Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитический белок CPAF Chlamydia Trachomatis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протеолитический белок CPAF Chlamydia Trachomatis"

На правах рукописи

Давыдова Дарья Юрьевна

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЙ БЕЛОК CPAF CHLAMYDIA TRACHOMATIS-. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОИСК ИНГИБИТОРОВ

03.02.03 - микробиология 03.02.07- генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МАП 2CU

Москва-2014

005547866

005547866

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Зигангирова Наиля Ахатовна

доктор медицинских наук Белый Юрий Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Пименов Николай Викторович Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН,

заместитель директора

доктор биологических наук, профессор Каменева Светлана Владимировна МГУ им. М.В. Ломоносова профессор биологического факультета

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «23» мая 2014 года в Пчасов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г.Москва, ул. Гамалеи, д.18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте www.gamaleya.org.

Автореферат разослан « 22 » апреля 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Русакова

Актуальность работы.

Одним из самых распространенных возбудителей инфекций,

передающихся половым путем, является Chlamydia trachomatis (Malhotra М., Sood S., et al., 2013). Хламидии вызывают широкий спектр заболеваний, связанных с тяжелыми осложнениями, трахому, урогенитальный хламидиоз, бесплодие, патологию беременности, артриты. В настоящее время для лечения хламидиоза применяют этиотропную терапию, основанную на чувствительности хламидий к некоторым антибиотикам. Однако лечение хламидийных инфекций, особенно при хроническом течении, по-прежнему остается нерешенной проблемой, что во многом обусловлено низкой чувствительностью внутриклеточно персистирующих хламидий к используемым антибиотикам (Шипицына Е.В., Савичева A.M., и др., 2004). Отсутствие эффективных и безопасных препаратов для лечения разных форм хламидийных инфекций определяет необходимость разработки нового подхода для поиска лекарственных средств, основанного на выявлении принципиально новых мишеней у бактериальных патогенов.

Основная стратегия внутриклеточного выживания патогена направлена на инактивацию защитных механизмов хозяина и модуляцию клеточных сигнальных путей, ответственных за контроль развития инфекции. При разработке новых антибактериальных препаратов, эффективных в отношении внутриклеточных патогенов, в том числе и хламидий, перспективными мишенями могут служить ключевые бактериальные молекулы, подавление активности которых позволит «разоружить» патоген, и в дальнейшем он может быть элиминирован иммунной системой организма (Зигангирова H.A., Федина Е.Д., и др., 2009). Поэтому действие новых препаратов должно быть направлено на ингибирование специфических механизмов, которые способствуют развитию инфекции и принципиально важны для подавления защитных механизмов хозяина.

Реализация такого подхода возможна на основе технологии «мишень-направленного поиска», предусматривающая полный цикл разработки новых кандидатных препаратов для антимикробной терапии. Этот цикл включает в себя: выбор биомишени, виртуальный скрининг библиотек химических соединений для поиска потенциальных ингибиторов выбранной мишени, синтез и химическую оптимизацию низкомолекулярных соединений, создание бесклеточных и клеточных систем скрининга, экспериментальный скрининг, использование экспериментальных моделей инфекции in vitro и in vivo. Применение такой технологии позволяет существенно сократить время разработки нового препарата с предсказанным механизмом действия.

Ведущую роль в патогенезе хламидийной инфекции играет белок CPAF (chlamydial protease/proteasome-like activity factor), подавляющий множественные сигнальные пути клетки-хозяина, и благодаря этому обеспечивающий возможность установления инфекции и длительного выживания патогена в организме хозяина. Белок CPAF расщепляет многие транскрипционные факторы (Zhong G., Liu L.,et al., 2000), проапоптозные белки (Dong F., Pirbhai M. et al., 2005), и компоненты системы промежуточных филаментов клетки-хозяина (Kumar Y., Valdivia R.H., et al., 2008), препятствуя презентации антигенов хламидий на поверхности зараженной клетки, блокируя индукцию апоптоза хозяйской клетки и способствуя росту хламидийных включений. Кроме того, протеасомный белок CPAF имеет не только эукариотические мишени, но также способен расщеплять и некоторые белки самого патогена, выполняя функцию регуляторного белка и координируя активность хламидийных белков (Jorgensen I., Bednar М.М., et al., 2011). Однако до сих пор не проводились исследования, направленные на изучение биологической активности белка и ее взаимосвязи с протеолитической активностью.

Таким образом, белок CPAF является ключевым фактором патогенности, что делает его перспективной бактериальной мишенью для создания нового антихламидийного препарата.

Цель работы: характеристика функциональной активности фактора патогенности хламидий белка CPAF и поиск специфических ингибиторов протеолитической активности белка.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Клонировать ген cpaf в Е. coli, оптимизировать условия его экспрессии и разработать схему получения белка в биологически активной форме.

2. Осуществить генетический анализ цитотоксического действия CPAF с использованием дрожжей S. cerevisiae.

3. Разработать системы тестирования биологической активности белка CPAF in vitro, необходимые для скрининга низкомолекулярных химических соединений.

4. Провести экспериментальное тестирование выбранных на основе компьютерного моделирования потенциальных ингибиторов белка CPAF с целью получения эффективного низкомолекулярного ингибитора хламидийной протеазы.

Научная новизна работы.

Впервые созданы генетические конструкции, позволяющие целенаправленно получать препаративные количества очищенного белка CPAF как в денатурированной, высокоиммуногенной, так и в растворимой, ферментативно активной формах. Впервые создана биологическая модель с использованием дрожжей S. cerevisiae, пригодная для изучения генетических особенностей и механизма цитотоксического действия белка

CPAF. Показана высокая токсичность протеазы хламидий на дрожжевых клетках.

Впервые обнаружены ингибиторы протеолитической активности белка CPAF среди низкомолекулярных соединений класса индол-3-ил-глиоксиламидов и 6-оксо-1,6-дигидро-пиримидинов.

Практическое значение работы. Разработаны технологии получения высокоочищенного белка CPAF в препаративных количествах. Очищенный белок может быть использован для приготовления моноспецифических сывороток и разработки на их основе диагностических тест-систем. Разработана модель для исследования токсических факторов бактериального происхождения с использованием дрожжей S. cerevisiae.

Отобраны низкомолекулярные соединения, подавляющие хламидийную инфекцию в культуре клеток и блокирующие протеолитическую активность белка CPAF in vitro. Данные ингибиторы могут служить прототипом лекарственного препарата против инфекций, вызываемых С. trachomatis.

По результатам работы подготовлены методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 25 января 2013 г, протокол № 23.

Основные положения, выноснмые на защиту. Методами генной инженерии получен высокоиммуногенный и ферментативно активный рекомбинантный белок CPAF, фактор патогенности С.trachomatis.

Впервые создана экспрессирующая рекомбинантный белок CPAF модель на основе его клонирования в S. cerevisiae, позволяющая

оценивать биологическую активность хламидийной протеазы в отношении эукариотических клеток.

Получены два ранее неизвестных ингибитора протеазы С.trachomatis, подавляющие внутриклеточное размножение патогена ш vitro.

Выбранные ингибиторы - низкомолекулярные соединения, нетоксичные для эукариотических клеток, блокирующие протеолитическую активность белка CPAF в отношении эукариотических мишеней и подавляющие хламидийную пролиферацию, могут рассматриваться как перспективные соединения для разработки лекарственного средства против инфекций, вызываемых С. trachomatis.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 22-ом съезде Европейского Общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (Лондон, 2012), на Седьмом заседании Европейского общества исследования хламидиоза (Амстердам, 2012), международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на Ежегодном конгрессе британского общества иммунологов (Ливерпуль, 2013).

Апробащи работы состоялась 19 декабря 2013 года на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список использованной

литературы, содержащий ссылки на 155 источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 32 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы: референс-штамм Chlamydia trachomatis биовара лимфогранулемы (LGV) серовар L2 штамм Bu 434 (АТСС VR 902В), Escherichia coli DH10B, Е. coli BL21 (DE3), Saccharomyces cerevisiae MH272a.

Для моделирования острой хламидийной инфекции была использована клеточная линия McCoy, а для выделения ядерного экстракта клеточная линия HeLa.

В работе использованы коммерческие плазмидные векторы: рЕТ28а и рЕТ28с (Novagen, США), pUC19 (New England Biolabs, США), pGEX-4Tl (GE Healthcare, Германия), pBluescript KS (Stratagene, США), pESC-Ura (Stratagene, США).

Компьютерный скрининг потенциальных ингибиторов проводился группой биоинформационного анализа ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под руководством A.C. Карягиной.

Низкомолекулярные химические соединения, используемые для исследований, были получены в группе органического синтеза ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Культивирование бактериальных штаммов Е. coli проводили в жидкой или агаризованной среде LB с добавлением селективного антибиотика ампициллина (200 мкг/мл) или канамицина (50 мкг/мл) в течение ночи при температуре 37°С. Для индукции экспрессии гена в культуру вносили 0,2 мМ ИПТГ.

Культивирование эукариотических штаммов S. cerevisiae проводили в жидкой или на агаризованной питательной SD среде с добавлением селективных аминокислот при температуре 30°С с шутелированием в течение ночи или в течение 48-72 ч соответственно.

Выделение плазмидной ДНК из E.coli осуществляли с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Выделение ДНК из штаммов S. cerevisiae проводили набором Yeast DNA Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя.

Метод полимеразиой цепной реакции (ПЦР) использовали для амплификации гена cpaf (cl611). В качестве матрицы использовали хромосомную ДНК С. trachomatis. Программа ПЦР состояла из стадии денатурации при 95°С в течение 30 сек, стадии отжига при 55°С - 30 сек и стадии элонгации при 72°С - 3 мин. Циклы ПЦР повторялись 25 раз. Для амплификации укороченных фрагментов гена cpaf в качестве матрицы использовали плазмиду р707 (табл. 1).

Сайт-направленный мутагенез гена cpaf проводили методом ПЦР набором QuikChange mutagenesis (Promega, Германия). В качестве матрицы использовали генетическую конструкцию р708 (табл. 1). Программа амплификации включала следующие этапы: 95 °С - 2 мин, (95°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С -6 мин) х 16, 72°С - 5мин.

Продукт амплификации выявляли методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле, приготовленном на основе трис-ацетатного буфера, с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Германия).

Таблица 1. Гибридные плазмиды.

Название плазмиды Описание плазмиды

р678 Полноразмерный ген сра/в векторе рЕТ28а

р698 Полноразмерный ген сра/в векторе рЕБС-ига

р707 Полноразмерный ген сра/в векторе рОЕХ-4Т1

р708 Фрагмент гена сра/в векторе риС19

р709 Фрагмент гена сра/с заменой 1,28 Ю в векторе рис 19

P712 Ген сра/с удаленной последовательностью сигнального пептида в векторе рЕТ28с

р736 Ген сра/с заменой Ь2810 в векторе рЕТ28а

р742 Ген сра/с удаленной последовательностью сигнального пептида в векторе риС19

р743 Полноразмерный ген сра/с удаленной последовательностью сигнального пептида в векторе рОНХ-4Т1

р744 Полноразмерный ген сра/с заменой Ь28Ю в векторе рЕБС-ига

р745 Ген сра/с заменой Ь28Ю в векторе рЕТ28с

р750 Ген сра/с удаленной последовательностью сигнального пептида в векторе рОЕХ-4Т1

р839 Ген сра/с заменой Ь28Ю в векторе риС19

р840 Ген сра/с заменой 1,281 в в векторе рОЕХ-4Т1

plOSS Полноразмерный ген сра/в векторе риС19

pi 132 Ген сра/ с заменой Ь28Ю в векторе рЕЯС-Н1^

р1133 Ген сра/с удаленной последовательностью сигнального пептида в векторе рЕЗС-Шэ

Генно-инженерное конструирование осуществляли по стандартным протоколам, согласно руководству Маниатис и др. 1989.

Трансформация гибридных плазмид и лигированных смесей осуществлялась в компетентные клетки E.coli штаммов DH10B или BL21 двумя методами: электропорацией (в соответствии с рекомендациями изготовителя Electroporator 2500) и химической трансформацией согласно W. Edward Swords, 2003.

Выделение «нерастворимого» белка из штамма-продуцента включало в себя последовательные этапы осаждения бактериальной культуры центрифугированием, разрушения ультразвуком и вновь центрифугирования. Полученный осадок дважды промывали 1 % Тритон-Х-100, однократно 1М NaCl и растворяли в мочевине.

Очистку «растворимых» и «нерастворимых» белков проводили с использованием системы быстрой жидкостной хроматографии на колонке HisTrap или GSTrap (GE Healthcare) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Трансформация клеток S. cerevisiae осуществляли с использованием ОДМ ацетат лития. Компетентные клетки культуры S. cerevisiae МН272 готовились согласно Lu Y., 2011.

Для получения тотального экстракта S. cerevisiae дрожжевые клетки осаждали центрифугированием. Осадок суспензировали в буфере, содержащем гидроксид натрия, меркаптоэтанол, ПМСФ и инкубировали на льду в течение 10 минут. Далее вносили 50% уксусной кислоты и вновь повторяли инкубацию. Затем полученный препарат центрифугировали, полученный осадок дважды промывали холодным ацетоном и высушивали при комнатной температуре.

Определение токсического фенотипа у дрожжей проводилось методом «drop test». Для этого готовились суспензии рекомбинантных штаммов дрожжей и контрольного штамма, содержащего дрожжевой вектор. Суспензии титровались пятикратно и наносились на агаризованную среду SD с добавлением 2% глюкозы или 2% галактозы.

Моноспецифичную сыворотку к белку CPAF получали путем иммунизации мышей линии Balb/C и кролика Советская шиншилла очищенным рекомбинантным белком. Внутрибрюшинную иммунизацию мышей проводили трехкратно в дозе 50 мкг/животное. Иммунизация кролика проводилась пятикратно каждые две недели. Смесь 0,5мл препарата (100 мкг/мл) с 0,5мл адъюванта Фрейнда вводили в пять точек: подмышечные и паховые лимфатические узлы и в холку, по 0,2 мл смеси в каждую точку. Забор крови производили через 14 дней после последней иммунизации.

Анализ выделенных белков проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) (Laemmli U. К., 1970). Обнаружение белков осуществляли путем окрашивания геля нитратом серебра (Nesterenko M.V., 1994). Антигенная специфичность белков изучалась при помощи вестерн-блотгинга с полученными моноспецифичными сыворотками против рекомбинантного белка CPAF.

Ферментативную активность очищенного CPAF оценивали по реакции расщепления специфических субстратов методом иммуноблотганга и FRET-анализом. Для получения ядерного экстракта из

клеток HeLa, содержащего субстрат RFX5, был использован набор NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents «Thermo scientific» (США). Для проведения реакции в пробирку с ядерным экстрактом вносили разные концентрации очищенного белка CPAF и инкубировали при температуре 37°С.

Для FRET-анализа в качестве субстрата использовали синтезированный пептид виментин с флуоресцентной меткой на NH2-концевом участке (Dabcyl-VRLRSSVPGVK-FITC). FRET-анализ проводили в формате 96-луночного культурального планшета в объеме 100 мкл. К разведениям белка CPAF, приготовленных в Трис-HCl буфере, содержащем NaCl, добавляли пептид. Полученную смесь инкубировали при 37 °С в течение 2 часов. Флуоресценцию мерили при длине волны 485 нм на флуориметре VICTOR2.

Поиск ингибиторов белка CPAF проводили методами компьютерного моделирования, основанными на известной структуре белка-мишени CPAF и на структуре известного протеасомного ингибитора - лактацистина.

Токсичность низкомолекулярных химических соединений для эукариотической клетки оценивали методами окрашивания клеток метиленовым синим (МВ-тест) и в МТТ-тесте (Зигангирова Н.А, 2012).

Определение влияния отобранных химических соединений на внутриклеточное размножение хламидий проводили на клеточных линиях McCoy, инфицированных методом суспензионного заражения С. trachomatis в формате 24-луночных планшетов. Исследуемые химические соединения вносили в культуру клеток одновременно с патогеном C.trachomatis в разных дозах (25, 50, ЮОмкМ). Затем инфицированные клетки с исследуемыми соединениями инкубировали 48 ч в С02 -инкубаторе при 37°С. Через 48 ч фиксированные клетки окрашивали моноклональными антителами к белку МОМР C.trachomatis, меченными

ФИТЦ. Готовые препараты оценивались методом иммунофлюоресцентной микроскопии.

Ингибирующую активность низкомолекулярных соединений

оценивали методом иммуноблоттинга с кроличьей антисывороткой против белка RFX5. Для приготовления проб в пробирки вносили разные дозы химических соединений, растворенных в TBS и белок CPAF. Пробирки со смесями выдерживали 10-15 минут при комнатной температуре. Затем в пробирки добавляли ядерный экстракт клеток HeLa, содержащий RFX5, и инкубировали в течение часа при температуре 37°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Клонирование гена cpaf в штаммы Е. coli и выделение активного белка CPAF

Для решения первой поставленной задачи цельноразмерный ген cpaf был клонирован в одной рамке считывания с последовательностью шести остатков гистидина в бактериальный вектор и экспрессирован в E.coli. Для исключения ошибок клонирования было проведено секвенирование клонированного гена.

Первые опыты по очистке белка показали низкую продукцию CPAF, который находился преимущественно в нерастворимой фракции (в тельцах включений). Анализ белка в полиакриламидном геле показал, что очищенная фракция неоднородна по составу (рис.1).

His-CPAF

Рис.1. Электрофорез в полиакриламидном геле белка His-CPAF. Дорожка 1- белок, полученный из «растворимой» фракции; дорожка 2- белок, полученный из телец включений.

1 2

кЦ ^ ^

100 _ ¿.у

70 — „ i р

55 — — "Ш

и* Ш ц

35 —| в* § *

25—j рРг * т

w w

С целью увеличения продукции исследуемого белка была проведена делеция предполагаемого сигнального пептида. Это привело к увеличению продукции белка в 10 раз. Однако, повышенная экспрессия целевого гена в E.coli также приводила к образованию нерастворимых агрегатов (рис.2). Для подтверждения идентичности очищенного препарата CPAF был проведен масс-спектрометрический анализ элюированной из полиакриламидного геля белковой полосы -70 кД, соответсвующей белку CPAF.

His-CPAF без сигнального пептида

70

1 2

Получение моноспецифической сыворотки к белку CPAF

Известно, что денатурированные белки являются хорошими иммуногенами и с успехом используются для получения моноспецифических сывороток. Исходя из этого, мы разработали схему очистки CPAF из включений, а очищенный денатурированный белок был использован для иммунизации лабораторных животных. Полученные антисыворотки отличались высокой активностью и были использованы в данной работе для определения протеасомного белка.

Получение белка CPAF в растворимой форме

На следующем этапе работы необходимо было получить растворимую форму белка. Попытка осуществить ренатурацию белков из телец включения разными методами оказались безуспешными. Поэтому для получения водорастворимого белка фрагмент cpaf был клонирован в

Рис.2. Электрофорез в полиакриламидном геле белка №з-СРАР без сигнального пептида. Дорожка 1 - белок из «растворимой» фракции; дорожка 2 - белок из телец включений.

одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей глутатион-S-трансферазу.

Изучение полученного белка методами электрофореза и иммуноблотинга выявило полосу, соответствующую отщепленной от гибридного белка молекуле глютатион-Б-трансферазы, а также компоненты, содержащие в своем составе как фрагменты глютатион-S-трансферазы, так и фрагменты CPAF (рис.3).

Анти-GST Ahth-CPAF

сыворотка сыворотка

Рис.3. Вестерн-блотгинг препаратов CPAF. Дорожка 1-«нерастворимый» белок His-CPAF; дорожка 2-«растворимый» белок GST-CPAF.

12 12

Таким образом, полученный рекомбинантный белок GST-CPAF находился в растворимой фракции. В ходе исследования было обнаружено характерное расщепление рекомбинантного белка на несколько специфичных фрагментов, что указывает на автоактивацию белка в процессе выращивания или очистки.

Оценка ферментативной активности белка GST-CPAF

Протеолитическую активность рекомбинантного белка CPAF оценивали методом вестерн-блоттингом, а также с помощью FRET-анализа. Для вестерн-блоттинга в качестве субстрата был выбран транскрипционный фактор RFX5, содержащийся в выделенном ядерном экстракте (ЯЭ) клеток HeLa. В ходе работы были подобраны условия активации протеазы хламидий, такие как время и температура инкубации CPAF (37°С в течение часа) и субстрата RFX5; а также был определен диапазон рабочих доз рекомбинантного белка (более 10 нг на реакцию). В

качестве отрицательного контроля был выбран пептид глутатион-S-трансфераза (рис.4).

ЯЭ (RFX5) + + + + + +

CPAF, нг - 80 26 9 3

GST, мкг - ■ ■ ■ 0,4

•Ш'. «о«*««'»

Рис.4. Анализ протеолитической активности разных доз белка CPAF по реакции расщепления субстрата RFX5. Все пробы инкубировались в течение часа при 37°С.

В качестве второго субстрата был выбран субстрат виментин. Для этого был синтезирован пептид виментина, содержащий флуоресцентную метку, и активность белка оценивали с помощью FRET-анализа, позволяющего детектировать флуоресценцию на этапе отщепления протеазой N-концевой части субстрата, содержащего гаситель флуоресценции. В результате была определена рабочая концентрации флуоресцентного пептида (8мкМ), необходимая для оценки протеасомной активности исследуемого белка (рис.5).

Б.

. . |

0.16 ■■■■■■■■■

и

0,04 МЯВ

О 5 10 15 20 25 30

отношение флуоресценций

Рис.5. Флуоресцентный анализ реакции расщепления пептида О-УК-Р. Уровень флуоресценции представлен как соотношение уровня флуоресценции в пробе к уровню флуоресценции нерасщепленного пептида. А. Зависимость флуоресценции от концентрации пептида Б-УК-Р в реакции с протеиназой К. Б, Зависимость флуоресценции от концентрации белка СРАР в реакционной смеси.

А.

0 ^ 0,125 X 0,25

1

1

5 10 15 20 25 30

отношение флуоресценций

Таким образом, по результатам проведенной работы удалось доказать ферментативную активность рекомбинантного белка CPAF по реакции специфического расщепления субстратов хламидийного белка. Также были определены оптимальные концентрации компонентов для создания тест-системы, которая на следующем этапе была использована для изучения специфического ингибирования протеолитической активности тестируемыми химическими соединениями. 2. Клонирование гена cpaf в Saccharomyces cerevisiae

В литературе нет данных, напрямую доказывающих связь ферментативной активности белка CPAF с его биологическим действием. Поэтому с целью определения взаимосвязи между протеолитической активности белка и оказываемого им биологического эффекта были проведены эксперименты с использованием эукариотической системы S. cerevisiae.

На начальном этапе работы для исследования биологического эффекта хламидийного белка CPAF в отношении эукариотических мишеней 5. cerevisiae, нами было впервые проведено молекулярное клонирование кодирующей последовательности гена cpaf в дрожжевой экспрессирующий вектор pESC-Ura. В результате трансформации плазмиды в S. cerevisiae был получен штамм-продуцент белка CPAF.

Согласно данным литературы мутация, приводящая в белке к замене аминокислоты лейцина в положении 281 на глицин, нарушает протеолитическую активность CPAF, в результате чего он теряет способность деградировать субстрат RFX5 и другие эукариотические мишени (Pirbhai ML, Dong F.,et al., 2006). В связи с этим нами были сконструированы штаммы дрожжей, продуцирующие мутантный белок.

На следующем этапе для установления биологического эффекта CPAF на клетки S. cerevisiae был использован «drop test». С этой целью готовились суспензии рекомбинантных штаммов дрожжей, содержащих

экспрессирующие плазмиды, а также контрольного штамма, содержащего вектор pESC-Ura.

Индукция экспрессии рекомбинантного белка CPAF в клетках дрожжей приводила к значительному подавлению роста дрожжевой культуры, что указывало на сильный токсический эффект CPAF на эукариотическую систему. Для доказательства специфичности обнаруженного токсического действия был использован белок CPAF с заменой L281G. Продукция мутантного варианта CPAF L281G приводила к значительно меньшему токсическому эффекту по сравнению со CPAF дикого типа, что указывало на прямую связь между токсичностью и ферментативной активностью исследуемого белка хламидий (рис.6).

-вдукгор транскрипции + индуктор транскрипции

вектор с 3 Э 0 в J, * ОООМ> ,

CPAF ,J а ö (jj :. « CPAF ;

CPAF ф J v * t- * CPAP ® S

L281G ■ * L281G

5-1фатные разведения 5-кратные разведения

от стартовой О Ода, =1 от стартоаой ODgM =1

Рис. 6. Токсический эффект CPAF на модели культуры клеток 51. cerevisiae («drop test»).

Согласно данным иммуноблотинга с экстрактами из дрожжевых культур белок CPAF продуцировался в обоих штаммах (рис.7).

К-г CPAF CPAF L281G Рис. 7. Анализ дрожжевых экстрактов

■В " методом иммуноблоттинга с анти-CPAF

Щ * 44* .<■* сывороткой.

у*

^

3. Получение вариантов дрожжей с повышенной устойчивостью к белку CPAF

При изучении токсических свойств на дрожжевых культурах нами был обнаружен любопытный феномен, заключающийся в появлении быстрорастущих клонов дрожжей, в существенной мере устойчивых к токсическому действию белка CPAF (рис.8). Дальнейшие исследования выделенной плазмиды позволили установить, что быстрорастущие варианты S. cerevisiae содержали в себе ген cpcif, имеющий, по данным нуклеотидного секвенирования, типичную структуру.

вектор CPAF

CPAF'

- индуктор транскрипции

• Ф Щ

' © Ф • Щ <sg rt*. ! •(

« © « • « «<I

#■:■:; • -ф Ш Ш Ц» 1 0 & Ф ф т Ф . V

п •> ю ■.

® f. s "

5-храишс разведеаня от стартовой 006ш =1

вектор CPAF

CPAF"

+ индуктор транскрипции

G © О « © +t

* т » at '•

О О > „= ©

5-кратные разведения от стартовой ODz.~3 =1

Рис.8. Ростовая характеристика быстрорастущих продуцентов CPAF (CPAF*) методом («drop test»).

Высокая продукция протеазы хламидий быстрорастущими вариантами S.cerevisiae была подтверждена вестерн-блотгингом (рис.9). К4 CPAF* Рис.9. Анализ выделенных белков из быстрорастущих

клонов дрожжей методом вестерн-блоттинга с анти-CPAF сьшороткой, где «К+» - это лизат штамма-нидухтортранскриявет продуцента белка CPAF.

Повторная трансформация исходных штаммов дрожжей cpaf-содержащими плазмидами, выделенных из быстрорастущих вариантов, приводила к типично сильному токсическому действию (рис.10).

- индуктор транскрипции + индуктор транскрипции

CPAF* /а

CPAF*

CPAF вектор

Рис.10. Ростовая характеристика быстрорастущих продуцентов CPAF (CPAF*), а также штаммов дрожжей, содержащих трансформированные плазмиды из быстрорастущих вариантов (CPAF*/a) методом "drop-test".

Таким образом, результаты анализа роста дрожжей подтверждали исходные данные о токсичности синтезируемого белка CPAF. Для объяснения обнаруженного феномена мы выдвинули гипотезу, согласно которой резистентность быстрорастущих вариантов S.cerevisiae к токсическому действию хламидийной протеазы может быть связана с появлением мутации в гене какого-либо дрожжевого жизненно-важного субстрата белка CPAF, который, в результате аминокислотных замен, становится невосприимчивым к протеолитическому действию продукта хламидий.

4. Выбор ингибиторов белка CPAF

В результате проведенных исследований было установлено, что биологическая активность CPAF определяется его протеолитическим действием на ряд эукариотических белков. Из полученных данных следует, что подавление протеолитической активности CPAF будет приводить к снижению биологических эффектов исследуемой протеазы хламидий на эукариотические клетки и, как следствие, блокировать внутриклеточное развитие хламидий. Это послужило идеологической основой следующего этапа нашей работы, связанного с поиском ингибиторов протеолитической активности белка-мишени CPAF.

О © Ц и

шр

- О j :

. а " iHü

9 Ф # » ю. Bf .

•

• • А в *

% Q в «

5-кратные разведения от стартовой 00^0=1

5-кратные разведенш от стартовой ОГХ;те =1

Наличие данных о трехмерной структуре белка-мишени CPAF, построенной с помощью рентгеноструктурной кристаллографии, а также его комплекса с ингибитором белка CPAF - омуралидом (Huang Z., Feng Y., et al., 2008), позволило использовать методологию виртуального скрининга на основе молекулярного докинга. Группой

биоинформационного анализа под руководством A.C. Карягиной был проведен компьютерный скрининг около 2 млн. соединений, который позволил отобрать потенциальные ингибиторы белка CPAF. Все соединения были разбиты на кластеры и выбрано по одному соединению из 48 разных кластеров для экспериментального тестирования.

Экспериментальный скрининг потенциальных ингибиторов белка-мишени включал в себя три этапа. Во-первых, выбор нетоксичных соединений для эукариотической клетки, во-вторых, выбор эффективных соединений в отношении подавления хламидийной инфекции и, в-третьих, выбор соединений, блокирующих ферментативную активность белка CPAF.

Изучение цитотоксического эффекта отобранных химических соединений проводили на клеточной линии McCoy с использованием методов, позволяющих определить воздействие низкомолекулярных соединений на жизнеспособность и метаболическую активность клеток эукариот. Так, из 48 соединений было отобрано 29 соединений, нетоксичных для эукариотических клеток, для которых цитотоксическая концентрация (СС50), вызывающая гибель 50% клеток, составила более 100 мкМ.

Следующим этапом исследования была оценка влияния отобранных потенциальных ингибиторов на развитие хламидийной инфекции. Для этого нетоксичные соединения вносились до конечной концентрации 25, 50 и 100 мкМ в культуру клеток одновременно с патогеном С. trachomatis. В результате тестирования было отобрано 11 химических соединений, дозозависимо подавляющих внутриклеточное развитие хламидий. При

этом разные дозы тестируемых химических соединений приводили к различным морфологическим изменениям хламидийных включений с образованием мелких, средних и разрушенных включений. Появление разрушенных включений может быть следствием подавления активности белка CPAF, одной из функций которого является регулирование роста хламидийных включений. В результате проведенной работы было показано, что соединение 2394809 в концентрации 100 мкМ полностью подавляло развитие хламидийной инфекции, а соединение 877783 при этой же концентрации снижало количество инфицированных клеток на 80% и приводило к образованию разрушенных включений.

Способность отобранных соединений ингибировать белок-мишень оценивали по реакции расщепления рекомбинантным белком CPAF специфического субстрата RFX5 методом вестерн-блоттиига. Так, из 11 соединений лишь 5 проявляли ингибирующую активность в отношении хламидийной протеазы (рис.11).

ЯЭ (RFX5) + + + + + + + + + + + + + + + + +

CPAF - + + + + + + + + + + + + + + + +

ингибитор, мМ - - 0,5 1 2 0,5 1 2 0,5 1 2 0,5 1 2 0,5 1 2

914532 1920536 560920 877783 2394809 д» „ ^ ^ w дд

Рис. 11. Вестерн-блоттинг с отобранными на первом этапе нетоксичными соединениями, эффективно подавляющими развитие хламидийной инфекции in vitro и ннгибирующими протеолитическую активность белка CPAF.

Два соединения обладали наилучшими характеристиками в отношении подавления хламидий в культуре клеток и способности ингибировать активность протеазы (табл.2). В связи с этим, было решено на их основе синтезировать структурные аналоги с целью улучшения физико-химических и биологических характеристик.

Таблица 2. Характеристика выбранных низкомолекулярных соединений. СС50 -концентраты, вызывающая 50% гибель эукарнотических клеток, IC50 - концентрация, вызывающая 50% подавление инфекции in vitro, СО-стандартное отклонение.

Шифр Класс соединений Структура в ¡VIB тесте СС5„±СО, мкМ в тесте МТТ СС50±СО, мкМ 1С„±СО, мкМ

2394809 индол-3-ил глиоксиламиды 401,3±17,5 638,3±45,5 21,б±3,7

877783 б-оксо-1,6-дигидро-пиримидины ь О 368,5±258,5 45454,6±9,3 19±3,5

Так, на следующем этапе группой органического синтеза ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» было синтезировано 38 структурных аналогов лучших соединений. Аналоги с разными заместителями и направление синтеза были выбраны на основе дополнительно проведенного молекулярного докинга.

Анализ токсичности новых низкомолекулярных соединений позволил отобрать 30 соединений, характеризующихся низкой токсичностью для эукарнотических клеток in vitro, для которых СС50 составила более ЮОмкМ. Результаты исследования новых химических соединений в отношении подавлен™ хламидийной инфекции показали, что из 30 протестированных химических соединений наиболее выраженным подавляющим эффектом обладали 9 соединений, приводящих к дозозависимому снижению количества инфицированных клеток в монослое и изменению морфологии внутриклеточных хламидийных включений.

Экспериментальную оценку влияния выбранных

низкомолекулярных соединений на белок-мишень CPAF также проводили по реакции протеолитического расщепления транскрипционного фактора RFX5. Так, из 9 соединений четыре ингибировали протеолитическую активность (рис .12).

ЯЭ (RFX5) + + + + + + + + + + + + + +

CPAF - + + + + + + + + + + + + +

ингибитор, мМ - - 0,5 1 2 0,5 1 2 0,5 1 2 0,5 1 2

CL-63

CL-69

CL-139

CL-142

Рис. 12. Вестерн-блоттинг с отобранными на втором этапе нетоксичными соединениями, эффективно подавляющими развитие хламидийной инфекции in vitro, ингибирующими протеолитическую активность белка CPAF.

В результате проведенного экспериментального тестирования было выбрано 2 соединения - новых ингибитора белка CPAF: CL-63 и CL-69, обладающих наиболее выраженной ингибирующей активностью и почти полностью подавляющих внутриклеточное размножение хламидий при концентрации 100 мкМ. Выбранные ингибиторы отличались стабильностью и хорошей растворимостью. Стоит отметить, что для новых синтезированных ингибиторов эффективная ингибирующая размножение хламидий концентрация была существенно выше токсичности для эукариотических клеток (табл.3).

Таблица 3. Характеристика новых ингибиторов белка CPAF. СС50-концентрация, вызывающая 50% гибель эукариотических клеток, IC50 - концентрация, вызывающая 50% подавление инфекции in vitro, СО-стандартное отклонение.

Шифр Структура в тесте MB СС.п+СО, мкМ 1С50±СО, мкМ

CL-63 N ( И F \ F 1137,47 ± 18,029 57,76 ±8,1

CL-69 о HS-Xj!0" н 32321,42 ± 198,6 43,22± 2,92

Таким образом, были получены два новых низкомолекулярных ингибитора основного фактора патогенности C.trachomatis, белка CPAF, которые могут послужить основой для разработки нового антихламидийного препарата.

ВЫВОДЫ

1. Созданы генетические конструкции, позволяющие получить значительные количества белка CPAF в нерастворимых тельцах включения, а также водорастворимый ферментативно-активный препарат, подвергающийся характерной автопротеолитической активации.

2. Продукция рекомбинантного белка CPAF в дрожжевых клетках сопровождается подавлением роста S. cerevisiae. Обнаруженный токсический фенотип у дрожжей напрямую связан с протеолитической активностью белка хламидий.

3. С использованием очищенных рекомбинантных белков разработаны методы для определения протеолитической активности CPAF и ее ингибирования низкомолекулярными соединениями.

4. На основе экспериментального тестирования потенциальных ингибиторов белка CPAF, отобранных в результате компьютерного скрининга, выбрано два низкомолекулярных соединения, ингибирующих протеолитическую активность хламидийной протеазы.

5. Химическая оптимизация в сочетании с экспериментальным тестированием токсичности и специфической активности структурных аналогов отобранных ингибиторов позволила получить два новых низкомолекулярных ингибитора белка CPAF С.trachomatis, подавляющих внутриклеточное развитие хламидий in vitro.

Список опубликованных работ

1. Карягина А.С., Зигангирова Н.А., Гришин А.В., Давыдова Д.Ю., Кривозубов М.С., Кирсанов Д.Д., Заякин Е.С. Выбор мишеней и поиск их ингибиторов методами компьютерного моделирования для разработки инновационных препаратов для лечения хронических бактериальных инфекций// Вестник РАМН. - 2011. - №10. — С.22- 28,

2. N.A. Zigangirova, E.S. Zayakin, L.N. Kapotina, E.A. Kost, L.V. Didenko, D.Y. Davydova, J.P. Rumyanceva, A.L. Gintsburg. Development of chlamydial type III secretion system inhibitors for suppression of acute and chronic forms of chlamydial infection//Acta Naturae. - 2012. - Vol. 4(2). - P.87-97.

3. D. Davydova, A. Grishin, A. Karyagina, N. Zigangirova, E. Zayakin, Y. Belyi, A. Gintsburg. Identification of chlamydial protease-like activity factor inhibitors by structure-based virtual and experimental screening// Clinical Microbiology and Infection. -London, 2012. - Vol.18. -P.392.

4. N. Zigangirova, L. Nesterenko, E. Zayakin, N. Kobets, L. Shabalina, D. Balunets, D. Davydova, A. Gintsburg. Inhibition of type III secretion system in Chlamydia trachomatis and Salmonella enterica

serovar Typhimurium by small-molecule compounds in vitro and in vivo// Clinical Microbiology and Infection. - London, 2012.-Vol.18. -P.391.

5. Давыдова Д.Ю. Получение активной формы протеасомного белка Chlamydia trachomatis// Материалы Международной конференции «Биология - наука XXI века». - Москва, 2012. - С.214.

6. D. Davydova, N. Zigangirova, A. Grishin, A. Kariagina, I. Lupu, Y. Belyi. Novel class of small molecule CPAF inhibitors block C.trachomatis infection in vitro/1 Proceedings Seventh Meeting of the European Society for Chlamydia Research. -Amsterdam, 2012. -P.90.

7. D.Y. Davydova, N.A. Zigangirova, N.V. Kobets, E.A. Koroleva, A.V. Grishin, A.S. Karyagina, Y.F. Belyi. Anti-bacterial and immunopotentiative activity of novel CPAF protease inhibitor//Abstracts of the Annual Congress of the British Society for Immunology. - Liverpool, 2013. - Vol.140(1). - P. 74.

8.Давыдова Д.Ю., Зигангирова H.A. Прогеасомный белок Chlamydia trachomatis как основной фактор патогенности возбудителя// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2014. — №2. -СЛ-8.

патент:

Гришин А.В., Давыдова Д.Ю., Заякин Е.С., Луйксаар С.И., Кривозубов М.С., Белый Ю.Ф., Зигангирова Н.А., Карягина-Жулина А.С., Гинцбург А.Л. Применение индол-3-ил-глиоксиламидов для подавления хламидийной инфекции// Патент РФ № 2493259 от 20.09.2013 г.

Подписано в печать: 02.04.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1102 Отпечатано в типографии «Реглет» . Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдова, Дарья Юрьевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ДАВЫДОВА

0420145727?

Дарья Юрьевна

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИИ БЕЛОК CPAF CHLAMYDIA TRACHOMATIS: ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОИСК

ИНГИБИТОРОВ

03.02.03 - микробиология 03.02.07- генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Н.А. Зигангирова, доктор медицинских наук Ю. Ф. Белый

Москва 2014

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................6

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................12

1.1 .Биологическая характеристика хламидий.............................................12

1.2. Таксономическое положение хламидий...............................................13

1.3. Генетические особенности С. trachomatis.............................................14

1.4. Жизненный цикл хламидий................................................................16

1.4.1. Образование хламидийных включений..............................................18

1.4.2. Секретируемые факторы хламидий.....................................................23

1.5. Протеасомный белок С.trachomatis....................................................28

1.5.1 Субстратная специфичность белка CPAF............................................28

1.5.2. Структурная характеристика белка CPAF...........................................31

1.5.3. Секреция белка CPAF через See-зависимый путь..................................35

1.6. Ингибирование белка CPAF...............................................................39

1.7. Разработка антихламидийных препаратов на основе подавления

протеасомного белка.............................................................................42

Заключение........................................................................................44

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................46

2.1. Материалы....................................................................................46

2.1.1. Штаммы, клеточные линии и плазмидные вектора................................46

2.1.2. Реактивы для синтеза и модификации ДНК.........................................46

2.1.3. Общелабораторные реагенты..........................................................46

2.1.4. Питательные среды.......................................................................47

2.1.5.Буферные растворы.......................................................................48

2.1.6. Лабораторное оборудование...........................................................49

2.1.7. Предоставляемые материалы...........................................................50

2.2. Методы........................................................................................50

2.2.1. Культивирование микроорганизмов.................................................50

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК..........................................................51

2.2.3.Постановка полимеразной цепной реакции..........................................51

2.2.3.1. Метод горизонтального электрофореза в агарозном геле......................53

2.2.4. Молекулярное клонирование гена cpaf в Escherichia coli........................53

2.2.5. Делетирование сигнальной последовательности в гене cpaf....................54

2.2.6. Мутагенез гена Cpaf.....................................................................55

2.2.7. Трансформация клеток Escherichia coli..............................................55

2.2.7.1. Выделение и очистка белка из культуры E.coli.................................56

2.2.8. Трансформация клеток S. cerevisiae..................................................57

2.2.8. 1. Выделение белка CPAF из культуры S. cerevisiae................................58

2.2.9. Определение токсического фенотипа у дрожжей «drop test» методом.......58

2.2.10. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку CPAF................................................................................................59

2.2.11. Электрофорез в SDS - полиакриламидном геле.................................59

2.2.11.1. Окрашивание SDS - полиакриламидного геля серебром.....................59

2.2.12. Определение ферментативной активности белка CPAF........................60

2.2. 13. Поиск ингибиторов белка CPAF методами компьютерного моделирования....................................................................................62

2.2.14. Определение цитотоксического эффекта химических соединений методом окрашивания клеток метиленовым синим.................................................63

2.2.15. Определение цитотоксического эффекта химических соединений в МТТ-тесте................................................................................................64

2.2.16. Метод суспензионного заражения эукариотических клеток...................64

2.2.17. Определение влияния химических соединений на внутриклеточное размножение хламидий.........................................................................65

2.2.18. Определение ингибирующей активности низкомолекулярных соединений методом иммуноблоттинга.....................................................................66

2.2.19. Статистическая обработка результатов.............................................67

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................68

3.1. Клонирование гена cpaf в штаммы Е. coli и выделение активного белка CPAF................................................................................................68

3.2. Получение моноспецифичной сыворотки к рекомбинантному белку

CPAF................................................................................................74

3.3. Получение рекомбинантного белка CPAF в биологически активной

форме...............................................................................................74

3.4. Оценка ферментативной активности белка CPAF...................................77

3.5. Клонирование гена cpaf в Saccharomyces cerevisiae................................81

3.5.1. Изучение токсического эффекта CPAF с использованием

S.cerevisiae.........................................................................................83

3.5.2. Получение вариантов дрожжей с повышенной устойчивостью к действию CPAF................................................................................................85

3.6. Выбор химических соединений - ингибиторов CPAF на основе виртуального скрининга.........................................................................................88

3.6.1. Изучение токсичности химических соединений на основе стандартных токсикологических тестов.....................................................................89

3.6.2. Изучение влияния химических соединений на развитие хламидийной инфекции в культуре клеток...................................................................94

3.6.3. Изучение влияния химических соединений на протеолитическую активность белка CPAF..........................................................................98

3.7. Экспериментальное тестирование структурных аналогов выбранных ингибиторов белка CPAF....................................................................................101

3.7.1. Оценка токсичности новых синтезированных соединений с использованием метиленового синего...........................................................................106

3.7.2.Изучение влияния новых синтезированных соединений на внутриклеточное развитие хламидий.............................................................................108

3.7.3. Оценка влияния отобранных низкомолекулярных соединений на

протеолитическую активность белка CPAF...............................................Ill

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................113

выводы.................................

Список использованной литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ишш инфекции, передающиеся половым путем

УГХ урогенитальный хламидиоз

воз Всемирная организации здоровья

CPAF chlamydial protease/proteasome-like activity factor

ЭТ элементарные тельца

РТ ретикулярные тельца

Ж липидная капля

эв экзоцитозная везикула

МВТ мультивезикулярные тельца

цом центр организации микротрубочек

лпс липополисахарид

МНС главный комплекс гистосовместимости

ССТТ система секреции III типа

ОРС открытая рамка считывания

иптг изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозид

КД килодальтон

LB среда Луриа - Бертани

SD синтетическая минимальная среда

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

GST глутатион-Б-трансфераза

dNTP дезоксинуклеозидтрифосфат

SDS додецилсульфат натрия

ТАЕ трис - ацетатный буфер

TBS трис - солевой буфер

ПААГ полиакриламидный гель

ФИТЦ ф луоресцеин-5 -изотиоцианат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Одним из самых распространенных возбудителей инфекций, передающихся половым путем, является Chlamydia trachomatis (Malhotra М., Sood S., et al., 2013). Хламидии вызывают широкий спектр заболеваний, связанных с тяжелыми осложнениями, трахому, урогенитальный хламидиоз, бесплодие, патологию беременности, артриты. В настоящее время для лечения хламидиоза применяют этиотропную терапию, основанную на чувствительности хламидий к некоторым антибиотикам. Однако лечение хламидийных инфекций, особенно при хроническом течении, по-прежнему остается нерешенной проблемой, что во многом обусловлено низкой чувствительностью внутриклеточно персистирующих хламидий к используемым антибиотикам (Шипицына Е.В., Савичева A.M., и др., 2004). Отсутствие эффективных и безопасных препаратов для лечения разных форм хламидийных инфекций определяет необходимость разработки нового подхода для поиска лекарственных средств, основанного на выявлении принципиально новых мишеней у бактериальных патогенов.

Основная стратегия внутриклеточного выживания патогена направлена на инактивацию защитных механизмов хозяина и модуляцию клеточных сигнальных путей, ответственных за контроль развития инфекции. При разработке новых антибактериальных препаратов, эффективных в отношении внутриклеточных патогенов, в том числе и хламидий, перспективными мишенями могут служить ключевые бактериальные молекулы, подавление активности которых позволит «разоружить» патоген, и в дальнейшем он может быть элиминирован иммунной системой организма (Зигангирова H.A., Федина Е.Д., и др., 2009). Поэтому действие новых препаратов должно быть направлено на ингибирование специфических механизмов, которые способствуют развитию инфекции и принципиально важны для подавления защитных механизмов хозяина.

Реализация такого подхода возможна на основе технологии «мишень-направленного поиска», предусматривающая полный цикл разработки новых

кандидатных препаратов для антимикробной терапии. Этот цикл включает в себя: выбор биомишени, виртуальный скрининг библиотек химических соединений для поиска потенциальных ингибиторов выбранной мишени, синтез и химическую оптимизацию низкомолекулярных соединений, создание бесклеточных и клеточных систем скрининга, экспериментальный скрининг, использование экспериментальных моделей инфекции in vitro и in vivo. Применение такой технологии позволяет существенно сократить время разработки нового препарата с предсказанным механизмом действия.

Ведущую роль в патогенезе хламидийной инфекции играет белок CPAF (chlamydial protease/proteasome-like activity factor), подавляющий множественные сигнальные пути клетки-хозяина, и благодаря этому обеспечивающий возможность установления инфекции и длительного выживания патогена в организме хозяина. Белок CPAF расщепляет транскрипционные факторы (Zhong G., Liu L.,et al., 2000), проапоптозные белки (Dong F., Pirbhai M. et al., 2005) и компоненты системы промежуточных филаментов клетки-хозяина (Kumar Y., Valdivia R.H., et al., 2008), препятствуя презентации антигенов хламидий на поверхности зараженной клетки, блокируя индукцию апоптоза хозяйской клетки и способствуя росту хламидийных включений. Кроме того, протеасомный белок CPAF имеет не только эукариотические мишени, но также способен расщеплять и некоторые белки самого патогена, выполняя функцию регуляторного белка и координируя активность хламидийных белков (Jorgensen I., Bednar М.М., et al., 2011). Однако до сих пор не проводились исследования, направленные на изучение биологической активности белка и ее взаимосвязи с протеолитической активностью.

Таким образом, белок CPAF является ключевым фактором патогенности, что делает его перспективной бактериальной мишенью для создания нового антихламидийного препарата.

Цель диссертационной работы. Целью работы являлась характеристика функциональной активности фактора патогенности хламидий белка CPAF и поиск специфических ингибиторов протеолитической активности белка.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

• Клонировать ген cpaf в Е. coli, оптимизировать условия его экспрессии и разработать схему получения белка в биологически активной форме.

• Осуществить генетический анализ цитотоксического действия CPAF с использованием дрожжей S. cerevisiae.

• Разработать системы тестирования биологической активности белка CPAF in vitro, необходимые для скрининга низкомолекулярных химических соединений.

• Провести экспериментальное тестирование выбранных на основе компьютерного моделирования потенциальных ингибиторов белка CPAF с целью получения эффективного низкомолекулярного ингибитора хламидийной протеазы.

Научная новизна работы. Впервые созданы генетические конструкции, позволяющие целенаправленно получать препаративные количества очищенного белка CPAF как в денатурированной высокоиммуногенной, так и в растворимой ферментативно активной форме. Впервые создана биологическая модель с использованием дрожжей S. cerevisiae, пригодная для изучения генетических особенностей и механизма цитотоксического действия белка CPAF. Показана высокая токсичность протеиназы хламидий на дрожжевые клетки.

Впервые обнаружены ингибиторы протеолитической активности белка CPAF среди низкомолекулярных соединений класса индол-3-ил-глиоксиламидов и б-оксо-1,6-дигидро-пиримидинов.

Практическое значение работы. Разработаны технологии получения высокоочищенного белка CPAF в препаративных количествах. Очищенный белок может быть использован для приготовления моноспецифических сывороток и разработки на их основе диагностических тест-систем. Разработана модель для

исследования токсических факторов бактериального происхождения с использованием дрожжей S. cerevisiae.

Отобраны низкомолекулярные соединения, подавляющие хламидийную инфекцию в культуре клеток и блокирующие протеолитическую активность белка CPAF in vitro. Данные ингибиторы могут послужить прототипом лекарственного препарата против инфекций, вызываемых С. trachomatis.

По результатам работы подготовлены методические рекомендации «Определение токсичности факторов патогенности бактерий с использованием дрожжей Saccharomyces cerevisiae», утвержденные советом по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России 25 января 2013 г, протокол № 23.

Основные положения, выносимые на защиту.

Методами генной инженерии получен высокоиммуногенный и ферментативно активный рекомбинантный белок CPAF, фактор патогенности С. trachomatis.

Впервые создана экспрессирующая рекомбинантный белок CPAF модель на основе его клонирования в S. cerevisiae, позволяющая оценивать биологическую активность хламидийной протеазы в отношении эукариотических клеток S. cerevisiae.

С целью поиска специфического ингибитора белка CPAF проведено экспериментальное тестирование отобранных методами компьютерного скрининга низкомолекулярных химических соединений, а также структурных аналогов экспериментально выбранных ингибиторов хламидийной протеазы.

Получены два ранее неизвестных ингибитора протеазы С.trachomatis, подавляющие внутриклеточное размножение патогена in vitro.

Выбранные ингибиторы - низкомолекулярные соединения, нетоксичные для эукариотических клеток, блокирующие протеолитическую активность белка CPAF в отношении эукариотических мишеней и подавляющие хламидийную

пролиферацию, могут рассматриваться как перспективные соединения для разработки лекарственного средства против инфекций, вызываемых С. trachomatis.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 22-ом съезде Европейского Общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (Лондон, 2012), на Седьмом заседании Европейского общества исследования хламидиоза (Амстердам, 2012), международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), на Ежегодном конгрессе британского общества иммунологов (Ливерпуль, 2013).

Апробация работы состоялась 19 декабря 2013 года на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список использованной литературы, содержащий ссылки на 155 источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 32 рисунками.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биологическая характеристика хламидий

Хламидии - грамотрицательные бактерии с облигатным типом паразитирования; вызывают различные заболевания человека, животных и птиц. Свое название хламидии получили от греческого слова «%tax¡_iú5a », что означает «мантия», так как в инфицированных клетках они образуют включения, окруженные оболочкой, напоминающей мантию (Schachter J., 1990).

Хламидии представляют собой мелкие бактерии шаровидной или овоидной формы. Клеточная стенка хламидий представляет собой двухслойную мембрану, ограничивающую периплазматическое пространство, однако практически не содержит N-ацетил-мурамовую кислоту - основной компонент пептидогликана (Fox A., Rogers J.C., 1990). Но при этом в геноме содержатся гены, кодирующие белки, необходимые для полного синтеза пептидогликана. Синтезируемые компоненты пептидогликана имеют иные функции, отличные от других бактерий, и важны для клеточного деления хламидий (McCoy A.J., Sandlin R.C., 2003).

Ригидность клеточной стенке придают цистеинбогаты