Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2

Зимин, Андрей Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2"

На правах рукописи

Зимин Андрей Леонидович

«Разработка метода специфической детекции и видовой

1 дифференциации возбудителей хламидиозов на основе

(

( структурного полиморфизма гена отр2»

03.00.07 - микробиология 03.00.15 -генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук В.В.Демкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинких наук, профессор И.К.Мазурова доктор медицинких наук, профессор И.АЛПагинян

Ведущая организация:

Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Защита состоится « _2003 г. в ^ ч. на заседании

Диссертационного совета ДОО1.007.01. в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « /» 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор fil " Е.В.Русакова

( ^f ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хламидии являются облигатными внутриклеточными паразитами, вызывающими широкий спектр заболеваний у человека, животных и птиц. Хламидиозы отличаются большим полиморфизмом клинических проявлений и отсутствием специфических симптомов. У человека хламидии являются возбудителями трахомы, венерической лимфогрануломы, заболеваний урогенитального и респираторного тракта, конъюнктивитов, зоо- и орнитоантропонозных заболеваний. В последнее время с этими бактериями связывают развитие сердечно-сосудистых патологий, атеросклероза, болезни Альцгеймера, некоторых форм артритов и бронхиальной астмы. Однако истинная роль хламидий в патогенезе многих заболеваний остается невыясненной, в том числе по причине отсутствия простых и надежных средств детекции, идентификации и дифференциации хламидий, учитывающих современный уровень знаний об их биологическом разнообразии.

Фундаментальные исследования генетической вариабельности хламидий, проведенные в 1999 г. д-р K.D. Everett и др. [Everett KD, et.al.(1999)], позволили предложить новую классификацию представителей порядка Chlamydiales. Согласно новой классификации к одному виду хламидий были отнесены только те штаммы, нуклеотидные последовательности генов 16S и 23S рРНК которых имели степень гомологии более 97%. Штаммы, имеющие более высокий показатель генетической дивергенции, были выделены в самостоятельные виды. В результате вместо 4 идентифицированных до введения новой классификации видов в семействе Chlamydiaceae было выделено 9 видов, разделенных на 2 рода - Chlamydia и Chlamydophila. Род Chlamydia включает 3 вида: С.trachomatis, C.suis и C.muridarum\ род Chlamydophila включает 6 видов: C.pneumoniae, С pecorum, C.abortus,

C.psittaci, С.felis, C.caviae. Следует подчеркнуть, ) ч m ^ и и в ы с ^ вш^ы __<jbPlH

ггербург >уУ »

awff «угг »

РОС. НАЦИОНАЛЫ! БИБЛИОТЕКА С. Петербург ОЭ

образованы за счет реклассификации видовой принадлежности ранее известных штаммов.

В связи с кардинальным изменением таксономии хламидий разработанные ранее генетические и иммуноферментные методы видоспецифической детекции и дифференциации в большой мере утратили видовую специфичность. Таким образом, единственным надежным способом видовой идентификации хламидийных штаммов стал метод секвенирования фрагмента гена, кодирующего 168 рРНК хламидий.

Метод ПЦР с последующим анализом структурного полиморфизма полученных ампликонов в течение последнего десятилетия зарекомендовал себя как эффективный способ генотипирования микроорганизмов. В частности, этот метод успешно использовался для анализа генетической гетерогенности представителей семейства СЫатусИасеае. На его основе был создан ряд систем, направленных на анализ видовой и внутривидовой вариабельности хламидий, но подавляющее большинство из них были разработаны в соответствии с положениями старой таксономии СЫатусИасеае и в настоящее время не позволяют провести адекватную видовую идентификацию патогена.

Разработка новых систем генетической дифференциации и идентификации сдерживается недостаточным объемом данных о видовой вариабельности генов хламидий, и крайне ограниченным набором .генов, последовательности которых известны для всех видов семейства СЫатусИасеае.

В сложившейся ситуации расширение исследований генетической вариабельности хламидий и создание надежного и простого метода практической идентификации и дифференциации представителей семейства СЫатусНасеае является актуальной задачей фундаментальной и практической микробиологии.

Цель исследования

Целью настоящей работы было изучение структурных особенностей генов хламидий и создание метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов, основанного на методе амплификации ДНК генома хламидий с последующим анализом структурного полиморфизма полученного ампликона.

Задачи исследования

Для достижения поставленной цели нами был определен ряд задач:

1. На основе компьютерного анализа известных нуклеотидных последовательностей генов хламидий провести выбор оптимальной генетической мишени для разработки метода видовой дифференциации хламидий.

2. Создать банк рекомбинантных плазмид, содержащих выбранную в качестве мишени область ДНК референс-штаммов всех видов семейства СЫатусИасеае.

3. Определить нуклеотидные последовательности выбранной генетической мишени у тех видов хламидий, для которых она не известна.

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидной последовательности выбранной генетической мишени у всех видов СЫатусИасеае.

5. Разработать систему ПЦР, обеспечивающую специфическую амплификацию маркерной области генетической мишени у всех видов семейства СМатусИасеае.

6. Разработать метод видовой генетической дифференциации видов хламидий, основанный на видовом своеобразии' нуклеотидных последовательностей выбранной генетической мишени.

7. Апробировать методику специфической детекции и видовой дифференциации на коллекции изолятов хламидий.

Научная новизна и практическая значимость работы

1. Впервые определены нуклеотидные последовательности гена отр2 С.suis и C.felis, которые были заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.

2. Клонированы значащие участки (около 97%) гена отр2 представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae.

3. Разработан оригинальный способ детекции представителей семейства Chlamydiaceae методом ПЦР-амплификации.

4. Разработан новый для клинической микробиологии методический подход для оценки генетической вариабельности микроорганизмов, основанный на электрофоретическом анализе рестриктов ПЦР-продуктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

5. Разработан метод идентификации и дифференциации видов семейства Chlamydiaceae в соответствии с современной таксономией Chlamydiaceae, который позволяет в короткие сроки и без существенных материальных затрат проводить идентификацию и видовую дифференциацию штаммов хламидий и может использоваться для определения видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценки соответствия контрольных штаммов хламидий данным сертификата соответствия, генотипирования имеющихся музейных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства Chlamydiaceae, а также для решения других задач клинической микробиологии.

6. С помощью разработанного метода проведено генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий, полученных из коллекции ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Внедрение

Получено авторское свидетельство на изобретение №2205876 от 10.06.03 «Способ диагностики хламидийной инфекции (варианты)».

Апробация работы

Результаты исследования доложены на 9-м Европейском конгрессе по Клинической микробиологии и инфекционным болезням (Берлин, 1999г.), 3-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине", посвященной памяти М.М. Авербаха (Москва, 2000г.), на отчетной конференции института Молекулярной генетики РАН (Москва, 2001г.), на конкурсе аспирантских работ на стипендию фонда «Будущее Молекулярной Генетики» (Москва, 2001г.), на межлабораторном семинаре отдела медицинской микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва, 2002г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 - в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 101 странице машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 123 источника, из них 18 отечественных и 105 иностранных.

