Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота

Банзузи Бадиата Арно Сезар

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота"

БАНЗУЗИ БАДИАТА АРНО СЕЗАР

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 / окI- 2011

Казань-2011

4858106

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарией медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Равилов Рустам Хаметович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Хазипов Наримап Залилович

доктор ветеринарных наук, профессор Гаффаров Харис Зарипович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится «Л » i-bWNp/; 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.01 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» (420029, г, Казань, ул. Сибирский тракт, 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» (420029, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 35).

Автореферат разослан «04 » ПУ:-г ^г л 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.в.н., профессор

А.К. Галиуллин

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хламидийные инфекции широко распространены среди всех видов млекопитающих животных и птиц. Заболевание наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди домашних и диких животных, а также птиц представляет постоянную угрозу спарадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (Шафикова P.A., 1991; Хамадеев Р.Х. с соавт., 1997; Равилов Р.Х. , 1999; Равилов А.З. с соавт., 2000 и др.).

В 1956 году Schoop G. и Kauker Б. в ФРГ впервые серологическим методом подтвердили, что причиной аборта у коров являются хламидии. В настоящее время хламидиоз у этого вида животных достаточно подробно изучен. Большой вклад в изучение хламидийных инфекций у коров внесли ученые Казанской школы хламидиологов. Большое внимание исследователи уделяли совершенствованию методов лабораторной диагностики (Гаффаров Х.З., 1969; Хамадеев Р.Х., 1975, 1984; Равилов А.З. с соавт., 2000 и др.).

Лабораторная диагностика хламидиоза включает обнаружение возбудителя в органах и тканях путем световой и люминесцентной микроскопии, выделение возбудителя на куриных эмбрионах и культурах клеток, выявление в сыворотках крови, больных и переболевших животных комплемент связывающих антител. Эти тест-системы имеют целый ряд недостатков: длительность получения ответа, низкая чувствительность и специфичность, субъективность оценки результатов исследования.

Одно из важных мест в лабораторной диагностике хламидиозов занимают методы выявления в сыворотках крови инфицированных животных специфических антител. В настоящее время вопросы серологической диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота остаются открытыми.

Наиболее широко в ветеринарной практике применяется реакция связывания комплемента. Однако согласно данным J. Schachter et al. (1975) при помощи РСК удается выявить только 50% больных животных. Впервые РСК была использована для обнаружения хламидийных антител в 1935 году, а в современных ветеринарных лабораториях до сих пор используют наборы диагности-кумов, технология изготовления которых была разработаны в 70-е годы прошлого столетия.

В последние годы для индикации и идентификации хламидий предложены современные иммунохимические и молекулярно-генетические методы, такие как: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и др. (Engvall Е., Perlmann Р., 1971; Van Zaane D., Ijzerman J., 1984; Lema F. et al., 1986; Шафикова, P.A. с соавт., 1987; Белоусов В.И. с соавт., 1995; Гришаев М.П. с соавт, 1998; Сухова Л.П. с соавт., 1998; Обухов И.Л., Яковенко М.В., 2000; Равилов, Р.Х. с соавт., 2000 и др.). Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, возможностью одновременно исследовать большое число

проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и межштаммовые различия хламидий. До настоящего времени в Российской Федерации не выпускаются наборы для иммуноферментной индикации хламидийных антител у крупного рогатого скота.

Исходя из этого, перспективным является усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций у крупного рогатого скота с учетом достижений современной биотехнологии.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - усовершенствовать средства лабораторной диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан;

- провести эпизоотологическое обследование некоторых неблагополучных в отношении хламидийных инфекций сельхозпредприятий Республик Татарстан, Башкортостан и Марий Эл;

- разработать тест-систему для серологической диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота иммуноферментным методом;

- провести сравнительные серологические исследования неблагополучного по хламидиозу крупного рогатого скота хозяйств с использованием РСК и ИФА.

Научная новнзна. Впервые проведен комплексный анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан.

Разработан новый метод получения антигена из очищенной культуры хламидий.

Впервые сконструирована и апробирована в лабораторных и производственных условиях иммуноферментная тест-система для индикации в сыворотках крови крупного рогатого скот противохламидийных антител.

С использованием разработанного набора диагностикумов проведен серологический скрининг спонтанно зараженных хламидиями крупного рогатого скота.

Практическая ценность. Результаты исследований позволили установить эпизоотическую ситуацию по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан.

Проведено эпизоотологическое обследование некоторых неблагополучных в отношении хламидийных инфекций сельхозпредприятий Республик Татарстан, Башкортостан и Марий Эл, разработаны рекомендации по их оздоровлению.

Разработана иммуноферментная тест-система для ретроспективной диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативно-технические документы; "Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота (в порядке опыта)", утвержденное ГУВ Кабинета министров РТ 18 мая 2011 г.; "Временную инструкцию

по изготовлению и контролю иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота", утвержденную ректором КГАВМ 18 мая 2011 г.; "Технические условия на опытную партию иммуно-ферментных тест-систем для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота", утвержденные ректором КГАВМ 18 мая 2011 г.

Пути реализации результатов исследования. Полученные результаты исследований могут быть использованы для совершенствования диагностических и противоэпизоотических мероприятий при хламидиозе крупного рогатого скота, а также при организации учебно-педагогического процесса в ВУЗах при подготовке и повышении квалификации ветеринарных специалистов.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведены при личном участии автора. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГБОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (2009 и 2010 гг.);

- Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина домашних животных" (Казань, 2009 г.);

- Научно-практической конференции по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2011 г.).

- Всероссийских научно-практических конференциях "Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития" (Саратов, 2009 и 2011 гг.);

- XVII-XIX Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2009-2011 гг.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 в изданиях рекомендованных ВАК для кандидатских диссертаций.

Основные положения диссертации, выдвигаемые для зашиты:

- хламидиоз крупного рогатого скота имеет существенное распространение на территории Республики Татарстан;

- общепринятые методы диагностики хламидиоза не позволяют в полной мере контролировать эпизоотическую ситуацию по хламидийным инфекциям;

- разработанная иммуноферментная тест-система более эффективна по сравнению с РСК при выявлении хламидийных антител у крупного рогатого скота.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2003", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 242 источника, в том числе 140 иностранных и 4 ссылки на сайты Internet). Диссертация

иллюстрирована 13 таблицами и 3 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования по изучению хламидиоза крупного рогатого скота проводились в 2008-2011 годы на кафедре эпизоотологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» и Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционных заболеваний Министерства здравоохранения Республики Татарстан. На отдельных этапах исследования проводились совместно с к.б.н. Герасимовым В.В.

Эпизоотологическое обследование проводилось среди поголовья крупного рогатого скота в некоторых хозяйствах республик Татарстан, Марий Эл и Башкортостан. Для оценки эпизоотической ситуации учитывали: благополучие по инфекционным болезням; условия комплектования поголовья, кормления и содержания животных; возможные источники хламидийной инфекции и пути ее передачи; результаты лабораторных исследований патологического материала и сывороток крови животных. При этом использовали ветеринарную учетную документацию районных ветеринарных лабораторий. Для уточнения предварительного диагноза на хламидиоз, проводили лабораторные исследования.

Для анализа встречаемости хламидиоза у крупного рогатого скота нами были использованы данные о результатах исследования клинических и патологических материалов в лаборатории вирусологии ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория», а также в районных ветеринарных лабораториях муниципальных образований Республики Татарстан (серологическими и вирусологическими методами) в период 2001-10 гг.

Во время нашей работы было исследовано параллельно в РСК и ИФА 1153 пробы сывороток крови крупного рогатого скота, подозрительного по заболеванию хламидиозом. Пробы были получены из разных районов и хозяйств республик Татарстан, Марий Эл и Башкортостан. Из сельхозпредприятий, где проводилось эпизоотологическое обследование, были получены 55 мазков-отпечатков (25 со слизистой оболочки влагалища коров и 30 с конъюнктивы телят).

При получении контрольных положительных и отрицательных сывороток для иммуноферментной тест-системы в серологических тестах было тестировано 586 проб сывороток. В серологических тестах испытывали сыворотки подозрительных по заболеванию крупного рогатого скота, а также различные варианты антигенов, которые были получены при конструировании иммуноферментной тест системы для диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота, положительные и отрицательные контрольные сыворотки.

РСК проводили общепринятыми методами, согласно "Методическим указаниям по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных", утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 30.06.99 г. (№ 13-7-2/643). ИФА выполняли по непрямому методу. В качестве коньюгата при выполнении анализа использовали белок А, меченые пероксидазой хрена (НПО

"Пептоскрин-2", г.Электросталь). Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра Multiskan, измеряя оптическую плотность (ОП) смеси реагентов в лунках при длине волны 450 нм. «0» (бланк) устанавливали по воздуху.

В качестве биологического материала для получения антигена использовали желточные оболочки павших куриных эмбрионов, которые были инфицированы штаммом "Ростиново-70". Очищенную суспензию обрабатывали ультразвуком и детергентами в различных сочетаниях. Всего было испытано 5 вариантов обработки антигена хламидий: обработка ультразвуковым дезинтегратором (УЗДИ); обработка УЗДИ и 0,1%-ным раствором додецилсульфата натрия; обработка УЗДИ и 1%-ным раствором дезоксихолата натрия; обработка УЗДИ и 1%-ным раствором твина-80; обработка УЗДИ и 1%-ным раствором тритона-ХЮО. Готовый антиген стандартизировали по содержанию белка на спектрофотометре СФ-46.

Специфическую хламидийную сыворотку получали на клинически здоровых серонегативных быках-донорах. Контрольные (отрицательные) сыворотки получали от серонегативных быков-доноров.

Результаты исследований подвергали математической обработке на персональном компьютере с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2003. Цифровые данные подвергали статистическому анализу с определением средних величин и их ошибок непосредственным и разностным методом по Стьюденту.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ЗЛ. Степень распространения хламидийных инфекций среди поголовья крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан и некоторых

сельхозпредприятиях Республик Башкортостан и Марий Эл ЗЛЛ. Анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан

Для анализа эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан нами были использованы данные о результаты исследований клинических и патологических материалов в лаборатории вирусологии ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория», а также в районных ветеринарных лабораториях муниципальных образований Республики Татарстан (серологическими и вирусологическими методами) с 2001 по 2010 гг.

За последние 10 лет в ветеринарных лабораториях Республики Татарстан за последние 10 лет серологическим исследованиям на хламидиоз в районных ветеринарных лабораториях в среднем за год было подвергнуто более 30 ты с. голов крупного рогатого скота, из них реагировало с хламидийным антигеном в РСК в среднем 0,98% исследуемых животных, что в цифровом обозначении составляет 294,5 проб в год.

При анализе динамики количества исследованных проб и позитивных результатов серологических исследований сывороток крови крупного рогатого скота с хламидийным антигеном установлено, что наибольшее число исследований в ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» проводится во втором и четвертом кварталах года.

В разрезе районов данные о результатах серологических исследований крупного рогатого скота в период 2007-10 гг. свидетельствуют о том, что наибольшее число исследований проведено в лаборатории города Набережные Челны и Балтасинской ветеринарной лаборатории, соответственно 14493 и 11671 проба, меньше всего исследований проведено в Аксубаевской, Актаныш-ской и Буинской ветеринарных лабораториях, соответственно 6, 13 и 20 проб за 4 года, наибольшее количество положительных результатов РСК также получено в лаборатории города Набережные Челны и Балтасинской ветеринарной лаборатории, соответственно 240 (1,66%) и 439 (3,76%) проб. Кроме того, при исследовании 624 проб в Арской районной ветеринарной лаборатории было получено 120 положительных результатов, что составило 18,75%. В 23 районах республики за последние 4 года не было выявлено ни одного реагирующего животного, несмотря на то, что в хозяйствах этих районов ветеринарные специалисты регулярно регистрируют у крупного рогатого скота (коров и телят) клинические признаки, характерные для хламидийных инфекций (аборты, мер-творождения, бесплодие, эндометриты, конъюнктивиты, артриты и другие).

За последние 10 лет в ветеринарных лабораториях Республики Татарстан не получено не одного позитивного результата световой и люминесцентной микроскопии, а также ни разу не удалось выделить хламидии на лабораторных моделях.

3.1.2. Эпизоотологическое обследование некоторых сельхозпредприятий республик Татарстан, Башкирия и Марий Эл в отношении хламидийных инфекций крупного рогатого скота

3.1.2.1. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы АФ «Камскоустьинская» (подразделение «Сюкеевское»)

В хозяйстве в результате лабораторного обследования всего поголовья быков было выявлены животные инфицированные возбудителем хламидиоза (Chlamidia psittaci). Дальнейшему распространению инфекции способствовали абортировавшие коровы и телята, рожденные от больных коров, которые выделяли возбудитель во внешнюю среду с различными истечениями из половых органов, абортированными плодами, последом, а также с мочой, молоком и фекалиями. Передача возбудителя от одного животного к другому происходило при искусственном осеменении коров и телок, аэрогенным и контактным путями. Факторами передачи возбудителя инфекции явились инфицированные и загрязненные выделениями больных животных корма, вода, предметы ухода.

Проведенные в 2007 году противоэпизоотические мероприятия оказались малоэффективными, болезнь в хозяйстве не ликвидирована, и на сегодняшний день имеются больные животные. Хозяйству нанесен большой экономический ущерб, который складывается из снижения продуктивности, недополучения телят, снижения прироста, из затрат на лечение и мероприятии направленных на ликвидацию болезни.

Многие ветеринарно-санитарные мероприятия не соблюдаются, мероприятия направленные на обезвреживание молока не отвечает требованиям за-

конодательства. Молоко от абортировавших коров с клиническои формой мастита из непораженных четвертей подлежит обязательному кипячению в течение 30 минут и может быть использовано в хозяйстве только для кормления животных. Молоко из пораженных четвертей подлежит уничтожению.

В хозяйстве необходимо огородить территорию комплекса, построить санпропускник, площадку для вскрытия, специальные карантинные помещения и изоляторы.

Для ликвидации заболевания рекомендуется использовать специфическую иммунопрофилактику в сочетании с антибиотикопрофилактикой.

Всех животных подозрительных по заболеванию хламидиозом подвергать обязательному лабораторному исследованию бактериологическими и серологическими методами.

Противоэпизоотические мероприятия проводить согласно соответствующей инструкции.

3.1.2.2. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы

ЗАО "Марийское"

В результате проведенного эпизоотологического обследования получены следующие данные: у коров нередко регистрируют эндометриты, перегулы и бесплодие; состояние телят 20-дневного возраста удовлетворительное, клинически у некоторых телят регистрируются конъюнктивиты. Однако установлено, что телята имеют упитанность и массу ниже нормы для галштинской породы в этом возрасте. Кроме того, телят первых дней жизни содержат в одном помещении и в непосредственной близости от глубокостельных и отелившихся коров родильного отделения. Состояние и упитанность 3-х месячных телят имеет те же параметры, что и телят первых недель жизни. У них регистрируют конъюнктивиты и заболевания органов дыхания. Условия содержания этой группы телят можно оценить как удовлетворительное или даже хорошее. Среди телят старше 3 месяцев регистрируются симптомы респираторной инфекции. ^В содержании телят установлено нарушение принципа "все пусто - все занято".

3.1.2.3. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы

ООО СХП «Агрогалс» (Республика Башкортостан)

В хозяйстве в результате лабораторного обследования всего поголовья быков было выявлено инфицирование животных возбудителем хламидиоза. Дальнейшему распространению инфекции способствовали выделение возбудителя во внешнюю среду с различными истечениями из половых органов, абортированными плодами, последом, а также с мочой, молоком и фекалиями. Передача возбудителя от одного животного к другому происходила алиментарным, аэрогенным и контактным путями. Факторами передачи возбудителя инфекции явились инфицированные и загрязненные выделениями больных животных корма, вода, предметы ухода. Противоэпизоотические мероприятия в хозяйстве не проводились.

3.2. Выявление комплементсвязывающих антител и антигена хламидий в клинических материалах

На предварительных этапах исследований нами были проведены лабораторные исследования 1153 проб сывороток крови подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота. Наибольшее число проб сыворотки крови для проведения исследований были получено в Республике Татарстана из ООО Агрофирма «Сарсазы» Чистопольского района (270 проб); из ООО им. Ти-мерязева Балтасинского района (197 проб); из ПК «Камский» Тукаевского района (112 проб) и из ОАО "КВ-Агро" ж/к Юхмачи Апькеевского района (103 проб). Из ближайших Республик (Марий Эл и Башкортостан) было получено соответственно 40 и 72 пробы сыворотки крови крупного рогатого скота от животных подозрительных по заболеванию хламидиозом. При этом в РСК реагировали только 1,4% подозрительных по заболеванию хламидиозом животных.

В хозяйствах, где удалось выявить серопозитивных животных (ООО Агрофирма «Сарсазы» Чистопольского района РТ, ООО им. Тимерязево Балтасинского района РТ и ООО «Нур-Агро» Ютазинского района РТ), как правило, регистрировали острое течение хламидийной инфекции в виде абортов и мер-творождений у коров. Процент реагирующих в РСК животных в этих хозяйствах варьировал в пределах 1,1-5,1. В остальных сельхозпредприятиях, где регистрировали преимущественно хронические формы патологии (эндометриты у коров, артриты и конъюнктивиты у телят) реагирующих в РСК животных выявить не удалось.

Анализ результатов исследований сывороток крови подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота в РСК дает нам основание утверждать, что хламидийная инфекция имеет определенное распространение среди поголовья этого вида животных в Республике Татарстан, однако указанный метод исследования не всегда дает полную картину распространения инфекции на восприимчивом поголовье.

Все 1153 сыворотки в дальнейшем были испытаны в ИФА при помощи разработанной нами тест-системы, результаты этих исследований представлены в следующих главах диссертации.

Кроме сывороток крови, из трех хозяйств: ООО АФ «Камско-Устьинская» Камско-Устьинского района РТ, ЗАО «Марийское» Медведевского района РМЭ и ООО СХП «Агрогалс» Аургазинского района РБ, где мы проводили эпизоотоло-гическое обследование, были получены мазки-отпечатки (со слизистой влагалища коров и конъюнктивы телят). Во всех обследуемых хозяйствах имеются инфицированные хламидиями животные. Их доля среди исследованных колеблется в пределах от 30 до 60%, среди телят эти цифры составляю 30-40%, среди коров 4060%. Всего исследованию в РИФ было подвергнуто 55 мазков-отпечатков и получено 23 или 41,8% положительных результатов.

Все это позволяет констатировать наличие хламидийной инфекции среди крупного рогатого скота в указанных хозяйствах. Необходимо указать, что сыворотки крови, полученные из этих сельхозпредприятий в РСК со специфическим хламидийным антигеном не реагировали.

3.3. Разработка иммуноферментиой тест-системы для выявления хлами-

дийных антител

3.3.1. Подбор метода получения хламидийного антигена

При выполнении твердофазного варианта ИФА по выявлению антител важным моментом, предшествующим самой реакции, является подготовка антигена. Для сравнения в ИФА нами были получены и испытаны лизатные антигены хламидий.

Очищенную суспензию хламидий обрабатывали детергентами: 0,1%-ным раствором додецилсульфата натрия, 1%-ным раствором дезоксихолата натрия, 1%-ным раствором твина-80 и 1%-ным раствором тритона-ХЮО, а также ультразвуком в различных сочетаниях. Всего было испытано 5 вариантов обработки антигена хламидий. От детергентов и обломков клеток освобождались 3-х кратным переосаждением суспензии насыщенным раствором сульфата аммония. Надосадок, содержащий антиген СЬ. рэкгаа, служил исходным материалом для дальнейших процедур очистки, которую проводили путем ультрацентрифугирования при ЮООООя в течение 6,5 часов в градиенте плотности сахарозны 5-55% (\у/у) с шагом 5%. Было получено по 11 фракций каждого варианта обработки хламидийной биомассы, из которых были изготовлены антигены для испытания в ИФА с положительными и отрицательными сыворотками крупного рогатого скота.

Максимальный коэффициент специфичности показал антиген, который подвергался обработке ультразвуком и 0,1%-ным раствором дезоксихолата натрия из фракции собранной в 35%-ной сахарозе ступенчатого градиента. Коэффициент специфичности реакции иммуноферментного анализа при использовании этого антигена в модельных опытах составил 10,2.

Полученный специфический антиген не реагировал с геторологичными сыворотками, содержащими антитела против бруцелл, микоплазм и вируса чумы плотоядных. При проверке полученного в идентичных условиях контрольного антигена из интактных желточных мешков куриных эмбрионов было установлено, что положительные и отрицательные контрольные сыворотки с ним не реагируют.

3.3.2. Конструирование иммуноферментиой тест-системы для выявления хламидийных антител.

При разработке тест-системы за основу был взят непрямой метод постановки ИФА - наиболее перспективный при разработке тест-систем для выявления антител. Конструирование иммуноферментиой тест-системы включало несколько этапов: подбор режима "посадки" антигена на полистироловую основу; отбор контрольных положительных и отрицательных сывороток; титрование конъюгата; подбор регламента проведения реакции; определение критериев оценки результатов тестирования, определение срока годности тест-системы.

3.3.2.1. Подбор режима "посадки" антигена

В процессе подбор режима посадки антиген, в модельных опытах нами были испытаны концентрации антигена от 1 до 12 мкг/мл для определении оп-

тимальной концентрации белка в антигене. Наименьшая концентрация белка в антигене, при которой удается достичь наивысшей специфичности тест-системы, составляет 6 мкг/мл.

При подборе режима посадки антигене на полистироловую основу мы испытывали 3-, 6-, 12-, 24-, 48- и 72-часовые режимы экспозиции. Испытывали также температурный режим при каждом режиме посадки антигена. Оптимальный режим посадки антигена, при которой удается достичь наивысшего коэффициента специфичности тест-системы, является 24 часа при температуре 4°С.

3.3.2.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток

Контрольные сыворотки получали от животных доноров. Обработку сывороток проводили следующим образом: кровь получали в закрытой системе от зафиксированных животных. Отстоявшуюся сыворотку сливали в центрифужные стаканы и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут. «Осветленную» сыворотку отсасывали в бутыль, консервировали азидом натрия в конечной концентрации 0,1%.

Через сутки консервированную сыворотку исследовали в РСК и проверяли на стерильность. При исследовании в РСК положительные контрольные сыворотки должны были реагировать со специфическим хламидийным антигеном, а отрицательные контрольные сыворотки не должны.

3.3.2.3. Титрование конъюгата

Титр конъюгата был определен путем "шахматного" титрования специфического антигена и положительных хламидийных сывороток.

В результате нами установлено, что для исследования сывороток крупного рогатого скота к 10 мкл базового раствора конъюгата (содержимое ампулы с леофильновысушенным препаратом растворяли в 100 мкл дистиллированной воды) необходимо добавлять 1 мл раствора ФСБР-Т.

В модельных опытах сначала подбирали регламент экспозиции сывороток (при одинаковой экспозиции конъюгата), а затем наоборот.

При анализе результатов этих опытов учитывали необходимость максимального сокращения времени исследования проб, а также то, что чрезмерное увеличение времени инкубации планшете с реагентами в термостате часто приводит к снижению коэффициента специфичности тест-системы. Оптимальным временем экспозиции сывороток оказалась инкубация планшета в термостате в течение 60 минут, конъюгата - 40 минут.

3.3.2.4. Подбор регламента проведения реакции

Для постановки ИФА мы подбирали регламент проведения исследования, при этом мы ориентировались на регламенты выполнения ИФА, которые используют в медицинских тест-системах для диагностики хламидиоза.

Сенсибилизированный антигеном планшет один раз предварительно промывали раствором (ФСБР-Т), заливали в каждую лунку по 400 мкл. По истечении 5 мин раствор аккуратно удаляли в сосуд с дезинфицирующим раствором. По окончании промывки тщательно удаляли влагу из лунок, постукивая перевернутыми стрипами по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

При этом старались допускать высыхания лунок между отдельными операциями при постановке реакции.

Контрольные образцы разводили в растворе ФСБР-Т 1:100 и вносили по 100 мкл в лунку. Контрольный образец в рабочем разведении вносили в 2 лунки: контрольную положительную сыворотку крупного рогатого скота (К+) и контрольную отрицательную сыворотку крупного рогатого скота (К-), Одну лунку оставляли без добавления сыворотки для контроля конъюгата. Планшет помещали в термостате, инкубировали 60 минут при 37°С. Лунки 5 раза промывали раствором ФСБР-Т, заливая в каждую лунку по 400 мкл.

В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, после чего планшет или стрипы помещали в термостат и инкубировали 60 минут при температуре 37°С. Лунки 5 раз промывали раствором ФСБР-Т, заливая в каждую лунку по 400 мкл. Остатки содержимого лунок удаляли легким постукиванием по 4-5 слоям фильтровальной бумаги.

В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл хромогена и инкубировали при комнатной температуре в темном месте в течение 30 минут. Затем реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл стоп-реагента и проводили учет результатов ИФА.

3.3.2.5. Определение критериев оценки результатов тестирования

Результаты ИФА регистрировали с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм.

В большинстве медицинских иммуноферментных тест-систем для оценки результатов реакции используют понятие «критическая оптическая плотность» или ОПкрит, которую вычисляют по формуле: ОПкриг- ОЦр.к- + 0,2, где ОПср.к. среднее значение оптической плотности цветной реакции иммуноферментного анализа в лунках с отрицательными контрольными сыворотками.

Чтобы проверить насколько данная формула подходит для нашей тест-системы все имеющиеся в нашем распоряжении 1153 сыворотки, были испытаны в ИФА и результаты оптической плотности цветных реакции в лунках с этими сыворотками были разделены на группы: ОП < 0,2 o.e., ОП=Ю,2-0,4, ОП=0,4-0,6, ОП=0,6-0,8 и ОП>0,8. ОП вычисленное по выше-представленной формуле, составило в опыте 0,386 o.e.

Используя данную формулу, мы установили, что 89,4% (689 проб) из числа сывороток, которые считаются «отрицательными» (771 проба), имели ОП менее 0,2 o.e. При этом, 64,1% (245 проб) из числа сывороток, которые считаются «положительными» (382 пробы), имели ОП выше ОП ^ и имели ОП в диапазоне 0,4-0,6 o.e.; 29,3% (112 проб) - имели ОП в диапазоне 0,6-0,8 o.e.;

6,6% (25 проб) - имели ОП более 0,8 o.e.

Таким образом, мы установили, что в разработанной нами иммунофер-ментной тест-системе положительными считаются образцы исследуемых сывороток ОП которых превышает критическое значение (ОПкр„т.), которое рассчитывается по формуле: ОП^ ОПср.к- + 0,2, где ОП^к. - среднее арифметическое оптической плотности цветной реакции в лунках с отрицательными контролями.

Антиген адсорбированный на полистироловых планшетах должен реагировать с позитивными сыворотками крупного рогатого скота (в разведении 1:100) и не реагировать с отрицательными, т.е. результат подлежит учету, если среднее значение ОП контрольной отрицательной сыворотки (ОПср. К-) не превышает 0,2 оптические единицы (o.e.), а среднее значение ОП контрольной положительной сыворотки (ОПсрК+) не менее 0,8 o.e.

Используя эти критерии оценки реакции, мы установили, что результаты ИФА в разработанной нами тест-системе можно также регистрировать визуально по интенсивности окрашивания цветной реакции ферментзависимой метки с субстратом. Положительными считаются образцы, интенсивность окрашивания которых в лунках с исследуемой сывороткой отчетливо отличаются от таковой в отрицательном контроле. Интенсивность окрашивания положительного контроля при этом должна быть достаточно выраженной.

3.3.2.6. Определение срока годности тест-системы.

Для определения срока годности тест-системы несколько коробок опытной партии диагностикума было помещено на хранение. Через 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяцев упаковку вскрывали и проводили анализ с положительными и отрицательными контрольными сыворотками.

Исследованиями установлено, что тест-система сохраняет активность в течение 24 месяцев со дня изготовления. Таким образом, срок годности диагностикума определен в 12 месяцев при соблюдении требований к применению и хранению. Датой изготовления тест-системы считают наиболее раннюю дату изготовления одного из компонентов диагностикума.

Таким образом, в результате исследований представленных в этой главе нами разработан набор для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота в ИФА путем выявления антител, включающий: иммуносорбент - планшет для иммунологических реакций, сорбированный специфическим хламидийным антигеном; положительные контрольные образцы - сывороток крови крупного рогатого скота, содержащие хламидийные антитела; отрицательные контрольные образцы - сывороток крови крупного рогатого скот, не содержащие хламидийные антитела; конъюгат - белок А, меченный пероксидазой хрена; фосфат-но-солевой буферной раствор с твином; цитратный буферный раствор с перекисью водорода; хромоген - тетраметилбензидин (ТМБ); стоп-реагент - 4N раствор серной кислоты.

Тест-система имеет достаточно высокий коэффициент специфичности (6,5-7,5), что позволяет регистрировать результаты анализа не только инструментально, но и визуально. В этом случае учет проводится по интенсивности окрашивания цветной реакции ферментзависимой метки с субстратом. Положительными будут образцы, интенсивность окрашивания которых в лунках с исследуемой сывороткой будут отчетливо отличиться от таковой в отрицательном контроле. Интенсивность окрашивания положительного контроля при этом должна будет быть достаточно выраженной.

3.3.3. Сравнительное изучение эффективности РСК и ИФА для ретроспективной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота

В наших опытах в РСК и ИФА параллельно были испытаны 1153 пробы сывороток крови крупного рогатого скота, подозрительного по заболеванию хламидиозом. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

1. Исследования сывороток крови крупного рогатого скота, подозрительного по заболеванию хламидиозом, в РСК и ИФА

РСК+/ИФА+ РСК+/ИФА- РСК-/ИФА+ РСК-/ ИФА- Общее количество проб

кол-во % кол-во % кол-во % кол-во %

14 1,2 2 0,2 368 31,9 769 66,7 1153

Из 1153 сывороток крови крупного рогатого скота в РСК с хламидийным антигеном прореагировали положительно и сомнительно 16 проб (1,4%). При исследовании в ИФА было установлено, что из 16 реагирующих в РСК сывороток, 14 (1,2%) были также позитивными в ИФА, а 2 сыворотки (0,2%) дали отрицательный результат в иммуноферментном тесте.

368 проб (31,9%), ранее негативных в РСК, в ИФА реагировали положительно. Общее количество реагирующих в ИФА проб составило 382 (33,1%). 769 сыворотка крови (66,7%) крупного рогатого скота оказались отрицательными и в РСК, и в ИФА. Общее число отрицательных в ИФА проб составило 771 (66,9%). Количество сывороток, результаты которых совпали в обеих реакциях составило 785 (68,3%). Значение показателя "РСК отрицательно / ИФА положительно", равное 31,9%, говорит о более высокой чувствительности им-муноферментного теста. Кроме того, следует отметить, что проведение РСК -весьма трудоемкий по сравнению с ИФА процесс, для которого требуется, как минимум, 4-5 часов, а для постановки последней - около 3 часов.

Материалы по разработке ИФА в качестве диагностического теста для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота и нормативно-техническая документация рассмотрены и одобрены на научно-техническом совете КГАВМ (протокол № 6 от 25.03.2011 г.). Временная инструкция и технические условия утверждены ректором КГАВМ, наставление по применению тест-системы - начальником ГУ В Кабмина РТ 18 мая 2011 г.

3.4. Серологический скрининг поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидийных инфекций с использованием ИФА

Нами был проведен серологический скрининг поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидийной инфекции. Всего было исследовано 1153 пробы сывороток крови крупного рогатого скота подозрительного по заболеванию хламидиозом. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

1. Результаты исследования сывороток крови подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота в РСК и ИФА

о\

Республика, район Название организации Количество проб сывороток крови Результат РСК Результат ИФА

+ (%) 1 -(%) + (%) I -(%)

Республика Татарстан

Чистопольский ООО Агрофирма «Сарсазы» 270 3(1Д) 267 (98,9) 49(18,1) 221 (81,9)

Балтасинский ООО им. Тимерязева 197 8(4,1) 189 (95,9) 127 (64,5) 70 (35,5)

Тукаевский ПК «Камский» 112 .... 112 (100) 18(16,1) 94 (83,9)

Алькеевский ОАО «КВ Arpo», ж/к Юхмачи 103 -— 103 (100) .... 103 (100)

Ютазинский ООО «Нур-Агро» 98 5(5,1) 93 (94,9) 52 (55,9) 46(44,1)

Кайбицкий ООО АФ «Кубпя» 75 — 75(100) 47 (62,7) 28 (37,3)

Сабинский ООО «Утра Саба» 73 — 73(100) 15(20,5) 58 (79,5)

Нурлатский ООО «Агроразвитие» 50 . — 50(100) 19(38,0) 31 (62,0)

Камско-Устьинский ООО АФ «Камско-Устьинская» 48 — 48(100) 15(31,3) 33 (68,7)

Пестречинский ООО ПХ «Герефорд» 15 — 15(100) 15(100)

Республика Марий Эл

Медведевский ЗАО «Марийское» 40 — 40(100) 17(17,5) 23 (72,5)

Республика Башкортостан

Аургазинский ООО СХП «Агрогалс»" 72 — 72(100) 23 (31,9) 49 (60,1)

ВСЕГО 1153 16 (1,4) 1137(98,6) 382 (33,1) 771 (66,9)

Процент реагирующих в ИФА животных в хозяйствах варьировал в пределах 16,1-64,5, при этом в РСК данный показатель составил 1,1-5,1.

С использованием разработанной нами иммуноферментной тест-системы были выявлены серопозитивный крупный рогатый скот во всех 3-х хозяйствах, в которых ранее при помощи РСК регистрировались реагирующие животные (ООО Агрофирма «Сарсазы» Чистопольского района РТ, ООО им. Тимерязева Балтасин-ского района РТ и ООО «Нур-Агро» Ютазинского района РТ).

Кроме того, нам удалось обнаружить специфические антитела в пробах сывороток крови коров из 7 хозяйств, где ранее в РСК реагирующие животные не регистрировались (ПК «Камский» Тукаевского района РТ, ООО АФ «Кубня» Каи-бицкого района РТ, ООО «Утра Саба» Сабинского района РТ, ООО «Агроразви-тие» Нурлатского района РТ, ООО АФ «Камско-Устьинская» Камско-Устьинского района РТ, ЗАО «Марийское» Медведевского района РМЭ и ООО СХП «Агро-галс» Аургазинского района РБ), а клиническими исследованиями были установлены случаи хронического проявления различной патологии у самок и молодняка,

характерной для хламидиоза. _

В двух хозяйствах (ж/к Юхмачи ОАО «КВ Arpo» Алькеевского района Р1 и ООО ПХ «Герефорд» Пестречинского района РТ) антитела против хламидии у подозрительных по заболеванию животных ни в РСК, ни в ИФА так и не были обнаружены.

Таким образом, результаты исследований представленных в этом главе показали высокую эффективность разработанной тест-системы для серологического скрининга поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидийных инфекций, особенно в хозяйствах, где РСК не позволяет адекватно оценить эпизоотическую ситуацию.

4. ВЫВОДЫ

1 Хламидийные инфекций крупного рогатого скота имеют существенное распространение в Республике Татарстан. За последние 10 лет в ветеринарных лабораториях республики подвергается исследованию на хламидиоз в среднем в год 30122,4 проб сывороток крови крупного рогатого скота, полученных от подозрительного по заболеванию хламидиозом и племенных животных. При этом в РСК с хламидийным антигеном в диагностических титрах реагируют в год в среднем 0,98% проб, что в цифровом обозначении составляет в среднем 294,5 проб в год.

2. Эпизоотологическим обследованием и комплексными лабораторными исследованиями (РИФ и ИФА) установлен хламидиоз в некоторых сельхозпредприятиях Республик Татарстан, Марий Эл и Башкортостан.

3. Сконструированная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять специфические противохламидийные антитела у спонтанно зараженного крупного рогатого скота. Полученный антиген имеет коэффициент специфичности 10,2 и не реагирует с геторологичными иммунными сыворотками.

4. Анализ результатов исследования сывороток крови подозрительного по заболеванию крупного рогатого скота в разработанной иммуноферментной тест-системе показал, что положительными считаются образцы, у которых оптическая плотность цветной реакции ИФА превышает критическое значение, которое рассчитывается по формуле: 011крит= среднее арифметическое цветной реакции в лунках с отрицательными контролями + 0,2 оптические единицы.

5. При сравнительном исследовании сывороток крови, полученных от подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота, в РСК и ИФА с хламидийным антигеном в диагностических титрах реагируют соответственно 1,4% и 33,1%, что свидетельствует о высокой специфичности разработанной иммуноферментной тест-системы. Значение показателя "РСК отрицательно / ИФА положительно", равное 31,9%, говорит о более высокой чувствительности разработанной иммуноферментной тест-системы.

6. Серологическим скринингом сывороток крови, полученных от подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота, с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы позволяет выявлять серопози-тивных животных в тех сельхозпредприятиях, где при использовании РСК таковые не регистрировались. В хозяйствах, где в РСК выявляются серопозитивные животные, при использовании ИФА их процент увеличивается с 1,1-5,1 до 18,169,5.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие практические предложения:

1. С целью оперативной диагностики хламидидийных инфекций у крупного рогатого скота ветеринарные специалисты обязаны регистрировать все случаи абортов и мертворождений у коров, уретритов и орхитов у быков, конъюнктивитов и артритов у телят, а также гибели приплода в первые дни жизни.

2. При диагностике заболевания у крупного рогатого скота необходимо использовать сочетание серологических тестов и методов индикации антигенов хла-мидий в тканях.

3. Иммуноферментная тест-система для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота предложена для промышленного изготовления (Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота, утверждено начальником ГУВ Кабмина РТ 18 мая 2011 г.) и может быть использована в ветеринарной практике для подтверждения ранее установленного другими методами диагноза на хлами-диоз у спонтанно больных животных, серологическом скрининге поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидиоза, а также оценке иммунитета у вакцинированных животных.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1 Банзузи Б A.C. Методика получения антигена для конструирования иммуно-' ферментных тест-систем / Б.А.С. Банзузи [и др.] // Труды XVII Междунар.

Моск. конгр.-М., 2009.-С. 190-191.

2 Банзузи, Б.А.С. Антиген для иммунологических реакции / Ь.А.С. ьанзузи [и др.] // Матер. IX Всерос. науч.-практ. конф. "Вет. медицина. Совр. пробл. и

пресп. разв." - Саратов, 2009. - С.113-115.

3 Банзузи Б A.C. Иммуноферментная тест-система для диагностики хламидиоза ' у крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов // Сб.

стат ■ Вет. мед. дом. жив. - Казань, 2009. - С. 141-144.

4 Банзузи Б A.C. Тест-система для иммуноферментной диагностики хламидиоза ' у крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов //

Труды XVIII Междунар. Моск. конгр. - М., 2010. - С. 305-306. 5. Банзузи, Б.А.С. Набор диагностикумов для иммуноферментной индикации антител против хламидий у крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2010. -Т. 201. - С.23-26.

6 Банзузи Б A.C. Сравнительная оценка ретроспективных методов диагностики хламидиоза у крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов // Труды XIX Междунар. Моск. конгр. - М., 2011. - С. 285-286.

7 Банзузи, Б.А.С. Анализ результатов серологических и вирусологических исследований крупного рогатого скота на хламидиоз в ветеринарных лабораториях Республики Татарстан / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2011. - Т. 206. - С.12-19.

8 Банзузи, Б.А.С. Оценка эффективности РСК и ИФА при выявлении хла-мидийных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2011. - Т. 206. - С.19-22.

9 Банзузи БАС. Сопоставление РСК и ИФА при выявлении хламидииных анти' тел у крупного рогатого скота / Б.А.С. Банзузи, Р.Х. Равилов, В.В. Герасимов //

Ветеринарная медицина: материалы международного научно-практического симпозиума. - Саратов: ИЦ "Наука", 2011. - С. 33-35

Отпечатано в ООО «Печатный двор». л Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 04.10.2011 г Печ.л.1,0 Заказ № К-7065. Тираж 100 экз. Формат 60х$41/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Банзузи Бадиата Арно Сезар

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика возбудителя.

1.1.1. Таксономическое положение хламидий

1.1.2. Морфология и цикл развития хламидий

1.1.3. Химический состав хламидий

1.1.4. Антигенная структура и иммуногенные свойства хламидий

1.1.5. Геномика хламидий

1.2. Лабораторная диагностика хламидиоза.

1.2.1. Выявление морфологических структур возбудителя в исследуемом материале

1.2.2. Выделение и культивирование хламидий

1.2.3. Индикация и идентификация антигенов хламидий

1.2.4. Генодиагностика хламидиоза

1.2.5. Выявление противохламидийных антител

1.3. Хламидиоз крупного рогатого скота.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Эпизоотологическое обследование.

2.2. Клинический материал.

2.3. Серологические реакции.

2.4. Получение хламидийного антигена для иммуноферментной тест-системы.

2.8. Получение положительных и отрицательных контрольных сывороток для иммуноферментной тест-системы.

214. Статистическая обработка результатов исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.49»

З.1.,Степень распространения хламидийных инфекций среди поголовья крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан и некоторых сельхозпредприятиях Республик Башкортостан и Марий Эл.

3.1.1. Анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в

Республике Татарстан

3.1.2. Эпизоотологическое обследование некоторых сельхозпредприятий республик*

Татарстан, Башкирия и Марий Эл в отношении хламидийных инфекций крупного рогатого скота

3.1.2.1. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы АФ

Камскоустьинская» (подразделение «Сюкеевское»)

3.1.2.2. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы ЗАО

Марийское”

3.1.2.3. Акт эпизоотологического обследования животноводческой фермы ООО СХП

Агрогалс» (Республика Башкортостан)

3.2. Выявление комплементсвязывающих антител и антигена хламидий в клинических материалах.

3.3. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител.

3.3.1. Подбор метода получения хламидийного антигена

3.3.2. Конструирование иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител.

3.3.2.1. Подбор режима “посадки” анти гена

3.3.2.2. Получение контрольных положительных и отрицательных сывороток

3.3.2.3. Титрование конъюгата

3.3.2.4. Подбор регламента проведения реакции

3.3.2.5. Определение критериев оценки результатов тестирования

3.3.2.6. Определение срока годности тест-системы.

3.4. Серологический скрининг поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидийных инфекций с использованием ИФА.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Хламидийные инфекции широко распространены среди всех видов млекопитающих животных и птиц. Заболевание наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и ( птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного I приплода. Распространенность возбудителей хламидиозов в природе среди домашних и диких животных, а также птиц представляет постоянную угрозу спарадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (70, 71, 87, 95 и др.).

В 1956 году ЭсЬоор в. и Каикег Е. в ФРГ впервые серологическим методом подтвердили, что причиной аборта у коров являются хламидии (220).

1 В настоящее время хламидиоз у этого вида животных достаточно подробно изучен. Большой вклад в изучение хламидийных инфекций у коров внесли / ученые Казанской школы хламидиологов. Большое внимание исследователи уделяли совершенствованию »методов лабораторной диагностики (14, 70, 84, 85 И др.).

- специфичность, субъективность оценки результатов исследования.

Наиболее широко в ветеринарной практике применяется реакция Г связывания комплемента. Однако согласно данным J. Schächter et al. (217) при помощи РСК удается выявить только 50% больных животных. Впервые РСК была использована для обнаружения хламидийных антител в 1935 году, а в современных ветеринарных лабораториях до сих пор используют наборы диагностикумов, технология изготовления которых была разработаны в 70-е годы прошлого столетия.

В последние годы для индикации и идентификации хламидий предложены современные иммунохимические и молекулярно-генетические методы, такие как: иммуноферментный анализ, иммуноблотинг, гибридомные технологии, полимеразная цепная реакция и др. (4, 22, 60, 72, 75, 96, 134, 173, 232 и др.). Перечисленные методы обладают высокой чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, возможностью одновременно исследовать большое число проб, простотой постановки и учета результатов, способностью выявлять межвидовые и- межштаммовые различия хламидий. До настоящего времени в Российской Федерации не выпускаются наборы для. иммуноферментной индикации хламидийных антител у крупного рогатого скота. ,

Исходя из этого, перспективным является усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций у крупного рогатого скота с учетом1 достижений современной биотехнологии.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации* по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан;

- разработать тест-систему для серологической диагностики хламидиоза у

I крупного рогатого скота иммуноферментным методом; , f 1

Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу крупного рогатого скота в Республике

Татарстан. /

Разработан новый метод получения антигена из очищенной культуры хламидий.

Впервые сконструирована и' апробирована в лабораторных и* производственных условиях иммуноферментная1тест-система для,индикации в сыворотках крови крупного рогатого скот противохламидийных антител.

Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативно-технические документы:

- “Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота (в порядке опыта)”, утвержденное ГУВ Кабинета министров РТ 18 мая 2011 г.;

- “Временную инструкцию по изготовлению и контролю иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота”, утвержденную ректором КГАВМ 18 мая 2011 г.;

- “Технические условия на опытную партию иммуноферментных тест-систем для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота”, утвержденные ректором КТ ABM 18 мая 2011 г.

Пути реализации результатов* исследования. Полученные результаты исследований могут быть использованы для совершенствования, диагностических И' противоэпизоотических мероприятий при1 хламидиозе крупного рогатого скота, а также при организации учебно-педагогического процесса в ВУЗах при подготовке и повышении, квалификации ветеринарных специалистов.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведены при, личном участии автора. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГБОУ ВПО “Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана” (2009 и 2010 гг.);

- Научно-практической конференции “Ветеринарная медицина домашних животных” (Казань, 2009 г.);

- Научно-практической конференции по проблемам ветеринарии и зоотехнии (Казань, 2011 г.).

- Всероссийских научно-практических конференциях “Ветеринарная -медицина. Современные проблемы и перспективы развития” (Саратов, 2009 и 2011 гг.);

- XVII-XIX Московских международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2009-2011 гг.).

Основные положения диссертации, выдвигаемые для защиты:

- хламидиоз крупного рогатого скота имеет существенное распространение на территории Республики Татарстан;

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах компьютерного текста (текстовый редактор “Microsoft Word 2003”, стиль “Times New Roman”, размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 242 источника, в том числе 140 иностранных и 4 ссылки на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 3 рисунками. Прилагаются разработанные нормативно-технические и другие документы, подтверждающие результаты исследований.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Банзузи Бадиата Арно Сезар

5. ВЫВОДЫ

1. Хламидийные инфекций крупного рогатого скота имеют существенное распространение в Республике Татарстан: за последние 10 лет в ветеринарных лабораториях республики подвергается исследованию на хламидиоз в среднем в год 30122,4 голов крупного рогатого скота; при исследовании сывороток крови, полученных от подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота и племенных животных, предназначенных для продажи, в РСК с хламидийным антигеном в диагностических титрах реагируют в год в среднем

0,98% проб, что в цифровом обозначении составляет в среднем 294,5 проб в год.

3. Сконструированная иммуноферментная тест-система позволяет выявлять специфические противохламидийные антитела у спонтанно больного крупного рогатого скота. Полученный1 антиген имеет коэффициент специфичности 10,2 и не реагирует с геторологичными иммунными сыворотками.

4. Анализ результатов исследования сывороток крови подозрительного по заболеванию крупного рогатого скота в разработанной иммуноферментной тест-системе показал, что положительными считаются образцы, у которых оптическая плотность цветной реакции превышает критическое значение, которое рассчитывается по формуле: ОГ1крих = среднее арифметическое цветной реакции в лунках с отрицательными контролями + 0,2 оптические единицы.

6. Значение показателя "РСК отрицательно / ИФА положительно", равное 31,9%, говорит о более высокой чувствительности разработанной иммуноферментной тест-системы.

7. Серологическим скринингом сывороток крови, полученных от подозрительного по заболеванию хламидиозом крупного рогатого скота, с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы позволяет выявлять серопозитивных животных в тех сельхозпредприятиях, где при использовании РСК таковые не регистрировались. В хозяйствах, где в РСК выявляются серопозитивные животные, при использовании ИФА их процент увеличивается с 1,1-5,1 до 18,1-69,5.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований внесены следующие практические предложения:

2. При диагностике заболевания у крупного рогатого скота необходимо использовать сочетание серологических тестов и методов индикации антигенов хламидий в тканях.

3. Иммуноферментная тест-система для ■ выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота предложена для промышленного изготовления (Временное наставление по применению иммуноферментной тест-системы для выявления хламидийных антител у крупного рогатого скота, утверждено начальником ГУВ Кабмина РТ 18 мая 2011 г.) и может быть использована в ветеринарной практике для подтверждении ранее установленного другими методами диагноза на хламидиоз у спонтанно больных животных, серологическом скрининге поголовья крупного рогатого скота в отношении хламидиоза, а также оценке иммунитета у вакцинированных животных.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Банзузи Бадиата Арно Сезар, Казань

1. Багдонас, И.И*. Внутрикожная проба как диагностический тест хламидийнойпневмонии телят. / И.И. Багдонас, Б.И. Тамашаускене // Матер, конф.: “Вопр. групп, профилактики заболеваний животных и птиц”. Вильнюс, 1986. -С.39-40. '

2. Белоусов, В.И. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампило-бактериям и- хламидиям. /

3. B.И. Белоусов и др. // Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995.1. C.74.

4. Белоусов, В.И. Разработка набора для иммуноферментной серо-диагностики хламидиоза овец. / В.И. Белоусов, В.И. Клюкина, И.И. Кочиш. / Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С.76.

5. Бескина, С.Р. Индикация антигенов гальпровий (хламидий) иммунопероксидазным методом. / С.Р. Бескина, В.Н. Панкратова, В.П. Попов. // Сб. науч. тр.: Экология вирусов. Баку, 1976. - С.208-209.

6. Борисенко, К.К. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний, передаваемых половым путем. / К.К. Борисенко и др. // Методический материал. М.: Асс. «Сенам», 1997. - С. 53.

7. Бортничук, В.А. Хламидиоз свиней. / В.А. Бортничук // Киев: Урожай, 1991. -192с.

8. Бортничук, В.А. Выделение хламидий от сельскохозяйственных животных и их идентификация. / В.А. Бортничук, Г.Г. Попович // Микробиол. журн. -1981.-Т. 43. № 2. - С.183-187.

9. Брагина, Е.Е. Морфологическое обоснование персистентного или латентного течения урогенитального хламидиоза. / Е.Е. Брагина, Г.А. Дмитриев. // Тез. докл.: Рос. съезда дерматол. и венерол. Казань, 1996. - С.106.

10. Бутин, B.C. Эпизоотология болезней сельскохозяйственных животных. /

11. В.С.Бутин, Э.К. Тарасова, А.И. Сосновская. //Новосибирск, 1983. С.74-76.

12. Вишняков, И.Ф. Иммуноферментный анализ при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. / И.Ф. Вишняков, Л.Я. Цыбанова, Т.В. Молчанова. // Вопр. вет. вирусол., эпиз. и микроб.: Тез. докл. научн. конф. Покров, 1983. - С.66-76.

13. Вишнякова, Л.А. Иммунология орнитоза. / Л.А. Вишнякова. // Автореф. дис. докт. мед. наук. Ленинград, 1974. - 33с.

14. Гаффаров, Х.З. Выделение вируса из группы пситтакозалимфо-гранулемы оттелят, больных бронхопневмонией. / Х.З. Гаффаров. // Ученые записки КВИ. -1969.-№ 104.-С.47. '

15. Гольдин, Р.Б. Применение флуоресцирующих антител для обнаружения вируса орнитоза. / Р.Б. Гольдин, Ф.И. Красник. // Вопр. мед. вирусол. 1964. -№10.-С.55-62.

16. Горовиц, Э.С. Использование иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации для изучения орнитозной инфекции. / Э.С. Горовиц, O.A. Тимашева. // Ж. Микробиол. эпидемиология и иммунобиология. 1981. - №9.- С.67-70.

17. Горовиц, Э.С. Использование реакции непрямой гемагглютинации дляизучения орнитозной инфекции. / Э.С. Горовиц, O.A. Тимашева. // Ж.

18. Микробиол. 1976. - № 12. - С.120-124.

19. Горовиц, Э.С. Использование реакции непрямой гемагглютинации приизучении орнитозной инфекции. / Э.С. Горовиц, O.A. Тимашева. // Ж.

20. Микробиол., эпидемиология и иммунобиология. 1979. - № 3. - С.108-112.

21. Горовиц, Э.С. Использование РИГА для изучения орнитозной инфекции. /

22. Э.С. Горовиц, О.А. Тимашева // Ж. Микробиол. Эпидемиология и иммунобиология.-1978.-№2.-С.68-71.

23. Горовиц, Э.С. Выявление иммунологических сдвигов к хламидиям у больных ’ с урогенитальной патологией. / Э.С. Горовиц и др. // Ж. Микробиол.эпидемиология и иммунобиология. 1984. - №2. - С.89-91.

24. Гришаев, М.П. Комплексная1 лабораторная диагностика хламидийной инфекции, обусловленной Chl.trachomatis. / М.П. Гришаев и др. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инфек. заболев.: Сб. тр. 2-й Всерос. науч.-пр. конф. М., 1998. - С.51-52.

25. Громыко, Л.Г. Обнаружение и локализация антигена возбудителя орнитоза итрахомы в клетке. / Л.Г. Громыко, И.И. Терских. // Вопр. вирусол. 1966. -№4. - С.95-99. '

26. Громыко, Л.Г. Применение иммуноферментного метода (ELISA) при хламидийных инфекциях. / Л.Г. Громыко, И.И. Терских. // Вопр. вирусол. -1981. № 2. - С.245-248.

27. Домейка, М.A. ELISA для индикации антител и антигена хламидий энтерита и пневмоний телят. / М.А. Домейка. // Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1985. - №58.-С.58-61.

28. Домейка, М.А. Биологическая характеристика хламидий возбудителяэнзоотического энтерита телят. / М.А. Домейка. // Автореф. дис. . канд. вет. наук. Тарту, 1986. - 25с. '

29. Домейка, М.А. Использование иммуноферментного метода для исследований антихламидийных сывороток. / М.А. Домейка и др.//Вопр. вирусол. 1985.- № 4. С.474.

30. Домейка, М.А. Применение реакции ELISA для индикации антител и антигена хламидий энтерита и пневмонии телят. / М.А. Домейка, И.И. Терских. // Вопр. груп. профилакт.заболеваний животных и птиц: Тез. докл. Межресп. конф. Вильнюс, 1987. - С. 46-48.

31. Евдокимова, Н.С. Выделение возбудителя орнитоза методами вирусолог. Исследований. / Н.С. Евдокимова. // Материалы 45-й Научн. конф. мед. ин-та.- Вып.2. Алма-Ата, 1976. - С.27-29.

32. Евстигнеева, Н.П. Молекулярно-генетический и иммунофлуорес-центный методы в диагностике хламидиоза. / Н.П. Евстигнеева. // ПЦР в диагностике и контроле лечения инф. забол.: Сб. тр. 2-й Всеросс. научн. пр. конф. - М., 1998. - С.39-40.

33. Евстифеев, В.В. Выявление хламидийных антител и антигенов в РНГА. / В.В. Евстифеев и др. //Матер. Междунар. науч. конф., посв.125-летию академии.- Казань, 1998. 4.1. - С.37-38.

34. Ильинский, Ю.А. Орнитоз. / Ю.А. Ильинский. // Клиника, диагностика, лечение. М., Медицина. - 1974.

35. Ильинский, Ю.А. Уровень спецефической сенсибилизации у больных орнитозом. / Ю.А. Ильинский. // Матер, всесоюзн. конф. Львов, 1988. -С.123-124.

36. Караваев, Ю.Д. Агглютинирующая активность штаммов возбудителя, выделенных при массовых абортах овец. / Ю.Д. Караваев. // Бюлл. ВИЭВ. -1972.-№ 14. С.62-63.

37. Караваев, Ю.Д. Сравнительное изучение чувствительности РСК и микроагглютинации при диагностике энзоотического аборта овец. / Ю.Д. Караваев, H.H. Дзиова, H.H. Крюков. // Бюлл. ВИЭВ. 1971. - Ч. II. - С.77-78.

38. Караваев, Ю.Д. Сравнительное изучение РСК, РНГА и РНИФ при диагностике хламидиозного аборта овец. / Ю.Д. Караваев, Ш.И. Исатаева,

39. Н.И. Налетов. // Бюлл. ВНИИ экспер. вет. 1986. - № 62. - С. 14-18.

40. Караваев, Ю.Д. Хламидиозы меры борьбы и профилактики. / Ю.Д. Караваев,

41. Н.И. Налетов, И. Калугина. // Ветеринарная газета. 1993. - № 26. - С.4.

42. Ковалев, В.Л. Схема выделения хламидий от животных. / В.Л. Ковалев. // Труды Тадж. НИВИ. Душанбе, 1977. - Т.7. - С.11-14.

43. Колкова, Н.И. К вопросам диагностики хламидийных инфекций. / Н.И. Колкова, В.Р. Мартынова. // Ж. Клин. Лаб. диагн. 1998. - № 2. - С.20-21.

44. Кравченко, Т.Ф. Серологическая диагностика при хламидиозе свиней. / Т.Ф. Кравченко. // Матер. Всесоюзн.конф.: Эпизоотол., эпидемиол., средства диагн., терапии и спец.профил.инф.бол., общих для чел. и жив. Львов, 1988.- С.114-115.

45. Кузьменко, В.П. Особенности взаимодействия хламидий с клетками. / В.П. Кузьменко. // Микробиол.журнал.-1980.-№2.-С.250-259.

46. Курбанов, И.А. Диагностика, меры борьбы и профилактика хламидийных абортов скота. / И.А. Курбанов и др. // г. Казань. 1982. 29 с.

47. Кутлин, A.B. Иммунодиагностические препараты на основе моноклональных антител к Chl.trachomatis. / A.B. Кутлин, A.A. Шаткин, Э.И. Дробышевская. // Ж. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - № 6. - С.42-44.

48. Манолов, А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для i количественного экспресс-анализа в микробиологии. / А.Д. Манолов. // Ж. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985. - № 4. - С.100-107.

49. Мартынова, Р.В. Хламидии и хламидиозы: клиника, биология и диагностика.

50. Р.В. Мартынова, Н.И. Колкова, A.A. Шаткин. // Рос. мед. вести. 1997. - Т.2.- № 3. С.49-55 .

51. Митрофанов, П.М. К эпизоотологии и лечению генитального хламидиоза быков-произво дител ей. / П.М. Митрофанов, Д. Д. Гомбоев. // Науч.-техн. бюлл. ВАСХНИЛ СО. 1986. - Т.24. - С.11-17.

52. Митрофанов, П.М. Клиника и патогенез хламидиоза. / П.М. Митрофанов. //

53. Ветеринария. 1980. - № 6. - С.37-39. ■

54. Митрофанов, П.М. Меры борьбы с хламидиозом крупного рогатого скота. / П.М. Митрофанов. //Ветеринария. 1980. - № 10. - С.33-34. ‘

55. Митрофанов, П.М. Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. / П.М. Митрофанов, В.А.Семенов, Р.Х. Хамадеев. // Чебоксары: РИЦ «Гранит», 2001. 54с.

56. Мошковский, Ш.Д. Природа вирусов и их место в системе живого. / Ш.Д. Мошковский. // Вестн. АМН СССР. 1963. - Т.1. - С.37-39.

57. Муравьева, Т.В. Применение метода флуоресцирующих антител длядиагностики некоторых вирусных заболеваний глаз (трахома, паратрахома, герпес). / Т.В. Муравьева. // Автореф. дис.канд. мед. наук. М., 1968. - 22 с.

58. Небогатиков, Г.В. Хламидийное инфицирование половых органов и плацентыу коров. Актуал. пробл. и достижения в области репродукции и-биотехнологии размножения животных. / Т.В. Муравьева: //1.1. Сгаирополь, 1998:128-130.

59. Новохатский, A.C. Иммуноферментный анализ моноклональных антител на твердой фазе инфицированных клеток. / A.C. Новохатский и др. // Вопр. вирусол. 1986. - № 4. - С.440-444.

60. Обухов, И.Л. Молекулярный механизм паразитизма хламидий и их внутриклеточное развитие. / И.Л. Обухов. // С/х биол. Сер. Биол. животных. -1997. № 2. - С.86-98.

61. Обухов, И.Л. Хламидиоз- кошек. / И.Л. Обухов. // Приложение к журналу «Новости звероводства». М., 1994. - 92 с.

62. Обухов, И.Л. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях. / И.Л. Обухов, К.Н. Груздев, А.Н. Панин. // Ж. Ветеринария. 1997. - № 2. - С.24-27.

63. Обухов, И.Л. Разработка праймеров для детекции хламидий. / И.Л. Обухов, М.В. Яковенко. // Ж. Ветеринария. 2000. - №5. - С.22-23.

64. Овчинников, М.Н. Ультратсруктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение. / М.Н. Овчинников, В.В. Дилекторский. // М.: Медицина, 1986. - С.175. .

65. Ориэл, Д.Д. Хламидиоз. / Д.Д. Ориэл, Д.Л. Риджуей. // М.: Медицина, 1984.- 191с.

66. Осидзе, Д.Ф. Неориккетсиозы. / Д.Ф. Осидзе. // Малоизвестные заразн. болезни жив. М., 1973. - С.164-183.

67. Ощепков, В.Г. Распространенность и клиническое проявление хламидиоза у крупного- рогаток» скота в Омской области. / В.Г. Ощепков и др. // Проблемы сельско-хозяйства Сибири. Сб. науч. тр. аспирантов и молодых ученых Ом ГАУ, Омск, 1996, 1: 51-59.

68. Попов, В.Л. Цикл развития и клеточный цикл и хламидий. / В.Л. Попов. // Хламидии (гальпровии) и хламидиозы. М., 1982. - С.16-17.

69. Попов, В.Л. Электронно-микроскопическое определение локализациигруппоспецифического антигена гальпровий (хламидий) прямым иммунопероксидазным методом. / В.Л. Попов, С.Р. Бескина, A.A. Шаткин. // ЖМЭИ. 1976. - № 12. - С.70-73. '

70. Попович, Г.Г. Антигенные свойства хламидий разного* происхождения. / Г.Г. Попович. // Ж. Микробиол. 1978. - № 1. - С.69172.

71. Попович, Г.Г. Оценка серологических методов диагностики хламидиозов. / Г.Г. Попович. //Микробиол. журн. 1981. - Т.43. - № 2. - С. 188-192.

72. Попович, Г.Г. Изучение антигенов полученных при помощи ультразвуковой дезинтеграции из хламидий, в перекрестных РСК. / Г.Г. Попович. // Микробиол. журн. 1978. - Т. 40. - №4. - С.477-479.

73. Равилов, А.З. Хламидиоз животных. / А.З. Равилов, Х.З.Гаффаров, Р.Х. Равилов. // Ж. Ветерин. врач. ¡2000. -№ 1. - С.51-58.

74. Равилов, Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных. / Р.Х. Равилов. // Автореф. дис. докт. вет. наук. Казань, 1999. - 28с.

75. Равилов, Р.Х. Современные методы диагностики хламидиозов животных и птиц. / Р.Х. Равилов, Х.З. Гаффаров, Р.Х. Хамадеев. // Ж. Ветеринарный врач.- №3. 2000. - С. 40-52. (12/4).

76. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней / Под. ред. В.И. Покровского. М., 1993. т.1: 357-366.

77. Сербезов , В. Выявление вируса орнитоза методом флуоресцирующих антител при помощи сывороток овец, содержащих антитела к вирусному аборту. / В. Сербезов, Д. Огнянов, Б. Матова. // Ж. гигиены, эпидемиол., микробиол., иммунолог.-1965.-9.-№2.-С. 225-227.

78. Терских, И.И. Культивирование вируса орнитоза в культуре клеток и приготовление тканевого диагностикума для кожной пробы. / И.И. Терских, А.Ю. Беклешова, О.М. Попова. // Вопр. мет. вирусол. 1964. - № 10. - С.95-100.

79. Терских, И.И. Возбудитель орнитоза и другие представители хламидиоза. / И.И. Терских. // Веста. АМН СССР. 1964. - № 3. - С.67-78.

80. Терских, И.И. Орнитоз в СССР. / И.И. Терских. // Автореф. дис. . докт. мед. наук. М., 1957.

81. Терских, И.И. Орнитоз и другие хламидийные инфекции. / И.И. Терских. // М.: Медицина, 1979.

82. Токаревич, К.Н. Опыт серодиагностики орнитозной инфекции при помощифлуоресцентного метода. / К.Н. Токаревич. // Научн. труды Ленинградского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера. 1963. — Т. 25.-С.245-250. •

83. Фаизов, Т.Х. ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция для выявления зооантропонозов. / Т.Х. Фаизов и др. // Матер. Респ. научно-произв. конф. по акт. проблемам ветер, и зоотехнии. Казань, 1996. - С.49.

84. Шаткин, A.A. Гальпровии (хламидии) и вызываемая ими патология. / A.A. Шаткин. // Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М., 1979. -Вып.1. - С.5-12.

85. Шаткин, A.A. Основные принципы лабораторной диагностики гальпровиозов (хламидиозов). / A.A. Шаткин. // Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных. М., 1979. - Вып.1. - С.25-36:

86. Шафикова, P.A. Выявление антител к возбудителю хламидиозного абортаовец в РЭМА. / P.A. Шафикова, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов. // Сб. науч.тр. КВИ: Актуал. вопр.инф.патол.в промышл.животн. Казань, 1987. - С.35-40.

87. Шафикова, P.A. Диагностика эпизоотического аборта! овец реакцией энзиммеченных антител. / P.A. Шафикова, Х.З. Гаффаров, А.З. Равилов. // Науч. основы технол. и промыш. произв. вет. биол. преп.: Тез. докл. III Всесоюзн. конф. М., 1987. - С.204-206.

88. Alexander E.R., Wang S.P., Grayston J.T. Father classification of TRIC agents from ocular trachoma and other sources by the mouse toxicity prevention test // Am. J. Ophthal. 1967. - N63. - P.1469-1478.

89. Armstrong J.A., Valentine R.C., Filds C. Structure and replication of the trachoma agent in cell cultures, as shown by electromicroscopy // J. Gen. Microbiol. 1963. -N30. — P.59-73.

90. Babudieri B. The slide microagglutination tests in the field of Rickettsial and viral serology. Its Advantages and Limitations // Path. Microbiol. 1961. - N24. - P.11-20.

91. Barron A.L., Collins A.R. Studies on trachoma agent by double diffusion gel precipitation // Amer. J. Ophthal. -1967. -63. -p.1437/461-1491/465.

92. Barron A.L., Gaste P.G., Paul B., Page L.A. Detection of chlamydiae antibodies inanimal sera by double diffusion in gel // Appl. Microbiol. -1972. -29, #4.- P.770-774. '

93. Bedson S.P Immunological studies with virus of psittacosis // Brit. J. Exp. Path. -1935. N14. - P.165-170.

94. Bedson S.P The PVL group of viruses // Brit. Med. Bull. V.9. - N3. - P.226-230.

95. Bedson S.P., Bland J.O. Morphological study of the psittacosis virus, with a description of the developmental cycle // Brit. J. Exp. Path. 1932. - N13. - P.461-466.

96. Beer I. Der Virusabort des Schafes // Mh. Vet. Med. 1961. - V.16. - NI. - P.1-5.

97. Beer I. Untersuchungen an und mit romplement bilden den Antigen des Virusabortus Schafe //Zbl. Vet. Med. 1958. - V.5. - N4. - S.305-328.

98. Beer J. Experimentelle Untersuchungen über die Diagnostik der Virus-aborts der Schafe mit allergishen Intracutantesten // Arch. Exp. Veterinarmed. -1958.-12.-S. 384-391.

99. Belden E.L., Mckercher D.G. Passive hemagglutination test for bovine ctnlamydial abortion // Infec. and Immun. — 1973. 7. #2.-P. 141-146.

100. Benedict A.A., O'brien E. Antigenic studies on the psittacosis-lympho-gjranuloma venereum group of viruses. II. Characterisation of complement fixing antigens extracted with sodium lauril sulfate //J. Immunol.-1956.-76,#4.-P.293-300

101. Blanco L.A., Barrera P.J., Macrotegui M.A. Ultrastructura de una chla^mydia de origen bovino // An. Inst Nac. Investig. Agr. Ser.: Hig. Sanid anim. 197S. — N2. — P.37-55.

102. Caldwell H.D., Judd R.C. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins // Infect. Immunol. 1982. - N38 - P.960-968.

103. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J'. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis // Infect. Irctmunol. -1981. -N31. -P.l 161-1176.

104. Cevenini R., Rumpianesi F., Donati M., Sarov I. A rapid immunoperoxidase assay for the detection of specific Ig G antibodies to Chlamydia trachomatis //J. Clin. Pathol. 1983. - 36, #3.-P.353-356.

105. Charton A. Chlamydioses des ruminants (bovine, ovine, caprine): etudesexperimentales. 2. Composition polypeptidique des corps élémentaires de soches de diverses origines //Bull. Acad. Vet. Fr. 1976. - V.49. -N4. -P.401-408.

106. Chassey D., Davies P., Dawson M. Immunoperoxidase detection of chlamydia ovis in experimentally infected cell culture // Brit. Vet. J. — 1981. — V. 13 7 — TST6. — P.634-638.

107. Chiba N., Arikawa J., Takaschima I., Hashimoto N. Isolation and serological survey of chlamydioses in feral pigeons and crows in Horraido // Jap. J. Vet. Sc. -1984. V.46 - N2. - P.243-245.

108. Christensen P.M., Nolkert M. Two complement fixing antigens from infected yolk sacs. II. The nature of the virus antigen and its relation to phosphatide antigen // Acta Path. Microbiol. Scand. 1955. - V.37. -N.3. — P.219-224.

109. Christiansen G., Ostergaard L., Birkelund S. Molecular biology of the Chi. pneumoniae surface // Scand. J. Infect Dis. 1997. Suppl. N104. - p.5-10.

110. Colon J.I. The role of folic acid in the metabolism of members of the psittacosis group of microorganisms // Ann. N.Y. Acad. Sc. 1962. - N98. - P.243.

111. Cutlip R.S. Electron microscopy of cell cultures infected with a chlamydial agent causing polyartritis of lambs // Infect. Immunity. 1970. -Nl. -P.499-502.

112. Darougar S., Dwyer R., Trehame J.D. et al. A comparison of laboratory methods of diagnosis of chlamydial infection // Excerpta Med. Amsterdam, 1971. - P.445-460.

113. Darougar S., Treharne J.D. Cell culture methods for the isolation of Chi. trachomatis : a review / Chlamydial infection Elsevier Biomedical Press, 1982. — P.265-274.

114. Dhingra P.N., Agarwal L.P., Mahajan V.M. et al. Chlamydia group antigen // Zbl. Vet.Med. 1981. - B.28. - N4. - P.336-340.

115. Dhir S.P., Hakomori S., Kenny G.E. et al. Immunochemical studies on chlamydial group antigen//J. Immunol. 1972. -N109. - P.116-122.

116. Dhir S.P., Kenny G.E., Grayston J.T. Characterization of the group antigen of Chi. trachomatis //Am. Soc. Microbiol. 1971. - V.4. -N6. -P.725-730.

117. Doughri A.M., Storz J., Altera K.P. Mode of Chlamydia in infections of intestinal epithelial cells // J. Infect. Dis. 1972. - V.126. -P.652-657.

118. Duggan M.A., Pomponi C., Kay D., Robboy S.J., Infantile chlamydial conjuncticitis A comparison of Papanicolaon, Giemsa and immunoperoxidase staining methods // Acta cytol. -1986. -30, #4.- P.341-346.

119. Dwenger A. Radioimmunoassay: an overview // J. Clin Biochem. 1984. — V.22. — N12. -P.883-894.

120. Eissenberg L.G., Wyrick P.B., Davis C.H., Rumpp J.W. Chi. psittaci elementary body envelopes: Ingestion and inhibition of phagolysosome fusion // Infect, and Immunol.- 1983.-¥.40.-N2.-P1741-751.

121. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay for immunoglobulin G // Jilmmunochem—1971.— N8—P.871-874.

122. Erlandson R.A., Allen E.G. The ultrastructura of meningopneumonitis // Virology.1964. N22. P.410-418. ' .

123. Escalante O.C., Rivera F.A., Trigo T.F., Romero M.J. Detection of Chi. psittaci inenteric subclinical infections in adult sheep, through cell culture isolation // Rev. Latinoamer. Microbiol. — 1996.— V.38.-Ni.-P.17-23. •

124. Evans R.T., Chalmres W.S., Woolcock P.R. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of Chlamydia antibody in duck sera // Avian Pathol. 1983.- V.12.-N1.-P.117-124.

125. Fames K., Richard D.F., Groft G.F., Johnson F.B. Evaluation of a cell culture-immunoperoxidase stain method for the diagnosis of Chlamydia trachomatis infections // Abstr. Annu Veet Amer. Soc. Microbiol., 1986.- Washington D.C.,1986.

126. Fedorko D.P., Clark R.B., Nachamkin I., Dalton H-P. Complement dependent in vitro neutralization of Chi. trachomatis by a subspecies-specific monoclonal antibody//Med. Microbiol, and Immunol. 1987. — V.176. — N4. — P.225-228.

127. Finney P.M., Bushell A.C. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) foranti-chlamydial secretory immunoglobulin A in guinea pig tears // J. Immunol. Meth.- 1986.-V.86.-N1.-P.71-74. ’

128. Frazer G., Berman D.T. Typospecific antigens in the PLV group of organisms // J. Bact. 1965. -N89. - P.943-948.

129. Frei W. Eine Meue Hautreaktion bei Lumphogranuloma inguinale // Klin. Wochenschr.- 1925.- 4.-S. 2148-2149.

130. Friis R.R. Infection of L cells and Chi. psittaci, entry of the parasite and host responses to its development// J. Bacteriol. 1972. — V.110. — P.706-721.

131. Geally J.F. Monoclonal antibodies and their potential in medicine // Irish Med. J. — 1987. V.80. -N6. — P.161-162.

132. Glynn A.A., Ison C. Enzyme immunoassay in Bacteriology / Immunoassays 80: Symp. Lancaster, 1981. -'P.431-440.1

133. Gollins A.R. Barron A.L. Demonstration of Group and Species-Specific Antigens-of Chlamydial Agents by Gel Diffusion // J.Inf. Dis. —1970.-121, #1.- P.1-8.

134. Gordon F.E., Nichols R.L., Quan A.L. Trachoma and related disorders caused by chlamydial agents. -Excerpta-Medica, 1971. P.358-3 62.

135. Hackstandt T. Identification and properties of chlamydial polypeptides that bind eukaryotic cell surface components // J. Bacteriol. — 1986. — N165. — P.13-20.

136. Hartley J.C., S. Kaye, S. Stevenson, J. Bennett, and G Ridgway. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 2001, p. 3072-3079. Vol. 39, No. 9.

137. Haskizume S. Diagnosis of chlamydial infection // Asian Med. J. — 1988. — V.31. — N2. -P.83-86.

138. Hendrick J.C., Franchimont P. New trends in radioimmunoassay / Protid. Biol. Fluids. Oxford, 1974.-P.619-624.

139. Hewinson R.G., Griffitls P.C., Rankin S.E.S. Towards a d: fferential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci. Vet. Tec., 1991,128; 381-382

140. Higachi N. Electron microscopic studies on the trachoma virus and psittacosis virus in cellcultures // Ex. Mol. Pathol. 1965. - N4. - P.24-29.

141. Holland S.m., Gaydes C.A., Quinn T.C. Detection and di fferention of Chlamydia trachomatis, Chi. psittaci and Chi. pneumonia by DNA amplification. J Jnfect. Dis, 1990, 162:984-987.

142. Hunter W.M. Radioimmunoassay: Handbookof experimental immunology / Weir

143. D.M., ed. Oxford: Blackwell Scient. Publ., 1978. - V.l. -N14. -P.1-40.

144. Jeggo M.H. Diagnosis of viral diseases using ELISA techniques / Nucl. And Related Techn. Anim. Prod. And Health, Proc. Inf. Symp. Viena, 1986. - P.289301.i

145. Jenkin H.M. Chlamydia: biology and experimental pathology / Charman's report and discussion: Nongonococcal urethritis and relat. infect. — Washington, D.C., 1977. -P.233-234.

146. Jenkin H.M. Preparation and properties of cell walls of agent of meningopneumonitis // J. Bacteriol. — 1960. — V.80. P.639-647.

147. Jenkin H.M., Ross H.R., Moulder J.W. Spacies-specifie antigens from the cell walls of the agents of meningopneumonitis and foline pneumonitis // J. Immunol.-1961.-86.-P. 123-127.

148. Johnson F.W.A., Glarksen M.J., Spencer W.N. Susceptibility of Chlamydia psittaci (ovis) to antimicrobial agents // J. Antimicrob. Chemother.-1983.-11,#5.-P.413-418.

149. Kaleta E.F. Aktuelle Fragen der Diagnose und Bekämpfung der Psittakose // Tierarztl. Umsch. 1997. Jg.52. - NI. - S.36-44.

150. Lema F., Everaere S., Rougeot C. et al. ELISA for detection of human antibodies to Chlamydiae III. Immunol. Meth. 1986. -V.94. -N1-2. - P. 153-159.1.„4.‘Lejyis V.J., Thacker W.L., Engelman H.M. Indirect Hemagglutination Test for’ 'Л*

151. Chlamydial antibodies //App.Microbiol.-1972. -24, #1.-P.22-252.

152. Litwin J., Officer J., Brawn A., Moulder S. A comparative study of the different cycle of different member of the psittacosis group in different host cells // J. Infect. Dis. 1961. - V.109. -N3. - P.251.

153. Maclean I.W., Peelino R.W., Brunham R.C. Characterization of Chi. trachomatisantigens with monoclonal antibodies // Can. J. Microbiol. 1988. - N34. - P.141147. '

154. Manire C.P., Tamura A. Preparation and chemical composition of the cell walls of nature infections dense forms of meningopneumonitis organisms // J. Bact. — 1967.- V.94. — N4. P.l 178-1183.

155. Л 82. Mields W., Hentchke J., Becker W., Teufel P. Die Immunoperoxidase-methode zum Nachweis von Virus-and Chlamydien-antigenen // Zbl. Vet. Med. B. — 1974. -V.21. S.48-58.

156. Mitscherlich E. Der Virusabort des Schofes in Deutschland // Dtsch. Tierarztl. Wsch. 1954. - N5. - S.42-46.

157. Kaltenboeck B. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompl) genes of the chlamidial species. J. Bact. 1993 V. 175.- P.478-502.

158. Kaltenboeck B., K.G. Kousoulas, and J. Storz. Structures of and Allelic Diversityand Relationships among the Major Outer Membrane Protein (ompl) Genes of the Four Chlamydial Species. Journal of Bacteriology, Jan. 1993, p. 487-502. Vol. 175, No. 2. ’ ,

159. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Stors J. Two-step Polymerase chain reactions and1 restriction endonuclcase analyses detect and differentiate omp ADNA of Chlamydia spp. J.Clin. Microbiol., 1992,30:1098-1104.

160. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction // J. Clin.

161. Microbiol. 1991 - V.29. - P. 1969-1975.

162. Kaltenboeck B., Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompllocus in chlamidiae isolated from swine // Am. J. Vet. Res. 1992. - - P.14821487. , • ’• •' ** »

163. Kingsbery DWeiss E. Lack of DNA* homology between species of the genus. . 'r.Çhlamydià // J. Bacteriol. 1968. - V.96. -N4. - P.1421-1423.

164. Kishimoto T., Kobota Y., Matsumoto A. et al. // J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1996.- V.70. -N8. -P.821-829.r

165. Krauss H. Diagnosis of Chlamydia disease with particular reference to aheep // Ann. Proc. sheep. Vet. Soc.-1985.-9.-P.73-78.

166. Kuo C.C., Caldwell H.D., Wang S.P., Grayston J.T. Nongonococcal Uirethntis^and. 1 c ,

167. Related Infections.-Washington, D.C., 1977.-P.176-185.

168. Morter R. Chlamydial diseases // Mod. Vet. Pract. 1981. - V.62. - N6. - P.467-468.

169. Moulder J.W. Metabolic capabilities and deficiencies of rickettsiae and psittacosis group // Int. J. Leprosy. 1965. - V.33. - P.494.

170. Moulder J.W. The contribution of model system to the studying of infections disease // Persp. Biol. Med. 1971. -N14. -P.486-502.

171. Moulder J.W. Биохимия внутриклеточного паразитизма. М.: Мир,1965. — 197с.

172. Moulder J.W., Grissa D.L., Cho H.J. Endogenous metabolism of protein and ribonucleic acid in a member of the psittacosis group // J. Infect. Dis. 1965. -V.l 15. -N3. -P.254.

173. Moulder J.W., Levy N.J., Schulman L.P. Persistent infection of mouse fibroblasts (L-cell) with Chi. psittaci: evidence for a cryptic chlamydial from // Infect. And Immunol. 1980. - V.30. -N3. -P.874-883.

174. Murrey E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the PLV group // J. Infect. Dis. 1964. — N114. P. 1-12.

175. Nettleman M.D., Batteiger B.E., Wilde C.E., Jones R.B. Conservation of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis within a serovar // Abstr. Ann. Meet Am. Soc. Microbiol. — Washington, D.C., 1986. P.92-96.

176. Nowell P. Phytohemagglutinin an initiator of mitoses in cultures of normal human leucocytes // Gancer. Res.-1960.-20.-P.462-470.

177. Ohana B., Prankratova V., Groh A. et al. Sero CT™-e new peptide based ELISA test for specific detection of Chi. trachomatis antibodies // Infect. Dis. Obstet. and Ginecol. — 1996. —V.4.-N3.-P.192.

178. Page L.A. Stimulation of cell mediated immunity to Chlamydiosis in Turkeys byinoculation of Chlamydial Bacterin // Am. J. Vet. Res. 1978. - V,39. - P.473-480.

179. Parker C.W. Radioimmunoassay of biologically active compounds. New Jersey: Prentice-Hall Inc., 1976.

180. Pearson T.W. Properties of the monoclonal antibodies produced by hybridoma technology and their application to the study of diseases. Geneva, 1982. — P.5562. '

181. Pepin M., Bailly L., Souriau A., Rodolakis A. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of chlamydial antibodies in caprine sera // Ann. Rech. Vet. 1985. - V.16. -N4. - P.393-398.

182. Petersen E.E. Chlamydien infektionen // MTA. 1996. — V.l 1. -N5. - S.354,356-358,360,362.

183. Piriano F.F., Abel C. Plague assay for psittacosis virus in monolayers of chick embryo fibroblasts // J. Bacteriol. 1964. -N87. - P. 1503-1511.

184. Poffenroth L., Costerton J.w., KordovaN., Wilt J.C. Ultrastructural studies of Chi. psittaci 6BC strains // Can. J. Microbiol. 1973. — V,19. — N8. - P.887-894.

185. Rake G. Viral and rickettsial diseases of the skin, eye and mucous membranes of man //Ann. N.Y. Acad. Sc. 1953. - V.56.-N3. - P.557-560.

186. Rank R.G., Barron A.L. Effect of antithymocyte serum on the course of chlamydial genital infection in female guinea pigs // Infec. and Immun.-1983.-41, #2.-P. 876879.

187. Rasmussen S.J., Douglas P.P., Timms P. PCR detection and differentiation ofe Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes. 1992. - №6. - P.389-394.

188. Rasmussen S J., Timms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett. 1992. - V.77. - P.169-174.

189. Reed D.K., Lincoln S.D., Kwaplan R.P., et al. Comparison of antigenic structure and pathogenicity of bovine intestinal Chlamydia isolate with an agent of epizootic bovine // Am. J. Vet. Res. 1975. - V.36. -N8. - P.l 141-1143.

190. Riera M.C., Barron A.L. Reactions with Hemagglutinin of Psittacosis Agent in Gel Biffusion // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970.-135, #1.-P.594-597.

191. Rodolakis A., Souriau A. Clinical evaluation of a commerical vaccine against ' • chlamydial abortion of ewes // Ann. Rech. Vet.-1979.-10,-S.41-48.1

192. Russo P., Giauffret A. Interet du test de transformation lymphoblactique pour le controle des vaccins chlamydiens // Rev. Med. Veter. -1978.-129, #6.-P.879-886.

193. Samoilovich S.R., Dugan C.B., Macario A.J.L Hybridoma technology: new developments of practical interest // J. Immunol. Meth. 1987. — V.101. — N2. —1. P. 153-170.

194. Sardinia J., Ganem D. Outer membrane protein of Chi. Trachomatis are developmentally regulated // J. Cell Biochem. — 1987. B.II. - P.l 12-115.

195. Sarov J., Becker Y. Trachoma agent DNA // J. Mol. Biol. — 1969. — N42. — P.581584. '

196. Schächter J., Banks J., Sugg N. et al. . Serotyping of Chlamydia: isolates of bovine origin // Infect, and Immunol. 1975. - V.II. - N5. - P.905-907.t

197. Schächter J., Storz J., Tarizzo M.L., Bodel K. Chlamydiae as agents of human and animal diseases // Bull. Wrld. Hlth. Org. 1973. - V.43. - P.443-449.

198. Schlossberger H., Kolle W., Hetsch H. Experimentelle Bakteriologie und Infektionskrankheiten München, 1952.

199. Schoop G., Kauker E. Infectioneines Rinderbestandes durch ein virus der PLV gruppe // Dtsch. Tierarztl. Wschr. 1956. - V.63. - P.223-229.

200. Seki C., Takashima I., Arikawa J., Hashimoto N. Monoclonal antibodies to Chi. psittaci: characteristics and antigenic analysis // Jap. Vet. Sc. 1988. - V.50. -N2.- P.383-393.

201. Singh C.K., Dhingra P.N., Kumar N. Isolation of Chlamydia from cerebral tissue of buffalo calf// Curr. Sc. (India) 1989. - V.58. - N9. - P.500-502.

202. Storz J. Superinfection of pregnant ewes latently infected with a psittacosis lymphogranuloma agent // Cornell Vet. 1963. -N53. - P.469-480.

203. Studdert M.J., Mokercher D. Bedsonia abortion of Sheep. III. Immunological

204. Studies //Res. Vet. Sei.- 1968.-9. -P.331-336. ,

205. Terzin A.L., Matuka S., Fomazaric M.R., H'Laca D.M. Preparation of group specific Bedsonia antigens for use in complement-fixation reaction // Acta Virol. -1961. -N5. -P.78-83.

206. Todd W.J., Caldwell H.D. The infection of Chi. trachomatis with host cell. Ultrastructural studies of the mechanism of release of biovar II stain from Hela 229 cells // J. Infect. Dis. 1985. - V. 151. - N6. - P. 1037-1044.

207. Travnicek M., Dravesky T., Balascak J. Isolacia Chi. psittaciz abortovaneho plodu kravy //fVet. Med. (CSSR). 1984. - V.29. -N3. - P. 133-136.

208. Umovitz H.B., Gottfried T.D., Robinson DJ. Immunoassays for the detection of antibodies to Chi. Trachomatis in the urine: Pat. 5516638 USA. 1996.

209. Van Weemen B.K., Schuurs A.H.W.M. Immunoassay using antigen-enzyme conjugete //FEBS Letters. -1971.-N15.-P.232-236.1. V*

210. Van Zaane D., Ijzerman J. Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulins and their use in isotype-specific ELISAs for rotavirus antibody // J. Immunol. -1984. V.72. - N2. - P.421-44.

211. Wachendörfer C., Valder W-.A., Luthgen W. Erfahrungen mit der Vakzination gegen den Chlamydien abort des Schafes // Wiss. Z.Humb. Univ. Berlin.-1980.-R.29.-S. 105-111.

212. Wang S.P., Grayston J.T. Trachoma and related disorders coused by chlamydial agents / Amsterdam, 1971. P.305-321.

213. Wang S.P., Kuo C.C., Barnes R.C. et al. Immunotyping of Chi. trachomatis with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. — 1985. V.152. — N4. — P.791-800.

214. Watkins N.G., Moos A.B., Caldwell H.D. A genus specific chlamydial antiden elicits ocular delayed hypersensitivity in immune guinea pigs // J.Cell. Bioch.1987.-11B.-P.120-124.

215. Yolken R.H. Monoclonal antibodies in microbiologic immunoassay // Lab. Manag.- 1983. V.21. -N9.-P.49-51, 54-55.

Информация о работе

Банзузи Бадиата Арно Сезар
кандидата ветеринарных наук
Казань, 2011
ВАК 06.02.02

Диссертация

Усовершенствование лабораторной диагностики хламидиоза крупного рогатого скота - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы