Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение семейства генов d4"

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Честков, Александр Викторович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЯЕГАШТА

на правах рукописи Г УДК 577.21

Честков Александр Викторович Изучение семейства генов <24.

Молекулярная биология С 03,00.03 )

ШСОЕРТАПИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: академик РАН. доктор биологических наук Г.П.ГЕОРГИЕВ; кандидат биологических наук

МОСКВА, 1999

J

.........................................................u-iv

1. ВВЕДЕНИЕ.................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................7

2.1. Транскрипционные факторы и их экспрессия в нервной системе...........................................................7

2.2. металлосвязызающие домены, особенности их

структуры и функций............................ 17

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................... 34

3.1. Материалы....................................... 34

3.2. Методы..........................................38

■j

4. РЕЗУЛЬТАТЫ............................................. 55

4.1. Экспрессия neuro-а4 б центральной нервной системе крысы в постнатальном развитии.... 57

4.2. Последовательности, гомологичные neuro-d4, присутствуют в геномах других позвоночных и зкопреооируютоя в нервных системах..............57

4.3. Экспрессия neuro-d4 в эмбриогенезе мыши.........60

4.4. Клонирование щШК гена neuro-d4 человека........64

4.5. Структура кдНК клонов...........................64

4.6. Первичная структура щ!НК гена neuro-d4 человека.67

4.7. Первичная структура предполагаемого белка.......69

4.8. Хромосомная локализация neuro-d4 гена человека

на панели соматических гибридов.................69

4.9. Клонирование геномных последовательностей, гомологичных neuro-d4 ив космидной библиотеки

генов человека.................................. 71

4.10. Анализ нуклеотидной последовательности космидных клонов в области, соответствующей зкзону 11 пеиго-ё4 гена крысы..................75

4.11. Локализация космид. соответствующих генам цЫ~а4 и сег-а4, на метафазных хромосомах человека.......................................75

4.12. Клонирование кЛНК тракскриптов других членов

а4-семейства у позвоночных.

,78

4.13. Поиск последовательностей. гомологичных

d4-домену 5 в GeriBank...........................79

5, ОБСУЖДЕНИЕ. ............................................ 85

5.1. Neuro-d4 ген детектируется в геномах млекопитающих с помощью neuro-а4~кДНК крысы......85

5.2. Кинетика экспрессии neuro-d4 гена в развивающейся нервной системе грызунов...........86

5.3. Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей neuro-d4 крысы и человека.... 87

5.4. Множественность d4-генов человека и хромосомная локализация..................____... 89

5.5. Строение и конформация d4-домена................. 91

5.6. Семейство о4-генов в геномах позвоночных.........95

6. ВЫВОДЫ................................................101

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

102

- 4 ~

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А ГАГР) - аденовин (АТФ) С(OTP) - цитовин (ДТФ) SC3TP) - гуанин СГТФ) Т(ТТР) - ткмндин (ТТФ)

М(МТР) - любой из вышеперечисленных нуклеотидов (трифосфатов)

U(UTP) - уриднн (УТФ)

ЗДТА - этиленлиаминтетраацетат (Трижш Б)

МеОН - метанол

NaPh - буферный раствор натрия фосфорнокислого

одно/двух/трехзамещенного о соотв. pH ТАЕ - ТРИО-ацетатный буферный раствор TBE - ТРИО-боратный буферный раствор ДЕАЕ - дизтилсшиноэтилцеллюлоза Дмии - диметилсульфоксид ЛША - днметилшормамид ДТТ - дитнотрейтол ФЙТЦ - фенилизотиоцианат " - время в минутах " - время в секундах

1, ВВЕДЕНИЕ

Исследование мозга - одна из древнейших областей науки. Его изучение сильно ускорилось к концу XIX века; новые методики, разработанные за последние тридцать лет. привели к значительным успехам, и в последнее десятилетие нейробиология стада одной из самых активных отраслей науки. Следствием этого недавно явился подлинный взрыв открытий и прозрений. Но тем не менее, изучение мозга только начинается. Констатация сложности мозга стала уже штампом, однако же это факт.

Проблема понимания работы мозга в чем-то сходна о проблемой понимания структур и функций макромолекул. Каждый организм содержит миллионы сложных изощренных молекулярных комбинаций, не говоря уже об отличиях индивидуумов и. тем более, особей разных видов. Для того, чтобы детально изучить полную структуру одной макромолекулы, по-видимому, потребуются годы, не говоря о том. чтобы узнать точно, как она работает. Точно также мозг состоит из очень большого числа функциональных подразделений, из которых каждое обладает своей особой архитектоникой и своей сетевой схемой; а дать описание одного из них вовсе не значит описать их вое. Поэтому понимание идет медленно (хотя бы по практическим причинам), но с прорывами и неуклонно, хотя вряд ли достигнет конечной точки,

У современных физиологов не вызывает сомнений, по крайней мере, один постулат: мозг является командным пунктом всего организма и вое сигналы, индуцирующиеся в нем, находят некий ответ либо в органах назначения, либо во внутренних структурах мозга, Но ведь возникновения, передачи и восприятия каждого сигнала не может

- о -

происходить бев присутствия в клетках соответствующих белков, которые синтезируются на свойственных только им транскриптах. А первоисточником любой мРНК является ген. экспрессия которого происходит в клетке. Поскольку в течение жизни зкопресоируются мириады генов, то нейроопецифичеокие гены имеют превалирующее значение, так как их продукты определяют, в конечном счете, экспрессию тканевых генов и, таким образом, их изучение является одним из важнейших пунктов молекулярной нейробиологии.

Изучение регуляции экспрессии генов остается одной ив сложнейших задал современной молекулярной биологии. Исследования последних лет показали, что практически вое гены эукариот имеют довольно сложную структуру. обуславливающую их правильную временную и тканеспецифичную экспрессию, а так же характер этой экспрессии. Регуляторная часть гена, обеспечивающая его работу в большинстве случаев находится в области. расположенной непосредственно перед точкой начала транскрипции и имеет размеры от нескольких десятков пар оснований до нескольких сотен тысяч пар оснований. Эта регуляторная часть может включать в себя модуляторы транскрипции. такие как оайленоеры и знхансерв последовательности ДНК, связывающиеся с

белками-транс-регуляторами. Регуляторная часть генов может иметь и последовательности ДНК, прямо не участвующие в регуляции транскрипции, но облегчающие выпетливаение или изгибание ДНК. а так же обеспечивающие рыхлую структуру хроматина, характерную для регуляторных областей.

Сам же механизм регуляции работы генов в настоящее время окончательно не прояснен. Можно говорить лишь об общих закономерностях регуляции экспрессии, з так же лишь о наиболее вероятных схемах активации и репрессии генов, не забывал о том.

нжи уикишшкй идедшшкввж шяш^ттш

множество механизмов настроили их точного действия.

В связи о вышеизложенным, каждое исследование. касающееся механизма регуляции генной активности представляет значительный интерес в сфере упорядочивания имеющихся знаний, и поиска новых решений описанной проблемы. Что же касается работ по исследованию генов-регуляторов в нервной системе, то они должны быть особенно интересны, так как повволяют пролить свет на первопричинную природу функционирования организма.

Цель настоящей работы состояла в характеристике нового нейроспецифического гена человека, имеющего в своей структуре металлоовязывашше домены. подобные ''цинковым пальцам", особенности его структуры и экспрессии.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Транскрипционные Факторы и их экспрессия в нервной системе.

Некоторые ядерные белки играют определенную роль в регуляции транскрипции и большинство их можно объединить названием "трансрегуяирующие факторы". Их функции - или ингибирование. или активапия экспрессии генов - выполняются посредством взаимодействия со специфическими пио-элементами - участками ЛИК определенной структуры (Ashburner М..1967; Baby Р.. Bhat S.L.,1980).

В противоположность прокариотичеоким пио-элементам при -10 и -35 нуклеотидах относительно сайта начала транскрипции, регуляторные элементы для РНК-полимеразы II могут находиться, как

до. так и после сайта качала транскрипции РКК данного гена (Reznikoff ¥.5,и ооавт..1985; Maniatis Т. и ооавт,, 1987; Jones N. С. и ооавт.Д988). Мутационный анализ показал, что каждый ген имеет ряд позитивных и негативных цис-элементов, расположенных в уникальной комбинации. Эти элементы являются сайтами связывания с оайто-специфичными транскрипционными факторами, которые являются активаторами или репреооорами транскрипции мРНК данного гена. Контрольная область в непосредственной близости от сайта инипиации транскрипции называется промотором, а регионы, регулирующие деятельность промотора. находясь на значительном от него расстоянии - энхансерами (Ptashne М., 1986). Некоторые промоторные элементы, такие как TATA, 80 и ССААТ боксы являю многих генов, транскрибирующихся полимеоазой II, но особых, сигнал-зависимых, транскрипционных регуляторов. Значение специализированных пио-элементов может сильно меняться, как из-за типа клеток, так и из-за типа физиологического сигнала, поскольку способности распознавания сайтов ДНК-связывающими факторами сильно меняются в различных условиях и тканях COndek В, и ооавт,, 1987; Schirm 3. и ооавт,, 1987; Shirayoshi Y. и ооавт., 1987; Sen к. и Baltimore D., 1986), Б результате конкуренции за сайты связывания может наблюдаться наложение и перекрывание транскрипционных факторов (Akerblom LE. и ооавт.» 1988; Comb М. и ооавт. f 1988; Schule R, и ооавт.. 1988; Strahle ü, и ооавт., 1988). Различные типы оайленоеров могут блокировать деятельность цио-линкерных знхзноеров (Lairníns L. и ооавт., 1986; Kühl D. и ооавт.. 1987; Finita и ооавт., 1388; Miyazaki J,и ооавт.* 1986), Кроме того, надо оказать, что у некоторых генов есть несколько сайтов инипиации транскрипции» транскрипция с каждого из которых регулируется связывающими сайтами, разными для разных

- О -

транскрипционных факторов (Simeone А, и соавт., JLS&8). Хотя взаимодействие между различными факторами еще не вполне понятно, но полагает, что уникальные для каждого гена комбинации цио-элементов являются основой для индивидуальных механизмов транскрипции (Mitchell Р. и Triian Е., 1989),

Многочисленное семейство транорегулирующих Факторов

стремительно пополняется за счет внедрения новых и модернизации старых методов обнаружения белков, связывающихся оо специфическими последовательностями ДНК, Некоторые факторы, идентифицированные в этих исследованиях, принадлежали к онкобелкзм или ядерным рецепторам гормонов, подчеркивая, тем самым, их фундаментальную роль в дифференцировке и развитии (Ptashne М., 1986),

Различные типы транскрипционных факторов характеризуются, в первую очередь, наличием своих функциональных доменов, узнающих специфическую последовательность ДНК и связывающихся с ней,

К первыму типу относятся транскрипционные Факторы, содержание наиболее простой по отроению, домен, структура которого представляет собой два участка а-опирали, разделенные плоским поворотом - "спираль-поворот-спираль" или гомеодомен, Впервые гомеодомен, состоящий ие 60 аминокислот, был идентифицирован как консервативный бедок в различных регуляторах эмбриогенеза дрозошиллы и обнаружен в генах позвоночных (Ptashne М, , 1986), Аминокислотная последовательность гомеодоменов отдаленно связана оо "спираль-поворот-спиральными" ДНК-связывающим структурами прокариотичеоких репрессоров и гомология по большинству гидрофобных и основных амининокислотных остатков между ними сохраняется.

Поскольку генетическим путем было идентифицировано взаимовлияние многих гомеодомен-содержащих белков лрозефиллы,

участвующих в регуляции эмбриогенеза, возникло предположение о шмеодсмен-содержащих белках, как о факторах, регулирующих транскрипцию генов путем связывания ДНК. Исследования, обнаружившие, что некоторые гомеодомен-содержащие белки связываются о AT-богатыми последовательностями в контрольных областях овоих собственных генов или генов других гомеодомен-содержащих белков, подтвердили эту гипотезу (Fainsod А, и соавт., 1986; Desplan 0. и соавт., 1988; Коеу Т. и Kevine М. . 1988; Beachy Р.А, и ооа.вт., 1988; Odenwald и соавт,. 1989; Cho K.W.Y, и соавт.. 1988). Эксперименты с трансфекцией и транскрипцией in vitro дали основание предполагать, что наблюдаемые генетические эффекты, причиной которых является влияние этих белков. происходят из-за изменения уровня транскрипции (Han К. и соавт., 1389)

Окончательное подтверждение того, что гомеодомен-содержадше белки могут связываться и впрямую активировать транскрипцию было получено из биохимических экспериментов и исследований in vivo с лроклонированными тремя транскрипционными факторами. Гомеодомены были обнаружены в октамер-связывающих факторах DCT-1 (Herr W., 1988) С он же 0TF-1, NF-AI и MFiil), OCT-2 (Ко Н.5.И соавт., 1988; Muller М.М. и соавт., 1988; ulero R.G. и соавт., 1988) (0TF-2 и NF-2A) и гипофиз-oneцицифичеоком факторе Pit-i (BNF-Í) (Irigraham К.А. и соавт.. 1988; Bodner М. и соавт., 1988), Присутствие гомеодоменов в ОСТ-i показывает, что распространение белков о этими структурами не ограничивается регуляцией развивающихся систем, так как ОСТ-i экспресоируетоя во всех типах клеток млекопитаадшхся и активирует транскрипцию генов, которые включают гистон Н2Б, Гипофиз-опецицифичеокий фактор Fit-i, октамер-связывающие белки Oct-í и Oct-2 и транскрипционный фактор

Lînc-86 составляют отдельный подкласс гомеодомен-содержащих генов, состоя из 50™аминокислотного консервативного гомеодомена, отделенного вариабельной частью от другого консервативного 76-78 аминокислотного домена. Последний домен уникален для этого подкласса и называется POU-специфическим доменом (Wright C.V.E. и соавт., 1989; Herr W. и соавт.. 1988). Предположение о существовании другого класса ДНК-связывающих белков, было высказано в 1988 году (Landschulz W.H. и соавт., 1988) для дймерного белка 0/ЕВР. который связывается о энханоером. Этот класс представляет собой представляет собой белки, имеющие в своем составе домены, называющиеся "лещиновыми замками- и состоящие из повторов пяти лещиновых остатков, причем лейцины отделены друг от друга пятью аминокислотами. Сразу за "лещиновым замком" находится домен основных аминокислот, который непосредственно ответственней за связывание белка о ДНК. Что же катается "лещинового замка", то его■ Функцией является создание димерных структур с другим "лейциновым замком" для образования функциональной молекулы транскрипционного фактора. В работе О'Shea и соавт., 1989, было показано, что регионы лещиновых замков оуперокручиваютоя при образовании димерных структур. Структура этих доменов достаточно постоянна и встречается как во многих транскрипционных факторах . так и в неядерных белках. Так Fos и Jun семейства содержат пять таких же лещиновых остатков, как и С/ЕВР, в то время, как в GCN4 и GREB происходит замена пятого лейцинового остатка на аргининовый и лизиновый, соответственно, Транскрипционный фактор дрожжей áP-1 содержит аспарагин, заметающий третий из лейцинов в домене, но вое же образующий функционирующий гомолимер.

Классическими представителями транскрипционных факторов, содержащих лещиновые замки, являются белки семейств Pos и Jun

-продукты ядерных протоонкогенов, ини относятся к генам раннего ответа, быстро экопреооируюшимся в ответ на отимуляпию клеточной пролиферации. Вероятно, они играют основополагающую роль в процессе роста клеток (Venns I.M. и Sassone-Corsi Р.. 1937; Vogt Р. К. и Bos T.J., 1989). Различные члены fos и :jun семейств уже охарактеризованы и проклонированы. Различные гены одного семейства имеют различную скорость активации и, вероятно, роли их белковых продуктов на различных стадиях клеточного цикла будут разными. Так. ген с-fes индуцируется не только при переходе клетки к процессу деления, но и при переходе от деления к дифференцировке. Например, экспрессия c-fos увеличивается при дифференцировке мономиелоцитов HL-60 и U-937 в макрофаги и дифференцировке клеток феохромоцитомы PC-13 в нейроны (Curran и Morgan. 1985).

Транскрипция генов c-fos и c-.jun быстро индуцируется в результате зкетраклеточной стимуляции (Morgan и Curran. 1986). Накопление мРНК зтих генов в цитоплазме происходит в течение 1-2 часов, после чего происходит синтез соответствующих белков Роз и Jun. Как и РНК данных генов, белки имеют относительно короткий период жизни (полупериод жизни Роз составляет приблизительно 2 часа).

В 1987 - 1938 г,г. было показано, что Pos и Juri онкобелки могут образовывать транскрипционные комплексы, как между собой, так и о другими транскрипционными факторами из класса "лещиновых замков", выполняющие, по-видимому. регуляцию промоторыой активности, как в положительном. так и в отрицательном направлениях (Bolirnann D. и соавт,, 1987; Curran Т. и Pranza В.. 1988).

Большинство белков этого класса существуют в виде гомодимеров в растворах, и уже показано, что существование гомодимерных

- is -

orcvmyD. по «ройкей мере? а «е>етшшт»л bwewñbauscíft, дердоу-еан»* млн, эффективного связывания ДНК, лз всех известных примеров только ios является исключением из этого правила. Fos-белки не образуют гомолимеров, но могут гетеродимеризоваться о Jun-онкобелками. Замечательной особенностью Fos-Jim гетеродимеров оказалась их стабильность, в 500-1000 раз превышающая стабильность Jun-гомод