (1989) Regulation of p34cdc2 protein kinase during mitosis. Cell. 58(2):361-72.

97. Moreno S, Klar A, Nurse P (1991) Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe, pp. 795-823 in Methods in Enzymology, edited by C. guthrie and g. Fink. Academic Press, Inc., New York.

98. Moser BA and P Russell (2000) Cell cycle regulation in Schizosaccharomyces pombe. Curr Opin Microbiol. 3(6):631-6. Review.

99. Mulvihill DP Mulvihill, J Petersen, H Ohkura, David M. Glover,1" and IM Hagan (1999) Plol kinase recruitment to the spindle pole body and its role in cell division in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell.l0(8):2771-85.

100. Murakami Y, Huberman JA, Hurwitz J (1996) Identification, purification, and molecular cloning of autonomously replicating sequence-binding protein 1 from fission yeast Schizosaccharomyces pombe. ProcNatl Acad Sci U S A 93:502-507

101. Nakagawa H, Lee JK, Hurwitz J, Allshire RC, Nakayama J, Grewal SI, Tanaka K, Murakami Y (2002) Fission yeast CENP-B homologs nucleate centromeric heterochromatin by promoting heterochromatin-specific histone tail modifications. Genes Dev 16:1766-1778

102. Nakaseko Y, Goshima G, Morishita J, Yanagida M (2001) M phase-specific kinetochore proteins in fission yeast: microtubule-associating Disl and Mtcl display rapid separation and segregation during anaphase. Curr Biol 11:537-549

103. Nasmyth K, Peters JM, Uhlmann F (2000) Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science. 288(5470): 1379-85. Review.

104. Nigg, E.A. (1998). Polo-like kinases: positive regulators of cell division from start to finish. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 776-783.

105. Novak B, Mitchison JM (1989) The first transition point of the mutant cdc2.33 in the fission yeast S. pombe. J Cell Sci. 94: 657-662

106. Ohkura H, Adachi Y, Kinoshita N, Niwa O, Toda T, Yanagida M (1988) Cold-sensitive and caffeine-supersensitive mutants of the Schizosaccharomyces pombe dis genes implicated in sister chromatid separation during mitosis. EMBO J 7:1465-1473

107. Syndrome Consortium, Mutation of TBCE causes hypoparathyroidism-rand and autosomal recessive Kenny-Caffey syndrome, Nat. Genet. 32: 448^152.

108. Perez-Castro AV, Shamanski FL, Meneses JJ, Lovato TL, Vogel KG, Moyzis RK, Pedersen R (1998) Centromeric protein В null mice are viable with no apparent abnormalities. Dev Biol.201(2):135-43.

109. Petersen J and IM Hagan (2005) Polo kinase links the stress pathway to cell cycle control and tip growth in fission yeast. Nature. 435(7041):507-12.

110. Polizzi С and L Clarke, (1991) The chromatin structure of centromeres from fission yeast: differentiation of the central core that correlates with function. J Cell Biol. 112(2):191-201.

111. Radcliffe PA, Hirata D, Vardy L, Toda T (1999) Functional dissection and hierarchy of tubulin-folding cofactor homologues in fission yeast. Mol Biol Cell 10:2987-3001

112. Radcliffe PA, Garcia MA, Toda T (2000a) The cofactor-dependent pathways for alpha- and beta-tubulins in microtubule biogenesis are functionally different in fission yeast. Genetics 156:93-103

113. Radcliffe PA, Vardy L, Toda T (2000b) A conserved small GTP-binding protein Alp41 is essential for the cofactor-dependent biogenesis of microtubules in fission yeast. FEBS Lett 468:84-88

114. Radcliffe P, Hirata D, Childs D, Vardy L, Toda T (1998) Identification of novel temperature-sensitive lethal alleles in essential beta-tubulin and nonessential alpha 2-tubulin genes as fission yeast polarity mutants. Mol Biol Cell 9:1757-1771

115. Ren Y, Zhao J, Feng J (2003) Parkin binds to alpha/beta tubulin and increases their ubiquitination and degradation. J Neurosci 23:3316-3324

116. Rieder CL, Cole RW, Khodjakov A, Sluder G (1995) The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130(4):941-8.

117. Ritzi M and Knippers R (2000) Initiation of genome replication: assembly and disassembly of replication-competent chromatin. Gene. 245(l):13-20. Review.

118. Saitoh S, Takahashi K, Yanagida M (1997) Mis6, a fission yeast inner centromere protein, acts during Gl/S and forms specialized chromatin required for equal segregation. Cell. 90(1): 131-143

119. Samejima I, Yanagida M (1994) Bypassing anaphase by fission yeast cut9 mutation: requirement of cut9+ to initiate anaphase. J Cell Biol 127:1655-1670

120. Sawin KE, Nurse P (1998) Regulation of cell polarity by microtubules in fission yeast. J Cell Biol.l42(2):457-471

121. Shern JF, Sharer JD, Pallas DC, Bartolini F, Cowan NJ, Reed MS, Pohl J, Kahn RA (2003) Cytosolic Arl2 is complexed with cofactor D and protein phosphatase 2A. J Biol Chem 278:40829-40836

122. Shultz T, Shmuel M, Hyman T, Altschuler Y. 2008. Beta-tubulin cofactor D and ARL2 take part in apical junctional complex disassembly and abrogate epithelial structure. FASEB J. 22:168-182.

123. Stearns T, Hoyt MA, Botstein D (1990) Yeast mutants sensitive to antimicrotubule drugs define three genes that affect microtubule function. Genetics 124:251-262

124. Stern В and P Nurse (1996) A quantitative model for the cdc2 control of S phase and mitosis in fission yeast. Trends Genet. 12(9):345-50. Review.

125. Symchen G (1978) Cell cycle mutants. Ann. Rev. Genet. 12:161-191

126. Szymanski D (2002) Tubulin folding cofactors: half a dozen for a dimer. Curr Biol 12:R767- R769

127. Takahashi K, S Murakami, Y Chikashige, H Funabiki, О Niwa, and M Yanagida, (1992) A low copy number central sequence with strict symmetry and unusual chromatin structure in fission yeast centromere. Mol Biol Ceil. 3(7):819-35.

128. Takahashi K, Yamada H, Yanagida M (1994) Fission yeast minichromosome loss mutants mis cause lethal aneuploidy and replication abnormality. Mol Biol Ceil 5:11451158

129. Taveres AA, DM Glover, and CE Sunkel (1996) The conserved mitotic kinase polo is regulated by phosphorylation and has preferred microtubule-associated substrates inDrosophila embryo extracts. EMBO J. 15(18):4873-83.

130. Tian G, Huang Y, Rommelaere H, Vandekerckhove J, Ampe C, Cowan NJ (1996) Pathway leading to correctly folded beta-tubulin. Cell 86:287-296

131. Tian G, Bhamidipati A, Cowan NJ, Lewis SA (1999) Tubulin folding cofactors as GTPase-activating proteins. GTP hydrolysis and the assembly of the alpha/beta-tubulin heterodimer. J Biol Chem 274:24054-24058

132. Tian G, Lewis SA, Feierbach B, Stearns T, Rommelaere H, Ampe C, Cowan NJ (1997), Tubulin subunits exist in an activated conformational state generated and maintained by protein cofactors. J Cell Biol 138:821-832

133. Toda T, Adachi Y, Hiraoka Y, Yanagida M (1984) Identification of the pleiotropic cell division cycle gene nda2+ as one of two different alpha-tubulin genes in Schizosaccharomycespombe. Cell 37:233-242

134. Toda T, Umesono K, Hirata A, Yanagida M (1983) Cold-sensitive nuclear division arrest mutants of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Mol Biol 168:251270

135. Tyson JJ, A Csikasz-Nagy, В Novak (2002) The dynamics of cell cycle regulation. Bioessays. 24(12): 1095-109. Review.

136. Uhlmann F, D Wemic, M Poupart, E Koonin, К Nasmyth, (2000) Cleavage of cohesin by the CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 103(3):375-86.

137. Umesono K, Toda T, Hayashi S, Yanagida M (1983) Cell division cycle genes nda2+ and nda3+ of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe control microtubular organization and sensitivity to anti-mitotic benzimidazole compounds. J Mol Biol 168:271-284

138. Uzawa S, Samejima I, Hirano T, Tanaka K, Yanagida M (1990) The fission yeast cutl+ gene regulates spindle pole body duplication and has homology to the budding yeast ESP1 gene. Cell 62:913-925

139. Vainberg, S. Lewis, H. Rommelaere, C. Ampe, J. Vandekerckhove, H. Klein, N. Cowan (1998) Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 93(5):863-73. •

140. Vardy L, Toda T (2000) The fission yeast gamma-tubulin complex is required in G(l) phase and is a component of the spindle assembly checkpoint. EMBO J. 19(22):6098-6111к

141. Waters JC, R-H Chen, AW Murray, and ED Salmon (1998) Localization of Mad2 to kinetochores depends on microtubule attachment, not tension. J Cell Biol. 141(5):1181-91.

142. Weiss E and M Winey (1996) The Saccharomyces cerevisiae spindle pole body duplication gene MPS1 is part of a mitotic checkpoint. J Cell Biol. 132(1-2): 111-23.

143. Yamada H, Kumada K, Yanagida M (1997) Distinct subunit functions and cell cycle regulated phosphorylation of 20S APC/cyclosome required for anaphase in fission yeast. J Cell Sci 110:1793-1804

144. Yamashita YM, Nakaseko Y, Samejima I, Kumada K, Yamada H, Michaelson D, Yanagida M (1996) 20S cyclosome complex formation and proteolytic activity inhibited by the cAMP/PKA pathway. Nature 384:276-279

145. Yanagida M (2000) Cell cycle mechanisms of sister chromatid separation; roles of Cutl/separin and Cut2/securin. Genes Cells 5:1-8

146. Yoda K, S Ando, A Okuda, A Kikuchi, T Okazaki, (1998) In vitro assembly of the CENP-B/alpha-satellite DNA/core histone complex: CENP-B causes nucleosome positioning. Genes Cells. 3(8):533-48.

147. Yokota S, Yanagi H, Yura T, Kubota H (1999) Cytosolic chaperonin is up-regulated during cell growth. Preferential expression and binding to tubulin at G(l)/S transition through early S phase. J Biol Chem. 274(52): 37070-37078.

Информация о работе

Федянина, Ольга Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Исследование роли тубулинового кофактора D в митозе у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы