Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики хламидиоза овец

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики хламидиоза овец"

На правах рукописи

КОЧИШ Иван Иванович

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ

03.00.23. — Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН и в институте вирусологии им Д.И.Ивановского

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук В.И.Белоусов;

кандидат технических наук,

доктор биологических наук Е.А.Рубан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Э.Ф.Токарнк; доктор ветеринарных наук, профессор К.Н.Груздев

Ведущая организация

Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Защита диссертации состоится^декабря 2000 г. в Я часо на заседании специализированного совета К 120.17.01 по защит диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук пр Всероссийском научно-исследовательском и технологическо! институте биологической промышленности по адресу: 141142 Московская обл., Щелковский район, пос. Биокомбинат, п/о К? шинцево, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке ВШ

ТИБП.

Автореферат разослан^^ноября 2000

г.

Ученый секретарь диссертационного с< кандидат биологической промышленнс

¿Г С?

Ю.Д.Фроло

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы среди инфекционных болезней животных и птиц все большее внимание привлекают хлймидийные инфекции.

По данным ряда исследователей (Ю.Д. Караваев 1999 г., Х.З. Хазипов, А.З. Равилов 1984 г.) наиболее значительный экономический ущерб испытывает промышленное овцеводство из-за больших потерь приплода в результате массовых абортов и гибели ягнят в первые дни после рождения.

По данным 1995-2000 гг. массовые аборты и мертворож-цения составляют при хламидиозе - 22,1%.

Поэтому борьба с хламидийным абортом овец признана эдной из актуальных задач ветеринарной науки и практики.

Основным методом серологического мониторинга при шамидиозах животных является реакция связывания комплемента (РСК, РДСК), недостатками которой является: низкая чувствительность, трудоемкость и длительность выполнения.

Для устранения перечисленных недостатков в ветеринарию практику интенсивно внедряется иммуноферментный ана-шз, который занял лидирующее положение при диагностике многих инфекционных болезней (В.Н. Сюрин 1989 г.). Явным 1реимуществом этого теста является высокая чувствительность, 1ростота выполнения, экспрессность, доступность и стабиль-юсть реагентов, возможность автоматизации процесса и объективность инструментального учета реакции.

Однако применение ИФА в диагностике хламидиозов жи-ютных сдерживается отсутствием в ветеринарной практике вы-юкочувствительных и специфичных диагностикумов.

Таким образом, разработка технологии получения компо не.нтов тест-системы диагностики хламидиоза овец методом им-муноферментного анализа на сегодняшний день является важно* и актуальной задачей.

Цели и задачи исследований. Целью настоящих исследо ваний явились: разработка технологии получения специфически) компонентов для ИФА, отработка условий постановки ИФА длз выявления антител к хламидиям, вызывающим аборты у овец I сыворотках иммунизированных животных и сравнительное изу чение чувствительности РСК (РДСК) и ИФА при количественного определении антител в этих сыворотках.

Для реализации указанной цели были поставлены еле дующие задачи:

- получить, очистить и концентрировать суспензию хламидш штамм «Улетово»;

- приготовить антигены хламидий;

получить хламидийные сыворотки на кроликах и овцах; синтезировать конъюгат антивидовых антител с ферменто!* пероксидазы для постановки ИФА;

отработать оптимальные условия постановки реакции ИФ/ для выявления антител к антигенам хламидий;

- изучить чувствительность ИФА и РСК (РДСК) при количест венном определении антихламидийных антител в сыворотка иммунизированных овец;

провести опытные испытания набора для иммуноферментно диагностики хламидиоза овец.

Научная новизна. Впервые для ветеринарных лаборатс рий России разработан набор компонентов для иммунофермеш

ной диагностики, позволяющий выявлять инфицированных хла-мидиями овец. Экспериментально доказана возможность повышения эффективности диагностики хламидиоза на 17,5% за счет применения набора ИФА.

Практическая значимость работы. Результаты научно-исследовательских работ, полученные при выполнении диссертации, вошли в нормативно-техническую документацию: I. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора

для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец; I. ТУ-938800-004 «Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец», утвержденные 31 марта 1997 г. ГУВ Мин-сельхоза и продовольствия Российской Федерации; ■ . Временное наставление по применению набора для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец, утвержденное ГУВ Минсельхоза и продовольствия Российской Федерации 31 марта 1997 г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и бсуждены на конференциях:

. Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных», Владимир, 1995 г.;

. V Всероссийской конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», Москва, 1996 гг.; Ученых советах ВНИТИБП (1995-1998 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано -статьи, заключительный отчет по научно-исследовательской

работе, нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение диагностикума.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

получение специфических компонентов для постановки им-муноферментного анализа;

отработка условий постановки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к антигенам хламидий; изучение сравнительной чувствительности РСК (РДСК) и ИФА при определении антихламидийных антител в сыворотках иммунизированных животных; - апробация набора для иммуноферментной диагностики хла-мидиоза овец.

Объем и структура диссертации. Диссертационный материал изложен на 128 машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 13 рисунками. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 105 иностранных.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования по разработке диагностики хламидиоза ове1 методом иммуноферментного анализа проводились в 1995-200( годах во ВНИТИБП и ВИЭВ.

Штаммы хламидий. Использовали хламидии штама «Улетово» (ВНИТИБП) - вид С.рэМаа, выделенный в 1994 г. и

плодов абортированных овец, адаптированный к размножению в куриных эмбрионах.

Антиген для ИФА готовили из суспензии хламидий с инфекционным титром не ниже 106'°-107'° ЭЛД50/03 см3 по разработанному нами методу. 20%-ную суспензию хламидий обрабатывали ультразвуком циклично по 15 сек в течение 10 мин на установке УЗДН-2Т, после центрифугирования супернатант очищали хроматографией на колонке К 16/70, заполненной сефакрилом 8300. В качестве эллюирующего буфера использовали 50мМ трис-НС1 буфер с 0,15 М №С1 рН-7,6 с 0,1% ЭДТА при скорости 0,1 см3/мин.

Получение хламнднйных и лпгивндовых сывороток.

Хламидийные сыворотки получали иммунизацией кроликов и овец 20%-ной взвесью инфицированных хламидиями желточных оболочек куриных эмбрионов с инфекционным титром 10б'° -

7 0 3

10 ! ЭЛД50/03 см и препаратом очищенного антигена хламидий по предложенным нами схемам. Схемы иммунизации кроликов и овец отличались дозой и сроками введения антигена.

Отрицательную (нормальную) сыворотку получали от животных из хозяйств, благополучных по хламидиозу.

В исследованиях применяли экспериментальные сыворотки крови овец с установленным диагнозом - хламидиоз (325 прозы) и подозрительные по заболеванию (182 пробы), а также кам-пилобактериозные, сальмонеллезные и лептоспирозные сыворотки (42 пробы), полученные из хозяйств, ветучреждений и ВНИ-ГИБП.

Антивидовые сыворотки получали иммунизацией кроли-<ов подкожно препаратом ^О, выделенным из нормальной сыво-

ротки крови барана, используя на весь цикл иммунизации 15 мг белка. Препарат IgG барана вводили кроликам пять раз с 3-дневным перерывом. Для повышения титров антител на 45-й день дополнительно вводили бустер-дозу (2 мг белка) в/венно двукратно.

' Антисыворотку на весь белковый спектр сыворотки крови барана получали по схеме, разработанной ранее в лаборатории иммунологии ВНИТИБП. Цельную сыворотку вводили кроликам подкожно 4-кратно в течение 2 недель в дозе 1-5 см3.

Животные и куриные эмбрионы. В работе использованы:

кролики массой 2,5-3,0 кг - 20 гол.; овцы 2-годовалые - 10 гол. - 6-10-дневные развивающие куриные эмбрионы - 350 шт.

Выделение IgG из сыворотки крови барана. За основу получения IgG был взят метод ионообменной хроматографии выделения IgG из сыворотки крови человека в нашей модификации: в качестве исходного материала использовали фракцию иммуноглобулинов, полученную осаждением 20%-ным водным раствором ПЭГ-6000. Ионообменную хроматографию проводили на ДЭАЭ-целлюлозе (Pharmacia, Швеция) в объеме, используя в качестве элюирующего буфера 0,01 М фосфатный буфер с рН: 6,7; 6,8, 6,9; 7,0.

Очистка антивидовых антител. Очистку антител из антивидовых сывороток проводили аффинной хроматографией на иммуносорбенте с иммобилизованными белками IgG барана на активированную BrCn-сефарозу 4В (фирма «LKB», Швеция) из расчета 50 см3 агарозы и 10-50 мг белка. Несвязавшиеся с матри-

цей белки удаляли промыванием ФБР pH 7,2-7,4 до исчезновения поглощения при 280 нм. Антитела выделяли из антисыворотки, объем которой зависел от титра антивидовых антител, элюируя с иммуносорбента 0,2 М HCl-глициновым буфером pH 2,2-2,8. Элюаты с ОПгяо > 0,05 o.e. объединяли и концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 10 мг/см3.

Получение иммунофермснтных конъюгатов. Конъюга-ты получали ковалентным связыванием очищенных афинной хроматографией антивидовых антител с ферментом пероксидазы хрена (ПХ) производства НПО «Биохимреактив», Олайне с RZ = 2,8-3,0 перйодатным методом по Wilson, Nakane (1974). Меченые антитела отделяли хроматографией на сефадексе G-200 в 0,01 М ФБР pH 7,4. Фракции конъюгатов с отношением К = ОП403/ОП280 > 0,3-0,5 объединяли, стабилизировали бычьим сывороточным альбумином и лиофилизировали. Активность и рабочее разведение конъюгата устанавливали в ИФА. Антивидовой пероксидаз-ный конъюгат считался активным и специфичным, если в реакции с IgG барана величина 011492^1,2-1,5, а в реакции с IgG кротка - ОП492< 0,05.

Концентрирование препаратов антигенов и антител. Препараты антигенов и антител концентрировали методом ульт-зафильтрации на лабораторных ультрафильтрационных ячейках типа ФМО 2-200 (СКБ АП АН, Ленинград), на мембранах «Вла-щпор» УАМ-150. Ультрафильтрацию проводили на ацетатных лембранах под давлением 0,3 МПа при 18-22°С со скоростью 0,6 :м3/мин.

Иммунологические реакции. Для определения хлами-[ийных антител в исследуемых сыворотках использовали непря-

мой вариант ИФА, который ставили в микроплатах для иммуно-химических исследований «Медполнмер» (Россия) или «ОугШесЬ» (Швейцария) в объеме 0,1 см3. Результаты реакции ИФА учитывали через 30 минут при длине волн 492 нм на спектрофотометре М11-580 фирмы «Бупа1есЬ». В качестве энзим-субстрата использовали орто-фенилен-диамин (0,4 мг/см3) в 0,1М цитрат-фосфатном буфере рН - 5,0 с 0,03% Н2О2.

РСК (РДСК) проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторным исследованиям на хламидийные инфекции сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ Гос-агропрома СССР 15 апреля 1986 г., используя «Диагностикум хламидийный для РСК».

Реакцию диффузионной преципитации (РДП) проводили по Оухтерлони (1967) в 1,5%-ном агаре.

Иммунноэлектрофорез проводили в 1%-ном агаре на ве-ронал-мединаловом буфере рН - 8,6 по методу Грабар Р., Ульямс Д. (1953).

Биохимические методы. Общий белок в сыворотках крови и препаратах антигенов хламидий определяли по методу Ло-ури и др. (1956) и спектрофотометрически на СФ-26 при длине волн 280 нм.

Гомогенность препаратов иммуноглобулинов проверял! электрофорезом в 7,5% ПААГ в слабощелочной среде рН - 8,3.

Статистическая обработка результатов. Статистиче скую достоверность данных определяли по методу Стьюдента Статистическую обработку результатов серологических исследо ваний проводили по методике, описанной А.А.Маслаком с соав торами (1993).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе была изучена возможность получения антигена для ИФА из концентрированной очищенной биомассы хламидий.

Культивирование, очистка и концентрирование хламидий. В связи с тем, что часто эмбрионы погибают от мико-плазм, в своей работе мы использовали экспресс-метод контроля инфицированности микоплазмами эмбрионов птиц, предложенный Хамадеевым Р.Х. (1990), и в дальнейшей работе использовали эмбрионы из тех птицехозяйств, где микоплазмы не обнаружены или инфицированность их не превышала 20%.

Куриные эмбрионы 6-7-дневного возраста заражали в желточную полость 5%-нои суспензией хламидий в дозе 0,3 см . Желточные мешки от эмбрионов, павших на 6-9-й дни после заражения, с инфицированностью хламидиями на 3-4 креста и инфекционным титром Ю6,0- Ю7,0ЭЛД5о/о,з см3 собирали и готовили 20%-ную суспензию на 0,2 М ФБР рН-7,3. После отстоя (24ч) суспензию центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 30 мин, средний слой собирали в стерильные флаконы, а верхний (липиды) - удаляли. Осадок ткани повторно гомогенизировали в удвоенном количестве 0,2М ФБР рН-7,3 и обрабатывали в том же режиме. Объединенный материал использовали в качестве концентрированной частично очищенной и инактивированной хла-мидосодержащей взвеси для получения антигена и хламидийных сывороток.

Получение антигенов хламидий. Нами предложен метод получения антигена для ИФА, включающий обработку 20%-ной

суспензии хламидий ультразвуком, центрифугирования гомоге-ната при 5 тыс.об/мин в течение 30 мин и очисткой супернатанта хроматографией на сефакриле S-300.

Контрольные (отрицательные) антигены готовили по аналогичному методу, используя желточные мешочки от интактных 9-10-суточных куриных эмбрионов.

Хроматографический профиль супернатанта, снятый с колонки К 16/70 в 50 мМ в трис-HCl буфере с 0,15М NaCl рН 7,6 и 0,1%-ным ЭДТА, представлен на рис.1.

Фракции

Рис. 1. Хроматография очистки хламидийного антигена на сефакриле 8-300.

Как видно из рис.1 супернатант фракционировался на 3 белковых пика, характеристика которых представлена в табл.1.

Таблица 1

Характеристика фракций антигенов хламидий

№ Материал Белок, мг/см3 Активность в ОП492( 1:400)

РСК ИФА хлами-дийная сыворотка отрицательная сыворотка

1 Супернатант 0,32 1:32 1:640 0,980±0,10 0,315+0,01

2 I пик 0.20 1:16 1:640-1:1280 0,914±0,05 0,09±0,07

3 II пик 0,08 1:8 1:160-1:320 0,802±0,12 0,Ю±0,03

4 III пик 0,05 - - _ _

5 I+II пик 2-3 1:128 1:2560-1:5120 1,210+0,01 0,10+0,02

концентри-

рованный

Из приведенных в таблице результатов видно, что хроматография супернатанта на сефакриле 8-300 позволила освободиться от примесных белков и получить активные и специфичные по данным РСК и ИФА фракции антигенов.

Специфичность полученного хламидийного антигена (концентрированный материал I +11 пика) была подтверждена отрицательными результатами ИФА при титровании отрицательных, кампилобактериозных, сальмонеллезных и лептоспирозных сывороток.

Материал, полученный после обработки суспензии хламидий ультразвуком, использовали в качестве комплементсвязы-вающего антигена для РСК.

Для стабилизации активности хламидийных антигенов исследовали различные режимы высушивания и наполнители.

Активность антигена хламидий до и после лиофилизации с различной концентрацией защитной среды (декстран Т-70, сахароза) приведена в таблице 2.

Таблица 2

Влияние состава защитных сред на активность антигена хламидий при лиофилизации

№ Состав защит- Активность антигенов в ИФА

се- ной среды нативного после через 12 через 18

рии сушки мес. мес.

1. 1,0% декстрана 1 5120 1:2560 1:1280 1:1280

2. 1,5%декстрана 1 5120 1:5120 1:5120 1:5120

3. 3,0% декстрана 1 2560 1:1280 1:1280 1:640

4. 5,0% декстрана 1 5120 1:2560 1:1280 1:640

5. 5,0% сахарозы 1 2560 1:1280 1:640 1:320

Антиген, высушенный с 1,5%-ным декстраном Т-70, сохранял свою активность в течение 18 месяцев (срок наблюдения), при снижении активности антигена, высушенного в среде с 1%, 3%, 5%-ным декстраном и 5%-ной концентрацией сахарозы.

Таким образом, нами была разработана технология производства диагностического антигена для ИФА, позволившая сохранить его свойства в лиофилизированном виде в течение 18 месяцев.

Получение хламидийных сывороток на кроликах и овцах. Хламидийные сыворотки получали иммунизацией кроликов по трем схемам:

по №1 схеме кроликов иммунизировали 20%-ной суспензией

■у

хламидий подкожно в дозе 1 см с интервалом 8 дней, затем с интервалом в 10 дней животным вводили с адъювантом (1:1) антиген в дозе 50, 100, 120 мкг белка;

- по №2 схеме кроликов иммунизировали 20%-ной суспензией хламидий подкожно в дозе 2 см3, дальнейшую иммунизацию проводили по схеме №1;

по №3 схеме кроликов иммунизировали только очищенным антигеном с интервалом между инъекциями в 7 дней, используя 50, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 50 и 100 мкг белка.

Полученные сыворотки исследовали в РСК и ИФА титрованием с хламидийным антигеном и конъюгатом анти-IgG кролика, полученным в отделе иммунологии ранее (ТУ 46-21-78-85). Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3

Активность кроличьих хламидийных сывороток в ИФА и РСК

в зависимости от схем иммунизации

¿ 5 Сроки Титры ОП,92 (в разведении 1:400)

с Р 2 о иммуни- РСК ИФА хламидииныи слрицательиъш

и с- зации антиген антиген

1 57 1:64 1:6400 0,410±0,017 0,262+0,03

2 45 1:32 1:1600 0,380+0,012 0,212+0,015

3 63 1:256 1:51200-1:102400 0,612±0,07 0,127±0,01

Из таблицы видно, что наиболее активная хламидийная сыворотка (№3) получена иммунизацией очищенным антигеном. Она была использована на первом этапе отработки оптимальных условий постановки тест-системы ИФА для выявления хламидийных антител в качестве положительного контроля.

Сыворотки, полученные по схемам №№1-2, использовали в качестве диагностических сывороток при постановке РСК.

Для комплектования наборов для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец отрабатывали схемы иммунизации на суягных и несуягных животных. В связи с тем, что существуют технологические и организационные сложности получения хла-мидийных сывороток на суягных овцах, сыворотку получали на несуягных животных.

Активность полученных сывороток показана в таблице 4.

Таблица 4

Активность хлалшдшшых сывороток от песуягых овец в

ИФА u РСК

№ Сыворотки ОП«2 сывороток в разведении 1:400

п/п Объем, РСК ИФА хламидийным отрицательный

см3 антиген антиген

1 500 1:32 1:1600 0,313±0,12 0,071±0,07

2 500 1:64 1:3200 0,470±0,04 0,058+0,12

3 800 1:128 1:6400 0,612±0,01 0,05210,04

4 800 1:256 1:12800 0,828±0,05 0,022+0,01

Анализируя данные таблицы 4 можно заключить, что сыворотки, полученные от несуягных овец, имели титр в ИФА 1:6400 - 1:12800 с низким фоновым значением в тест-системе с отрицательным антигеном (среднее значение ОП492 составило 0,052±0,06 o.e.). С учетом полученных результатов, предложенная схема иммунизации несуягных овец была включена в НТД, а полученная хламидийная сыворотка была использована для комплектования наборов.

Контрольные (отрицательные) сыворотки, полученные от клинически здоровых овец с отрицательной реакцией в ИФА с хламидийным антигеном, лиофилизовали и комплектовали набор для диагностики хламидиоза овец.

Получение антител, меченных ферментом перокенда-.1, для постановки реакции ИФА. Специфичность ИФА на-эямую зависит от активности и специфичности иммуноперок-щазных конъюгатов.

Получение иммунопероксидазных конъюгатов включало: выделение ^О из нормальной сыворотки крови барана; получение антивидовой сыворотки иммунизацией кроликов препаратом ^О барана;

выделение специфических антител из антивидовых антисывороток;

мечение антивидовых антител с ферментом пероксидазы.

Выделение ^С из нормальной сыворотки крови бара-

¡1. Исходным материалом для выделения из сыворотки кро-\ барана служила глобулиновая фракция, полученная преципи-1цией 20%-ным водным раствором ПЭГ-6000.

С целью получения чистого препарата 1§С были исследо-шы 0,01М фосфатные растворы с различным значением рН: 6,7; 8; 6,9; 7,0.

На основании опытов было установлено, что применение 01М ФБР с рН 7,0 позволило получить иммунохимически чис-лй препарат ^О.

О чистоте препарата 1§0 по данным электрофореза в 7,5% ААГ свидетельствовало наличие одной окрашенной зоны, рас-оложенной ближе к катодной части столбика в зоне иммуногло-улинов данного класса.

Специфичность препарата барана была подтверждена ммунноэлектрофорезом и была представлена единственной ду-

гой преципитации, соответствующей 1^0 (контролем служи, нормальная сыворотка крови барана).

Таким образом, методом ионообменной хроматограф! глобулиновой фракции на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,01М ФБР рН 7 был получен иммунохимически чистый препарат из сыв ротки крови барана, который использовали для иммунизащ кроликов при получении антивидовых сывороток.

Иммунизация кроликов препаратом барана дл получения антивидовой сыворотки. Препарат барана концентрацией 2 мг/см3 белка и адъювантом Фрейнда (1:1) вв< дили кроликам 5 раз с интервалом 3 дня по схеме:

1-й день - 2 см3 смеси - подкожно;

4-й день - 1 см3 (2 мг белка) - подкожно;

7-й день - 1 см3 (2 мг белка) - внутримышечно;

10-й день - 1 см3 (2 мг белка) - подкожно;

о

13-й день - 1 см (2 мг белка) - внутримышечно.

На 30-й день проводили реиммунизацию внутривенн двукратно с интервалом 3 дня по 1 см3 препарата 1цО барана.

Полученные сыворотки исследовали в РДП против преш рата барана с концентрацией 1 мг/см3.

Прецигштирующая активность антивидовых сыворото представлена в таблице 5.

Таблица 5

Активность аитивидовых сывороток в РДП

№ п/п Сыворотки Титр в РДП

13-й день 54-й день

1 Кроличья против барана 1:8 1:64

2 -II- 1:4 1:32

3 -II- 1:16 1:128

4 1:16 1:128

К 13-му дню титры антител в сыворотках составили 1:4 -1:16, дополнительное введение антигена повысило титры преци-питирующих антител к 54-му дню до 1:128.

Антивидовые сыворотки в дальнейшем были использованы при выделении специфических антител методом аффинной хроматографии.

Выделение специфических антител из антивидовых сывороток. В опытах по определению максимальной сорбции белков на сефарозу было установлено, что количество иммобилизованных белков ^О составило 50-58% от исходного, наносимого на сефарозу.

Специфические антитела выделяли из антивидовых сывороток с титром преципитирующсй активности 1:8 - 1:128. Эффективность выделения специфических антител из антивидовых сывороток представлена в таблице 6.

Таблица 6

Характеристика специфических аитшпел, выделенных из антивидовых сывороток

Материал Характеристика исходной Характеристика выделеша.

алтисыворотки антител

Титр Объем, Белок, Всего Объем, Белок Всего 1

вРДП см3 мг/см3 белка см3 мг/см3 белка (

Сыворотка

антивидовая 1:16 10 68 680 2,0 3,45 6,9

-II - 1:64 10 68 680 2,2 5,1 11,2

1:128 10 68 680 2,2 8,2 18,0

-II - 1:8 10 68 680 2,0 2,0 4,0

1:32 10 68 680 2,0 4,2 8,4

Из приведенных данных в таблице видно, чтс выход специфических антител существенно зависел от титра антивидовой сыворотки. Из 10 мл сыворотки с различной активностью выход антител составил 2,6% с титром 1:128, 1,6% - 1:64 и всего 0,6% с титром 1:8.

Контроль специфичности выделенных антител в иммуно-электрофорезе показал, что препарат специфических антивидовых антител с цельной сывороткой крови барана формировал одну дугу преципитации, характерную для и не содержал примесей белков иммуноглобулинов других классов.

Выделенные специфические антитела использовали для получения конъюгатов с ферментом пероксидазы из хрена.

Меченые антивидовых антител с ферментом пероксидазы. Конъюгаты получали при использовании пероксидазы хрена с 112 - 2,7 - 3,0 и удельной активности 739,2 ед/мг и специфических антител очищенных афинной хроматографией.

Активность и специфичность полученных конъюгатов ус-анавливали в ИФА с гомологичными (IgG барана) и гетероло-ичными (IgG кролика) иммуноглобулинами, адсорбированными лунках микроплат в концентрации 20 мкг/см3 в 0,5М карбонатом буфере рН-9,6,.

Получено 4 серии конъюгатов активностью 1:20000 (рабо-ее разведение 1:4000), что соответствовало 150-300 нг/см3 феррита.

Исследования по изучению структурной гомологии имму-оглобулинов барана и козы с конъюгатами козы показали, что ровень ОП492 конъюгата анти-IgG барана с IgG козы в разведе-ии 1:4000 составил - 1,2 o.e., при ОП492 - 1,05 o.e. для конъюга-а анти-IgG козы с IgG барана, что свидетельствует о гомологич-ом родстве иммуноглобулинов барана и козы, при фоновой ре-кции с IgG кролика 0,05 o.e. для двух конъюгатов.

Конъюгат стабилизировали 1%-ным бычьим сывороточ-ым альбумином, лиофилизировали и использовали в комплекта-ии набора для диагностики хламидиоза овец методом ИФА.

Отработка оптимальных условий постановки реакции [ФА для выявления антител к антигенам хламндий. Отра-отку оптимальных условий постановки тест-системы ИФА про-одили на модели кроличьих хламидийных сывороток, в даль-ейших исследованиях использовали сыворотки, полученные на вцах.

Оптимальные условия постановки ИФА отрабатывали по ледующим показателям:

концентрация хламидийного антигена на носителе; стартовое разведение контрольных и исследуемых сывороток;

рабочее разведение конъюгата; условия инкубации реагентов.

Результаты подбора концентрации антигена показали, чт( максимальная интенсивность реакции ИФА регистрировалась начиная с дозы 4 мкг/0,1 см3, что и позволило считать ее опти мальной.

В опытах по определению стартового разведения иссле дуемых сывороток установлено, что влияние неспецифическогс фонового связывания удается свести к минимуму при стартово\ разведении сывороток 1:100.

Рабочее разведение конъюгата в реакции ИФА с кон трольными и исследуемыми сыворотками составило 1:4000.

Для подбора рН адсорбционного буфера, в котором про исходит фиксация антигенов в лунках микроплат, были испыта ны 0,01М ФБР рН 5,0-8,0 и 0,5М карбонатный буфер рН 8,5 - 9,5.

Результаты опытов показали, что оптимальная фиксацш антигена достигалась при рН, близким к нейтральным. Это далс нам основание использовать для фиксации антигена 0.01М ФБ1 рН 7,2 - 7,4 с 0,15М №С1.

Проведенными исследованиями установлены оптималь ные условия постановки реакции ИФА:

сорбция хламидийного антигена в лунки микроплат в дозе <-мкг/0,1см3 в 0,01М ФБР рН 7,2-7,4 с 0,15М ШС1 в течение 1 1,5 ч при 37°С или 24 ч при 4°С;

трехкратная промывка микроплат в ФБР с 0,05% детергешт твин-20, 40, 80 или тритон Х-305 (ТФБР); блокировка несвязавщихся мест - 1%-ным раствором БСА I ФБР в течение 1 ч при 37°С;

промывка микроплат ТФБР;

титрование исследуемых и контрольных сывороток, начиная с разведения 1:100 на ТФБР, инкубация 1,5 ч при 37°С; промывка микроплат ТФБР, сушка микроплат на фильтровальной бумаге;

внесение антивидового конъюгата в рабочем разведении на ТФБР, инкубация 1 ч при 37°С;

промывка микроплат ТФБР, дистиллированной водой, сушка микроплат на фильтровальной бумаге;

проявление реакции энзим-субстратным раствором рН-5,0

I

при 20°С в течение 30 мин.;

остановка реакции внесением стоп-реагента - 50 мкл 4Н раствора H2SO4;

учет результатов реакции визуально или на спектрофотометре с вертикальным лучом при 492 н.м.

Чувствительность и специфичность разработанной тест-:истемы анализировали сравнительным титрованием в ИФА и *СК (РДСК) сывороток крови невакцинированных, эксперимен-ально зараженных хламидиями, абортировавших в полевых ус-ювиях и вакцинированных против хламидиоза овец, а также юльных сальмонеллезом, кампилобактериозом и листериозом.

Установлено разведение исследуемых сывороток - 1:200 жрининг титр, позволяющий достоверно диагностировать хла-лидийнуго инфекцию у овец.

Из 128 сывороток в РСК (РДСК) положительно реагиро-?али 97 сывороток, а в ИФА - 118. Наибольший процент выявле--шя положительных сывороток (92,5%) был получен в ИФА, в 5СК процент положительных реакций был ниже и составил 75%.

При этом, титры хламидийных антител в ИФА превосходил аналогичный показатель РСК в 10-20 раз. Отмечена сильная кор релятивная зависимость (г= 0,86 при Р<0,01) между величинам! титров антител, определенных в ИФА и РСК. Причем скрининг титр оказался более вариабельным показателем для оценки ре зультатов ИФА в сравнении с конечным разведением. Данны свидетельствуют о тесной корреляционной связи между исполь зуемыми методами.

Использование диагностикума для оценки поствакциналь ного иммунитета, также показало высокую чувствительност] разработанного набора. При исследовании 213 сывороток от вак цинированных против хламидиоза овец в ИФА положителык реагировало 98-,5%, а в РСК - 84,5% от общего числа сывороток.

Анализ сывороток крови невакцинированных животных I овец, инфицированных другими возбудителями, дали отрицательные результаты ИФА.

Обобщая вышеизложенные результаты, можно заключить, что метод ИФА позволяет более эффективно определять хламидийные антитела в сыворотках крови инфицированных овец, чем это возможно при исследованиях в РСК, РДСК. Межд> методами существует коррелятивная связь.

Высокая чувствительность ИФА, небольшой объем исследуемой сыворотки, высокие возможности в стандартизации тест-системы, быстрое получение результатов позволяют использовать этот метод для сероэпидемиологических исследований.

Результаты полученных исследований обобщены в НТД по изготовлению, контролю и применению компонентов набора для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец.

Конструирование набора для иммуноферментной ди-iгностики хламидиоза овец. Диагностический набор содержит 1-3 компонентов (5 - лиофилизированных биологических и 8 - химических), четыре 9б-луночных полистироловых микроплаты для тостановки ИФА, упакованные в одну картонную коробку: апологические компоненты: Nal. Специфический хламидийный антиген; N°2. Хламидийная (положительная) сыворотка; Nb3. Отрицательная (нормальная) сыворотка; №4. Антивидовой (анти-IgG барана) конъюгат; №5 раствор 1% -ого альбумина;

¡N°№ 6-13 - химические компоненты для приготовления буферных растворов.

Набор пригоден для применения в течение 12 мес. со дня изготовления при условии хранения в темном сухом месте при температуре не выше 2-8°С.

Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец применяют при первичной постановке диагноза и с целью установления степени распространения инфекции в отаре.

При первичной постановке диагноза исследованию подвергают парные сыворотки, взятые в начале заболевания и спустя 10-15 суток.

Сыворотки исследуют в разведении 1:200, парные сыворотки - в разведениях 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600,.

Набор рассчитан на исследование 356 проб сывороток в разведении 1:200 или 84 парных сывороток в разведениях 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.

Результаты реакции ИФА учитывают визуально* и спек трофотометрически.

Визуальный учет.

При наличии специфических хламидийных антител луню с исследуемыми сыворотками имеют оранжево-коричневое ок рашивание, сравнимое с цветом раствора в положительном кон троле. Отрицательными считаются сыворотки, не изменивши! окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету от рицательного контроля.

Спектрофотометрический учет.

Регистрацию результатов реакции проводят на фотометр« при длине волны 492 нм и выражают в единицах оптическое плотности (ОП492 o.e.).

Исследуемая сыворотка в разведении 1:200 (скрининг титр) считается положительной, если ее ОП492 в 2 и более ра: превосходит ОП492 среднего значения отрицательной (нормаль ной) сыворотки в том же разведении, но при этом ОП492 не долж^ на быть ниже 0,200 o.e.

Сомнительными сыворотками считают те, ОП492 которы> выше отрицательного контроля и составляют 0,150 - 0,190 o.e.

Отрицательными сыворотками считают те, ОП492 которы> ниже 0,150 o.e.

Диагноз на хламидиоз.

Диагноз на хламидиоз считают установленным в следующих случаях.

При первичной постановке диагноза в хозяйстве:

нарастание титра антител при повторном исследовании сывороток крови, взятых с интервалом 10-15 суг не менее, чем у 10% животных (при отсутствии выделения возбудителя); установление положительной реакции в разведении сывороток крови 1:200 не менее, чем у 20% исследуемых животных.

В неблагополучных по хламидиозу хозяйствах: увеличение титра антител в 2 и более раз при исследовании сывороток крови, взятых с интервалом 10-15 суток; получение у данного животного положительной реакции в разведении сыворотки крови 1:200;

получение двукратной сомнительной реакции в разведении 1:200 при исследованиях сывороток крови, взятых с интервалом 10-15 сут.

Внедрение набора для нммуноферментной диагности-:н хламидиоза овец. В 1995 году набор для иммуноферментной иагностики хламидиоза овец прошел апробацию в профильной аборатории ВГНКИ ветпрепаратов и Государственной межве-омственной комиссии по испытанию ветеринарных биологиче-ких препаратов е Российской Федерации и рекомендован для [рименения в ветеринарных диагностических лабораториях.

По плану внедрения новых методов диагностики в цен-ральной научно-производственной лаборатории (Косино, л.Оранжерейная, 23) проведены 3 семинара с ветврачами 35 об-¡астей Российской Федерации по освоению метода иммунофер-1ентной диагностики хламидиоза овец и внедрению набора в ве-еринарную практику: Вологодская, Воронежская, Иркутская, Сабардино-Балкарская, Калмыкия, Краснодарский край, Курская, Типецкая, Мари-Эл, Мордовия, Московская, Оренбургская, Пен-

зенская, Пермская, Ростовская, Рязанская, Саратовская, Екатеринбургская, Северная Осетия, Ставропольский край, Тамбовская, Татарстан, Томская, Тульская, Тюменская, Удмуртия, Ульяновская, Челябинская, Чечня, Читинская, Ярославская, Алтайский край, Башкирия, Астраханская области.

Для проведения в производственных условиях сравнительных исследований сыворотки крови овец в РСК и ИФА в ветеринарные лаборатории упомянутых республик, краев и областей отправлено по 5 наборов ИФА для диагностики хламидиоза овец.

Рекламаций на качество отправленных наборов не поступало. Заключения о сравнительных испытаниях набора ИФА поступили из Тамбовской, Иркутской, Читинской областей и института ветеринарии Восточной Сибири. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7

Сравнительная диагностика хламидиоза овец с использованием РСК и ИФА

Область, Кол-во Реагировало положительно

хозяйство исслсд. РСК сред. % ИФА сред.

проб. титр тигр.

Тамбовская обл.

к-з Ганаева, 30 9 1:60+15 30,0 17 1:12800±800 «

к-з Россия, 93 3 1:26±5 3,2 9 1.9600+400 !

спк. Маяк, 35 4 1:18±4 11,4 12 1:6400±1:400

ТОО 1 мая 50 И 1:168+2 20,0 15 1:51200+1600 л J

Иркутская обл.

АО Усть-

Ордынское 155 47 1:64+16 34,2 90 1:25600+3200 5

Читинская обл.

с-з Оленгуйский 58 9 1:69±12 15,5 12 1:19200±1200 2

Всего 421 83 1:68+13 19,7 155 1:20800±1267 3

Результаты сравнительных исследований в производственных условиях показали, что из 421 исследуемой пробы в РСК юложительно реагировали 83 (19,7%), а в ИФА - 155 (37,2%) лроб, т!е. в ИФА больных хламидиозом животных выявлено на 17,5% больше, чем в РСК.

Следует отметить, что сыворотки крови, положительно реагирующие на хламидиоз в РСК, в 100% случаев реагировали юложительно в ИФА.

Таким образом, проведенные исследования показали, что 4ФА с использованием предлагаемого набора на 17,5% эффективнее РСК и может с успехом применяться в ветеринарных лабораториях вместо трудоемкой РСК.

4. ВЫВОДЫ

[. Разработан метод, включающий очистку ультразвукового су-пернатанта желточных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных штаммом «Улетово»-(ВНИТИБП) хроматографией на сефакриле Б-ЗОО, получения диагностического антигена хламидий для ИФА активностью 1:2560 - 1:5120. I. Предложены схемы получения хламидийных сывороток для

ИФА и РСК гипериммунизацией кроликов и овец. 5. На основе очищенных иммуносорбцией антител синтезирован с ферментом пероксидазы перйодатным методом антивидовой конъюгат активностью 1:20000. 1. Разработана тест-система ИФА определения хламидийных антител в сыворотках крови инфицированных овец в диагностическом титре 1:200.

5. Установлена коррелятивная зависимость РСК и ИФА (коэф фициент корреляции г=0,86 при Р<0,01), при большей эффек тивности ИФА в 17,5%.

6. Разработана технология получения компонентов набора дл: иммуноферментной диагностики хламидиоза овец.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных научно-исследовательских рабо-

оформлена научно-техническая документация:

1. Временная инструкция по изготовлению и контролю набор; для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец;

2. ТУ-93 8800-004 «Набор для иммуноферментной диагностик! хламидиоза овец», утвержденные 31 марта 1997 г. ГУВ Мин сельхоза и продовольствия Российской Федерации;

3. Временное наставление по применению набора для иммуно ферментной диагностики хламидиоза овец, утвержденно! ГУВ Минсельхоза и продовольствия Российской Федерацш 31 марта 1997 г.

4. Набор для иммуноферментной диагностики овец был апроби рован ветеринарными лабораториями России.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белоусов В.И., Клюкина В.И, Кочиш И.И. Разработка набор; для иммуноферментной серодиагностики хламидиоза овей Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезись докладов Всероссийской научно-практической конференции Владимир, 1995 г., Сборник научных трудов ВНИИЖ, с.76.

2. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Елисеев А.К., Кочиш И И. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериям и хламидиям. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. Владимир, 1995 г., Сборник научных трудов ВНИИЖ, с.74.

3. Белоусов В.И., Клюкина В.И., Кочиш И.И. Применение фермента при очистке вирусных антигенов для ИФА. Вирусные болезни сельскохозяйственных животных. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции. Владимир, 1995 г., Сборник научных трудов ВНИИЖ, с.77.

4. Белоусов В.И., Бирюков А.Г., Кузнецова C.B., Клюкина В.И., Кочиш И.И. Флюоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови различных видов животных. Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов 5-й Всероссийской конференции, Щелково, 14-17 мая 1996 г., стр.58.

Отпечатано в ООО "Мещере" Закал № 398. Тираж 100

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кочиш, Иван Иванович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОЬЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. 11ммуноферментный анализ в ветеринарии

I.II 11рииципы и методы ИФА

1. 1.2 Выбор фермет-субстратной системы 19 1.1.3. Синтез иммуноферментных конъюгатов ' 21 1.1.1 Результаты ИФА и практическое применение анализа 24 1.2 Характеристика возбудителя хламидиозов 27 1.2.1. Хламидиоз овен, и коз 30 1.2 2. Культивирование и очистка хламидий 33 1.2.3. Методы лабораторной диагностики хламидиозов

1.2.3.1. Серологические методы

1.2.3.2. Методы индикации хламидий

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 45 2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45 2.1.1. Iii гаммы хламидий 45 2.1 2 Получение хламидийных и аптивидовых сывороток 45 2 1.3. Животные и куриные эмбрионы 46 2.1 I Выделение IgG из сыворотки крови барана 47 2.1.5. Очистка аптивидовых антител

2.1.6 11олучение иммуноферментных конъюгатов

2.1.7 Концентрирование препаратов антигенов и антител 48 2.1 8. Иммунологические реакции 48 2.1.9 Биохимические методы 49 2.110 Статистическая обработка результатов

3. И ¡У'11.1 ЛТЫ С0БСТВЕ1ИТЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Культнвировапие, очистка и концентрирование хламидий

3.2 11олучсиие антигенов хламидий

3.3. Получение хламидийпых сывороток 57 3.3.1 Получение хламидийпых сывороток па кроликах 58 3.3.2. I ¡олучепне хламидийпых сывороток на овцах

3.4. Получение антител меченных ферментом пероксидазы для поста- 63 новки реакции ИФА

3.4.1 Выделение из нормальной сыворотки крови барана

3. 1.2. Иммунизация кроликов препаратом ^С барана для получения ан- 70 тир, и допой сыворотки

3.4.3 Выделение специфических антител из антивидовых сывороток

3.4.4. Мечение антивидовых антител с ферментом пероксидазы

3.4.5. Контроль иммунопероксидазпых конъюгатов

3.5. Отработка оптимальных условий постановки реакции ИФА для вы- 77 явления анти тел к антигенам хламидий

3.6. Конструирование набора для иммуиоферментной диагностики хла- 83 мидиоза оиец

3.7. Апробация набора для иммуиоферментной диагностики хламидио- 85 за овец

3.8. Внедрение набора для иммуиоферментной диагностики хламидиоза ' 90 овец

4 ()!>( УЖДЕППК РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

6 С! ШСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7. I !РИ НОЖЕПИЕ '

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментной тест-системы для диагностики хламидиоза овец"

Актуальность темы. В последние годы среди инфекционных болезней животных и птиц все большее внимание привлекают хламидийные инфекции.

Но данным ряда исследователей (Ю.Д.Караваев 1999 г., Х.З.Хазипов, А З.Равплов 1984 г.) наиболее значительный экономический ущерб испытывает промышленное овцеводство из-за больших потерь приплода в результате массовых абортов и гибели ягнят в первые дни после рождения.

Поэтому борьба с хламидийным абортом овец признана одной из актуальных задач ветеринарной науки и практики.

В настоящее время основным методом серологической диагностики хлнмидиозов является реакции связывания комплемента (РСК, РДСК). Недостатками этого метода является: трудоемкость, длительность выполнения и 11 из к а я 11 у вств ител ьность.

Для устранения перечисленных недостатков в ветеринарную практику интенсивно внедряется иммуноферменгный анализ, который занял лидирующее положение при диагностике многих инфекционных болезней (В.Н. Сюрип 1989 г.). Явным преимуществом этого теста является простота выполнения, высокая чувствительность, экспрессность, доступность и стабильность реагентов, возможность автоматизации процесса и объективность инструментального учета реакции.

Однако практическое применение ИФА во многом затрудняется из-за отсутствия в достаточном количестве необходимых специфических диагностику мо в.

Таким образом, разработка компонентов и создание тест-систем для иммунофермситной диагностики хламидиоза овец на сегодняшний день является важной и актуальной задачей.

Цели и задачи исследований. Целыо настоящих исследований явились разработка технологии получения специфических компонентов для ИФЛ, отработка условий постановки ИФА для выявления антител к хлами-дням. вы бывающим аборты у овец в сыворотках иммунизированных живот-пых и сравнительное изучение чувствительности РСК (РДСК) и ИФА при количественном определении антител в этих сыворотках.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

- получить, очистить и концентрировать суспензию хламидий штамм «Уле-тово»;

- приготовить антигены хламидий;

- получить хламидпйпые сыворотки на кроликах и овцах;

- синтезировать коныогат ангивидовых антител с ферментом пероксидазы р для постановки ИФА;

- отработать оптимальные условия постановки реакции ИФА для выявления антител к антигенам хламидий;

- изучить чувствительность ИФА и РСК (РДСК) при количественном определении агтгихламидийных антител в сыворотках иммунизированных овец;

- провести опытные испытания набора для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец.

Научная новизна. Впервые для ветеринарных лабораторий России разработан набор компонентов для иммуноферментной диагностики, позволяющий выявлять инфицированных хламидиями овец. Экспериментально доказана возможность повышения эффективности диагностики хламидиоза на 17,5% за счет применения набора ИФА.

Практическая значимость работы. Результаты научно-исследовательской работы, полученные при выполнении диссертации вошли в нормативно-техническую документацию:

1. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора для иммуно-ферментной диагностики хламидиоза овец;

2. Г^^-938800-004 «Набор для иммупоферментной диагностики хламидиоза овец», утвержденные 31 марта 1997 г. ГУВ Минсельхоза и продовольствия Российской Федерации;

3. Временное наставление по применению набора для иммупоферментной диагностики хламидиоза овец, утвержденное ГУВ Минсельхоза и продовольствия Российской Федерации 31 марта 1997 г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях:

1. V Всероссийской конференциях «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов», Москва, 19% гг.;

2. Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные болезни сельскохозяйственных животных», Владимир, 1995 г.;

3. Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных», Москва, 1996 г.;

4. Ученых советах ВНИТИБП (1995-1998 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, заключительный отчет по научно-исследовательской работе, нормативно-техническая документация на изготовление, контроль и применение диагно-стикума.

Основные положения диссертации, выносимые па защиту:

- получение специфических компонентов для постановки иммунофермент-по| о анализа;

- отработка условий постановки иммупоферментной тест-системы для- выявления антител к антигенам хламидий;

- изучение сравнительной чувствительности РСК (РДСК) и ИФА при определении антихламидийпых ант тел в сыворотках иммунизированных животных;

- апробация набора для иммуноферментной диагностики хламидиоза овец.

Объем и структура диссертации. Диссертационный материал изложен на 128 машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и приложения. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 13 рисунками. Список литературы содержит 220 источников., в том числе 105 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кочиш, Иван Иванович

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод, включающий очистку ультразвукового супсрпатаита желточных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных штаммом «Улетово»-(ВНИТИЬП) хроматографией па сефакриле S-300, получения диагностического антигена хламидий для ИФА активностью 1:2560

1:5 1 20.

2. Предложены схемы получения хламидийных сывороток для ИФА и РСК гиперпммупнзацией кроликов и овец.

3. IIa основе очищенных иммуносорбцией антител синтезирован с ферментом пероксидазы перйодатпым методом антивидовой конъюгат активностью 1:20()00.

4. Разработана тест-система ИФА определения хламидийных антител в сыворотках крови инфицированных овец в диагностическом титре 1:2()0.

5. Установлена коррелятивная зависимость РСК и ИФА (коэффициент корреляции г 0,86 при Р<0,01), при большей эффективности ИФА в 1 7,5%.

6. Разработана технология получения компонентов набора для иммунофер-мептпой диагностики хламидиоза овец.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных иаучио-исследовательских работ оформлена научно-техническая документация:

1. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора для иммуио-фермеитной диагностики хламидиоза овец;

2. ТУ-938800-004 «Набор для иммунофермептной диагностики хламидиоза овец», утвержденные 31 марта 1997 г. ГУ В Минсельхоза и продовольствия Российской Федерации;

3. Временное наставление по применению набора для иммунофермептной диагностики хламидиоза овец, утвержденное ГУВ Минсельхоза и продовольствия Российской Федерации 31 марта 1997 г.

4. Набор для иммунофермептной диагностике овец был апробирован ветеринарными лабораториями России.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кочиш, Иван Иванович, Щелково

1. Абортогенные иифекции овец в Восточном Забайкалье и перспективы борьбы с ними. / Стремилов П.И., Усольцев В.М., Сроков В.И. и др. Ветер. пробл. Забайкалья. Сб. научи, тр. СО РАСХИ. Новосибирск, 1993,сЛ-().

2. Авдосьева И.К., Лукьянчук В.А., Беклешова АЛО. Сравнительная оценка специфической активности хламидийных антигенов. // Тез.докл. Вссс.паучн.конф. «Соверщ. методов гос. контроля вет. препаратов» 14-16 мая 1991 / ВП 1КИ ветпрепаратов -М. 1991 ,-98с.

3. Альбертсоп Пер-Окс. Разделение клеточных частиц и макромолекул. -М.: Мир, 1974,-382с.

4. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиолог ических исследованиях JI., 1962.

5. Белоусов 13.И., Юпокина В.И., Кочиш И.И. Разработка набора для имму-иофермсптной серодиагностики хламидиоза овец / Вирусы, болезни с/х животных Владимир, 1995. - С.76.

6. Беклешова АЛО. Болезни овец хламидиями. Хламидиозы // Инфекционные болезни животных: Справочник. М:Агропромиздат 1987 - с.141

7. Ьортпичук В.А. Значение реакции иммунофлуоресценции при диаг ностике хлампдиоза свиней // Микробиол. Ж. 1989.- № 1. - С. 12.

8. Бортпичук В.А. Хламидиоз свиней Киев: Урожай, 1991. - 192с.

9. Васильев A.B., Непоклонова И.В. Иммуноферментный метод в диагностике вирусных инфекций // Ветеринария. 1982. - № 8. - С. 63-65.

10. Введение в прикладную эпзимологию. Иммобилизованные ферменты / Иод, ред. И.В. Березина и К. Мартенека. М,- МГУ,- 1982. - 384 с.1 6. Вши пяков И.Ф., Цыбанова Л.Я. Иммуноферментный анализ // Ветеринария. 1983. - № 9. - С. 68-70.

11. Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я., Молчанова Т.В. Иммуноферментный анализ при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / Вопр. вет. вирусол., эииз. и микроб.: Тез. докл. научи, конф. -Покров, 1983.-С.66-76.

12. Волкова A.A. Вирусный аборт овец // Малоизученные заболевания с.-х. животных: -М. Колос, 1967, -с. 123-124.

13. Выбор метода получения коныогатов стафилококкового белка А с перок-сидазой для иммупофермептпого анализа / Е.В.11ерельман, В.Ф.Булк, П.В.Щетинина и др. //ЖМ')И. 1986. - № 10. - С. 68-71.

14. Га(|)фаров Х.З., Хамадеев Р.Х., Шафикова Р.А. и др. Итоги широкого производственного испытания диагиостикума хламидийного аборта овец / Болезни овец и меры борьбы с ними: Тез. докл. Всесоюз. конф. Чита, 1980. С. 33-36.

15. Гаффаров Х.З., Михайлова Л.И., Кривоносов B.C., Рашевский И.П., Вале-св К.И. Выделение вируса из группы ОЛТ при энзоотическом аборте овец //1 ветеринария, -1971, №7, с. 104-1 1 1.

16. Гаффаров Х.З., Хамадеев. Эпизоотологические аспекты хламидиозпого аборта овец и основные принципы его профилактики. // Актуальн. воир. эпtI300T. Тез. докл. Всесоюзи. научн. комф. но проблемам эпизоотологии -Казань, 1983, - с. 138.

17. Гольдпп р.Б., Пурапова И.В., Мипакова П.Г. Способ получения хлами-дийпой иммунной асцитической жидкости. Ав.св. 1700823, 1989.

18. Громыко Л.Г., Громыко А.И. Диагностика орнигоза у птиц с помощью реакции агглютинации элементарных телец// Экология вирусов. Матер. К) симп. Баку, - 1976, - с. 209-210.

19. Громыко JI.Г., Терских И.И. Применение иммуноферментного метода (HI,ISA) при хламидийных инфекциях // Вопр. вирусол. 1981. - № 2. — С. 245-248. ■

20. Гусев A.A., Панин А.И. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом. Владимир, 1998. - 179 с.

21. Деханов A.A. Выделение при энзоотической бронхопневмонии телят микроорганизмов из группы орпитоза-пситтакоза / Профилактика и лечение заболеваний сельскохозяйственных животных: Труды Ульяновского с.-х. нп-та. 1970,-№ 16. -С.26-28.

22. Дзаптиев Б.Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа // Бюл. BIDB. 1985. Вып. 58. - С. 10-22.

23. Дзаптнев Б.Б., Егоров A.M. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа // ЖВХО. 1982. - Т. 27,- № 4. -С. 442--449.

24. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний, передаваемых половым путем: Методич. мазер. / Под ред. Борисенко К.К. и др. М.: Асе.1. Сенам». 1997.

25. Диксон М„ Уэбб ). Ферменты. М.: Мир,- 1982. - Т. 1-3. - 1 11 8 с.

26. Домейка М.А. ЭЛИСА для индикации антител и антигена хламидий энтерита и пневмоний телят // Бюлл. ВНИИ экспер.вет. 1985. - № 58.1. С.58-61.

27. Домейка М.Л., Абрамова JI.I1., Мальцева Н.П., Терских И.И. Использование пммунофсрмситпого метода для исследований аптихла-мидийных сывороток // Вопр. Вирусол. 1985. - № 4. - С. 474.

28. Т'встифеев 13.В., Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М., Равилов А.З. Выявление хдампдийных антител и антигенов в РИГА / Матер. Междунар. науч. конф. поев. 125-летию академии. Казань, 1998. - 4.1. - С.37-38.

29. Звягин И.В. Хорьков И.А. и др. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов, М„ 1981,- 33с.

30. Иммунофермент пый анализ / Под ред. Т.Т.Иго, Г.Ленхоффа, М.: Мир, -1988,- 446 с.

31. Иммупофермсптная тест-система на основе (Pab)2 -фрагментов антител для индикации гемагглютинина вируса гриппа / С.В. Леонов, Ю.А.Закомырдип, Г.И.Э1 терт и др. // Вопр. вирусол. -1987. № 4. - С.498 502.

32. Белоусов В.И. Средства специфической профилактики и диагностики хдамидиоза, кампилобактерпоза, сальмонеллеза и лептоспироза животных. Дисс. докт. вет. наук. Москва, 1997 г.

33. Исатасва ИТИ. Сравнительная оценка лабораторных методов диагностики хламидиозного аборта овец. Автор, дис. канд. вет. наук. М., 1983, -17с.

34. Испы тание иммунных коныогатов / Шаткин А.А., Караваев Ю.Д., Панкратова В.! I. и др. // Ветеринария, 1974, - №6, - с. 43-45.

35. Калугина И.А. Культивровапие Chlamydia psitlaci клеток почки сайги:

36. Автор, дне. канд. биол. наук., М., - 1992, - 22с.

37. К).Д. Караваев, Л.П.Дьяконов. Ультраструктура возбудителя хламидий-ного аборта овец // Ветеринария, 1985, - Т5, - с. 34-36.

38. KapaBaei? Ю.Д. Хламидиозный аборт овец (этиология, диагностика, специфическая профилактика): Диссерт. док. вет. наук, М., -1987, - 416с.

39. Караваев Ю.Д., Калугина И.А., Дудар В.П. Адаптация хламидий штамма К-8 ВИЭВ к перевиваемой культуре клеток почки сайги. В кн. Культивирование клеток животных и человека. Тезис, докл., Пугциио, -1990, -с.90.

40. Караваев К).Д., Налетов П.П., Калугина И.А. // Ветеринарная газета -1 993, №26, - 4с.

41. Караваев К).Д. Активность диагностических положительных сывороток, полученных от различных видов животных, гипериммунизированпых возбудителем аборта овец// Бюлл. ВИЭВ. 1972. -№ 14. -С.60-61.

42. Караваев 10.Д. Агглютинирующая активность штаммов возбудителя, выделенных при массовых абортах овец // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - № 14. -С.62-63.

43. Караваев 10.Д., Дзиова 11.11., Крюков H.H. Сравнительное изучение чувствительности РСК и мпкроагпнотинации при диагностике энзоотического аборта овец// Бюлл. ВИЭВ. 1971. - II. - С.77-78.

44. Караваев 10.Д., Исатаева III.И., Налетов И.И. Сравнительное изучение РСК, PI НА и РМИФ при диагностике хламидиозного аборта овец // Бюлл. ВНИИ жепер. вет. 1986. -№62 -С. 14-18.

45. Каральник Б.В. Научные основы изготовления эритроцитарпых диагио-стикумов // Ж. Микробиол. 1977. - № 4. - С.29-34.

46. Ковалев В.П. Выделение и изучение некоторых биологических свойств возбудителя эпизоотического аборта овец в Таджикской ССР: Диссерт. канд. биол. наук, Душанбе, - 1970, -133с.

47. Кравченко Т.Ф. Серологическая диагностика при хламидиозе свиней // Матер. Всесоюзп. конфер. «Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профил. инф. болезней, общих для человека и животных» /-Львов, -1988, с. 114-1 15.

48. Кульбсрг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа, 1985. -287 с.

49. Курбапов И.А., Авзалов Ф.З. Иммуни тет при хламидийпых инфекциях // Ветеринария, 1984, - №4, с. 26-27.

50. Кэрстак Э. Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретация результатов // Бюл. ВОЗ, 1985, - №4, - с. 1 18-139.

51. Лаковская И.А. Определение параметров сублимационного консервирования и исследование их влияния па сохранение исходных биологических свойств объектов: Автор, дис. канд. техн. наук., М., 1971, -22 с.

52. Марепппкова С.С., Хабакпашева H.A., Мальцева H.H., Ефремова Е.Е. Получение и сравни тельная оценка пероксидазных конъюгатов на основе чистых ан тител и РаБ-фрагмента Jg // Ж.МЭИ, -1982, №9, - с.99-103.

53. Обухов ИЛ. Молекулярный механизм паразитизма хламидий и их внутриклеточное развитие // С/х биол. сер. биол. животных. 1997. - № 2. -С.86-98.

54. Поляков A.A., Купешев Г.III. Выживаемость возбудителя хлами-диозпого аборта овец и режимы дезинфекции./ Ветеринария, 1983,- 7,- С. 24-26.

55. Попович Г.Г. Оценка серологических методов диагностики хламидиозов // Микробиол. жури. 1981. - Т.43. - № 2. - С. 188-192.

56. PaBH.MOB А.З., Хазипов Н.Э. Меры профилактики и борьбы // Хламидиозы сельскохозяйственных животных, М., Колос, 1984, - с.205-215.

57. Реутова Ii.Г., Чевелев С.Ф., Архипов H.H. Иммуиоферментный метод в вирусологических исследованиях (обзор литературы) // Ветеринария." -1 976. № 3. - С. 53-55.

58. Рубцов I I.В., Пимепова Г.П., Кулаков В.I I. Метод статистической обработки результатов иммуиофермептного анализа // ЖМЭИ. 1985. - № 6. -С.44-48.

59. Савосппа U.C. Видоспецифический и группоспецифический антигены возбуди теля орпитоза. / Двтореф. докт. дисс,- М.- 1987.

60. ВЗ.Савосина II.С., Попова О.М. Обнаружение гуморальных антител к видос-цецп(|)пческому и группоспецифическому антигенам орнитоза в динамике инфекции // Вопросы вирусологии. 1979. - № 4. - С.422-427.

61. Сравнительное изучение РДСК и РИГА при диагностике хламидиозпого аборта овец / Амирбеков М., Ковалев В.Л., Степанова С.П. и др. // Меры борьбы и профил. с инфекц. ииваз. и пезар. болезнями с-х ж-х в Таджикистане, -1989, с.25-29.

62. Гарасшпин J1.A. Иммуноферментный анализ и его модификации в исследовании вирусных антигенов // Микробиол. журнал. 1986. — Т. 48, №4. С. 99-104.

63. Терских И.И. Орнигоз и другие хламидиальные инфекции. М., Медицина, 1979.

64. Хазипов П.З., Гаффаров Х.З., Хамадесв Р.Х., Шафикова Р.А., Равилов А.З. Хламидиозы круниого рогатого скота и меры борьбы с ним. Казань, Га г. книгоиздат, - 1980, - 100 с.

65. Хамадесв Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней (Эпизоотология, дирагностика, специфическая профилактика и меры борьбы: Диссерт. докт. вет. наук, Казань, -1990, - с.412.

66. Хамадесв Р.Х. Методы лабораторной диагностики // Хламидиозы сельскохозяйственных животных. Под ред. И.З.Хазипова и А.З. Равилова, -1()Р0, №2,-48с.

67. Хамадесв Р.Х. Усовершенствование способа устранения антикомгт-лсмептарности антигенов / Актуал. воир. вет. вирусол: 1 езисы докл. Все-союз. конф. Казань, 1980. - С. 141.

68. Хамадесв Р.Х., Хусапнов Ф.М., Евсгифеев В.В., Равилов А.З. Получение чритроцитарпого диагностикума для выявления ан тител при хламидиозе / Науч. основы техн. пром. произв. вет. биол. преп.: Тез.докл. V Всерос. конф. Щелково, 1996. - С. 153-154.

69. Хамадеев Р.Х., Боровик Р.В., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Получение гннериммунных сывороток для диагностики энзоотического аборта овец // Ветеринария. 1975. - № 10. - С.36-38.

70. Хамадесв Р.Х., Габидуллина Р.Г., Полуянов В. Изыскание оптимальных условий лиофилизации комплемеитсвязывающего антигена хламидий // Тег докл. респ. науч.-техн. конф. по пробл. вет. Казань, 1980. —С. 131132.

71. Хамадеев Р.Х., Боровик Р.В., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Способ получения антигена для серологической диагностики вирусных заболевании: Авторское свидетельство № 543259. 1976.

72. Хамадеев Р.Х. Хламидмозы рогатого скота и свиней: Автореф. дис. докт. нет. наук. Казань, 1991. -40с.

73. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение): Методические рекомендации / Под ред. Серова В.И, Краспопольского В.И., Делекторского В.В. и др. М.: Патент, 1996. -22 с.

74. Хламидиозы сельскохозяйственных животных / Хазипов Н.З., Гаф-фаров Х.З., Шафикова P.A. и др. // М., -1984.

75. Хусаииов Ф.М., Хамадеев Р.Х., Равилов А.З., Хисматуллина H.A. Использование иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза свнпей / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С. 67.

76. Червонский В.Н., Панова О.М. Антиген для РСК при орпитозе-нситл'оказе // Вопрос, вирусологии, 1959, №1, - с.68-71.

77. Шаткин A.A. Индикация антигенов гальпровий (хламидий) прямым иммунопероксидазпым методом //Ж. Микроб., эпидем. и иммунобиол. -1970. № 9. - С.74-78.

78. Rec. 1990, v. 126, №>6, p. 136-138. I 16. Aitken I.D., Clarkson M. Chlamydial abortion and Toxoplasmolis // Proc.

79. Antigenic diversity of ruminant Chlamidia psittaci strain demonstrated by the inderect microimmunonuorescence test with monoclonal antibodies / Salina S.J., Sourian A., Cuello P., et. al. // Veter. Microb. 1995, v. 43, №. 2-3, p.r *219.226.

80. Ari/.mendi P., Grimes I.E. Evaluation of latex agglutination for detection chlamydial antibody activity in psittacine bird sera by comparison with direct complement fixation fest.// J.veter.Diagnostic-invcstig. 1993, № 5, JST« 2, p. 277-279

81. A.Simple EIA to discriminate between Antibodies to EpS and to protein chlamydia //Osseawaarte T.M., Mauten 1 .M., I looft H.Tetal // Proc. of the Eur. Soc. lor chlamydia Res.,1 st. Meet, Bologna, Italy, May-30 june 1, 1988, p. 2.70.

82. Avrameas S. Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Use of the conjugates lor the detection of antigens and antibodies // Immunochem. -1969. V.6. P. 43-52.

83. Avrameas S. Enzyme immunoassays and related techniques: development and limitations // Curr. fop. Microbiol, and Immunol. 1983. - V. 104. - P. 9Ï-W.

84. Avrameas S., Ternynck T., Guesdon J.L. Coupling of enzymes to antibodies and antigens // Scand. J. Immunol. 1978. -V. 8, suppl., N 7. - P. 7-23.

85. Barbour U.M. Development of enzyme immunoassay for human placenta! lactogen using labelled antibodies // J. Immunol. Meth. 1976. - V. 1 1. - P.с. о15.23.

86. Bavoil P., Ohlin A., Schachter T. Rolle dissulfide bonding in onter membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis // In feet.Immun. 1984, v. 44, p. 479-485.

87. Beer T. Untersuchungen on und mit Komplementbinden antigenen des vims-aborts der Schafe // Zntbl. Veterin, 1 958, v. 5, p. 305-308.

88. Bidvvell D.E., Bartlett A., Voiler A. Enzyme immunoassays for viral diseases /7 .1. Infect. Dis. 1977. - V. 136, suppl. - P. 274-278.

89. Bioch N., Dialio J. Serological survey on Sheep and goats in four department of Niger// Rev. Elev. Med. Veter. Pays-Tropicaux 1991, v. 44, №. 4, p. 397-404.

90. Buonavoglia D., Montagua C., Giuratrabocohetti G., Prestera G. Serolagical survey of Clamydiosis in Sheep and Goals in Potenza province // Acta Medica Veterin 1994, v. 40,№.l, p.37-40.

91. Brunham R., Peeling R., Maclean T., Mc Dowel! T., Persson. K, Osser S. Postabortal C.trachomatis salpingitis: correlating rick with antigen-specifik serological responses and with neutralization // J.Inf. Dis. 1987, v. 155, p. 749-45S.

92. Caldwell I I.D., Kuo C.C., Kenny G.E. Antigenic analysis of Chlamydia by two-dimensional Immunoelectrophoresis II A.trachorua-LGV-specific antigen /V.l. Immunol. 1975, v. 115, p. 969.

93. Caldwell I I.D., Perry L.T. Neutralization of Chlamydia trachomatis infec-tivity with antibodies to the major outer membrane protein// Infect. Immun. 1982, v. 38, p. 745-754.

94. Caldwell I I.D., Judd R.C. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteina // Infect. Immunol.- 1982. N38. - P.960-968.

95. Campbell L.A., Chou-Chou Kuo, Grayston T.I. Characterization of the new Chlamydia agent TWAR, as a unigue organism by restriction endenuclease analysis and DNA DNA hybridization // J. Clin. Microbiol. 1987, v. 25, p. 1911-1916.

96. Catt K.J., Tregear G.W. Solid-phase radioimmunoassay in antibody-coated tubes // Science. 1967. - V. 158.-P. 1570-1572.

97. Cevenini R. Rumpianesi P., Donati M., Sarov I. A rapid immunoperoxidase assay for the detection of specific IgG antibodies to Chi. trachomatis // J. Clin. Pat hot. 1983. V.36. - №3. - P. 353-356.

98. Charan S., Gautam O.P. Applications of enzyme-linked immunosorbent assay in veterinary medicine: a bibliography// Vet. Res. Commun. 1984. - № 8. - P.255-267.

99. Collins A.R., Barron A.L. Demonstration of Group- and Species-specific antigens ofchlamydiai agents by gel diffusion // J. Infect. Dis. 1970. - V. 121.1. V" 1. P. 1-8.

100. Dane D.S., Clapp K.M. Complement fixing antibodies to the psittocosis-lymphagranulema group of virus in south Australian Sheep// Austr. Vet. J. I 956, v. 32, p. 91-93.

101. Development and evaluation of on indirect Elisa to detect antibodies to abortion strains of Chlamydia psittaci in sheep sera / Anderson J.E., Herring A.I. Jones E et. al. // Veter. Microb. 1995, v.43, №.1, p. 1-12.

102. Dhir S.P., Boatmon E.E. Location of polysaccharide on Chlamydia psittaci by silver-mcthenamine staining and electron! microscopy // T. Bacteriol. 1972, v.l I I. p.267-271.

103. Diagnostic value of the polymerase chain reaction for \Chlamydia detection as determined in a fol-lovv-up study / Claas H.Wagenvoort T., Niesters LI. el. al. //J. Clin. Microb. 1991, v.29, p.42-45.

104. Differentiation of abortion-inducing and intestinal strains of Chlamydia psittaci isolated from rumianats by microimmunofluorescence / Sourian A., Rou/Jc E., Bernard F. et. al. // Vet. Ree. 1993, v. 132, №.9, p.217-219.

105. Ehlers U., Paul I LL. Binding of viruses from crude plant extracts to gluta-raidehyde-treated plates for indirect ELISA //J. Virol. Meth. 1984. - V. 8,-3. P. 217-224.

106. Giroud P., Jadin J. Importance des micro-agglutinations pour le diagnostic serologigue des infections provogues par der clement virulent a la limite des rickettsie. CR // Soc. Biol. (Paris) 1954, v. 148, p. 1157-1158.

107. GrimesT. E. Latex agglutination: a rapid sérodiagnostic aid for Chlamidia psittaci infection in psittacine herds// 4 Intern symp. of Vet. labor diagn. Amsterdam 02-06. 06. 1986.

108. Grimes T.E., Arizmendi F. Elementary body agglutinations rapid clinical diagnostic aid for avain chlamydiosis// Proc. Ann. Conf. Ass. Avian Veter, Nashille, Aug.- 4 September 1993.

109. Harris T.W., Hunter A.R., Martin D.A. Experimental chlamydial pneumonia in pigs// Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1984, v. 7, p. 19-26.

110. Jensen A.E., Andersen A.A., Tappe T.P. el. al.// Avian Dis. 1993, v.37, №.1, p. I 70-1 76.

111. Immuno-dot blot as a rapid diagnostic method for detection of chlamydial in lection in coalax(phascolarctors cinerens) / Giles A. A., Ellis W.A.I 1., Lavin M.l;. el. al. // Veter.Rec. 1993, v.133, №.6, p. 136-141.

112. Intenstinal chlamydia psillaci-infection in cattle incidence and tecnical aspects of chlamydial isolation/witten brink M.M.,Bisping W.,Mrozek M. et. al. // Deutsche-Tierarztl.Wochenschr.1993, v. 100, №.5, p. 195-198.

113. Jenkin II.M.,Ross M.R.,Moulder T.W. Species specific antigens from cell walls of agents meningopneumonitis and feline pneumonitis// .(.Immunol. 1961, v.86, p. 123.

114. Jensen R. Enzootic abortion in ewes: in book: Diesease of Sheep. 1974, I'hiladelfia, p.46-51.

115. Jonhson F.W.A.,Clarkson M.F.,Spencer W.N. Direct isolation of the agent of enzootic abortion in ewes (Chlamydia psittaci) in cell cultures // Vet.Rec.1983, v.l 13, №.18, p.413-414.

116. Johnson F.W.A. Enteric infections in sheep associated with enzootic abortion (Chlamydia psittaci) // Irish.Veter.News. 1984, №.12, p. 10-15.

117. Jones M.F., Smith T.F., Hougluru A.T., Herrman T.E. Detection of chlamydia trachomatis in genital specimens by the chlamydiazyme test // J. Clin. Microbiol., 1984, v.20, p.465-467.

118. Judd M.A., Britten K.J.M. Tissue preparation for the demonstration of surface antigens by immunoperoxidase techniques// Ilistochem. J. 1982. - V. 14,- № 5.-P. 747-753.

119. Kahane S., Metzer E., Friedman M. Evidence that the novel microorganism " may belong to a new genus in the family Chlamydiaceae // FEMS Microbiol. fett. 1995, v.l26, p.203-208.

120. Kaltenboeck В.К., Konsoulas K.G., Storz. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1991, v.29, p. 1967-1975.

121. Kallenboeck В., Konsoulas K., Stonz T. Structures of and Allelic diversity and relationship among the major outer membrane protein (om A) genes of the Гош- chlamydial Species// Am.Soc.Microbiol. 1993, v.l 75, №.2, p.487-502.

122. KaulR., Roy K., Wenman W. Cloning expression and primary structure of a Chlamydia trachmatis binding protein // J.Bacteriol. 1987, v. 169, p.5 152-5 1 56.

123. Kawakami E., Kaji Т., Sugimura K., Omori Т., Matumoto M. Miyagawan-ella: psitacosis-lymphogranuloma group of viruses, isolation of a virus from feces of naturally infected sheep // Bull.Natl.Anim.Health 1958, №36.

124. Kuo Cho-Chou, ChiEmil Y. Ultrastructural study of Chlamydia trachomatis surface antigens by immunogold staining with monoclonal antibodies // Infect and Immun. 1987, v.55, №.5, p. 1324-1328.

125. Eayashi K., Rodolakis A., Buzoni G.D. Identification by western blots of virulence specific antigens of Chlamydia psittaci isolated from ewes // Vet.Res. 1993, v.24, №.1, p.55-65.

126. Eehtonen O.P., Viljanen M.K. Antigen attachment in EEISA//J. Immunol. Meth. 1980. - V. 34,-№1. - P. 61-70.180. levis V., Thacker.E., Engelman 11. Sudirect hemagglutination test for chlamydial antibodies // APPI. Microbiol. 1972, v.24, №.1, p.22-25.

127. Eiplet 11., Brand G. Die Complemenlbindungsreaklion in der Diagnostik dcr Ornithose (Psittacosis)// Dtsch. Med. Whschr. 1951, bd.80, №.3, p. 110

128. Lucher M., Storey C., Richmond S. Plasmid diversity within the genus Chlamydia //J. Gen. Microbiol. 1989, v.135, p.l 145-1151.

129. Ma bey D.C.W., Robertson T.N., Ward M.E. Detection of Chlamydia trachomatis by Enzyme-immunoassay in patent with trachoma // Lancet ii 1987, p. I 491-1492.

130. Markey B.K., McNulty M.S., Bums K. Chlamydia psittaci infection in sheep in Northern Ireland // Veter. Ree. 1993, v. 132, №. 15, p.389.

131. Markey B.K., McNulti M.S., Todd D. Comparison of serological tests for the diagnosis of chlamydia psittaci infection of sheep// Veterin. Microbiol. 1993, v.36, №3-4, p.233-252.

132. Martin P.K. A complement-fixation enzym-linked immunosorbent assay as on aid in the serological investigation of anzootic abortion in sheep // Res. Vet. Sei., 1995.v.58, №2, p.193-197.

133. Mitscherlich E. Die Bekämpfung der virusabortes der Schafe// Berl. Munh. Tierarztl. 1965, v.78, p.81-88.

134. Moreno-Iorez T., Tornovist M. Vaccination against acute respiratory enteric disease during calfood-Reports summaries // Intern, congr. dis. cattle, Pel-Aviv, 20-23. 10, 1980, p.388-393.

135. Moulder P., Match T., Kuo C., Schachter T., Storz T. Genus 1 Chlamydia Tones Rake and Stearns 1945, 55 AL, p.729-739. In N.R. Krieg and T. G. Holt (ed), Bergeys manual of systematic bacteriology 1984, v. 1. Williams and Wil-kins, Baltimore.

136. Nevjestie A. Primjena kvalitattivinog u kvantitativinog mikroagglutina-cionhotesta u dijagnostici enzootskod polacaaja avaca// J.Veter.(Tugoslaw), 1965. v. 14, №.3, p.347-358.

137. Newhall V., Batleigcr B., Jones R. Analisis of human serological response to proteins of (".trachomatis// Infect. Immun. 1982, v.38, p.l 181-1 189.

138. Nurminen M., Ecinonen M., Soikku P., Makela P. The genus spesific antigen of chlamydia resemblance to the lipopolysaccharide of enteric bacteria// Science 1983. v. 220, p. 1279-1281.

139. Ovine chlamydiosis: serological survey / Valente C., Gialetti L., Cuteri V., Battistacci I., Bonoflglio T. // Arch. Veterin. Italiano, 1993, v.44, №2, p.51-54.

140. Philips I I.L., Clarkson M.T. Cultura of sheep chlamydia in a sheep fibroblast cell culture// Res. Vet. Sci. 1992, v.53, № 2, p.267-268.

141. Pickett M.A., Everson T.S., Clarke J.N. Chlamydia psittaci ewe abortion agent: complete nucleotide seguence of the major outer membrane protein gene //1 I .MS Microbiol. Lett 1988, v. 55, p. 229-234.

142. Popovici V. Ovine virus abortion I. Incidence and diagnosis II.Epidemiology// Eucr. Inst. Cere. Vet. Bioprep, Past. 1962, v. 1, p. 339-347.

143. Preparation and use of monoclonal antibody to detect Chlamydia psittaci antigen in paraffinembedded tissue section / Bollo E., Biolatti B., Donn A. el.al. // Res. Vet. Sci., 1992, v. 53, p. 393-396.

144. Rapid genotyping of the Chlamydia trachomatis major outer membrane protein by the polymerase chain reaction / Sayada C., Denamur E., Orfila T. el.al. // EEMS Microbiol. Lett. 1991, v.83, p.73-78.

145. Reeve P., Tavcrne T. Some prorerties of the complement-fixing antigens of the agents of trachoma and inclusion blennorrhea and the relationship of the antigens to developmental cycle//J. Gen. Microbiol. 1962, v.27, p.501-508.

146. Riera M.C., Barron A.I. Reaction with hemagglutinin of psittacosis agent in gel diffusion // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970. - V.135. - №1. - P.594-597.

147. Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E. "Homogeneous" enzyme-immunoassay: a new immunochemical technique// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - V. 47. - P. 846-851.

148. Salinas T., Caro M.R., Cuello F. Comparison of different serological methods for the determination of antibodies to Chlamydia psittaci in pigeon sera // J. Vet. Med. Series B. 1993, v.40, №4, p.239-244.

149. Salinas T., Sourian A., Cuello F., Rodolakis A. Anticenic diversity of ruminant Chlamydia psittaci strains demonstrated by the inderect microimmuno-lluorescence test with monoclonal antibodies // Vetcr. Microbiol. 1995, v.43, №2/3, p.219-226.

150. Serological survey of Chlamydia psittaci in cows and pigs in 1984 in Japan / Ogata !'., Nagano 1., HasegawaT. et. al. // T. lap. Vet. Med. Ass. 1988, v.42, №1 1, p.799-802.

151. Serological assesment of chlamidial infection in the Koala by a slide EIA technique / IJeno II., Mizino S., Takashima J. et. al. // Austr. Vet. J., 1991, v.68, №. 12, p.393-396.

152. Spears P., Storz T. Biotyp of C.psittaci based of inclusion morphology and responce to diethylaminoethil-dextran and cycloheximide // Infect. Immun. 1979, v.24, p.224-232.

153. I'amura A., Monire G. Preparation and chemical composition of the cell membranes of developmental reticulate forms of meningopneumonitis organisms //.I. Bact. 1967, v.94, p. 1 184-1 188.

154. Taylor-Robinson D., Thomas B.T. Chlamydial diagnosis in the context of epidemiology // Epidemiology 1980, v.30, p. 14.

155. Taylor-Robinson D., Thomas 13.T., Osborne M.F. Evalution enzyme immu-noassay (ehlamydiazym) for detection Chlamydia trachomatis in genital tract specimes //J. Clin. Pathol. 1987, v.40, p. 194-196.

156. Thiele D., Karo M., Krauss 11. Monoclonal antibody based capture Elisa / Flila for the detection of Chlamydia psittaci in veterinary clinical specimens // Zbl. Bacter. 1992, v.277, №1, p.39-48.

157. I. The use of fliiorescein-conjugated monoclonal antibodies cell culture and transmission electromicroscopy to detect Chlamydia psittaci / Biolatti T.,

158. Dagnoll Ci.T.R., Bollo E. el. al. //J. Compar. Pathol. 1991, v. 105, №.1, p. 1726.

159. Vanrompay D., Ducatelle R., Halsebrouck P. Diagnosis of avian chlamy-diosis: speei (Icily of the modified Gimenez staining on smears and comparison of (he sensitivity Chlamydia psittaci // J. Vet. Med. / 1992, v.39, №2, p. 1051 12.

160. Varzques-Cisneros C., Wilsmore A. P., Bollo E. Experimental infections of pregmant sows with ovine Chlamydia psittaci strains // Veter. Microb. 1994, \ .42. №.4, p.383-387.

161. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. Enzyme immunoassays in diagnostic medicine. Theory and practice // Bull. World. Health Organ. 1976. - V. 53. -N 1. P. 55-65.

162. Wang S.P., Gtrayston J.T. Immunologic relationchip between genital TRIG, lymphogranuloma venerium and related organisms in a new microtiter indirect immunofluorescence test//Am. J. Ophtalmol 1970, v.70, p.367-374.

163. Wang S.P., Grayston J.T. Classification of trachoma virus strains by protection of mice from toxic death // J. Immunol. 1963, v.90, p.849-856.

164. NN. «IIх-.х!.)^''1,'.' '-'I

165. НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА ОВЕЦ1. ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ

166. ТУ 938800-004 ( на опытную серию в количестве 1000 наборов) Вводятся впервые

167. Срок введения с " 199 5 г.

168. Срок действия с " "199? г.1. СОГЛАСОВАНО:

169. Директор Всероссийского • государственного научно-исследовательского инстистандарти-рикации вепре парат о в1. НИН1995 г.

170. Директор Всероссийского научно-исследовательскогоа экспериментальной1. Г.Ф.Коромыслов199X7.

171. Продолжение' на следующем листе -130

172. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

173. ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ по применению набора для иммуно-ферментной диагностики хламидиоза овец (в порядке широкого производственного опыта 1997-1999 гг.)1. Общие сведения

174. Набор для иммуноферментной диагностики хламидиоза- овец применяют при первичной постановке диагноза и с целью установления' степени распространения инфекции в отаре.

175. При первичной постановш диагноза исследованию подвергают парные сыворотки., взятые в начале заболевания и спустя 10-15 суток.

176. Сыворотки исследуют в разведении 1:200, парные сыворотки в разведениях 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.

177. Набор рассчитан на исследование 350 проб сывороток, в разведении 1:200 или 84 парных сывороток в разведениях 1:200, .1:400, 1:800, 1:1600.

178. Набор содержит 12 компонентов, четырех 96-луночных полистироловых палелей для постановки реакции ИФА, упакованных в одну картонную коробку: