Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ хламидий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ хламидий"

На правах рукописи

ВАФИН РАМИЛЬ РИШАДОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХЛАМИДИЙ (геномика, таксономия, индикация и идентификация)

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой птрпр...» доктора биологичесю

иио*»« --_

Казань-2009

003481358

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном

учреждение высшего профессионального образования Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

Равилов Рустам Хамитович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ильинская Ольга Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО

«Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится « 3 » декабря 2009 г. в «_» часов

на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета.

доктор медицинских наук, профессор Поздеев Оскар Кимович

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

Д.18.

Автореферат разослан «'/? •»CKHI&foS 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Научные достижения последних десятилетий в области молекулярной биологии, генетики, биохимии, пересекающиеся с микробиологией, вирусологией, иммунологией и другими смежными дисциплинами, привели к созданию, развитию и внедрению в практику диагностических лабораторий молекулярно-генетических методов исследования геномов эукариот, прокариот и вирусов. Генодиагностические подходы, базовыми направлениями которых являются гибридизационные, амплификационные, сиквенсные и другие технологии ДНК/РНК-анализа, постоянно совершенствующиеся в плане специфичности, чувствительности, экономии и безопасности, позволяют осуществлять широкий спектр задач индикации и идентификации биологических объектов. На сегодняшний день они являются одними из самых эффективных приемов при постановке диагноза на инфекционные болезни (P. Singleton, 2ООО; N. Woodford et al., 2004; GJ. Viljoen et al., 2005; M. Klint et al., 2007; K. Sachse et al., 2008). В этом плане весьма актуальным представляется решение вопросов номенклатуры и классификации микроорганизмов, что является основой идентификации болезнетворных агентов.

Хламидиозы - группа разнообразных по проявлению контагиозных болезней животных, возбудителями которых являются внутриклеточные микроорганизмы со своеобразным циклом развития (J. Starz, 1988). Геномы хламидий являются перспективным объектом исследования, а генетический критерий идентификации служит одной из конструктивных звеньев построения их классификации (K.D. Everett et al., 1999а, 1999b; J.C. Hartley et al., 2001; M. Van Loock, 2003; N.R. Thomson et al., 2005,2008; R.S. Stephens et al., 2009).

Особенностью хламидиозов, значительно усложняющей контроль за развитием заболевания, является частое латентное или хроническое течение со стертой клинической картиной. Кроме того, обладая низкой иммуногенностью, не обеспечивающей выработку достаточного количества антител, инфекция часто приобретает персистирующий характер и способствует образованию тлеющего очага.

Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Это обусловливает необходимость изыскания и внедрения чувствительных средств диагностики, позволяющих выявлять хламидии при любой форме проявления инфекционного процесса (J.C. Hartley et al., 2001; К. Sachse et al., 2009).

Исходя из этого, перспективным направлением является совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов на основе молекулярно-генетических методов исследования.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - создание научно-практических основ генодиагностики биологических объектов и проведение системного молекулярно-генетического анализа хламидий на предмет их таксономической принадлежности.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

- разработать способ выделения нуклеиновых кислот хламидий для получения препаратов ДИК высокой степени чистоты и нативности;

- разработать способ проведения ПЦР, обеспечивающий эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции;

- разработать способ деконтаминации амплификационных реакций на основе урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты от контаминации;

- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидий в патологии клеточных пушных зверей, птиц, рептилий и амфибий;

- подобрать условия проведения индикации и идентификации хламидий в клиническом и патологическом материале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа;

- провести молекулярно-генетические исследования типичных представителей рода Chlamydophila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» на предмет их таксономической принадлежности на основании сравнительного анализа по ompl-, omp2-, 16S рРНК- и 23S рРНК-теням с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а также по наличию экстрахромосомной плазмиды.

Научная новизна.

- Впервые на основании системного молекулярно-генетического анализа представителей семейства Chlamydiaceae охарактеризован новый, ранее не изученный генотип хламидий, обозначенный нами «генотип G», с предложением соотнесения изолированных от млекопитающих при абортах штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода Chlamydophila в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov.

- Разработка фенольно-детергентного способа выделения ДНК хламидий (Патент РФ на изобретение № 2230120 - «Способ выделения ДНК микроорганизмов»).

- Разработка методики высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 2299240 - «Способ проведения ПЦР»),

- Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) (Патент РФ на изобретение № 2307167).

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены охраноспособными документами, отражены в публикациях ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК и глобальной

электронной базе данных генбанков NCBI (США), EMBL (Великобритания),

DDBJ (Япония).

Научно-практическая значимость.

- Результаты молекулярно-генетических исследований типичных представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», характеризующие собой новый, ранее не изученный генотип хламидий («генотип G»), с предложением выделения изученных штаммов в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov., существенно повышают уровень знаний о природе хламидийных инфекций и позволяют эффективно использовать полученную информацию в научно-практической деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины.

- Разработан способ выделения ДНК хламидий для последующего молекулярно-генетического анализа. Предложенная разновидность фенолыю-детергентного метода экстракции нуклеиновых кислот микроорганизмов проста в эксплуатации, экономична во времени и средствах, дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и концентрации препаратов ДНК хламидий.

- Разработан способ проведения полимеразной цепной реакции, являющийся действенной альтернативой разновидностям «точной» ПЦР, таким как «touch-up PCR» и «touch-down PCR». Предложенная методика высокоточной ПЦР позволяет значительно повысить специфичность амплификации интересуемых участков геномов исследуемых биологических объектов.

- Разработан способ ферментативной деконтаминации амплификационных реакций на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. соЩ. Предложенный подход является действенным инструментом защиты ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа» от загрязнения продуктами амплификации.

- Установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий; выделенные при этом изоляты микроорганизмов идентифицированы как хламидии.

- Подобраны условия проведения ПЦР-индикации и идентификации хламидий методом ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность тестов.

- Подготовленные на основе научно-практической работы методические рекомендации используются в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (20022008 гг.);

- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (2004-2006 гг.);

- Всероссийской научно-практической конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2002 г.);

- научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Киров, 2002 г.);

- Х-ХП, XIV и XV Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2002-2004,2006,2007 гг.);

- IV региональной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2004 г.);

- научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань. 2005 и 2006 гг.);

- научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2006 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 55 работ, в том числе 10 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, 4 методические рекомендации, 3 патента РФ на изобретения, 1 монография и 15 депонированных в глобальных базах данных генбанков NCBI, EMBL и DDBJ публикаций нуклеотидных последовательностей локусов ompl-, omp2-, 16S pPHK-, 23S рРНК-генов и экстрахромосомной плазмиды хламидий штамма «Ростиново-70».

Основные положения, выносимые на защиту.

- Штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» рода Chlamydophila по генетическому (анализ ompl-, omp2-, 16S рРНК- и 23S рРНК- генов хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям охарактеризованы как ранее не изученный генотип («генотип G») и предложены для выделения в новый вид - Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

- Фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий позволяет получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.

- Методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.

- Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) предотвращает возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа».

- Различные патологии у клеточных и домашних плотоядных животных, декоративных птиц, рептилий и амфибий имеют хламидийную природу, подтвержденную результатами комплексных исследований.

- Подобранные условия индикации и идентификации хламидий в исследуемом биоматериале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ обеспечивают высокую чувствительность и специфичность анализа.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 290 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 470 источников, в том числе 416 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 30 рисунками и 8 схемами. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в 1999-2008 годы на кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии, кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»; в лаборатории биохимического и молекулярного анализа биологических средств в объектах ветеринарного надзора и лаборатории контроля и индикации возбудителей вирусных и хламидийных инфекций в объектах ветеринарного надзора Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань) (ныне ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»); в лаборатории молекулярно-генетических исследований ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук» (г. Казань), в лабораториях НПО «СибЭнзим» (г. Новосибирск), в отделе генно-молекулярной диагностики ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» (г. Казань), в ГУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ» (г. Казань), в ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатории РТ» (г. Казань), в зверосовхозе «Вятский» Кировской области РФ, в КУК «Казанский зооботсад».

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы 5 штаммов хламидий: «Ростиново-70, «250», «БЛ-84», «ПП-87» и «КС-93» из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», выделенные соответственно от овцы, коровы, лисицы, песца и собаки.

Все штаммы адаптированы к размножению в куриных эмбрионах (КЭ).

Исследованный материал: лиофильно высушенные штаммы хламидий, клинический и патологический материал (сыворотки крови абортировавших лисиц, органы абортировавших и «неблагополучно» ощенившихся лисиц и собак; абортированные плоды лисиц; щенки лисиц и собак, павшие в первые дни жизни; моча и соскобы с конъюнктивы кошек; мазки со слизистых оболочек глаз, ротовой полости и клоаки у рептилий; мазки со слизистой оболочки клоаки у амфибий; соскобы с клоаки у птиц, рептилий и амфибий; сыворотки крови рептилий, амфибий и птиц), цельная кровь крупного рогатого скота, инфицированные PVY и ЯРТрастения картофеля.

Эпизоотологическое обследование проводили в зверосовхозе «Вятский» Кировской области РФ. При этом были использованы: зоотехническая и ветеринарная учетная документация; собеседование со специалистами и обслуживающим персоналом; собственные клинические наблюдения.

Учитывали условия кормления и содержания животных; результаты щенения самок и сохранность молодняка в первые дни после рождения; благополучие поголовья по инфекционным болезням; возможные источники хламидийной инфекции и пути ее передачи; результаты лабораторных исследований патологического материала и сывороток крови лисиц.

Лабораторную диагностику хламидиоза ставили бактериоскопическим (световая и люминесцентная микроскопия), вирусологическим (заражение развивающихся куриных эмбрионов), серологическими (РСК и ИФА), и молекулярно-генетическими (ПЦР, ПЦР-ПДРФ, секвенирование) методами.

При очистке и концентрировании хламидий использовали схему, включающую: инактивацию возбудителя, разрушение клеточных элементов КЭ для освобождения элементарных телец хламидий, дифференциальное и на градиенте сахарозы центрифугирование суспензии биомассы.

Все операции с исходной и концентрированной биомассами хламидий выполняли в стерильных условиях после инактивации возбудителя. Инактивацию проводили в водяной бане при 60°С в течение 60 минут.

Для выделения ДНК хламидий использовали разработанный нами фенольно-детергентный способ. Также применяли способ щелочного лизиса по Н. Birnboim et al. (1979); способ J. Marmur (1961); способ L. Gafford et al. (1967), модифицированный A.P. Садриевым с соавт. (1999) (рис. 1).

Пробоподготовка исследованного материала (биомасса хламидий, клинический и патологический материал от млекопитающих, птиц, рептилий и амфибий, инфицированные PVY и PVX растения картофеля) также осуществлялась сорбционным способом («ДНК-сорб» и «Рибосорб», ЦНИИЭМ, Россия).

ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота выделяли оптимизированным нами комбинированным щелочным способом.

При совершенствовании способов генодиагностики протестирован разработанный нами способ проведения ПЦР на предмет диагностики хламидиозов животных в сравнении с классическим аналогом.

Классическую ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ dNTPs, 0.5 ед Taq ДНК полимеразы, 0.25 мкМ праймера Chi: 5-ATGTCCAAACTCATCAGACGAG-S' (расчетная Г„=58,4°С), 0,25 мкМ праймера Ch2: S'-CCTTCTTTAAGAGGTTTTACCCA-S' (расчетная Тт=57,9°С), сконструированных J.C. Hartley et al. (2001) для амплификации фрагмента отр2-т\э. хламидий семейства Chlamydiaceae длиной 557-590 bp, 1 мкл исследуемой пробы ДНК в режиме: х 1: 94°С - 4 мин; х40: 94°С - 30 сек, 55°С -30 сек, 72°С -30 сек; xl: 72°С -10 мин (рис. 3-4).

В качестве положительной пробы использовали ДНК хламидий штамма «Ростиново-70» (амплификации фрагмента отр2-геш длиной 587 bp).

Разработанный способ ПЦР проводили на программируемом термоциклере РТС 200 NJ Research (США) и «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ dNTPs, 0.5 ед Taq ДНК полимеразы, 0.25 мкМ праймера Chl-hs с 5^-некомплементарным участком (и) длиной 5 нуклеотидов и 3 -комплементарным участком (N) длиной 22 нуклеотида: 5'-gggggATGTCCAAACTCATCAGACGAG-3' (расчетная nN Тт=68,7°С; N Тт =58,4°С), 0,25 мкМ праймера Ch2-hs с 5'-некомплементарным участком (и) длиной 5 нуклеотидов и З'-комплементарным участком (N) длиной 23 нуклеотида: s'-cccccCCTTCTTTAAGAGGTTTTACCCA-S' (расчетная nN Гт=70,0°С; N Г„=57,9°С), 1 мкл исследуемой пробы ДНК в режиме градиентной ПЦР\ xl: 94°С - 4 мин; *40:94°С - 30 сек, 55-65°С - 30 сек, 72°С -30 сек; xl: 72°С - 10 мин (рис. 2) и оптимизированном режиме амплификации: *1: 94°С - 4 мин; ><40: 94°С - 30 сек, 60°С - 30 сек, 72°С -30 сек; xl: 72°С - 10 мин (рис. 3-4).

В качестве положительной пробы использовали ДНК хламидий штамма «Ростиново-70» (амплификации специфичного фрагмента ДНК длиной 597 bp).

Для сопоставления внутренней структуры амплифицируемых с праймерами Chl+Ch2 и Chl-hs+Ch2-hs фрагментов отр2-гена хламидий штамма «Ростиново-70» проводили процедуру полного и неполного эндонуклеазного расщепления ферментом Alul (рис. 3) с учетом анализа картирования сайтов ее рестрикции (схема 1. NEBcutter v.2.0).

ПЦР-продукты, амплифицированные с вышеперечисленными праймерами для молекулярно-генетического анализа хламидий обрабатывались 1 ед Alul при 37°С в течение ночи (или в течении 1 часа при процедуре неполного эндонуклеазного расщепления) (10 мкл ПЦР-продукта, 7,0 мкл <ffl20, 2,0 мкл lOxSE-буфера Y, 1 ед/мкл Alul).

При разработке способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы протестировано исполнение в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP.

При обосновании эффективности предложенного способа проводили дальнейшую процедуру реамплификацию урацил-содержащих ампликонов с урацил-ДНК-гликозилазой и без нее (рис. 5). В качестве диагностической модели использованы РНК-содержащие вирусы картофеля PVY и PVX.

В мультиплексной ОТ-ПЦР для амплификации и реамплификации участков генома Potato virus Y и Potato virus X использовали PVY специфичные [PPVYCP6P: 5'-CGTCCAAAATGAGAATGCC-3' и PPVYCP6M: 5'-TCTTGTGT ACTGATGCCAC-З'] (С. Varveri, 2000) и PVX специфичные [PPVXvl: 5'-GACA CTATGGCACAGGCTGCTTGG-S' и PPVXv2: S'-TTGGGCAGCATTCATTTCAG СТТС-З'] (A.M. Soliman, 2000) праймеры, соответственно (рис. 5).

Разработанный нами способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации протестирован на предмет индикации хламидий по 23SрРНК с праймерами U23F: S'-GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGG А-3 и 23SIGR: 5'-TGGCTCATCATGCAAAAGGCA-3' в альтернативной стратегии амплификации (K.D. Everett et al., 1999b) (рис. 6).

ПЦР-индикацию хламидий в пробах материала, взятого от млекопитающих и птиц, осуществляли с использованием специфичных для вида Chlamydia psittaci (согласно нынешней классификации, для видов Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis и Chlamydophila caviae) олигонуклеотидных праймеров CPF: 5'-GCAAGACACTC CTCAAAGCC-3' и CPR: S'-CCTTCCCACATAGTGCCATC-S' (R. G. Hewinson et al., 1997). Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов (bp), который включает в себя 5'-не транслируемый регион и часть гена Chlamydia psittaci, кодирующего синтез основного белка наружной мембраны возбудителя (рис. 7-9).

Амплификацию участка генома хламидий длиной 264 bp проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) в объеме 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ КС1, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ dNTPs, 1 ед Taq ДНК полимеразы, по 0.2 мкМ праймера CPF и CPR и 2 мкл исследуемой пробы ДНК.

ПЦР с пробами материала, взятого от рептилий и амфибий, проводили с использованием тест-системы «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом полимеразной цепной реакции («Амплисенс», Россия). Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации специфичного для микроорганизмов семейства Chlamydiaceae фрагмента ДНК длиной 300 пар нуклеотидов (рис. 10).

При молекулярно-генетическом анализе хламидий для амплификации фрагмента ompZ-гена хламидий использовали праймеры 5GPF: 5-ACGCATGCAAGACACTCCTCAAAGCC-S' и 3GPB: S'-ACGAATTCCTAGGTT CTGATAGCGGGAC-3' (В. Kaltenboeck et al., 1991, 1993); отр2-твна - Chi: 5-ATGTCCAAACTCATCAGACGAG-S' и Ch2: S'-CCTTCTTTAAGAGGTTTTACC CA-3' (J.C. Hartley et al., 2001); 16S pPHK- 16SIGF: S'-CGGCGTGGATGAGGC АТ-З' и 16SIGR: S'-TCAGTCCCAGTGTTGGC-S' (K.D. Everett et al., 1999b); 23S pPHK - U23F: S'-GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA-S' и 23SIGR: S'-TGGCTCATCATGCAAAAGGCA-S7 (K.D. Everett et al., 1999b); экстрахромосомной плазмиды - ML-PLF01: 5/-CAGAACGGTGTGTAGATT-3/ и ML-PLR01: 5'-AGGAGATAAGGTTGCTAA-3' (M. Van Loock et al., 2003).

Амплификацию участков генома хламидий проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

Хламидийные ompl-, omp2-, 16S pPHK-, 23S pPHK-фрагменты и ДНК экстрахромосомной плазмиды были амплифицированы в объемах по 20 ц1. Реакционные смеси содержали по 1 мкл исследуемого препарата ДНК, 0,2 мМ dNTPs, по 0,5 мкМ каждого из соответствующих праймеров, 2 мкл 10*буфера

для Taq ДНК полимеразы и 1 ед Taq ДНК полимеразы. Режимы амплификации: Omph 1х94°С - 4 мин; 40*94°С - 1 мин, 59°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 1*72°С - 7 мин. Отр2: 1х94°С - 4 мин; 40><94оС - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 1 мин; 1Х72°С - 7 мин. 16SрРНК: 1х94°С - 4 мин; 40х94°С - 30 сек, 51°С - 30 сек, 72°С - 30 сек; 1х72°С - 7 мин. 23S рРНК: 1*94°С - 4 мин; 40х94°С - 30 сек, 61°С - 30 сек, 72°С - 30 сек; 1х72°С — 7 мин. Экстрахромосомная плазмида: 1 х94°С - 4 мин; 40х94°С - 30 сек, 52°С - 30 сек, 72°С - 30 сек; 1 х72°С - 7 мин.

ПЦР-продукты, амплифицированные с вышеперечисленными праймерами для молекулярно-генетического анализа хламидий обрабатывались 1 ед A lid при 37°С в течение ночи (10 мкл ПЦР-продукта, 7,0 мкл dH20, 2,0 мкл lOxSE-буфера Y, 1 ед/мклЛМ).

ПЦР-продукты, амплифицированные с праймерами 5GPF и 3GPB обрабатывались 10 ед НаеШ при 37°С в течение ночи (10 мкл ПЦР-продукта, 7,0 мкл dH20,2,0 мкл lOxSE-буфера G, 10 ед/мкл НаеПГ).

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0 (http://tools.neb.com/).

Детекция результатов ПЦР-ПДРФ проведена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0) содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (^=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Секвенирование продуктов амплификации ompl-гена. с праймерами 5GPF и 3GPB штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87», «КС-93», а также оотр2-гена с праймерами Chi и Ch2, löSpPHKс праймерами 16SIGF и 16SIGR, 23S рРНК с праймерами U23F и 23SIGR штамма хламидий «Ростиново-70» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим».

GenBank A/N штамма «Ростиново-70»: DQ177459 - локус ompl-гена; DQ177460 - локус отр2-гет; DQ663788 - локус 16SрРНК; DQ663789 - локус 23SрРНК; DQ663790 - локус экстрахромосомной плазмиды хламидий.

Штамм Ростиново-70 был выравнен по длине 881 нуклеотидов (н.) локуса ompl-гена (DQ177459, 1-881 н.); по длине 587 н. локуса отр2-гена (DQ177460, 1-587 н.); по длине 294 н. локуса 16S рРНК-гена (DQ663788, 1-294 н.); и по длине 604 н. локуса 23S рРНК-гена (DQ663789, 1-604 н.) с соответствующими опубликованными в GenBank NCBI нуклеотидными последовательностями штаммов микроорганизмов семейства Chlamydiacae, используя программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) и CLUSTAL W (v. 1.83) Multiple Sequence Alignments (http://align.genome.jp/). При построении филограмм представителей семейства Chlamydiaceae использовали алгоритм NJ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Совершенствование способов генодиагностики 3.1.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий

Всем молекулярно-генетическим методам диагностики предшествует этап выделения нуклеиновых кислот исследуемого биоматериала. Чистота и концентрация полученных препаратов нуклеиновых кислот обуславливают успех дальнейших исследований.

В данной работе выделение нуклеиновых кислот хламидий проводили по разработанному нами фенольно-детергентному способу. Принцип его заключается в том, что разделения реакционной смеси на две фазы (фенол-вода) не происходит за счет наличия фенолята натрия (1,2%) в лизирующем растворе, образующегося в результате взаимодействия фенола с едким натром. Благодаря образующейся однофазной системе достигается повышенная депротеинизирующая активность применяемой смеси с заменой резкого встряхивания препарата осторожным медленным перемешиванием, что, в конечном счете, сводит к минимуму гидродинамические воздействия на освобождающиеся нуклеиновые кислоты.

Спектрофотометрические показатели полученных препаратов нуклеиновых кислот хламидий варьировали в пределах 1,8-2,0; что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков и фенола. Практический выход ДНК хламидий составил 18,7-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов, что соответствует 55-60%. Это свидетельствует о пригодности препаратов нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований.

Кроме указанного способа, для выделения ДНК хламидий были испытаны способы: щелочного лизиса по Н. В^пЬот е! а!. (1979); 1 Магтиг (1961); Ь. Оайогс! й а1. (1967), модифицированный А.Р. Садриевым с соавт. (1999).

Результаты этих исследований представлены на рис. 1.

12 3 4

Рис. 1. ДНК хламидий, выделенные различными способами Обозначения:

1) способ щелочного лизиса Н. ВипЬоип е! а1. (1979);

2) способ Д. Магтаг (1961);

3) способ Ь. вайда! е1 а1. (1967), модифицированный А.Р. Садриевым с соавт. (1999);

4) предложенный нами фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий.

При выделении ДНК способам щелочного лизиса по Н. Birnboim et al (1979), несмотря на многочисленные попытки, получить нативные экстракты нуклеиновой кислоты не удалось. ДНК при этом разрушалась, о чем свидетельствовал шлейф по треку электрофоретической разгонки препаратов ДНК (рис. 1, трек 1).

Применение способа J. Marmur (1961) вызвало частичное разрушение ДНК (рис. 1, трек 2). Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК колебались в пределах 1,4-1,6, что говорит о наличии в препаратах нуклеиновой кислоты примесей белков, поэтому точное измерение количества ДНК в данном случае было невозможно.

При использовании способа L. Gafford et al. (1967) в модификации А.Р. Садриева (1999), структура ДНК не нарушалась, о чем свидетельствовало расположение фракции нуклеиновой кислоты в начале трека (рис. 1., трек 3). Спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК колебались в пределах 1,8-2,0, что говорит о высокой степени чистоты препаратов ДНК от примесей белков. Практический выход ДНК хламидий составил 17,0-18,7 мкг/мг сухой массы микроорганизмов, что соответствует 50-55%. Однако отрицательным свойством данного способа экстракции нуклеиновых кислот является его длительность из-за того, что при использовании этого подхода необходимо проводить инкубацию реакционной смеси в течение 16-18 часов. Кроме того, указанный способ предполагает 4-х кратную экстракцию хлороформом, что в значительной степени усложняет процесс выделения ДНК.

Таким образом, нами разработан фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий, преимущества которого заключаются в том, что он прост в эксплуатации, экономичен во времени и средствах, дает приемлемые результаты в отношении нативности (рис. 1., трек 4), чистоты и концентрации препаратов ДНК хламидий. Разработанный фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий является изобретением, на которое получено решение РОСПАТЕНТ о выдаче патента РФ (№ 2230120).

3.1.2. Разработка способа проведения ПЦР

Задачей данного раздела исследования являлась разработка эффективной методики высокоточной ПЦР для индикации и идентификации биологических объектов.

Нами разработан способ проведения ПЦР, схожий с разновидностями «touch-up» ПЦР (М. Ailenberg et al., 2000; F. Weighardt et al., 1993) тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотиды, которые состоят из 3'-участка, комплементарного последовательности-мишени, и 5'-участка, не комплементарного последовательности-мишени, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют олигонуклеотиды с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их з'-комплементарного участка на 5-10°С, а при проведении ПЦР отжиг ведут при температуре, соответствующей указанной потенциальной температуре гибридизации.

Стратегия выбранного подхода заключается в том, что, используя фиксированную температуру потенциального оптимума отжига праймеров по всей длине, связывание З'-комплементарного участка олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой исследуемого биологического объекта затруднительно в виду несоответствия температур гибридизации на 5-10°С, однако неспецифичное праймирование находится в значительно более угнетенном состоянии, чем достигается более эффективная наработка только специфичных ампликонов, которые в дальнейшем являются мишенями для праймеров в системе 100% комплементарное™.

Разработанная нами методика высокоточной ПЦР апробирована на предмет диагностики хламидиозов животных в сравнении с классическим аналогом.

При апробации разработанной нами методики высокоточной ПЦР на предмет диагностики хламидиозов животных установлено, что протестированные модифицированные праймеры СЫ-Ьб и СЬ2-)15, инициирующие амплификацию фрагмента отр2-гена хламидий, в градиентной ПЦР с температурой отжига от 55°С до 65°С показали положительные сигналы амплификации в заданном широком спектре гибридизаций (рис. 2).

М 1

1500 Ьр — • «

1000 Ьр— ВД- 500 Ьр — 400 Ьр- ''МШШШмЖ

300 Ьр—

200 Ьр-

100 Ьр—

........ '<>'*:. ■ ' ' ■ .

..о'............. ' г^-у:; ':''"

щт *** **** яр ' ,

1-597 Ьр

Рис. 2. Электрофореграмма результата тестирования праймеров СЫ-Ьв и в градиентной ПЦР с температурой отжига 55°С - 65°С

Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 Ьр (СибЭнзим); 1-9) положительный контроль: ДНК штамма «Ростиново-70»: 1) Та=. 55,0°С; 2) Го=55,9°С; 3) 7о=57,8°С; 4) 7о=61,0°С; 5) 7а=62,4°С; 6) Та=63,5°С; 7) Та=64,3°С; 8) 7а=64,8°С; 9) Та= 65,0°С.

При сопоставлении внутренней структуры амплифицируемых с праймерами СЫ-Ьз+СЬ2-Н5 и СЬ1+СЬ2 фрагментов отр2-гена хламидий штамма «Ростиново-70», на основании результатов полного и неполного эндонуклеазного расщепления ферментом Л 1и! (рис. 3) с учетом анализа картирования сайтов ее рестрикции (схема 1) определена идентичность наработанных ПЦР-продуктов, что характеризуется тождественной инициацией амплификации выбранной мишени.

Рис. 3. Электрофореграмма тестирования праймеров Chl-hs+Ch2-hs и Chl+Ch2

на предмет сопоставления результата амплификации локуса отр2-гена хламидий, полного и неполного расщепления эндонуклеазой рестрикции Alul Обозначения: М) ДНК-маркеры 1500-100 bp; 1) цельный ПЦР-фрагмент локуса отр2-гена хламидий штамма «Ростиново-70», инициированный праймерами ChI-hs+Ch2-hs (597 bp); 2) отр-2-ПЦР-ПДРФ-/1/и7-профш1ь штамма «Ростиново-70» (192, 165, 145, 95 bp, полное расщепление / Chl-hs+Ch2-hs); 3) от/э-2-ПЦР-ПДРФ-.4&/-профиль штамма «Ростиново-70» (357, 287, 240, 192, 165, 145, 95 bp, неполное расщепление / Chi-hs+Ch2-hs); 4) omp-2-ПЦР-ПДРОМЫ-профиль штамма «Ростиново-70» (352, 287, 235, 192, 160, 140, 95 bp, неполное расщепление / Chl+Ch2); 5) отр-2-ПЦР-ПДРФ~А/и/-профиль штамма «Ростиново-70» (192, 160, 140, 95 bp, полное расщепление / СЫ+СЬ2); 6) цельный ПЦР-фрагмент локуса отр2-гена хламидий штамма «Ростиново-70», инициированный праймерами Chl+Ch2 (587 bp).

200 bp

100 bp

—597/587 bp

bp

287 bp 240/235 bp 192 bp 165/160 bp 145/140 bp

95 bp

300 bp

I ООО 900 700 600 500

400 bp

287 bp

357 bp 240 bp

165 bp 192 bp 95 bp 145 bp

Chi AS lit Mi3 -Aiijt Ch2 |

160 bp 192 bp 95 bp 140 bp

352 bp 235 bp

287 bp

Схема 1. Картограмма отр2-ПЦР-ПДРФ-А/и/-профилей

При исследовании препаратов ДНК, экстрагированных из осадков мочи от 3-х кошек, серонегативных по хламидийной инфекции, нами получен яркий неспецифичный сигнал проб № 1 и № 3 при проведении ПЦР с праймерами Chi и Ch2 (J.C. Hartley et al., 2001) в классической постановке: (рис. 4, трек 1, 3).

При проведении ПЦР с модифицированными праймерами Chl-hs и Ch2-hs в постановке разработанного способа, удалось ликвидировать ход неспецифичной амплификации (рис. 4, трек 5-7).

597 587

bp

lOOObp-, 800 Ьрн 600 bp-j 500 bp-400 bp -300 bp-200 bp->

100 bp-

Рис. 4. Элестрофореграмма результата тестирования способов ПЦР па предмет индикации хламидий

Обозначения:

М) ДНК-маркеры 1000-100 bp (СибЭнзим);

1-4) ПЦР в классической постановке с праймерами Chi и Ch2:

1) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 1;

2) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 2;

3) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 3;

4) ДНК Chlamydophila spp. «Ростиново-70» (положительный контроль).

5-8) ПЦР в постановке предлагаемого способа с праймерами Chl-hs и Ch2-hs:

5) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 1;

6) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 2;

7) препарат ДНК, экстрагированный из осадка мочи от кошки № 3;

8) ДНК Chlamydophila spp. Ростиново-70 (положительный контроль);

9) dH20 (отрицательный контроль).

При тестировании способов ПЦР на предмет индикации хламидий с праймерами Chi и Ch2 в классической постановке (Та=55°С), а также праймерами Chl-hs и Ch2-hs в предлагаемом варианте (Га=60°С), в определенной степени, нами получены прогнозируемые результаты (рис. 4).

Действительно, авторами протокола детекции хламидий с праймерами Chi и Ch2 (J.С. Hartley et al., 2001) доказана возможность неспецифичной амплификации нехламидийной ДНК в исследуемых пробах, которую можно избежать при использовании Taq Gold ДНК полимеразы, нежели стандартной Taq ДНК полимеразы.

Таким образом, применение предлагаемого способа проведения ПЦР на предмет индикации хламидий с праймерами Chl-hs и Ch2-hs позволило устранить неспецифичную амплификацию в исследуемых пробах при использовании в реакции амплификации фермента Taq ДНК полимеразы (рис.

2-4).

По результатам практических исследований, направленных на теоретическое обоснование эффективности предлагаемого способа проведения ПЦР нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в демонстрации более эффективной наработки специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.

Разработанный способ проведения ПЦР является изобретением, на которое получено решение РОСПАТЕНТ о выдаче патента РФ (№ 2299240)..

Данная методика высокоточной ПЦР также апробирована на предмет оценки аллельного полиморфизма гена каппа-казеина крупного рогатого скота в сравнении с классической ПЦР и ближайшим аналогом, результаты исследования которых представлены в материалах патента.

3.1.3. Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликознлазы

Контаминация - попадание из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты (S. Kwok et al., 1989; М.С. Longo et al., 1990).

Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки (S. Kwok et al., 1989; М.С. Longo et al., 1990).

Задачей данного раздела исследования являлась разработка эффективного способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе урацил-ДНК-гликознлазного метода защиты - действенного инструмента ферментативной деконтаминации, значительно снижающего риск ложноположительных и ложноотрицательных реакций.

Оптимизированные методики с использованием AMV обратной транскриптазы, Tth ДНК полимеразы и С. therm. ДНК полимеразы нашли достойное применение в решении данной проблемы, благодаря соответствующим температурным оптимумам данных ферментов, позволяющим использовать урацил ДНК гликозилазный метод защиты от контаминации в варианте «1 пробирка, 1 этап». Использование же M-MuLV обратной транскриптазы совместно с урацил ДНК гликозилазой в варианте «1 пробирка, 1 этап» невозможна по причине одинаковой рабочей температуры.

Нами разработан способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP.

Принцип способа заключается в том, что на 1 этапе M-MuLV обратная транскриптаза катализирует матричный синтез ДНК на матрице РНК с исключением использования урацил-содержащих ампликонов в качестве матрицы из-за их гидролиза урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) при температуре 37°С. В качестве строительных блоков используются 4 стандартных дезоксинуклеозидгрифосфатов. На 2 этапе, добавляется в реакционную смесь Taq ДНК полимераза и смесь из дезоксинуклеозидгрифосфатов с заменой dTTP на dUTP в пропорциональной

концентрации с общим содержанием во время проведения ПЦР 5 дезоксинуклеозидтрифосфатов, что обеспечивает выход урацил-содержащей ДНК (схема 2).

Схема 2. Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ

матрица РНК_

|A|U|0|C|C|OIUIU|C|C|01<IO|C|C|U|A|A|0|C|A|U|C|C|0|0 T~Ä~1

си

праймер

А I О I О I С I

ДОБАВЛЯЕТСЯ В РЕАКЦИОННУЮ СМЕСЬ: M-MuLV обратная транскриптаза

37°С

Смесь из дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) Урацид-ДНК-гткозилаза (из К cotí)

dATP

JTIP

dGTP

dCTP

общее содержание трифосфатов

Отжиг и синтез комплементарной ДНК на матрице РНК

IClOtAlOlClClUl AlAlOl ClAlUl'

fea с т-J-c I u I т I а I ■

О I о I А~1

ш

134 с 1 а? I га, t-.ш.

ПОЛИМЕРА311АЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

ДОБАВЛЯЕТСЯ В РЕАКЦИОННУЮ СМЕСЬ: Тац ДНК полимераза

Смесь из дезоксинуклеозидтрифосфатов с заменой

(ИГР на ¿ИГР в пропоргщоналъной концентрации ((НАТР, йШР, (ЮТР, дСТР)

МW

dTTP

&ГГР

dCTP

dtn?

общее содержание трифосфатов

Денатурация РНК'ДНК комплекса при 94 С

|A|U|0|C|C|Q|U|U|C|C|Q 1 А I О I С I С I U I А | А | О I С | А | U I С I С~

Г5~гл

£-уг: t-vа": I с ГЪТЛ'Л с f а:1 'а ГЦ ГИРЯ с. t¿g..l с W'a ГТ'Г? 1 с I .ТГГ прай

ш:

I о I с Kl

праймер_

I о tele НИ

\ } 1С га. У ú"i С!Л|А rsf Ol КОМПЛ&

i i Iii T3 ч Alt; T -1 С I О 1 T I A i Г, I « I С I

янтарная ДНК, синтезированная с матрицы РНК

Отжиг и синтез урацил-содержащих ампликонов (вероятность включения <ШТР в растушую цепь ДНК составляет приблизительно 50%)

.А Г ,..*..тчп с | с'ГГГЧТ^! с Г с I ¿1" ГаТ"а| ['"О [ Г"..Т"1-с I с

ypaifwi-codepoicautuii ампликон

.......в случае

контаминации ОТ-ПЦР урацил-содержащим ампликоном

а I t I и l e I с i о t-4.1 J :f I с I с fcjfr^t A-i--Q:i с I с у. ц^аша^: с t \ ¡т..) с | с t-.el

I О I Т I А I CT I О I С I праймер

M-KíuLV обратная транскриптаза

['¿ATP

37°С ¿TTP

Урацил-ДНК-гликозилаза ^ОТ?

dCTP

общее содержание трифосфатов

Высвобождение свободного урацила из урацил-содержащей ДНК

_и лишение ковтаминанта роли мишени

AI Г| «| с| cl 0| \ Tl cl сШ'лт-clcl t 1 о ix! Fl 5 ( о Fe 1

Для теоретического обоснования разработанного способа нами были проведены практические исследования, направленные на доказательство эффективности выбранного подхода, для чего проводили мультиплексную ОТ-ПЦР для одновременного выявления возбудителей вирусных болезней картофеля в варианте «1 пробирка, 2 этапа» с использованием в качестве ПКО (положительный контрольный образец) положительную на PVY (Potato virus Y)+PVX (Potato virus X) амплифицированную ОТ-ПЦР-пробу в разведении 1:10б в смеси с ОКО (отрицательный контрольный образец).

1 2 3 4 5

Рис. 5. Электрофореграмма результата разрушающего действия урацил-ДНК- гликозилазы (из Е. coli) на урацил-содержащую ДНК Обозначения:

1-2) Реашшификация урацил-содержащих ампликонов [ПКО (PVY+PVX)] с урацил-ДНК-гликозилазой (технический результат - предотвращение возможности реамплификации урацил-содержащих ампликонов).

3) ДНК маркеры.

4) Реамплификация урацил-содержащих ампликонов [ПКО (PVY+PVX)]

без урацил-ДНК-гликозилазы (технический результат - успешная реамплификация урацил-содержащих ампликонов).

5) ОКО [сорт картофеля «Адретта»].

По результатам практических исследований нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в демонстрации предотвращения возможности реамплификации урацил-содержащих ампликонов в виду того, что урацил-содержащая ДНК (контаминант) теряет роль мишени из-за выщепления из нее свободного урацила ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (из £. coli) в процессе реакции.

Представленный способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации также апробирован в системе проведения ОТ-ПЦР при индикации хламидий по 23S рРНК с праймерами U23F и 23SIGR (рис. 6) в альтернативной стратегии амплификации (K.D. Everett et aL, 1999b).

Рис. 6. Элсктрофореграмма результата ОТ-ПЦР для индикации хламидий по 235рРНК с праймерами ШЗР и 238ЮК Обозначения: М) ДНК-маркеры 1000-100 Ьр (СибЭнзим);

1) СЫату^орИНаэ рр. «Ростиново-70»;

2) СЫатуЖ>рЫ1а врр. «250»;

3) СЫатус1орИИа врр. «ПП-87»;

4) СМатуёорЫ1а врр. «КС-93»;

5) Н20.

Разработанный способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы является изобретением, на которое получено решение РОСПАТЕНТ о выдаче патента РФ (№ 2307167).

3.2. Результаты исследования плотоядных животных на хламидиоз 3.2.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей

Изучение эпизоотического состояния неблагополучного зверохозяйства проводилось за 3 года (1999-2001 гг.).

По данным документов и информации главного ветеринарного врача зверосовхоза известно, что в хозяйстве у лисиц регистрировались: заболевания мочеполовой сферы у самцов и самок; аборты, мертворождения и рождения слабого нежизнеспособного молодняка, а также конъюнктивиты и атипичное течение заболеваний органов дыхания и пищеварения; поражения суставов невьисненной этиологии; высокий процент дорегистрационной и после регистрационной гибели щенков лисиц, что является характерным и для хламидийной инфекции. Областная ветеринарная лаборатория исключает бактериальные и вирусные инфекции (бруцеллез, лептоспироз, листериоз, сальмонеллез, стрептококкоз, вирусный гепатит плотоядных и т.п.). Токсикологические исследования кормов в областной лаборатории дали отрицательные результаты.

В 1999 году процент абортировавших и бесплодных лисиц в зверохозяйстве составил соответственно 3 и 6. В 2000 г. наблюдался рост в стаде доли абортировавших (до 6%) и бесплодных (до 11%) самок. С этого же

года произошло увеличение процента мертворожденных и павших до регистрации щенков до 8 и 15, соответственно. В 2001 году произошло снижение анализируемых показателей, что вероятно связано с тем, что с декабря 2000 года по нашим рекомендациям с целью профилактики хламидиозов в рацион зверям стали добавлять кормовые антибиотики тетрациклинового ряда («Биовит-80 и 120»), перед гоном двукратно с интервалом 1 месяц в дозах, согласно инструкциям по применению указанных препаратов.

В апреле 2000 года из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ к нам поступил патологический материал: органы абортировавших и «неблагополучно» ощенившихся лисиц, абортированные плоды и щенки, павшие до регистрации, а также сыворотки крови абортировавших лисиц из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ. Для подтверждения предположений о хламидийной природе вышеописанных патологических явлений у лисиц были проведены лабораторные (бактериологические, серологические и молекулярно-генетические) исследования.

Хламидии были выделены в первом же пассаже из патологического материала, полученного из неблагополучного хозяйства, на развивающихся куриных эмбрионах. Специфическая гибель КЭ в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения. При вскрытии павших эмбрионов отмечали множественные точечные кровоизлияния в области головы и конечностей, а также гиперемию и отек желточного мешка и хорионаллантоисной оболочки. В мазках-отпечатках, приготовленных из оболочек желточных мешков погибших куриных эмбрионов, обнаруживали характерные фиолетово-красные элементарные тельца хламидий на зеленовато-синем фоне препарата. Окрашивание проводили по модифицированному методу Стемпа.

При испытании 12 проб сывороток крови, полученных от абортировавших лисиц из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ, в РСК положительно реагировали (титр хламидийных антител 1:10 и выше) 4 пробы, сомнительно (титр хламидийных антител 1:5)- 4 пробы.

Эти же сыворотки параллельно были исследованы в ИФА на предмет выявления специфических антител. 4 пробы сыворотки, положительно реагирующие в РСК, имели титр хламидийных антител в ИФА 1:200 - 1:1600; 4 пробы сыворотки, сомнительно реагирующие в РСК, имели титр хламидийных антител в ИФА 1:100-1:400. Из 4 проб сывороток, не реагирующих в РСК, в 3 случаях в ИФА были выявлены специфические хламидийные антитела в титрах 1:100-1:400. Одна проба сыворотки не реагировала ни в РСК, ни в ИФА.

Таким образом, на основании выделения возбудителя и положительных результатов серологических исследований сывороток крови абортировавших лисиц, в зверосовхозе «Вятский» Кировской области РФ ними установлен хламидиоз лисиц.

Для подтверждения вышеописанных данных нами были проведены молекулярно-генетические исследования патологического материала. Эти исследования описаны ниже.

В результате ПЦР диагностики доказана этиологическая роль хламидийной инфекции у лисиц зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ, приводившая к абортам, мертворождениям и рождениям слабого нежизнеспособного молодняка.

3.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфичными праймерами для индикации хламидий

ПЦР проводили с использованием специфичных исключительно для вида Chlamydia psittaci (согласно новой классификации хламидий, предложенной K.D. Everett et al. (1999b), - для видов Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila felis и Chlamydophila caviae), олигонуклеотидных праймеров, сконструированых R. Glyn Hewinson et al. (1997).

Разработанный ПЦР-тест основан на амплификации фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов, который включает в себя 5у-не транслируемый регион и часть гена Chlamydia psittaci, кодирующего синтез основного белка наружной мембраны возбудителя.

Результатом ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR проб ДНК штаммов хламидий «КС-93», «ПП-87», «250», «Ростиново-70», «БЛ-84» явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 bp (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR для индикации хламидий Обозначения: М) ДНК маркеры; 1) ДНК хламидий штамма «КС-93»; 2) ДНК хламидий штамма «ПП-87»; 3) ДНК хламидий штамма «250»; 4) ДНК хламидий штамма «Ростиново-70»; 5) ДНК хламидий штамма «БЛ-84»; 6) ДНК неинфицированных хламидиями ЖОКЭ; 7) ДНК Chlamydia trachomatis штамма «L2»; 8) ДНК Brucella abortus штамма «82»; 9) ДНК Salmonella typhimurium штамма «371»; 10) ДНК Listeria monocytogenes штамма «АУФ».

Данный фрагмент отсутствовал при проведении ПЦР с ДНК, выделенной от других микроорганизмов (хламидий вида Chlamydia trachomatis, бруцелл, сальмонелл и листерий), а также ДНК ЖОКЭ, неинфицированных хламидиями.

Полученные результаты дают основания считать, что ПЦР со специфичными праймерами СРБ и СРП является эффективным средством индикации ряда возбудителей хламидийных инфекций животных.

Следующим этапом наших исследований было определение чувствительности ПЦР-теста с праймерами СРР и СРК

Исходя из расчета, что 10 fg хламидийной ДНК эквивалентно одной геномной копии (К Иуп НетлчпБоп а1., 1997), нами были приготовлены серийные разведения ДНК хламидий штамма «250» (240 fg, 120 fg, 60 fg и 30 fg в пробе, что эквивалентно 24, 12, 6 и 3 геномным копиям хламидий, соответственно). Результаты этих исследований представлены на рис. 8.

Рис. 8. Определение чувствительности ПЦР со специфичными праймерами CPF и CPR для индикации хламидий

Обозначения:

М) ДНК маркеры;

1-4) Серийные разведения ДНК хламидий штамма «250»:

1) 240 fg в пробе; 2) 120 fg в пробе; 3) 60 fg в пробе; 4) 30 fg в пробе.

Анализируя электрофореграмму полученных ампликонов, можно констатировать, что чувствительность ПЦР с очищенной ДНК хламидий составляет > 60 fg ДНК или 6 геномных копий хламидий в пробе.

3.2.2.1. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами

Следующим этапом наших исследований явилось выявление возбудителей хламидиоза в патологическом материале, используя технику ПЦР.

С этой целью нами методом ПЦР со специфичными праймерами CPF+CPR на предмет выявления хламидий был исследован патологический материал;

- поступивший из зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ;

- полученный от собак и кошек, подозрительных по заболеванию хламидиозом.

Результаты этих опытов представлены не рис. 9.

Рис. 9. ПЦР-индикация хламидий в патологическом материале (праймеры CPF и CPR) Обозначения: М) ДНК маркеры; 1) ДНК хламидий штамма «БЛ-84» (положительный контроль); 2) матка абортировавшей собаки; 3) матка «неблагополучно» ощенившейся лисицы; 4) соскоб с конъюнктивы кошки; 5) органы щенка собаки, павшего на 3-й день после рождения; 6) отрицательный контроль.

Из рис. 9 видно, что исследованные в ПНР пробы патологического материала образовали специфичные для хламидий амшшконы длиной 264 Ьр.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность ПЦР-индикации возбудителей хламидиоза в патологическом материале с применением искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров CPF и CPR.

3.3. Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий и декоративных птиц на хламидиоз

В результате проведенных исследований методом РИФ специфическое свечение хламидийного антигена обнаружили у 7 (35%) из 20 исследованных рептилий. Хламидии были обнаружены: у среднеземноморской черепахи (самец, 15 лет, клинически здоров); среднеазиатской черепахи (самка, 7 лет, периодическая диарея и конъюнктивит); еще одной среднеазиатской черепахи (самка, 5 лет, диарея и конъюнктивит); европейской болотной черепахи (самец, 10 лет, влажный некроз хвоста); красноухой черепахи (самка, 7 лет, конъюнктивит и влажный некроз пальцев); еще одной красноухой черепахи (самка, 10 лет, клинически здорова); синеязычного сцинка (самец, 4 года, клинически здоров).

При исследовании в РИФ земноводных, обитающих в некоторых естественных водоемах РТ, специфическое свечение хламидийного антигена было обнаружено в клиническом материале, полученном от 54 лягушек, в т.ч. от особей, отловленных в прудах п. Столбищи и с. Тат. Саралы, а также озере на территории Раифского монастыря. У лягушек, отловленных в озере недалеко от химкомбината ЗАО «Оргсинтез», хламидийный антиген не был выявлен.

Световой микроскопией мазков-отпечатков морфологические структуры хламидий были обнаружены только в 18 случаях; все они были получены от животных, которые входили в число тех 61 рептилий и амфибий, у которых в РИФ был обнаружен антиген хламидий. Полученные данные подтверждают мнение исследователей о низком проценте выявления хламидий при световой микроскопии.

При скрининговых исследованиях сывороток крови рептилий, амфибий и декоративных птиц в РСК комплементсвязывающие антитела были обнаружены соответственно в 15, 8 и 18% исследованных проб.

При исследовании в ПЦР 20 проб клинического материала, полученного от животных позитивных по хламидиозу в РИФ, ДНК хламидий были обнаружены в 12 случаях. Результатом ПЦР (тест-система «ХЛА-КОМ») клинического материала, полученного от рептилий и амфибий явилась амплификация фрагмента ДНК хламидий длиной 300 пар нуклеотидов (рис. 10).

1 2 ^ 4 ?!

Рис. 10. Электрофореграмма результатов ПЦР с клиническим материалом, полученным от хладнокровных животных (тест-система «ХЛА-КОМ») Обозначения:

1) отрицательный контрольный образец;

2) положительная контрольная ДНК (ДНК Chi. psittaci);

3) исследуемая проба от черепахи (положительный результат);

4) исследуемая проба от черепахи (отрицательный результат);

5) исследуемая проба от лягушки (положительный результат).

Проведенными исследованиями продемонстрирована возможность ПЦР-индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от рептилий и амфибий с использованием тест-системы «ХЛА-КОМ».

Лабораторными методами нами были выявлены несколько случаев хламидиоза у декоративных птиц.

В первом случае поступил волнистый попугай, у него воспалились глаза, сначала один, затем другой. У попугая были взяты мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза и кровь для получения сыворотки. Во втором случае обратился владелец канарейки. За три месяца до визита к нам у нее появился конъюнктивит. Характерным было то, что конъюнктивит был односторонний и очень вяло развивался. У канарейки также были взяты мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза и кровь для получения сыворотки. Люминесцентным

методом у обеих птиц в клиническом материале было выявлено специфическое свечение хламидийного антигена, в сыворотке крови попугая и канарейки были обнаружены специфические противохламидийные антитела в диагностических титрах.

В следующем случае поступил декоративный голубь. У него регистрировалось заболевание, которое характеризовалось поражением верхних дыхательных путей и конъюнктивитом. У голубя был взят мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза. Люминесцентным методом в клиническом материале было выявлено специфическое свечение хламидийного антигена.

В феврале 2006 г. к нам поступил домашний индюк. За неделю до этого у него появились признаки поражения органов дыхания. При клиническом осмотре было установлено, что индюк сильно истощен, у него регистрировались: односторонние катаральные синусит и ринит, а также односторонний же гнойный конъюнктивит. У индюка был взят мазок-отпечаток с конъюнктивы глаза. Люминесцентным методом в клиническом материале было выявлено специфическое свечение хламидийного антигена.

Клинический материал от одного из попугаев был подвергнут молекулярно-генетическим исследованиям. Результатом ПЦР клинического материала со специфичными праймерами СРБ и СРК явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов (рис. 11).

М 1 2 3

Рис. П.Электрофореграмма результатов ПЦР с клиническим материалом, полученным от попугая (праймеры СРР и 01'к)

Обозначения:

М) ДНК-маркеры;

1) положительный контроль (ДНК хламидий);

2) исследуемая проба;

3) отрицательный контроль.(Н20).

Таким образом, подтверждена возможность ПЦР-индикации возбудителей хламидиоза в клиническом материале, полученном от декоративной птицы с применением искусственно синтезированных олигонуклеотидных праймеров СРР и СРК.

3.4. Молекулярно-генетический анализ хламидий

Задачей данного раздела исследования являлись молекулярно-генетические исследования типичных представителей рода Chlamydophila из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» на предмет их таксономической принадлежности, на основании сравнительного анализа по ompl-, отр2-, 16S рРНК- и 23S рРНК-генам с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а также наличию экстрахромосомной плазмиды.

Нами установлено, что штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» являются типичными представителями рода Chlamydophila и по характеру клинических проявлений схожи с видом Chlamydophila abortus. Однако, результаты ПЦР изучаемых штаммов хламидий, анализа ПДРФ и секвенирования продуктов ПЦР-амплификации показали отличия, позволяющие дифференцировать их от других представителей семейства Chlamydiaceae.

3.4.1. Сравнительная характеристика хламидий по ompl-rmy

После проведения ПЦР, используя праймеры 5GPF и 3GPB, с экстрактами ДНК очищенных штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса ompl-гена длиной 1378 bp (рис. 12).

При последующем эндонуклеазном расщеплении ферментом НаеШ амплифицированного локуса ompl-гена были получены 2 дискретных фрагмента длиной 1070 bp и 308 bp (рис. 12).

Ml 23 456 7 8 9

Рис. 12. 0«/>7-ПЦР-ПДРФ-ЯвеД/-профиль штаммов хламидий из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»

Обозначения: М) ДНК маркеры; 1) «Ростиново-70»; 2) «Росгиново-70» (НаеШ); 3) «250»; 4) «250» (НаеШ); 5) «ПП-87»; 6) «ПП-87» (НаеШ); 7) «КС-93»; 8) «КС-93» (НаеШ); 9) Н20.

При эндонуклеазном расщеплении ферментом A 1и1 амплифицированного локуса ompl- гена исследованных штаммов хламидий были получены фрагменты длиной 438, 279, 230,150, 89, 75, 72, 33 и 12 bp (рис. 13).

1500 Ьр-1000 bp-700 bp-

500 Ьр-400 Ьр-

300 Ьр-200 Ьр-

100 Ьр-

1378 bp

438 bp

279 bp 230 bp

■ ■ ■ ¡ ---33/(2 bp

Рис. 13. 0»(/>/-1ЩР-ПДРФ-/1/и/-профиль штаммово хламидий из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Обозначения: М) ДНК маркеры; I) «Ростиново-70»; 2) «Ростиново-70» (Alul); 3) «250»; 4) «250» (Alul); 5) «ПП-87»; 6) «ПП-87» (Alul); 1) «КС-93»; 8) «КС-93» (Alul); 9) Н20.

Аналогичные результаты бьши получены также при проведении ПЦР-ПДРФ с неочищенными культурами исследованных штаммов хламидий (рис. 14).

М1 2345 67 89

1000 bp

800

№

жц

500 bp 400 bp 300 bp

200 bp 100 bp

1378 bp

438 bp

279 bp 230 bp

150 bp

89 bp 75/72 bp

шттШщщщ.:. ^^ , • 33/12 bp

Рис. 14. 0/я/>7-ПЦР-ПДРФ-/1;н/-профиль штаммов хламидий из коллекции

микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (неочищенные культуры) Обозначения: М) ДНК маркеры; 1) «Ростиново-70»; 2) «Роспшово-70» (Alul); 3) «250»; 4) «250» (Alul); 5) «ПП-87»; 6) «ПП-87» (Alul); 7) «КС-93»; 8) «КС-93» (Alul); 9) Н20.

Штамм «Ростиново-70» был выравнен по длине 881 н. локуса ompl-гена. (DQ177459, 1-881 н.) с соответствующими опубликованными в GenBankNCBI нугслеогидными последовательностями штаммов микроорганизмов семейства Chlamydiaceae, используя программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/) и CLUSTAL W (v. 1.83) Multiple Sequence Alignments (http://align.genome.jp/). При построении филограммы при анализе ompl-гена представителей семейства Chlamydiaceae использовали алгоритм NJ.

Секвенированные последовательности частичного ompl-гена штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» имели между собой 100% гомологию и были на 99% идентичны со штаммами «GD», «СТ1» и «Pari». Следует отметить, что отр ¡-гетерогенность данных штаммов по отношению к штамму «6ВС» Chlamydophila psitiaci составляет 21%, а по отношению к штамму «S26/3» Chlamydophila abortus - 14%.

По результатам филогенетического анализа ompl-гена хламидий выявлено, что исследуемые штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» когерентны к так называемым «промежуточным» штаммам хламидий Chlamydophila psittaci.

Для упорядочивания генотипов исследуемых штаммов хламидий нами были дополнительно проанализированы результаты выравнивания и Alu! / Haelll рестрикционного картирования амплифицируемых при помощи праймеров 5GPF и 3GPB нуклеотидных последовательностей ДНК локуса ompl-гена ряда референтных штаммов Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophila felis, данные которых использованы при моделировании OmpJ-ПЦР-ПДрФ-НаеШ и Ompl-Wjp-ПДРФ-ЛМ-профилей хламидий (рис. 15-16).

На основании результатов выравнивания и рестрикционного картирования амплифицируемых нуклеотидных последовательностей ДНК локуса ompl-гена ряда референтных штаммов Chlamydophila psittaci, Chlamydophila abortus, Chlamydophila caviae и Chlamydophila felis, данные которых использованы и при моделировании ОтрМЩР-ПДРФ-профилей, можно сделать утвердительное заключение, что по ompl -ПДРФ-//0е///-профилю штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», а также «GD», «СТ1» и «Pari» можно объединить в одну группу (рис. 15). Однако, согласно ompl-ПДРФ-Л/и/-профилю штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» характеризуются признаком нового, ранее не изученного генотипа хламидий, названного нами «генотип G» (рис. 16).

MI 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1.4 15 16 17 18 19 20 21 M

Рис. 15. Ою/>7-ПЦР-ПДРФ-#веЯ/-профиль хламидий рода Chlamydophila (праймеры 5GPF и 3GPB)

Обозначения:

M - ДНК-маркеры.

1) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (цельный ПЦР фрагмент длиной 1378 bp).

2) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (1070/308 bp); гомологичные штаммы: 250; ПП-87, КС-93.

3) Chlamydophila psittaci GD (1070/308 bp); гомологичные штаммы: СТ1, Pari.

4) Chlamydophila psittaci 6BC (987/424 bp); гомологичные штаммы: GV, 90/1051, MNZang.

5) Chlamydophila psittaci 84-55 (1414 bp).

6) Chlamydophila psittaci CP3 (987/424 bp); гомологичные штаммы: 41A12.

7) Chlamydophila psittaci NJ (1124/257 bp); гомологичные штаммы: 92-1293, ТТЗ, 7344/2.

8) Chlamydophila psittaci MN_VR122 (987/424 bp); гомологичные штаммы: A22/M, MNRh, MNOs, 3759/2.

9) Chlamydophila psittaci N352 (987/424 bp); гомологичные штаммы: 98AV2129, WS/RT/E30.

10) Chlamydophila psittaci VS225 (1378 bp); гомологичные штаммы: 7778B15.

11) Chlamydophila psittaci 82/2334 (1378 bp).

12) Chlamydophila psittaci R54 (1375 bp).

13) Chlamydophila psittaci WC (1393 bp).

14) Chlamydophila psittaci M56 (987/424 bp).

15) Chlamydophila abortus S26/3 (1372 bp); гомологичные штаммы: LW508, OCLH_196, ЕВА, B577, BAI.

16) Chlamydophila abortus LLG (1372 bp).

17) Chlamydophila abortus pmSHl (1372 bp).

18) Chlamydophila abortus pm364 (1372 bp); гомологичные штаммы: pmll2, pmd623, pm225.

19) Chlamydophila abortus pm326 (1372 bp); гомологичные штаммы: pm234.

20) Chlamydophila felis FP Pring (1073/257/51 bp); гомологичные штаммы: FP FEPN, FP Baker, FP Cello.

21) Chlamydophila caviae GPIC (642/302/201/197/30 bp); гомологичные штаммы: isolate GPIC.

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 М

Рис. 16. 0«/;7-ПЦР-ЦЦРФ-Л/и/-профиль хламидий рода Chlamydophila (праймеры 5GPF и 3GPB)

Обозначения:

М - ДНК-маркеры.

1) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (цельный ПЦР фрагмент длиной 1378 bp).

2) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (438/279/230/150/89/75/72/33/12 bp); генотип О; гомологичные штаммы: 250; ПП-87, КС-93.

3) Chlamydophilapsittaci GD (438/279/230/101/89/75/72/49/33/12 bp); генотип С; гомологичные штаммы: СТ1, Pari.

4) Chlamydophila psittaci 6ВС (411/282/230/110/102/89/72/41/33/18/12/7/4 bp); генотип А; гомологичные штаммы: GV, 90/1051, MNZang.

5) Chlamydophila psittaci 84-55 (411/285/230/110/102/89/72/41/33/18/12/7/4 bp); генотип A.

6) Chlamydophila psittaci CP3 (411/294/230/117/102/89/72/41/33/18/4 bp); генотип В; гомологичные штаммы; 41А12.

7) Chlamydophila psittaci NJ (471/240/230/147/89/75/72/45/12 bp); генотип D; гомологичные штаммы: 92-1293, ТТЗ, 7344/2.

8) Chlamydophila psittaci MN_VR122 (411/282/230/102/94/89/72/41/33/18/16/12/7/4 bp); генотип E; гомологичные штаммы: A22/M, MNRh, MNOs, 3759/2.

9) Chlamydophila psittaci N352 (411/282/230/102/94/89/72/41/33/18/16/12/7/4 bp); генотип E/B; гомологичные штаммы: 98AV2129, WS/RT/E30.

10) Chlamydophila psittaci VS225 (230/222/177/132/123/102/89/78/75/72/60/12/6 bp); генотип F; гомологичные штаммы: 7778В15.

11) Chlamydophila psittaci 82/2334 (387/230/198/156/150/89/84/72/12 bp).

12) Chlamydophila psittaci R54 (306/230/195/165/147/89/75/72/54/15/15/12 bp).

13) Chlamydophila psittaci WC (231/230/219/165/150/123/89/72/69/33/12 bp).

14) Chlamydophila psittaci M56 (294/291/230/120/117/106/89/72/59/33 bp).

15) Chlamydophila abortus S26/3 (230/198/171/161/159/82/81/78/75/60/51/12/8/6 bp); гомологичные штаммы: LW508, OCLH_196, ЕВА, B577, BAI.

16) Chlamydophila abortus LLG (230/198/171/161/159/84/82/81/75/60/51/12/8 bp).

17) Chlamydophila abortuspmSHl (230/198/171/161/159/135/90/82/81/51/8/6 bp).

18) Chlamydophila abortus pm364 (230/198/171/161/159/90/82/81/75/60/51/8/6 bp); гомологичные штаммы: pml 12, pmd623, pm225.

19) Chlamydophila abortus pm326 (230/171/161/159/141/90/82/81/75/60/57/51/8/6 bp); гомологичные штаммы: pm234.

20) Chlamydophila felis FP Pring (272/230/189/180/132/93/89/84/46/33/33 bp); гомологичные штаммы: FP FEPN, FP Baker, FP Cello.

21) Chlamydophila caviae GPIC (230/198/180/174/171/89/89/63/57/46/36/21/18 bp); гомологичные штаммы: isolate GPIC.

Примечателен факт, что Т. веепБ й а1. (2005а) при сравнительной характеристике ряда генотипов хламиднй вида СЫатус1орЫ1а р$Шас1 акцентировали Л/и/-ПДРФ-генотип-специфичные фрагменты, инициированные праймерами ОУ-1 и БУ-2 (Б. Уапгошрау ег а1., 1998), коими для генотипов А и В являются характерные полосы длиной 110 Ьр и 117 Ьр, соответственно; для генотипа Е - отсутствие, характерных для генотипа А (110 Ьр) и генотипа В (117 Ьр) полос; для генотипа С - наличие фрагмента длиной 438 Ьр; для генотипов Б и Б - наличие характерных фрагментов длиной 471 Ьр и 222 Ьр, соответственно (Т. веепБ й а!., 2005а).

Анализ использованного в данной работе протокола генотипирования хламидий, с праймерами 5вРР и 3 вРВ (В. КаКепЬоеск et а1., 1991, 1993) выказывает акцент ЛМ-ПДРФ-генотип-специфичных фрагментов тождественный результату, описанному Т. веет & а1. (2005а).

Анализ протокола генотипирования хламидий с праймерами СТО и СИ, (Е. Бепашиг ег а1., 1991; С. Бауаск et а!., 1995; Б. Уапгошрау е! а1., 1997), являющихся прототипом праймеров БУ-1 и БУ-2 (О. Уапгошрау е1 а!., 1998; Т. веем й а1., 2005а) выказывает следующий акцент Л7и/-ПДРФ-генотип-специфичных фрагментов, коими для генотипов А и В остаются характерные полосы длиной 110 Ьр и 117 Ьр, соответствнно; для генотипа Е - отсутствие, характерных для генотипа А (110 Ьр) и генотипа В (117 Ьр) полос; для генотипа С - наличие фрагмента длиной 442 Ьр; для генотипов Б и Б - наличие характерных фрагментов длиной 475 Ьр и 222 Ьр, соответственно.

В свете сравнительной характеристики нового генотипа хламидий (генотип Б: штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87», «КС-93») по маркерному отр1-гену, характерным его Л/иЛ-ПДРФ-фрагментом является полоса длиной 150 Ьр, генерируемая в результате реализации вышеописанных протоколов генотипирования хламидий. В ввиду наличия у генотипа О также Л/и/-ПДРФ-фрагмента, ранее уже акцентированного как характерная полоса для генотипа С, именно факт присутствия фрагмента размером 150 Ьр (для генотипа О) или его отсутствия (для генотипа С) имеет особую идентификационную ценность.

В целях же исчерпывающей идентификации генотипов хламидий целесообразно руководствоваться анализом полной картины ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продукгов.

3.4.2. Сравнительная характеристика хламидий по отр2-гену

После проведения ПЦР, используя праймеры СЬ1 и СЬ2, с экстрактами ДНК очищенных штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса отр2-геш длиной 587 Ьр (рис. 17).

При последующем эндонуклеазном расщеплении ферментом А1и1 амплифицированного локуса отр2-гена были получены 4 дискретных фрагмента длиной 192,160,140 и 95 Ьр. (рис. 17).

bp

Следует отметить, что точные размеры ПЦР-ПДРФ-фрагментов установлены в результате секвенирования продуктов ПЦР-амплификадии, данные которых использованы и при моделировании Отр2-Ш1Р-1 ЩРФ-Л 1и1-профиля хламидий семейства СЫатусЧасеае (рис. 18).

ЬР bp bp

Рис. 17. Омр2-ПЦР-1ЩРФ-А1и1-профиль штаммов хламидий из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Обозначения: М) ДНК-маркеры; 1) «Ростиново-70»; 2) «Росгвново-70» (А1иГ)\ 3) «250»; 4) «250» (А1иГ); 5) «ПП-87»; 6) «ПП-87» (Alul); 7) «КС-93», 8) «КС-93» (Alul); 9) Н20.

Рис. 18. Om/;2- IIЦ Р -11ДР Ф-Л /и /-11 р о ф и л ь хламидий семейства Chlamydiaceae (праймеры Chi и Ch2) Обозначения: М - ДНК-маркеры. 1) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (цельный ПЦР фрагмент длиной 587 bp). 2) Chlamydophila sp. Rostinovo-70 (192/160/140/95 bp). 3) Chlamydophila abortus S26/3 (352/235 bp). 4) Chlamydophila psittaci 6BC (227/220/140 bp). 5) Chlamydophila felis FePn (225/140/95/85/45 bp). 6) Chlamydophila caviae GPIC (355/140/95 bp). 7) Chlamydophila pneumoniae TW-183 (444/127/13 bp). 8) Chlamydophila pecorum W73 (394/193 bp). 9) Chlamydia suis S45 (339/119/77/26/5 bp). 10) Chlamydia muridarum Nigg (216/117/97/77/26/22/5 bp). 11) Chlamydia trachomatis LI (158/119/114/84/77/5 bp).

В результате использования протокола индикации хламидий праймерами Chi и Ch2 с последующей видовой идентификацией их путем анализа отр2-ПДРФ-ЛМ-профиля (J.C. Hartley et al., 2001) бьшо установлено, что исследуемые экстракты ДНК штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» дали аналогичные между собой результаты (рис. 17), но отличные от упоминаемых в данной работе других представителей семейства СМамусНасеае (рис. 18).

Отр-2-гетерогенность штамма «Ростиново-70» по отношению к штамму «6ВС» Chlamydophila psittaci составляет около 4 (3,58) %, а по отношению к штамму «S26/3» Chlamydophila abortus — около 2 (1,36) %.

Таким образом, при проведении сравнительного анализа отр2-тъш штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» охарактеризован новый, ранее не изученный отр2-ПДРФ-Л/и/-профиль хламидий (рис. 17-18), а также установлено, что исследованные штаммы более когерентны к Chlamydophila abortus, нежели к Chlamydophila psittaci.

3.43. Сравнительная характеристика хламидий по 16SpPHK, 23SрРНКи наличию экстрахромосомной плазмиды (рСр)

После проведения ПЦР, используя праймеры 16SIGF и 16SIGR, с экстрактами ДНК очищенных штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса 16S рРНК длиной 294 Ър (рис. 19, трек 1), при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом Alul были получены 2 дискретных фрагмента длиной 216 и 78 bp (рис. 19, трек 2).

После проведения ПЦР с праймерами U23F и 23SIGR были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса 23S рРНК длиной 604 bp (рис. • 19, трек 5), при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом Alul были получены 4 дискретных фрагмента длиной 461,73,59 и 11 bp (рис. 19, трек 6).

После проведения ПЦР, используя праймеры ML-PLF01 и ML-PLR01, были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона локуса экстрахромосомной плазмиды длиной 469 bp (рис. 19, трек

3), при последующем эндонуклеазном расщеплении которого ферментом Alul были получены 3 дискретных фрагмента длиной 351, 89 и 29 bp (рис. 19, трек

4).

Праймеры на выявление экстрахромосомной плазмиды инициировали также амплификацию минорного неспецифичного фрагмента размером приблизительно 300 bp, который существенно не повлиял на корректную интерпретацию результата секвенирования.

1500 bp 1000 bp

600 bp 500 Ър 400 bp 300 bp

200 bp

100 bp

Рис. 19.16S рРНК-, pCp-, 23S р/>ЯА"-ПЦР-ПДРФ-/1/«/-профиль штамма «Ростиново-70»

Обозначения:

М) ДНК-маркеры; 1) «Ростиново-70» (16SрРНК); 2) «Росгиново-70» (16SрРНК-А1иГ); 3) «Ростиново-70» (рСр); 4) «Ростиново-70» (рСр-А1иГ)\ 5) «Ростиново-70» (23S рРНК)\ 6) «Росгиново-70» (23SpPHK-AluI).

При анализе 16S и 23S /;Р/Ж-ПДРФ-Л/и[-профилей установлено, что исследуемые экстракты ДНК штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», имеющие аналогичные между собой результаты, соответствуют общему профилю семейства Chlamydiaceae.

Следует отметить, что 16S рРНК-гетерогенность штамма «Ростиново-70» по отношению к штамму «6ВС» Chlamydophila psittaci составляет 1 нукпеотид, а по отношению к штамму «826/3» Chlamydophila abortus - 3 иуклеотида.

Секвенированная последовательность частичного 23S рРНК-гена штамма «Ростиново-70» имела 100% идентичность с соответстующими последовательностями штаммов «GD», «СТ1» и «Pari», a 23S рРНК-гетерогенность данных штаммов по отношению к штамму «6ВС» Chlamydophila psittaci составляет 2 нуклеотида, а по отношению к штамму «S26/3» Chlamydophila abortus - 8 нуклеотидов.

Таким образом, установлено, что штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» по маркерному генам 16S и 23S рРНК когерентны к Chlamydophila psittaci, нежели к Chlamydophila abortus.

Следует отметить, что по результатам выравнивания и Alul рестрикционного картирования амплифицируемых при помощи праймеров 16SIGF и I6SIGR нуклеотидных последовательностей ДНК локуса 16SрРНК, а также амплифицируемых при помощи праймеров U23F и 23SIGR нуклеотидных последовательностей ДНК локуса 23S рРНК известных представителей рода Chlamydophila можно сделать вывод, что для меж- и внутривидовой идентификации целесообразна процедура секвенирования продуктов ПЦР-амплификации.

604 bp 469/461 bp 351 bp 294 bp 216 bp

89 bp bp

Штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» имеют экстрахромосомную плазмиду, чья нуклеотидная последовательность (GenBank A/N: DQ663790) на 100% идентична последовательности экстрахромосомной плазмиды штамма «84/2334» Chlamydophila psittaci.

На основании видовой идентификации хламидий по генетическому (анализ ompl-, omp2-, 16S рРНК и 23S рРНК-тетв хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому критерию штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» могут быть предложены для выделения в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

Это действие продиктовано тем обстоятельством, что штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», согласно генетическому критерию видовой идентификации занимают промежуточное положение между видами Chlamydophila psittaci и Chlamydophila abortus, т.е. по ompl- и отр2-геиам они более когеренентны к Chlamydophila abortus, а по 16S рРНК, 23S рРНК и наличию экстрахромосомной плазмиды - Chlamydophila psittaci.

Факт существования «промежуточных» штаммов и проблемы видовой идентификации Chlamydophila psittaci от Chlamydophila abortus подробно изучены M. Van Loock et al. (2003). Однако штаммы «Ростиново-70» (Х.З. Гаффаров с соавт., 1971), «250» (И.А. Курбанов с соавт., 1973, 1978), «ПП-87» (Р.Х. Равилов, 1998) и «КС-93» (Р.Х. Равилов, 1998) были изолированы как из плаценты абортировавших животных, так и органов абортированных плодов, т.е. экологически они обладают признаками Chlamydophila abortus.

В тоже время, факт генетической схожести штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», которые изолированы от млекопитающих при абортах, со штаммами «GD», «СТ1» и «Pari», которые изолированы от птиц, вносит серьезный резонанс таксономического соотнесения штаммов хламидий, компромиссом в котором является утверждение нового вида хламидий -Chlamydophila parapsittaci sp. nov. с соотнесением в данный вид также промежуточных штаммов Chlamydophila psittaci «WC», «NJ1», «92-1293», «ТТЗ», «7344/2», «GD», «CT1», «Pari», «84/2334», «R54», «VS225», «777B15» и «Prk/Daruma».

С учетом соотнесения в новый вид Chlamydophila parapsittaci sp. nov. штаммов «WC», «NJ1», «92-1293», «ТТЗ», «7344/2», «GD», «CT1», «Pari», «84/2334», «R54», «VS225», «777B15» и «Prk/Daruma», одним из критериев таксономического размещения новых кандидатов в классификационной системе может служить вхождение в филогенетический спектр, фланкируемый штаммами «WC» и «777В15» при анализе ompl-гена. (рис. 20).

Следует отметить, что такие штаммы, как «84/2334», «Prk/Daruma» и «R54», относятся к Chlamydophila psittaci исключительно по экологическому критерию и наличию экстрахромосомной плазмиды. Фактически, по маркерным генам 23S рРНК, ompl и вероятно по отр2-гену (к сожалению, данные по отр2-гену промежуточных штаммов Chlamydophila psittaci «84/2334», «Prk/Daruma», «R54», а также «WC», «NJl», «92-1293», «ТТЗ», «7344/2», «GD», «СТ1», «Pari», «VS225», «777B15» отсутствуют в GenBank) их

можно причислить к Chlamydophila abortus, а по 16S рРНК они занимают промежуточное между Chlamydophila psittaci и Chlamydophila abortus положение.

г- Chlamydophila pecorum

--Chlamydophila pneumoniae

--Chlamydophila caviae

-Chlamydophila felis

-Chlamydophila psittaci

L -«WC» (AF269269)

«NJ1» (AF269266) -«92-1293» (Y16562)

_«TT3» (ЛК269267)

L Ч(7344У2» (AY762610)

ftGD»(AF269261) «CTl» (AF269260) _ «Гаги (125436)

«Роп'НН0В0-70» (DQ177459) «250» «ПП-87»

__«КС-93»

-«R54» (AJ243525)

-««4/2334» (AJ310735)

_r«VS225» (AF269259)

^J l«777SB15» (АУ762612)

*-Chlamydophila abortus

Рис. 20. Филограмма представителей рода Chlamydophila {ompl-ген)

На сегодняшний день уже не вызывает сомнения необходимость проведения комплексной идентификации хламидий по широкому спектру генетических маркеров с учетом также и экологического критерия (М. Van Loock et al.s 2003). Наши исследования подтверждают мнение ряда авторов, что для таксономической классификации видов хламидий необходимо также использовать гены, кодирующие белки наружной мембраны хламидий (ompl и отр2) (K.D. Everett et al., 1999b; J.C. Hartley et al„ 2001; B. Kaltenboeck et al., 1991, 1993).

Описание вида Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

Chlamydophila parapsittaci sp. nov - вид хламидий рода Chlamydophila семейства Chlamydiaceae, характеризующийся тем, что его представители согласно генетическому критерию идентификации обладают признаками промежуточного между Chlamydophila abortus и Chlamydophila psittaci вида, т.е по ompl- и о/я;>2-генам они когерентны к хламидиям вида Chlamydophila abortus, а по 16S pPHK-, 23S рРНК-ттам и (или исключительно по) наличию экстрахромосомной плазмиды - Chlamydophila psittaci. Типичные штаммы: «Роетиново-70», «250», «ПП-87», «КС-93», «WC», «NJ1», «92-1293», «ТТЗ», «7344/2», «GD», «CTl», «Pari», «84/2334», «Prk/Daruma», «R54», «VS225» и «777В15».

Chlamydophila 1 parapsittaci sp.nov.

ВЫВОДЫ

1. По результатам таксономической идентификации хламидий по генетическому (анализ ompl-, omp2-, 16S рРНК и 23SрРНК-теноъ хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» характеризуются признаком нового ранее не изученного генотипа хламидий, обозначенного нами «генотип G» и предложены для выделения в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

2. Разработанный фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий обеспечивает получение препаратов ДНК хламидий высокой степени чистоты (спектрофотометрические показатели полученных препаратов ДНК колебались в пределах 1,8-2,0) и нативности, пригодных для молекулярно-генетических исследований. Практический выход ДНК хламидий составил 18,7-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов.

3. Разработанная методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку специфичных амлликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции за счет использования праймеров, состоящих из 3-участка, комплементарного последовательности мишени, и 5-участка, не комплементарного последовательности-мишени, с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их з'-комплементарного участка на 5-10°С, а также применения фиксированной температуры отжига, соответствующей потенциальному оптимуму гибридизации по всей длине олигонуклеотидов.

4. Разработанный способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка, 2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP предотвращает возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов в виду того, что урацил-содержащая ДНК (контаминант) теряет роль мишени из-за выщепления из нее свободного урацила ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) в процессе реакции.

5. На основании анализа эпизоотологической ситуации, выделения возбудителя, а также положительных результатов бактериоскопических, серологических и молекулярно-генетических исследований установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий.

6. Подобранные условия ПЦР-индикации и ПЦР-ПДРФ-идентификации хламидий в исследуемом биоматериале обеспечивают высокую чувствительность и специфичность тестов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие

практические предложения:

1. Предложен фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий (Патент РФ на изобретение № 2230120 - «Способ выделения ДНК микроорганизмов»), позволяющий получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.

2. Предложена методика высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 2299240 - «Способ проведения ПЦР»), который обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.

3. Предложен способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) (Патент РФ на изобретение № 2307167), предотвращающий возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка 2 этапа».

4. Предложены условия проведения индикации и идентификации хламидий методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность анализа.

5. Охарактеризован новый генотип хламидий («генотип G»), по результатам молекулярно-генетических исследований типичных представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», с предложением выделения изученных штаммов в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov., что существенно повышает уровень знаний о природе хламидийных инфекций и позволяет эффективно использовать полученную информацию в практической деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины.

6. Подготовлены методические рекомендации для использования опубликованных материалов в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях:

- «Методические рекомендации по индикации и идентификации микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции», утверждены директором ВНИВИ 21 ноября 2002 г.

- «Индикация и идентификация микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (методические рекомендации)», утверждены Ученым советом КГАВМ 24 декабря 2002 г.

- «Методические рекомендации по диагностике хламидийных инфекций у рептилий, амфибий и декоративных птиц», утверждены Ученым советом КГАВМ 10 июня 2008 г.

- «Методические рекомендации по идентификации генотипов хламидий по маркерному гену (ompl)», утверждены Ученым советом КГАВМ 25 декабря 2008 г.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1) Вафин, Р.Р. Индикация и идентификация хламидий методом полимеразной цепной реакции / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Т.Х. Фаизов // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2003. - Т. 174. - С. 51-59.

2) Вафин, P.P. Фенольно-детергентный метод выделения ДНК хламидий / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Т.Х. Фаизов // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2003.-Т. 174.-С. 59-66.

3) Вафин, P.P. Молекулярно-генетический анализ штаммов хламидий по ompl- и отр2-генам / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров, P.P. Вафин // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2006. - Т. 190. - С. 13-25.

4) Вафин, P.P. Разработка методики высокоточной ПЦР / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Р.Р. Вафин, И.Х. Бакиров, Т.М. Ахметов, О.Г. Зарипов, Э.Ф. Валиуллина // Ж. Ветеринарная практика. - 2006/2007. - № 4 (35). - С. 1522.

5) Вафин, Р.Р, Сравнительная характеристика штаммов хламидий по ompl-гену / Р.Р. Вафин, Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров, Р.Р. Вафин // Ж. Ветеринарная практика. - 2007. - № 3 (38). -С. 54-59.

6) Вафин, РР. О номенклатуре и классификации хламидий / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров, В.Н. Кашов, Р.Р. Вафин // Ж. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 4. - С. 17-25.

7) Вафин, Р.Р. Изучение 16S рРНК, 23S рРНК фрагментов ДНК и экстрахромосомальной плазмиды хламидий / P.P. Вафин. М.З. Каримов, Р.Х. Равилов // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2008. - Т. 192. - С. 22-25.

8) Вафин, Р.Р. Проблема контаминации в ПЦР-лаборатории. Способы деконтаминации / Р.Р. Вафин. И.В. Пикалова, Ф.Ф. Замалиева, Т.М. Ахметов, Р.Х. Равилов // Ж. Ветеринарная практика. - 2008. - № 4 (43). - С. 56-61.

9) Вафин, Р.Р. Идентификация нового генотипа хламидий по маркерному гену / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров, Р.Р. Вафин // Ж. Ветеринарная практика. - 2009. - № 1 (44). - С. 82-90.

10) Иванов, A.B. Характеристика нового генотипа хламидий по маркерному гену / A.B. Иванов, P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров // Ж. Ветеринарный врач. - 2009. -№ 2. - С. 18-22.

Монография

11) Бакиров, И.Х. Лабораторная диагностика хламидиозов животных / И.Х. Бакиров, Р.Р. Вафин. Р.Х. Равилов // Монография. - Тобольск: ГОУ ВПО «ТГПИ им. Д.И. Менделеева», 2008.- 150 с.

Патенты РФ на изобретения

12)Вафин, PP. Способ выделения ДНК микроорганизмов. Патент на изобретение № 2230120 / P.P. Вафин. Л.И. Зайнуллин, Т.Х. Фаизов, Р.Х. Равилов, A.M. Алимов, Р.Р. Вафин // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - опубликовано 10.06.2004. - Бюл. № 16.

13)Вафин, Р.Р. Способ проведения ПЦР. Патент на изобретение № 2299240 / Р.Р. Вафин. Р.Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова, Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - опубликовано 20.05.2007. - Бюл. № 14.

14) Вафин, P.P. Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил ДНК гликозилазы. Патент на изобретение № 2307167 / P.P. Вафин, P.P. Вафин, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова, 3. Сташевски, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Р.Х. Равилов // Официальный бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - опубликовано 27.09.2007. - Бюл. № 27.

Методические рекомендации

15)Вафин, P.P. Индикация и идентификация микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (методические рекомендации) / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов, Т.Х. Фаизов, А.Р. Садриев, А.М. Алимов // Методические рекомендации. - Казань, КГАВМ. - 2002. - 18 с.

16) Вафин, P.P. Методические рекомендации по индикации и идентификации микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом молимеразной цепной реакции / P.P. Вафин. Т.Х. Фаизов, А.З. Равилов, A.M. Алимов, Р.Х. Равилов // Казань, ВНИВИ. - 2002. -18 с.

17) Равилов, Р.Х. Методические рекомендации по диагностике хламидийных инфекций у рептилий, амфибий и декоративных птиц (методические указания) / Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов, P.P. Вафин. A.B. Буракова, A.B. Кострова И Казань, ЦИТ КГАВМ. - 2008. - 24 с.

18) Вафин, P.P. Идентификация генотипов хламидий по маркерному гену ompl (методические рекомендации) / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров // Казань, КГАВМ. - 2008. - 14 с.

Публикации в материалах конференций, научных и научно-практических журналах и изданиях

19) Вафин, P.P. К вопросу о роли хламидий в патологии лисиц и песцов / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов // Материалы, научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, 2001. - Ч. I. - С. 196-198. [тезисы].

20) Вафин, P.P. Хламидиоз лисиц и песцов / P.P. Вафин // Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных». — Киров, 2001. - С. 59-61. [тезисы].

21) Вафин, Р.Р. Оптимизация методов выделения ДНК хламидий / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов // Материалы научно-практической конференции молодых ученых и специалистов РТ. -Казань, 2001. - С. 68. [тезисы].

22) Вафин, Р.Р. Сравнительное изучение штаммов хламидий в ПЦР с специфическими и универсальными праймерами / P.P. Вафин // Материалы Всероссийской научно-производствнной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, КГАВМ. - 2002. - Ч. 1. - С. 16-18. [тезисы].

23) Вафин, Р.Р. Фенольно-детергентный метод выделения ДНК хламидий и сальмонелл / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, Л.И. Зайнуллин, Т.Х. Фаизов, A.M. Алимов, Р.Р. Вафин // Материалы Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии. - Казань, КГАВМ. - 2002. - Ч. 1. - С. 18-20. [тезисы].

24) Вафин, Р.Р. Дифференциация возбудителей хламидиоза при помощи RAPD-PCR / Р.Р. Вафин. Р.Х. Равилов, Т.Х. Фаизов // Ж. Ветеринарный врач. -2002. - № 3. - С. 73-75 [статья].

25) Вафин, P.P. Диагностика хламидиоза плотоядных животных методом полимеразной цепной реакции / Р.Р. Вафин. Р.Х. Равилов, Т.Х. Фаизов // Сборник статей: Актуальные вопросы ветеринарной медицины мелких домашних животных. - Екатеринбург, 2003. - С. 28-30. [статья].

26) Вафин, P.P. Молекулярно-генетическая диагностика хламидиоза мелких домашних животных / P.P. Вафин. Р.Х. Равилов // Материалы XI Московского международного ветеринарного конгресса. - М., 2003. - С. 12. [тезисы].

27) Вафин, Р.Р. ПЦР-диагностика хламидийных инфекций у собак и кошек / P.P. Вафин. A.B. Куприянова, Р.Х. Равилов // Материалы IV региональной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития». - Саратов, 2004. - С. 49-50. [тезисы].

28) Вафин, Р.Р. Индикация хламидиоза у собак и кошек методом полимеразной цепной реакции / P.P. Вафин. A.B. Куприянова, Р.Х. Равилов // Материалы ХП международного московского конгресса по болезням мелких домашних животных. - М., 2004. - С. 79. [тезисы].

29)Бакиров, И.Х. Индикация и идентификация хламидий в ПЦР со специфическими праймерами / И.Х. Бакиров, Р.Р. Вафин. Р.Х. Равилов, Г.М. Исхаков // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. -Казань, 2005. - С. 26-30. [статья].

30)Вафин, Р.Р. Результаты секвенирования штаммов хламидий, выделенных от сельскохозяйственных и мелких животных / P.P. Вафин, Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов, Г.М. Исхаков, И.Х. Бакиров, P.P. Вафин // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. - Казань, 2005. - С. 34-37. [статья].

31) Вафин, Р.Р. Разработка техники мультиплексной ОТ-ПЦР на выявление PVY и PVX в системе защиты от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил ДНК гликозилазы / P.P. Вафин.

И.В. Пикалова, Ф.Ф. Замалиева, 3. Сташевски, О.Г. Зарипов, Е.Г. Варламова, А.И. Баландин // Сборник статей: Научные труды молодых ученых ГНУ ТатНИИСХ. - Казань, 2005. - С. 41-47. [статья].

32)Вафин, Р.Р. Разработка новой эффективной методики высокоспецифичной ПЦР / P.P. Вафин. Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова, Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Пути мобилизации биологических ресурсов повышения продуктвиности пашни, энергоресурсосбережения и производства конкурентноспособной сельскохозяйственной продукции». -Казань, 2005. - С. 467-470. [тезисы].

33) Бакиров, И.Х. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов продуктов амплификации хламидий / И.Х. Бакиров, P.P. Вафин // Материалы научно-практической конференции «Научно-практическая конференция молодых ученых». - Казань, 2006. - С. 8. [тезисы].

34) Равилов, Р.Х. Индикация хламидий у попугаев методом полимеразной цепной реакции (тезисы) / Р.Х. Равилов, A.B. Кострова, P.P. Вафин // доклады 2-3 й московской орнитолого-зоологической конференции. - М., 2006. - С. 12. [тезисы].

35) Равилов, Р.Х. Молекулярно-генетическая диагностика хламидиоза у попугаев / Р.Х. Равилов, АБ. Кострова, Р.Р. Вафин // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. - Казань, 2006. - С. 80-82. [статья].

36) Вафин, P.P. Оптимизация способов генотипирования крупного рогатого скота по гену каппа-казеина / P.P. Вафин. Т.М. Ахметов, Э.Ф. Валиуллина, О.Г. Зарипов, СВ. Тюлькин // Ж. Ветеринарная практика. - 2007. - № 2 (37). -С. 54-59. [статья].

37) Vafin, R.R. On the nomenclature and classification of chlamydiae / R.R. Vafin, R.Kh. Ravilov, Kh. Z. Gaffarov, A.Z. Ravilov, G.M. Iskhakov, I.Kh. Bakirov, V.N. Kashov // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. - 2007. - V. 22. - № 4. - P. 155-164. [статья].

38) Вафин, P.P. Анализ генома хламидий по 16S рРНК, 23S рРНК и плазмиде / P.P. Вафин. М.З. Каримов, Р.Х. Равилов // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. - Казань, 2007. - С. 56-58. [статья].

39)Равилов, Р.Х. ПЦР-диагностика хламидиоза у попугаев / Р.Х. Равилов, A.B. Кострова, P.P. Вафин // Материалы XV международного Московского конгресса по болезням мелких домашних животных. - М., 2007. - С. 144145. [тезисы].

40) Вафин, P.P. Высокоточный вариант ПЦР / P.P. Вафин, Т.М. Ахметов, Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. - Казань, 2008. - С. 61-67. [статья].

Публикации в глобальной электронной базе данных генбанков NCBI (США), EMBL (Великобритания), DDBJ (Япония).

41) National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: DQ177459 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein (ompA) gene, partial cds.) / Vafin.R.R., Ravilov,R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. -GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2005. - Режим доступа: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=74423036, свободный.

42) EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ177459 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein (ompA) gene, partial cds.) / Vafin.R.R.. Ravilov,RH„ Gaffarov,H.Z„ Ravilov,A.Z., Ishakov,G:M., Bakirov,I.H. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2005. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz ?-e+[EMBL:DQ177459]+-newId, свободный.

43)DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]: DDBJ (A/N: DQ177459 -Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein (ompA) gene, partial cds.) / Vafin.R.R., Ravilov,R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov,A.Z„ Ishakov,G.M., Bakirov,I.H. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. - DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Mishima, Japan, 2005. - Режим доступа: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp, A/N search mode, свободный.

44)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: DQ177460 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein 2 (omp2) gene, partial cds.) / Vafin.R.R., Ravilov.R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov.G.M., Bakirov.I.H. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. -GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2005. - Режим доступа: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=74423038, свободный.

45)EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ177460 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein 2 (omp2) gene, partial cds.) / Vafin.R.R., Ravilov,R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov,A.Z„ Ishakov,G.M., Bakirov,I.H. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2005. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/ wgetz ?-e+[EMBL:DQ177460]+-newId, свободный.

46)DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]: DDBJ (A/N: DQ177460 -Chlamydophila sp. Rostinovo-70 outer membrane protein 2 (omp2) gene, partial cds.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov.H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov,G.M„ Bakirov,I.H. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Mishima, Japan, 2005. - Режим доступа: http://getentry.ddbj.nig.ac.jp, A/N search mode, свободный.

47) National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: DQ663788 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R.. Ravilov.R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov.A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H„ Kashov,V.N. and Vafin,R.R. -

Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2006. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entre2/viewer.fcgi?db=nuccore&id=7442 3038, свободный.

48)EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ663788 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov,H.Z„ Ravilov,A.Z., Ishakov,G.M„ Bakirov.LH., Kashov.V.N. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbi n/cgi-bin/wgetz?-e+[EMBL:DQ663788]+-newId, свободный.

49)DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]: DDBJ (A/N: DQ663788 -Chlamydophila sp. Rostinovo-70 16S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R., RaviIov,R.H., Gaffarov,H.Z„ Ravilov.A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H., Kashov,V.N. and Vafin.R.R. - Электрон, дан. - DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Mishima, Japan, 2006. - Режим доступа: http://getentfy.ddbj.nig.ac.jp, A/N search mode, свободный.

50)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: DQ663789 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 23S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov.H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H„ Kashov,V.N. and Vafin,R.R. -Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2006. - Режим доступа: http://wvAv.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db~nuccore&id=l 101 80586, свободный.

51)EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ663789 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 23S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H„ Gaffarov,H.Z., RaviIov,A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H., Kashov,V.N. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsbi n/cgi-bin/wgetz?-e+[EMBL:DQ663789]+-newId, свободный.

52) DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]: DDBJ (A/N: DQ663789 -Chlamydophila sp. Rostinovo-70 23S ribosomal RNA gene, partial sequence.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov.H.Z., Ravilov,A.Z, Ishakov,G.M., Bakirov,I.H., Kashov,V.N. and Vafin,R.R. - Электрон, дан. - DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Mishima, Japan, 2006. - Режим доступа: http://getentry.ddbj. nig.ac.jp, A/N search mode, свободный.

53)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: DQ663790 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 plasmid pCp hypothetical protein genes, partial cds.) / Vafin.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov.H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H., Kashov.V.N. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2006. -Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore& Id=l 10180586, свободный.

54)EMBL-European Bioinformatics Institute [Электронный ресурс]: EMBL Nucleotide Sequence Database (A/N: DQ663790 - Chlamydophila sp. Rostinovo-70 plasmid pCp hypothetical protein genes, partial cds.) / Vafm.R.R.. Ravilov,R.H., Gaffarov,H.Z., Ravilov,A.Z., Ishakov.G.M., Bakirov,I.H., Kashov,V.N. and Vafm.R.R. - Электрон, дан. - EMBL Nucleotide Sequence Database (EBI), Hinxton, UK, 2006. - Режим доступа: http://srs.ebi.ac.uk/srsb in/cgi-bin/wgetz?-e+[EMBL:DQ663790]+-newId, свободный.

55) DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]: DDBJ (A/N: DQ663790 -Chlamydophila sp. Rostinovo-70 plasmid pCp hypothetical protein genes, partial cds.) / Vafm.R.R., Ravilov,R.H., Gaffarov.H.Z., Ravilov.A.Z., Ishakov,G.M., Bakirov,I.H., Kashov,V.N. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Mishima, Japan, 2006. - Режим доступа: http://getentry.ddbj. nig.ac.jp, A/N search mode, свободный.

Отпечатано в ООО «Астория» 420021, г. Казань, ул. Сайдашева, д. 12 тел. 260-44-40,278-98-96 Заказ Л1» 194 от 25.08.2009 г. Формат 62x94 1/16. Усл. печ. л. 3. Бумага офсетная 80 г. Печать ризографическая. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Вафин, Рамиль Ришадович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-генетическая диагностика.

1.1.1. Методы выделения нуклеиновых кислот.

1.1.1.1. Детергентный метод.

1.1.1.2. Фенольный метод.

1.1.1.3. Фенольно-детергентный метод.

1.1.1.4. Сорбционный метод.

1.1.2. Методы амплификации нуклеиновых кислот.

1.1.2.1. Полимеразная цепная реакция и ее модификации.

1.1.2.2. Альтернативные методы амплификации.

1.1.3. Генотипирование с учетом полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP-генотипирование).

1.1.4. Проблема контаминации. Методы деконтаминации.

1.2. Таксономия и номенклатура хламидий.

1.2.1. Семейство Chlamydiaceae.

1.2.1.1. Род Chlamydia.

1.2.1.2. Род Chlamydophila.

1.2.2. Семейство Parachlamydiaceae.

1.2.3. Семейство Simkaniaceae.

1.2.4. Семейство Waddliaceae.

1.2.5. Семейство Criblamydiaceae.

1.2.6. Хламидиозы рыб.

1.2.7. Критический взгляд на классификацию хламидий.

1.3. Исторический ракурс изучения проблемы хламидиозов животных на постсоветском пространстве.

1.3.1. Характеристика некоторых штаммов хламидий, выделенных от млекопитающих.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы хламидий. Исследованный материал.

2.2. Эпизоотологическое обследование.

2.3. Выделение и идентификация возбудителя хламидиоза.

2.4. Серологические реакции.

2.5. Люминесцентная микроскопия.

2.6. Очистка и концентрирование хламидий.

2.7. Экстракция нуклеиновых кислот исследованного материала.

2.8. ПЦР. ПДРФ. Горизонтальный гель электрофорез.

2.9. Секвенирование. Выравнивание и филогенетический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Совершенствование способов генодиагностики.

3.1.1. Разработка способа выделения ДНК хламидий.

3.1.2. Разработка способа проведения ПЦР.

3.1.3. Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы.

3.2. Результаты исследования плотоядных животных на хламидиоз.

3.2.1. Оценка эпизоотического состояния зверосовхоза «Вятский» Кировской области РФ в отношении хламидиоза пушных зверей.

3.2.2. Лабораторная диагностика хламидиоза лисиц в зверосовхозе «Вятский» Кировской области РФ.

3.2.2.1. Вирусологические исследования.

312.212. Серологические исследования.

3.2.2.3. Молекулярно-генетические исследования.

3.2.3. Совершенствование молекулярно-генетической индикации возбудителей хламидиоза.

3.2.3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) со специфичными праймерами для индикации хламидий.

3.2.3.2. Выявление возбудителя хламидиоза в патологическом материале при помощи ПЦР со специфичными праймерами.

3.3. Результаты лабораторных исследований рептилий, амфибий и декоративных птиц на хламидиоз.

3.4. Молекулярно-генетический анализ хламидий.

3.4.1. Сравнительная характеристика хламидий по отр1-тещ.

3.4.2. Сравнительная характеристика хламидий по отр2-тену.

3.4.3. Сравнительная характеристика хламидий по 16SрРНК,

23SрРНКи наличию экстрахромосомной плазмиды (рСр).

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ хламидий"

Актуальность темы. Научные достижения последних десятилетий в области молекулярной биологии, генетики, биохимии, пересекающиеся с микробиологией, вирусологией, иммунологией и другими смежными дисциплинами, привели к созданию, развитию и внедрению в практику диагностических лабораторий молекулярно-генетических методов исследования геномов эукариот, прокариот и вирусов. Генодиагностические подходы, базовыми направлениями которых являются гибридизационные, амплификационные, сиквенсные и другие технологии ДНК/РНК-анализа, постоянно совершенствующиеся в плане специфичности, чувствительности, экономии и безопасности, позволяют осуществлять широкий спектр задач индикации и идентификации биологических объектов. На сегодняшний день они являются одними из самых эффективных приемов при постановке диагноза на инфекционные болезни (P. Singleton, 2000; N. Woodford et al., 2004; G.J. Viljoen et al., 2005; M. Klint et al., 2007; K. Sachse et al., 2008). В этом- плане весьма актуальным представляется решение вопросов номенклатуры и классификации микроорганизмов, что является основой идентификации болезнетворных агентов.

Хламидиозы — группа разнообразных по проявлению контагиозных болезней животных, возбудителями которых являются внутриклеточные микроорганизмы со своеобразным циклом развития (J. Storz, 1988). Геномы хламидий являются перспективным объектом исследования, а генетический критерий идентификации служит одной из конструктивных звеньев построения их классификации (K.D. Everett et al., 1999а, 1999b; J.C. Hartley et al., 2001; M. Van Loock, 2003; N.R. Thomson et al., 2005, 2008; R.S. Stephens et al., 2009):

Особенностью хламидиозов, значительно- усложняющей контроль за развитием заболевания, является частое латентное или хроническое течение со стертой клинической картиной. Кроме того, обладая низкой иммуногенностью, не обеспечивающей выработку достаточного количества антител, инфекция часто приобретает персистирующий характер и способствует образованию тлеющего очага.

Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Это обусловливает необходимость изыскания и внедрения чувствительных средств диагностики, позволяющих выявлять хламидии при любой форме проявления инфекционного процесса (J.C. Hartley et al., 2001; К. Sachse et al., 2009).

Исходя из этого, перспективным направлением является совершенствование лабораторной диагностики хламидиозов на основе молекулярно-генетических методов исследования.

Цель и задачи исследования. Цель исследования- - создание научно-практических основ генодиагностики биологических объектов и проведение системного молекулярно-генетического анализа хламидий на предмет их таксономической принадлежности.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

- разработать способ выделения нуклеиновых кислот хламидий для получения препаратов ДНК высокой степени чистоты и нативности;

- разработать способ проведения ПТДР, обеспечивающий эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов .реакции;

- разработать способ * деконтаминации * амплификационных реакций на-основе урацил-ДНК-гликозилазного метода защиты от контаминации;

- провести комплекс исследований по выяснению этиологической роли хламидий в патологии клеточных пушных зверей, птиц, рептилий и амфибий;

- подобрать условия проведения индикации и идентификации хламидий в клиническом и патологическом материале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа;

- провести молекулярно-генетические исследования типичных представителей рода Chlamydophila штаммов «Ростиново-70», «250», «1Ш-87» и «КС-93» на предмет их таксономической принадлежности на основании сравнительного анализа по ompl-, отр2~, 16SрРНК- и 23SрРНК-генам с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных видов хламидий, а также по наличию экстрахромосомной плазмиды.

Научная новизна.

- Впервые на основании системного молекулярно-генетического анализа представителей семейства Chlamydiaceae охарактеризован новый, ранее не изученный генотип хламидий, обозначенный нами «генотип G», с предложением соотнесения изолированных от млекопитающих при абортах штаммов «Ростиново-70», «250», «1Ш-87» и «КС-93» рода Chlamydophila в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov.

- Разработка фенольно-детергентного способа выделения ДНК хламидий^ (Патент РФ на изобретение № 2230120 - «Способ выделения ДНК микроорганизмов»).

- Разработка методики высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 2299240 - «Способ проведения ПЦР»).

- Разработка способа защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) (Патент РФ на изобретение № 2307167).

Научная новизна и приоритет разработок, диссертации- защищены охраноспособными документами; отражены, в публикациях ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК и глобальной электронной базе данных генбанков NCBI (США), EMBL (Великобритания), DDBJ (Япония).

Научно-практическая значимость.

- Результаты молекулярно-генетических исследований типичных представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «1111-87» и «КС-93», характеризующие собой новый, ранее не изученный генотип хламидий («генотип G»), с предложением выделения изученных штаммов в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.nov., существенно повышают уровень знаний о природе хламидийных инфекций и позволяют эффективно использовать полученную информацию в научно-практической деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины.

- Разработан способ выделения ДНК хламидий для последующего молекулярно-генетического анализа. Предложенная разновидность фенольно-детергентного метода экстракции нуклеиновых кислот микроорганизмов проста в эксплуатации, экономична во времени и средствах, дает приемлемые результаты в отношении нативности, чистоты и концентрации препаратов ДНК хламидий.

- Разработан способ проведения полимеразной цепной реакции, являющийся действенной альтернативой разновидностям «точной» ПЦР, таким как «touch-up PCR» и «touch-down PCR». Предложенная методика высокоточной ПЦР позволяет значительно повысить специфичность амплификации интересуемых участков геномов исследуемых биологических объектов.

- Разработан способ ферментативной деконтаминации амплификационных реакций на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli). Предложенный подход является действенным инструментом защиты ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа» от загрязнения продуктами амплификации.

- Установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий; выделенные при этом изоляты микроорганизмов идентифицированы как хламидии.

- Подобраны условия проведения ГЩР-индикации и идентификации хламидий методом ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность тестов.

- Подготовленные на основе научно-практической работы методические рекомендации используются в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (20022008 гг.);

- ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСХН (2004-2006 гг.);

- Всероссийской научно-практической конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань 2002 г.);

- научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Киров, 2002 г.);

- Х-ХИ, XIV и XV Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2002-2004, 2006, 2007 гг.);

- IV региональной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2004 г.);

- научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань. 2005 и 2006 гг.);

- научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская академия^ ветеринарной медицины им; Н:Э: Баумана» (Казань, 2006 г.).

Публикация результатов, исследования: По теме ' диссертации опубликовано 55 работ, в том числе 10 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, 4 методические рекомендации, 3 патента на изобретения, 1 монография и 15 депонированных в глобальных базах данных генбанков NCBI, EMBL и DDBJ публикаций нуклеотидных последовательностей локусов ompl-, отр2-, 16S рРНК-, 23S рРНК-генов и экстрахромосомной плазмиды хламидий штамма «Ростиново-70».

Основные положения, выносимые на защиту:

- Штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «Ш1-87» и «КС-93» рода Chlamydophila по генетическому (анализ ompl-, отр2~, 16S рРНК- и 23S pPHK-TQROB хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям охарактеризованы как ранее не изученный генотип («генотип G») и предложены для выделения в новый вид - Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

- Фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий позволяет получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.

- Методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.

- Способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) предотвращает возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка, 2 этапа».

- Различные- патологии у клеточных и домашних плотоядных животных, декоративных птиц, рептилий и амфибий имеют хламидийную природу, подтвержденную результатами комплексных исследований.

- Подобранные условия индикации и идентификации хламидийв исследуемом биоматериале методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ* обеспечивают высокую чувствительность и специфичность анализа.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 290 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 470 источников, в том числе 416 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 21 таблицами, 30 рисунками и 8 схемами. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вафин, Рамиль Ришадович

5. ВЫВОДЫ

1. По результатам таксономической идентификации хламидий по генетическому (анализ ompl-, отр2~, 16SрРНК и 23SрРНК-генов хламидий и наличия экстрахромосомной плазмиды) и экологическому (изолированы от млекопитающих при абортах) критериям штаммы хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» из коллекции микроорганизмов ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» характеризуются признаком нового ранее не изученного генотипа хламидий, обозначенного нами «генотип G» и предложены для выделения в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp. nov.

2. Разработанный фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий обеспечивает получение препаратов ДНК хламидий высокой степени чистоты (спектрофотометрические показатели (А260/А280) полученных препаратов ДНК колебались в пределах 1,8-2,0) и нативности, пригодных для молекулярно-генетических исследований. Практический выход ДНК хламидий составил 18,7-20,4 мкг/мг сухой массы микроорганизмов.

3. Разработанная' методика высокоточной ПЦР обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции за счет использования праймеров, состоящих из 3''-участка, комплементарного последовательности мишени, и 5/-участка, не комплементарного последовательности-мишени, с потенциальной температурой гибридизации по всей длине, превышающей температуру отжига их З'-комплементарного участка на 5-10°С, а также применения фиксированной температуры отжига,, соответствующей потенциальному оптимуму гибридизации по всей длине олигонуклеотидов.

4. Разработанный способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) на урацил-содержащую ДНК в варианте «1 пробирка,.2 этапа» при использовании M-MuLV обратной транскриптазы и Taq ДНК полимеразы путем комбинированного использования dTTP/dUTP предотвращает возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов в виду того, что урацил-содержащая ДНК (контаминант) теряет роль мишени из-за выщепления из нее свободного урацила ферментом урацил-ДНК-гликозилазой (из Е. coli) в процессе реакции.

5. На основании анализа эпизоотологической ситуации, выделения возбудителя, а также положительных результатов бактериоскопических, серологических и молекулярно-генетических исследований установлена хламидийная природа различных патологий у клеточных и домашних плотоядных животных, птиц, рептилий и амфибий.

6. Подобранные условия ПЦР-индикации и ПЦР-ПДРФ-идентификации хламидий в исследуемом биоматериале обеспечивают высокую чувствительность и специфичность тестов.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие практические предложения:

1. Предложен фенольно-детергентный способ выделения ДНК хламидий (Патент РФ на изобретение № 2230120 - «Способ выделения ДНК микроорганизмов»), позволяющий получать чистые, нативные и концентрированные препараты нуклеиновых кислот возбудителя.

2. Предложена методика высокоточной ПЦР (Патент РФ на изобретение № 2299240 - «Способ проведения ПЦР»), которая обеспечивает эффективную наработку специфичных ампликонов с исключением амплификации неспецифичных продуктов реакции.

3. Предложен способ защиты ОТ-ПЦР от контаминации продуктами амплификации на основе разрушающего действия урацил-ДНК-гликозилазы (из Е. coli) (Патент РФ на изобретение № 2307167), предотвращающий возможность реамплификации урацил-содержащих ампликонов при использовании заявленного протокола ОТ-ПЦР в варианте «1 пробирка 2 этапа».

4. Предложены условия проведения индикации и идентификации хламидий методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ в исследуемом биоматериале, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность анализа.

5. Охарактеризован новый генотип хламидий («генотип G»), по результатам молекулярно-генетических исследований, типичных представителей рода Chlamydopila штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», с предложением выделения изученных штаммов в новый вид хламидий, Chlamydophila parapsittaci sp.novчто существенно повышает уровень-знаний о природе хламидийных инфекций и позволяет эффективно использовать полученную информацию в практической деятельности ветеринарной и гуманитарной медицины.

6. Подготовлены методические рекомендации для использования опубликованных материалов в учебном процессе факультетов ветеринарной медицины сельскохозяйственных ВУЗов, для повышения квалификации специалистов ветеринарных лабораторий и при научных исследованиях: «Методические рекомендации по индикации и идентификации микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции», утверждены директором ВНИВИ 21 ноября 2002 г. «Индикация и идентификация микроорганизмов вида Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (методические рекомендации)», утверждены Ученым советом КГАВМ 24 декабря 2002 г.

- «Методические рекомендации по диагностике хламидийных инфекций у рептилий, амфибий и декоративных птиц», утверждены Ученым советом КГАВМ 10 июня 2008 г.

- «Методические рекомендации по идентификации генотипов хламидий по маркерному гену (ompl)», утверждены Ученым советом КГАВМ 25 декабря 2008 г.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю признательность и благодарность коллективам ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГУ «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт» (г. Казань), ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХН» (г. Казань), НПО «СибЭнзим» (г. Новосибирск), ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» (г. Казань), ГУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ» (г. Казань), ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатории РТ» (г. Казань), КУК «Казанский зооботсад» за содействие.

Выражаю признательность и благодарность своему научному консультанту, доктору ветеринарных наук, профессору Рустаму Хамитовичу Равшову за научное направление и сотрудничество.

Выражаю признательность и благодарность «Заслуженному деятелю науки Республики Татарстан», профессору Магязу Мубаракишновичу Сахабутдинову и генеральному директору ООО «Сюмбель-Т» Илъгизу Минсабировичу Габбасову за оказанную финансовую поддержку.

Выражаю признательность и благодарность своим родителям за всемернуюпомощь.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Вафин, Рамиль Ришадович, Казань

1. Багдонас, И. Изучение экспериментальной пневмонии телят, зараженных возбудителем группы хламидий / И. Багдонас, А. Лабутинас // Труды Литовского НИИВ. 1976. - С. 5-14.

2. Бородина, Т. Методы детекции SNP / Т. Бородина // Практическая молекулярная биология электронный ресурс. — 2005. — Режим доступа: http://molbiol.edu.ru, свободный.

3. Бортничук, В. А. Значение реакции иммунофлуоресценции при диагностике хламидиоза свиней / В.А. Бортничук // Микробиол. Ж. 1989. -№ 1.-С. 12.

4. Бортничук, В.А. Хламидиоз свиней / В.А. Бортничук // Киев: Урожай, 1991.-192 с.

5. Бортничук, В.А. Поражение половой сферы у хряков при хламидиозе. Ветеринарные и зоогигиенические мероприятия в промышленном животноводстве / В.А. Бортничук с соавт. // Тр. Латв. СХА. 1983 — № 204.-С. 67-73.

6. Бортничук, В.А. Электронно-микроскопическое исследование хламидий, выделенных от свиней, в клетках желточного мешка куриных эмбрионов / В.А. Бортничук, Г.А. Иванченко // Микробиологический журнал. 1984. -№46(1).- С. 56-61.

7. Волкова, А.А. Вирусный аборт овец / А.А. Волкова // Малоизученные заболевания с.-х. животных. М., 1967. - С. 123-124.

8. Гаффаров, Х.З. Выделение вируса из группы пситтакоза-лимфогранулемы от телят, больных бронхопневмонией / Х.З. Гаффаров // Ученые записки КВИ.- 1969. -№ 104. -С. 47.

9. Гаффаров, Х.З. Энзоотия хламидийного энцефаломиелита у телят / Х.З. Гаффаров // Акт. вопр. вет. вирусол., Тез. Докл. V Всесоюзн. вет вирус, конф. Казань, 1980. - С. 22.

10. Гаффаров, Х.З. Выделение вируса из группы OJIT при энзоотическом аборте овец / Х.З. Гаффаров, Л.И. Михайлова, B.C. Кривоносое // Ветеринария. -М., 1971. -№ 7. -С. 109-111.

11. Грибанов, О. Использование аэросила и фильтров GF/F для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК / О. Грибанов, А. Щербаков, И. Перевозчикова, А. Гусев // Биохимия. 1996. - Т. 61. - С. 10.

12. Гринин, А.С. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных / А.С. Гринин, И.Н. Титов // М.: Колос, 1971. 240 с.

13. Домейка, М.А. Биологическая характеристика хламидий возбудителя энзоотического энтерита телят: Автореф. дис. . канд. вет. наук. - Тарту, 1986. - 25с.

14. Караваев, Ю.Д. Изучение комплементсвязывающей активности различных штаммов .возбудителя аборта овец / Ю;Д. Караваев // Профилактика и меры борьбы с болезнями овец: Тез. докл. науч. совещания. М., 1973. - С. 162164.

15. Ковалев, В.JI. Схема выделения хламидий от животных / В.Л. Ковалев // Труды Тадж. НИВИ. Душанбе, 1977. - Т. 7. - С. 11-14.

16. Ковалев, В.Л. Дикие животные резервенты возбудителей хламидиозов / В.Л. Ковалев, Р.Х. Андреева, С.Н. Степанова // Вопросы природ, очаговости болезней. - 1978. - № 9. — С. 138-143.

17. Колкова, Н.И. К вопросам диагностики хламидийных инфекций / Н.И. Колкова, В.Р. Мартынова // Клин, лаборат. диагн. 1998. - № 2. - С. 20-21.

18. Курбанов, И.А. Хламидийный энтерит телят. — Автореф. дис. . канд. вет. наук. Казань, 1982. - 18 с.

19. Курбанов, И.А. Аборты крупного рогатого скота хламидиозной этиологии / И.А. Курбанов, Р.В. Боровик, О.М. Попова, Т.Г. Габдулхаев, П.М. Митрофанов // Ветеринария. 1978. - № 2. - С. 66-70.

20. Курбанов, И.А. Возбудители группы ОЛТ в этиологии абортов коров / И.А. Курбанов, О.М. Попова, И.И. Терских, Х.Г. Гизатуллин // Ветеринария. 1973. - № 7. - С. 36-39.

21. Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической практике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйделыдтейн // КМАХ. 2000. - Т. 2. - № 3. - С. 96-106.

22. МУ 1.3.1794-03. «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности.

23. МУ 1.3.1888-04. «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами Ш— IV групп-патогенности»:

24. Носов, И.И. Аборты овец вирусной этиологии / И.И. Носов // Тез. докл. научн. конф. по малоизученным в СССР забол. с/х жив. — М., 1965. С. 17.

25. Носов, И.И. Аборты овец вирусной этиологии / И.И. Носов // Малоизученные забол. с/х жив. — М.: Колос, 1967. — 104 с.

26. Обухов, И.Л. Хламидиоз кошек / И.Л. Обухов // Приложение к журналу «Новости звероводства». М., 1994. - С. 92.

27. Обухов, И.Л. Обнаружение Chi.psittaci при конъюнктивитах у собак / И.Л. Обухов // Сб. науч. тр. Всерос. гос. НИИ контроля стандартизации и сертификации вет. препаратов. — 1996. Т. 57. - С. 45-51.

28. Обухов, И.Л. Диагностика хламидийной инфекции у кошек / И.Л. Обухов // Ветеринария. 1997. - № 5. - С. 49-50.

29. Обухов, И.Л. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев, А.Н. Панин / Ж. Ветеринария. 1997. - № 2. - С. 24-27.

30. Обухов, И.Л. Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий / И.Л. Обухов, Г.А. Шипулин, К.Н. Груздев, А.Н. Панин // Докл. РАСХН. 1997. - № 1. - С. 44-45.

31. Першина, М.Ю. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами / М.Ю. Першина, И.А. Шагинян, Ю.В. Ананьина, С.В. Прозоровский // Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. — № 1. — С. 29-32.

32. Равилов, Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных (этиология, диагностика, профилактика и меры борьбы). — Дисс. . докт. вет. наук. Казань, 1998. -316 с.

33. Равилов, Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных / Р.Х. Равилов // Казань: «Алма-Лит», 20031 130 с.

34. Равилов, А.З. Хламидиоз животных / А.З. Равилов, Х.З. Гаффаров, Р.Х. Равилов // Казань: «Фэн», 2004. 368 с.

35. Ременцова, М.М. Антропозоонозы в звероводческих хозяйствах / М.М. Ременцова, О.В. Постричева, С.И. Рыбалко // Алма-Ата: Наука, 1983. 176 с.

36. Садриев, А.Р. Иммунохимический анализ и геноидентификация хламидий. Дисс. . канд. биол. наук. - Казань, 1999. — 137 с.

37. Теоретические основы полимеразной цепной реакции электронный ресурс. М.: ДНК-технология, 1998. - режим доступа: www.dna-technology.ru, свободный.

38. Терских, И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции // И.И. Терских / М.: Медицина, 1979. 223 с.

39. Тихоненко, Т.И. Получение и характеристика высокополимерных дезоксирибонуклеиновых кислот из бактериофагов / Т.И. Тихоненко // Ж. Биохимия. 1962. - Т. 27. - Вып. 6. - С. 1015-1021.

40. Улендеев, А.И. Материалы по изучению респираторных заболеваний телят / А.И. Улендеев, А.А. Деханов // Тез. докл. Всесоюзной межвузовской конференции по вет. вирусологии. М., 1971. - Ч. 2. - С. 48-50.

41. Урацил-ДНК-гликозилаза — снижение риска контаминации продуктами амплификации электронный ресурс. ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. -режим доступа: www.pcr.ru, свободный.

42. Фаизов, Т.Х. Произвольные праймеры: новые возможности идентификации бактерий / Т.Х. Фаизов, Н.М. Гришкевич, A.M. Алимов // Матер. Междунар. научн. конф. посвящ. 125-летию КГАВМ Казань, 1998а.-Т. 4.1.-С. 90-91.

43. Федоров Н.А., Ёлов А.А., Павлов С.А., Лихонин А.Г. Бактериальная безопасность компонентов крови: источники, детекция и частота риска инфекций. ФГУ «Центральная станция переливания крови Росздрава» в г. Москве.

44. Хазипов, Н.З. Хламидиозы сельскохозяйственных животных / Н.З. Хазипов, А.З. Равилов // М.: Колос, 1984. 223с.

45. Хамадеев, Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней. — Автореф. дис. . докт. вет. наук. — Казань, 1991. 40 с.

46. Шаткин, А.А. Основные принципы лабораторной диагностики гальпровиозов (хламидиозов) / А.А. Шаткин // Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М., 1979. - Вып. 1. — С. 25-36.

47. Шафикова, Р.А. Иммунобиологическая характеристика хламидий, усовершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов: Автореф. дис. докт. вет. наук. Казань, 1991. - 38с.

48. Эйделыптейн, И.А. Фундаментальные изменения в классификации хламидий и родственных им микроорганизмов порядка Chlamydiales / И.А. Эйделыптейн // КМАХ. 1999. - Т. l.-№ 1.-С. 5-11.

49. Эйделыптейн, И.А. Разработка молекулярно-генетических методов для выявления и дифференциации представителей Chlamydiaceae. Дис. . канд. биол. наук. - Смоленск, 2004. — 118 с.

50. Abdelrahman, Y.M. The chlamydial developmental cycle / Y.M. Abdelrahman, R.J. Belland // FEMS Microbiol. Rev. 2005. - V. 29. - № 5. - P. 949-959.

51. Abravaya, K. Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications / K. Abravaya, J. Huff, R. Marshall, B. Merchant, C. Mullen, G. Schneider, h Robinson // Clin. Chem: Lab. Med. 2003. - V. 41. - № 4. - P. 468 - 474.

52. Ada, G.L. Yield of infective ribonucleic acid from impure Murray Valley encephalitis virus after different treatments / G.L. Ada, S.G. Anderson // Nature. 1959. -V. 183. -№ 4664. - P. 799-800.

53. Agrawal, H.O. Isolation of high-molecular-weight, P32-labeled influenza virus ribonucleic acid / H.O. Agrawal, G. Bruening // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -1966. V. 55. - № 4. - P. 818-825.

54. Ahmadian, A. Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing / A. Ahmadian, B. Gharizadeh, A.C. Gustafsson, F. Sterky, P. Nyren, M. Uhlen, J. Lundeberg // Anal. Biochem. 2000. - V. 280. - № 1. - P. 103-110.

55. Ailenberg, M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS) / M. Ailenberg, M. Silverman // Biotechniques. 2000. - V. 29. № 5. - P. 1018-1020.

56. Alexander, H.E. Infectivity of ribonucleic acid from poliovirus in human cell monolayers / H.E. Alexander, G. Koch, I.M. Mountain, O. Van Damme // J. Exp. Med. 1958. -V. 108. -№ 4. -P. 493-506.

57. Amann, R. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia- spp. / R. Amann, N. Springer, W. Schonhuber, W. Ludwig, E.N. Schmid, K.D. Muller, R. Michel // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -№'1.-P. 115-121.

58. An, L. Characterization of a thermostable UvrD helicase and its participation in helicase-dependent amplification / L. An, W. Tang, T.A. Ranalli, H.J. Kim, J. Wytiaz, H. Kong // J. Biol. Chem. 2005. - V. 280: - № 321 - P. 28952-28958.

59. Andersen, A.A. Serotyping of Chlamydia psittaci isolates using serovar-specific monoclonal antibodies withthe-microimmunofluorescence test/ A.A. Andersen // J: Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. - № 4. - P: 707-711.

60. Andersen, A.A. Two new serovars of Chlamydia psittaci from'North* American birds / A.A. Andersen // J. Vet. Diagn. Invest. 1997. - V. 9. - № 2. - P. 159164.

61. Andersen, A.A. Serotyping of C. psittaci isolates from ratites / A.A. Andersen, J.E. Grimes, H.L. Shivaprasad // J. Vet. Diagn. Invest. 1998a. - № 10. - P. 186-188.

62. Andersen, A.A. Avian chlamydiosis / A.A. Andersen, D. Vanrompay // OIE Revue Scientifique et Technique. 2000. - V. 19. - № 2. - P. 396-404.

63. Andersen, A.A. Avian chlamydiosis / A.A. Andersen, D. Vanrompay // Edited by Y.M. Saif. In Diseases of Poultry, 11th edition. — Iowa State Press, Ames, Iowa, 2003.-P. 863-878.

64. Appleyard, W.T. Attempted venereal transmission of Chlamydia psittaci in sheep / W.T. Appleyard, I.D. Aitken, I.E. Anderson // Yet. Rec. 1985. - Y. 116.-№20. -P. 535-538.

65. Ashkenas, J. Simple enzymatic means to neutralize DNA contamination in nucleic acid amplification / J. Ashkenas, J.W. Dennis, C.Y. Ho // BioTechniques. 2005. - V. 39. - № 1. - P. 69-73.

66. Ausubel F.M. Short protocols in molecular biology / F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl // Third edition. Wiley. - 1995.

67. Bachrach, H.L. Thermal degradation of foot-and-mouth disease virus into infectious ribonucleic acid / H.L. Bachrach // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. — 1961.-№ 107.-P. 610-613.

68. Baker, J.A. Virus causing pneumonia in cats and producing elementary bodies / J.A. Baker // J. Exp. Med. 1944. - V. 19: - P. 159.

69. Balin, B.J. Identification and localization of Chlamydiae pneumoniae in the-Alzheimer's brain / B.J. Balin, H.C. Gerard, E.J. Arking, D.M. Appelt, P.J.

70. Branigan, J.T. Abrams, J.A. Whittum-Hudson, A.P. Hudson // Med. Microbiol. Immunol. 1998. -V. 187. - № 1. - p. 23-42.

71. Barany F. The ligase chain reaction in a PCR world / F. Barany 11PCR Methods Appl. 1991. -V. 1. — № l.-P. 5-16.

72. Barany, F. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions / F. Barany, M. Lubin, P. Belgrader // US Patent. -2001. -№ 6268148.

73. Barron, A.L. Microbiology of Chlamydia // A.L. Barron // Boca Raton, FL, USA: CRC Press. 1988.

74. Batteiger, B:E. The major outer membrane protein of a single Chlamydia trachomatis serovar can possess more than one serovar-specific epitope / B.E. Batteiger // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - № 2. - P. 542-547.

75. Becker, Y. Electron microscopy of Vaccinia virus DNA / Y. Becker, I. Sarov // J. Mol. Biol. 1968. - V. 34. - № 3. - P. 655-660.

76. Beld, M. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms / M. Beld, C. Sol, J. Goudsmit, R. Boom // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24.-№ 13.-P. 2618-2619.

77. Berger, L. Chlamydia pneumoniae in a free-ranging giant barred, frog (Mixophyes iteratus). from Australia / L. Berger, K. Volp, S. Mathews, R. Speare, P. Timms // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. - № 7." - P. 2378-2380.

78. Bernard, P.S. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping / P.S. Bernard, G.H. Pritham, C.T. Wittwer // Analytycal Biochemistry. 1999. - V. 273. - № 2. - P. 221-228.

79. Birch, L. A comparison of nucleic acid amplification techniques for the assessment of bacterial viability / L. Birch, C.E. Dawson, J.H. Cornett, J.T. Keer // Letters in Applied Microbiology. 2001. - V. 33. - № 4. - P. 296 - 301.

80. Birnboim, H.C. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA / H.C. Birnboim, J. Doly // Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. -№6.-P. 1513-1523.

81. Birtles, R.J. Chlamydia like obligate parasite of freeliving amoebae / R.J. Birtles, T.J: Rowbotham, C. Storey, T.J. Marrie, D. Raoult // Lancet. 1997. -V. 349. - № 9056. - P. 925-926.

82. Bishop, J.M. Purification and characterization of poliovirus-induced infectious double-stranded ribonucleic acid / J.M. Bishop, G. Koch // J. Biol. Chem. -1967. V. 242. - № 8. - P. 1736-1743.

83. Blumer, C. Chlamydiae in free-ranging and captive frogs in Switzerland / C. Blumer, D.R. Zimmermann, R: Weilenmann, L. Vaughan, A; Pospischil// Vet. Pathol. 2007. - V. 44. - № 2. - P. 144-150.

84. Boom, R. Rapid and Simple Mёthodi• for Purification^ of Nucleic Acids / R. Boom; C.J;,Sol; M;Mi Salimans^ C.E. Jansen* P:M; Wertheim-van Dillen, Ji vaniderNoordaa// J-Clih-Microbiol'. 1990: - V. 28: -№^3: -P: 495-503;. •

85. Borel; N. Parachlamydia spp. and related Chlamydia-like organisms and bovine abortion / N. Borel, S. Ruhl, N. Casson, C. Kaiser, A. Pospischil, G. Greub // Emerg. Infect. Dis. -2007. V. 13. -№12. -P. 1904-1907.

86. Bourgaux, P. Chromatographic separation of the various forms of polyoma virus DNA / P. Bourgaux, D. Bourgaux-Ramoisy // J. Gen. Virol. 1967. - V. 1. - № 3.-P. 323-32.

87. Bradley, T. Epitheliocystis associated with massive mortalities of cultured lake trout, Salvelinus namaycush / T. Bradley, C. Newcomer, K. Maxwell // Dis. Aquat. Organ. 1988. - V. 4. - P. 9-17.

88. Brown, F. The ribonucleic acids of the infective and interfering components of vesicular stomatitis virus / F. Brown, S.J. Martin, B. Cartwright, J. Crick // J. Gen. Virol. 1967. - V. 1. - № 4. - P. 479-486.

89. Carballeira, N. Purification of a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8, useful in the polymerase chain reaction / N. Carballeira, M. Nazabal, J. Brito, O. Garcia // Biotechniques. 1990. - V. 9: - № 3; - P. 276281.

90. Carlson, J.H. Comparative genomic analysis of Chlamydia trachomatis oculotropic and genitotropic strains / J.H. Carlson, S.F. Porcella, G. McClarty, H.D. Caldwell // Infect. Immun. 2005. - V. 73. - № 10. - P. 6407-6418.

91. Cartwright, S.F. Some applications of detergents to the study of the virus of foot-and-mouth disease / S.F. Cartwright, H.V. Thorne // J. Gen. Microbiol. -1959. V. 20. - №4. - P. 61-77.

92. Casson, N. Protochlamydia naegleriophila as etiologic agent of pneumonia / N. Casson, R. Michel, K.D. Muller, J.D. Aubert, G. Greub // Emerg. Infect. Dis. — 2008.-V. 14.-№ l.-P. 168-172.

93. Cello, R.M. Ocular infections in animals with PLT (Bedsonia) group agents / R.M. Cello // Am. J. Opthalmol. 1967. - V. 63. - № 5. - P. 1270-1274.

94. Chae, C. In situ hybridization for the detection and localization of swine Chlamydia trachomatis / C. Chae, D.S. Cheon, D. Kwon, O. Kim, B. Kim, J. Suh, D.G. Rogers, K.D. Everett, A.A. Andersen // Vet. Pathol. 1997. - V. 36. — № 2. — P. 133 - 137.

95. Chan, A.B. NASBA and other transcription-based amplification methods for research and diagnostic microbiology / A.B. Chan, J.D. Fox // Reviews in Medical Microbiology. 1999. - V. 10. - P. 185-196.

96. Chen, X. Homogenous genotyping assays for single nucleotide polymorphisms with fluorescence resonance energy transfer detection / X. Chen, P-Y. Kwok // Genet. Anal. Biomol. Eng. 1999. - V. 14. - № 5. - P. 157-163.

97. Chen, C.Y. Mutations at Arginine 276 transform human uracil-DNA glycosylase into a single-stranded DNA-specific uracil-DNA glycosylase / C.Y. Chen, D.W. Mosbaugh, S.E. Bennett // DNA Repair (Amst). 2005. - V. 4. - № 7. p; 793-805.

98. Cheng, S. Long PCR / S. Cheng, S.Y. Chang, P. Gravitt, R. Respess // Nature. -1994. V. 369 - № 6482. - P. 684-685.

99. Cheng, H. Relative accuracy of nucleic acid amplification tests and culture in detecting Chlamydia in asymptomatic men / H. Cheng, M. Macaluso, S.H. Vermund, E.W. Hook 3rd // Journal of Clinical Microbiology. — 2001. — V. 39. -№ 11.-P. 3927-3937.

100. Chien, A. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus / A. Chien, D.B. Edgar, J.M. Trela // J. Bacteriol. — 1976. — V. 1-27. №-3. - P. 1550-1557.

101. Choi, T.Y. Evaluation of serotyping using monoclonal antibodies and PCR-RFLP for Chlamydia trachomatis serotype identification / T.Y. Choi, D.A. Kim, Y.H. Seo// J. Korean Med. Sci.-2001. V. 16-№ l.p. 15.19.

102. Chomezynski, P. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction / P. Chomezynski, K. Mackey / Organelles and cellular structures. 1996. - V.10. - P.221-224.

103. Chua, P.K. Isolation of Waddlia malaysiensis, a novel intracellular bacterium, from fruit bat (Eonycteris spelaea) / P.K. Chua, J.E. Corkill, P.S. Hooi, S.C. Cheng, C. Winstanley, C.A. Hart // Emerg. Infect. Dis. 2005. - V. 11. - № 2 -P. 271-277.

104. Cimino, G.D. Post-PCR sterilization: A method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction / G.D. Cimino, K.C. Metchette, J.W. Tessman, J.E. Hearst, S.T. Isaacs // Nucleic Acids Res. 1990. V. 19. - № l.-P. 99-107.

105. Collingro, A. "Candidatus Protochlamydia amoebophila', an endosymbiont of Acanthamoeba spp." / A. Collingro, E.R. Toenshoff, M.W. Taylor, T.R. Fritsche, M. Wagner, M. Horn // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005b. - V. 55. -№5.-P. 1863-1866.

106. Corsaro, D. Pathogenic potential of novel Chlamydiae and diagnostic approaches to infections due to these obligate intracellular bacteria / D; Corsaro, G. Greub // Clin. Microbiol1. Rev. 2006. - V. 19. - № 2. - P: 283-297.

107. Corsaro, D. Emerging chlamydial" infections / D. Corsaro, D. Venditti // Crit. Rev. Microbiol. 2004. - V. 30. - № 3. - P. 75-106.

108. Cotton, R.G. Mutation detection by chemical cleavage / R.G. Cotton // Genet. Anal.-1999.-V. 14.-№5-6.-P. 165-168.

109. Cox, R.L. Deoxyribonucleic acid relatedness of Chlamydia sp. strain TWAR to Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci / R.L. Cox, C.-C. Kuo, J. T. Grayston, L.A. Campbell./ Int. J. Syst. Bacleriol. 1988. -Vol. 38. - P. 265268.

110. Darougar, S. Prevalence of antichlamydial antibody in London blood donors / S. Darougar, T. Forsey, D.A. Brewerton, K.L. Rogers // Brit. J. Vener. Dis. — 1980. V. 56. - № 6. - P. 404-407.

111. DeFilippes, F.M. Decontaminating the polymerase chain reaction / F.M. DeFilippes // BioTechniques. 1991. - V. 10. -№ 1. - P. 26-29.

112. DeGraves, F.J. High-sensitivity quantitative PCR platform / F.J. DeGraves, D: Gao,- B. Kaltenboeck // Biotechniques. 2003b: - V. 34: - № 1. - P. 106-110, 112-115.

113. Del Tito, B.J. Jr. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection- / B.J. Jr. Del Tito, H.E.3rd Poff, M.A. Novotny, D.M.

114. Cartledge, R.I.2nd Walker, C.D. Earl, A.L. Bailey // Clin. Chem. 1998. - V. 44. - № 4. - P. 731-739.

115. Devchand, P.R. Uracil-DNA glycosylase as a probe for protein~DNA interactions / P.R. Devchand, J.D. McGhee, J.H. van de Sande // Nucleic Acids Res. 1993'. - V. 21. - № 15. - P. 3437-3443.

116. Dilbeck-Robertson, P. Results of a new serologic test suggest an association of Waddlia chondrophila with bovine abortion / P. Dilbeck-Robertson, M.M. McAllister, D. Bradway, J.F. Evermann // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. — V. 15.-№6. -P. 568-569.

117. Dille, B.J. Amplification of Chlamydia trachomatis DNA by ligase chain reaction / B.J. Dille, C.C. Butzen, L.G. Birkenmeyer // J. Clin. Microbiol. -1993. V. 31. - № 3. - P. 729-731.

118. Don, R.H. «Touchdown» PCR to circumvent spurious priming during gene amplification / R.H. Don, P.T. Сох, В,J. Wainwright, K. Baker, J.S. Mattick // Nucl. Acids. Res. 199L - V. 19.>-№ -14.- - P. 4008.

119. Draghi, A.2nd Characterization of 'Candidatus Piscichlamydia salmonis' (order Chlamydiales), a Chlamydia-like bacterium associated' with epitheliocystis in farmed Atlantic salmon (Salmo salar) / A. 2nd Draghi, V.L. Popov VL, M.M.

120. Kahl, J.B. Stanton, C.C. Brown, G.J. Tsongalis, A.B. West, SJr. Frasca // J Clin Microbiol. 2004. - V. 42. - № 11. - P.5286-5297.

121. Duraffour, S. Substrate specificity of homogeneous monkeypox virus uracil-DNA glycosylase. / S. Duraffour, A.A. Ishchenko, M. Saparbaev, J.M. Crance, D. Garin // Biochemistry. 2007. - V. 46. - № 42. - P. 11874-11881.

122. Ehricht, R. Optimized DNA microarray assay allows detection and genotyping of single PCR-amplifiable target copies / R. Ehricht, P. Slickers, S. Goellner, H. Hotzel, K. Sachse // Mol. Cell. Probes. 2006. - V. 20. - № 1. - P. 60-63.

123. Ellis, R.W. Infection and coronary heart disease / R.W. Ellis // J Med Microbiol. 1997. - V.46. - № 7. - P. 535-539.

124. Everett, K.D. The ribosomal intergenic spacer and domain-L of the 23 S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. ■/ K.D. Everett, A.A. Andersen // Int. J. Syst. Bacterid. 1997. - V. 47. - № 2. - P. 461-473.

125. Everett, K.D. Identification of nine species of the Chlamydiaceae using PCR-RFLP / K.D. Everett, A.A. Andersen // Int. J. Syst. Bacterid. 1999a. - V. 49. -№2.-P. 803-813.

126. Everett, K.D. Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests / K.D. Everett, L.J. Hornung, A.A. Andersen // J. Clin. Microbiol. 1999c. - V. 37. - № 3. - P. 575-580.

127. Fahy, E. Self-sustained sequence replication (3SR): an isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR / E. Fahy, D.Y. Kwoh, T.R. Gingeras // PCR Methods Appl. 1991. - V. 1. - № 1. - P. 25-33.

128. Favis, R. Universal DNA array detection of small insertions and deletions in BRCA1 and BRCA2 / R. Favis, J.P. Day, N.P. Gerry, C. Phelan, S. Narod, F. Barany // Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - № 5. - P. 561-564.

129. Fiandaca, M.J. Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis / M.J. Fiandaca, J.J. Hyldig-Nielsen, B.D. Gildea, J.M. Coull // Genome Research. -2001. V. 11. - № 4. - P. 609-613.

130. Francis, T.J. An unidentified virus producing acute meningitis and pneumonia in experimental animals / T.J. Francis, T.PI Magill // J. Exp. Med. 1938*. — V. 68. -P.s 147-160.

131. Fukano, H. Comparison- of five PCR assays for detecting Chlamydophila* pneumoniae DNA / H: Fukano // Microbiol. Immunol. — 2004. V. 48. - № 6. — P. 441-448.

132. Fukushi, H. Monoclonal antibody typing of Chlamydia psittaci strains derived from avian and mammalian species / H. Fukushi, K. Nojiri, K. Hirai // J. Clin. Microbiol.-1987.-V. 25.-№ 10.-P. 1978-1981.

133. Fukushi, H. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants / H. Fukushi, K. Hirai // Int. J. Syst. Bacterid. 1992. -V. 42.-№2.-P. 306-308.

134. Furrer, B. Improving PCR efficiency / B. Furrer, U. Candrian, P. Wieland, J. Luthy // Nature. 1990. - V. 346. - № 6282. - P. 324.

135. Gafford, L.G. The high molecular weight of the fowlpox virus genome / L.G. Gafford, C.C. Randall // Jt Mol. Biol. 1967. - V. 26. - № 2. - P. 303-310.

136. Gaillard, E.T. Pathogenesis of feline gastric chlamydial infection / E.T. Gaillard, A.M. Hargis, D.J. Prieur, J.F. Evermann, A.S. Dhillon // Am. J. Vet. Res. -1984.-V. 45.11.-P. 2314-2321.

137. Garrett, A.J. Some properties of the polysaccharide from cell cultures infected with TRIG agent (Chlamydia trachomatis) / A.J. Garrett // J. Gen. Microbiol. — 1975.-Vol. 90.-P. 133-139.

138. Gatti R.A. Modified SSCP method using sequential electrophoresis of multiple nucleic acid segments. United States Patent. 2002. - № 6458536.

139. Geens, T. Sequencing of the Chlamydophila psittaci ompA gene reveals a new genotype, E/B, and the need for a rapid discriminatory genotyping method / T.

140. Geens, A. Desplanques, M. Van Loock, B.M. Bonner, E.F. Kaleta, S. Magnino, A.A. Andersen, K.D. Everett, D. Vanrompay // J. Clin. Microbiol. 2005a. - V. 43.-№5.-P. 2456-2461.

141. Geens, T. Development of a Chlamydophila psittaci species-specific and genotype-specific real-time PCR / T. Geens, A. Dewitte, N. Boon, D. Vanrompay // Vet. Res. 2005b. - V. 36. - № 5-6. - P. 787-797.

142. Gethings, P.M. Prevalence of Chlamydia, toxoplasma, toxocara and ringworm in farm cats in south-west England / P.M. Gethings, G.L. Stephens, J.M. Wills, P. Howard, A.H. Balfour, A.L Wright, K.L. Morgan // Vet. Rec. 1987. - V. 121. -№ 10.-P. 213-216.

143. Gierer, A. Infectivity of ribonucleic acid from tobacco mosaic virus / A. Gierer, G. Schramm / Nature. 1956. - V. 177. - P. 702-703.

144. Gill, P. Nucleic acid isothermal amplification technologies:, a review. Nucleosides Nucleotides / P. Gill, A. Ghaemi // Nucleic Acids. 2008. - V. 27. - № 3 - P. 224-243.

145. Gingeras, T.R. Unique features of the self-sustained sequence replication (3SR) reaction in the in vitro amplification of nucleic acids / T.R. Gingeras, K.M. Whitfield, D.Y. Kwoh // Ann. Biol. Clin. (Paris). 1990. - V. 48. - № 7. - P. 498-501.

146. Girjes, A.A. Lipopolysaccharide1 biosynthesis genes in koala type I Chlamydia: cloning and. characterization / A.A. Girjes, F.N. Carrick, M.F. Lavin // Res. Microbiol. 1997.-V. 148. -№ 5. -P. 413-425.

147. Girjes, A.A. Comparison! of type I and type II Chlamydia psittaci» strains infecting koalas (Phascolarctos cinereus) / A.A. Girjes, A. Hugall, D.M:

148. Graham, T.F. McCaul, M.F. Lavin // Vet. Microbiol. 1993. - V. 37. - № 1-2. -P. 65-83.

149. Glassick, T. Outer membrane protein 2 gene sequences indicate that Chlamydia pecorum and Chlamydia pneumoniae cause infections in koalas / T. Glassick, P. Giffard, P. Timms // System. Appl. Microbiol. 1996. - V. 19. - № 3. - P. 457464.

150. Goldmeyer, J. Development of a novel one-tube isothermal reverse transcription thermophilic helicase-dependent amplification platform for rapid RNA detection / J. Goldmeyer, H. Kong, W. Tang // J. Mol. Diagn. 2007. - V. 9. - № 5. - P. 639-644.

151. Gordon, F.B. Observations on guinea pig inclusion conjunctivitis agent / F. B. Gordon, E. Weiss, A.L. Quan, H.R. Dressier // J. Infect. Dis. 1966. - V. 116. -P. 203-207.

152. Goy, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages / G. Goy, A. Croxatto, G. Greub // Microbes Infect. 2008. - V. 10. - № 5. - P. 556- 562.

153. Graber, J.H. Differential sequencing with mass spectrometry / J.H. Graber, C.L. Smith, C. Cantor// Genet. Anal. 1999. -V. 14. -№ 5-6. - P. 215-219.

154. Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR / J. T. Grayston, C.-C. Kuo, L. A. Campbell, S.-P. Wang // Int. J. Syst. Bacteriol. 19891 — V. 39.-P. 88-90.

155. Greub, G. Parachlamydiaceae as rare agents of pneumonia / G. Greub, P. Berger, L. Papazian, D. Raoult // Emerg. Infect. Dis. 2003 - V. 9. - № 6. - P. 755-756.

156. Greub, G., Parachlamydiaceae:-potential emerging pathogens / G. Greub, D. Raoult // Emerging Infect. Dis. 2002. - V. 8. - № 6. - P. 625-630.

157. Greub, G. History of the ADP/ATP-Translocase-Encoding Gene, a Parasitism Gene Transferred from a Chlamydiales Ancestor to Plants 1 Billion Years Ago /

158. G. Greub, D. Raoult // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 9. - P. 5530-5535.

159. Grieg, J.R. Enzootic abortion in ewes. A preliminary note / J.R. Grieg // Vet. Rec. 1936. - V. 48. - P. 1225-1232.

160. Griffin, T.J. Direct genetic analysis by matrix assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry / T.J. Griffin, J.G. Hall, J.R. Prudent, L.M. Smith 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. - V. 96. - № 11. - P. 6301-6306.

161. Grimes, J.E. Chlamydia psittaci infection of pet and other birds in the United States in 1984 / J.E. Grimes, D. Clark // J. Infect. Dis. 1986. -V. 153. - P. 374375.

162. Hacia, J.G. Mutational analysis using oligonucleotide microarrays / J.G. Hacia, F.S. Collins 11 J. Med. Genet. 1999. - V. 36. - № 10. - P. 730-736.

163. Harkinezhad, T. Chlamydophila psittaci genotype E/B transmission from African grey parrots to humans / T. Harkinezhad, K. Verminnen, C. Van Droogenbroeck, D. Vanrompay // J. Med. Microbiol. 2007. - V. 56. - № 8. P. 1097-1100.

164. Harrison, GJ. A practitioner's view of the problem of avian chlamydiosis / G.J. Harrison//J. Am. Vet. Med. Assoc. 1989.-V. 195.-№ 11.-P. 1525-1528.

165. Hartley, J.C. PCR detection and molecular identification of Chlamydiaceae species / J.C. Hartley, S. Kaye, S. Stevenson, J. Bennett, G. Ridgway // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - №-9. - P. 3072-3079.

166. Hartley, J.L. Dealing with contamination: enzymatic control of carryover contamination in PCR / J.L. Hartley, A. Rashtchian // PCR Methods. Appl. -1993. — V. 3. — № 2. P. 10-14.

167. Heddema, E.R. Genotyping of Chlamydophila psittaci in human samples / E.R. Heddema, E.J. van Hannen, B. Duim, C.M. Vandenbroucke-Grauls, Y. Pannekoek // Emerg. Infect. Dis. 2006. - V. 12. - № 12. - P. 1989-1990;

168. Heid, C.A. Real time quantitative PCR / C.A. Heid, J. Stevens, K.J. Livak, P.M. Williams // Genome Res. 1996. - V. 6. - № 10. - P: 986-994.

169. Heinz, E. An Acanthamoeba sp. containing two phylogenetically different bacterial endosymbionts / E. Heinz, I. Kolarov, C. Kastner, E.R. Toenshoff, M. Wagner, M. Horn // Environ. Microbiol. 2007. - V. 9. - № 6. - P. 1604-1609.

170. Helps, C. Detection of Chlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis / C. Helps, N. Reeves, K. Egan, P. Howard, D. Harbour //J. Clin. Microbiol. -2003. -V. 41. -№ 6. P. 2734-2736.

171. Helps, C. Use of real-time quantitative PCR to detect Chlamydophila felis infection / C. Helps, N. Reeves, S. Tasker, D. Harbour // J. Clin. Microbiol. — 2001.-V. 39.-№7.-P. 2675-2676.

172. Herrmann, B. Chlamydophila psittaci in Fulmars, the Faroe Islands / B. Herrmann, H. Persson, J.K. Jensen, H.D. Joensen, M. Klint, B. Olsen // Emerg. Infect. Dis. 2006. - V. 12. - № 2. - P. 330-332.

173. Herrmann, B. Chlamydophila abortus in a-Brown skua (Catharacta antarctica lonnbergi) from a subantarctic island / B. Herrmann, R. Rahman, S. Bergstrom, J. Bonnedahl, B. Olsen / Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - № 8. - P. 3654-3656.

174. Hewinson, R.G. Detection of Chlamydia psitaci DNA in avian clinical samples by polymerase chain reaction / R.G. Hewinson, P.C. Griffiths, B.J. Bevan, S.E. Kirwan, M.E. Field, M.J. Woodward, M. Dawson // Vet. Microbiol. 1997. -V. 54.-№2.-P. 155-166.

175. Higuchi, R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions/ R. Higuchi, C. Fockler, G. Dollinger, R. Watson // Biotechnology. — 1993.-V. 11. № 9. - P. 1026-1030.

176. Hjelm, E. Cervical, urine and vaginal specimens for detection of Chlamydia trachomatis by ligase chain reaction in women: a comparison / E. Hjelm, A. Hallen, M. Domeika // Acta Derm. Venereol. 2001. - V. 81. - № 4. - P. 285288.

177. Hoffman, G.L. Epitheliocystis, a new infectious disease of the bluegill (Lepomis macrochirus) / G.L. Hoffman, C.E. Dunbar, K. Wolf, L.O. Zwillenberg // Antonie Van Leeuwenhoek. 1969. - V. 35. - № 2. - P. 146-158.

178. Hongyo, T. «Cold SSCP»: a simple, rapid and non-radioactive method for optimized single-strand conformation polymorphism analyses / T. Hongyo, G.S. Buzard, R.J. Calvert, C.M. Weghorst // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - № 16.-P. 3637-3642.

179. Hortzel, H. Genetic characterisation of Chlamydophila pneumoniae isolate from an African frog* and comparison to currently accepted biovars / H. Hortzel, E. Grossmann, F. Mutschmann, K. Sachse // Syst. Appl. Microbiol. 2001. - V. 24.- № l.-P: 63-66.

180. Hosoda К. Kinetic analysis of the entire RNA amplification process by Qbeta replicase / K. Hosoda, T. Matsuura, H. Kita, N. Ichihashi, K. Tsukada, T. Yomo // J. Biol. Chem. 2007. - V. 282. - № 21. - P. 15516-15527.

181. Howard, J.T. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease / J.T. Howard, J. Ward, J.N. Watson, K.H. Roux // Biotechniques. 1999. - V. 27. - № 1. - P. 18-19.

182. Huang, J. Quantitative detection of Chlamydia spp. by fluorescent PCR in the LightCycler / J. Huang, F.J. DeGraves, D. Gao, P. Feng, T. Schlapp, B. Kaltenboeck // Biotechniques. 2001. - V. 30. - № 1. - P. 150-157.

183. Instruction manual, DyNAmo™ Capillary SYBR® Green 2-Step qRT-PCR Kit (Distributed by New England Biolabs, Version 1.2. — 2005. режим доступа: www.finnzymes.com.

184. Jackson, L.A. Isolation of Chlamydia pneumoniae from a carotid endarterectomy specimen / L.A. Jackson, L.A. Campbell, C.C. Kuo, D.I. Rodriguez, A. Lee, J.T. Grayston // J. Infect. Dis. 1997 - V. - 176. - № 1. - P. 292-295.

185. Jackson, M. Outer membrane protein A gene sequencing demonstrates the polyphyletic nature of koala C. pecorum isolates / M. Jackson, P. Giffard, P. Timms // Syst. Appl. Microbiol. 1997. - V. 20. - P. 187-200.

186. Jackson, P.E. Mass spectrometry for genotyping: an emerging tool for molecular medicine / P.E. Jackson, P.F. Scholl, J.D. Groopman // Mol. Med. Today. -2000. V. 6. - № 7. - P. 271-276.

187. Jalal, H. Development of real-time PCR assays for genotyping of Chlamydia trachomatis / H. Jalal, H. Stephen, S. Alexander, C. Carne, C. Sonnex // J. Clin. Microbiol. 2007. - V. 45. -№ 8.,-P. 2649-2653.

188. Jee, J. High prevalence of natural'Chlamydophila1 species infection in calves / J. Jee, F.J. Degraves, T. Kim, B. Kaltenboeck // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42.-№12.-P. 5664-5672.

189. Jinno, Y. Use of psoralen as extinguisher of contaminated DNA in PCR / Y. Jinno, K. Yoshiura, N. Niikawa // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - № 22. -P. 6739.

190. Jorgensen, D.M. Gestational psittacosis in a Montana sheep rancher / D.M. Jorgensen // Emerg. Infect. Dis. 1997. - V. 3 - № 2. - P. 191-194.

191. Kacian, D.L. Methods for assaying reverse transcription / D.L. Kacian // Edited by Maramorosch et al. In Methods in Virology. — Academic Press Inc., London, 1977.-P. 143-184.

192. Kahane, S. Description and partial characterization of a new chlamydia-like microorganism / S. Kahane, R. Gonen, C. Sayada, J. Elion, M.G. Friedman // FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 109. - № 2-3. - P. 329-334.

193. Kahane, S. Simkania negevensis strain ZT: growth, antigenic and genome characteristics / S. Kahane, K.D. Everett, N. Kimmel, M.G. Friedman // Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. -V. 49. -№ 2. - P. 815-820.

194. Kalman, S. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis / S. Kalman, W. Mitchell, R. Marathe, C. Lammel, J. Fan, R.W. Hyman, L. dinger, J. Grimwood, R.W. Davis, R.S. Stephens // Nature Genet. 1999. - V. 21.-№4.-P. 385-389.

195. Kaltenboeck, B. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction / B. Kaltenboeck, K.G. Kousoulas, J. Storz // J. Clin. Microbiol. 1991. - V. 29. - № 9. - P. 19691975.

196. Kaltenboeck, B. Biological properties and genetic analysis of the ompA locus in chlamydiae isolated from swine / B. Kaltenboeck, J. Storz // Am. J. Vet. Res. -1992. V. 53. - № 9: - P. 1482-1487.

197. Kaltenboeck, B. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompA) genes of the four chlamydial species / B. Kaltenboeck, K. G. Kousoulas, J. Storz // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - № 2. -P. 487-502.

198. Kaltenboeck, В. Evidence for numerous ompl alleles of porcine Chlamydia trachomatis and novel chlamydial species obtained by PCR / B. Kaltenboeck, N. Schmeer, R. Schneider // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - № 7. - P. 18351841.

199. Karlsen, M. Characterization of'Candidatus Clavochlamydia salmonicola1: an intracellular bacterium infecting salmonid fish / M. Karlsen, A. Nylund, K. Watanabe, J.V. Helvik, S. Nylund, H. Plarre // Environ. Microbiol. 2008. - V. 10.-№ l.-P. 208-218.

200. Kilger, C. Direct DNA sequence determination from total genomic DNA / C. Kilger, S. Paabo // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. -№ 10. - P. 2032-2034.

201. Kleiboeker, S.B* Quantitative assessment1 of the. effect : of uracilrDNA glycosylase on amplicon DNA degradation and RNA amplification in reverse transcription-PCR / S.B. Kleiboeker // Virol: J. 2005. - V; 2. - P. 29.

202. Klinger, E. /Е. Klinger, P. Choppin, G. Dubs //Proc.Soc.Exp.Biol.Med: 1959. -V. 101.

203. Kristensen, T. High throughput; screening .for known5 mutations by automated analysis of single sequencing reactions (SSR) / T. Kristensen, V. Nedclcheva Kj-istensen; A-L. Bon-esen-Dale // BioTechniques. 1998. - V. 24. - № 5. - P.•" 832-835. .

204. Krusong, К. A comparative study of uracil-DNA glycosylases from human and herpes simplex virus type 1 / K. Krusong, E.P. Carpenter, S.R. Bellamy, R. Sawa, G.S. Baldwin // J. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - № 8. - P. 4983-4992.

205. Kuo, C.-C. Chlamydia pneumoniae (TWAR) / C.-C. Kuo, L.A. Jackson, L.A. Campbell, J.T. Grayston // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - Y. 8. - № 4. - P. 451-461.

206. Kuoppa, Y. Quantitative detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by real-time PCR / Y. Kuoppa, J. Boman, L. Scott, U. Kumlin, I. Eriksson, A. Allard // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - № 6. - P. 22732274.

207. Kwok, S. Avoiding false positives with PCR / S. Kwok, R. Higuchi // Nature. -1989. V. 339. - № 6221. - P. 237-238.

208. Lan, J. Improved PCR sensitivity for direct genotyping of Chlamydia trachomatis, serovars by using a nested, PCR / J. Lan, J.M. Ossewaarde, J.M. Walboomers, C.J. Meijer, A.J. van den Brule // J. Clin. Microbiol. 1994. - V. 32'.-№2.-P. 528-530.

209. Leutenegger, C.M. The Real-Time TaqMan PCR and Applications in Veterinary Medicine / C.M. Leutenegger // Veterinary Sciences Tomorrow. 2001. — № 1. - режим доступа: www.vetscite.org/issuel/tools/leut0800.pdf.

210. Lindahl, T. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli / T. Lindahl, S. Ljungquist, W. Siegert, B. Nyberg, B*. Sperens // J. Biol. Chem.- 1977. V. 252. -№ 10.-PI 3286-3294.

211. Little, D.P. Mass spectrometry from miniaturized arrays for full' comparative1 DNA analysis / D.P. Little, A. Braun, M.J. Donnel, H. Koester // Nat. Med: -1997. -V. 3. -№ 12. P. 1413-1416.

212. Little, M.C. Strand displacement amplification and homogeneous real-time detection incorporated in a second-generation DNA probe system,

213. BDProbeTecET / М.С. Little, J. Andrews, R. Moore, S. Bustos, L. Jones, C. Embres, G. Durmowicz, J. Harris, D. Berger, K. Yanson, C. Rostkowski, D. Yursis, J. Price, T. Fort, A. Walters, M. Collis, O. Llorin, J. Wood, F. Failing,

214. C. O'Keefe, B. Scrivens, P. Pope, T. Hansen, K. Marino, K. Williams et al // Clinical Chemistry. 1999. - V. 45. - № 6. - P. 777 - 784.

215. Liu, B.L. Molecular characterization of a bacteriophage (Chp2) from Chlamydia psittaci / B.L. Liu, J.S. Everson, B. Fane, P. Giannikopoulou, E. Vretou, P.R. Lambden, I.N. Clarke // J. Virol. 2000. - V. 74. - № 8. - P. 3464-3469.

216. Lizardi, P.M. Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification / P.M. Lizardi, X. Huang, Z. Zhu, P. Bray-Ward,

217. D.C. Thomas, D.C. Ward // Nat. Genet. 1998. - V. 19. - № 3. - P. 225-232.

218. Longo, M.C. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions / M.C. Longo, M.S. Berninger, J.L. Hartley//Gene.-1990.-V. 93.-№ l.-P. 125-128.

219. Lusher, M. Plasmid diversity within the genus Chlamydia / M. Lusher, C.C> Storey, S.J. Richmond // J. Gen. Microbiol. 1989. - V. 135. - № 5. - P. 11451151.

220. Mair, T.S. Chlamydia psittaci infection in horses: results of a prevalence survey and experimental challenge / T.S. Mair, J.M. Wills // Vet. Rec. 1992. - V. 130. -№ 19.-P. 417-419.

221. Marmur, J. A procedure for isolation of DNA from microorganisms / J. Marmur // J. Mol. Biol. 1961. - V.3. - P.208-218.

222. Marras, S.A. Multiplex detection of single nucleotide variations using molecular beacons / S.A. Marras, F.R. Kramer, S. Tyagi // Genet. Anal. Biomol. Eng. -1999.-V. 14.-№5-6.-P. 151-156.

223. Marras, S.A. Genotyping SNPs with molecular beacons / S.A. Marras, F.R. Kramer, S. Tyagi // Methods Mol. Biol. 2003. - V. 212. - P. 111-128.

224. Mathews, S.A. Development of a quantitative gene expression assay for Chlamydia trachomatis identified temporal expression of sigma factors / S.A. Mathews, K.Mi Volp, P. Timms // FEBS Eett. 1999. - V. 458. - № 3. - P. 354-358. '

225. May, S.W. Virulence of feline Chlamydia psittaci in mice is not a function of the major outer membrane protein / S.W. May, C.L. Kelling, M. Sabara, J. Sandbulte // Vet. Microbiol. 1996. - V. 53. - № 3-4. - P. 355-368.

226. Medrano, J.F. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification / J.F. Medrano, E. Aguilar-Cordova / Bio/Technology. — 1990. -V. 8.-P. 144-146.

227. Meijer, A. Chlamydophila abortus infection in a pregnant, woman associated with indirect contact with infected goats / A. Meijer, A. Brandenburg, J. de

228. Vries, J. Beentjes, P. Roholl, D. Dercksen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 2004. V. 23. - № 6. - P. 487-490.

229. Meijer, A. Genomic relatedness of Chlamydia isolates determined by amplified fragment length polymorphism analysis / A. Meijer, S.A. Morre, A.J. van den Brule, P.H. Savelkoul, J.M. Ossewaarde// J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - № 15.-P. 4469-4475.

230. Messmer, Т.О. Application;of a nested, multiplex PCR to psittacosis outbreaks / Т.О. Messmer, S.K. Skelton, J.F. Moroncy, H. Daugharty, B.S. Fields // J. Clin. Microbiol: 1997. - V. 35; - № 8. - P; 2043-2046.

231. Meyer, K.F. Ornithosis / K.F. Meyer // Edited by H.E. Biester et al. In Diseasetbof Poultry, 5 edition; Iowa.State University Press, Ames, Iowa, USA, 1965. -P. 1-675.

232. Mhlanga, M.M. Using molecular beacons to detect single-nuclcotide polymorphisms with real-time::PCR / MM. Mhlanga^ B. Malmberg // Methods.• ;-200r.-V.25:-№4.-P:463-47K .

233. Miyashita, N: The morphology of Chlamydia pneumoniae / N. Miyashita, Y. Kanamoto-yA. Matsumotoi//^^JrMediMicrobiol.^1993^ V.-38i- № 6^- Pf;41'8'•■ 425. ' ' '■--'.

234. Miyashita, N. Evaluation of the diagnostic: usefulness of real-time PCR for detection of Chlamydophila'pneumoniae in acute respiratory infections / N.

235. Miyashita, Y. Obase, M. Fukuda, H. Shouji, K. Yoshida, K. Ouchi, M. Oka // J. Infect. Chemother. 2007. -V. 13. -№ 3. - P. 183-187.

236. Moulder, J.W. Genus Chlamydia / J.W. Moulder, T.P. Hatch, C.-C.Kuo, J. Schachter, J. Storz // Edited by N. R. Krieg et al. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. - 1984 - V. 1. - P. 729-739.

237. Mullis, K.B. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction / K.B. Mullis // Ann. Biol. Clin. (Paris). 1990. - V. 48. - № 8. - P. 579-582.

238. Mullis, K. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain,reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Нот, H. Erlich // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986. - V. 51. - № 1. - P. 263-273.

239. Mullis, K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain,reaction / K.B. Mullis, F.A. Faloona // Methods Enzymol. 1987. — V. 155.-P. 335-350.*

240. Murray, E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the psittacosislymphogranuloma-trachoma group / E.S. Murray // J. Infect. Dis. 1964. - V. 114. - P. 1-12.

241. Myers, T.W. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase / T.W. Myers, D.H. Gelfand // Biochemistry. -1991 V. 30. - № 31. - P. 7661-7666.

242. Mygind, P. Analysis of the humoral immune response to Chlamydia outer membrane protein 2 / P. Mygind, G. Christiansen, K. Persson, S. Birkelund // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. -V. 5. -№ 3. - P. 313-318.

243. Nelson, N.C. Detection of all single-base mismatches in solution by chemiluminescence / N.C. Nelson, P.W. Hammond, E. Matsuda, A.A. Goud, M.M. Becker // Nucleic Acids Res. 1996. - V. 24. - № 24. - P. 4998-5003.

244. Niederhauser, C. Reliability of PCR decontamination systems / C. Niederhauser, C. Hofelein, B. Wegmuller, J. Luthy, U. Candrian // PCR Methods Appl. -1994.-V. 4.-№2.-P. 117-123.

245. Nigg, C. Unidentified virus which produces pneumonia and systemic infection in mice / C. Nigg // Science. 1942. - V. 95. - P. 49-50.

246. Nikkari, S. Ligase chain reaction in detection of Chlamydia DNA in synovial fluid cells / S. Nikkari, M. Puolakkainen, U. Yli-Kerttula, R. Luukkainen, O.P. Lehtonen, P. Toivanen // Br. J. Rheumatol. 1997. - V. 36. - № 7. - P. 763 -765.

247. Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA / T. Notomi, H. Okayama, H. Masubuchi, T. Yonekawa, K. Watanabe, N. Amino, T. Hase // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - № 12. - P. E63.

248. Nowak, B.F. Epitheliocystis in fish / B.F. Nowak, S.E. LaPatra // J Fish Dis. df 2006. - V. 29. - № 10. - P. 573-588.

249. Nylund, A. A morphological study of the epitheliocystis agent in farmed Atlantic salmon / A. Nylund, A. Kvenseth, E. Isdal // J. Aquat. Anim. Health. — 1998.-Y. 10.-P. 43-55.

250. Page, L.A. Comparison of pathotypes among chlamydial (psittacosis) strains recovered from diseased birds and mammals / L.A. Page // Bull. Wildlife Dis. Assoc.-1967.-V. 2.-P. 166-175.

251. Page, L.A. Proposal for the recognition of two species in the genus Chlamydia / L.A. Page // J. Syst. Bacteriol. 1968. - V. 18. - P. 51-66.

252. Pang, J. Use of modified nucleotides and uracil-DNA glycosylase (UNG) for the control of contamination in the PCR-based amplification of RNA / J. Pang, J. Modlin, R. Yolken // Mol. Cell Probes. 1992. - V. 6. - № 3. - P 251-256.

253. Papp, J.R. Localization of chronic Chlamydia psittaci infection in the reproductive tract of sheep / J.R. Papp, P.E. Shewen, C.E. Thom, A.A. Andersen //J. Infect. Dis.-1996.-V. 174.-№6.-P. 1296-1302.

254. Pastinen, T. Multiplex fluorescent solidphase minisequencing for efficient screening of DNA sequence variation / T. Pastinen, J. Partanen, A-C. Syvanen // Clin. Chem. 1996. - V. 42. - № 9. - P. 1391-1397.

255. Pastinen, T. Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays / T. Pastinen, A. Kurg, A. Metspalu, L. Peltonen, A-C. Syvanen // Genome Res. 1997. - V. 7. - № 6. - P. 606-614.

256. Peeling, R.W. Chlamydiae as pathogens: new species and new issues / R.W. Peeling, R.C. Brunham // Emerg Infect. Dis. 1996. - V. 2. - № 4. - P. 307319.

257. Perez Melgosa, M. Sequence analysis of the major outer membrane protein gene of Chlamydia pneumoniae / M. Perez Melgosa, C.C. Kuo, L.A. Campbell // Infect. Immun: 1991. - V. 59. -№ 6. - P. 2195-2199:

258. Plaschke, J. Doublex sequencing in molecular diagnosis of hereditary diseases / J. Plaschke, H. Voss, M. Hahn, W. Ansorge, H.K. Schackert // BioTechniques. -1998. V.24 -№ 5. — P. 838-841.

259. Poddar, S.K. Optimized PCR amplification of influenza A virus RNA using Tth DNA polymerase, incorporating uracil N glycosylase (UNG) in a single tube reaction / S.K. Poddar, M.H. Sawyer, J.D. Connor // J. Clin. Lab. Anal. 1997. -V. 11.-№6.-P. 323-327.

260. Poffenroth, L. Ultrastructural studies of Chl. psittaci 6BC strains / L. Poffenroth, J.W. Costerton, N. Kordova, J.C. Wilt / Can. J. Microbiol. 1973. - V. 19. - № 8.-P. 887-894.

261. Poison, A. Physico-chemical investigation of an enteric cytopathogenic bovine orphan virus, ECBO SA.I. / A. Poison, A. Kipps // Arch. Gesamte Virusforsch. 1965. -V. 17. -№ 3. - P. 488-494.

262. Pons, M.W. Polyacrylamide gel electrophoresis of the replicative form of influenza virus RNA</ M.W. Pons, G.K. Hirst // Virology. 1968. - V. 35. - № l.-P. 182-184.

263. Poppert, S. Detection and differentiation of chlamydiae by fluorescence in situ hybridization / S. Poppert, A. Essig, R. Marre, M. Wagner, M. Horn // Appl. Environ. Microbiol. 2002a. - V. 68. - № 8. - P. 4081-4089.

264. Popov, V.L. infrastructure of Chlamydia pneumoniae in cell culture / V.L. Popov, A.A. Shatkin, V.N. Pankratova, N.S. Smirnova, C.H. von Bonsdorff, M.R. Ekman, A. Morttinen, P. Saikku // FEMS Microbiol. Lett. V. 68. - № 2. -P. 129-134.

265. Pospischil, A. Abortion in woman caused by caprine Chlamydophila abortus (Chlamydia psittaci serovar 1) / A. Pospischil, R. Thoma, M. Hilbe, P. Grest, J.O. Gebbers // Swiss Med. Wkly. 2002. - V. 132. - № 5-6. - P. 64-66.

266. Pospisil, L. Chlamydia (Chlamydophila) pneumoniae in animals: a review / L Pospisil, J. Canderle // Vet. Med. Czech. - 2004. - V. 49. - № 4. - P. 129-134.

267. Pruvost, M. Minimizing DNA contamination by using UNG-coupled quantitative real-time PCR on degraded DNA samples: application to ancient DNA studies / M. Pruvost, T. Grange, E.M. Geigl // Biotechniques. 2005. -V. 38.-№4.-P. 569-575.

268. Pudj iatmoko. Phylogenetic analysis of the genus Chlamydia based on 16S rRNAgene sequences / Pudj iatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, T. Yamaguchi, K. Hirai //i1.t. J. Syst. Bacteriol. 1997a. - V. 47. - № 2. - V. 425-431.

269. Pudjiatmoko. Diversity of feline Chlamydia psittaci revealed by random amplification of polymorphic DNA / Pudjiatmoko, H. Fukushi, Y. Ochiai, T. Yamaguchi, K. Hirai // Vet. Microbiol. 1997b. - V. 54. - № 1. - P. 73-83.

270. Wacholder, E. Freer, B. Cortes, R. Herrero // J. Clin. Microbiol. 2007. - V. 45.-№ 12.-P. 3986-3991.

271. Reed, K.D. Chlamydia pneumoniae in a breeding colony of African clawed frogs (Xenopus tropicalis) / K.D. Reed, G.R. Ruth, J.A. Meyer, S.K. Shukla // Emerg. Infect. Dis. 2000. - V. 6. - № 2. - P. 196-199.

272. Reed, L.F. A simple method of counting 50% end-point / L.F. Reed, H. Muench // Am. J. Higiene. 1938. - V. 27. - P. 493-497.

273. Regan, R.J. Infective endocarditis and glomerulonephritis associated with cat Chlamydia (C. psittaci) infection / R.J. Regan, J.R.E. Dathnan, J.D. Treharne // Br. Heart. J. 1979. - V. 42. - P. 349-352.

274. Reischl, U. Rapid and standardized detection of Chlamydia pneumoniae using LightCycler real-time fluorescence PCR / U. Reischl, N. Lehn, U. Simnacher, R. Marre, A. Essig // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - V. 22. - № 1. -P. 54-57.

275. Ridley, A.M. Genomic Fingerprinting by Application of. repPCR / A.M. Ridley // Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical. Applications. Totowa: Humana Press. - 1998.-P. 103-117.

276. Rincon, G. Single nucleotide polymorphism, genotyping of bovine milk protein genes using the tetra-primer ARMS-PCR / G. Rincon, J:F. Medrano // J. Anim. Breed. Genet. 2003. - V. 120. - №-5. - P: 331-337.

277. Ritzier, M. Influence of residual uracil-DNA glycosylase activity 'on the electrophoretic migration of dUTP-containing PCR products / M. Ritzier, I.

278. Perschil, M. Altwegg // J. Microbiol. Methods. 1999. - V. 35. - № 1. - p. 7376.

279. Roche PCR Application Manual 2nd edition. - 1999. - P. 1-321.

280. Rodolakis, A. Mouse models for evaluation of virulence of Chlamydia psittaci isolated from ruminants / A. Rodolakis, F. Bernard, F. Lantier // Res. Vet. Sci. -1989. V. 46. - № 1. - P. 34-39

281. Rogers, D.G. Intestinal lesions caused by two swine chlamydial isolates in gnotobiotic pigs / D.G. Rogers, A.A. Andersen // J. Vet. Diagn. Invest. 1996. -V. 8.-№4.-P. 433-440.

282. Rogers, D.G. Lung and nasal lesions caused by a swine chlamydial isolate in gnotobiotic pigs / D.G. Rogers, A.A. Andersen, B.D. Hunsaker // J. Vet. Diagn. Invest.-1996.-V. 8.-№ l.-P. 45-55.

283. Rourke, A. A light and electron microscope study of epitheliocystis in uvenile steelhead trout, Salmo gairdneri Richardson / A. Rourke, R. Davis, T. Bradley // J. Fish. Dis. 1984. - V. 7. - P. 301-309.

284. Ruano, G. Coupled amplification and sequencing of genomic DNA / G. Ruano, K.K. Kidd //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. -V. 88. - P. 2815-2819.

285. Rushizky, G.W. Ribonuclease-sensitive infectious units from tomato bushy stunt virus / G.W. Rushizky, C.A. Knight // Virology. 1959. - V. 8. - P. 448-455.

286. Sachse, К. Specificity and performance of diagnostic PCR assays / K. Sachse // Methods Mol. Biol. 2003. - V. 216. - P. 3-29.

287. Sachse, K. PCR Detection of Microbial Pathogens / K. Sachse, J. Frey // Humana Press. 2003a. - P. 334.

288. Sachse, K. Detection and differentiation of Chlamydiae by nested PCR / K. Sachse, H. Hotzel // Methods Mol. Biol. 2003b. - V. 216. - P. 123-136.

289. Sachse, K. DNA microarray-based detection and identification of Chlamydia and Chlamydophila spp. / K. Sachse, H. Hotzel, P. Slickers, T. Ellinger, R. Ehricht // Mol. Cell Probes. 2005. - V. 19. - № 1. - P. 41-50.

290. Sachse, K. Genotyping of Chlamydophila psittaci using a new DNA microarray assay based on sequence analysis of ompA genes / K. Sachse, K. Laroucau, H. Hotzel, E. Schubert, R. Ehricht, P. Slickers // BMC Microbiol. 2008. - V. 8. -P. 63.

291. Sachse, K. Recent developments in the laboratory diagnosis of chlamydial infections / K. Sachse, E. Vretou, M. Livingstone, N. Borel, A. Pospischil, D. Longbottom // Vet. Microbiol. 2009. - V. 135. - № 1-2. - P. 2-21.

292. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis, H.A. Erlich // Science. 1988! - V. 239.-№4839.-P. 487-491.

293. Sandigursky, Ml' Uracil-DNA glycosylase in the extreme thermophile Archaeoglobus fulgidus / M: Sandigursky, W.A1. Franklin // J. Biol. Chem. — 2000.--V. 275. № 25. - P. 19146-19149.

294. Sayada, C. Homogeneity of the major outer membrane protein gene of feline Chlamydia psittaci / C. Sayada, A. Andersen, P. Rodriguez, F. Eb, A. Milon, J. Elion, E. Denamur // Res. Vet. Sci. 1994. - V. 56. - № 1. - р. 116-118.

295. Schachter, J. Human infection with the agent of feline pneumonitis / J. Schachter, H.B. Ostler, K.F. Meyer // Lancet. 1969. - V. 1. - P. 1063-1065.

296. Schmitz-Esser, S. ATP/ADP translocases: a common feature of obligate intracellular amoebal symbionts related to Chlamydiae and Rickettsiae / S.

297. Schmitz-Esser, N. Linka, A. Collingro, C.L. Beier, H.E. Neuhaus, M. Wagner, M. Horn // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - № 3. - P. 683-691.

298. Schuster, H. Die structur der ribonucleinsaure aus tabakmo- saik virus / H. Schuster, G. Schramm, W. Zilling // Z. Naturforschung. 1956. - V. 116. - P. 339-345.

299. Scieux, C. Molecular typing of Chlamydia trachomatis by random amplification of polymorphic DNA / C. Scieux, F. Grimont, B. Regnault, A. Bianchi, S. Kowalski, P.A.D. Grimont // Res. Microbiol. 1993. - V. 144. - № 5. - P. 395404.

300. Shaw, E.I. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental*cycle / E.I. Shaw, C.A. Dooley, E.R. Fischer, M.A. Scidmore; K.A-. Fields, T. Hackstadt // Mol. Microbiol. 2000. - V. 37. - № 4. -P. 913-925.

301. Sheehy, N. Differentiation of Chlamydia-- psittaci and-C. pecorimv strains by species-specific PCR / N. Sheehy, В. Markey, M. Gleeson, P.J. Quinn // J. Clin. Microbiol. 1996. -V. 34. -№ 12. - P. 3175-3179.

302. Sheffield, V.C. The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions / V.C. Sheffield, J.S. Beck, A.E. Kwitek, D.W. Sandstrom, E.M. Stone // Genomics. 1993. - V. 16. - № 2. -P. 325-332.

303. Shewen, P.E. Feline chlamydial infection / P.E. Shewen, R.C. Povey, M.R. Wilson // Can. Vet. J. 1978. - V. 19. - P. 289-292.

304. Sheehy, N. Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum strains by species-specific PCR / N. Sheehy, В. Markey, M. Gleeson, P.J. Quinn // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - № 12. - P. 3175-3179.

305. Siarkou, V. Papadopoulos O. Subspecies variation in Greek strains of Chlamydophila abortus / V. Siarkou, A.F. Lambropoulos, S. Chrisafi, A. Kotsis //VetMicrobiol.-2002:-V. 85.-№2.-P. 145-157.

306. Singleton, P. DNA Methods in Clinical Microbiology / P. Singleton // Springer. -2000.-P. 255.

307. Sokolov, В.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotides in genomic DNA / B.P. Sokolov // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - № 12. -P. 3671.

308. Spears, P.A. Simultaneous strand displacement amplification and fluorescence polarization detection of Chlamydia trachomatis DNA / P.A. Spears, C.P. Linn, D.L. Woodard, G.T. Walker // Anal. Biochem. -1997. V. 247. - № 1. - P. 130-137.

309. Sprunt, K. Reaction of infectious RNA.with mammalian cells. I. Attachment to cells // K. Sprunt, M. Fierer, H.E. Alexander // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1967.-V. 124.-№ 1.-P. 12-18.

310. Srinath, T. Substrate specificities and* functional" characterization of a thermo-tolerant uracil DNA glycosylase (UdgB) from Mycobacterium tuberculosis / T. Srinath, S.K. Bharti, U. Varshney // DNA Repair (Amst). 2007. - V. 6. - № 10.-P. 1517-1528.

311. Stamp, J.T. Enzootic abortion in ewes. I. Transmission of the disease / J.T. Stamp, A.D. McEwen, J.A.A. Watt, D.L. Nisbet // Vet. Rec. 1950. - V. 62. -P. 251-254.

312. Stephens, R.S. Chlamydia. Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity I R.S. Stephens // ASM Press: Washington, 1999. P. 143-146.

313. Stephens, R.S. Divergence without difference: phylogenetics and taxonomy of Chlamydia resolved /R.S. Stephens, G. Myers, M. Eppinger, P.M; Bavoil // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009. - V. 55. - № 2. - P. 115-119.

314. Stephens, R.S. Diversity of Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes / R.S. Stephens, R. Sanchez-Pescador, E.A. Wagar, C. Inouye, M.S. Urdea // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - № 9. - P. 387.9-3885.

315. Stills, H.F. A «new» Chlamydia sp. strain SFPD isolated from transmissible proliferative ileitis in hamsters / H.F. Stills, J.G. Fox, B.J. Paster, F.E. Dewhirst // Microbiol. Ecol. Health Dis. 1991. - V. 4. - P. 99.

316. Storey, G. Evidence for- Chlamydia1, pneumoniae of non-human origin / C. Storey, M. Lusher,. P. Yates, S. Richmond // J. Gen-.Microbiol: 1993. - V. 139.-№ 11.-P. 2621-2626.

317. Storz, J., 1971. Intestinal' chlamydial infections of ruminants / J. Storz // In Chlamydia and C/i/arwy^'ar-Induced Diseases. — Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, U.S.A, 1971.-P. 146-154.

318. Storz, J. Overview of animal diseases induced by chlamydial infections / J. Storz // Edited by A.L. Barron. In Microbiology of Chlamydia. - CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 1988.-P. 167-192.

319. Storz, J. The isolation of a viral agent from epizootic bovine abortion / J. Storz, D.G. McKercher, J.A. Howarth, O.C. Straub // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1960. -V. 137.-P. 509-514.

320. Studdert, M.J. Isolation of Chlamydia psittaci from cats with conjunctivitis / M.J. Studdert, V.P. Studdert, H.J. Wirth // Aust. Vet. J. 1981. - V. 57. - № 11. -P. 515-517.

321. Sykes, J.E. Detection of feline calicivirus, feline herpesvirus 1 and Chlamydia psittaci mucosal swabs by multiplex RT-PCR/PCR / J.E. Sykes, J.L. Allen, V.P. Studdert, G.F. Browning // Vet. Microbiol. 2001. - V. 81. - № 2. - P. 95-108.

322. Syvanen, A.-C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms / A.-C. Syvanen // Hum. Mutat. 1999. - V. 13. - №. 1. - P. 1-10.

323. Szemes, M>. Design of molecular beacons for AmpliDet RNA assay-Characterization1 of binding stability and probe specificity / Ml Szemes, C.D. Schoen // Anal. Biochem. 2003. - V. 315. - № 2. - P. 189-201.

324. Szeredi, L. Intestinal Chlamydia in finishing pigs / L. Szeredi, I. Schiller, T. Sydler, F. Guscetti, E. Heinen, L. Corboz, E. Eggenberger, G.E. Jones, A. Pospischil // Vet. Pathol. 1996. - V. 33. - № 4. - P. 369-374.

325. Taggart, E.W. Use of heat labile UNG in an RT-PCR assay for enterovirus detection / E.W. Taggart, K.C. Carroll, C.L. Byington, G.A. Crist, D.R. Hillyard //J. Virol. Methods. 2002. - V. 105.-№ 1.-P.57-65.

326. Takahashi, T. Immunotyping of Chlamydia psittaci by indirect immunofluorescence antibody test with monoclonal antibodies / T. Takahashi, I. Takashima, N. Hashimoto // Microbiol. Immunol. 1988. - V. 32. - № 3. - P. 251-263.

327. Takahashi, T. Phylogenetic analyses of Chlamydia psittaci from birds based on 16S rDNA gene sequence / T. Takahashi, M. Masuda, T. Tsuruno, Y. Mori, I.

328. Takashima, T. Hiramune, N. Kikuchi // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - №i11.-P. 2908-2914.

329. Takashima, I. Polymerase chain reaction for the detection of Chlamydia psittaci in the feces of budgerigars / I. Takashimal, Y. Imai, N. Itoh, H. Kariwa, N. Hashimoto // Microbiol. Immunol. 1996. - V. 40. - № 1. - P. 21-26.

330. Thao, M.L. Phylogenetic evidence for two new insect-associated Chlamydia of the family Simkaniaceae / M.L. Thao, L. Baumann, J.M. Hess, B.W. Falk, J.C. Ng, P.J: Gullan, P. Baumann // Gurr. Microbiol. 2003. - V. 47. - № 1. - P. 4650.

331. Thomas, N.S. Plasmid diversity in Chlamydia / N.S. Thomas, M. Lusher, C.C. Storey, I.N. Clarke // Microbiology. 1997. - V. 143. - № 6. - P. 1847-1854.

332. Thomas, V. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture / V. Thomas, N. Casson, G. Greub // Environ. Microbiol. 2006. - V. 8. - № 12. - P. 2125-2135.

333. Thorne, H.V. Electrophoretic characterization* and fractionation of polyoma virus DNA / H.V. Thorne // J. Mol. Biol. 1967. - V. 24. - № 2. - P. 203-211.

334. Timms, P. Comparison of Chlamydia psittaci isolates by restriction endonuclease and DNA probe analyses / P. Timms, F.W. Eaves, A.A. Girjes, M.F. Lavin // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - № 1. - P. 287-290.

335. Tondella, M:L. Development and. evaluation of real-time PCR-based. fluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae / MIL. Tondella, D.F. Talkington, B.P. Holloway, S.F. Dowell, K. Cowley, MI Soriano-Gabarro,

336. M.S. Elkind, B.S. Fields // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - № 2. - P. 57583.

337. Tong, C.Y. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR / C.Y. Tong, M. Sillis // J. Clin. Pathol. 1993. - V. 46.-№4.-P. 313-317.

338. Tsourkas, A. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons / A. Tsourkas, M.A. Behlke, S.D. Rose, G. Bao // Nucleic Acids Res. 2003. -V. 31. — № 4. - P. 1319-1330.

339. Turnbull, J. Evidence that superfical brancial colonies on the gills of Salmo salar L. are not Aeromonas salmonicida / J. Turnbull; R. Richards, M. Tatner // J. Fish. Dis. — 1989. V. 121 —№ 5; — P. 449M-58;

340. Tyagi, S. Multicolor molecular beacons for allele discrimination / S. Tyagi, D.P. Bratu, F.R. Kramer // Nat. Biotechnol; 1998. - V. 16. - P. 49-53 .

341. Tyagi; S. Molecular beacons: probes, that fluoresce: upon hybridization / S. Tyagi, F.R. Kramer / Nat. Biotechnol. 1996. - V. Г4. -P. 303-308.

342. Van Der Pol; B; Multicenter Evaluation of the BDProbeTec ET System for Detection; ofi Chlamydiai trachomatis and? Neisseria? gonorrhoeae; in; Uriner

343. Pol, D:V. Ferrero, L. Buck-Barrington; E.3rd Hook, C. Lcndcrman, T. Quinn;, C.A. Gaydos,.Ji Lovchik, J; Schachter, J. Moncada; G: Hall, MJ. Tuohy, R.B. Jones // J. Clin, Microbiol; 2001. - V. 39.-№3. - P. 1008-1016.

344. Vanrompay, D. Serotyping of European isolates of Chlamydia psittaci from poultry and other birds / D. Vanrompay, A.A. Andersen, R. Ducatelle, F. Haesebrouck//J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31.-№ l.-P. 134-137.

345. Vanrompay, D. Pneumonia in Moorish tortoises (Testudo graeca) associated with avian serovar A Chlamydia psittaci / D. Vanrompay, W. De Meurichy, R. Ducatelle, F. Haesebrouck // Vet. Rec. 1994'. - V. 135. - № 12. - P. 284-285.

346. Vanrompay, D. High-level expression of Chlamydia psittaci major outer membrane protein in COS cells and in skeletal muscles of turkeys / D. Vanrompay, E. Cox, J. Mast, B. Goddeeris, G. Volckaert // Infect Immun.1998. V. 66. - № 11. - P. 5494-5500.

347. Varveri,. C. Potato: Y Potyvirus Detection by Immunological and' Molecular Techniques in Plants and Aphids / C. Varveri // Phytoparasitica. 2000. - V. 28.2. — P. 10-20

348. Verma I.M. Studies on reverse transcriptase of RNA tumor viruses III. Properties of purified Moloney murine leukemia virus DNA polymerase and associated RNase H. J Virol. 1975 April; 15(4): 843-854.

349. Viljoen, G.J. Molecular Diagnostic PCR Handbook / G.J. Viljoen, L.H. Nel, J.R. Crowther // Springer. 2005. - P. 307.

350. Vincent, M. Helicase-dependent isothermal DNA amplification / M. Vincent, Y. Xu, H. Kong // EMBO Rep. 2004. - V. 5. - № 8. - P. 795-800.

351. Vos, P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Homes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau // Nucleic Acids Res. 1995. - V. 23. - № 21. - P. 44074414.

352. Walker, G.T. Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system / G.T. Walker, M.C. Little, J.G. Nadeau, D.D. Shank // Proc. Natl. Acad. Sci. USA- 1992. V. 89. - № 1. - P. 392-396.

353. Wang, Z.G. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2 / Z.G. Wang, D.G. Smith, D.W. Mosbaugh // Gene.-1991.-V. 99.-№> 1.-P. 31-37.

354. Wardrop, S. Characterisation of the koala biovar of Chlamydia pneumoniae at four gene loci / S. Wardrop, A. Fowler, P. O'Callaghan, P. Giffard, P. Timms // Syst Appl. Microbiol. 1999. - V. 22. - № 1. - P. 22-27.

355. Weighardt, F. A simple procedure for enhancing PCR specificity / F. Weighardt, G. Biamonti, S: Riva / PCR Methods Appl. 1993; - V. 3. - № 1. - P. 77-80.

356. Wecker, E. The extraction of infectious virus nucleic acid with hot phenol / E. Wecker // Virology. 1959. - V. 7. - № 2. - P. 241-243.

357. Westphal, O. Uber die extartion von bacterien mit phenol / O. Westphal, O. Luderitz, F. Bister // Z. Naturforsch. Teil. B. 1952. - V. 7. - P. 148-155.

358. Wills, J.M. Characterisation of Chlamydia psittaci isolated from a horse / J.M. Wills, G. Watson, M. Lusher, T.S. Mair, D. Wood, SJ. Richmond // Vet. Microbiol. 1990. - V. 24. - № 1. - P. 11-19.

359. Wittenbrink, M.M. Endometritis in cattle experimentally induced by Chlamydia psittaci / M.M. Wittenbrink, H.A. Schoon, D. Schoon, R. Mansfield, W. Bisping // Zentralbl. Veterinarmed B. 1993. - V. 40. - № 6. - P. 437-450.

360. Woodford, N. Genomics, Proteomics, and Clinical Bacteriology: Methods and Reviews / N. Woodford, A. P. Johnson // Humana Press. 2004. - P. 395.

361. Wu, D.Y. The ligation amplification reaction (LAR)~amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation / D.Y. Wu, R.B. Wallace // Genomics. 1989.* - V. 4. - № 4. - P: 560-569.

362. Xu, Y. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA autoligation reaction / Y. Xu, E.T. Kool // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. - № 3. - P. 875-881.

363. Yang, J.M. Development of a rapid' realtime PCR assay for detection^ and quantification of four familiar species of Chlamydiaceae / J.M: Yang, H.X. Liu,

364. Y.X. Нао, С. Не, D.M. Zhao // J. Clin. Virol. 2006. - V. 36. - № 1. - P. 7981.

365. Yuan, Y. Multiple tandem promoters of the major outer membrane protein gene (ompl) of Chlamydia psittaci / Y. Yuan, Y.X. Zhang, D.S. Manning, H.D. Caldwell // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - № 9. - P. 2850-2855.

366. Zhang, Y.-X. Cloning and sequence analysis of the major outer membrane protein genes of two Chlamydia psittaci strains / Y.X. Zhang, S.G. Morrison, H.D. Caldwell, W. Baehr // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - № 5. - P. 1621-1625.

367. Zhao, Q. Lack of allelic polymorphism for the major outer membrane protein gene of the agent of guinea pig inclusion conjunctivitis (Chlamydia psittaci) / Q. Zhao, J. Schachter, R.S. Stephens // Infect Immun. 1993. - V. 61. - № 7. - P. 3078-3080.

368. Zhu, K.Y. Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles / K.Y. Zhu, J.M. Clark // Biotechniques. 1996. -V. 21. -№ 4. - P. 586-590.