Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические аспекты разработки иммуноанализа для диагностики хламидиоза овец

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты разработки иммуноанализа для диагностики хламидиоза овец"

Ш^рщ^рукописи

Полянина Татьяна Ивановна

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ИММУНОАНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005559729 3 МАР 2015

Саратов-2015

005559729

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном паучнем учреждении «Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт» (ФГБНУ «Саратовский НИВИ»)

Научные руководители: Федорова Валентина Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт»,

отдел зоо-зооантропонозных заболеваний, заведующая отделом Мотнн Владимир Леонидович кандидат биологических наук

Медицинский Факультет Университета Техас, США, лаборатория патогенных микроорганизмов, заведующий лабораторией Официальные оппоненты: Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»,

кафедра микробиологии, биотехнологии и химии, профессор кафедры Пльясов Павел Владимирович кандидат биологических наук

Государственное научное учреждение Самарская научно-исследовательская ветеринарная станция, заместитель директора по науке Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский

научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности, Московская обл., Щелковский р-н, п/о Кашинцево

Защита состоится «8» апреля 2015 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при Федеральном государственном бюджетом учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук по адресу: 410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13. Тел./факс (8452)97-03-83

Автореферат диссертации размещен на официальном сайге Минобрнауки РФ. Диссертация и автореферат диссертации размещены на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnvv-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФРМ РАН. Автореферат диссертации разослан <'.12 » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Н Позднякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время задачи ветеринарной медицины по обеспечению сохранности, увеличения поголовья сельскохозяйственных животных и поддержанию эпизоотического благополучия территории страны весьма усложнились, поскольку темпы и объемы транспортировки животных, продукции и сырья с каждым годом увеличиваются не только внутри страны, но и между государствами. В связи с этим от ветеринарной службы зачастую требуется принятие оперативных решений, основанных на применении современных методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (Шевырев и др., 1999; Обухов, 2000). Однако существуют некоторые опасные и карантинные инфекционные болезни, для которых еще не разработаны быстрые, качественные и информативные диагностические тесты. Особое место среди них занимает хламидиоз сельскохозяйственных животных, который Решением комиссии Евроазиатского таможенного союза в 2010 г. вошел в перечень опасных и карантинных инфекционных болезней. Хламидийная инфекция поражает млекопитающих, рептилий и птиц и наносит ощутимый экономический ущерб животноводству, который складывается из недополучения прироста живой массы и приплода, увеличения падежа и вынужденного убоя животных, а также затрат на проведение мероприятий по профилактике и ликвидации болезни (Ковалев, 1971; Моисеев, 2000; Чугунова, 2004; Равилов, 2010; Фомченко, Наконечный, 2013; Митрофанов, 2013). Широкий спектр осложнений, вызванных хламидийной инфекцией, связан с распространением возбудителя из первичного очага инфекции в отдаленные органы интраканаликулярным, лимфогенным, интранатальным и гематогенным путями (Зигангирова и др., 2007; Пашко и др., 2010), а также при прохождении плода через родовые пути животного. Судя по публикациям последних десяти лет, эта инфекция получила повсеместное распространение и представляет собой реальную угрозу для здоровья, как животных, так и людей, в том числе, профессионально не занятых в животноводстве (Макеева, 2001; Караваев и др., 2005; Обухов, 2013). Трудности диагностики хламцдийной инфекции связаны с выраженным полиморфизмом клинических проявлений, зачастую бессимптомным течением, приводящим к спонтанным абортам и последующему бесплодию. Согласно официальной статистике, в РФ количество неблагополучных по хламидиозу овец хозяйств в 2008-2010 г составило 28,9-69%, а заболеваемость - 6,2-18,9%, соответственно. Следовательно, современному животноводству требуется качественная и своевременная лабораторная диагностика данного заболевания с применением диагностических систем нового поколения, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью, экспрессностью, простотой постановки и учета реакции (Шафикова, 1991; Алимов, 2010).

Степень разработанности проблемы. До настоящего времени были предложены бактериологические методы, основанные на выделении' возбудителя в культуре клеток или куриных эмбрионах; серологические методы - на выявлении специфических хламидийных антител (реакция связывания комплемента, иммуноферментный анализ (Моисеев, 2000)); молекулярно-генетические - на обнаружении ДНК или РНК инфекционного агента (полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция). Каждый метод имеет свои достоинства и недостатки. Преимуществом серологических методов считают простоту постановки реакций, однако

сравнительно низкая специфичность и чувствительность снижает их привлекательность для практической ветеринарии (Михин, Леонов, 1938; Розанов, 1952; Перадзе, Халонен, 1985; Пастер и др., 1989; Ганова и др., 2004; Титов, 2008; Но et а!., 2009). Молекулярно-генетические методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью (Обухов, 2000; Meyer, 2009; Pedersen et al., 2009), являясь при этом достаточно дорогостоящими, а доказанная в последние годы значительная вариабельность генома возбудителя хламидиоза зачастую обеспечивает большое количество ложноотрицательных результатов (Hoorfar, Cook, 2002; Метельская и др., 2008; Вафин, 2009; Meyer, 2009; Pedersen et al., 2009). К тому же, в настоящее время имеется достаточно доказательств отсутствия строгой специфичности возбудителя хламидиоза по отношению к своим биологическим хозяевам. Установлено, что помимо Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis может вызывать заболевание, как у человека, так и у животных, имеют место и перекрестные заражения. Поэтому диагностические тесты, направленные на выявление только С. psittaci, могут давать определенное количество ложноотрицательных результатов (Deptula et al., 1990; Busch et al., 2000; Pospisil, Canderle, 2004; Ozbek et al, 2008). Снижает диагностическую значимость тест-систем и необходимость доставки клинического материала в лабораторию, поскольку при длительной или неправильной транспортировке повышается риск получения ложноотрицательных ответов.

Большинства указанных недостатков лишены методы иммуноанализа. Наиболее перспективными для лабораторной диагностики инфекционных заболеваний считаются такие модификации, как дот-иммуноанализ (ДИА) и иммунохроматографические тест-системы (ИХТ) (Блинов, 1995; Сазыкин и др., 2008; Яковлева, 2013). Низкая себестоимость и простота их постановки позволяют проводить массовые исследования с минимальными затратами на оборудование и квалифицированный персонал и за короткое время (10-30 мкнут) выявлять в исследуемом клиническом материале антигены искомого патогена. Очевидно, что конструирование ДИА для скрининговой лабораторной диагностики хламидиоза овец и ИХТ, перспективного для использования непосредственно в мостах содержания животных (на фермах, пастбищах, домашних подворьях и т.д.), делает разработку указанных тестов особенно актуальной и востребованной в условиях современного животноводства.

Создание указанных вариантов иммуноанализа предопределяет, в первую очередь, необходимость разработки технологии получения специфических хламидийных антител (ХАТ), которая отличалась бы простотой и возможностью быстрого получения их препаративного количества (Выгодчиков, 1964; Кегги, 1991; Andreotti et al., 2003; Альтшулер и др., 2010; Гришин, Валякина, 2013). Весьма перспективным, на наш взгляд, является использование биотехнологии получения моноспецифических антител с применением в качестве биопродуцентоз мышей инбредной линии BALB/c. В отличие от кроличьих сывороточных поликлональных полиспецифических антител, требующих адсорбции гегерологичными микроорганизма.™ для удаления перекрестно-реагирующих агглютининов, мышиные моноспецифические политональные антитела из иммуноасцитических жидкостей пригодны для использования без дополнительных этапов очистки (Федорова и др., 1996). Более того, в мышиной асцитической жидкости содержится сопоставимое с сывороткой крови кролика количество специфических иммуноглобулинов, и для получения равного с кроликом количества специфических антител

необходимо не более 4 мышей (Девдариани и др., 1998; Девдариани, Федорова, 1991; Федорова, 2004). В качестве метки специфических ашител наиболее часто использовалось коллоидное золото, которое по сравнению с остальными метками считается «идеальным маркером» благодаря таким преимуществам, как заданный размер и форма наночаспщ, устойчивость к агрегации и прочная связь с биомолекулами без изменения их активности. Также важным преимуществом данной метки считается безопасность наночаспщ золота, как для исследователя, так и для окружающей среды (Калиновский и др., 1998; Al-Yousif et al, 2002; Sharma et al, 2005; Дыкман, Богатырев, 2007; Assadollahi et al, 2009; Houghton et al, 2009; Дыкман, Хлебцов, 2011; Fasla etal., 2011; Османова, 2012).

Цель работы - разработка основных этапов биотехнологии конструирования экспериментальных вариантов тест-систем доя скрининговой и экспресс-диагностики хламидиоза овец на основе специфических хламидийных антител, меченных наночастицами золота.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную технологию конструирования вариантов иммуноанализа для выявления возбудителя хламидиоза овец в условиях лаборатории и на месте содержания животных, включающую этапы получения ХАТ как основы иммунотесга с использованием в качестве биопродуцентов мышей линии BALB/c и кроликов; приготовления на основе полученных Ig экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов; тестирования основных компонентов тест-систем и этапов постановки анализа.

2. Изучить диагностическую значимость и апробировать экспериментальные варианты иммунотестов на клиническом материале от овец (лабораторные испытания).

3. Провести исследования клинического материала от овец на наличие генетического материала хламидий видов С. psittaci и С. trachomatis с применением современных молекулярно-генетических методов, биоинформатики, а также иммуноанатиза.

4. Изучить возможные изменения генома вариантов С. trachomatis, представленных, совместно с С. psittaci, в клиническом материале от овец и влияющих на оценку диагностической значимости сконструированных вариантов иммунотестов для детекции возбудителя хламидиоза.

5. Разработать систему валидации иммунотестов для диагностики хламидиоза овец с использованием современных молекулярно-генетических методов - секвенирования, геногапирования, биоинформатики, а также ПЦР с комбинацией оригинальных и коммерческих праймеров на плазмвдные и хромосомные мишени С. trachomatis.

Научная новизна. Впервые показана принципиальная возможность использования инбредных мышей линии BALB/c в качестве биопродуцешов ХАТ, путем использования принципов гибридомной технологии, применение которой позволило значительно (в 7 раз) сократил, сроки получения ХАТ и снизить количество требуемого антигена по сравнению с кроликами. Новыми являются данные о способности полиоксидония (ПО) при совместном введении с антигенами хламидий индуцировать выработку у мышей BALB/c более высоких титров ХАТ в более ранние сроки по сравнению с полным и неполным адьювантом Фрейнда (ПАФ/НАФ) или TiterMax (ТМС). Использование экспериментальных серий иммуноконъюгата мышиных ХАТ и наночаспщ коллоидного золота диаметром (d) 40 нм позволило повысить интенсивность

цветного сигнала в 2 раза и, соответственно, улучшить качество интерпретации результатов, полученных в ДИА и ИХТ. Установлено повышение эффективности ИХТ не менее чем на 30% при использовании на этапе пробоподготовки специального буфера для образцов, разрушающего эпителиальные клетки и обеспечивающего доступность хламидийных клеток и локализованных на них специфических хламидийных антигенов для взаимодействия с ХАТ. Приоритеты.™ являются сведения о возможности выявления в клинических образцах от больных хламидиозом овец содержащих генетический материал С. psittaci, ДНК диких штаммов С. trachomatis (wtCT), а также природных мутантов в виде новых «шведских» вариантов С. trachomatis (nvCT), штаммов с дефектами в области плазмидных генов orf2 и otj8 и однонуклеотидными заменами (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) в позициях 995 и в 997 гена ompl в регионе вариабельного участка VD4. Разработаны научно-методические основы системы валидации для контроля качества разрабатываемых ветеринарных диагностических препаратов, направленные на индикацию возбудителя хламидиоза овец.

Практическая значимость работы. С применением инбредных биопродуцентов, мышей линии BALB/c (источника ХАТ), разработаны основные этапы экспериментальной биотехнологии конструирования иммунотестов для лабораторной диагностики хламидиоза овец в случае моноинфекции С. psittaci, ко-инфекции с wtCT, в том числе, несущими дефекты в критической плазмиде, и nvCT. Оптимизирована биотехнология получения кроличьих ХАТ как источника ксеногенных тестовых иммуноглобулинов (Ig), необходимых для конструирования ИХТ. На основе экспериментальных серий мышиных и кроличьих ХАТ сконструированы два варианта иммунотеста для диагностики хламидиоза овец: ДИА40/15 для массового обследования поголовья овец в условиях диагностической лаборатории и ИХТ40/15 для экспресс-диагностики в местах содержания животных. Результаты использования обеих тест-систем могут быть учтены и, в случае необходимости, архивированы без использования дополнительного оборудования. Экспериментальные варианты каждой тсст-сисгсмы успешно апробированы на клиническом материале от овец неблагополучного по хламидиозу ООО «Наир» Саратовской области. Разработана система валидации иммунотестов, сочетающая параллельное использование ПИР с комбинацией оригинальных праймеров на плазмидные и хромосомные мишени, коммерческих хламидийных моноклональных антител (МКА) и наборов ПЦР. Предлагаемая система валидации направлена на повышение эффективности лабораторной диагностики хламидиоза овец путем значительного сокращения количества лажноположительных и ложноагрицательных ответов в создаваемых диагностических тест-системах и, соответственно, повышение их качества. По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ФГБНУ «Саратовский НИВИ» «Методические рекомендации по выявлению возбудителя хламидиоза овец в ДИА40/15 и ИХТ40/15» (от 7 октября 2014 г.), а также «Методические рекомендации по использованию системы валидации иммунотестов для повышения качества лабораторной диагностики хламидиоза овец» и «Методические рекомендации по детекции новых «шведских» вариантов хламидий в клиническом материале от овец» (от 21 октября 2014 г.). Материалы исследований используются при чтении курса лекций по биотехнологии и микробиологии студентам Саратовского государственного аграрного университета им. НИ Вавилова (ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ»),

Методология и методы исследования. При проведении данного исследования и изложении материала были использованы общепринятые научные экспериментальные и теоретические методы: микробиологические, молекулярно-генетические, биохимические, методы иммуноанализа и биоинформатики. Результаты, представленные в данном исследовании, получены с использованием современного оборудования (поверенного и сертифицированного). Полученные экспериментальные данные были обработаны при помощи соответствующих статистических методов. Использование вышеперечисленных методов в совокупности с эмпирическим и компьютерным анализом полученных данных позволили сделать объективные выводы и результаты.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана экспериментальная биотехнология получения мышиных и кроличьих ХАТ -основы иммуногестов для диагностики хламидиоза овец.

2. Сконструированные на основе экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов варианты иммуноанализа ДИА40/15 и ИХТ40/15 для диагностики хламидиоза овец позволяют выявлять случаи моноинфекции С. psittaci, ко-инфекции с vvtCT, а также пггаммы С. trachomatis с дефектами в критической плазмиде, включая nvCT.

3. В параллельных исследованиях с коммерческими хламидийными МКА и наборами для ПЦР, в том числе, в режиме реального времени, и ПЦР с панелью оригинальных праймеров к плазмидным и хромосомным мишеням хламидий установлена высокая диагностическая значимость разработанных экспериментальных иммуногестов, что позволяет рекомендовать их в качестве перспективных для внедрения в ветеринарную пракшку.

4. Обнаружение в клиническом материале от абортировавших овец специфического генетического материала С. psittaci, дикого штамма С. trachomatis геновара Е, нового «шведского» варианта С trachomatis с делецией размером 377 п.н. в районе гена orfl критической плазмиды, а также штаммов с дефектами в генах orfl и orß доказывает необходимость использования новых критериев контроля качества разрабатываемых тсст-систсм для детекции возбудителей хламидиоза овец.

5. Полиморфизмы гена отр! штаммов С. trachomatis в клинических образцах овцы-1 в виде SNP в 995 и 997 нуклеотидах (G—»A) вариабельного участка VD4 приводят к аминокислотной замене серина на аспзрагин и аланина на треонин, соответственно, что, в свою очередь, может способствовать изменению локальной структуры белка.

6. Разработана система валидации иммунотестов, включающая в себя использование коммерческих моноклональных хламидийных антител и вариантов ПЦР с панелью оригинальных и коммерческих праймеров на плазмидные и хромосомные мишени. Данная система позволяет оценивать тест-системы для диагностики хламидиоза с учетом их способности детектировать как \vtCT, так и варианты С trachomatis с дефектами в плазмиде, в том числе, nvCT.

Работа выполнена на базе ФГБНУ «Саратовский НИВ И» в ходе выполнения научно-исследовательских работ по заданию Россельхозакадемии «08.02.01 - Разработать эффективные средства и метода специфической профилактики, диагностики и лечения на основе мониторинга наиболее распространенных инфекционных (в том числе зоонозных) и протозойных болезней млекопитающих животных, северных оленей, рыб и пчел и изучения биологических свойств

возбудителей» в рамках «Плава фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 годы», а также при частичной поддержке Российских и международных научных проектов: NIH/BTEP/ISTC #3846, «Разработка экспресс-метода лабораторной диагностики Chlamydia trachomatis», совместно с Университетом им. Дж. Хопкинса (Балтимор, США), 2008-2014; Национальная ассоциация инноваций и развитая информационных технологий (НАИРИТ) № НК-32 «Конструирование нового оригинального однсотапного иммуноанализа для экспресс-диагностики хламидиоза», 2011 г.; Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере № 19747 «Разработка лабораторного образца ветеринарного иммуногесга, исследование и ошимизация диагностики хламидиоза у домашних животных», 2012-2013 г.; Федеральная целевая программа, соглашение № 14.В37.21.0563 «Разработка когерентно-оптических биосенсоров на генетическом, клеточном и организменном уровнях организации», 2012-2013 г.; Федеральная целевая программа, соглашение № 14.132.21.1312. «Молекулярно-генетическая характеристика возбудителя хламидиоза Chlamydia trachomatis и перспектива разработки универсальной высокочувствительной мультиплексной платформы для детекции хламидий в клинических образцах от человека и животных», 2012-2013 г.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены на: научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского государственного медицинского университета: «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2009); международной научной конференции, посвященной 15-летию кафедры экологии Саратовского государственного аграрного университета им. НИ. Вавилова (Саратов, 2009); форуме "Research Sustainability" (Астана, Казахстан, 2009); международной конференции, посвященной 80-летию Самарской научно-исследовательской станции Россельхозакадемии (Самара, 2009); международной научно-пракшческой конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека» (Минск, Беларусь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Социальные проблемы медицины и экологии человека», посвященной 100-летию Саратовского государственного медицинского университета (Саратов, 2009); 12lh International symposium on human chlamydial infections (Hof bei Salzburg, Austria, 2010); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург,

2010); международной научно-пракгаческон конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины», посвященной 121-й годовщине ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии (Саратов, 2011); 5th Biennial meeting of the chlamydia basic research society (Redondo Beach, California 2011); 5th Annual global vaccine congress, (Seattle, USA,

2011); 7th Meeting of the European society for chlamydia research (Amsterdam, The Netherlands, 2012); международной молодежной научной школе (Оренбург, 2012); Ш международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012); П Всероссийской научной конференции молодых ученых

«Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); 5th Congress of European microbiologists (Leipzig, Germany, 2013); IUSTI Europe scientific meeting (St Julian, Malta, 2014), международной конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарной медицины» (Самара, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 работ, в том числе, 5 статей, представленных в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора. Автор принимала активное участие в планировании и проведении экспериментов, обобщении и интерпретации полученных результатов работы, апробации тест-систем. Автором лично проведен компьютерный и статистический анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, подготовлены публикации, представлены полученные экспериментальные данные на отечественных и зарубежных конференциях разного уровня.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (4 главы), включающих описание объектов, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 337 источников, из них - 153 зарубежных. Объем диссертации составляет 206 страниц, в том числе, 35 рисунков и 24 таблицы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекггы, материалы и методы исследований

Экспериментальные животные. Для получения ХАТ использовали сингенных по отношению к миеломным клеткам Sp.2/0-Ag.8 мышей инбредной линии BALB/c весом 18-20 г в возрасте 8-12-иедель из лицензированного питомника филиала «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН, М.о., Солнечногорский район, п. Ацдреевка Для наработки поликлональных специфических антител использовали »роликов породы Шиншилла весом 2,5-3 кг из питомника Федерального государственного учреждения Саратовская межобластная ветеринарная лаборатория, г. Саратов.

Антигены. Для отработки стадий биотехнологии получения специфических ХАТ использовали коммерческий препарат С-аншгена возбудителя хламидийной инфекции сельскохозяйственных животных (стандартный орнигозный ангаген), выделенный из штаммов С. psittaci «Улетово-96-ВНИиТИБП», «Лори» и «250» (коллекция микроорганизмов института вирусологии им. ДИ. Ивановского) (Патент RU 2223497; Люлькова, 2013), обозначенный нами как «С-аг-1». Параллельно применяли антиген С. trachomatis («С-аг-2») производства Минмедбиопром Украины (г. Одесса), любезно предоставленный к.м.н. Банниковой ВА. (Банникова, 2004; Федорова и др., 2005).

Методы исследований. Иммунизацию кроликов и мышей проводили путем инъекции антигена с адьювангом или без него в зависимости от схемы иммунизации. В качестве адьювантоз использовали полный (ПАФ) и неполный (НАФ) адьюванты Фрейнда (Difco Laboratories, США), полиоксидоний (ПО) (Иммафарма, Россия) и ТйегМах Gold Adjuvant (TMQ (Sigma-Aldrich, США). Дтя стимуляции асцитообразования, иммунным мьппам, предварительно праймированным минеральным маслом «Pristane» (Sigma-Aldrich, США) (Пат, 1989; Кэтга и др., 1991; Feodorova etal., 2001; Kovalchuk et al., 2002; Прохватилова и др., 2006; Orlova et ей., 2012), инокулировали сингенную

миеломную линию Sp2/0-Ag.8 (Банникова, 2004; Федорова и др., 2005). Специфические иммуноглобулины (Ig) из иммуноасщпической жидкости (АЖ) мышей и сьшоротки крови кроликов выделяли методом ступенчатого осаждения % сульфатом аммония (Фримель, 1987). Освобождение Ig от солей аммония проводили диализом против фосфатно-солевого буфера (PBS) (Скоупс, 1985; Коллинз, 1991) или гель-фильтрацией на колонках с сефадексом G-25M (Скоупс, 1985). Чистоту Ig контролировали фракционированием ХАТ в 12,5% ПААГ-SDS по методу U.K. Laemmli (Laemmli, 1970). Титры полученных ХАТ исследовали в непрямом ТИФА с «С-ai^l» и «С-аг-2» в качестве сенсишнов, специфичность - в ДИА на ншроцеллюлозных мембранах (НЦМ) с диаметром пор 0,2 и 0,45 мкм производства: «Bio-Rad» (США), «Amersham» (Великобритания) и «Владипор» (Россия).

Для приготовления экспериментальных серий иммунозолотых конъюгатов ХАТ готовили раствор коллоидного золота по методу Френса (Frens, 1973) с диаметром наночастиц 20 и 40 нм (Аи20 и Аи40, соответственно). Определение «золотого числа» и коньюгирование с ХАТ проводили согласно рекомендациям (Dykman, 2000; Дыкман, 2005). Полученные серии конъюгатов, обозначенных как «Ig4-Au20», «Ig4-Au40», «Igl4-Au20», <dgl4-Au40», хранили при +4°С. Для отдельных экспериментов иммунозолотые коньюгаты концентрировали в 5-10 раз центрифугированием в течение 25 минут при 14000 об/мин (16873g). ИХТ конструировали с использованием следующих видов мембран: полисульфоновой GE Water & Progress Technologies с диаметром 8,0 микрон (Lermtech, Netherlands), НЦМ Hi-Flow Plus 90 и Hi-Flow Plus 240 (Merck Millipore, Germany), а также стекловолоконной Conjugate release matrix, (MDI, India), для фиксации иммунозологого конъюгата.

Забор клинического материала (цельная и гепаринизированная кровь, соскобы со слизистых влагалища и носа) от заведомо больных хламидиозом овец из ООО «Наир» Саратовской области и здоровых особей (п=285) производили в транспортные среды с помощью стерильного зонда-тампона (ООО "ГЕМ", Москва) и/или ложки Фсиькмаиа (МедФарм, Россия). Процедура проводилась в соответствии с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, 2008). Дополнительно были взяты соскобы со слизистой мочевого пузыря, влагалища и носа после патологоанатомического вскрытия двух овец с хламидиозным абортом в анамнезе (обозначены в нашем исследовании как овца-1 и евца-2). Хтамидии внутри эпителиальных клеток выявляли окраской мазков методом Романовского-Гимза (Дмитриев, 1999).

Валидацию сконструированных экспериментальных вариантов иммуноанализа (ДИА40/15 и ИХТ40/15) проводили в ДИА с использованием коммерческих серовароспецифических хламиднйных МКА (Куглин и др., 1996) и методов молекулярной биологии. Выделение ДНК из клинических образцов и выявление ДНК С. psittaci и С. trachomatis в ПЦР осуществляли коммерческими наборами «ДНК-сорб-АМ», «ХЛА-ПСИТ», «АмплиСенс Chlamydia trachomatis -Eph» (ИнтерЛабСервис, Россия) и «РеалБест ДНК Chlamydia trachomatis, комплект 1» (серия набора 1077, D-1998, ВекгсрБесг, Россия).

Определение геновара (сероварианта) бактерий С. trachomatis, детектируемых в клиническом материале, проводили по вариабельному региону VD2 гена ompl, кодирующего

МОМР, с помощью праймеров (momp-fwl; momp-fw2; momp-fw3; momp-rvl; momp-rv2; momp-rv3; momp-rv4), описанных в работе (Quint et aL, 2007), в нашей модификации.

Для детекции ДНК С. trachomatis также использовали прямые и обратные праймеры на гомологичный хромосомный ген 16S рибосомального белка (16Srb) - открытая рачка считывания СТ026 в геноме штамма С. trachomatis D/UW-3/CX, депонированного в генном банке под номером АЕ001273, предложенные (Slepenkin et al., 2003). Праймеры CT026-16S-152_F/CT026-16S-152_R амплифицировали фрагмент размером 152 п.н.

Дтя изучения изменений в криптической плазмиде С. trachomatis использовали оригинальные прямые и обратные праймеры на плазмидные гены orf2 и orj8 (обозначение открытых рамок считывания приведено согласно последовательности плазмиды pCTDLCl штамма С. trachomatis D-LC, депонированной в генном банке под номером СР002055). Праймеры (ORF2-145_F/ORF2-145_R; ORF8-150_F/ORF8-150_R) были нами рассчитаны с использованием программы Primer 3 (http://bioinlb.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). В присутствии ДНК С. trachomatis праймеры амплифицировали фрагмент размером 150 п.н. и 145 п.н., соответственно. Положительным контролем служила ДНК С. trachomatis серовара Е штамма BOUR (АТСС, VR-348BD).

Дтя выявления nvCT применяли праймеры, предложенные ранее (Catsburg et al., 2007). Прямой праймер swCT_serE_F применялся без изменений, а обратный праймер svvCT_serE_R был модифицирован нами в одном нуклеогиде. В присутствии ДНК \vtCT, праймеры swCT амплифицировали фрагмент размером 474 п.н., а при детекции nvCT, несущих делению в 377 п.н., фрагмент амплификации составлял 97 п.н.

Амплификацию полноразмерного гена ompl с целью последующего определения нуклеотидной последовательности и обнаружения в данном гене SNP осуществляли с панелью прямых и обратных праймеров MOMP-EFl.seq; MOMP-E_F3.seq; MOMP-E_F5.seq; МОМР-E_R2.seq; MOMP-E_R4.seq; MOMP-E_R6.scq, рассчитанных для консервативных участков данного гена в программе Primer 3, или праймеров F11 и В11, как описано ранее (Dean et aL, 1995). В присутствии ДНК С. trachomatis пара праймеров F11+B11 амплифицировала фрагмент размером 1021 п.н., MOMP-E_Fl+Bl 1 - 1156 п.н., MOMP-E_F5+Bll - 374 п.н. Очистку фрагментов амплификации проводили коммерческим набором «Cleanup Mini для выделения ДНК из агарозного геля и реакционных смесей» (Евроген, Россия). Нуклеотидную последовательность фрагментов амплификации гена ompl с панелью гомологичных праймеров определяли секвенированием по методу Сенгера. Каждый участок гена был прочитан полностью по прямой и обратной цепи от трех до пяти раз. Сборка полноразмерного гена ompl осуществлялась выравниванием (alignment) секЕенированных последовательностей с семью, наиболее часто встречающимися в мире последовательностями клинических изолятов геновара Е С. trachomatis (E/Bour, Sweden2; E/SW3; E/SotonE4; E/SotonE8; E/11023; E'150) в программе BLAST (http://blast.ncbi.nlmnih.gov/Blast.cgi). Для выявления SNPs проводили сравнение с нуклеотидных последовательностей, полученных на каждый фрагмент амплификации с разной комбинацией праймеров к определенным участкам гена ompl и референтных последовательностей из Мирового генного банка SNP считали замену нуклеотида при прямом и обратном прочтении в программах MultAlin

(http^/multalia toulouse.inra.fr/multalin/multaliahtml) и ClustaIW2

(http:/AraT,v.ebi.ac.uk/Tools/rrLsa/cluslalw2/) с подтверждением SNP при чтении с другой парой праймеров. Каждый SNP был подтвержден независимой амплификацией соответствующего участка гена ompl и последующего его повторного секвенирования. Фрагменты выделяли из геля с помощью набора QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen, США), сиквенс проводили в компании Евроген, Россия (hltp://evrogen.ru/). Для статистического анализа полученных результатов использовали общепринятые статистические методы (Ашмарин, Воробьев, 1986;. Астафьева, 2002).

Результаты исследований и их обсуаедение Разработка экспериментальной биотехнологии получения моноспецифических хламидийных антител как основы иммунотестов для детекции возбудителя хламидиоза овец На первом этапе в результате сравнительного изучения 26 различных схем иммунизации кроликов и мышей BALB/c антигенами «С-аг-1» и «С-аг-2» установлено, что мышиные ХАТ с относительно высокими титрами за наиболее короткое время были получены при использовании схем 4 и 15 с ПО в качестве адьюваша, а кроличьи - после применения схемы 3 с ПАФ/НАФ (Таблица 1).

Таблица 1 - Сравнение различных схем иммунизации мышей ВАВЬ/с и кроликов дтя индукции _специфических ХАТ к «С-аг-1» и «С-аг-2»__

№ п/п № Схемы иммунизации для получения ХАТ Кол-во инъекций Общее кол-во антигена, мкг Адъювант Длительность иммунизации, сут. Обратные титры антител

1 1 МЫШИНЫХ к «С-аг-1» 5 90 ПАФ/НАФ 12 1:640

2 2 5 90 ПАФ/НАФ 56 1:1280

3 3 » 5 90 ПАФ/НАФ 84 1:20480

5 <4 1Ю :и с « ■

5 5 5 90 ПО 56 1:320

6 6 5 90 ПО 84 1:20480

7 7 1 20 ПАФ 14 1:320

8 8 1 20 ПАФ 14 1:320

9 9 1 20 ПО 14 1:320

10 10 1 20 ПО 14 1:320

11 11 1 20 тмс 14 1:320

12 12 мышиных к «С-аг-2» ч 90 ПАФ/НАФ 12 1:610

13 13 5 90 ПАФ/НАФ 56 1:160

14 14 5 90 ПАФ/НАФ 84 1:5120

■■¡шт. ' • " ilo 12 : ■:...■

16 16 5 90 ПО 56 1:640

17 17 5 90 по 84 1:5120

18 18 1 20 ПАФ 14 1:320

19 19 1 20 ПАФ 14 1:320

20 20 1 20 по 14 1:320

21 21 1 20 по 14 1:320

22 22 1 20 ТМС 14 1:320

23 1 кроличьих к «С-аг-1» 6 950 - 70 1:640

24 2 6 205 ПАФ 47 1:640

' 1 "Г .

26 4 4 1100 ПАФ/НАФ 42 1:1250

Следует отметить такие существенные недостатки применения кроликов в качестве продуцентов ХАТ - основного биосырья для конструирования иммунотестов, как длительность иммунизации (не менее 2 месяцев), большой расход антигена (в 175 раз больше, чем при иммунизации мышей) и слабая интенсивность цветного сигнала в ДИА несмотря на относительно высокие титры ХАТ. Совместное введите антигенов с ПАФ/НАФ позволяло стимулировать выработку высоких титров мышиных ХАТ только при длительной иммунизации животных (в

течение почти трех месяцев), а их однократные инъекции с каждым из трех адьювантов обеспечивали индукцию относительно низких титров специфических антител (Таблица 1).

При исследовании иммунохимической чистоты в 12,5% ПААТ-вОЗ АЖ серии 15, источника моноспецифических ХАТ, обнаружено наличие двух мажорных полос с молекулярными массами 25 и 50 к Да соответствующих легкой и тяжелой цепям иммуноглобулинов класса в, и всего одной дополнительной минорной полосы (Рисунок 1, дорожка 1). В кроличьей антисыворотке, как и предполагалось, наряду с двумя аналогичными мажорными полосами, выявлено большее количество минорных линий (Рисунок 1, дорожка 2), что типично для этого вида биопродуцентов (Кэтти, 1991).

Рисунок 1 - Изучение иммунохимической чистоты мышиных ХАТ серии 15 (1 50 цц» дорожка) и кроличьих ХАТ серии 3 (2 дорожка) в 12,5% БОв-РАОЕ. М -маркеры молекулярных масс

После выделения Ig и последующего изучения их специфичности в ДИА на ограниченном количестве клинических образцов, содержащих гомологичные антигены С. trachomatis (1-3 образцы) или C.psittaci (4-6 образцы), было установлено, что мышиные Ig серии 4 (Ig4) положительно реагировали с образцами, содержащими C.psittaci, а Ig серии 15 (Igl5) давали положительную реакцию с клиническими образцами, содержащими как С. trachomatis, так и С. psittaci (Таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительное изучение специфичности экспериментальных серий ^4, ^15 _(мышиных) и (кроличьих) хламидийных антител в ДИ А_____

№ клинического образца (содержащего бактерии вица) Реакция в ДИА с антителами* Выявление в ПЦР ДНК

Мышиные Кроличьи, Ig3 к «С-аг-1» МКА С. trachomatis С. psittaci

Ig4 к«С-аг-1» Igl5 к«С-аг-2»

1. (С. trachomatis) - +++ - 1 1 1 1 + -

1. (С. trachomatis) +++ - +Ч-++ + -

3. (С. trachomatis) - +++ - ++++ + -

4. (С. psittaci) IIM ++ ++ - - +

5. (С. psittaci) +++ INI ++ - - +

6. (С. psittaci) +++ ++ ++ - - 4-

7. PBS - - - - - -

«*» - Интенсивность окрашивания оценивали по четырех бальной системе: «мм» - интенсивное положительное окрашивание, «+++» - положительное окрашивание, «++» - слабоположительное окрашивание, «+» - следы реакции. «-» - отрицательный ответ (Кегга, 1991; Фримель. 1987).

Наличие возбудителей хламидиоза в указанных образцах было подтверждено в ПЦР с коммерческими наборами для детекции С. trachomatis или С. psittaci и ДИА со смесью МКА (ДИА-МКА), строгоспсцифичсскнми к эпигонам 15-ти основных ссроваров С. trachomatis, не дающими перекрестных реакций с С. psittaci.

Результаты ДИА с тфоличьими ХАТ оказались сходными с данными, полученными при использовании мышиных Ig4, однако интенсивность цветного сигнала у последних

м

11« «д. --'

«»к«к -- 8 111111

нл1д!'-\ Ш

регистрировалась на порядок выше. Следует отметить 100% сохранение активности ХАТ при хранении под сульфатом аммония при +4°С в течение четырех лет (срок наблюдения) (Таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительный анализ влияния способов и длительности хранения мышиной асцитической жидкости и кроличьей аншсыворотки на -титры специфических хламццийных антител

Сроки наблюдения, годы Обратные титры ХАТ в непрямом ДЙА при хранении

под сульфатом аммония (+4°С) замораживание (-20°С)

Мышиные антитела Кроличьи антитела Мышиные антитела Кроличьи антитела

1р4 1 1^15 1яз 184 1й15 1йЗ

май 2009 г. ЩШ 11 .1ЙШ 1№. 1:5120 1:5120 1:20480

май 2010 г ¡щш 1' ящ 1 • ММ, 1:5120 1:5120 1:20480

май 2011г. 1 иш шш , тт 1:5120 1:5120 1:20480

май 2012 г 13«» 1:2560 1:2560 1:10240

Изучение диагностической значимости указанных экспериментальных серий ХАТ проводили на расширенной коллекции клинических образцов от овец (п=285), которые мы условно разделили на две группы: группу А - от заведомо больных хламидиозом (п=270) и группу В - от здоровых овец (п=15). Исследования показали, что наибольшее количество положительных результатов в ДИА регистрировалось с мышиными ХАТ серии ^15, значительно меньше позитивных ответов отмечалось с и ^3 (Таблица 4).

Таблица 4 - Сравнительный анализ диагностической значимости экспериментальных серий _мышиных(1§4 и ^15) и кроличьих (1§3) хламидийных антител в ДИА

Группа образцов Кол-во позитивных ответов в ДИА Бактериоскопия

с мышиными ХАТ с кроличьими ХАТ

ы 1й15 1§3

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

А(п-270) 214 79,25 232 85,92 219 81,10 239 88,51

В (п=15) 0 0 0 0 0 0 0 0

Следует отметить, что во всех положительных в ДИА клинических образцах в параллельных исследованиях методом бактериоскопии были найдены типичные хламидийные включения. На рисунке 2 представлены результаты бактериоскопии материала от абортировавшей овцы-2. Внутри эпителжшьных клеток обнаружены характерные элементарные и ретикулярные тельца- Несколько включений располагались в виде "шапочки" вокруг ядра клетки (Рисунок 2А), что считается важным диагностическим признаком хламидиоза (Дмитриев и др., 1999; \Vyrick, 2010). В эукариотических клетках из клинического материала от здоровой овцы специфических хламидийных включений обнаружено не было (Рисунок 2Б).

Рисунок 2 - Обнаружение хламиднй внутри эпителиальных клеток в соскобе со слизистой влагалища овцы-2 (А)

методом бактериоскопии после окрашивания мазка по Романовскому-Гимза. Хламидийные включения в эпителиальной клетке обозначены: РТ - ретикулярные тельца; ЭТ - элементарные тельца; «Ш» - включения в виде «шапочки». Соскоб влагалища от здоровой овцы (Б). Иммерсионная микроскопия, хЮОО.

В результате сравнительного анализа несовпадений по положительным ответам между ХАТ Ig4 и Igl5 каждого клинического образца из группы А в ДИА мы выяснили, что обе серии Ig давали окрашивание с одними и теми же клиническими образцами, а серия Igl5 дополнительно выявляла 7,8% клинических образцов, не реагировавших с Ig4 (Рисунок 3, обведены черной линией). Это указывало, на наш взгляд, на возможное присутствие в данных образцах антигенов только С. trachomatis, в отличие от остальных «положительных» образцов, содержащих иммунореактивные компоненты как С. psittaci, так и С. trachomatis.

клиническими материалом от овец из неблагополучного по хламидиозу хозяйства Саратовской области (1-55-исследуемые клинические образцы, 56 - положительный, 57 - отрицательный контроли). Черной линией обведены клинические образцы, реагировавшие только с Igl5.

На следующем этапе при тестировании в ДИА-МКА клинических образцов, дававших

положительный ответ в ДИА только с Igl5 (Таблица 4, Рисунок 3 (номера 6, 11- 15, 17-19, 21, 28, 31), были получены положительные ответы практически со всеми клиническими образцами, за исключением 19 образца. Это также указывало, на наш взгляд, на возможное присутствие в материале от овец специфического антигена С. trachomatis.

Рисунок 4 - Результаты ДИА-МКА с клиническим материалом от: 1-12 - овец, положительно реагировавших с Igl5; 13-14 - овцы-1 и овцы-2 с кровоизлияниями на карунхулах, типичными для хламидиозното аборта овец 15 - положительный («С-аг-2»), 16 - отрицательный контроль (PBS).

Таким образом, была разработана экспериментальная биотехнология получения ХАТ с использованием в качестве биопродуцентов мышей BALB/c и кроликов и приготовлены экспериментальные серии Ig3, Ig4 и Igl5 - перспективных базовых компонентов для конструирования иммунотестов, направленных на детекцию возбудителя хламидиоза овец.

Конструирование и апробация экспериментальных вариантов иммуноанализа для экспресс-диагностики хламидиоза овец

Полученные на предыдущем этапе экспериментальные серии мышиных lg4 и lgl5 были использованы для приготовления иммунозолотых конъюгатов «Ig4-Au20», «Ig4-Au40», «Igl5-Аи20» и «Igl5-Au40». В результате тестирования каждой серии конъюгата на клиническом материале от овец (заведомо положительные и заведомо отрицательные образцы) установлено совпадение по положительным и отрицательным ответам в 100% случаев у трех экспериментальных серий конъюгата. При использовании конъюгата «Ig4-Au20» был зарегистрирован один ложноположительный ответ (на уровне следовой реакции) (Таблица 5).

¿Г

ШЩ'Ш

Таблица 5 - Сравнительный анализ специфичности экспериментальных серий «1§4-Аи20», «^4-

Аи40», «Гз15-Аи20)> и «Гд15-Аи40»

№ п/п Оригинальный № образца Реакция в ДИА иммунозолотых коньюгатов экспериментальных серий ПЦР* Бактериоскоп ия

«1д4-Аи20» |«1й4-Аи40» |«1й15-Аи20» |«1я15-Аи40»

А: образцы, содержащие хламидии

1 А9 ++ +++ + +++ + +

л А10 ++ +++ + +++ + +

3 АЗ 5 -н- +++ ++ 1111 + +

4 А49 ++ +++ ++ +++ + +

5 А50 ++ +-Н- ++ +++ + +

6 А72 ++ +++ ++ +++ + +

7 А78 ++ +++ ++ +++ + +

8 А86 ++ +++ ++ +++ + +

9 А142 ++ +++ ++ +++ + +

10 А222 + +++ ++ +++ + +

В: образцы, не содержащие хламидии

11 ОЗ + - - - - -

12 05 - - - - -

13 018 - - - - - -

14 030 - - - - -

15 034 - - - - - -

16 093 - - - - -

17 097 - - - - - -

18 0107 - - - - -

19 РВЭ - - - - - -

* - ПЦР тест-система "ХЛА-ПСИ"

Все положительные и отрицательные ответы были подтверждены в параллельных исследованиях тех же образцов в ПЦР с коммерческим набором и бактериоскопией.

Поскольку при создании иммунотестов существенную рать играют не только антитела и, соответственно, приготовленные на их основе коньюгаты, (Кепи, 1991; Коллинз, 1991), на следующем этапе мы тестировали остальные компоненты тест-системы. Среди НЦМ наиболее оптимальной была признана НЦМ ВюКас! с диаметром пор 0,45 км ввиду отсутствия ложноположительных и ложноотрицательных результатов и более высокой интенсивности цветного сигнала по сравнению с остальными НЦМ. При последующем конструировании на основе указанной НЦМ 50 различных вариантов ДИА и экспериментальных серий иммуноконъюгатов (с/без использования «кармашков» из парафилма, с/без термофиксации клинического материала на НЦМ (+110°С, 10 мин), с/без концентрации иммунозолотых коньюгатов, с/без блокировки свободных сайтов НЦМ, с использованием в качестве разводящей жидкости для лактальбумина боратного и фосфатного буферов (Рисунок 5) и временем инкубирования с иммунозолсггыми конъюгатами 5-30 минут) были отработаны основные биотехнологические этапы конструирования ДИА для скрининговой лабораторной диагностики хламидиоза овец (ДИА40/15).

щш ; ;

щ ш

р

f

Рисунок 5 - Схематичное изображение оптимизации

основных биотехнологических этапов конструирования ДИА40/15 для скрининговой лабораторной диагностики хламидиоза овец.

Ю.Ы

В результате нами был сконструирован экспериментальный вариант ДИА40/15, включающий в себя использование в качестве твердой фазы HUM BioRad 0,45, термофиксацию клинического материала от животных на НЦМ, блокировку свободных сайтов НЦМ 0,5% лактальбумином на PBS и инкубирование с «Igl5-Au40» в «кармашке» из парафилма не менее 5 минут. Так, мы смогли добиться полного совпадения (100%) в ДИА как по положительным, так и по отрицательным ответам (Рисунок 6).

6 7

<f {£> У/

W 'i f<f

fc I?

¡8

Рисунок 6 - Апробация ДИА40/15 (лабораторные испытания) на ограниченном количестве клинических образцов,

1-10 - «положительные», 11-20 — «отрицательные» клинические образцы.

В параллельных исследованиях с применением четырех серий иммунозолотого конъюгата, на основе мышиных ХАТ, а также кроличьих 1^3 как ксеногенных антител для тестовой линии, проводили конструирование экспериментальной модификации ИХТ. (Этапы представлены на рисунке 7).

Рисунок 7 - Схематичное изображение оптимизации основных биотехнологических этапов конструирования

экспериментального варианта ИХТ (обозначенный нами как ИХТ40/15) для экспресс-диагностики хламидиоза овец.

Ж&Г&& зялхтячжтя

\ ВЫЫ;

> ¿Шис^т ЪЛхт

; Г"ть................. И

ф i res-riSK га П ¡¡L __ ф Л ; J 1 1 \

Пй» п

у__ж ш

Зде&ф ^vfasateytAs» (CTj

В ходе проведенных экспериментов проводили тестирование всех необходимых компонентов, а также сравнительное изучение методов фиксации Ig на мембранах-носителях, вариантов блокировки свободных сайтов аналитической мембраны и использования разводящих тест-буферов для подготовки клинического материала.

Разработанный нами вариант экспериментальной ИХТ40/15 включал в себя применение Hi Flow Plus 90 в качестве аналитической мембраны, фиксацию на ней тестовых Ig3 и контрольных антимыигиных Ig в течение 24 ч при комнатной температуре, блокировку свободных сайтов НЦМ 0,5% лакгоальбумином на PBS, Conjugate release matrix для фиксации «Igl5-Au40» при комнатной температуре, и специального тест-буфера на этапе пробоподготовки для разрушения эпителиальных клеток и обеспечения доступности для анализа хламидийных антигенов.

На рисунке 8 представлен результат использования ИХТ40/15 для анализа контрольного образца А35, наличие в нем хламидий подтверждено методами бактериоскопии и ПЦР (Таблица 5). На рисунке 8 видно, что тестовая и контрольная линии окрашивались четко, и интерпретация результата не составляла труда.

Рисунок 8 - Результаты тестирования заведомо положительного клинического образца А35 экспериментальным вариантом ИХТ40/15 для экспресс-диагностики хламидиоза овец.

Для подтверждения диагностической значимости и апробации ДИА.40/15 и ИХТ40/15 параллельно методами бактериоскопии и ДИА-МКА исследовали клинический материал от

овцы-1 и овцы-2 (Таблица 6).

Таблица 6 - Сравнительный анализ результатов тестирования ИХТ40/15 и ДИА40/15 для _детекции возбудителя хламидиоза овец__

№ клинического образца Выявление хламидий методами

Бактериоскопия | ДИА-МКА | ДИА15/40 | ИХТ40/15

А: клинический материал от овцы-1

1 .соскоб со слизистой носа + + + +

2.соскоб со слизистой мочевого пузыря + + + +

3.соскоб со слизистой влагалища + + + +

В: клинический материал от овцы-2

1. соскоб со слизистой носа + + + +

2.соскоб со слизистой мочевого пузыря + + + +

3.соскоб со слизистой влагалища + + + +

С: клинический материал от овцы-05*

1. соскоб со слизистой носа - - - -

2.соскоб со слизистой мочевого пузыря - - - -

3 соскоб со слизиш'ОЙ влашлища - - - -

* - отрицательные в ПЦР и БП (Таблица 5)

Таким образом, в результате проведенных экспериментов нами было зарегистрировано полное совпадение между всеми использованными тестами по положительным и отрицательным ответам

_ Контрольная линия

I - Тестовая линия

Разработка системы валидации иммунотестов для экспресс-диагностики хламидиоза овец с использованием современных молекулярно-генетических методов

Разработку системы валидации сконструированных в рамках данной диссертационной

работы тесг-сисгем, проводили при помощи молекулярно-генетического анализа, которому- по праву отводится ведущая роль среди методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний. Основным преимуществом данного метода является возможность выявления ДНК возбудителя даже з том случае, если бактериальная клетка погибла или ее иммунореакгивносгь снижена под влиянием неблагоприятных факторов, например, антибиотикотерапии (Обухов, Васильев, 2003; Вафин, 2009).

Первоначально, для подтверждения присутствия ДНК С. trachomatis в исследуемых клинических образцах, содержащих хламидии, в ПЦР нами был детально исследован материал от двух абортировавших овец коммерческим набором «АмплиСенс Chlamydia trachomatis - Eph» (Рисунок 9). В отличие от образцов овцы-1 (Рисунок 9А), в образцах овцы-2 четко выявлялся специфический для С. trachomatis фрагмент ДНК размером 330 п.н. (Рисунок 9В).

740 п.н Г" 330 п.н.

740 п.н 330 п.н

Рисунок 9 - Результаты детекции продуктов ПЦР-амплификации методом электрофореза в 2 % агарозном геле с клиническими образцами от овцы-1 (А) и овцы- 2 (В) (1 - соскоб со слизистой носа, 2 - со слизистой влагалища, 3

- со слизистой мочевого пузыря, «К-» - отрицательный контроль (вода), «К+» - положительный контроль (/ТНК геновараЕ С. trachomatis), «М» - маркер молекулярных масс (М. 50-20(м00-850-1500 п.н.). Размер специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК: С. trachomatis - 330 П.Н., ВКО комплексного - 740 п.н.

Однако, нам удалось определить геновар ДНК С. trachomatis всех клинических образцов

овцы-1 и овцы-2 методом, основанным на определении нуклеотидной последовательности вариабельного района VD2 гена ompl, кодирующего основной белок внешней мембраны (МОМР), с применением праймеров raomp-fwl-4 и momp-rvl-4 (Quint et al, 2007). С помощью этого метода определяли принадлежность возбудителя к одному из 19 геноваров (А, В/Ва, С, D/Da, Е, F, G/Ga, Н, L'Ia, J, К, LI, L2/L2a, и L3). После секвенирования фрагментов амплификации, содержащих комплементарные районы VD2, и сопоставления полученных нами нуклеотидных последовательностей с референтным последовательностями мирового генного банка, было установлено присутствие во всех позитивных клинических образцах ДНК геновара Е С. trachomatis.

Полученные результаты в совокупности с данными о наличии специфических антигенных субстанций С. trachomatis в указанных клинических образцах при их комплексном изучении в ДИА-МКА, ДИА40/15 и ИХТ40/15 (Таблица 6), предопределили необходимость более детальной молекулярно-генетической характеристики штаммов С. trachomatis, выявляемых в клинических образцах иммунотесгами. Особую значимость для валидации, на наш взгляд, имели появившиеся в последние годы литературные сведения об обнаружении штаммов С. trachomatis с мутациями в хромосоме и мультикопийной критической плазмиде, на детекцию генов которой нацелены

большинство коммерческих ПЦР-диагностикумов (Ripa, Nilsson, 2006, 2007; Storm at al., 2006; Herrmann at al, 2008; Clarke, 2010).

При исследовании ДНК из клинического материала от овец в ПЦР с панелью оригинальных специфических праймеров к генам криптической плазмиды orf 2 и or]S нами во всех случаях получены отрицательные ответы на наличие в геномах хламидий orf8, а ген orf2 был детектирован только в соскобах мочевых пузырей обеих овец. В тоже время ПЦР с праймерами на хромосомный ген 16Srb (Slepenkin et al., 2003,1 выявляла специфический фрагмент амплификации требуемого размера (152 п.н.), что также подтверждало наличие во всех тестируемых клинических образцах ДНК С. trachomatis. Это указывало на наличие потенциального дефекта в области гена orfti С. trachomatis всех тестируемых образцов и, возможно, гена orfl в образцах из носа и влагалища обеих овец. Также в ПЦР с панелью прямых и обратных праймеров, амплифицирующих различные участки гена ompl, у овцы-1 найдены SNP в 995 и в 997 нуклеотидах (G—>А) в районе вариабельного участка VD4 которые приводят к аминокислотной замене серина на аспарагин и аланина на треонин, соответственно, что, в свою очередь, может способствовать изменению локальной стр5<ктуры белка. (Рисунок 10).

t/Ъм îRGCCCfiGCCRflflaTCflGCTRCRGCTflTCTTTGRTRCTflCCRCGCTTRRCCCflflCTflTTGCÏGG

Suetetó TfttCa:(lGCaWlflTCflGCTfiCnGCTnTCnTGnTfiCinCCRCGCTTfiRr.CCIlfiCTnTTGCTM

E/9Q RGCCCRGCCRflRRTCfiGCTRCRGCTflTCTTTGfiiflCTRCCflCGCTTRHCCCRRCTRT TGCTGGfiGCTGGCGRTGTGRRRGCTRGCGCRGHGGGTCRGCl STц. ,

ЕУ5о^ол£4 rRGtCCRGCCHflHRICfiGL'lfiCHGGTflICITrGRIRCTnCCHCGCTrHRCtCnRCrflTTGCrGCnGCIGGCGRIGIGRRRGCIRGCGCRGRGGGTCRGGl Ж' 1 n,1L-

E/1» TRGCCCflGCCfiflflflTCRGCTflCflGCÏflTCTTTGRTRCTIKCHCGCTTRfiCCCfiflCTHTTGCTGGflGCTGGCGRÎGÎGRRRGCÏRGCGCRGflGGGTCflGCl щ ТППг

E/11023 rRörCCflGCCRRRHTCRGCTRCRGCTfiTCTTTGRTRCTnCCRCGCTTRRCCCRflCTflTTGCTGGflGCTGGCWTGTGRRRGCaettCRGRGGGTCflGGlf - I ■ И

E^Snten£S II I I I III I I III Hill I Nil I III..... HIM I I II HIHI III I III I I I IIIIII I I Mill Mil II I II II I 11 I I I ll 11 11 III l/Tll Mfc |lh|i 1 f g j -

JUU TRÍKCCflGCCRflflflTCRGCT№flGCTflTCTTTGRTTCTflCCflCGCTTflRCCC^TñTTGCTGGRGCTGGCfiRrGrGRRAT(»CG(lllflmCflGCl\ • I I "II

'".' J 1 IRGCCEflGCCRRHRTCflRCTRCRGCTRTCl TTGRlRCTHCCRCiiCT IRRCCCHHOlll I llüH.GRIIG IGGCGRTGlGRRllpTÄCGWGRGGGIEHGCl VtQ * -

Consensus ÍRfiCCCRGCCflflRRTCflGCTFICRGCTflTCTTTGRTflCIRCCHCGCTrRRCCCñfltTflTTGCTGORGCTGGCGflTGTGRfiR^Ü/l^|liffÍGRIilillli Ulf! I Xi H£fL

■ ш 92» 9» 95® ffiö 97» 9Й> líWft Ifttft 997 П.Н.

Е/Вочг ÎRGCCCRfiCCRRRRÏCflfiCTRCRGCTRfCTTTGRTflCTfKCfiCGCTTflflCCCffflCIRIIGCTGGfiGCTGGCGRTGTGRRflGCTflGCGCRGRGGGICRGCTI jp. 1 I-, I £

SwifenZ TRGCCCflGCCRHflRTCRGCTHCRGCTflTCTTTGfiïfiCTflCCflCGCTTflRCCCRflCTRTTGCTGGflGCTGGCGRTGTGflRRGCTflGCGCRGRGGGTCRGCÎI У4 ■

Е/5Ш I(IGCCCflGCCRRRRrraGCTRCRGCTRICTTTGRTRCTflCCflCGCTTfiRCCCnflCTRTTGCTGGfiGCTGGGGnTGTGfiRflGCTÍiGCGCRGRGGGÍCRGCTl/]flí~ftp Di

E/SotoeE-t ÍRGCCCfiGCCRRRflTCfIGCTRCRGCTRÍCTTTGRTRCTRCCflCGCTTflRCCCflflCíRrrGCTGGflGCTGGCGnTGTGflRRGCTflGCGCRGRGGGTCRGCTlf 11 .

E/15» TflGCCCfiGCCRRRRÏCflGCIRCRGCTaiCTTTGflrfiCTflCCflCGCTTfiRCCCRflCTRTTGCTGGflGCTGGCGRTGTGflRflGCTRGCGCRGRGGGTCRGCTlI |Г,ГПГ ПГ|

E/H№3 IRGCCCWÍCCRRRRTCflGCIRCRGCTRICTTTGRTRCTflCCflCGCTTfiRCCCflflCTRTrGCTGGfiGCTGGCGflTGTGnflRGCTffieéiffifiGGGTCRGCTli lul

E/SofcooE» TnrrrrnrrrRRRRîrnrrTRrRrrrRTrTTTrRTRrTRrrRrrrTTnRrrrRRrTRrTrrirrRrrTrrrrnTrTrrriirriïïr-T-nll ' „ ГГ . ГП*

К7_Ш TRGCCC№CCflRflflTCraTRCflGCTRTCTTTGRTfiCTflCCflCGCTTflfiCCCflflCTRTTGCTGGRGCTGGCGflTGTGfiRflGfRGtí!CRGlip«^klll К4- 1 V

6?_Е5 iHGCCCRGCCHRRHÏCHfiClRCHGCTHICI I IGRTflCTRCCRCGCl IRHCCCMCTATTGCTGGflGCTGGCGII I • :: \ « i

Consensus TflGCCCfiGCCflRRRTCflGCTflCRGCTRTCTTTGflTnCTfiCCflCGCTTfiflCCCflflCTflTTGCTGGflGCTGGCGflTGTGfinflGC^S^yiftGGICRGCTI

Рисунок 10 - Изучение полиморфизма гена ompl хламидийной ДНК из клинических образцов овцы-1.

SNP выявлены в позициях 995 (А) и 997 (Б).

У овцы-2 в указанном регионе плазмиды SNP обнаружено не было. Полученные данные свидетельствовали о генетическом разнообразии популяции штаммов С. trachomatis, выявляющихся совместно с С. psittaci в клинических образцах абортировавших овец.

Следует отметить неоднократные сообщения об обнаружении в большинстве европейских стран штаммов С. trachomatis с делецией размером 377 п.н. в критической плазмиде в регионе гена orfl и дополнительной дупликацией размером 44 п.н., захватывающей часть генов orfi и orß, так называемых новых «шведских» вариантов, nvCT, которые в 2006 г составили 20-64% выявляемых штаммов хламидий (Peterson et al, 1996; Ripa, Nilsson,2006, 2007; Storni ai ai., 2006; Herrmann at al., 2008; Seth-Smith et al., 2009; Clarke, 2010; Schachter, 2010; Unemoeío/., 2010). Выявление дефектов в orf2, по крайней мере, в четырех тестируемых нами образцах, и положительная реакция в ПЦР с праймерами swCT_serE_F/swCT_serE_R позволило нам идентифицировать типичные nvCT в соскобах со слизистой носа обеих овец (Таблица 7, Рисунок 11).

Таблица 7 - Сравнительный анализ результатов изучения ДНК из клинического материала от

овцы-1 и овцы-2 в ГИДР

№ клинического образца ПЦР

с праймерами ЛмпяиСенс Chlamydia trachomatis-FL РештБест ДНК С .trachomatis

swCT serE Г/R ORF2-145 Г/R ORF 8150 Г/R CT026-16S-152 Г/R

Клинический материал от овцы-1 (соскобы со слизистой)

1 носа 1 - - - - -

2 влагалища - - - + - +

3 мочевого пузыря - + - + - -

Клинический материал от овцы-2 (соскобы со слизистой)

4 носа + - - + + -

5 влагалишв - - - + + -

б мочевого пузыря - + - + + -

7 отрицательный контроль - - - - - -

Более того, искомую ДНК выявили в одном из образцов овцы-1 (соскоб со слизистой влагалища) методом ПЦР в режиме реального времени, которая, как считается, отличается большей разрешающей способностью (Гущин и др., 2011).

На рисунке 11 представлен результат анализа секвенированных последовательностей образцов ДНК, выделенных из клинического материала овцы-1 (слизистая носа) с типичной делецией размером 377 п.н. (отмечена желтым цветом), полностью идентичной делеции референтного штамма 8\¥3 из мирового генного банка.

СЬийТАЬ 2.1 ти1пр1е ве^иепсе аП^птеш

CGGCATGCTACATATCTTTCACAAAGTTTTTGTATAGATTGACCAAGGGATATAT'TAAAC «О

cgqcatqctagatatctttcacaaäötttttgtataoattqaccaaoqgatatattaaac 60

CCG<^ATTCCATlXäAAAGATTTT<5QAAACACTACATTTTTTAAAATCC<^GACÄAAATCA 120

CCGCTATTCCATTGAAAGAITTTOGAAACACTACATTTTTTAAAATCCOAOACAAAATCA 120

ccoctattccattgaaaqattttogaaacactacattttttaaaatccqagacaaaatca 120

A^CAGAAI03ATTTCTAAX3CAQ<3AAT<SeAGAGTTTTÍ

ÍAA3CGCTCO3GAIA0TGA 180

ATTAIAQAGACTATTTAATCOGTAAATTÍ3ATTÍ3IACAAOGGA.TCCG---

TTTTOTCTTTÖCOCAGWSACQAIOTArTTTTTaCATCCAATC^ 300

ААААААЭДСМЭДАХАААбДОАССАОДАХТСХААТСАСАТТТССХАХСдеСТХААТОЗДАб 360

A^XAÄAAür^CXCCCAÖAOIACXTCQTOGAAflCOCTTTGASTCW'TlAAAOGAAAIA© 5

GATTAAAASATi

Рисунок 11 - Сравнительное изучение распшфрованных нуклеотидных

последовательностей ДНК из соскоба со слизистой носа овцы-1 (позе!, выделено красным цветом) с типичной для пуСТ делецией (выделено желтым) и референтной последовательности пуСТ штамма (зеленым цветом) из мирового генного банка с использованием программы СЬШТАЬ 2.1. Контроль - типичный дикий штамм без делеции (черным цветом)

OOTTCTTTGAAßCOTTOTCTTCTCOAG 94 О

Существование подобных дефекгаых штаммов, вероятно, может обеспечивать определенное количество ложноотрицательных ответов даже при использовании таких современных высокочувствительных методов как ПНР Поэтому для минимизации количества ложноотрицательных или ложноположительных ответов при использовании диагностических тестов, на наш взгляд, следует предложить разработанную в рамках настоящего исследования систему валидации, основанную на использовании современных молекулярно-генетических методов с учетом выявленных нами и известных мутаций в геноме хламидий (Таблица 8).

Таблипз 8 - Сравнительный анализ результатов валидации ДИА40/15 и ИХТ40/15 с использованием

Штаммы хламидий ПЦР для детекции ДНК ИХТ40/15 ДИА40/15

С. psittaci С. trachomatis, мишени

плазмидные хромосомные nvCT

C.psittaci + - - - + +

wtCT - + + + + +

nvCT - - + + + +

Таким образом, нами разработана система валидации диагностических тестов, включающая в себя параллельные исследования их специфичности в ПЦР с комбинацией праймеров на плазмидные и хромосомные мишени, позволяющих выявлять дикие штаммы хламидий, в том числе, с известными мутациями.

Заключение

В результате проведенных экспериментов были сконструированы и апробированы на ограниченном количестве клинических образцов экспериментальные варианты иммуноанализа: ДИА40/15 - для скрининговых лабораторных исследований хламидиоза овец и ИХТ40/15 - для экспресс-диагностики данной инфекции, позволяющий быстро и качественно проводить диагностику этого заболевания непосредственно на местах содержания животных без необходимости доставки клинических образцов в лабораторию.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная технология конструирования вариантов иммуноанализа для лабораторной диагностики хламидиоза овец: ДИА40/15 - для скрининговых исследований и ИХТ40/15 - для экспресс-диагностики данной инфекции непосредственно в местах содержания животных без необходимости доставки клинических образцов в лабораторию, с оптимизацией основных этапов их конструирования.

2. На клиническом материале от больных хламидиозом и здоровых овец в параллельных исследования с коммерческими диагностическими тестами показана высокая диагностическая значимость сконструированных иммунотестов.

3. С применением методов иммуноанализа на основе МКА и молекулярно-генетических методов доказано наличие в клиническом материале от больных хламидиозом овец специфических антигенов и генетического материала С. psittaci и С. trachomatis. Молекулярно-генетические методы включали в себя применение секвенирования, генотипирования и биоинформационного анализа, а также использование ПЦР с комбинацией экспериментальных праймеров на хромосомные и плазмидные мишени, а также коммерческих ПЦР тест-систем.

4. Обнаружено генетическое разнообразие популяции штаммов С. trachomatis, представленных в клиническом материале от овец в виде точечных мутаций в 995 и 997 нуклеотидах (G—>А) в районе вариабельного участка VD4, делеции размером 377 п.н., полностью идентичной таковой в типичном новом «шведском» варианте, а также дефектах в области генов orf 2 и orß.

5. Разработана система валидации иммунотестов, включающая в себя параллельные исследования клинического материала в ПЦР с комбинацией праймеров на плазмидные и хромосомные мишени, и позволяющая выявлять дикие штаммы хламидий, в том числе, с известными мутациями. Это необходимо для оценки качества предлагаемых тест-систем для диагностики хламидиоза и повышения эффективности лабораторной диагностики данной инфекции в целом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Федорова, В.А. Использование различных мишеней для выявления штаммов Chlamydia trachomatis / В.А. Федорова, С.С. Коннова, Т.И. Полянина, И.В. Дружкин, Э.А. Федотов, B.J1. Мотин // Известия Саратовского университета Новая серия, Серия химия, Биология. Экология, выпуск 2. - 2011, том 11, С. - 73-77.

2. Feodorova, V.A. High potency of novel polymeric adjuvant in eliciting the immune response in mice to major antigens of Chlamydia and Yersinia / V.A. Feodorova, A.M. Lyapina, O.V. Ulianova, T.I. Polyanina, Y.Y. Eliseev, V.L. Motín // Procedía in Vaccinology. - 2012. - Vol. 6. - P. 93-97.

3. Ляпина, A.M. Применение полиоксидония для получения специфических антител к бактериальным антигенам / A.M. Ляпина, Т.И. Полянина, О.В. Ульянова, Ю.Ю. Елисеев, М.В. Телепнев, В.Л. Мотин, В.А. Федорова // Современные проблемы науки и образования. -2012. - № 2 URL:www.science-education.ru/102-5729 (дата обращения: 26.08.2014).

4. Полянина, Т.И. Роль молекулярно-генетических методов в таксономии хламидий и диагностике хламидиозов / Т.И. Полянина, В.А. Федорова, С.С. Коннова, С.С. Зайцев, В.Л. Мотин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2012. -№ 12.-С. 222-225.

5. Feodorova, V.A. Comparative detection of Chlamydia trachomatis in clinical specimens obtained from genital and extragenital sites / V.A. Feodorova, S.S. Konnova, A.V. Kazantsev, E.S. Sultanakhmedov, T.I. Polyanina, S.R. Utz, A.M. Lyapina, E.P. Lyapina, V.L. Motín // Sexually Transmitted Infections. - 2013. - Vol. 89, Supplement 1. - P. A147-A148. http://sti.bmj.com/content/89/SupDl 1/A147.3 (дата обращения: 26.08.2014)

Публикации в других изданиях

6. Полянина, Т.И. Сравнительный анализ влияния адъюванта Фрейнда и полиоксидония на выработку специфических антител у инбредных мышей линии BALB/c / Т.И. Полянина,

B.А. Банникова, И.В. Голова, A.M. Ляпина, С.С. Коннова // Молодые ученые -здравоохранению региона: сб. материалов науч.-пракг. конф. студентов и молодых ученых Саратовского Государственного Медицинского университета. - Саратов, 2009. - С. 153-154.

7. Полянина, Т.П. Значение ранней диагностики хламидиозов животных для обеспечения здоровья населения / Т.И. Полянина, О.В. Ульянова, В.А. Федорова // 15-летие кафедры экологии СГАУ имени Н.И. Вавилова: Сб. тр. международной науч. конф. - Саратов, 2009. -

C. 192-195.

8. Федорова, В.А. Разработка экспресс-метода лабораторной диагностики Chlamydia trachomatis / В.А. Федорова, В.А. Банникова, Т.И. Полянина, В.А. Грашкин, A.M. Ляпина, Г.П. Шведун, И.Г. Грашкина, И.В. Голова, О.В. Ульянова, Э.А. Федотов // Сб. материалов форума "Research Sustainability", Астана, 2009. - С. 25.

9. Полянина, Т.И. Перспективы развития экспресс-диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных / Т.И. Полянина, И.В. Голова, В.Н. Ласкавый, В.А. Федорова

// 80-летие Самарской НИВС Россельхозакадемии: Сб. материалов международной конф. -Самара, 2009. - С. 336-339.

Полянина, Т.П. Перспективы совершенствования экспресс-диагностики хламидийной инфекции с использованием различных модификаций ТИФА / Т.П. Полянина, И.В. Голова,

A.M. Ляпина, С.С. Коннова, В.А. Банникова, В.А. Граппсин, Ю.Ю. Елисеев, В.А. Федорова // Современные проблемы инфекционной патологии человека: Сб. материалов международной науч.-практ. конф. - Минск, 2009. - Вып. 2. - С. 384-387.

11.Полянина, Т.П. Оптимизация ДОТ-иммуноанализа в диагностике хламидийной инфекции: сравнительная характеристика мембран-носителей / Т.И. Полянина, В.А. Банникова, И.В. Голова, A.M. Ляпина, С.С. Коннова, Г.П. Шведун, В.А. Федорова // Социальные проблемы медицины и экологии человека. 100-летие Саратовского государственного медицинского университета: Сб. материалы Всерос. науч.-практ. конф. - Саратов, 2009. - С. 459-462.

12.Feodorova, V.A. Development and evaluation of a new dot-ELISA immunoglobulin kit for laboratory diagnostics of Chlamydia trachomatis-, comparison with PCR / V.A. Feodorova, T.I. Polyanina, A.M. Lyapina, I.V. Golova, I.N. Druzhkin, E.A. Fedotov, V.A. Tambovskaya, V.A. Grashkin // Proceeding Book, 12th International symposium on human chlamydial infections, Hof bei Salzburg, Austria, June, 20-25. - 2010. - B-17. - P. 25.

13.Feodorova, V.A. Evaluation and optimization of a new dot-ELISA immunoglobulin kit for laboratory diagnostics of Chlamydia / V.A. Feodorova, T.I. Polyanina, A.M. Lyapina, I.V. Golova, I.N. Druzhkin, E.A. Fedotov, V.A. Tambovskaya, V.A. Grashkin // Proceeding book, 12th International symposium on human chlamydial infections, Hof bei Salzburg, Austria, June, 20-25. -2010. - A-18. - P. 26.

Ы.Полянина, Т.Н. Апробация экспериментальной диагностической тест-системы для лабораторной диагностики хламидийной инфекции в ДОТ-иммуноанализе / Т.П. Полянина, И.В. Голова, И.Н. Дружкин, Э.А. Федотов, В.А. Федорова // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Сб. материалов международной конф. - Санкт-Петербург, 2010. - С,- 127.

15Полянина, Т.П. Конструирование различных модификаций твердофазного иммуноанализа для экспресс-диагностики хламидийной инфекции / Т.И. Полянина, И.В. Голова, И.Н. Дружкин, Э.А. Федотов, И.Г. Грашкина, В.А. Грашкин, Л.А. Дыкман,

B.А. Тамбовская, В.А. Федорова // Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации: Сб. материалов третьего съезда военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации. - Санкт-Петербург, 2010. - С. - 292.

\6.Полянина, Т.И. Биотехнологические особенности конструирования тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза: сравнительный анализ влияния боратного и фосфатно-солевого буферов на чувствительность и специфичность экспериментального кита / Т.И. Полянина, О.В. Ульянова, Э.А. Федотов, И.Н. Дружкин, Л.А. Дыкман, В.А. Федорова // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины, 121-ая годовщина ГНУ Саратовского НИВИ Россельхозакадемии: Сб. статей международной науч.-практ. конф. - Саратов, 2011. - С. 229-232.

17.Полянина, Т.И. Биотехнологические аспекты разработки методов экспресс-диагностики хламидиоза / Т.И. Полянина, О.В. Ульянова, С.С. Зайцев, Э.А, Федотов, И.Н. Дружкин, Л.А. Дыкман, В.А. Федорова // От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины, 121-ая годовщина ГНУ Саратовского НИВИ Россельхозакадемии: Сб. статей международной науч.-практ. конф. - Саратов, 2011. - С. 232-235.

18.Feodorova, V.A. Modulation of an immune response to Chlamydia specific antigens with a novel polymeric adjuvant / V.A. Feodorova, T.I. Polyanina, I.V. Golova, A.M. Lyapina, S.S. Konnova, O.V. Ulianova, V.A. Tambovskaya, V.A. Grashkin // Proceedings book, 5th Biennial meeting of the chlamydia basic research society, Redondo Beach, California, March 18-21, 2011. -P. C40.

19.Feodorova, V.A. Chlamydia trachomatis genotypes and plasmid variants detected in clinical urogenital samples in the Southeastern European region of Russia / V.A. Feodorova, S.S. Konnova,

I.N. Dmzhkin, T.I. Polyartina, V.A. Tambovskaya, V.L. Motin // Proceedings book, 7-th Meeting of the European society for chlamydia research. University Amsterdam. - Amsterdam, 2012. - P. 36-37.

20.Федорова, B.A. Методы молекулярной диагностики хламидиозов: современное состояние и перспективы / В.А. Федорова, Т.Н. Полянина, С.С. Коннова, С.С. Зайцев,

B.Л. Мотин // Международная молодежная научной школа: Сб. материалов. - Оренбург, 2012. -

C. 13-21.

21. Федорова, В.А. Разработка иммунотеста для экспресс-диагностики хламидиоза с использованием наночастиц коллоидного золота / В.А. Федорова, Т.Н. Полянина, С.С. Коннова, С.С. Зайцев, Ю.В. Салтыков, И.Н. Дружкин, В.Л. Мотин // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Сб. тезисов III международной науч.-практ. конф. - Казань, 2012. - С. 264-265

22.Полянина, Т.П. Разработка экспериментальной иммунохроматографической тест-системы для диагностики хламидиоза / Т.П. Полянина, С.С. Зайцев, С.С. Коннова, И.Н. Дружкин, Л.А. Дыкман, О.В. Ульянова, В.А. Федорова // Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия: Сб. материалов II всероссийской научной конференции молодых ученых. - Санкт-Петербург, 2012. - С. 427-429.

23. Feodorova, V.A. First case of detection of Chlamydia trachomatis in livestock in Russia / V.A. Feodorova, T.I. Polyanina, S.S. Konnova, V.N. Laskavy // FEMS 2013, 5th Congress of European Microbiologists, Program Book. - poster 612. Leipzig, Germany, 2013. - P. 237.

24.Feodorova, V.A. The first case of the Swedish new variant Chlamydia trachomatis in the Southeastern European Region of Russia / V.A. Feodorova, E.S. Sultanakhmedov, Yu.V. Saltykov, T.I. Polyanina, S.R. Utz, S.S. Zaitsev, N.Sh. Bogoutdinov, V.L. Motin // Proceeding Book, IUSTI Europe Scientific Meeting in St Julian, Malta, September, 18 -20,2014. - P. 106.

25.Федорова, В.А. Изучение диагностической значимости экспериментальной иммунохроматографической тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза у овец / В.А. Федорова, Т.П. Полянина, С.С. Зайцев // Материалы международной конференции, посвященной 85-летию ГНУ Самарской НИВС. - Самара, 2014. - С. 419-422.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 10.02.2015 Гарнитура Times. Печать Riso. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0110

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов; Пугачёвская, 161, офис 320 9 27-26-93