Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индикация и идентификация Chlamydia psittaci с помощью полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вафин, Рамиль Ришадович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Таксономическое положение хламидий.

1.2. Биологическая характеристика хламидий.

1.2.1. Морфология и цикл развития.

1.2.2. Химический состав.

1.2.3. Геномика.

1.3. Лабораторная диагностика хламидиоза.

1.3.1. Бактериоскопические и вирусологические методы.

1.3.2. Серологические методы.

1.4. Молекулярно-генетическая диагностика инфекционных болезней.

1.5. Полимеразная цепная реакция.

1.6. ПЦР-диагностика хламидийных инфекций.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы хламидий.

2.2. Сыворотки и патологический материал.

2.3. Эпизоотологическое обследование.

2.4. Выделение и идентификация возбудителя.

2.5. Серологические реакции

2.6. Очистка и концентрирование хламидий.

2.7. Выделение ДНК.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей.

3.2. Лабораторная диагностика хламидиоза лисиц в зверосовхозе "Вятский"

Кировской области РФ.

3.2.1. Вирусологические исследования.

3.2.2. Серологические исследования.

3.2.3. Молекулярно-генетические исследования.

3.3. Совершенствование молекулярно-генетической индикации и идентификации возбудителей хламидиоза.

3.3.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий.

3.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфичными праймерами для индикации Chl.psittaci.

3.3.3. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами.

3.3.4. Произвольная амплификация полиморфных локусов ДНК (RAPD-PCR) для идентификации штаммов Chl.psittaci.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Индикация и идентификация Chlamydia psittaci с помощью полимеразной цепной реакции"

Актуальность темы. Хламидиозы - группа разнообразных по проявлению контагиозных болезней млекопитающих, птиц и человека. Известно, что данный возбудитель вызывает широкий спектр клинических проявлений у животных - это аборты, пневмонии, конъюнктивиты, энтериты, артриты, орхиты, уретриты, энцефалиты, а также рождение нежизнеспособного молодняка, погибающего в первые дни жизни (74).

Особенностью хламидиозов, значительно усложняющей контроль за развитием заболевания, является частое латентное или хроническое течение со стертой клинической картиной. Кроме того, обладая низкой иммуногенностью, не обеспечивающей выработку достаточного количества антител, инфекция часто приобретает персистирующий характер и способствует образованию тлеющего очага (12). Это обусловливает необходимость изыскания и внедрения в ветеринарную практику чувствительных средств диагностики, позволяющих выявлять хламидии при любой форме проявления инфекционного процесса.

Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Исходя из этого, перспективным направлением исследований является совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов с учетом достижений современной молекулярной биологии (ПЦР и УП-ПЦР).

В последние годы для индикации и идентификации хламидий предложены современные иммунохимические и молекулярно-генетические методы, такие как: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и другие (11, 21, 35, 49, 98, 130, 145, 174 и другие). Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. Эти методы позволяют проводить индикацию и идентификацию патогенных агентов на основе регистрации и анализа ДНК микроорганизмов с высокой чувствительностью и специфичностью.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить генетические аспекты индикации и идентификации хламидий и на этой основе усовершенствовать средства диагностики хламидиоза животных.

В соответствии с целью работы для решения были выдвинуты следующие задачи:

- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидий в патологии клеточных пушных зверей в одном из зверохозяйств РФ;

- разработать эффективный способ выделения нуклеиновых кислот для получения препаратов ДНК хламидий высокой степени чистоты и нативности;

- подобрать регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидий;

- провести генотипирование штаммов хламидий на основе произвольной амплификации полиморфных локусов ДНК.

Научная новизна. Разработан новый метод выделения ДНК хламидий, обеспечивающий получение препаратов нуклеиновых кислот возбудителя высокой степени чистоты и нативности, пригодных для молекулярно-генетических исследований.

Подобран регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидий.

Отобран праймер для произвольной амплификации полиморфных локусов ДНК, позволяющий идентифицировать штаммы хламидий.

Практическая ценность. Результаты исследований позволили выяснить хламидийную природу заболевания клеточных пушных зверей в одном из зверохозяйств РФ. Выделенные при этом штаммы микроорганизмов идентифицированы как хламидии.

Разработан фенольно-детергентный метод выделения ДНК хламидий, позволяющий получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.

Определена специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции с использованием очищенной ДНК штаммов хламидий.

Разработан эффективный вариант ПЦР с универсальным праймером, который позволяет идентифицировать штаммы хламидий, выделенных от разных видов животных.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- Ежегодных итоговых заседаниях ученых советов Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (1999-2002 гг.).

- Научно-практических конференциях по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2001 и 2002 г.г.).

- Международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета (Казань, 2000 г.).

- Научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных" (Киров, 2001 и 2002).

- Научно-практической конференции "Актуальные вопросы ветеринарной медицины домашних животных" (Екатеринбург 2001 г.).

- Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития" (Саратов, 2001 г.).

- IX и X международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2001 и 2002 г.г.).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 методические рекомендации. Основные положения, выдвигаемые для защиты:

- результаты клинико-эпизоотологических и лабораторных исследований поголовья пушных зверей в отношении хламидийных инфекций в одном из зверо9 водческих хозяйств РФ;

- разработка фенолыю-детергентного метода выделения ДНК хламидий.

- оценка эффективности использования ПНР со специфичными и универсальными праймерами для индикации и идентификации хламидий.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2000", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (3 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 190 источников, в том числе 102 иностранных и 6 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 8 таблицами и 7 рисунками. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую ценность работы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вафин, Рамиль Ришадович

ВЫВОДЫ.

1. Полимеразная цепная реакция со специфичными искусственно синтезированными олигонуклеотидными праймерами "CPF" и "CPR" является эффективным средством индикации хламидий вида Chi. psittaci в патологическом материале.

2. На основании анализа эпизоотологической ситуации и лабораторных исследований (выделения возбудителя, серологических и молекулярно-генетических исследований) установлен хламидиоз лисиц в неблагополучном зверосовхозе.

3. Разработанный фенольно-детергентный метод выделения нуклеиновых кислот обеспечивает получение препаратов ДНК хламидий высокой степени чистоты (спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК колебались в пределах 1,8-2,0) и нативности, пригодных для молекулярно-генетических исследований. Практический выход ДНК хламидий составил 18,7-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов.

4. Чувствительность ПЦР с очищенной ДНК хламидий на 2 Log2 выше (более 60 fg ДНК или 6 геномных копий хламидий в пробе), чем с пробами культур хламидий, подготовленных для исследования кипячением (более 24 хламидий в пробе).

5. УП-ПЦР с праймером #129 позволяет идентифицировать штаммы хламидий вида Chi. psittaci: "Ростиново-70", "250", "БЛ-84", "ПП-87" и "КС-93" - возбудителей хламидиоза овец, коров, лисиц, песцов и собак соответственно:

- штамм "КС-93" при амплификации с праймером #129 генерирует 3 фрагмента ДНК (длиной 315, 637 и 830 пар нуклеотидов);

- штамм "БЛ-84" - 4 фрагмента (156, 681,830 и 911п.н.);

- штамм "ПП-87" и "250" - 5 фрагментов (315, 637, 681, 830 и 911 п.н.);

- штамм "Ростиново-70" - 6 фрагментов (315, 637, 681, 789, 830 и 911п.н.).

94

6. Штаммы "ПП-87" и "250" невозможно дифференцировать друг от друга при использовании праймера #129 в виду отсутствия различий в результатах УП-ПЦР.

95

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие практические предложения:

1. Для получения препаратов нуклеиновых кислот хламидий высокой степени чистоты и нативности, которые можно использовать в дальнейшем для мо-лекулярно-генетических исследований, необходимо использовать фенольно-детергентный метод выделения ДНК.

2. Использовать результаты исследований в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях:

- "Методические рекомендации по индикации и идентификации микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции ", утверждены директором ВНИВИ 21 ноября 2002 г.

- "Индикация и идентификация микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (методические рекомендации)", утверждены Ученым советом КГАВМ 24 декабря 2002 г.;

Заключение

Лабораторные методы диагностики хламидиоза имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Перспективным направлением совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов является использование современных методов основанных на достижениях молекулярной биологии (PCR и RAPD-PCR).

На основании выделения возбудителя, положительных результатов серологических исследований, а также молекулярно-генетических исследований в зверосовхозе "Вятский" Кировской области РФ ними установлен хламидиоз лисиц.

Нами предложен простой в эксплуатации и непродолжительный по времени фенольно-детергентный метод выделения ДНК хламидий, который позволял получать нативные, чистые и концентрированные препараты нуклеиновых кислот.

Определена специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции с использованием очищенной ДНК штаммов хламидий, что дает основания считать, что ПЦР с праймерами CPF и CPR является эффективным средством индикации представителей вида Chi. psittaci. Проведенные исследования также подтвердили возможность индикации возбудителей хламидиоза в патологическом материале с использованием искусственно синтезированных оли-гонуклеотидных праймеров CPF и CPR.

Используя УП-ПЦР с праймером #129 нам удалось идентифицировать штаммы Chi. psittaci: "Ростиново-70", "250", "БЛ-84", "ПП-87" и "КС-93". Анализ результатов RAPD-PCR свидетельствует о принципиальной возможности межштаммовой дифференциации Chi. psittaci. Использованный в нашей работе праймер #129 с оптимальными условиями RAPD-PCR является эффективным средством геноидентификации исследованных штаммов вида Chi. psittaci.

82

Детальное описание разработанной нами методики индикации и идентификации хламидий нашло отражение в методических рекомендациях:

- "Методические рекомендации по индикации и идентификации микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции", утверждены директором ВНИВИ 21 ноября 2002 г.;

- "Индикация и идентификация микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (методические рекомендации)", утверждены Ученым советом факультета ветеринарной медицины КГАВМ 24 декабря 2002 г.

Результаты наших исследований позволили выяснить хламидийную природу заболевания клеточных пушных зверей в одном из зверохозяйств, получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя, идентифицировать штаммы хламидий, выделенных от разных видов животных и тем самым расширить знания о природе возбудителей хламидиозов.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. В последние годы для детекции хламидийных инфекций предложены современные иммунохимические методы, такие как: иммуноферментный анализ, имму-ноблотинг, гибридомные технологии (14, 36, 59, 75, 99, 108, 110, 177, 184 и другие).

Перспективным направлением совершенствования лабораторной индикации и идентификации хламидий являются методы основанные на достижениях современной молекулярной биологии (ПЦР, УП-ПЦР) (21, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 76, 81, 98, 104, 116, 123, 125, 126, 127, 128, 130, 134, 135, 136, 137, 156, 162, 164, 168, 167, 172).

Эти методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, воспроизводимостью и возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий.

В целях изучения генетических аспектов индикации и идентификации хламидий животных, нами был проведен комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидий в патологии клеточных пушных зверей в одном их зверохозяйств РФ, совершенствованию методов выделения нуклеиновых кислот хламидий, использованию техники полимеразной цепной реакции при диагностике хламидиоза и генотипирование штаммов хламидий.

В работе были использованы 5 штаммов хламидий: возбудитель хламидиоза собак - штамм "КС-93", возбудитель хламидиоза песцов - штамм "ПП-87", возбудитель хламидиоза коров - штамм "250", возбудитель хламидиоза овец — штамм "Ростиново-70", возбудитель хламидиоза лисиц - штамм "БЛ-84", полученные из коллекции лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань).

При проведении эпизоотологического обследования неблагополучного пункта были использованы: зоотехническая и ветеринарная учетная документация; собеседование со специалистами и обслуживающим персоналом, а также собственные клинические наблюдения. Учитывались условия кормления и содержания животных; результаты щенения самок и сохранность молодняка в первые дни после рождения; благополучие поголовья по инфекционным болезням; возможные источники хламидийной инфекции и пути ее передачи; результаты лабораторных исследований патологического материала и сывороток крови животных.

В целях установления этиологической роли хламидий в патологии лисиц зверосовхоза "Вятский" Кировской области РФ, где у зверей регистрировались заболевания мочеполовой сферы; аборты и бесплодие самок (6-11% от общего поголовья самок), мертворождения и рождения слабого нежизнеспособного молодняка (8-15% от числа родившихся щенков), а также конъюнктивиты и атипичное течение заболеваний органов дыхания и пищеварения, поражения суставов невыясненной этиологии, нами были проведены лабораторные исследования (вирусологические, серологические и молекулярно-генетические).

В 2001 году, когда по нашим рекомендациям с целью профилактики хламидиозов в рацион зверям с декабря 2000 года стали добавлять антибиотики тетрациклинового ряда ("Биовит-80 и 120") произошло снижение анализируемых показателей.

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что потенциальными источниками возбудителя хламидиоза лисиц могли являться вновь завозимые животные из неблагополучных хозяйств и корма, инфицированные хла-мидиями. Кроме того, развитию эпизоотического процесса способствовали еледующие факторы: сопутствующие инфекции; снижение резистентности организма животных вследствие нерационального кормления и другие. Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей, изучавших эту проблему (57, 60, 74).

Данные эпизоотологического обследования вышеназванного хозяйства подтвердились выделением возбудителя инфекций и исследованиями сывороток крови подозрительных по заболеванию хламидиозом пушных зверей.

Хламидии были выделены на развивающихся куриных эмбрионах в первом же пассаже из патологического материала, полученного из неблагополучного хозяйства. Возможность использования этой лабораторной модели для изоляции и культивирования хламидий использовали многие исследователи (13, 15,16, 33, 57, 73, 78). Специфическая гибель КЭ в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения. При вскрытии павших эмбрионов отмечали множественные точечные кровоизлияния в области головы и конечностей, а также гиперемию и отек желточного мешка и хорионаллантоисной оболочки. В мазках-отпечатках, приготовленных из оболочек желточных мешков погибших куриных эмбрионов, обнаруживали характерные фиолетово-красные элементарные тельца хламидий на зеленовато- на развивающихся куриных эмбрионах

Кроме того, нами изучалась возможность применения для серологической диагностики хламидийных инфекций у зверей иммуноферментного анализа. Исследованиями ряда авторов за рубежом и в нашей стране установлено, что этот метод может быть использован для ретроспективной диагностики хла-мидиозов сельскохозяйственных животных (11, 21, 25, 57,60, 73, 78 и другие).

Сыворотки, исследованные в РСК, также были испытаны в ИФА на предмет выявления специфических антител. При этом 4 пробы сыворотки, положительно реагирующие в РСК, имели титр хламидийных антител в ИФА 1:200 - 1:1600; 4 пробы сыворотки, сомнительно реагирующие в РСК, имели титр хламидийных антител в ИФА 1:100-1:400. Из 4 проб сывороток, не реагирующих в РСК, в 3 случаях в ИФА были выявлены специфические хламидийные антитела в титрах 1:100-1:400. Одна проба сыворотка не реагировала ни в РСК, ни в ИФА.

Результаты наших исследований подтверждают, что ИФА имеет целый ряд преимуществ перед РСК, так как специфичнее и чувствительнее последней (6, 26, 57, 60, 78 и другие).

В последние годы для индикации и идентификации микроорганизмов все более широкое распространение получают молекулрно-генетические методы, основанные на изучении генома (1, 27, 50, 59, 64, 164, 190 и другие) У нас в стране в 1999 году разработаны и утверждены ГУВ Минсельхозпрода РФ "Методические указания по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных", где в качестве метода диагностики хла-мидиоза предполагается использовать полимеразную цепную реакцию.

Таким образом, на основании выделения возбудителя, положительных результатов серологических и молекулярно-генетических исследований в зверосовхозе "Вятский" Кировской области РФ ними установлен хламидиоз лисиц.

При проведении опытов по генодиагностике у исследователей возникает необходимость выделения ДНК исследуемых микроорганизмов. Чистота и концентрация препаратов нуклеиновых кислот обуславливают успех дальнейших исследований (1, 20, 57, 60, 118 и другие).

Хламидии - облигатные внутриклеточные паразиты, а при экстрагировании ДНК из микроорганизмов, способных размножаться только в живой клетке, возникают дополнительные трудности, вызванные необходимостью разделения хламидийной ДНК и ДНК клетки хозяина. В таких случаях главное значение на предварительном этапе имеет очистка культуры штаммов хламидий от клеточного дебриса (57, 60, 125, 164)

При очистке и концентрировании хламидий мы использовали дифференциальное и на градиенте сахарозы центрифугирование суспензии инфицированных хламидиями желточных оболочек павших куриных эмбрионов. В преформированном зональном градиенте сахарозы 30% - 60% хламидии локализовались в зоне 39% - 40% сахарозы. Эти результаты согласуются с данными других исследователей (57, 60, 161).

Кроме указанного, для выделения ДНК были испытаны следующие методы: щелочного лизиса по Н. Birnboim и J. Doly (93); J. Marmur (148); L. Gafford и С. Randall (118), модифицированный A.P. Садриевым с соавт (60).

При выделении ДНК методом щелочного лизиса по Н. Birnboim и J. Doly, несмотря на многочисленные попытки, получить нативные экстракты нуклеиновой кислоты не удалось. ДНК при этом разрушалась, о чем свидетельствовал шлейф по треку электрофоретической разгонки препаратов ДНК.

Применение метода J. Marmur.вызвало частичное разрушение ДНК. Спек-трофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А260/А280) колебались в пределах 1,4-1,6, что говорит о наличии в препаратах нуклеиновой кислоты примесей белков, поэтому точное измерение количества ДНК в данном случае было невозможно.

При использовании метода L. Gafford и С. Randall в модификации А.Р. Садриева структура ДНК не нарушалась, о чем свидетельствовало расположение фракции нуклеиновой кислоты в начале трека. Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А260/А280) колебались в пределах 1,8-2,0, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков. Практический выход ДНК хламидий составил 17,0-18,7 мкг/мг сухой массы микроорганизмов, что соответствует 50-55%.

Однако отрицательным свойством данного метода является его длительность из-за того, что при использовании этой методики необходимо проводить инкубацию реакционной смеси в течение 16-18 часов. Кроме того, указанный метод предполагает 4-х кратную экстракцию хлороформом, что в значительной степени усложняет процесс выделения ДНК.

Одним из способов выделения нуклеиновых кислот бактерий и вирусов является обработка микроорганизмов теплой гомогенной смесью фенола с водой, что приводит к разделению смеси на две фазы. Для эффективной депро-теинизации образующегося при этом нуклеопротеидного комплекса необходимо интенсивно встряхивать смесь реагентов, что приводит к механическому повреждению нуклеиновых кислот.

С целью устранения эффекта образования двух фаз, что в значительной степени усиливает депротеинизирующие и денатурирующие свойства фенола, а также уменьшает гидродинамические воздействия на макромолекулы, применяют метод выделения нуклеиновых кислот в однофазной системе, где к фе-нольной фазе добавляют этанол (20). Метод адаптирован для выделения нуклеиновых кислот вирусов.

Недостатком данного метода является то, что при выделении нуклеиновых кислот бактерий, имеющих более высокомолекулярную ДНК, увеличивается риск потери нуклеиновых кислот вследствие осаждения их этанолом.

В нашей работе выделение ДНК хламидий проводили по предложенному нами фенольно-детергентному методу. Принцип его заключается в том, что разделения реакционной смеси на две фазы (фенол-вода) не происходит за счет наличия фенолята натрия (1,2%) в лизирующем растворе, образующегося в результате взаимодействия фенола с едким натром. Высокая депртеинизирующая активность используемой смеси позволяет заменить резкое встряхивание препарата осторожным медленным перемешиванием и тем самым свести к минимуму гидродинамические воздействия на освобождающиеся нуклеиновые кислоты.

Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК (А260/А280) колебались в пределах 1,8-2,0; что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков и фенола. Практический выход ДНК хламидий составил 18,7-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов, что соответствует 55-60%. Это свидетельствует о пригодности препаратов нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований.

Таким образом, нами разработан фенольно-детергентный метод выделения ДНК хламидий. Преимущества этого метода заключаются в том, что он прост в эксплуатации, экономичен во времени и средствах и дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и концентрации препаратов ДНК хламидий. Результаты наших исследований по изысканию эффективного метода выделения ДНК хламидий оформлены в виде заявки на получение патента.

В качестве теста для генодиагностики хламидиоза нами была использована полимеразная цепная реакция, которая является наиболее удобной для индикации и идентификации нуклеиновых кислот хламидий в патологическом и клиническом материале (125, 164).

ПЦР проводили с использованием специфичных для Chi. psittaci олиго-нуклеотидных праймеров, последовательность которых сконструирована R.G. Hewinson et al.(125).

Выбранные праймерные последовательности были: CPF: S'-GCAAGACACTCCTCAAAGCC-S7; CPR: S'-CCTTCCCACATAGTGCCATC-S'.

ПЦР-тест, который выполнялся с использованием указанных праймеров, основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеоти-дов, который включает в себя 5'-нетранслируемый регион и часть гена Chi. psittaci, кодирующего синтез основного белка наружной мембраны возбудителя.

В ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR были подвергнуты испытанию ДНК штаммов хламидий "КС-93", "ПП-87", "250", "Ростиново-70" и "БЛ-84".

Концентрации нуклеозидтрифосфатов, праймеров и режимы амплификации были заимствованы из источника (125). Авторы использовали в реакции смесь нуклеозидтрифосфатов в концентрации 0,2 мМ, а праймеры CPF и CPR в концентрациях по 0,2 мкМ. Амплификацию проводили в следующем режиме: первоначальное плавление при 94°С - 5 минут, за которым следует 40 циклов: денатурация при 94°С - 1,5 минуты, отжиг при 50°С - 1,5 минуты и синтез при 72°С - 2 минуты. Заключительный этап включает досинтез при 72°С - 10 минут

Результатом ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR проб ДНК штаммов Chi. psittaci "КС-93", "ПП-87", "250", "Ростиново-70", "БЛ-84" явилась амплификация фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов.

При определении специфичности ПЦР с праймерами CPF и CPR было установлено, что данный фрагмент отсутствовал при проведении ПЦР с ДНК, выделенной от других микроорганизмов (хламидий вида Chi. trachomatis, бру-целл, сальмонелл и листерий), а также желточными оболочками куриных эмбрионов, неинфицированных хламидиями.

Полученные результаты дают основания считать, что ПЦР с праймерами CPF и CPR является специфичным средством индикации представителей вида Chi. psittaci.

При определении чувствительности ПЦР с праймерами CPF и CPR было установлено, что при проведении реакции с препаратами, содержащими очищенную ДНК хламидий чувствительность анализа на 2 Log2 выше (> 60 fg ДНК или 6 геномных копий хламидий), чем с пробой, содержащей хламидии, подготовленной для исследования кипячением (>24 хламидий в пробе).

Эти данные согласуются с результатами других исследователей, изучавших данную проблему (125). Причиной сравнительно низкой чувствительности ПЦР амплификации лизированных кипячением хламидиосодержащих проб может служить слабая диссоциация в них нуклеопротеидного комплекса.

Следующим этапом наших исследований явилось выявление возбудителей хламидиоза в патологическом материале.

С этой целью нами методом ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR на предмет выявления Chi. psittaci был исследован патологический материал, поступивший из зверосовхоза "Вятский" Кировской области РФ и полученный от собак и кошек, подозрительных по заболеванию хламидиозом. Неследованные в ПЦР пробы патологического материала образовали специфичные ампликоны длиной 264 пар нуклеотидов, комплиментарные локусу ДНК хламидий вида Chi. psittaci.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность индикации возбудителей хламидиоза в патологическом материале с использованием искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров CPF и CPR.

Эффективной модификацией полимеразной цепной реакции для межштаммовой дифференциации возбудителей инфекционных заболеваний является ПЦР с универсальными праймерами. Произвольная амплификация полиморфных локусов ДНК осуществляется за счет использования в качестве прай-мера олигонуклеотида, комплиментарного к участкам генома различных микроорганизмов, в районе повторяющихся последовательностей. В результате УП-ПЦР синтезируются ампликоны, размеры и взаиморасположение которых в электрофореграммах специфичны для каждого генома.

Метод имеет ряд преимуществ над другими способами генотипирования микроорганизмов:

- анализ продуктов произвольной амплификации полиморфных локусов ДНК намного проще, чем интерпретация результатов, полученных с помощью ре-стрикционного эндонуклеазного расщепления ДНК;

- УП-ПЦР быстрее и менее трудоемка, чем «классическая» мультилокусная геномная дактилоскопия, которая требует несколько операций: рестрикци-онное эндонуклеазное расщепление генома, электрофоретическое разделение полученных фрагментов , перенос на соответствующую мембрану, гибридизация меченным зондом с последующей детекцией.

Для идентификации штаммов Chi. psittaci проводили произвольную амплификацию полиморфных локусов ДНК с применением праймеров, предложенных Н. Pudjiatmoko et al. (164) для межштаммовой дифференциации хламидий:

V3: s'-AACGATCGCAGCGATGAC-^';

129: S'-GCGGTATAGT-S7.

В ПЦР с "универсальными" праймерами V3 и #129 были подвергнуты испытанию ДНК штаммов хламидий "КС-93", "ПП-87", "250", "Ростиново-70" и "БЛ-84".

В УП-ПЦР с праймером V3 не выявлено различий между исследуемыми штаммами Chi. psittaci. Все полученные ампликоны от разных штаммов были одинаковые по количеству и не отличались по своим размерам, о чем свидетельствовали одинаковые расстояния пробега ампликонов от стартовых зон треков.

В результате УП-ПЦР с праймером #129 нам удалось идентифицировать штаммы хламидий вида Chi. psittaci: "Ростиново-70", "250", "БЛ-84", "ПП-87" и "КС-93".

Штамм "КС-93" при амплификации с праймером #129 генерирует 3 фрагмента ДНК (длиной 315, 637 и 830 пар нуклеотидов); "ПП-87" и "250" - 5 фрагментов (315, 637, 681, 830 и 911п.н.); "Ростиново-70" - 6 фрагментов (315, 637, 681, 789, 830 и 911п.н.); "БЛ-84" - 4 фрагмента (156, 681, 830 и 911п.н.).

При этом штаммы "ПП-87" и "250" невозможно дифференцировать друг от друга в виду отсутствия различий в результатах УП ПЦР с праймером #129.

Использованный в нашей работе праймер #129 в произвольной амплификации полиморфных локусов ДНК является эффективным средством геноиден-тификации исследованных штаммов хламидий.

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о принципиальной возможности межштаммовой дифференциации Chi. psittaci при использовании УП-ПЦР.

Дальнейшие исследования с применением данной техники, используя максимально возможное число изолятов микроорганизмов и другие "универсальные" праймеры, позволят провести паспортизацию штаммов хламидий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вафин, Рамиль Ришадович, Казань

1. Анализ генома. Методы: Пер. с англ. /Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. - 246 с.

2. Алимов A.M., Фаизов Т.Х. Молекулярная ДНК/ДНК гибридизация для идентификации возбудителей зоонозов // Тез. докл. Республиканской на-учно-произв. конференции Казань, 1992. - с.7.

3. Алимов A.M., Фаизов Т.Х. Молекулярно-гибридизационные тест-системы для идентификации возбудителей инфекционных болезней // Мат. научно-произв. конф. по вопросам ветеринарии. Казань, 1994. - с. 15

4. Аскарова А. Н. ПЦР в анализе генома. Казань, 2000. - с. 17-33.

5. Багдонас И., Лабутинас А. Изучение экспериментальной пневмонии телят, зараженных возбудителем группы хламидий / Труды Литовского НИИВ. 1976. - С.5-14.

6. Байтурина О.Ш. Лечебно-профилактическая эффективность дибиомицина при хламидиозе овец / Труды Алма-Атинского зооветинститута. 1976. -Т.34. - С.85-89.

7. Беклешова А.Ю. / Инфекционные болезни животных. М. 1987. - С. 141149.

8. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Елисеев А.К., Кочиш И.И. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериям и хламидиям / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С.74.

9. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Кочиш И.И. Разработка набора для имму-ноферментной серодиагностики хламидиоза овец / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С.76.

10. Бескина С.Р., Панкратова В.Н., Попов В.П. Индикация антигенов гальпровий (хламидий) иммунопероксидазным методом / Сб. науч.тр.: Экология вирусов. Баку, 1976. - С.208-209.

11. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней. Киев: Урожай, 1991. - 192с.

12. Бутин B.C., Тарасова Э.К., Сосновская А.И. Эпизоотология болезней сельскохозяйственных животных. Новосибирск, 1983. - С.74-76.

13. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я., Молчанова Т.В. Иммуноферментный анализ при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / Вопр. вет. вирусол., эпиз. и микроб.: Тез. докл. научн. конф. -Покров, 1983. С.66-76.

14. Гаффаров Х.З. Выделение вируса из группы пситтакоза-лимфогранулемы от телят, больных бронхопневмонией / Ученые записки КВИ. 1969. - № 104.-С.47.

15. Гаффаров Х.З., Михайлова Л.И., Кривоносов B.C. Выделение вируса из группы ОЛТ при энзоотическом аборте овец // Ветеринария. 1971. - № 7. - С.109-111.

16. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний // Клин. лаб. диагн. 1998. - №2. - с.35-39.

17. Говорун В.М. Новые направления в ДНК-диагностике / ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний // Сб. тр. II Всерос. на-учно-практ. конф. -М., 1998. с. 12-13.

18. Горовиц Э.С., Тимашева О.А., Петров В.Ф., Корпунина Т.И. Диагностика хламидийных инфекций человека и животных // ЖМЭИ. — 1998. №2. -с.72-75.

19. Гринин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: Колос. 1971. 240 с.

20. Гусева Е.В., Сатина Т.А. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных // Обзор литературы. Владимир, 1995. - 44с.

21. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний, передаваемых половым путем: Методич. матер. / Под ред. Борисенко К.К. и др. М.: Асс.»Сенам». - 1997.

22. Домейка М.А. Биологическая характеристика хламидий возбудителя энзоотического энтерита телят: Автореф. дис. . канд. вет. наук. - Тарту, 1986.-25с.

23. Дубинина Г.И., Щербо С.Н. Роль метода полимеразной цепной реакции в генодиагностике // Сб.тр.: Новые генетические технологии. 1988. - №1. - С.20-39.

24. Караваев Ю.Д., Дзиова Н.Н., Крюков Н.Н. Сравнительное изучение чувствительности РСК и микроагглютинации при диагностике энзоотического аборта овец // Бюлл. ВИЭВ. 1971. -№11. - С.77-78.

25. Караваев Ю.Д. Активность диагностических положительных сывороток, полученных от различных видов животных, гипериммунизированных возбудителем аборта овец // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - № 14. - С.60-61.

26. Караваев Ю.Д. Агглютинирующая активность штаммов возбудителя, выделенных при массовых абортах овец // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - № 14. С.62-63.

27. Караваев Ю.Д., Налетов Н.И., Калугина И. Хламидиозы меры борьбы и профилактики // Ветеринарная газета. - 1993. - №26. - С.4.

28. Ковалев B.JI. Исследование сыворотки крови в РСК при диагностике вирусного аборта овец // Вирусн. болезни с/х животных: Матер.I Межвузовской ветеринарной вирусол. конф. М., 1970. - С. 130-131.

29. Колкова Н.И., Мартынова В.Р. К вопросам диагностики хламидийных инфекций //Клин, лаборат. диагн. 1998. - №2.-С.20-21.

30. Кузьменко В.П. Особенности взаимодействия хламидий с клетками //Микробиол.журнал.-1980.-№2.-С.250-259.

31. Кутлин А.В., Шаткин А.А., Дробышевская Э.И. Иммунодиагностические препараты на основе моноклональных антител к Chi. trachomatis // ЖМЭИ. 1996. - № 6. - С.42-44.

32. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии // ЖМЭИ -1985. -№4. -С.100-107.

33. Мартынова Р.В., Шаткин А.А., Щербакова Н.И. Диагностическое выделение гальпровий (хламидий) в куриных эмбрионах при трахоме, паратра-хоме и другой этиологически родственной патологии // Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. -М., 1979. С.36-40.

34. Мартынова Р.В., Колкова Н.И., Шаткин А.А. Хламидии и хламидиозы: клиника, биология и диагностика // Рос. мед. вести. 1997. - Т.2. - №3. -С.49-55.

35. Машкиллейсон A.JL, Гамберг М.А. Диагностика урогенитальной хлами-дийной инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом при использовании моноклональных антител / Хламидийные инфекции. М., 1986. - С.56-60.

36. Милютин В.И., Неустроев В.Д., Хандуев Ц.Ц. Микрофотография крупных вирусов и риккетсий под люминесцентным микроскопом // Вопр. вирусол. 1959.-№ 4. - С.502-506.

37. Мошковский Ш.Д. Природа вирусов и их место в системе живого // Вестн. АМН СССР. 1963. - Т.1. - С.37-39.

38. Николаева А.В. Об энзоотической пневмонии свиней, вызываемой вирусом из группы орнитоза лимфогранулемы- трахомы / Вирусн. болезни с/х животных: Матер. I Межвузовской вет. вирусол. конф. - М., 1970. -с.227-228.

39. Новохатский А.С., Носик Д.Н., Литвинович Н.Е., Малахова ИВ. Имму-ноферментный анализ моноклональных антител на твердой фазе инфицированных клеток // Вопр. вирусол. 1986. - № 4. - С.440-444.

40. Норкина О.В., Куличенко А.Н., Шоводаева Г.А. и др. Конструирование видоспецифичного для Yersenia pestis хромосомального ДНК-зонда // Генетика. 1993. - Т.29. - №3. - С.1732-1736.

41. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек. Приложение к журналу «Новости звероводства». - М., 1994. - 92с.

42. Обухов И.Л. Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза. Дисс. . докт. биол. наук. М., 2000. С.351

43. Обухов И.Л. Обнаружение Chi. psittaci при конъюнктивитах у собак // Сб. науч. тр. Всеросс. гос. НИИ контроля стандартизации и сертификации вет препаратов. 1996. - Т.57. - С.45-51.

44. Обухов И.Л, Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях // Ветеринария. 1997. -№2. -С.24-27.

45. Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий // Докл. РАСХН. 1997. - № 1. - С.44-45.

46. Овчинников М.Н., Дилекторский В.В. Ультраструктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение. М.: Медицина, 1986.-С.175.

47. Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции // Ветеринария. 1997. - №7. - С.19-21.

48. Першина М.Ю., Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Прозоровский С.В. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами // Молек. генетика, микробиол. и ви-русол. 1998. - №1. - С.29-32.

49. Покровский В.И., Голубинский Е.П., Семина Н.А. и др. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития / Обз. инф. ВНИИ мед. и мед.-техн. инф. 1986. - №3. - 73с.

50. Попов В.JI. Цикл развития и клеточный цикл хламидий / Хламидии (гальпровии) и хламидиозы. М., 1982. - С.16-17.

51. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных (этиология, диагностика, профилактика и меры борьбы): Дисс. . докт. вет. наук. Казань, 1998. 316с.

52. Рассулин Ю.Ю., Федорова Н.А., Речинский В.О., Парфанович М.И. Обнаружение провируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах периферической крови крупного рогатого скота методом ДНК гибридизации // Вопр. вирус. - 1988. - №1. - С.58-63.

53. Рысков А.П., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И., Иванов П.Л., Лимберская С.А. Геномная «дактилоскопия» организмов различных таксономических групп: использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М13 // Генетика. 1988. Т.24. - №2, - С.102-109.

54. Садриев А. Р. Иммунохимический анализ и геноидентификация хламидий. Дисс. . канд. биол. наук. Казань, 1999. 137с.

55. Улендеев А.И., Деханов А.А. Материалы по изучению респираторных заболеваний телят / Тез. докл. Всесоюзной межвузовской конференции по вет.вирусологии. М., 1971. - 4.2. - С.48-50.

56. Улендеев А.И., Деханов А.А. О роли микроорганизмов из группы ОЛТ при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях телят / Труды Ульяновского с/х института. 1971. - Т.16. - №4. - С. 166-176.

57. Фаизов Т.Х., Равилов Р.Х., Гришкевич Н.М., Староверов С.А. ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция для выявления зооантропонозов // Матер. Респ. научно-произв. конф. по акт. проблемам ветер, и зоотехнии. -Казань, 1996,-С.49.

58. Фаизов Т.Х., Гришкевич Н.М., Алимов A.M. Произвольные праймеры: новые возможности идентификации бактерий // Матер. Междунар. научн. конф. посвящ. 125-летию КГАВМ 4.1. - Казань, 1998. - С.90-91.

59. Хамадеев Р.Х. Изучение энзоотического аборта овец в Татарской АССР и усовершенствование методов лабораторной диагностики этого заболевания: Автореф. дис. канд. вет. наук. Казань, 1975. - 26с.

60. Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М., Равилов А.З. Разработка и испытание по-лиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота // Тез. докл. научно-практ. конф. по проблемам ветер, и живодновоства.- Казань, 1994.-С.28-29.

61. Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М., Равилов А.З. Разработка инактивирован-ной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней // Вирусн. болезни с/хламидиозов животных. Владимир, 1995. - С. 151.

62. Хамадеев Р.Х., Равилов А.З. Хламидиозы меры борьбы и специфической профилактики // Материал. Всеросс. научн. конф.: Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных - М., 1996. - С.36-37.

63. Хамадеев Р.Х., Равилов А.З. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и их патогенность для человека // Журн. микробиол. -1997. № 1. - С.99-101.

64. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение): Методические рекомендации / Под ред. Серова В.Н., Краснопольского В.И., Делекторского В.В. и др. -М.: Патент, 1996. 22с.

65. Хламидиозы сельскохозяйственных животных. // Под ред. Хазипова Н.З. и Равилова А.З. М.: Колос, 1984. - 223с.

66. Шагинян И.А., Гинцбург A.J1. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций II Мол. генет., микробиол. и вирус. 1994. -№12,- С.3-9.

67. Шаманек Т.П., Новиков Е.А., Гаврюшкин А.В., Ковпак Д.Н., Соков Б.Н. Сравнительная оценка чувствительности ПЦР и РИФ при диагностике урогенитальных инфекций // ЖМЭИ 1998. - №1. - С.86-88.

68. Шаткин А.А. Основные принципы лабораторной диагностики гальпро-виозов (хламидиозов) / Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М., 1979. - Вып. 1. - С.25-36.

69. Шафикова Р.А. Иммунобиологическая характеристика хламидий, усовершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов: Автореф. дис. . докт. вет. наук. Казань, 1991. - 38с.

70. Щербань Г.П., Щербань Н.Ф. Энзоотический (вирусный) аборт овец // Ветеринария. 1974. - № 8. - С.85-87.

71. Щербань Г.П., Зимина В.П. Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним // Ветеринария. 1986. - №9. - С.46-48.

72. Щербо С.Н., Макаров В.Б. ПЦР диагностика заболеваний, передаваемых половым путем // Клин. лаб. диагн. - 1998. - №2. - С.21-24.

73. Ярыгин В.Н., Васильева В.И., Волков И.Н., Синелыцикова В.В. Биология. -М.: Высш. шк., 2001. с. 10-12.

74. Armstrong J.A. Valentine R.C, Filds C. Structure and replication of the trachoma agent in cell cultures, as shown by electromicroscopy // J.Gen. Microbiol. P.25-26.

75. Asso M. et al. La chlamydiose abortiv ovine // Patre 1981. - V.284. - P.25-26.

76. Babudieri B. The slide microagglutination tests in the field of Rickettsial and viral serology. Its Advantages and Limitations // Path. Microbiol. 1961. -№24. -P.ll-20.

77. Barron A.L., Collins A.R. Studies on trachoma agent by Double diffusion gel precipitation // Am. J. Ophthal. 1967. - №63. - P.461 -465.

78. Barron A.L., Gaste P.G., Paul В., Page L.A. Detection of chlamydiae antibodies in animal sera by double diffusion in gel // Appl. Microbiol. 1972. - V.29.- №4. P.770-774.

79. Beck S., Kleffe Т.О., Coull L.M. et al. Chemilumenescent detection for DNA sequensing and hybridization // Nucl. Acids Res. 1989. - V.17. - №13. -P.5115-5123.

80. Bedson S.P., Bland J.O. Morphological stady of the psittacosis virus, with a description of the developmental cycle // Brit. J. Exp. Path. 1932. - №13. - P. 461-466.

81. Benedict A.A., O'Brien E.A. Antigenic studies on the psittacosis-lymphogranuloma venereum group of viruses. II. Characterization of complement fixing antigens extracted with sodium lauril sulfate // J. Immunol. 1956.- V.76. №4. - P.293-300.

82. Benedict A.A., O'Brien E.A. Passive hemagglutination reaction for psittacosis // J. Immunol. 1958. - V.80. - №2. - P.94-99.

83. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis // Yerlag chemie. 1983. -V.86. - №1. - P.9-12.

84. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513.

85. Blanco L.A., Barrera P.J., Macrotequi M.A. Ultrastructura de una chlamydia de origen bovino // An. Inst. Nac. Investig. Agr. Ser.: Hig. Sanid anim. — 1975. — №2. P.37-55.

86. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis // Infect. Immunol. 1981. -№31. -P.1161-1176.

87. Caldwell H.D., Judd R.C. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins // Infect. Immunol. 1982. - №38. - P.960-968.

88. Calisto M.L., Marino D., Picerno J. et. al. Studio comparativo tra il test di am-plificazione del DNA (PCR) elacoltura cellulare nella diagnosi dell infeczioni da Chi. trachomatis in ginecologia ./ Riv. Ital. Ig. 1996 - V.56. - №3-4. -P.47-54.

89. Campbell L.A., Kuo C.C., Grayston J.T. DNA analisis of a new chlamydial agent (TWAR) associated with acute respiratory disease / Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.: 87th Annu Meet. Atlanta, Ga, 1987.

90. Charton A. Chlamydioses des ruminants (bovine, ovine, caprine): etudes ex-perimentales. 2. Composition polypeptidique des corps elementaires de soches de diverses origines // Bull. Acad. Vet. Fr. 1976. - V.49. -№4. - P.401-408.

91. Christiansen G., Ostergaard L., Birkelund S. Molecular biology of the Chi. pneumoniae surface // Scand. J. Infect Dis. 1997. Suppl. №104. - P.5-10.

92. Collins A.R., Barron A.L. Demonstration of Group- and Species-specific antigens of chlamydial agents by gel diffusion // J. Infect. Dis. 1970. - V.121. -№1. -P.l-8.

93. Colon J.I. The role of folic acid in the metabolism of members of the psittacosis group of microorganisms // Ann. N.Y. Acad. Sc. 1962. - №98. - P.243.

94. Corcish J.D., Bevan B.J. Diagnosis of psittacosis. Yet. Rec. 1991. - №12. P.42-43.

95. Dixit S.N., Kalra D.S., Sadana JR., Purohi V.D. Neo on seroprevalenie of chla-mydiosis in sheep and goats // Indian J. Anim. Sci. 1980. - V.50. - P.786-787.

96. Eissenberg L.G., Wyrick P.B., Davis C.H., Rumpp J.W. Chl.psittaci elementary body envelopes: Ingestion and inhibition of phagolysosome fusion // Infect.and Immunol. 1983. - V.40. -№2. -P.741-751.

97. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay for immunoglobulin G // Immunochem. 1971. - №8. - P.871-874.

98. Engvall E., Carlsson H.E. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA: First International Symposium on Immunoenzymatic Techniques INSERM, Symposium N2 / Feldman et al., eds. North Holland Publishing Company. - Amsterdam, 1976.

99. Enzyme immunoassay // Ishikawa E., Kawai Т., Miyai K., eds. Tokyo: Igaku-Scoin, 1981.

100. Enzyme-mediated immunoassay / Ngo T.T., Lenhoff H.M., eds. N.Y.: Plenum Press, 1985.

101. Erlandson R.A., Allen E.G. The ultrastructura of meningopneumonitis // Virology. 1964. - №22. - P.410-418.

102. Erlich H.A. PCR technology: principles and applications for DNA amplification N. Y Academic Press. - 1989.

103. Fitts R., Diamond M., Hamilton C., Nery M. DNA-DNA hubrydization assay for detection of Salmonell spp. in foods // Appl. and Envizon.Microbiol. -1983.-№5.-P. 1146-1151.

104. Frazier M.E., Samuel J.'E., Baca O. et al. Detection of Coxiella burnetti by DNA probes // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microb. 87 th. Atlanta. 1987. -P.356.

105. Friis R.R. Infection of L cells and Chi. psittaci, entry of the parasite and host responses to its development // J. Bacteriol. 1972. - V. 110. - P.706-721.

106. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants// Int. J. Syst. Bact. 1992. - V.42. - P.306-308.

107. Fukuchi H., Ogawa H., Ninamoto N. et al. Seroepidemiological surveillance of Chi. psittaci in cats and dogs in Japan // Vet.Res. 1985. - V. 117. - №19. -P.503-504.

108. Gafford L.G., Randall C.C. // J. Molecular Biol. 1967. - №26. - P.303.

109. Geally J.F. Monoclonal antibodies and their potential in medicine // Irish Med. J. 1987. - V.80. -№6. - P. 161-162.

110. Gonsales S.J. Chi. psittaci varieded TWAR. Un nueve patogeno a considerar // Enferm. Infect. VMicrobiol. Clin. 1987. -№5. -P.319-321.

111. Grayston J.T., Wang S.P., Kuo C.C., Campbell L.A. Current knowledge on Chi. pneumoniae, strain TWAR, an important cause of pneumonia and other acute respiratory diseases //Eur. J. Clin. Microbiol, and Infect. Dis. 1989. -V.8. - №3. - P.191-202.

112. Hackstandt T. Identification and properties of chlamydial polypeptides that bind eucaryotic cell surface components // J. Bacteriol. 1986. - №165. -P. 13-20.

113. Hartmann В., Schuh E., Stary A. Amplifizierungs-methoden in der Chlamy-dien-diagnostic // MTA. 1997. - V.12. - №7. - P.476-480.

114. Haskizume S. Diagnosis of chlamydial infection // Asian Med. J. 1988. -V.31. -№2. -P.83-86.

115. Hewinson R.G., Griffiths P.C., Bevan B.J. et al. Detection of Chi. psittaci DNA in avian clinical samples by polymerase chain reaction // Vet. Microbiol. -1997.-V.54. -№2.-P.155-166.

116. Hewinson R.G., Griffiths P.C., Rankin S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci // Vet. Tec.- 1991,- V.128. -P.381-382.

117. Higachi N. Electron microscopic studies on the trachoma virus and psittacosis virus in cellcultures // Ex. Mol. Pathol. 1965. - №4. - P.24-29.

118. Holland S.M., Gaydes C.A., Quinn T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect. Dis. 1990. - V.162. -P.984-987.

119. Ibrahim A., Uesach W., Stuchebrand E. Polymerase chain reaction gene probe detection system specific for pathogenic of Yersinia enterocolitica // J. Clin. Microbiol. - 1991. - V.30. - №8. -P.1942-1947.

120. Isobe K., Aoki K., Itoh N. et al. Serotyping of Chi. trachomatis from inclusion conjunctivitis by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis // Jap. J. Ophtal. 1996. - V.40. - №2. - P.279-285.

121. Ito J.I., Harrison H.R., Alexander E. et al. Establishment of genital tract infection in the CF-1 mouse by intravaginal inoculation of a human oculogenital isolate of Chi. trachomatis // J. Infect. Dis. 1984. - Y.150. - №4. - P.577-582.

122. Jenkin H.M. Preparation and properties of cell walls of agent of meningopneu-monitis // J. Bacteriol. 1960. - У.80. - P.639-647.

123. Jenkin H.M., Ross H.R., Moulder J.W. Spacies-specifie antigens from the cell walls of the agents of meningopneumonitis and foline pneumonitis //J.Immunol. 1961. - V.86. - P.123-127.

124. Kaltenboeck В., Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamidiae isolated from swine // Am. J. Vet. Res. 1992. - №9 - P.1482-1487.

125. Kaltenboeck В., Kousoulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. -1991 V.29. - P. 1969-1975.

126. Kaltenboeck В., Kousoulas K.G., Storz J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompA DNA of Chlamydia spp // J. Clin. Microbiol. 1992. - V.30. - P. 1098-1104.

127. Kaltenboeck В., Kousoulas K.G., Storz J. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the chlamidial species. J. Bact. 1993 V.175. -P.478-502.

128. Kingsbery D.T., Weiss E. Lack of DNA homology between species of the genus Chlamydia//J. Bacteriol. 1968.-V.96. - №4. - P. 1421-1423.

129. Lebar W.D., Herschman В., Jemal C. et al. Comparison of DNA probe, monoclonal antibody enzyme immunoassay and cell culture for detection Chi. trachomatis // J. Clin. Microbiol. 1989. - V.27. - №5. - P.826-828.

130. Lepinay A., Robineaux R., Orfilla J. Ultrastructura et cytochimie ultrastruc-turale des membranes de Chi. psittaci // Arch. Des. Virus forsch. 1971. -V.33. -P.261-270.

131. Lincoln S., Kwapien R.P., Reed D. E. et al. Epizootic bovine abortion // Am. J. Vet. Res. 1969. - V.30. - №12. - P.2105-2113.

132. Lipine P., Sautter A. //Bull. Acad. Nat. Med. 1951. - V.332 - P. 19-20.

133. Litwin J. The growth cycle of the psittacosis group of microorganisms // J. Infect. Dis. 1959. - V.105. - P. 129-161.

134. Longhofer S.L. Chemotherapy of ricketsial, protosoal and chlamydial diseases // Veter. Clin. N. Amer.: Small. Anim. Pract. 1989. - V.18. - №6. - P.l 1831196.

135. Ma J.J., Stephens R.S., Kuo C.C. The heterogenic composition of the outer membrane protein of Chi. trachomatis //Abstr. An. Meet Am. Soc. Microbiol. -Waschington, D.C. 1987. - P.98-100.

136. Maclean I.W., Peelino R.W., Brunham R.C. Characterization of Chi. trachomatis antigens with monoclonal antibodies // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34. -P.141-147.

137. Manire C.P., Tamura A. Preparation and chemical composition of the cell walls of nature infections dense forms of meningopneumonitis organisms // J. Bacteriol. 1967. - V.94. -№4. - P.l 178-1183.

138. Marmur J. A procedure for isolation of DNA from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. - V.3. - P.208-218.

139. Meyer K.F., Eddie В., Schachter J. Возбудители пситтакоза и венерической лимфогранулемы // Лаб. диагн. вирус, и риккетсиозных забол. М.: Медицина. -1974. - С.708-739.

140. Moulder J.W. Биохимия внутриклеточного паразитизма. М.: Мир. - 1965.- 197с.

141. Moulder J.W. Metabolic capabilities and deficiencies of rickettsiae and psittacosis group // Int. J. Leprosy. 1965. - V.33. - P.494.

142. Moulder J.W., Grissa D.L., Cho H.J. Endogenous metabolism of protein and ribonucleic acid in a member of the psittacosis group // J. Infect. Dis. 1965. -V.115. -№3. - P.254.

143. Moulder J.W. The contribution of model system to the studying of infections disease // Persp. Biol. Med. 1971. - Y.14. - P.486-502.

144. Murrey E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the PLV group // J. Infect. Dis. 1964. V.114.

145. Oehme A., Berlau J., Groh A. et al. Comparison of two immunoassays for detection of Chi. trachomatis and evaluation of discrepant results by means of cell culture, PCR and serology // Clin. Lab. 1996. - V.42. - №10. - P.843-846.

146. Oellerich M., Haeckel R., Haindl H. Evaluation of EMIT adapted to the Bio centrifugal analyzer (Cobas) // J. Clin. Biochem. 1982. - V.20. - P.765-772.

147. Oriel J.P. Treatment of nongonococcal urethritis / Charman s report and discussion: Nongonococcal urethritis and relat. infect. Washington, D.C. - 1977.- P.38-48.

148. Ориэл Д.Д., Риджуей Д.Л. Хламидиоз. М.: Медицина, 1984. - 191с.

149. Petersen E.E. Chlamydien infektionen I I MTA. 1996. - V.l 1. - №5. - P.354-362.

150. Poffenroth L., Costerton J.W., Kordova N., Wilt J.C. Ultrastructural studies of Chi. psittaci 6BC strains // Can. J. Microbiol. 1973. - V.19. - №8. - P.887-894.

151. Pollard D.R., Tyler S.D., N g C. W. e.a. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia sppЛ Mol. Cel. Probes. -1989.-№3.-P.383-389.

152. Popov G., Martinov S. Electronmicroscopic diagnostics of the chlamydial abortion in ewes // Abstracts. 1986. - P.925-928.

153. Pudjiatmoko H., Ochiai Y., Yamaquchi T. et al. Diversity of feline Chi. psittaci revealed by random amplification of polymorphic DNA // Yet. Microbiol. -1997. V.54. - № 1. -P.73-83.

154. Rake G. Viral and rickettsial diseases of the skin, eye and mucous membranes of man//Ann. N.Y. Acad. Sc. 1953. - V.56. -№3. - P.557-560.

155. Rappolee D.A. Optimizing the sensitivity of RT PCR К A forum for PCR users: Issue U. - 1990. - P.23.

156. Rasmussen S.J., Douglas P.P., Timms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes. 1992. - №6. - P.389-394.

157. Rasmussen S.J., Timms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett. 1992. - V.77. - P.169-174.

158. Raulston Jane E. Chlamydial envelope components and pathogen host cell interactions // Mol. microbiol. - 1995. - V.l5. - P.4.

159. Reed L.F., Muench H. A simple method of counting 50% end-point // Am.J. Higiene. 1938. - V.27. - P.493-497.

160. Samoilovich S.R., Dugan C.B., Macario A.J.L Hybridoma technology: new developments of practical interest// J. Immunol. Meth. 1987. - V.101. - №2. -P.153-170.

161. Schachter J. DNA, EIA, PCR, LCR and other technologies: What tests should be used for diagnosis of chlamydial infections? // Immunol. Invest. 1997. -V.26. -№1-2. - P.157-161.

162. Schlossberger H., Kolle W., Hetsch H. Experimented Bakteriologie und In-fektionskrankheiten. -Munchen, 1952.

163. Seki C., Takashima I., Arikawa J., Hashimoto N. Monoclonal antibodies to Chi. psittaci: characteristics and antigenic analysis // Jap. Vet. Sc. 1988. -V.50. -№2. - P.383-393.

164. Симерджиев Б. Неориккетсиози сельскостопански животни и птици // Вет. Мед. Науки. 1968. - №10. - С.3-9.

165. Stephens R.S., Kuo С.С. Chi. trachomatis species-specific epitope detected on mouse biovar outer membrane protein // Infect. Immunol. 1984. - V.45. -P.790-791

166. Telenius H., Clark J., Maraus E. et al. Minisatellite DNA profiles: rapid simple identification in linlage analysis // Human Herdity. 1990. - V.40. - P.77-80.

167. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked imrnunoelectrotrans-fer blot techniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies seperated by gel electrophoresis // Meth. Enzymol. 1983. - V.92. -P.377-391.

168. Tuffrey M., Folder P., Thomas В., Taylor-Robinson D. The distribution and effect of Chi trachomatis in CBA mice inoculated genitally, intraarticularly or in-travenoualy // Med. Microbiol, and Immunol. 1984. - V.173. - №1. - P.29-35.

169. Van Zaane D., Ijzerman J. Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulins and their use in isotype-specific ELISAs for rotavirus antibody // J. Immunol. 1984. - V.72. -№2. - P.421-441.114

170. Wang S.P., Kuo C.C., Barnes R.C. et al. Immunotyping of Chi. trachomatis with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. 1985. - Y.152. - №4. - P.791-800.

171. Wehr J. Zu einign Characteristika non Rinderchlamydia-enstammen // Wiss. Z. Humbold-Univ. Berlin Math. Naturwiss. R. 1980. - V.29. - №1. - S.25-32.

172. Wiedmann M., Wilson W.J., Crajka J. et al. // PCR Methods and Applications. 1994. - V.3. - № 4. - P.551-564.

173. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ Департамент ветеринарии

174. Методические рекомендации предназначены для специалистов ветеринарных и медицинских лабораторий, занимающихся вопросами борьбы с хла-мидийными инфекциями.

175. Методические рекомендации рассмотрены и одобрены научно-исследовательским Советом ВНИВИ от «21» ноября 2002 г.

176. КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМ. Н.Э. Баумана

177. Кафедра патологии мелких животных и оперативной хирургии

178. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

179. Лаборатория химического и молекулярного анализа биологических средств вобъектах ветеринарного надзора

180. Вафин P.P., Равилов Р.Х., Фаизов Т.Х., Садриев А.Р., Алимов A.M.

181. ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ВИДА CHLAMYDIA PSITTACI МЕТОДОМ ИОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИметодические рекомендации)1. Казань 2002

182. Рецензенты: заведующий кафедрой биохимии КГАВМ, д.в.н., профессор Хазипов Н.З.заведующий кафедрой микробиологии КГАВМ, д.в.н., профессор Госманов Р.Г.

183. Рекомендованы к опубликованию Ученым советом факультета ветеринарной медицины 24 декабря 2002 г. (протокол № 3).

184. Методические указания предназначены для студентов факультета ветеринарной медицины, слушателей факультета повышения квалификации, специалистов ветеринарных лабораторий, практикующих ветеринарных врачей

185. В результате исследований 25 проб патологического материала на хламидиоз, бруцеллез, листериоз, лептоспироз и сальмонеллез были выделены хламидии от лисиц.

186. Методом ПЦР в указанных материалах также были обнаружены хламидии.

187. При исследовании 12 проб сывороток крови абортировавших лисиц, в РСК положительно реагировали (титр хламидийных антител 1:10 и выше) 4 пробы, сомнительно (титр хламидийных антител 1:5) - 4 пробы.

188. Таким образом, на основании выделения возбудителя и положительных результатов серологических исследований в зверосовхозе «Вятский» Кировской Области РФ нами установлен хламидиоз лисиц.

189. Директор Всероссийского научно-исследовательскоговетеринарного института,профессорподпись А.З. Равиловпечать