Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транскрипционные факторы, вовлеченные в регуляцию генов стрессового ответа: протоонкогена С-FOS и ГЕМ-оксигеназы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Транскрипционные факторы, вовлеченные в регуляцию генов стрессового ответа: протоонкогена С-FOS и ГЕМ-оксигеназы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

Р Г Б ОД

На правах рукописи О , .„„ УДК 577.214/215

^ 4 АПР 1335

ЛАВРОВСКИЙ Ян Вадимович

ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ, ВОВЛЕЧЕННЫЕ В РЕГУЛЯЦИЮ ГЕНОВ СТРЕССОВОГО ОТВЕТА: ПРОТООНКОГЕНА С-РОБ И ГЕМ-ОКСИГЕНАЗЫ.

специальность: 03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ диффёренцировки клеток Института цитологии РАН и лаборатории фармакологии Рокфеллеровского университета, США.

Научные руководители:

доктор биологических наук В.А.Поспелов, профессор Н.Г.Абрахам,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.В.Томилин, доктор медичинских наук В.С.Гайцхоки ,

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный университет

| совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 144064, С.-Петербург, Тихорецкий проспект, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан

•И

195 года.'

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Л.Н.Писарева

Актуальность проблемы:

Оксидативньш стресс и острая форма воспаления, являясь одними из ключевых процессов в патофизиологии миокардиальной ишемии и инсульта, атеросклероза и ожоговой травмы, инфекционной интоксикации и гкпербилирубинемии, ультрафиолетового и радиационного облучения, стали предметом пристального изучения современной молекулярной медицины. Гены стрессового ответа, во многом определяющие дальнейшее течение патофизиологического процесса и процессов репарации, составляют большую группу, включающую множество генов, таких как: кодирующие белки теплового шока, иммуноглобулины, цитохромы, различные регуляторные белки и др.

Однако, одним из главных и наиболее интересных звеньев этой цепи являются ядерные факторы, способные регулировать транскрипцию с промоторов различных генов. Типичным представителем генов, кодирующих такие белки, является нормальный клеточный протооккоген с-/о.ч.

Являясь геном раннего ответа, с-/оя непосредственно связан с переходом клеток из заторможенного состояния к делению. Главная функция гена с-/оз - активация экспрессии генов, необходимых для клеточной пролиферации, при этом, однако, его собственная регуляция, как в интактных, так и в индуцированных к дифференцировке или пролиферации клетках, остается не до конца ясной. Известные на сей день регуляторные элементы, контролирующие экспрессию гена с-/о«, не обеспечивают её истинную динамику, поэтому одним из направлений в исследованиях ее регуляции является поиск новых регуляторных элементов и взаимодействующих с ними транскрипционных факторов.

Другим, не менее интересным звеном являются белки, выполняющие защитную функцию при локальном повреждении тканей, при котором клетки экспонированы к высокому уровню оксидантов, генерированных самими клетками в результате такого повреждения. Клетки, защищая себя от стресса, вызванного такими веществами, контролируют синтез реактивных окислительных радикалов. Эти радикалы служат вторичными посредниками для активации транскрипционных факторов, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов на уровне промотора.

Одним из типичных представителей стрессовых белков является гем-оксигеназа, играющая главную роль в рефляции метаболизма клеточного гема, необходимого для синтеза гемоглобина и других гемопротеиноп.

Продукты распада гема - биливердин и билирубин, продуцируемые локально, могут действовать как потенциальные физиологические антиоксиданты, подтверждая, что гем-оксигеназа - важное звено в защитной системе против оксидативного стресса\локального повреждения тканей.

Шли и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлось определение молекулярных механизмов острой фазы воспаления и клеточного ответа на оксидативный стресс на уровне транскрипционной регуляции. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентификация транскрипционных факторов, вовлеченных в патофизиологию оксидативного стресса и острой фазы воспаления;

2. Выяснение молекулярных механизмов транскрипционной регуляции генов стрессового ответа;

3. Поиск нуклеотидных последовательностей внутри данных генов, доступных для аффинной модификации с целью модуляции процессов воспаления и клеточного ответа на оксидативный стресс.

Научная новизна:

В промоторных областях генов гем-оксигеназы и с-/оя, являющихся генами стрессового ответа, обнаружены новые регуляторные участки, ответственные за модуляцию экспрессии данных генов при. ответе на оксидативный стресс и во время острой фазы воспаления.

Научная и практическая иекностъ:

Научной ценностью данной работы является создание модели транскрипционной модуляции генов стрессового ответа, открывающее новую сторону в изучении патофизиологии оксидативного стресса и воспаления. Практической ценностью данной работы являются:

1. Возможность использования разработанной модели для тестирования влияния биологически активных веществ на процессы оксидативного стресса и воспаления;

2. Разработка нозых лекарственных препаратов;

3. Искусственная модуляция экспрессии генов стрессового ответа, с целью изменения тканевого и клеточного ответа на оксидативный стресс.

Апробация работы. Результаты работы бьтк доложены на симпозиумах 'Транскрипционная регуляция клеточного цикла" (Киев, 1991), "Молекулярная биология гематопоэза", (Москва. 1992), Американского гематологического общества (St-Louis, 1993), FASEB (Anaheim. 1994). Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, обсуждения, вьтодов и списка литературы, включающего источника. Работа изложена на страницах и содержит 25 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.МАТЕРИАЛЫ:

Культуральные среды, сыворотки, и другие реактивы для клеточных культур были получены от фирмы "Gibco". Химические реактивы - от фирмы "Sigma", ферменты и олигонуклеотицы - от фирмы "Promega", радиоактивные препараты - от фирмы "Amersbam", реагенты для переноса генов - от "Stratagene".

2.КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ:

Клеточная линия К562 (клетки миелоидной лейкемии человека) была предоставлена банком клеточных культур (ЦИН, Санкт-Петербург) или Американской коллекцией клеточных культур. Клетки выращивались на среде RPM1-1640 с 10% эмбриональной сывороткой коровы в присутствии 20 шМ HEPES, 100 мкг/мл гентамицина, а атмосфере, содержащей 5% С Оз.

Капиллярные эндотелиальные клетки были выделены из миокарда новозеландского кролика и поддержаны в DME среде с 10% эмбриональной сыворотки коровы. Спецефические антитела к поверхностным антигенам показали, что 95% клеток представляли собой сосудистый эндотелий.

3.ПОСТОЯННЫЕ И ВРЕМЕННЫЕ ТРАНСФЕКНИИ:

При постоянной трансфекции один миллион клеток высевали на 75 смг флакон в среде DME с 10% эмбриональной сыворотки коровы при 37° С в атмосфере 5% СОг. Через 4 «аса среда заменялась средой без сыворотки, и клетки траксфецировались 20 мкг плазмидной ДНК кальций-фосфатным методом. Клетки инкубировались с плазмидой 4 часа в атмосфере 3% СОг, после чего среда менялась на обычную среду с 10% сывороткой. Через 20

часов к клеткам добавляли антибиотик G418 (500 мкг/мл) для селекции на устойчивость к неомицину. 2 недели спустя были изолированы индивидуальные клоны, амплифицированы и охарактеризованы Саузерн и Иозерн гибридизациями.

При временной трансфекции клетки через 24 часа после трансфекции были лизированы и проверены на активность

хлора.чфениколацетилтрансферазы по методу Горман. Для этого 50 мкг клеточного экстракта инкубировали со 100 мкг ацетилкофермента А и 0.1 мкКм 14С-хлорамфеникола. Продукты реакции разделяли тонкослойной хроматографией на силикагеле в системе метанол:хлороформ 1:19. 4.ПЛАЗМИДЫ.

ьлазмида fos-CAT, использованная для анализа промотора гена c-fos, была сделана следующим образом.

1. Фрагмент мышиного гена c-fos HindHI-XhoI (1200 п.н,) был клонирован в гшазмиду pBS ("Stratagene") по Hindlll-Sall сайтам,

2. Ген CAT был вырезан из плазмиды RSV-CAT ("Sigma") по BamHI-Hindlll, и клонирован в плазмиду pBluescriptSK ("Stratagene") по BamHI-HindlU.

3. CAT из pBluescriptSK был вырезан по BamHI-Clal и клонирован в pBS-fos по Narl-Bamlil сайтам.

Следующие п пазмиды были использованы для 5'-делеционного анализа промотора гена гем-оксигеназы:

(A)-конструкт был получен путём клонирования EcoRI-XhoI фрагмента (1500 п.н.) человеческого гена гем-оксигеназы в pBluescriptSK по EcoRI-XhoI. После этого BamHI-XhoI фрагмент, содержащий промоторную область гена гем-оксигеназы был клонирован по BamHI-XhoI сайтам плазмиды tk-CAT вместо промотора гена тимидинкиназы.

(B)-конструкт был получен из (А) путём делеции Pstl-Pstl фрагмента.

(C)-конструкт был сделан из (В) делецией Hindlll-Smal фрагмента.

(Р)-конструкт был так же получен из (В) в результате делеции Aval-Aval

фрагмента.

Планиды pRc/CMV и CMV-gal были получены от "Invitrogene" и "Stratagene", соответственно. Плазмида pRc/CMVsHHO-1, содержащая кодирующую область человеческого гена гем-оксигеназы под промотором цитомегалонируса, била любезьо предоставлена д-ром Shibahara.

5.АНАЛИЗ РНК.

РНК выделяли гуанидинтиоцианатным методом. Для анализа экспрессии мРНК генов c-fos и гем-оксигеназы на 1.2% агарозный гель, содержащий 2.2 M формальдегид, наносили по 10 мкг РНК. Гибридизацию проводили в 7% SDS, ЗХ SSC, 1 мМ EDTA, и 1Z BSA при 60°С, используя в качестве зонда Pstl-PstI фрагмент гена v-fos (1000 п.н.), Xhol-Xbal фрагмент человеческого гена гем-оксигеназы (1100 п.н.), EcoRI-Hindlll фрагмент крысиного гена гем-оксигеназы (900 п.н.) или фрагмент гена G3PDH (контроль нанесения РНК на гель). Пробы метили методом ник-трансляции. Удельная радиоактивность была 5Х108 имп/мин/мкг. После .гибридизации фильтры дважды отмывали в 1% SDS, 0.1Х SSC, 0.5% BSA, 1 мМ EDTA при 60°С.

6.ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЯДЕРНЫХ ЭКСТРАКТОВ И МЕТОД ЗАДЕРЖКИ В ГЕЛЕ.

Клетки лизировались буфером, содержащим 0.32 M сахарозу, 3.0 мМ CaCla, 2.0 мМ MgCla, 0.1 мМ EDTA, 0.5Х тритон Х-100, 1.0 мМ DTT, 20 мМ HEPES, рН 8.0 (буфер No 1), в течение 15 минут на льду.

Ядра лизировались буфером, содержащим 20 мМ HEPES, рП 7.9, 25% глицерин. 0.42 M NaCl, 1.5 мМ MgCh, 0.2 мМ EDTA, 0.5 мМ DTT и 5 мкМ PMSF (буфер No 2).

Олигонуклеотиды были мечены у-[мР]-АТФ по 5'-концу полинуклеотидкиназой фага Т4, элюированы из полиакриламидного геля и очищены с помощью обращённофазовой хроматографии (Silasorb С8, градиент ацетонитрила 0-50%, содержащий 20 мМ LiClOi).

5 мкг ядерного экстракта, разведённого буфером No 3 (20 мМ IPPES, рН 7.9. 10% глицерин. 50 мМ KCI, 0.2 мМ EDTA, 0.5 мМ DTT, 5 мкМ PMSF), инкубировали с 2 мкг неспецифической ДНК (ДНК из тимуса телёнка, обработанная ультразнуком) в течение 15 минут на льду. После этого добавляли радиоактивно меченый олигонуклеотид (3000 Ки/ммоль), объём всех проб доводили до 20 мкл буфером No 3 и инкубировали в течение 15 минут при комнатной темперятуре. Далее пробы наносились на 4% полиакриламидный гель (лкриламид:бисакриламия 40:1). Электрофорез проводился в О.ЗХ трисборатном буфере, рП 7.9, при напряжении 10 В/гм » течение 2 часов. После этого гель высуширакся и анторадиографирова.игя с усиливающими экранами при -70"С в течение ночи.

- 8 -

7. ПОЛИМЕР АЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПНР!

Для анализа промотора гена гем-оксигеьазы 590 п.н. фрагмент был получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), с использованием 5'-прэймера А (5 '-ТС АСАТТТТАСССАССГОСА-З') и З'-праймера О (5-ТТСССГСТССССТТСС-З'). Праймеры соответствовали позициям -480 и +110 человеческого гена гем-оксигеназы и были сконструированы с использованием программы "О^орптеге" ("С1оп1есЬ").

ПЦР была выполнена с использованием 100 нг каждого праймера и 10 нг плазмиды (А), содержащей промотор гена гем-оксш'еназы, за 20 циклов: 5 минут - 94'С, 30 сек - 94°С, 30 сек - 50»С, 1 мин - 72°С, 10 мин - 72°С. Продукт был очищен хроматографией и радиоактивно мечен у-[мР]-АТФ по 5'-концам полинуклеотидкиназой.

8.АНАЛИЗ БЕЛОК-СВЯЗЫВАКШИХ САЙТОВ МЕТОДОМ ФУТПРИНТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНКазы-1.

Для анализа промотора гена с-/о.у с помощью защиты от ДНКазы-1 использовали фрагмент АуаЬРэИ из плазмиды Гоб-САТ, меченый а-[мР]-дЦТФ по Ауа1-сайту достройкой цепи фрагментом Клёнова.

Для анализа промотора гена гем-оксигеназы использовали радиоактивно меченый продукт ПЦР, гапролизованный с помощью рестриктазы Р$И.

Радиоактивно меченый фрагмент (приблизительно 20 тыс. имп/мин) ДНК инкубировали с 50 мкг ядерного экстракта или ДНК-связывающей единицей коммерческих транскрипционных факторов АР-1, АР-2, ЫР-кВ (р50), в буфере N0 3 8 течение 15 минут на льду, затем 2 мин при 25°С. ДНКазу-1 добавляли на 1 минуту в концентрации 1 ед/мл при 25°С. Реакцию останавливали стоп-раствором (1% ЗОБ, 0.1 М ЕОТА, 0.5 М №оАс, 100 мкг/мл тРНК). ДНК экстрагировали фенол-хлороформом, осаждали этанолом и анализировали в 6% полиакриламидном геле с 8 М мочевиной, в трисборатном буфере.

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

Ка модели фибробластов, интактных и обработанных митотическими факторами, была исследована регуляция протоонкогена с-]'оз. Было показано, что при стимуляции интактных клеток митогенами уровень мРНК гена о-/ох резко увеличивается и достигает максимального значения через 30 минут после начала стимуляции, в то время, как ДНК-связывающая активность факторов, взаимодействующих с основными регуляторными элементами промотора гена БКЕ (сывороточно регулируемый элемент) и АР-1,

появляется только через 6 часов после такой обработки.

В интактных непролиферирующих и пролиферирующих клетках количество мРНК гена с-/оз находилось на очень низком, неопределяемом методом Нозерн-гибридизации, уровне, в то время как активность факторов, взаимодействующих с указанными выше регуляторными элементами, находилась на высоком уровне в пролиферирующих клетках. В неделящихся клетках ДНК-связывающая активность данных факторов не проявлялась (Ьаугоуяку ег а!., 1993). Отсутствие корреляции между уровнем мРНК гена с-/оз" и активностью известных транскрипционных факторов позволяет предположить участие других регуляторных элементов и взаимодействующих с ними транскрипционных факторов, опосредующих регуляцию данного гена.

Исследовали связывание белков из ядерных экстрактов клеток, находящихся ка разных стадиях клеточного цикла, с фрагментом промотора мышиного гена с~/оя (600 п.н.), проклонированного в плазмиду рВЯ-Гоч-САТ (рис.1). ТАГА М/С

Для этого разделили этот фрагмент на несколько более мелких участков. Было показано, чте с фрагментом Ач'аМ^и (142 п.н.), находящимся перед 8!1:-С|!Я;и-,'ВКК1Щк>/, элементом, связывается белковый фактор из ядерных экстрактов, который отсутствует в цитоплазме. Более того, при инкубации исследованного фрагмента с ядерными экстрактами из покоящихся клеток на электрофореграмме присутствует только одна полоса, соответствующая ДНК-белковому комплексу, в то время как после инкубации данного фрагмента с ядерными экстрактами из делящихся клеток появляется ещё одна полоса, обладающая более высокой подвижностью а 47. полиакриламидном геле, чем указанная вь1ше (рис.2). Это можно было объяснить > > « • • » • » " « » либо наличием двух разных белков, взаимодействующих с „ашюй область» промотора, либо наличием двух разногх форм одного белка.

to*-»«

Рис. 2. Связывание ядерных белкон с фрагментами промотора гена c-fos Aval-PstI (1-0) и Hindlll-Aval (7-12) 1,2,4,6-3,10,12 - ядерные экстракты из пролиферирующих меток; 3,5,9.11 - ядерные экстракты из непролиферирующих клеток.

Для проверки этих гипотез и более точной локализации сайта связыдания мм разделили фрагмент Aval-PstI на несколько ещё более коротких фрагментов: Aval-Avail (30 п.н.), Avall-Sacll (70 п.н.) и SacU-Pstl (40 п.н.). Оказалось, что связывание происходит только с фрагментом Aval-AvalZ (30 п н.), причём характер связывания точно такой же, как с исходным фрагментом Aval-PstI.

Появление дополнительной полосы строго коррелировало с состоянием клеточного деления, что даёт повод предположить, что именно она соответствует модифицированной форме фактора, взаимодействующего с данным участком промотора. Кроме того, было показано, что при длительной инкубации клеток К562 с ТРА полностью исчезает верхняя полоса и заметно усиливается нижняя дополнительная, то есть все молекулы фактора переходят в модифицированную форму. Так как известно, что ТРА активирует прстеинкиназу С, то возможно, что модификация связана с фосфорилированием белка.

Все исследоеанные клетки (NIH3T3, U937, К562, МТ4 и асцитная карцинома Кребса) репрессировали данный фактор. Связызаниз факторов с

ДНК наиболее эффективно протекало при 0°С и не требовало присутствия DTT, Mg2' и Zn2*.

Разработанный метод аффинной фотомодификацни (Лавровский и ¿р., 1994) был применён для определения молекулярной массы ф.жтороя из ядерных экстрактов клеток К562, взаимодействующих с Avai-Avoll фрагментом. Молекулярные массы оказались одинаковы и состапили 59 кДа, что подтверждает гипотезу о наличии различных форм одного и того же белка.

С целью более точного определения последовательности ДНК промотора гена c-fos, взаимодействующей с ядерными факторами, фрагменты Aval-Avail (30 п.н.) ч Aval-PstI (142 п.н.) (рис.1) были иссле/тозаны методом футпринта с использованием ДНКазы-I. До обработки ДНКазой фрагменты инкубировали с ядерными экстрактами из пролифернрующих и покоящихся фибробластов и клеток К56Я Все использованные экстракты обладали способностью защищать от ДНКазы-I последовательность CGOAAC с обоих фрагментах ДНК, находящуюся между -430 и -474 позициями (фрагмент L, рис.3). При использовании олигонуклеотидов, соответствующих АР-1, АР-2, NF-кВ, TF1ID, SP1, ОКТ1, CREB, CTF/NF'l, метагло-, глюкокортакоил- и сывороточно- зависимым элементам, не было отмечено конкуренции за изучаемый ядерный фактор.

•565 TTOCTTCrCCTAATACCAGAGACTCAAAAAAAAAAAAAAAQTrcCAGATTGCrGGAC

FBSl FBS2

•50» аагг,агггс,с,отстсатссс1ТПагггтГ1ПОААСгпг.г.т1~гагаттг;алтгапг!

A L

•454 TCCCAAT

АГ2

ИК4

-лоз CGGccccGGTl'CCCccccrGCGCTGCACCcrc\GAQXuiirii£AQ

ар: AW ап р

•359 CCCGCGAGrTCTTCCCriTCAATrCCTCC(TCCTTTACACAgpATriTCCATATTAOGACA SIF SRI!

-.100 ТСТСГПТГ/Г;СЛГОТТТГС.АСП^ГСГ,Г.ТСГГГПГТ . 26S

Рис. 3. Структура дистальной части промотора гена

А-Ауя(, 1МЧ<[ сайты рестрикции; $!Г - элемент РПОР-зэнип'мой регуляции, ЭЙК - гмпороточпо-ззвисимый элемент.

- 12 -

Компьютерный анализ фрагмента Avai-PstI (142 п.к.) показал, что дистальный фрагмент Aval-Avail (30 п.н.) не является высоко консервативным, в го время как центральный фрагмент Avall-Sacll (70 п.н.) чрезвычайно консервативен (100% гомологии с соответствующим фрагментом промотора человеческого гена c-fos и 90% гомологии с фрагментами промоторов генов Int-1, HSP-70 и с-тус). _ Компьютерный анализ также выявил наличие нескольких AP-2-подобных сайтов в проксимальной части фрагмента Aval-Pstl (142 п.н.). Для проверки присутствия этих сайтов были выполнены футпринты с использованием рекомбинантных очищенных транскрипционных факторов АР-1 и АР-2. Связывания АР-1 фактора с данным фрагментом не наблюдалось, тогда как АР-2 белок связывал ДНК в четыре. рядом расположенных сайтах, как и было предсказано компьютерным анализом. Специфичность связывания была подтверждена в экспериментах с использованием специфичных (АР-2) и неспецифичных олигоиуклеотидов. Результаты схематизированы на рис.3.

Обработка человеческих эритролейкемических клеток К562 и кроличьих эндотелиальных клеток геном, НгОа, ростовыми факторами, такими как IL-1, IL-2, 1L-6, lFN-y, TNF-a, приводит к значительному повышению количества мРНК гем-оксигеназы в этих клетках.

Нозерн-гибридизация показывает, что механизм этого повышения зависит от концентрации биологически активных веществ и времени экспозиции к ним с максимумом около 30-40 минут. .

Одной из возможностей индукции гена гем-оксигеназы после стимуляции биологически активными веществами является активация специфических транскрипционных факторов. Для проверки этой гипотезы был применён метод задержки в геле. Были использованы олигонуклеотиды, соответствующие АР-1, АР-2, NF-кВ, TFHD, SPl, ОКТ1, CREB, CTF/NF1, металло (MP.E)-, глюкокортиксид (GRE)- и сывороточно (ЗНЕ)-зависимым элементам, инкубирован..je с ядерными экстрактами из кроветворных и эндотелиальных клеток, обработанных биологически активными веществами. На рис.4 приведены результаты типичного эксперимента, в котором использованы ядерные экстракты из контрольных и обработанных гемом (10 мкМ) в течение 30 минут К562 клеток. Наблюдали увеличение связывающей активнопи факторов, взаимодействующих с АР-1, CTF/NF1 и GRE, и снижение - с SRE и CREB. из клеток, обработанных гемом. Но наиболее впечатляющий эффект был получен с ЛР-2 и NF-кВ связывающими

активностями (рис.4). Они возрастали драматически после 5 минут инкубации с гемом, оставаясь повышенными более 1 часа. Пик возрастания транскрипционной активности выпадал на 20 минут. Специфичность связывания была подтверждена в экспериментах с задержкой в геле,' в которых использовались различные концентрации специфических и неспецифических олигонуклеотидов.

КАВСОЕРОН

К-л-

ы -

I*

Рис. 4. Связывание ядерных белков с олигонуклеотидами, соответствующими регуляторньш элементам.

а. Контрольные клетки - А; Клетки, обработанные гемом - В.

Ь. АР-2 (А-Э) и ЫР-кВ (Е-Н) олигонуклеотиды были инкубированы с ядерным экырактом из обработанных гемом клеток (А, Е), в присутствии 100Х (Б, Н), 10Х (С, в) молярного избытка конкурентных специфических (АР-2 и №-кВ соответственно) нерадиоактивных олигонуклеотидов и 100Х (В, Г) молярного избытка конкурентных неспецифических олигонуклеотидов.

С целью выяснения следующего вопроса - содержит ли ген гем-оксигеназы последовательности для взаимодействия с транскрипционными факторами АР-2 и №-кВ - промотор гека был амплифицирован с помощью ПЦР. Продукт реакции был инкубирован с рекомбинантными транскрипционными факторами АР-1, АР-2, ОТ-кВ (р49 к р50) и подвержен обработке ДНКазэй-1. Были обнаружены сайты для специфического связывания АР-2 и №-кВ (р50) факторов. АР-1 фактор не связывался с промотором человеческого гена гем-оксигеназы. АР-2 транскрипционный фактор связывался с областью (-130) - (-85) от сайга начала транскрипции, КИ-кВ - (-170) - (-150). №-кВ (р49) связывался с той же областью, что и

NF-icB (p50), но с более низкой эффективностью. Результаты этих экспериментов схематизированы на рис.5.

САГ

si! HSE GRE poly[d[T-G)! NFkB TRE AP-2 GRE USF TATA Г

—ея-йл--еюеШ-—

-520 -380 -320 Р -200 -170 -140 • -80 -40 +1

A/S Х/А

Рис. 5. Схематическое изображение промотора гена гем-оксигеназы. sil - сайленсер; HSE - элемент регуляции белками теплового шока; GRE -элемент, сходный с глюкокортико.чд-зависимым элементом; TRE - элемент регуляции форболовыми эфирами; USF - Мус/Мах-связывающий сайт. <f

Обнаружение АР-2 связывающего элемента в промоторных областях генов c-fc s и гем-оксигеназы, и NF-кВ элемента в промоторе гем-оксигеназы подтверждает важнось этих стрессовых генов в процессах, при которых активируются транскрипционные факторы АР-2 и NF-кВ. Функциональные АР-2 элементы были обнаружены в экхансерных областях вирусных и клеточных генов, включая SV4Q, металлотионеиновый НА, вируса человеческой 'Г-клеточной лейкемии (Тип I), мышиный главный комплекс гистосовместичости и человеческий К14. Форболовые эфиры. циклический АМФ. ретиноевая кислота индуцируют АР-2 активность, которая, как полагают, играет важную роль б регуляции генов клеточной дифференцировки.

NF-кВ - транскрипционный фактор, который активируется во многих клеточных типах в ответ на первичные (вирусы, бактерии, стрессовые факторы) или вторичные (медиаторы воспаления) патогенетические стимулы. Активированный фактор затем приводит к быстрой индукции генов, кодирующих ' защитные и сигнальные белки, давая основание рассматривать Nf-sB как ранний медиатор иммунного и воспалительного ответов. Белки семейства NF-кВ также участвуют,в контроле «легочного роста.

Функционалвный анализ промотора гена гем-оксигеназы был проведён с целью выяснения биологической важности .обнаруженных регуляторных элементов. Рис.5 показывает схематическую карту промотора человеческого гена гем-оксигеназы. Элементы, регулируемые белками теплового шока (HSE), форболовыми эфирами (TRE), Мус/Мах (USF), были обнаружены д-ром Shibahara. Два элемента, похожих на ORE, были предсказаны компьютерным

- 15 -

анализом. Функциональный анализ промотора гена гйм-окснгсназы был проведен с помощью временной трансфекции эндотелиальных клеток плазмидами, экспргссирующими CAT псе промотором гем-оксиге.чалм. Для этого были сконструированы 4 плазмиды, структура которых приведена на рис.6.

(А)

PUC-Э н В я

ill-г—

р

(В)

TATA

-О-

i II ♦ 1 А

АР-2

АР-2

(С)

1 А

н Р NFkB

-1—I-1 i-1 -«■

-280 AIS

Рис. 6. Структура плазмид, содержащих различные фрагменты промотора гена гем-оксигеназы.

H-HindIH, P-PstI, B-BamHI, R-EcoRI, A-Avat, S-Smaí, X-Xhol сайти рестрикции.

Начальные эксперименты с временными трансфекцилми позволили определить базальную промоторную активность всех конструктов а эндотелиальных клетках. Было показано, что конструкт (А) определяет максимальную промоторную активность, которая падает от (А) к (D). В последующих экспериментах конструкты были тестированы на способность индуцироваться медиаторами воспаления и оксидатипного стресса. Для этой цели эндотелиальные клетки, временно граксфецироваяные конструктами (А), (В). (С) или (D), обрабатывались IL-1. IL-2, IL-6, IFN-y, TNF-e, Н2О2. гемем.

А

Результаты показали, что конструкты (А), (В) и (С) были индуцибельны вышеуказанными агентами, но (А) обладал значительно меньшим потенциалом индуцнбельности. (D), лишённый инициирующего транскрипционного комплекса, как и ожидалось, не был способен вызывать экспрессию CAT.

Сильный противовоспалительный агент - дексаметазон был исследован на способность модулировать транскрипционную активность гем-оксигеназы. Было показано, что дексаметазон способен подавлять транскрипцию гем-оксигеназы. Только конструкты (А) и (В) репрессировались в эндотелиальных клетках, обработанных дексаметазоном. Это даёт возможность предположить, чго участок промотора гем-оксигеназы между (-280) и (-120) отвествен за подавление экспрессии данного гена дексаметазоном.

Была предпринята попытка определит^ существуют ли механизмы авторегуляции гем-оксигеназы через собственный промотор. Для этого кроличьи эндотелиальные клетки были временно и постоянно трансфецированы плазмидой, содержащей кДНК человеческой гем-оксигеназы под промотором цитомегаловируса (pRc/CMYsHHO-1). В качестве контроля была использована плазмида, содержащая ген галактозидазы под промотором цитомегаловируса (CMVgal). Экспрессия гем-оксигеназы в трансфецированных эндотелиальных клетках была подтверждена Саузерн и Нозерн гибридизациями и энзиматическим тестом на гемчжсигеназу. Контрольные (-) и экспрессирующие гем-оксигеназу (+) клетки были временно трансфецированы конструктами (А), (В), (С) и (D), однако анализ активности CAT не выявил прямого механизма авторегуляции экспрессии гена гем-оксигеназы. Только минимальный промотор (конструкт (С)) обладал повышенной активностью в (+) клетках. Для определения, разницы в ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов, взаимодействующих с конструктом (С), были выполнены футпринты с использованием ДНКазы-1. Было показано, что в (+) клетках только базальные транскрипционные факторы обладали более высокой ДНК-связывающей активностью по сравнению с (-) клетками.

Активация или репрессия транскрипции во многом зависят от взаимодействия транскрипционных активаторов или репрессоров с элементами базального транскрипционного комплекса. Базальные факторы, взаимодействуя с проксимальным промотором, обеспечивают корректную транскрипцию. Показано, что гем-оксигеназный ген не является исключением. Минимальный промотор (конструкт (С), рис.6) обеспечивает базальную

промоторную активность в эндотелиальных клетках. Но в то же время базальная активность конструктов (А) и (В) (рис.6) была выше, показывая, что дополнительные элементы могут быть вовлечены в промоторную активность в эндотелиалъных клетках. Конструкт (С) был способен индуцироваться медиаторами воспаления и оксидативного стресса так же, как и конструкт (В), доказывая, что проксимальный промотор (С) содержит сайт-специфические регуляторные элементы наряду с базальными. Конструкт (А) был менее индуцибельным, давая возможность предположить наличие элементов для негативной регуляции в дистальной части промотора Одни и те же стимулы, в принципе, могут приводить к активации позитивных и негативных транскрипционных факторов, взаимодействующих с проксимальной и дистальной частями промотора.

Одним из сильных негативных стимулов, как было показано, является дексаметазон. В целом, глюкокортикоиды могут действовать на экспрессию генов, изменяя процессинг белка, сплайсинг РНК или её стабильность. Но наиболее'частой мишенью их действия является транскрипция гена. Эти транскрипционные эффекты опосредованы прямым взаимодействием глюкокортикоидного рецептора с GRE в гене-мишени, или непрямым - через глюкокортикоид-индуцированные изменения в . уровне транскрипционных факторов (таких как c-Fos, c-Jun, с-Мус и пр.), которые, в свою очередь, регулируют экспрессию генов. Присутствие двух GRE-подобных сайтов было предсказано компьютерным анализом, но эксперименты с временной трансфекцией не ¡подтвердили участие этих элементов в регуляции гем-оксигеназы дексаметазоном. Промоторный участок (-280) - (-120), как было показано, отвечает за такую регуляцию. В этой области был обнаружен NF-кВ - подобный элемент.

Принимая во внимание, что NF-кВ является мишенью для действия стероидных и нестероидных противовоспалительных агентов (это было показано в последнее время в нескольких лабораториях), можно предположить, что NF-кВ элемент промотора гем-оксигеназы отвечает за репрессию транскрипции этого гена дексаметазоном.

Настоящие эксперименты направлены на определение физических взаимодействий транскрипционных факторов с промоторами стрессовых генов с учётом информационных взаимодействий и третичной структуры ДНК, а также обнаружение новых последовательностей, доступных для аффинной модификации.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ ДНК-связывающей активности ряда транскрипционных факторов в эритролейкемических человеческих клетках К562 и установлено, что транскрипционные факторы ЫИ-кВ и АР-2 активно вовлечены в клеточный ответ на оксидативный стресс.

2. В промоторных областях генов с-/оа и гем-оксигеназы идентифицирован регуляторный элемент АР-2 и показано его участие в регуляции этих генов.

3. Определена локализация сайта посадки нового транскрипционного фактора в дистальной части промотора гена с-/оз и определена его молекулярная масса.

4. В промоторе гена гем-оксигеиазы локализован регуляторный элемент, ответственный за связывание транскрипционного фактора №-кВ и показано, что он является возможной мишенью для репрессии данного гена дексаметазоном.

5. В экспериментах с постоянной и временной трансфекциями эндотелиальных клеток геном сем-оксигеназы прямого действия продукта этого гена на собственный промотор выявлено не было.

6. Выявлены нуклеотидные последовательности, доступные для аффинной модификации с целью модуляции воспалительного процесса и клеточного ответа на оксидативный стресс.

- 19 -

СТАТЬИ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1. Кислякопа Т., Поспелова Т., Светликова С., Лавровский Я., Поспелов В, Негативный контроль экспрессии онкогена c-fos в недифференциропанных

эмбриональных клетках F9. Доклады Академии Наук СССР, 310:1504-1506, 1990.

2. SVinarchuk F., Lavrovsky Y., Konevetz D., Vlassov V. Nuclear polypeptides specifically interacting with oligonucleotines. Nucl. Acids Research, 24:316, 1991.

3. Lavrovsky Y., Svinarchuk F., Lavrovsky V., Vlassov V. c-fos gene expression in spontaneously transformed mouse fibroblast cell line. Nucl. Acids Research, 24:315, 1991.

4. Lavrovsky V., Guvakova M., Lavrovsky Y. High frequency of tumor cell reversion to nontumorigenic phenotype. Eur. Cancer J., 28:17-2.1, 1992.

5. Лавровский Я., Свинарчук Ф., Лавровский В., Власов В. Регуляция экспрессии гена c-fos в трансформированных клеточных линиях, • ревертирующих к псевдонормальному фенотипу. Молекулярная Биология, 26:936-942, 1992.

6. Свинарчук Ф., Лавровский Я., Коневец Д., Власов В. Белки, специфически взаимодействующие с олигонуклеотидами. Молекулярная Биология, 27:305-308, 1993.

7. Lavrovsky Y., Svinarchuk F., Lavrovsky V., Yefremov Y., Vlassov V. c-fos gene expression in cells revertants from a transformed to a pseudonormal phenotype. FEES Letters, 316:161-164, 1993.

8. Lavrovsky Y., Scliwartzman M.L., Abraham N'.G. Novel regulatory sites of the human heme oxygenase-1 promoter region. Biochem. Biophys. Res. Comm., 196:336-341, 1993.

9. Lavrovsky Y., Schwartzman M„ Lavrovsky V., Abraham N.G. Characterization of a 142-bp fragment of the murine c-fos oncogene promoter upstream of SrF-binding element. Cene. 142:235-290, 1994.

10. Lavrovsky Y., Schwartzman M.L., Abraham N.G. Identification of NF-кВ and AP-2 binding sites ;n the promoter region of the human heme oxygenase-1 gene. Proe. Natl. Acad. Sci. USA, 91:5987-5991, 1994.

11. Лавровский Я., Свинарчук Ф., Ефремов Я., Мастюгин В., Власов В. Связывание ядерных белков с участком промотора гена c-fos.

локализованным в позиции (-464) - (-435), коррелирует с клеточной пролиферацией. Молекулярная Биология, 28:580-535, 1994.

12. Lavrovsky Y., Yefremov Y., Lavrovsky V. The reversion of cells of highly tumorigenic lines to non-tumorigenic phenotype associated to c-jun downexpression. FEBS Letters, 1995.

13. Schwartzman M.L., I_avrovsky Y., Stoltz R.A., Conners M.S., Falck J.R., Chauhan K., and Abraham N.G. Activation of Nuclear Factor кВ and Oncogene Expression by 12(R)-Hydroxyeicosatrienoic Acid, an Angiogenic Factor in Microvessel Endothelial Cells. Journal of Biol. Chem., 269:2432124327, 1994.

Отпечатано в типографии ПШФ

Зак. 172, тир.ЮО, уч.-изд.л.1; 3/11Ы995 г. Беоплатго