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. С.С.Ямниковой ( ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) за предоставление коллекции хламидийных изолятов и к.б.н. М.В. Эйдельштейна и И.А.Эйдельштейн (НИИ антимикробной химиотерапии СГМА) за сотрудничество и помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объект исследования:

Контрольные образцы хламидий были получены из ряда зарубежных и отечественных научных учреждений в виде частично очищенных и инактиви-рованных клеточных суспензий (1-5) и очищенной ДНК (6-11). Кроме того, в исследование были взяты препараты из набора сухих хламидийных антигенов (С.trachomatis и C.psittaci) для реакции непрямой иммунофлуоресценции («Биомед», Пермь; далее «Набор Ch-антигенов»), содержащие лиофилизиро-ванные и инактивированные клетки хламидий. Перечень и условные обозначения использованных в работе штаммов приведен ниже (см. табл. 1). Штаммы, отмеченные (*), входили в группу референс-штаммов, по результатам исследования которых была создана новая таксономия хламидий [Everett KD, et.al.(1999)].

Также в работе были использованы хламидийные изоляты из коллекции хламидийных культур, любезно предоставленной нам д.б.н. С.С.Ямниковой (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.)

Полимеразная цепная реакция:

Частично очищенные и инактивированные клеточные суспензии хламидий, препараты из набора сухих хламидийных антигенов и хламидийные изоляты из коллекции хламидийных культур суспендировали в 100 мкл lxPBS, к осадку добавляли 100 мкл лизирующего буфера LB и 1 мкл 10 мг/мл раствора протеиназы К (Serva, Германия/США). Пробы инкубировали в течение 2 часов при 56°С, затем 5 мин при 95°С, затем 5 мин в ледяной бане и центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость использовали в качестве магрицы для ПЦР.

Реакцию ПЦР-амплификации проводили в термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия) при температуре денатурации ДНК 94°С и температуре

Таблица 1.

Контрольные образцы хламидий, использованные в работе.

06pa3tp>i inraMMOB xnamtmm Источник

1 Chlamydia trachomatis (L2) * Prof. Pekka Saikku, National Public Health Institute, Финляндия

2 Chlamydophila pneumoniae (K7)

3 Chlamydophila abortus (CP-16)

4 Chlamydia trachomatis (L2) Д-р И.Н. Манзенюк, Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, Москва

5 Chlamydophila psittaci (Lory)

6 Chlamydia muridarum (MoPn) * Dr. Katrin D.E.Everett, University of Georgia, США

7 Chlamydia suis (R24) *

8 Chlamydia suis (R27)

9 Chlamydia suis (H7)

10 Chlamydophila pecorum (Z) *

11 Chlamydophila felis (FP Backer)*

12 Chlamydophila caviae (GPIC) *

13 Simkania negevensis (Z) *

14 Chlamydia trachomatis (L2) Набор сухих хламидийных антигенов «Биомед», Пермь

элонгации - 72°. Временные режимы и количество циклов амплификации, а также температуру отжига устанавливали в зависимости от используемых праймеров и в соответствии с экспериментальными задачами. Реакционная смесь для ПЦР объемом 30 мкл содержала 50 мМ КС1, 10 мМ трис-НС1 (рН 8,4), 2,5 мМ ¡У^С1, 200 мкМ каждого дНТФ, 0,25 мкМ каждого праймера и 1 ед. Тац-полимеразы (ИМГ РАН, Россия) и 3 мкл тестируемого образца. Анализ продуктов амплификации, рестрикции, лигирования и выделения ДНК

осуществляли методом электрофореза в 0.8-1.5% агарозном (Serva, Германия/США) геле в режимах, которые зависели от экспериментальных задач. Электрофорез проводили в трис-ацетатном буфере с добавлением бромистого этидия (Serva, Германия/США) в концентрации 0.5 мкг/мл. Результаты электрофоретического анализа фиксировали с использованием системы фотодетекции EpiChemi II Gel Documentation System (UVP, Inc. США).

Электрофорез в геле с ДНК-связывающим лигандом:

ДНК-связывающий лиганд H.A.-Yellow был предоставлен фирмой Hanse Analytik GmbH, Германия. В агарозный гель лиганд добавляли в концентрации 1 ед./мл. Электрофорез проводили в соответствии с рекомендациями фирмы Hanse Analytik GmbH, Германия.

Выделение и анализ ДНК

Выделение хромосомной и плазмидной ДНК, обработку рестриктазами, полинуклеотидлигазой фага Т4, элюирование фрагментов ДНК из агарозного геля, трансформацию клеток E.coli плазмидной ДНК проводили стандартными методами [Sambrook J. et.al. (1989)] или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Клонирование и секвенирование

ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Предназначенные для клонирования фрагменты ДНК элюировали из геля, очищали стандартными методами и клонировали с помощью вектора pGEM-T (Promega, США) в клетках штамма E.coli TG-1. Клетки E.coli выращивали при 37°С на жидкой и твердой (2% агара) L-среде с добавлением ампицилина в концентрации 100 мкг/мл. Полученные гибридные клоны анализировали с помощью ПЦР и рестрикционного анализа, используя рестриктазу Rsal (MBI Fermentas, Литва).

Клонированные фрагменты ДНК хламидий секвенировали по методу Сэнгера [Sanger F., et.al. (1977)] на автоматическом секвенаторе AlphaExppess (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция). Секвенирование проводилось в

лаборатории Генной инженерии животных ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Программное обеспечение:

Сравнительный анализ последовательностей ДНК проводился с помощью программы Macaw 2.0.5.(© Greg Schuler, NCB1, 1995)

Построение рестрикционных карт генов проводилось с помощью программы WinDnasis 2.5 (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)

Конструирование олигонуклеотидных праймеров для ПЦР проводилось с помощью программы Oligo 6.31 (© Wojciech Rychlik, Molecular Biology Insights, Inc.)

Филогенетический анализ выполнен с помощью программы BioEdit 4.6.1 (© Tom Hall, North Carolina State University)

Теоретический анализ специфичности праймеров для ПЦР проводился с помощью on-line программы BLAST. (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

Результаты и обсуждение

Для выбора оптимальной генетической мишени, соответствующей поставленным задачам, нами был определен ряд критериев:

- наличие достаточно представительной выборки известных к началу исследования нуклеотидных последовательностей гена у разных видов;

- наличие в нуклсотиднои последовательности гена минимум двух консервативных участков, специфичных только для представителей семейства Chlamydiaceae\

- участок, фланкированный данными консервативными последовательностями, должен быть достаточно вариабилен у представителей разных видов семейства Chlamydiaceae.

Анализ имеющихся в базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов хламидий позволил нам на первом этапе выделить набор генетических локусов, изученных у большинства представителей семейства. Ко времени проведения анализа таких локусов было 5: гены,

кодирующие 168 и 238 рРНК, гены отр! и отр2, а также спейсерный участок между генами, кодирующими 168 и 23 Б рРНК.

В результате проведенного компьютерного анализа последовательностей этих генетических локусов в качестве оптимальной мишени для достижения поставленной цели нами был выбран ген отр2, размером от 1643 до 1676 п.н. у разных видов хламидий, кодирующий цистеин-богатый белок размером 60 Юа, локализованный в наружной мембране элементарных телец хламидий.

Prl Рг2 РгЗ Ргб РгБ Рг4

с==ь-^cri^-Ea^-::::?—чЕzb

I III V IV II

t t

О 1643 1676 п.н.

старгозшн тершпфтщш

кодой кодон

участокr консер&атявньн у всех представителей сем-ва Chlamydiaceae участок, консервативно у веек представителей роде Chlamydophila участок, специфичный для гтредстгшитепей ьида Chlamydia trachomatis

Рис.1 Карта консервативных и вариабельных участков гена отр2 с локализацией праймеров, использовавшихся в настоящей работе.

Этот ген полностью соответствовал определенным нами критериям:

- ген был достаточно хорошо изучен, на момент начала исследования в базе данных GenBank наличествовало 32 сиквенса этого гена 7 видов хламидий;

- в структуре гена было выявлено 3 консервативных в пределах семейства Chlamydiaceae участка, разделенных достаточно протяженными вариабельными участками (см. рис.1). Два консервативных участка (обозначенные как I и II) находились в противоположных концах гена, а третий (III) локализовался в районе, расположенном на расстоянии приблизительно 570 п.н. от 5'-конца гена;

сиз -

- степень вариабельности известных нуклеотидных последовательностей гена ompl позволяла использовать его для разработки систем оценки генетической вариабельности и видовой дифференциации хламидий.

Однако для двух из 9 видов Chlamydiaceae (С.suis и C.felis) нуклеотидные последовательности гена отр2 были не известны. Для разрешения этой проблемы на основе анализа консервативных участков, расположенных на противоположных концах гена отр2 и фланкирующих практически всю (около 97%) нуклеотидную последовательность гена, нами были сконструированы праймеры Prl и Рг4 (см. табл. 5, приложения 1). ПЦР-амплификация с праймерами Prl и Рг4 позволила получить ампликоны расчетного размера с образцами ДНК всех видов Chlamydiaceae (см. рис.2).

: -ЩhiJT-, '^ЬЦ-: -

: '^ЗШт' •

| - rta*^srw--'

г , * vir**»'. " * ' - * > »

l - . - . 5 - » " inältir f-Ki J». , . i^aafiv« „Д.йь... -Ji-»-. "iiaKi'ÄJi^'ej --' .

Рис.2 Результаты амплификации ДНК

конрольных штаммов Chlamydiaceae и S.negevensis с прайиерани Prl и Рг4

1-С. trachomatis L2 2 - С. imiridarum МоРп 3-С. suis R24 4 - паркер мопркулярных масс ДНК фага Ä,/HindlU

5 - С. pneumoniae К7

6 - С. pecorum Z

7-С. abortus CP-16

8-С. psittaci Lory

9 - С. felis FP Backer

10 - С. caviae GPIC

11 - S.negevensis Z

ПЦР-продукты, полученные при амплификации ДНК референс-штаммов хламидий (NN 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11, 12 по Табл.1) были выделены из

агарозного геля и клонированы в клетках Е coli. Специфичность клонированных фрагментов была подтверждена рестрикционным анализом с эндонуклеазой рестрикции Rsal. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов гена отр2 С. suis и С.felis были секвенированы.

В связи с большим размером анализируемых фрагментов их секвенирование проводили в несколько этапов. Первоначально сиквенс проводили с двух пар праймеров-затравок: Prl и Рг2, РгЗ и Рг4 (см. рис.1), фланкирующих фрагменты примерно 570 и 1030 п.н. соответственно. Для определения нуклеотидной последовательности внутреннего участка РгЗ-Рг4 синтезировали дополнительные праймеры, оригинальные для каждой последовательности.

Определенные нами в результате сиквенирования нуклеотидные последовательности гена отр2 С.suis и C.felis заложены в базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank под индивидуальными номерами AY286315 и AY286314 соответственно.

К моменту завершения наших работ по секвенированию гена отр2 в печати появилась работа группы английских исследователей [Hartley JC, et.al. (2001)], в которой были определены нуклеотидные последовательности небольших фрагментов 5'-конца гена отр2 С.suis и C.felis размером около 550 п.н. Сравнительный анализ показал практически полное сходство данных, опубликованных JC Hartley et.al. с результатами нашего исследования. Тем не менее были выявлены и некоторые различия, при этом результаты секвенирования, полученные нами, лучше коррелировали с общей картиной вариабельности нуклеотидной последовательности гена отр2

Сравнительный анализ всех известных нуклеотидных последовательностей гена отр2, включая полученные нами, позволил нам провести оценку генетической вариабельности гена отр2 внутри семейства Chlamydiaceae (см. таб.2). Построенное нами в результате анализа вариабельности гена отр2

Таблица 2.

Степень гомологии (в%) куклеотидных последовательностей гена ошр2 между различными видами семейства СЫашусИасеае.

Вид 9 8 7 6 5 4 3 2 1

С. trachomatis 52.9 53.8 53.3 53.9 48.0 48.8 80.2 77.5 9.2

С suis 48.2 48.5 46.7 46.3 48 0 47.0 83.1 Ед*

С murtdarum 47.3 47.2 47.1 45.1 47.5 47.4 Ед*

С. pneumoniae 61.9 60.9 63.1 60.4 53.0 98.4

С pecorum 53.9 57.3 58.0 57.2 100

С abortus 85.0 85.5 93.8 100

С psittaci 85.9 85.0 100

С felis 84.9 Ед*

С caviae Ед*

■ единственный сиквенс гена отр2 данного вида в GenBank

Chlamtydophila abortus EBA Chlamydophlla abortus B577 Chlamydophlla abortus S26/3

Chlamydophlla psittaci EAE/A22/M Chlamydophlla psittaci 6BC

- chlamydophlla caviae GPIC ■ Chlamydophlla fells FP Backer

' Chlamydophlla pneumoniae AR39 Chlamydophlla pneumoniae AR388 Chlamydophlla pneumoniae CWT.029 Chlamydophlla pneumoniae J138 . Chlamydophlla pneumoniae IOL-207 Chlamydophlla pneumoniae KC Chlamydophlla pneumoniae H16 Chlamydophlla pneumoniae DE177 Chlamydophlla pneumoniae Frog-Mi-

100 [ Chlamydophlla pecorum W73 [Chlamydophlla pecorum FcStra

83.1Г chlamydia muxidarum MoFti [ Chlamydia suis R24

Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia Chlamydia

trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis trachomatis

A/Har-13

B/jali20

C/TW-3

D/UW-3

E/Bour

r/lC-Cal3

G/UW-57

K/UW-4

l/UW-12 j/UW- 36 K/UW-31 1.2/434 13/404

AF240773 №111200 CP V7 6760

X53512 M61116

1141759 AY286314

AS002160

AF111201

AE001640

AP002547

X53511

U56925

V56926

AF347609

AT1.02831

CPU76761 AF111199

AE002341

AY286315

M35148

AF304332

X53510

X543B8. M85197 АГ304327, AE00131 X54389, X55903 118 5196

AF304326

AF304328

АГ304330

AF304329

АГ304331

M23001

X54390

Рие.З Филогенетическое древо семейства СЫатуМасеае, сконструированное на основе нуклеотидной последовательности гена отр2.

филогенетическое дерево семейства Chlamydiacea (см рис.3) практически полностью совпало с филогенетическим деревом, построенным K.D. Everet et.al. на основе анализа вариабельности генов 16S и 23S рРНК [Everett KD, et.al. (1999)].

По результатам сравнительного анализа были определены участки гена omp2t отличающиеся различной степенью консервативности внутри семейства Chlamydiaceae, и что дало нам возможность сконструировать праймеры, обладающие специфичностью к различным группам представителей семейства Chlamydiaceae (см. табл.5, приложения).

Для решения задачи создания системы специфической детекции всех видов семейства Chlamydiaceae нами были сконструированы праймеры РгЗ и Рг4. Специфичность праймеров была продемонстрирована нами в ПЦР-экспериментах с ДНК контрольных штаммов хламидий, а также Simkania negevensis, Ureaplasma urealyticum, Micoplasmapneumoniae, (см. рис.4)

- 7 . в 9 40 11 . ij. £8

i*S- ffe^MnÎ ££ M «н*^ - fcW -

..... «Mb

tr -Щ» J4

Exers .. - ■

Рис.i Результаты амплификации конрольных штаммов Chlamydiaceae с прайкераии РгЗ и Рг4 и проверка специфичности работы ПЦР-систеиы.

1-С. trachomatis L2 5 - С. pneumoniae К7 10 - С. caviae GPIC

2-С. mur1darum МоРп 6 - С. pecorum Z 11 - S.negevensis Z

3-C. suis R24 7 - С. abortus CP-16 12 - H. pneumoniae

4 - наркер молекулярных 8 - С. psittaci Lory 13 - U. urealyticum касс ДНК фага /HindXIl 9 - С, felis FP Backer

Для решения задачи видовой дифференциации хламидий мы использовали 3 методических подхода:

1) Создание системы родо- и видоспецифичных систем ПЦР-

идентификации хламидий на основе амплификации фрагментов гена отр2

2) Сравнительный анализ электрофоретической подвижности ПЦР-ампликонов фрагментов гена отр2 в агарозном геле, содержащем ДНК-связывающий лиганд.

3) Определение видоспецифической вариабельности нуклеотидной последовательности гена отр2 посредством анализа длины рестрикционных фрагментов ПЦР-продуктов.

! '

Рис.5 Результаты акгашфикации ДНК референс-штаюшв Chlamyrtiaceae с прайнераки Ргб и Рг4

1-С. trachomatis L2 5 - С. pneumoniae К7 9 - С. fells FP Backer

2-С. muridarum lioPn 6 - С. pecorum Z 10 - С. caviae GPIC

3-C. suis R24 7 - С. abortus CP-16 11 - отрицательный контроль 4 - ДНК фага X/HlndIII 8 - С. pgittaci Lory

Для родоспецифической ПЦР-идентификации ДНК представителей рода СЫатусЗорИИа был сконструирован праймер Ргб, который, в паре с праймером Рг4, обеспечивал амплификацию фрагмента ДНК размером около 870 п.н. (см. табл. 5, приложения). Эксперименты с ДНК контрольных штаммов всех видов

Рис.6 Результата акгашфикации ДНК референс-штаимов Chlamydiaceae с прайиерани РгЗ и Рс4

1-С. trachomatis L2 5 - С. pneumoniae К7 9 - С. felis FP Backer

2-С. muridarum lloPn 6 - С. pecorum Z 10 - С. caïiae GPIC

3-C. suis K24 7 - С, abortus СР-16 11 - отрицательный контроль 4 - ДНК фагаА/HindIII 8 - С. psittaci Lory

Chlamydiaceae показали, что с образование ампликонов наблюдалось только с ДНК видов, относящихся к роду Chlamydophila (см. рис.5).

Для специфической ПЦР-идентификации ДНК представителей вида Chlamydia trachomatis был сконструирован праймер Рг5, который в паре с праймером Рг4 обеспечивал амплификацию фрагмента ДНК размером около 560 п.н. (см. табл. 5, приложения). Специфичность ПЦР-системы с праймерами Ргб и Рг4 и была продемонстрирована в ПЦР-экспериментах с ДНК контрольных штаммов всех видов Chlamydiaceae (см. рис.6). Таким образом, сконструированные праймеры позволяют проводить родоспецифическую детекцию штаммов хламидий, относящихся к семейству Chlamydophila и специфическую детекцию представителей С. trachomatis.

Для исследования структурного полиморфизма гена отр2 хламидий нами разрабатывался оригинальный подход, основанный на методе, который еще не

применялся в клинической микробиологии для генетической дифференциации патогенных организмов. Принцип этого метода основан на изменении подвижности фрагментов ДНК при электрофоретическом анализе в агарозном геле, содержащем ДНК-связывающий лиганд H.A.-Yellow. Этот лиганд обладает специфической афинностью к тетра-АТ мотивам ДНК и при электрофорезе одинаковых по размеру, но имеющих различия в нуклеотидных последовательностях фрагментов ДНК, скорость перемещения фрагментов ДНК будет иметь обратную зависимость от количества возможных сайтов связывания лиганда [Muller М., et.al. (1997)].

Теория взаимодействия H.A.-Yellow с ДНК до конца не проработана и количественные оценки влияния лиганда на подвижность ампликонов не определены. В связи с этим, мы провели серию экспериментов, направленных на определение возможности данного подхода применительно к дифференциации о/ир2-ампликонов хламидий.

С этой целью мы использовали праймеры Prl и Рг2, которые обеспечивали ПЦР-амплификацию фрагмента 5'-конца гена отр2 размером около 550-585 п.н. (см. рис.1). К началу нашего исследования эта часть гена была изучена наиболее полно, и мы располагали надежной информацией о структуре нуклеотидных последовательностей этого участка гена у нескольких видов Chlamydiaceae. Нами были выбраны 2 вида хламидий - С. abortus и C.pneumoniae, для которых компьютерный расчет числа тетра-АТ мотивов (см. табл.3), расположенных в пределах ампликона Prl-Pr2, показывал различие в 2 предполагаемых сайта связывания лиганда H.A.-Yellow.

В результате электрофоретического анализа было показано, что электрофоретическая подвижность сходных по размеру ампликонов C.pneumoniae К7 и С. abortus CP-16, одинаковая при электрофорезе в агарозном геле, не содержащем лиганд, изменяется в случае проведения анализа в геле, содержащем H.A.-Yellow (см. рис.7), что позволяет уверенно дифференцировать два ПЦР-продукта. Полученные результаты показали возможность применения электрофореза с ДНК-связывающим лигандом Н.А.-

Таблица 3.

Количество сайтов связывания H.A.-Yellow в амлликоне Prl-Pr2 разных видов Chlamydiaceae

N Вид хламидий Размер ампликона Рг1-Рг2 Количество тетра-АТ мотивов

1 С. trachomatis 552 п.н. 24-26

2 С. suis 558 п.н. 26

3 С. muridarum 555 п.н. 28

4 С. pneumoniae 579 п.н. 25

5 С. abortus 582 п.н. 27

6 С. ресогит 582 п.н. 28

7 С. psittaci 582 п.н. 26

8 С. felis 585 п.н. 31

9 С. caviae 585 п.н. 31

1 2 3

Рис.7 Электрофорез продувов 1ЩР-амплификации ДНК референс-штаммов Chlamydiaceae с прайиерани Brl-Pr2 в стандартной агарозном геле (Л) и геле, содержащем H.A.-Yellow (В),

1) маркер молекулярной масси pUCl8/HaeIII

2) С. abortus СР-16

3) С. pneumoniae К7

Yellow для дифференциации одинаковых по размеру фрагментов ДНК, имеющих разный нуклеотидный состав.

Проведенный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента, фланкированного участками гибридизации праймеров РгЗ-Рг4 (см.

рис.1) и оценка наличия в нем сайтов узнавания для различных эндонуклеаз рестрикции позволил нам выбрать эндонуклеазу в качестве

дифференцирующего фермента. Теоретический расчет количества и размеров /¿5я1-рестрикционных фрагментов ампликонов РгЗ-Рг4 всех видов СЫатусИасеае, основанный на данных о нуклеотидных последовательностях гена отр2 приведен в табл.4. Величины фрагментов расставлены в порядке, в котором они предположительно будут размещаться на электрофореграмме.

1 I 1' р Ж" •г '1 и, 1 У • 1' О 1 I | и ч,. У 1 1 и У : ! и

1031

734

601

571 545

501/489 481

433 433 433 433

404

331

297/ 295 297 297/ 295 297 297 301/ 297

268

242 229 232

190 201 201

165 166 163

147

111/110 117

| 82

| 53 | 53

Таблица 4.

Расчетные величины ЛгаЬрестрикционных фрагментов ампликонов РгЗ-Рг4 различных видов хламидий. Размеры фрагментов указаны в парах нуклеотидных оснований (п.н.).

Для удобства восприятия в первой колонке приведены расчетные величины размеров Л%?1-рестрикционных фрагментов ДНК плазмиды р11С19, использовавшейся нами в качестве маркера молекулярных масс для электрофоретического анализа.

Рис.8 Злектрофоретический анализ в агарознон геле йваГ-рестрикционных фрагментов Рг3-Рг4 аишшконов фрагмента гена шпр2 всех видов СМатуИасеае

1 - маркер молекулярных масс риС19/Ияр1 7 - С. рпешмлиае К7 Рг3-Рг4

2 - С. иасЛатаПв 1.2 Рг3-Рг4 8 - С, рпеотштиае К7 РгЗ-Рг4/Н*а1

3 - С. 1гас1тта11В 1.2 РгЗ-Рг4/Нза1 9 - С. ресогит 1 РгЗ-Рг4/Нза1

4 - С. лшг1йагит ИоРп Рг3-Рг4/Иза1 10 - С. аЬоНиз СР-16 РгЗ-Рг4/1(8а1

5 - С. 8418 Н24 РгЗ-Рг4/Нва1 11 - С. р«1.иас1 1оху РгЗ-Рг4/Я8а1

б - маркер молекулярных масс 12 - С. ¡е1и ГР Васкег РгЗ-Рг4/Яза1

ДНК фагаЯ/НынИИ 13 - С. сат1ае (5Р1С РгЗ-Рг4/Н8а!

14 - маркер молекулярных касс риС19/Нгр!

Дифференциации этих видов нам удалось достичь, использовав для анализа структурного полиморфизма &га1-рестриктов ампликонов РгЗ-Рг4 метод электрофореза в агарозном геле, содержащем ДНК-связывающий лиганд Н.А.-Yellow. При этом подвижность рестрикционных фрагментов ампликонов

С.там и С.р$Шас1, одинаковая при электрофорезе в геле, не содержащем лиганд, значительно меняется (см. рис.9), что позволяет нам уверенно дифференцировать их.

Рис.9 Электрофоретнчесгага анализ Нва1-рестрнкционных фрагментов РгЗ-Рг4 амхшиконов фрагмента гена отр2 всех видов СЫ.атуй1асеае в агароонон геле, содержащей И.А-Ур

1 - маркер молекулярных масс pUC19/MspI 7 - С. pneumoniae К7 Pr3-Pr4

2 - С. trachomatis L2 Pr3-Pr4 8 - С. pneumoniae К7 Pr3-Pr4/Rsal

3 - С. trachomatis L2 Pr3-Pr4/Rsal 9 - С. pecorum Z Pr3-Pr4/Rsal

4 - С. muridarum MoPn Pr3-Pr4/Rsal 10 - С. abortus CP-16 Pr3-Pr4/Rsal

5 - С. suis R24 Pr3-Pr4/Rsal 11 - С. psittaci Lory Pr3-Pr4/Rsal

6 - маркер молекулярных масс 12 - С. felis FP Backer Pr3-Pr4/Rsal

ДИК фага % /Hindlll 13 - С. caviae GPIC Pr3-Pr4/Rsal

14 - паркер молекулярных масс pl/C19/MspI

Исходя из полученных результатов изучения полиморфизма нуклеотидной последовательности гена отр2 с применением трех вышеописанных методических подходов, нами был предложен оригинальный метод идентификации и видовой дифференциации представителей семейства СМатусИасеае.

Метод заключается в проведении ПЦР с СА/атус&'ясеае-специфичной парой праймеров РгЗ-Рг4, рестрикции полученных ампликонов эндонуклеазой рестрикции Äyal и последующим электрофоретическим анализом продуктов рестрикции путем электрофореза в геле, не содержащем и геле, содержащем H.A.-Yellow. Метод основан на использовании общепринятых молекулярно-генетических методик, проводится на стандартном оборудовании и позволяет уверенно дифференцировать все виды семейства Chlamydiaceae.

Разработанный метод идентификации и видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae был использован для генотипирования штаммов хламидий из коллекции ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В исследование было взято более 20 изолятов различного происхождения, выделенных в основном в 50-60е годы и не охарактеризованных до нашего исследования современными методами. Наряду с генотипированием по гену ompl, изоляты были протестированы альтернативными ПЦР-системами, использующими другие генетические мишени и обладающие различной специфичностью (см. табл.5 приложения)

В результате проведенного исследования большинство изолятов из коллекции были классифицированы нами как Chlamydophila psittaci. (см. табл.6, приложения) Кроме того, изолят N11 («Бурхам») был классифицирован как Chlamydia trachomatis и изолят N1 («Азур») был классифицирован как Chlamydophila abortus. Полученные результаты соответствовали данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина.

Полученные результаты показывают, что разработанный нами метод генетической идентификации видов семейства Chlamydiaceae, позволяет проводить оценку видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценку соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, а также генотипирование имеющихся музейных штаммов в соответствии с новой таксономией Chlamydiaceae.

Разработанный метод может применяться для изучения биологического разнообразия и генетической вариабельности хламидий, анализа путей и механизмов распространения возбудителя, оценки региональной специфичности хламидий и позволяет заменить несколько методов родо- и видо-специфической идентификации хламидий.

Дальнейшая работа над расширением возможностей данного метода в плане оптимизации его для работы с клиническим материалом медицинского и ветеринарного назначения материалом может привести к созданию на его основе простого и надежного инструмента для дифференциальной клинической диагностики хламидийной инфекции.

ВЫВОДЫ:

1. Показано, на основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей ряда генов хламидий, что ген отр2 является оптимальной генетической мишенью для видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae.

2. Создан банк рекомбинантных плазмид, содержащих ген отр2 референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.

3. Определены ранее неизвестные нуклеотидные последовательности гена отр2 С. suis и C.felis. Последовательности заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.

4. Показано, на основании проведенного анализа межвидовой вариабельности нуклеотидной последовательности гена отр2 хламидий, что степень гомологии между различными видами семейства Chlamydiaceae колеблется в пределах от 46.3 до 85.9%

5. Построено филогенетическое дерево семейства Chlamydiaceae на основе нуклеотидной последовательности гена отр2. Подтверждено, на основании проведенного филогенетического анализа, эволюционное родство между видами семейства Chlamydiaceae, определенное ранее на основании изучения генов рибосомального оперона и гена ompl хламидий.

6. Разработан оригинальный метод специфической детекции представителей семейства СМатуеНасеае, основанный на ПЦР-амплификации участка гена отр2.

7. Разработан новый для клинической микробиологии методический подход для оценки генетической вариабельности микроорганизмов, основанный на электрофоретическом анализе ПЦР-продуктов или их рестриктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

8. Разработан оригинальный метод межвидовой дифференциации представителей семейства СИ1атусНасеае, основанный на анализе полиморфизма длин ДгаГ-рестрикционных фрагментов отр2-ампликонов.

9. Разработанный метод специфической детекции и межвидовой дифференциации представителей семейства СЫатусИасеае позволяет проводить оценку видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценку соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, генотипирование имеющихся контрольных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства СЫатусИасеае, а также для решения других задач клинической микробиологии.

10. Проведено, с помощью разработанного метода, генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий коллекции ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Показано соответствие полученных результатов данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина, а также их корреляция с результатами, полученными при анализе коллекции рядом альтернативных ПЦР-систем.

Список сокращений

дНТФ - деозксинуклеозиттрифосфаты, ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, п.н. - пара нуклеотидиая, ПЦР - полимеразная цепная реакция, РНК -рибонуклеиновая кислота, рРНК - рибосомальная РНК, трис -гидроксиметиламинометан, bp - (base pairs) - пара нуклеотидная, kDa -килодальтон, MoPn - (mouse pneumoniae) пневмония мышей, ОМР - (outer membrane protein) - белок наружной мембраны, ORF - (open reading frame) открытая рамка считывания, р - плазмида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Demkin V.V., Zimin A.L., М. Edelstein, I. Edelstein, M. Suvorov. Identification of Chlamydia Species by Electrophoretic Separation of ompl Gene PCR Products in the Presence of Bisbenzimide-PEG. In Clinical Microbiology and Infection. 9th Eur. Congr. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Abstracts. 1999, v.5, suppl.3. p. 196.(Berlin, Germany, March 21-24, 1999).

2. Демкин B.B., Зимин A.JI., Манзенюк И.Н., Воробьева М.С. Генотипическая характеристика типовых штаммов хламидий, полученных из различных научно-производственных центров России. Генодиагностика в современной медицине. Сб. тез. докл. 3-й Всероссийской научно-практической конференции. Москва, 2000, стр. 17-21.

3. Demkin V.V., Edelstein M.V., Zimin A.L., Edelstein I.A., Suvorov M.M. Detection of sequence variation in PCR-amplified fragments of ompl gene from three species of the family Chlamydiaceae using agarose gel electrophoresis containing bisbenzimide-PEG. FEMS Microbiol Lett. 2000; 184(2):215-218.

4. Demkin V.V., Zimin A.L. Family specific PCR detection and genus specific differentiation of Chlamydiaceae species. Proceed. IVth meeting Eur. Soc. Chlamydia Res., Helsinki, Finland, August 20-23, 2000, P. Saikku Ed., Universitas Helsingensis, 2000, p. 125.

5. Демкин В.В., Зимин А.Л., Кузьменко О.В. Детекция и дифференциация современных видов хламидий на основе полимеразной цепной реакции. Сб. тез. Международный конгресс "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека". Кара-Даг, Феодосия, Украина, 8-19 июня 2003, стр.57.

6. Зимин А.Л., Демкин В.В. «Способ диагностики хламидийной инфекции (варианты)» авторское свидетельство на изобретение №2205876 от 10.06.03.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1.

Таблица 5.

ПЦР-системы, применявшиеся в работе.

ДНК-мишень ПЦР-система Размер амшшкона (п.н.) Специфичность Авторы системы

Ген отр2 Рг5-Рг4 ~ 570 С. trachomatis сконструирована в данной работе

Рг6-Рг4 ~ 870 все виды Chlamydophila сконструирована в данной работе

РгЗ-Рг4 ~ 1030 все виды Chlamydiaceae сконструирована в данной работе

Prl-Pr2 ~ 550-585 все виды Chlamydiaceae сконструирована в данной работе

Prl--Pr4 - 1580-1600 все виды Chlamydiaceae сконструирована в данной работе

Гена ошр1 Anl-An2 - 560 С. trachomatis Andersen I.E., et.al., 1996

Yshl-Ysh2 ~ 340 все виды Chlamydiaceae Yoshida H., et.al., 1998

Фрагмент плазмиды рСТ Р1-Р2 ~ 200 С. trachomatis Griffais R., Thnbon M., 1998

Гек 16S рРНК R1-R2 208 все виды Chlamydiaceae Claas H.C., et.al., 1990

Приложение 2.

Таблица 6.

Результаты амплификации коллекции штаммов хламидий в ПЦР-системах, сконструированных в ходе данной работы и в наборе альтернативных ПЦР-систем, а также /&а/-рестрикционного анализа РЗ-Р4 ампликонов.

генетжч есжая юпвеяь Реоультат анализа

рСТ 165 рРНК оюр! ояр2 АгаГ-рестршет о» аишЕижоког Рх3-Рх<

Название Р1- Я1- ап1- 1»Ь1- Рг5- Ргб- РгЗ- в геле о лигандои

н шакш Р2 К2 Ап2 г»Ь2 Рх4 Рх4 Рг4 Н.А.УеИо*

1 Иур - + - + - + + с.аЬагЁ!»

г Ног1ук - + - + » + +

3 Я-3 - + - t - + +

4 Ка*аду + - + - + +

5 Каира - + - + - + +

6 Еурхаи + + + + + - + С. ЬгасЬошаЫв

7 ГАЛ - + - + - + + C,pвlttзcí

8 Н-2 - + - + - + + С .ря±±Ьаа±

9 Перепелка - + - + - + +

1Л Окон - + - + - t + С

11 В - + - + - + +

12 Ту*аи - + - + - + + С.рвЛ.ЬЪас±

13 «15» - + - + - + + С.рж-ХССас!

14 *?« - + - + - + + С.ряЮаа!

15 Крут - + - + - + + C>pslttacii

16 Квашина - + - + - + + С.рвХЬЬас!

17 Кед - + - + - + +

18 Цео - + - + - + + С,ря±ЬЬас1

19 Каи - + - + - + + C.pslttacl

20 03 - + - + - + + С.рв1Ыяо1

21 вч - + - + - + + С.ра±ЬЬас1

22 Го*увь-7 - + - + - + + С.ряХОж!

23 У-200 - + - + - + + С.ря1ЬЬасХ

1 24 Г* - 1 ♦ - + - + + С-ря^Ьяа!

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую дея!ельносгь ПД № 00595

Подписано в печать 05 09.200*5 г. Формат 6()\90 1/16. 1 ираж 100 жч. Бумага «Сне1 >рочка» 1.2 л. Заказ № 315

IP 14 4 0 9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зимин, Андрей Леонидович

Принятые сокращения /4/

Введение /6/

Глава I. Обзор литературы /10/ 1.1. Общая характеристика хламидий. Строение клеточной стенки и жизненный цикл хламидий /10/

У 1.2. Таксономия хламидий /13/

1.3. Геном хламидий /15/ 1.4. Физиология хламидий. Взаимодействие с клеткой-хозяином /19/

1.5. Белки наружной мембраны клеточной стенки хламидий /22/

1.6. Заболевания, вызываемые хламидиями /25/

1.7. Методы обнаружения и дифференциации хламидий /29/

Глава П. Материалы и методы исследования /38/

2.1. Материалы /3 8/

2.1.1. Объект исследования /38/

2.1.2. Плазмидные векторы /40/

2.1.3. Ферменты и другие реактивы /40/

2.2. Методы /40/

2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК /40/

2.2.2. Полимеразная цепная реакция /41/

2.2.3. Синтез дезоксиолигонуклеотидов /42/

2.2.4. Проверка качества синтезированных праймеров /42/

2.2.5. Расщепление ДНК специфическими эндонуклеазами рестрикции. /42/

2.2.6. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле. /42/

2.2.7. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле, содержащем ДНК-связывающий лиганд /43/

2.2.8. Клонирование фрагментов ДНК /43/

2.2.9. Трансформация клеток Е.соИ и отбор гибридных клонов /44/

2.2.10. Сиквенирование клонированных фрагментов ДНК /44/ ^ 2.3. Использовавшееся программное обеспечение /44/

Глава Ш. Результаты исследования и обсуждение /45/

3.1 Выбор генетической мишени. /45/

3.2 Общий анализ нуклеотидной последовательности гена отр2 /49/

3.3 Сиквенирование гена отр2 у С.suis и C.felis. /50/

3.4 Филогенетический анализ видов сем. Chlamydiacea на основе нуклеотидных последовательностей гена отр2. /52/

3.5 Разработка систем специфической детекции различных представителей сем. Chlamydiaceae. /56/

3.6 Разработка системы видовой дифференциации хламидий. /59/

3.6.1. Создание ПЦР-систем, обладающих родовой и видовой специфичностью для различных представителей семейства Chlamydiaceae. /59/

3.6.2. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом задержки электрофоретической подвижности ампликонов в геле с ДНК-связывающим лигандом. /60/

3.6.3. Обнаружение структурного полиморфизма фрагментов гена отр2 методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК. /63/

3.6.4. Сочетанное применение методов анализа ПДРФ и электрофореза в геле с ДНК-связывающим лигандом для идентификации всех представителей семейства Chlamydiaceae. ' /67/

3.7. Апробация разработанной системы идентификации и видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae на коллекции штаммов хламидий. /69/

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2"

Создание простого и удобного метода специфической детекции и видовой дифференциации хламидий - одна из наиболее актуальных задач современной хламидиологии. Впечатляющее количество научных работ, посвященных этой тематике -лучший критерий необходимости подобной системы для нужд фундаментальной и клинической микробиологии. Высокая значимость хламидий как патогена определяет высокую (особенно в последние годы) скорость накопления новых знаний о биологическом разнообразии и генетике этих организмов. Результатом этого является существенное увеличение за последнее десятилетие числа идентифицированных видов в семействе Chlamydiaceae. Так, если в 1993 году после добавления нового вида Chlamydia ресогит (ныне Chlamydophila ресогит) общее число известных видов хламидий достигло 4-х, то предложенная в 1999 году таксономия определяет уже 9 видов этих организмов.

Таким образом, решение вопросов видовой дифференциации хламидий, ранее сталкивавшееся только с проблемами, связанными со сложностью изучения объекта и недостаточной степенью изученности геномов хламидий, в настоящее время усложняется еще и необходимостью пересмотра методических критериев и приемов, разработанных на более ранних этапах исследований, в соответствии с требованиями современной систематики. Это коснулось ряда систем, которые были предложены для видовой дифференциации хламидий в середине-конце 90-х годов, и которые во многом потеряли свою специфичность и способность к типированию современных видов хламидий после изменения классификации семейства Chlamydiaceae. В частности, в работе группы японских ученых под руководством др-H.Yoshida была предложена система дифференциации всех видов хламидий, основанная на ПЦР-амплификации фрагмента гена ompl и последующим анализе ПДРФ ампликона, обработанного рестриктазой Alul. Согласно положениям существовавшей тогда классификации эта система позволяла дифференцировать большинство штаммов представителей четырех видов хламидий, однако изменение таксономии и появление новых видов в составе семейства Chlamydiaceae сделало невозможным ее применение для генотипирования современных видов хламидий.

Публикация в 1999 году в International Journal of Systematic Bacteriology работы «Emended description of the order Chlamydiales, proposai of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms», авторами которой были известные специалисты по молекулярной генетике хламидий Katrin D. Everett, Robin M. Bush, Arthur A. Andersen ознаменовала изменение таксономии представителей Chlamydiaceae на основе анализа нуклеотидных последовательностей рибосомальных генов. Одновременно с вышеупомянутой, была опубликована работа тех же авторов под названием «Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP», в которой была описана методика генотипирования всех видов хламидий путем амплификации фрагмента рибосомального оперона размером 600 пар нуклеотидов с дальнейшим анализом ПДРФ, полученных при обработке ампликонов рестриктазами Bfal, Cfsl, Hpal, Bell, Ddel, Acil и Rsal. При всей несомненной значимости этой работы для фундаментальной хламидиологии, описанный способ молекулярно-генетической идентификации видов хламидий, конечно, не может стать инструментом для практического генотипирования хламидий ввиду дороговизны и технической сложности постановки эксперимента и интерпретации результатов рестрикционного анализа. Кроме того, система ПЦР-амплификации фрагмента рибосомального оперона, предложенная в этой работе, не являлась специфичной только для представителей сем. Chlamydiaceae, т.к. обеспечивала наработку ампликона сходного размера на ДНК-матрице Simkania negevensis и нескольких ампликонов различного размера на матрице Legionella pneumoniae и Mycoplasma orale.

Таким образом, до последнего времени не было предложено ни одного практического метода специфической идентификации и типирования всех девяти видов хламидий, которые не прибегали бы к техникам секвенирования или рестрикционного анализа с применением значительного количества различных рестриктаз. Даже появившаяся недавно работа группы английских ученых под руководством JC Hartley, «PCR detection and molecular identification of Chlamydiaceae species», которая, несомненно, является значительным шагом к разрешению поставленной проблемы, не решает ее до конца и в полном объеме по причине необходимости применения ряда дополнительных методов для дифференциации С.ресогит.

В сложившейся ситуации расширение исследований генетической вариабельности хламидий и создание надежного и простого метода практической идентификации и дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae является актуальной задачей фундаментальной и практической микробиологии

2. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение структурных особенностей генов хламидий и создание простого и надежного метода специфической детекции и видовой дифференциации представителей всех видов семейства Chlamydiaceae, основанного на методе амплификации ДНК генома хламидий с последующим анализом структурного полиморфизма полученных ПЦР-ампликонов.

Для достижения поставленной цели нами был определен ряд задач:

2. Создать банк рекомбинантных плазмид, содержащих выбранную в качестве мишени область ДНК референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.

3. Определить нуклеотидные последовательности выбранной генетической мишени у тех видов хламидий, для которых она не известна

4. Провести анализ вариабельности нуклеотидной последовательности выбранной генетической мишени у всех видов Chlamydiaceae.

5. Разработать систему ПЦР обеспечивающую специфическую амплификацию маркерной области генетической мишени у всех видов семейства Chlamydiaceae.

6. Разработать метод видовой генетической дифференциации видов хламидий основанный на видовом своеобразии нуклеотидных последовательностей выбранной генетической мишени.

7. Апробировать методику специфической детекции и видовой дифференциации на коллекции изолятов хламидий.

3. Научная новизна и практическая значимость работы

1. Впервые определены нуклеотидные последовательности около 97% гена отр2 Chlamydia suis и Chlamydophila felis. Определенные последовательности заложены в Банк нуклеотидных последовательностей GenBank.

2. Клонированы в клетках E.coli значащие участки (около 97%) гена отр2 представителей всех 9 видов семейства Chlamydiaceae.

3. Разработан оригинальный способ детекции представителей семейства Chlamydiaceae методом ПЦР-амплификации.

5. Разработан метод идентификации и дифференциации видов семейства СМатусИасеае в соответствии с современной таксономией СМатусИасеае. Метод позволяет в короткие сроки и без существенных материальных затрат проводить идентификацию и видовую дифференциацию штаммов хламидий и может использоваться для определения видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценки соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, генотипирования имеющихся музейных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства СМатусИасеае, а также для решения других задач клинической микробиологии.

6. С помощью разработанного метода проведено генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий, полученных из коллекции ГУ Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зимин, Андрей Леонидович

ВЫВОДЫ:

2. Создан банк рекомбинантных плазмид, содержащих ген отр2 референс-штаммов всех видов семейства Chlamydiaceae.

5. Построено филогенетическое древо семейства Chlamydiaceae на основе нуклеотидной последовательности гена отр2. Подтверждено, на основании проведенного филогенетического анализа, эволюционное родство между видами семейства Chlamydiaceae, определенное ранее на основании изучения генов рибосомального оперона и гена отр! хламидий.

6. Разработан оригинальный метод специфической детекции представителей семейства Chlamydiaceae, основанный на ПЦР-амплификации участка гена отр2.

8. Разработан оригинальный метод видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae, основанный на анализе полиморфизма длин ЛзаГ-рестрикционных фрагментов отр2-ампликонов.

9. Разработанный метод специфической детекции и видовой дифференциации представителей семейства Chlamydiaceae позволяет проводить оценку видовой принадлежности культивируемых хламидий, оценку соответствия контрольных штаммов хламидий паспортным данным, генотипирование имеющихся контрольных штаммов в соответствии с новой таксономией семейства Chlamydiaceae, а также для решения других задач клинической микробиологии.

10. Проведено, с помощью разработанного метода, генотипирование и установлена видовая принадлежность штаммов хламидий из коллекции ГУ Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Показано соответствие полученных результатов данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина, а также их корреляция с результатами, полученными при анализе коллекции рядом альтернативных ПЦР-систем.

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. С.С.Ямниковой ( ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН) за предоставление коллекции хламидийных изолятов, а также к.б.н. М.В. Эйдельштейна и И.А.Эйделынтейн (НИИ антимикробной химиотерапии СГМА) за сотрудничество и помощь в работе.

3.8. Заключение.

В настоящее время, в связи с широкой распространенностью заболеваний, вызываемых хламидиями, значительным разнообразием их клинических проявлений, особенностями биологии, трудностями культивирования возбудителя, а также кардинальным изменением филогенетической структуры семейства СМатусИасеае разработка простого и надежного метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов является насущной задачей клинической микробиологии.

Большинство иммунноферментных и молекулярно-генетических методов, позволяющих проводить детекцию и дифференциацию хламидий, использовавшихся до недавнего времени, в настоящее время не удовлетворяют требованиям идентификации всех видов представителей семейства СЫатусИасеае, что является необходимой процедурой при культивировании этих микроорганизмов, получении чистых культур и создании музея хламидийных штаммов, получении контрольных штаммов для диагностических препаратов.

В то же время, существующие в настоящее время методики, позволяющие решать эти задачи требуют значительных временных и материальных затрат или использования дорогостоящего оборудования.

Для решения задачи создания системы, позволяющей проводить специфическую детекцию и видовую дифференциацию возбудителей хламидиоза, был проведен анализ вариабельности нуклеотидной последовательности всех сколь-либо значительно изученных генетических локусов представителей всех видов семейства СМатусИасеае в результате которого в качестве оптимальной ДНК-мишенью был признан ген отр2, кодирующий белок наружной мембраны (Отр2) ЭТ хламидий. В процессе выполнения работы определены ранее неизвестные нуклеотидные последовательности этого гена у двух видов хламидий.

Построено филогенетическое дерево семейства СМатусИасеае на основе нуклеотидной последовательности гена отр2. Подтверждено, на основании проведенного филогенетического анализа, эволюционное родство между видами семейства СЫатусИасеае, определенное ранее на основании изучения других генетических мишеней хламидий.

Разработан оригинальный метод специфической детекции и межвидовой дифференциации представителей семейства СМатусИасеае, основанный на ПЦР-амплификации специфического участка гена отр2 и анализе полиморфизма длин и нуклеотидного состава рестрикционных фрагментов полученных ПЦР-ампликонов с использованием нового для клинической микробиологии методического подхода для оценки генетической вариабельности микроорганизмов. Предложенный методический подход основан на электрофоретическом анализе ПЦР-продуктов или их рестриктов в агарозном геле, содержащем специфический ДНК-связывающий лиганд.

Разработанный метод успешно апробирован на коллекции хламидийных изолятов, при этом результаты генотипирования изолятов коллекции полностью соответствуют результатам тестирования коллекции изолятов в альтернативных ПЦР-системах, обладающих различной специфичностью. Кроме того, полученные результаты хорошо коррелировали с данным об источнике выделения изолята и клинической картине заболевания организма-хозяина.

В результате проведенных исследований получено авторское свидетельство на изобретение №2205876 от 10.06.03 «Способ диагностики хламидийной инфекции (варианты)».

Информация о работе

Зимин, Андрей Леонидович
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы