Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis"

На правах рукописи

UUJ448780

Басовский Юрий Иванович

Структурно-функциональная характеристика белков мембраны

>

включения Chlamydia trachomatis

03 00 04 - Биохимия 03 00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 О KT 2008

МОСКВА - 2008

003448780

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Говорун Вадим Маркович, кандидат биологических наук, доцент Лазарев Василий Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Панасенко Олег Михайлович (ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава), кандидат биологических наук Каменский Петр Андреевич (Московский Государственный Университет им М В Ломоносова)

Ведущая организация: ГУ НИИ Биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН

_ л ^

Защита диссертации состоится « ^ » HúS cJyS. 2008 года в часов на

заседании Диссертационного Совета Д 208 057 01 при ФГУ НИИ физико-

химической медицины Росздрава 119992 г Москва ул Малая Пироговская д Ia

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава

Автореферат разослан « <3 » 2008 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Мурина М А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Chlamydia trachomatis - грам-отрицательная эубактерия, облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий ряд тяжелых заболеваний у человека трахому - поражение слизистой оболочки глаз, приводящее к слепоте, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы, являющиеся одними из самых распространенных инфекций, передающихся половым путем Хламидии обладают уникальным двухфазным жизненным циклом, который позволяет им отлично адаптироваться к паразитированию внутри эукариотической клетки Внутриклеточный цикл развития С trachomatis протекает внутри особой мембранной вакуоли, называемой включением Мембрана включения модифицируется уникальными хламидийными белками, наиболее интересными из которых является семейство Inc-белков (inclusion proteins, белки включения) Inc-белки обнаружены у всех видов хламидий, причем их аналоги отсутствуют у каких-либо других известных организмов Данные белки значительно отличаются между собой по первичной структуре, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, протяженностью 50-80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения Большинство Inc-белков являются белками ранней фазы инфекции, их гены экспрессируются в течение первых двух часов после заражения Гидрофильные домены некоторых Inc-белков располагаются на цитоплазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются киназами клетки-хозяина Вышеприведенные факты делают обоснованным предположение о ключевой роли Inc-белков в жизненном цикле развития хламидий и взаимодействии с эукариотической клеткой, что и привлекает к ним внимание исследователей

Тем не менее, механизмы патогенеза хламидийной инфекции, а так же механизмы взаимодействия с эукариотической клеткой остаются малопонятными Также мало исследованы механизмы, благодаря которым хламидия избегает действия защитных систем клетки, главным образом ее

эндосомно-лизосомного аппарата Известно лишь, что маркеров, характерных для поздних эндосом, в мембране включения не обнаружено Для транспортировки внутри инфицированной клетки хламидия использует ее транспортные системы при участии моторного белка динеина, однако роль мембраны включения в этих процессах остается невыясненной Таким образом, учитывая огромное клиническое значение хламидий, а также их уникальность среди всех внутриклеточных паразитов, изучение их взаимодействия с эукариотическими клетками является актуальной задачей как с научной, так и с медицинской точек зрения Более того, именно белки мембраны включения, на основании всех вышеперечисленных фактов, могут играть ключевую роль в процессах взаимодействия паразита с клеткой

Цель работы: Определение структурно-функциональной организация генов и белков мембраны включения С trachomatis

Задачи:

1 Определение структуры оперона, находящегося под контролем промотора гена тсВ С trachomatis

2 Поиск и клонирование промоторных областей генов белков мембраны включения incA, incBC, incDEFG С trachomatis в плазмидный вектор с репортерной системой на основе гена gfp

3 Компьютерное моделирование структуры промоторных областей генов шсА, incBC, incDEFG С trachomatis и определение их активности в клетках Е coli

4 Клонирование генов, кодирующих гидрофильные и гидрофобные домены белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С trachomatis, в составе плазмидных векторов для их экспрессии в клетках линии HeLa

5 Определение локализации рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С trachomatis слитых с GFP в клетках линии HeLa

6 Выявление ко-локализации гидрофобных доменов белков мембраны включения С trachomatis с мембранными эукариотическими органеллами в клетках линии HeLa

7 Получение антител к рекомбинантным полноразмерным белкам IncB, IncC

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе реализован один из походов к выявлению структурно-функциональной организации генов и белков мембраны включения семейства Inc С trachomatis, а так же их роли в жизненном цикле хламидий В результате показана принадлежность генов incB и incC С trachomatis к одному оперону, установлена локализация промоторных областей генов шсА, и оперонов тсВС, incDEFG в геноме хламидий Для промоторов данных генов предсказаны точки начала транскрипции, а так же -10 и -35 консервативные области Проведено сравнение их активности в гетерологичной системе Е coli с применением репортерной системы на основе GFP

В качестве объекта для исследования структурно-функциональной характеристики белков мембраны включения нами были выбраны белки мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG, относящиеся к белкам ранней фазы инфекции, гены которых начинают экспрессироваться в течениие первых двух часов после заражения клетки Нами была определена локализация рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов данных белков, слитых с репортером GFP в культуре клеток линии HeLa В результате было показано, что локализация полноразмерных IncC, IncG полностью определяется их гидрофобными доменами

Для подтверждения роли гидрофобного домена IncC в распределении полноразмерного белка в клетке были получены рекомбинантные плазмидные векторы, в составе которых ген гидрофобного домена IncC находился в одной рамке считывания с генами гидрофильных доменов IncB, IncE, IncG После трансфекции соостветствующими плазмидами культур клеток линии HeLa два из трех химерных белков локализовались сходно с полноразмерным IncC

Также были получены поликлональные мышиные антитела для белков ранней фазы инфекции IncB и IncC, биологическая функция которых не известна Полученные антитела могут использоваться в дальнейшем как дополнительный инструмент в исследованиях функциональной роли Inc-белков в жизненном цикле С trachomatis

Полученные данные по структурно-функциональной организации Inc-белков могут быть в дальнейшем использованы для определения их роли в патогенезе хламидийной инфекции, а также для поиска белков-партнеров Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия с эукариотической клеткой может стать основой для разработки новых лекарственных препаратов для терапии хламидиозов

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава (Москва, 29 мая 2008 года), а так же в ходе следующих конференций «Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions» (Hinxton, UK, 7-10 сентября 2006), «Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M I Vavilov» (Kyiv, Ukraine, 20-22 сентября 2007), «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, Россия, 15-16 сентября 2008)

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 6 публикациях (2 - в рецензируемых журналах, 4 - материалы конференций)

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 26 рисунков Состоит из следующих глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы», который насчитывает 150 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные векторы В работе были использованы клетки линии HeLa229 (АТСС, США) и бактериальные штаммы Е cob DH5a (F" <p80/acZAM15 à(lacZY A-argF) U169 recAX endAX hsdS.ll (rt., mk+)phoh supSM X thi\ gyrA96 relA\) (Life Technologies, Великобритания), ER2566 (F-_-fhuA2 [Ion] ompT lacZ T7 genel gai sulAll _(mcrC-mrr)l 14 1S10 R(mcr-73 miniTnlO-TetS)2 R(zgb-210 TnlO)(TetS) endAl [dem]), B834 (DE3)( F~ ompT hsdSü{xü~ mB~) gal dem met (DE3)) (Novagen, США) Референс штамм С trachomatis D/UW-3/Cx (АТСС VR-8B5) был любезно предоставлен доктором Eva Hjelm, Уппсальский университет, Швеция В процедурах клонирования и экспрессии использовались плазмидные векторы pGEM-T/easy (Promega, США), pET-15b (Novagen, США), pBI-EGFP, pEGFP-Nl и pEGFP-Cl (Clontech, США) В процедурах экспрессии и определения локализации рекомбинантных белков так же использовались плазмидные векторы pEGFP-Cl/IncC, pEGFP-Cl/IncG, любезно предоставленные н с НИИ ФХМ Кострюковой Е С

Антитела и флюоресцентные красители. В работе использовались следующие антитела и флюоресцентные красители анти-GFP мышиные моноклональные антитела (Calbiochem, США), козьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (любезно предоставлены с н с ВИЭВ им ЯР Коваленко Г К Юровым), анти-Гольджин-97 (человеческий), Alexa 594-конъюгированные козьи антимышиные антитела, глибенкламид BODIPY TR (dipyrromethene boron difluonde, дипирометен бор дифлуорид), Alexa 594-конъюгированный WGA (wheat germ agglutinine, пшеничный зародышевый агглютинин) (Molecular Probes Inc, США), моноклональные мышиные антитела к липополисахаридному антигену хламидий, меченые флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) (НИАРМЕДИК ПЛЮС, Россия)

Анализ структуры IncBC оперона Выделение РНК из культуры клеток линии HeLa, зараженной С trachomatis, осуществляли с помощью набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США) согласно протоколу, рекомендованному производителем Предварительную денатурацию РНК и отжиг праймеров проводили в 10 мкл смеси, содержащей 1мкг РНК и 20 пмоль специфического праймера (sC4) при 70°С в течениии 10 мин, затем содержимое пробирок охлаждали во льду К образцу добавляли реакционную смесь, содержащую 25тМ Tns-HCl (pH 8 3), 37 5тМ KCl, 1 5тМ MgCl2, 5тМ дитиотриэтола, lmM dATP, dCTP, dTTP и dGTP, 20 единиц ингибитора рибонуклеаз и 200 ед M-MLV обратной траскриптазы (Promega, США) в объеме 20 мкл Реакцию проводили при 42°С 1 час, затем останавливали прогреванием смеси при 85°С в течении 10 минут Полученную в результате реакции обратной транскрипции кДНК амплифицировали с использованием специфических праймеров в программируемом термостате Thermal Cycler Abbott LCX Probe System

5

(Великобритания) с помощью Taq-полимеразы (НПФ Литех, Россия) согласно инструкции производителя Детекция результатов ПЦР проводилась при помощи электрофореза в 1-1,5% агарозном геле

Поиск потенциальных промоторных областей генов Inc-белков Для предсказания консервативных -35 и -10 последовательностей промоторных областей, а так же точек начала транскрипции использовали программу bprora (http Wsoftberry com) Клонирование последовательностей промоторов генов incA, incBC, mcDEFG в экспрессирующий плазмидный вектор pBI-EGFP. Последовательности промоторов амплифицировали с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции (Notl, PvuII, (MBI Fermentas, Литва)) Продукты амплификации клонировали в составе плазмидного вектора pGEM-T/easy, а затем субклонировали в плазмидный вектор pBI-EGFP согласно стандартным протоколам с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы (MBI Fermentas, Литва)

Спектрофлюориметрический анализ активности промоторных областей Inc-белков в клетках Е coli. Клетки Е coli ER2566 трансформировали экспрессирующими рекомбинантными векторами, содержащими промоторные области генов incA, incB, incD Отдельные колонии переносили в 10 мл LB-среды, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировали при 37°С и умеренном встряхивании в течение ночи Культуру клеток, трансформированных плазмидным вектором pQE-30 (Qiagene, США), содержащим ген gfp, культивировали с добавлением изопропил-Р-О-тиогалактозида до конечной концентрации 0,1мМ Полученные клеточные суспензии уравнивали по оптической плотности при X = 600 нм Интенсивность флюоресценции измеряли на приборе Fluoroscan Ascent (Labsystems, Финляндия) при X = 485 нм

Клонирование генов Inc-белков в экспрессирующие плазмидные векторы Гены Inc-белков амплифицировали с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции (HindlII, Pstl, Ndel, либо Xhol (MBI Fermentas, Литва)) Продукты амплификации клонировали в составе экспрессирующих плазмидных векторов pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, pET-15b согласно стандартным протоколам с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции и Т4 ДНК-лигазы (MBI Fermentas, Литва)

Выделение рекомбинантных белков IncB, IncC из клеток Е coli Осадки культур Е coli размораживали при 0 °С и суспендировали в 10мл буфера (20мМ Ш3РО4, 10% глицерина 0,5М NaCl, 20мМ имидазола) Смесь подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц 5x10 с) до образования гомогенной суспензии Далее разрушенные клетки центрифугировали при 40000g 45 мин Наличие рекомбинантного белка в осадке и надосадочной жидкости

6

определяли с помощью денатурирующего электрофореза в 12-15% полиакриламидном геле согласно стандартной методике Для выделения препаративных количеств рекомбинантного белка из нерастворимой фракции клеточного лизата осадки культур Е coll суспендировали в буфере для нанесения (50мМ Tris-HCl рН 6,8, 2%SDS, 0,1% бромфеноловый синий, 10% глицерин) и проводили денатурирующий электрофорез в ПААГ Выделяли целевые белковые фракции и гомогенизировали в стерильном фосфатном буфере Собранные фракции анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле

Получение антител к рекомбинантным белкам IncB, IncC С trachomatis Гомогенными суспензиями ПААГ, содержащими рекомбинантные IncB, IncC подкожно иммунизировали мышей линии BALB/c из расчета 25мкг белка на 1 мышь Через две недели мыши подвергались повторной иммунизации таким же количеством белка Еще через неделю мышей декапитировали для получения сыворотки Полученную кровь после свертывания центрифугировали при 2000g в течение 10 мин, затем отбирали сыворотку Окрашивание антителами к IncB, IncC зараженной С. trachomatis культуры клеток линии HeLa. Клеточные культуры фиксировали в 2% параформальдегиде в течение 10 мин , затем пермеабилизировали с использованием 0,2% Triton Х-100 в течение 20 мин при комнатной температуре Образцы блокировали в буфере, содержащем 2% BSA и 0,05% Tween 20 в TBS (10mM Tns-HCl рН 7,4, 130тМ NaCl,) в течение 30 мин при 37°С Затем образцы инкубировали с сыворотками, разведенными 1 100, содержащими антитела к IncB, IncC, в течение часа при 37°С, отмывали и инкубировали с козьими антимышиными конъюгированными с Alexa 594 антителами в течение часа при 37°С, затем препараты отмывали и просушивались перед монтированием

Трансфекция клеток линии HeLa Клетки HeLa культивировали в среде DMEM (Sigma, США) с 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США), 10 мкг/мл гентамицина при 37°С в атмосфере 5% СОг на стерильных стеклах в течение 24 часов до достижения 50-70% монослоя Трансфекцию клеток линии HeLa рекомбинантными экспрессирующими плазмидными векторами проводили с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя Анализ экспрессии генов осуществляли через разные интервалы времени (19-25 часов) после трансфекции Препараты промывали фосфатным буфером (1,5 М NaCl, 17mM NaH2PO^, 170mM Na2HP04), фиксировали 2% параформальдегидом 30 минут, затем повторно промывали фосфатным буфером Конфокальная микроскопия Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и иммунофлюоресцентный анализ трансфицированных клеток осуществляли с использованием конфокального флюоресцентного микроскопа Eclipse Е800 (Nikon, Япония) с VEM Epi-FIuorescence насадкой, укомплектованного аргоновым (используемая длина

волны 488 нм) и гелий-неоновым (используемая длина волны 594 нм) лазерами (Nicon Corporation, Япония), под объективом 60х, ЧА 1,4 с масляной иммерсией Конфокальные изображения с шагом по Z -оси получали с интервалом в 0,25 мкм и записывали с помощью программы EZ-C1 2 00 Software (Nikon, Япония) Изображения обрабатывали с помощью программы Image Pro-plus 5 1 (Media Cybernetics, США)

Флюоресцентное окрашивание плазматической мембраны, ЭПР и аппарата Гольджи эукариотических клеток. Для окрашивания аппарата Гольджи клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут при комнатной температуре и пермеабилизировали в 0 5% Tnton-X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре Образцы блокировали с использованием 2% козьей сыворотки либо 2% бычьего сывороточного альбумина в TNT-буфере (0,1 М Tris-HCl [рН 7,5], 0,15 М NaCl, 0,05% Tween 20) от 30 до 40 минут Затем образцы инкубировались с антителами к анти-Гольджин-97 в течение ночи при 4°С, отмывали и инкубировали с Alexa 594-конъюгированными антителами в течение ночи при 4°С, затем препараты отмывали и просушивали перед монтированием Окрашивание эндоплазматического ретикулума осуществляли с использованием 2 мкМ ER-Tracker в HBSS(0 44mM КН2Р04, 0,34mM Na2HP04x7H20, 4,2mM NaHCOj, 137mM NaCl, 5,4mM KC1, l,3mM CaCl2, 0,5mM MgCl2x6H20, 0,41mM MgS04x7H20, 5,0mM D-глюкоза, 0,02% PSP) в течение 15 минут, затем препарат отмывали Окрашивание плазматической мембраны осуществляли с помощью 5 мкг/мл Alexa Fluor 594 WGA в HBSS в течение 15 минут, далее препарат отмывали

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определение структуры incBC оперона

В геноме С trachomatis ген тсС отделен от тс В короткой межгенной областью Наличие собственной промоторной области для гена тсС уточняли, используя ОТ-ПЦР анализ Для проведения данного исследования выделяли тотальную РНК из зараженных С trachomatis культуры клеток HeLa Затем проводили реакцию обратной транскрипции с целью получения хламидийной кДНК, которую затем использовали в качестве матрицы для постановки ПЦР При амплификации с кДНК синтезировался ампликон длиной 470 п н, включающий в себя межгенную область между генами incB, тсС и фланкирующие последовательности самих генов Получение такого ампликона свидетельствовало о транскрипции incB, incC в составе одной матричной РНК

8

(рис. 1). В результате была установлена принадлежность тсВ и тсС к структурным генам одного оперона, находящегося под контролем промотора

тсВ.

1 2 3 4 М

Рисунок 1. Электрофоретический анализ продуктов ОТ-ПЦР. 1 - отрицательный контроль без матрицы; 2 - отрицательный контроль на ДНК-контаминацию; 3 - ампликон, полученный с кДНК; 4 - положительный контроль (геномная ДНК С. trachomatis). М - маркер молекулярной массы.

Поиск и анализ активности промоторных областей генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis

Поиск потенциальных промоторных областей для генов incA, incBC,

Таблица 1. Потенциальные промоторные области генов, кодирующих 1пс-белки. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделены консервативные области (-35), (-10) и точка начала транскрипции (+1).

Inc- белок Достоверность (%) -35 -10 Последовательность промоторной области

IncA 17 68 gaaaacatstaagctggtttttacatagaatttttatcatataaagCcatag -35 -10 4-1

IncB 48 72 actgagttecttgtaagtcttttgcateatatactccttggccgaTcgggg -35 -10 +1

IncD 40 81 aaaagtttsttttaaatagtttttttaettaaaatggatgccTaaataa -35 -10 +1

incDEFG осуществлялся с использованием программы bprom Для каждого из трех генов, кодирующих Inc-белки, программа идентифицировала точки начала транскрииции, предполагаемые промоторные области, а также -10 и -35 последовательности с определенной численно выраженной достоверностью (табл 1)

Для клонирования потенциальных промоторных областей Inc-белков был использован плазмидный вектор pBI-GFP, несущий в своем составе репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP, Хтх возбуждения 488нм, Хтх испускания 538нм) У исходного вектора была удалена промоторная область, расположенная до гена gfp Фрагменты ДНК, содержащие предполагаемые промоторные области генов incA (137675-137878 пн генома С trachomatis), incBC (259213-259461 п н ), incDEFG (134611-135020 п н ) были получены путем амплификации с геномной ДНК Продукты амплификации клонировали в составе плазмидного вектора pGEM-T Easy Далее промоторные области Inc-белков субклонировали в составе плазмидного вектора pBI-EGFP на место исходной промоторной последовательности, контролирующей экспрессию гена gfp Полученными рекомбинантными конструкциями были трансформированы клетки Е coll штамма ER2566 В качестве отрицательного контроля была использована плазмида pBI-GFP, лишенная исходной промоторной последовательности, а как положительный контроль использовали плазмидный вектор pQE-GFP, где ген gfp находится под контролем промотора фага Т5 Сравнение силы промоторов Inc-белков было проведено определением интенсивности флюоресценции GFP для трансформированных клонов и сравнения с контрольными образцами Оказалось, что инициировать транскрипцию с высокой частотой, сравнимой с положительным контролем, способен только промотор incBC, в то время как активность промоторов incA, incDEFG оказалась существенно ниже (табл 2)

Полученные данные нельзя рассматривать как гарантию такой же эффективности работы данных промоторов при синтезе белка в клетках С trachomatis, в первую очередь из-за возможности присутствия у хламидий дополнительных транскрипционных факторов, не характерных для Е coli,

10

Таблица 2 Интенсивность флюоресценции клеток Е coli, трансформированных плазмидами содержащими промоторные области Inc-белков, а также положительный (К+) и отрицательный (К-) контроли

Промоторная область Интенсивность флюоресценции (отн ед)

IncA 400 ± 18

IncB 2204 ±47

IncD 541 ± 22

pQE-GFP (K+) 2563 ± 55

pBI-GFP (K-) 225 ±9

способных значимо влиять на уровень транскрипции Тем не менее, исследователи транскрипционной активности промоторных областей хламидий in vitro, с помощью направленного мутагенеза консервативных областей промоторов, показали высокую активность РНК-полимеразы хламидий при замене -10 и -35 регионов их промоторных областей на консенсусные консервативные последовательности для о70 Е coli, что в свою очередь свидетельствует о высокой степени гомологии хламидийной и Е coli РНК-полимеразы

Частично консенсусные последовательности Е coli присутствуют и в предсказанных для Inc-белков промоторных областях это TGT и TTG последовательности в -35 области и ТА и TATA (для тс В) последовательности в -10 области При этом показано, что -10 гексамерная последовательность МОМР Р2 С trachomatis TATCGC отличается от классической -10 последовательности Е coli присутствием G и С нуклеотидов в последних трех позициях гексамера, однако для активности промотора критичными являлись только два первых нуклеотида Таким образом, присутствие даже участков консенсусной последовательности Е coli может являться достаточным условием для распознавания промотора и инициации транскрипции, а в случае с тсВ, промотор которого в предсказанной -10 области обладает наиболее близкой к Е coli консенсусной последовательностью, это может объяснить его

высокую активность в данной гетерологичной системе

Таким образом, нами было произведено исследование четырех предполагаемых промоторных областей генов Inc-белков в гетерологичной системе Е coli, показавшее наличие собственных промоторных областей генов тсА, incBC, incDEFG, узнаваемых РНК-полимеразой Е coli и по структуре во многом схожих с промоторами Е coli, имеющими сродство к холоферменту с а70 субъединицей Также была показана принадлежность генов тсВ и incC С trachomatis к одному оперону, аналогично С psittaci

Определение локализации гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения С. trachomatis в культуре клеток линии HeLa

Ранее было показано специфичное распределение некоторых полноразмерных рекомбинантных Inc-белков при экспрессии их генов в эукариотической клетке Так, рекомбинантные белки IncB, IncC, IncE, IncF, IncG, несущие на N-концевом участке молекулы репортерный GFP, проявляли тропность к различным мембранным структурам клетки Для IncB, IncF это ЭПР, для IncE, IncG - ЭПР и аппарат Гольджи, для IncC - плазматическая мембрана Такое распределение составных белков, возможно, свидетельствует об их взаимодействии с белками экзоцитозного пути, служащего для транспортировки новосинтезированных полипептидов к клеточной поверхности и включающего в себя ЭПР, цистерны аппарата Гольджи, транспортные везикулы и везикулярно-тубулярные структуры, направленные к периферии клетки Правильно свернутые полипептидные цепи в мономерной или олигомерной форме включаются в экзоцитозный поток, попадая сначала в аппарат Гольджи и транспортируясь далее к цитоплазматической мембране При этом происходит сортинг экзоцитируемых белков, часть которых возвращается в ЭПР, а часть попадает через эндосомную систему в лизосомы Такой сортинг требует наличия у белков специфических "топогенных сигналов" В случае Inc-белков, учитывая их структурную организацию, роль таких сигналов для узнавания транспортными системами клетки могут выполнять отдельные гидрофильные, либо гидрофобные домены

12

Для определения локализации гидрофильных и гидрофобных доменов IncC, IncG С trachomatis при экспрессии кодирующих их генов в эукариотической клетке мы использовали плазмидные векторы pEGFP-Nl и pEGFP-Cl Данные векторы позволяют получить парные составные белки, несущие GFP как на аминотерминальном, так и на карбокситерминальном участках исследуемого белка Обычно при выборе расположения GFP учитывают возможное влияние репортера на сигнальные последовательности и активные центры изучаемого белка, что особенно важно при исследовании активности ферментов и при работе с белками, локализующимися в плазматической мембране, пероксисомах, ЭПР и других мембранных органеллах клетки Поэтому каждый ген был клонирован в составе обоих плазмидных векторов

После трансфекции культуры клеток линии HeLa была определена локализация полученных составных белков через 20 часов после трансфекции Оказалось, что локализация полноразмерных IncC (IncC-Cl), а также IncG (IncG-Cl) в эукариотической клетке полностью определяется их гидрофобными доменами

Гидрофобный домен IncC (fobC-Cl) локализовался в везикулах, тубуло-везикулярных образованиях, направленных к периферии клетки, в аппарате Гольджи, а также в области наружной мембраны клетки Гидрофобный домен IncG (fobG-Cl) располагался в области ЭПР, аппарата Гольджи и транс-Гольджи сети В то же время гидрофильные домены этих белков (filC-Cl для IncC, filG-Cl для IncG) не проявляли тропности к каким-либо клеточным органеллам, либо мембранным компартментам и распределялись в клетке подобно нативному GFP (рис 2)

К сожалению, невозможно абсолютно точно определить локализацию белка в области тех или иных органелл только на основании морфологической картины, полученной с использованием составных белков с GFP, либо другим репортером Поэтому уточнение локализации белков мы осуществляли путем измерения их ко-локализации с известными молекулами, являющимися специфическими для тех или иных клеточных структур Для гидрофобного

13

Рисунок 2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия клеток НеЬа, трансфицированных экспрессирующими плазмидными конструкциями через 20 часов после трансфекции. Показана локализация белков а- 1псО-С1, б- ГоЬО-С1, в- ЙЮ-С1, г- 1псС-С1, д-й)ЬС-С1, е- ШС-С1.

* 7« » ♦ "> , • -»Я * 1 /

I а б 1

' 1 > * ' Г"

1

1г ; Iд 1

Рисунок 3. Выявление ко-локализации слитых с вРР рекомбинантных гидрофобных доменов 1псС с плазматической мембраной (а,б,в), ¡пев с аппаратом Гольджи (г,д,е) клетки НеЬа.

домена IncC - с плазматической мембраной, для гидрофобного домена IncG - с аппаратом Гольджи Клетки линии HeLa трансфицировали экспрессирующими конструкциями, полученными на основе плазмидного вектора pEGFP-Cl и содержащими гены гидрофильных и гидрофобных доменов, либо их участки в одной рамке считывания с GFP Полученные препараты анализировали с использованием флюоресцентных красителей па плазматическоую мембрану (Alexa Fluor 594 WGA) и антител, специфически связывающихся с аппаратом Гольджи, которые затем связывались с Alexa 594-конъюгированными антителами (рис 3,5,6)

Тропность гидрофобных доменов IncC, IncG к различным мембранным структурам исключает неспецифичный гидрофобный характер этих взаимодействий в клетке и предполагает наличие в них последовательностей, узнаваемых эукариотической клеткой

Для определения локализации подобных сигналов в аминокислотной последовательности IncC нами было выбрано три варианта последовательностей, охватывающих весь гидрофобный домен белка По данным компьютерного моделирования гидрофобный домен IncC практически полностью локализован в мембране включения и состоит из двух отдельных трансмембранных альфа-спиралей, заякоренных в мембране, а так же С-концевого гидрофильного хвоста молекулы (рис 4) Учитывая его предполагаемое расположение в мембране, нами были получены три рекомбинантные конструкции, кодирующие две отдельных трансмембранных альфа-спирали (NfobC, CfobC), а также обе гидрофобные спирали без С-концевой гидрофильной части молекулы (NCfobC) в одной рамке считывания с GFP

Ни для одного из трех рекомбинантных белков, составляющих гидрофобный домен IncC, не было показано локализации в цитоплазматической мембране клетки (рис 5) Таким образом, для адресной доставки IncC к плазматической мембране необходим полноразмерный гидрофобный домен, обладающий определенной структурой Для подтверждения роли гидрофобного домена IncC в распределении полноразмерного белка в клетке, гидрофильные

15

Рисунок 4. Предполагаемое расположение гидрофобного домена 1псС в мембране построенное с использованием алгоритма 8081Л. Желтым выделены аминокислоты находящиеся, в составе химерных белков: а - №оЬС, б - СМ>С, в -ЫСйэЬС.

домены ГпсВ, 1псЕ, ГпсО были клонированы составе плазмидного вектора рР,( гРР-С1/ТоЬС в одну рамку считывания с гидрофобным доменом 1псС и ОН5. Выбор данных гидрофильных доменов был обусловлен прежде всего специфичной локализацией полноразмерных рекомбинантных 1псВ, 1псЕ, 1псС в культуре клеток НеЬа. Рекомбинантный белок ШВ-йэЬС (гидрофильный домен 1псВ + гидрофобный 1псС) локализовался сходно с полноразмерным 1псС. ШЕ-АэЬС (гидрофильный домен ГпсЕ + гидрофобный 1псС) располагался в области аппарата Гольджи и транс-Гольджи сети, существенная часть белка распределялась в области наружной мембраны. Химерный белок йЮ-АэЬС (гидрофильный домен 1псО + гидрофобный 1псС) локализовался преимущественно в области ЭПР и аппарата Гольджи, что больше соответствовало локализации полноразмерного 1псО (рис. 6).

Приведенные данные подтверждают тропность гидрофобного домена 1псС к мембранным компартментам клетки, к ее цитоплазматической мембране. Отсутствие тропности химерного белка ЙКЗМЪЬС к области наружной мембраны и его локализация в ЭПР, аппарате Гольджи и транс-Гольджи сети может указывать на наличие сигнальных мотивов в гидрофильном домене 1псС. Данное распределение химерного белка в клетке не удивительно, учитывая тот факт, что гидрофильный домен 1псС располагается на карбокситерминальном участке полноразмерного белка (1псО), фосфорилируется киназами клетки хозяина и взаимодействует с эукариотическим белком 14-З-Зр, одной из

Зеленый канал (составной белок) Красный канал (маркер на мембрану) Наложение зеленого и красного каналов

3 / /Щ 1

б I7 1

^ \, ^ / > й • 4 ) 4 1 1 [

г Д е

б? > /ч лаг _ 1 . * ' Д ' # * X ' # -. 1 у

| ж 3 и |

Рисунок 5. Определение локализации слитых с вБР составных частей гидрофобного домена 1псС и выявление ко-локализации с плазматической мембраной клетки НеЬа. №оЬС-С1 (а,б,в); ОоЬС-СЛ (г,д,е); ЖУоЬС-С 1 (ж,з,и).

функций которого является регуляция различных сигнальных путей и внутриклеточного трафика в клетке. Тем не менее, отдельный гидрофильный домен 1псО, слитой с ОРР, не показывал специфичной локализации в клетке, что, возможно, объясняется его неправильной структурой в отсутствии гидрофобной составляющей.

Таким образом, нами установлен факт взаимодействия гидрофобных доменов 1пс-белков с клеточными органеллами, формирующими экзоцитозный

путь в клетке - ЭПР, аппаратом Гольджи, транс-Гольджи сетью, цитоплазматической мембраной.

Зеленый канал (составной белок) Красный канал (маркер на мембрану) Наложение зеленого и красного каналов

ф- „ Л )М л ^м л ^ к^Ш - А

а 8 В

\ "г ■ £ ;. V '.л ( ">• £

* е ж

4 : ■ > 1 г N я 1 ■ V. 1 . У .. • Л''

1 к л

Рисунок 6. Определенеие локализации слитых с вРР гидрофильных доменов 1псВ, 1псЕ, 1псО, находящихся в одной рамке считывания с гидрофобным доменом 1псС. Выявление ко-локализации с плазматической мембраной клетки НеЬа. ГНВ-ГоЬС (а,б,в); А1Е-й)ЬС (г,д,е), ШС-йэЪС (ж,з,и).

Распределение гидрофобных доменов 1псС (йэЬС-С1), 1псО (1оЬС-С 1) при экспрессии их генов в аппарате Гольджи, транс-Гольджи сети, а для &>ЬС-С1 и в плазматической мембране эукариотической клетки позволяет выдвинуть

гипотезу о взаимодействии этих белков с ключевыми регуляторами мембранного трафика в клетке Хламидийное включение способно к распознаванию, сортировке и перехвату экзоцитарных пузырьков с гликопротеинами и гликолипидами, которые транспортируются из аппарата Гольджи к наружной мембране Ранее было показано, что уже через 2 часа после начала инфекции хламидии приобретают способность перехватывать сфингомиелин-содержащие рециркулирующие везикулы при их перемещении к плазматической мембране клетки, в результате чего они получают сфингомиелин, фосфатидилхолин, кардиолипин и холестерин, необходимые им для построения мембраны включения и обеспечения собственного размножения Поскольку процессы перехвата сфингомиелин-содержащих везикул так же требую г раннего бактериального синтеза белка, можно сделать предположение, что в них могут принимать участие Inc-белки (их гидрофобные домены), гены которых экспрессируются преимущественно на ранних стадиях жизненного цикла хламидий Являясь ложными эффекторами для регуляторов мембранного трафика, они могут распознавать и перехватывать экзоцитарные везикулы, циркулирующие между аппаратом Гольджи и наружной мембраной, и использовать их для дальнейшего развития инфекционного процесса

Получение антител к IncB, IncC С. trachomatis

Гены incB, incC экспрессировали в составе рекомбинантного плазмидного вектора рЕТ-15Ь после индуцирования IPTG клеток Е coli В834 (DE3) Наибольшее количество рекомбинантного белка нарабатывалось в течение 2-х часов после добавления индуктора После фракционирования грубого лизата белки IncB и IncC оказались в тельцах включения Из-за трудностей, связанных с очисткой подобных белков и практической невозможности получить препарат достаточной чистоты для антителогенеза, мы использовали метод препаративного денатурирующего электрофореза в ПААГ Соответстивие белковых препаратов целевым проверяли методом масс-спектрометрии белков, который показал наличие пептидов, составляющих IncB, IncC в исследуемых образцах Полученные таким образом препараты белков обладали достаточной

19

чистотой для получения специфичных антител и использовались для иммунизации мышей лини BALB/c. Антигены мышам вводили подкожно в виде полиакриламидной суспензии, содержащей препараты целевых белков. Такой способ введения обеспечивает повышенный иммунный ответ со стороны организма-реципиента, что обычно благоприятно сказывается на титре получаемой сыворотки. Через две недели мыши подвергались реиммунизации и еще через неделю проводили декапитацию мышей и отбирали сыворотки. Сыворотки анализировали методом иммуноблоттинга на препаратах антигенов, которые вводили мышам, а затем проводили иммуногистохимический анализ на зараженных С. trachomatis, клетках линии HeLa, в качестве контроля используя незараженную культуру. Полученные сыворотки специфично связывали хламидийные включения в зараженных

ЩЁ -4 л » V •5 iß «f ' , jä* W< . — * л ./ f.-; . 4

а 6

г^г М ' ■ * * f* f- ,

0 — с . ** >1,

1 В г

Рисунок 7. Иммуногистохимический анализ зараженных С. trachomatis клеток линии HeLa с использованием сывороток, содержащих антитела к IncB, IncC. а- зараженные клетки, окрашенные на липополисахарид С. trachomatis (контроль заражения); 6- окрашивание сыворотками, содержащими антитела к IncC незараженной культуры клеток HeLa; в,г-окрашивание зараженных клеток сыворотками, содержащими антитела к IncB, IncC соответственно.

клетках(рис 7)

Таким образом, нами получен дополнительный инструмент для исследования локализации и выяснения роли Inc-белков в жизненном цикле хламидий

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий ряд тяжелых заболеваний трахому, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы, являющиеся одними из самых распространенных инфекций, передающихся половым путем Механизмы взаимодействия данного возбудителя с клеткой-хозяином остаются практически неизвестными По мнению большинства исследователей, ключевую роль в этом процессе могут играть уникальные белки хламидий - белки мембраны включения

В настоящей работе применен подход по исследованию структурно-функциональных свойств генов и белков мембраны включения семейства Inc в Е coli и эукариотических клетках HeLa

Определены структурные гены оперона, находящегося под контролем промоторной области гена тсВ Произведен поиск промоторных областей гена incA, оперонов irtcBC, incDEFG и показана гомология с высококонсервативными -10 и -35 областями промоторов Е coli in sihco Показана и сравнена активность этих промоторов в клетках Е coli

Благодаря использованию метода конфокальной микроскопии и эукариотических клеток HeLa удалось показать, что специфичная локализация рекомбинантных IncC, IncG С trachomatis в эукариотической клетке определяется их гидрофобными доменами Подтверждена способность гидрофобного домена IncC транспортировть к плазматической мембране не только молекулу репортера, но и гидрофильные домены IncB, IncE Показано, что для локализации в цитоплазматической мембране необходим цельный гидрофобный домен IncC Полученные данные по локализации рекомбинантных гидрофобных доменов Inc-белков подтверждены определением ко-локализации полученных белков с клеточными органеллами,

21

составляющими экзоцитозный путь в клетке

Таким образом, на примере IncC показано, что взаимодействие гидрофобных доменов Inc-белков с органеллами экзоцитозного пути в клетке требует корректно свернутой молекулы гидрофобного домена Отдельные специфические сигнальные мотивы для IncC не обнаружены Полученные данные могут использоваться для характеристики структурно-функциональных взаимодействий Inc-белков с эукриотической клеткой

Также получены поликлональные антитела к белкам ранней фазы инфекции с использованием для этой цели полноразмерных рекомбинантных белков IncB, IncC Таким образом, получен допонительный инструмент для характеризации роли Inc-белков в жизненном цикле хламидий

Все эти данные, возможно, в дальнейшем позволят охарактеризовать взаимодействие Inc-белков с белками-партнерами в инфицированной клетке Понимание молекулярных механизмов таких взаимодействий будет способствовать разработке новых эффективных препаратов для терапии хламидийной инфекции

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что гены тсВ, тсС С trachomatis принадлежат к одному оперону

2 Промоторные области генов белков мембраны включения тсА, incBC, tncDEFG С trachomatis клонированы в составе плазмидного вектора с репортерной системой на основе гена gfp Определена их транскрипционная активность в клетках Е coli

3 Для экспрессии в линии клеток HeLa в составе плазмидных векторов клонированы гены, кодирующие гидрофильные и гидрофобные участки белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С trachomatis

4 Определена локализация рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения IncB, IncC,

IncE, IncG С trachomatis слитых с GFP в клетках линии HeLa и выявлена их ко-локализация с органеллами, составляющими экзоцитозный путь эукариотической клетки

5 Получены поликлональные антитела к рекомбинантным полноразмерным белкам IncB, IncC С trachomatis

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Lazarev V N, Shkarupeta М М , Kostryukova Е S , Levitskn S А , Basovskn Yu I, Govorun V M Analysis of Clamydia trachomatis Inc-proteins cellular localization during expression of their genes in HeLa cell line // Genomic Perspectives to Host Pathogen Interactions, 7-10 September (2006), Hinxton, UK, p - 47

2 Basovskiy Yu I, Kostrjukova E S , Shkarupeta M M , Levitskiy S A , Lazarev V N Hydrophobic domains of Chlamydia trachomatis Inc proteins determine it's specific localization in HeLa cell culture // Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M I Vavilov, 20-22 September (2007), Kyiv, Ukraine, p 49

3 Levitskiy S A , Basovskiy Yu I, Shkarupeta M M , Kostrjukova E S , Lazarev VN Identification of putative translocation signal sequence for Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein IncC II Conference for young scientist, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M I Vavilov, 20-22 September (2007), Kyiv, Ukraine, p 71

4, Басовский Ю И , Шкарупета M М , Левицкий С А , Кострюкова Е С , Лазарев В Н, Говорун В М Гидрофобные домены определяют локализацию полноразмерных белков IncC, IncG С trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток HeLa // Бюллетень

экспериментальной биологии и медицины (2008) Т 145, №4, стр 402 -408

5 Шкарупета М М , Кострюкова Е С , Лазарев В Н , Левицкий С А , Басовский Ю И, Говорун В М Локализация Inc-белков С trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток линии HeLa // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (2008) Т 145, №8, стр 204 -210

6 Шкарупета М М , Кострюкова Е С , Басовский Ю И , Левицкий С А , Лазарев В Н Белок мембраны включения IncC С trachomatis транспортируется к плазматической мембране по секреторному пути при экспрессии его гена в культуре клеток линии HeLa // Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии, (2008), 15-16 сентября, Казань, Россия, стр 146

Заказ №277/10/08 Подписано в печать 01 10 2008 Тираж 80экз Уел пл 15

^ ч\ ООО "Цифровнчок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 , с/г ги , е-тт1 т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Басовский, Юрий Иванович

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1. Общая характеристика хламидий

1.1.1. Классификация хламидий, вызывающих патологии у человека

1.1.2. Жизненный цикл хламидий

1.1.2.1. Инфицирование клетки. Ранние события (0-6 15 часов)

1.1.2.2. Развитие инфекции. Завершение 18 внутриклеточного цикла (6-72часа)

1.1.3. Организации промоторных областей хламидий. Сигма 19 факторы

1.2. Белки мембраны включения.

1.2.1. Гены белков мембраны включения в структуре генома 21 хламидий.

1.2.2. Экспрессионный профиль генов, кодирующих Inc-белки 22 хламидий.

1.2.3. История открытия Inc-белков.

1.2.4. Классификация Inc-белков по профилю гидрофобности.

1.2.5. Система секреции III типа у хламидий. Взаимосвязь с Inc- 28 белками.

1.2.6. Функции Inc-белков.

1.2.6.1. IncA.

1.2.6.2. IncG.

1.2.6.3. СТ229.

1.3. Взаимодействие хламидий с системой везикулярного транспорта в 41 клетке. Экзоцитозный путь.

1.3.1. Динеин-зависимый транспорт хламидийных включений в область аппарата Гольджи по системе микротрубочек.

1.3.2. Экзоцитозный путь в клетке. Взаимодействие хламидийного включения с Rab GTP-азами.

1.3.3. Локализация Inc-белков при экспрессии кодирующих их 47 генов в эукариотических клетках.

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.1.1. Клеточные линии, бактериальные штаммы и плазмидные 51 векторы.

2.1.2. Реактивы.

2.1.3. Антитела и флуоресцентные красители.

2.1.4. Олигонуклеотиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение геномной ДНК С. trachomatis.

2.2.2. Выделение РНК из культуры клеток линии HeLa, 55 зараженных С. trachomatis.

2.2.3. Реакция обратной транскрипции.

2.2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности 56 фрагментов генов, кодирующих Inc-белки С. trachomatis.

2.2.6. Реакция рестрикции.

2.2.7. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.8. Реакция лигирования.

2.2.9. Культивирование клеточных культур Е. coli.

2.2.10. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.2.11. Выделение плазмидной ДНК.

2.2.12. Поиск потенциальных промоторных областей Inc-белков.

2.2.13. Спектрофлюориметрический анализ активности 58 промоторных областей Inc-белков в клетках Е. coli.

2.2.14. Экспрессия генов incB и incC в клетках E.coli.

2.2.15. Масс-спектрометрический анализ рекомбинантных белков 60 His-IncB и His-IncC.

2.2.16. Выделение рекомбинантных белков IncB, IncC из клеток 61 E.coli.

2.2.17. Выделение цитоплазматической и мембранной фракций 61 трансфицированных клеток линии HeLa.

2.2.18 Получение антител к рекомбинантным белкам IncB, IncC

С. trachomatis.

2.2.19 Иммуноблот.

2.2.20. Окрашивание антителами к IncB, IncC незараженной и 63 зараженной С. trachomatis культуры клеток линии HeLa.

2.2.21. Трансфекция клеток линии HeLa.

2.2.22. Конфокальная микроскопия.

2.2.23. Флуоресцентное окрашивание плазматической мембраны, 64 ЭПР и аппарата Гольджи эукариотических клеток.

2.2.24. Подсчет параметров ко-локализации.

2.2.25. Дополнительное программное обеспечение.

Глава III. Результаты исследования. 67 3.1. Организация промоторных областей Inc-белков С. trachomatis.

3.1.1. Предсказание промоторных областей для генов, 67 кодирующих Inc-белки С. trachomatis штамма D. incB-incC оперон.

3.1.2. Клонирование промоторных областей Inc-белков С. trachomatis серовара D. 3.1.3. Анализ активности и сравнение "силы" промоторных 71 областей Inc-белков в клетках E.coli. 3.2. Определение локализации гидрофильных и гидрофобных доменов 72 IncC, IncG С. trachomatis в культуре клеток линии HeLa. 3.2.1. Клонирование гидрофильных(Ш) и гидрофобных^оЬ) 74 доменов IncC, IncG С. trachomatis.

3.2.2. Определение локализации рекомбинантных гидрофильных 78 и гидрофобных доменов Inc-белков С. trachomatis при экспрессии их генов в культуре клеток линии Hela.

3.2.3. Выявление ко-локализации рекомбинантных гидрофобных 83 доменов IncC, IncG С. trachomatis с эукариотическими органеллами при экспрессии кодирующих их генов в клетках линии HeLa.

3.3. Получение антител к IncB, IncC С. trachomatis.

Глава IV. Обсуждение результатов исследования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная характеристика белков мембраны включения Chlamydia trachomatis"

Актуальность работы. Внутриклеточные паразиты -микроорганизмы, идеально приспособленные для обитания внутри эукариотической клетки. В ходе эволюционного процесса постоянное совершенствование механизмов проникновения, выживания и размножения привело к появлению множества способов для адаптации данных микроорганизмов внутри эукариотических клеток. Одной из приоритетных задач внутриклеточных паразитов после проникновения в клетку-мишень является модулирование процессов, позволяющих избежать элиминации защитной системой клетки, ее эндосомно-лизосомного аппарата. Данная задача эффективно и специфично решается различными группами паразитов. Некоторые из них паразитируют в клетках, лишенных лизосомного аппарата (эритроциты млекопитающих; Plasmodium), другие локализуются в цитоплазме эукариотических клеток {Shigella, Listeria, Rickettsia), однако жизненный цикл большинства внутриклеточных паразитов протекает в особых мембранных везикулах, которые они формируют при проникновении в клетки-мишени (Coxiella, Salmonella, Chlamydia, Legionella). Как правило, внутри таких везикул создается комфортное жизненное пространство, благоприятствующее дальнейшему развитию паразита.

Изучение взаимодействия внутриклеточных паразитов с клеткой-хозяином было и остается одной из самых сложных задач современной молекулярной микробиологии. Это объясняется особенностями культивирования, невозможностью применения классических генетических методов к некоторым микроорганизмам (Chlamydia), а также наличием у данных микроорганизмов большого числа патоген-специфических генов, не имеющих функциональных аналогов (Кострюкова с соавт. 2006). Как правило, продукты именно этих генов используются внутриклеточными паразитами для подчинения метаболических процессов клетки-хозяина. Механизмы подобного подчинения весьма разнообразны - внутриклеточные паразиты синтезируют различные макромолекулы, искусно имитирующие, либо модифицирующие процессы перестройки цитоскелета, функционирования различных сигнальных и метаболических путей в клетке-хозяине (Hackstadt et ah, 1998, 2000, Salcedo et ah, 2005). До сегодняшнего дня расшифровка механизмов данных взаимодействий остается весьма непростой задачей.

Chlamydia trachomatis - грам-отрицательная эубактерия, облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий ряд тяжелых заболеваний человека: трахому - поражение слизистой оболочки глаз, приводящее к слепоте, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы, являющиеся одними из самых распространенных инфекций, передающихся половым путем. При этом, течение болезни в большинстве случаев практически бессимптомно, что способствует ее быстрому распространению в популяции, а также, при отсутствии должной терапии, может привести к серьезным осложнениям - сальпингитам, эктопической беременности, бесплодию, что особенно опасно для репродуктивного здоровья женщин, а также хроническим заболеваниям мочеполового тракта у мужчин: уретритам, эпидимитам, хроническому простатиту (Allan et ah, 1983).

Хламидии обладают уникальным двухфазным жизненным циклом, который позволяет им отлично адаптироваться к паразитированию внутри эукариотической клетки. Внутриклеточный цикл развития С. trachomatis протекает внутри особой мембранной вакуоли, называемой включением. Мембрана включения модифицируется уникальными хламидийными белками, наиболее интересными из которых является семейство Inc-белков (inclusion proteins, белки включения).

Inc-белки обнаружены у всех видов хламидий, причем их аналоги отсутствуют у каких-либо других известных организмов. Данные белки значительно отличаются между собой по первичной структуре, однако для всех Inc-белков характерно наличие двудольного гидрофобного домена, протяженностью 50-80 аминокислот, который, возможно, и определяет их локализацию в мембране включения (Bannantine et al., 2000). Большинство Inc-белков являются белками ранней фазы инфекции, их гены экспрессируются в течение первых двух часов после заражения. Гидрофильные домены некоторых Inc-белков располагаются на цитоплазматической поверхности мембраны включения и фосфорилируются кпназами клетки-хозяина (Rockey et al., 2002). Вышеприведенные факты делают обоснованным предположение о ключевой роли Inc-белков в жизненном цикле развития хламидий и взаимодействии с эукариотической клеткой, что и привлекает к ним внимание исследователей.

Тем не менее, механизмы патогенеза хламидийной инфекции, а так же механизмы взаимодействия с эукариотической клеткой остаются малопонятными. На сегодняшний день известны только три хламидийных белка, секретируемые в цитоплазму клетки-хозяина в процессе инфекции -специфическая протеиназа CPAF (Zhong et al., 2001), п два потенциальных эффектора системы секреции III типа у хламидий: белок, вызывающий реорганизацию актина TARP (Clifton et al., 2004) и ССА00037, функции которого неизвестны (Subtil et al., 2005), при этом сама мембрана включения непроницаема для пассивного транспорта внутрь включения метаболитов размером более 520Да (Heinzen et al., 1997). Также мало исследованы механизмы, благодаря которым хламидия избегает действия защитных систем клетки, главным образом ее эндосомно-лизосомного аппарата. Известно лишь, что маркеров, характерных для поздних эндосом, в мембране включения не обнаружено (Wyrick et al., 2000). Для транспортировки внутри инфицированной клетки хламидия использует ее транспортные системы, в том числе с участием моторного белка динеина (Clausen et al., 1997), однако роль мембраны включения в этих процессах остается невыясненной.

Таким образом, учитывая огромное клиническое значение хламидий, а также их уникальность среди всех внутриклеточных паразитов, изучение их взаимодействия с эукариотическими клетками является актуальной задачей как с научной, так и с медицинской точек зрения. Более того, именно белки мембраны включения, на основании всех вышеперечисленных фактов, могут играть ключевую роль в процессах взаимодействия паразита с клеткой.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе реализован один из походов к выявлению структурно-функциональной организации генов и белков мембраны включения семейства Inc С. trachomatis, а так же их роли в жизненном цикле хламидий. В результате показана принадлежность генов incB и гпсС С. trachomatis к одному оперону, установлена локализация промоторных областей генов incA, и оперонов incBC, incDEFG в геноме хламидий. Для промоторов данных генов предсказаны точки начала транскрипции, а так же -10 и -35 консервативные области. Проведено сравнение их активности в гетерологичной системе Е. coli с применением репортерной системы на основе GFP.

В качестве объекта для исследования структурно-функциональной характеристики белков мембраны включения нами были выбраны белки мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG, относящиеся к белкам ранней фазы инфекции, гены которых начинают экспрессироваться в течениие первых двух часов после заражения клетки. Основываясь на данных структурного анализа Inc-белков и предполагаемого расположения в мембране, полученных с использованием программы SOSUI, нами была определена локализация их рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов, слитых с репортерной молекулой GFP в культуре клеток линии HeLa. Полученные данные показали, что локализация полноразмерных IncC, IncG полностью определяется их гидрофобными доменами. При этом, используя метод сайт-направленного мутагенеза, лишь частично удалось добиться изменения локализации IncG в клетке.- Локализация IncC оставалась неизменной.

Для подтверждения функциональной роли гидрофобного домена IncC в распределении полноразмерного белка в клетке были получены рекомбинантные плазмидные векторы, в составе которых ген гидрофобного домена IncC находился в одной рамке считывания с генами гидрофильных доменов IncB, IncE, IncG. После трансфекции культур клеток линии HeLa два из трех химерных белков распределялись сходно с полноразмерным IncC.

Для определения возможной сортирующей последовательности, локализованной в гидрофобном домене IncC и ответственной за специфичную локализацию белка в эукариотической клетке, данный домен был разбит на несколько участков, формирующих определенные вторичные структуры в белке. Распределение полученных составных белков в эукариотической клетке показало отсутствие их тропности к определенным клеточным органеллам, характерной для полноразмерного белка IncC. Таким образом, сопоставляя полученные данные с результатами исследования мутантных форм Inc-белков можно прийти к выводу, что по крайней мере для IncC не характерно наличие каких-либо сортирующих последовательностей, определяющих специфичную локализацию в клетке. Для специфичного распределения белка необходим полноразмерный гидрофобный домен, обладающий определенной структурой.

Так же были получены поликлональные мышиные антитела для белков ранней фазы инфекции IncB, IncC биологическая функция которых не известна. Полученные антитела могут использоваться в дальнейшем как дополнительный инструмент в исследованиях функциональной роли Inc-белков в жизненном цикле С. trachomatis.

Полученные данные по структурно-функциональной организации Inc-белков могут быть в дальнейшем использованы для определения их роли в патогенезе хламидийной инфекции, а также для поиска белков-партнеров. Расшифровка молекулярных механизмов взаимодействия с эукариотической клеткой может стать основой для разработки новых лекарственных препаратов для терапии хламидиозов.

Цель работы: Определение структурно-функциональной организация генов и белков мембраны включения С. trachomatis.

Задачи:

1. Определение структуры оперона, находящегося под контролем промотора гена incB С. trachomatis.

2. Поиск и клонирование промоторных областей генов белков мембраны включения incA, incBC, incDEFG С. trachomatis в плазмидный вектор с репортерной системой на основе гена gfp.

3. Компьютерное моделирование структуры промоторных областей генов incA, incBC, incDEFG С. trachomatis и определение их активности в клетках Е. coli.

4. Клонирование генов, кодирующих гидрофильные и гидрофобные домены белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С. trachomatis, в составе плазмидных векторов для их экспрессии в клетках линии HeLa.

5. Определение локализации рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С. trachomatis слитых с GFP в клетках линии HeLa.

6. Выявление ко-локализации гидрофобных доменов белков мембраны включения С. trachomatis с мембранными эукариотическими органеллами в клетках линии HeLa.

7. Получение антител к рекомбинантным полноразмерным белкам IncB, IncC.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Басовский, Юрий Иванович

Выводы:

1. Установлено, что гены incB, incC С. trachomatis принадлежат к одному оперону.

2. Промоторные области генов белков мембраны включения incA, incBC, incDEFG С. trachomatis клонированы в составе плазмидного вектора с репортерной системой на основе гена gfp. Определена их транскрипционная активность в клетках Е. coli.

3. Для экспрессии в линии клеток HeLa в составе плазмидных векторов клонированы гены, кодирующие гидрофильные и гидрофобные участки белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С. trachomatis.

4. Определена локализация рекомбинантных гидрофильных и гидрофобных доменов белков мембраны включения IncB, IncC, IncE, IncG С. trachomatis слитых с GFP в клетках линии HeLa и выявлена их ко-локализация с органеллами, составляющими экзоцитозный путь эукариотической клетки.

5. Получены поликлональные антитела к рекомбинантным полноразмерным белкам IncB, IncC С. trachomatis.

Заключение.

Chlamydia trachomatis - облигатный внутриклеточный паразит, вызывающий ряд тяжелых заболеваний человека: трахому, паховый лимфогранулематоз, урогенитальные хламидиозы, являющиеся одними из самых распространенных инфекций, передающихся половым путем. Механизмы взаимодействия данного возбудителя с клеткой-хозяином остаются практически неизвестными. По мнению большинства исследователей, ключевую роль в этом процессе могут играть уникальные белки хламидий - белки мембраны включения.

В настоящей работе применен подход по исследованию структурно-функциональных свойств генов и белков мембраны включения семейства Inc в Е. coli и эукариотических клетках HeLa.

Определена принадлежность генов incB, incC к одному оперону. • Произведен поиск промоторных областей гена incA, оперонов incBC, incDEFG rr показана гомология с высоко-консервативными -10 и -35 областями промоторов Е. coli in silico. Показана и сравнена активность этих промоторов в клетках Е. coli.

Благодаря использованию метода конфокальной микроскопии и эукариотических клеток HeLa удалось показать, что специфичная локализация рекомбинантных IncC, IncG С. trachomatis в эукариотической клетке определяется их гидрофобными доменами. Подтверждена способность гидрофобного домена IncC транспортировть к плазматической мембране не только молекулу репортера, но и гидрофильные домены IncB, IncE. Показано, что для локализации в цитоплазматической мембране необходим цельный гидрофобный домен IncC. Методом сайт-направленного мутагенеза incC, incG лишь частично удалось выявить аминокислоты, критичные для специфичного распределения белка в клетке. Полученные данные по локализации рекомбинантных гидрофобных доменов Inc-белков подтверждены определением ко-локализации полученных белков с клеточными органеллами, составляющими экзоцитозный путь в клетке.

Таким образом, на примере IncC показано, что взаимодействие гидрофобных доменов Inc-белков с органеллами экзоцитозного пути в клетке требует корректно свернутой полноразмерной молекулы гидрофобного домена. Отдельные специфические сигнальные мотивы для IncC не обнаружены. Полученные данные могут использоваться для характеристики структурно-функциональных взаимодействий Inc-белков с эукриотической клеткой.

Также получены поликлональные антитела к белкам ранней фазы инфекции с использованием для этой цели полноразмерных рекомбинантных белков IncB, IncC. Таким образом, получен допонительный инструмент для характеризации роли Inc-белков в жизненном цикле хламидий.

Все эти данные, возможно, в дальнейшем позволят охарактеризовать взаимодействие Inc-белков с белками-партнерами в эукариотической клетке. Понимание молекулярных механизмов таких взаимодействий будет способствовать разработке новых эффективных препаратов для терапии хламидийной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Басовский, Юрий Иванович, Москва

1. Е.С. Кострюкова, В.Н. Лазарев, Г.А. Титова, Т.А. Акопиан, С.А. Левицкий, В.М. Говорун. Экспрессия генов белков мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli. // Биохимия, 2006, Т. 71, №3, стр. 333-340.

2. Allan I., Pearce J.H. Amino acid requirements of strains of Chlamydia trachomatis and C. psittaci growing in McCoy cells: relationship with clinical syndrome and host origin // J. Gen. Microbiol., 1983, vol. 129(7), pp. 20012007.

3. Anderson D.M., Schneewind O. Yersinia enterocolitica type III secretion: an mRNA signal that couples translation and secretion of YopQ // Mol. Microbiol., 1999a, vol. 31, pp. 1139-1148.

4. Alzhanov D., Barnes J., Hruby D.E., Rockey D.D. Chlamydial development is blocked in host cells transfected with Chlamydophila caviae incA. // BMC Microbiol., 2004, vol. 4, pp. 24-34.

5. Banik U., Wang G.A., Wagner P.D., Kaufman S. Interaction of phosphorylated tryptophan hydroxylase with 14-3-3 proteins. // J. Biol. Chem. 1997, vol. 272(42), pp. 26219-26225.

6. Bannantine J.P., Griffiths R.S., Viratyosin W., Brown W.J., Rockey D.D. A secondary structure motif predictive of protein localization to the chlamydial inclusion membrane. // Cell. Microbiol., 2000, vol. 2, pp. 35-47.

7. Bannantine J.P., Rockey D.D., Hackstadt T. Tandem genes of Chlamydia psittaci that encode proteins localized to the inclusion membrane // Mol. Microbiol., 1998a., vol. 28, pp. 1017-1026.

8. Bannantine J.P., Stamm W.E., Suchland R.J., Rockey D.D. Chlamydia trachomatis IncA is localized to the inclusion membrane and is recognized by antisera from infected humans and primates // Infect. Immun., 19986, vol. 66, pp. 6017-6021.

9. BaiT F.A. A novel Rab6-interacting domain defines a family of Golgi-targeted coiled-coil proteins // Curr. Biol., 1999, vol. 9(7), pp. 381-384.

10. Bavoil P. M., R. Hsia. Type III secretion in Chlamydia: a case of de ja" vu? // Mol. Microbiol., 1998, vol. 28, pp. 859-862.

11. Bavoil P., Ohlin A., Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 1984, vol. 44, pp. 479^185.

12. Beraud-Dufour S., Balch W. A journey through the exocytic pathway. // J. Cell Sci., 2002, vol. 115(Pt 9), pp. 1779-1780.

13. Birkelund S., Johnsen H., Christiansen G. Chlamydia trachomatis serovar L2 induces protein tyrosine phosphorylation during uptake by HeLa cells // Infect. Immun., 1994, vol. 62, pp. 4900-4908.

14. Boone C.W., Ford L.E., Bond H.E., Stuart D.C., Lorenz D. Isolation of plasma membrane fragments from HeLa cells. // J. Cell Biol., 1969, vol. 41(2), pp. 378-92.

15. Brunet A., Bonni A., Zigmond M.J., Lin M.Z., Juo P., Hu L.S., Anderson M.J., Arden K.C., Blenis J., Greenberg M.E. Akt promotes cell survival byphosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. // Cell. 1999, vol. 96(6), pp. 857-868.

16. Byrne G.I., Moulder J.W. Parasite-specified phagocytosis of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis by L and HeLa cells // Infect. Immun., 1978, vol. 19, pp. 598-606.

17. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 1981, vol. 31, pp. 1161-1176.

18. Carabeo R. A., Grieshaber S. S., Fischer E. Hackstadt T. Chlamydia trachomatis induces remodeling of the actin cytoskeleton during attachment and entry into HeLa cells // Infect. Immun., 2002, vol. 70, pp. 3793-3803.

19. Carabeo R.A., Grieshaber S.S., Hasenkrug A., Dooley C., Hackstadt T. Requirement for the Rac GTPase in Chlamydia trachomatis invasion of non-phagocytic cells // Traffic, 2004, vol. 5(6), pp. 418-425.

20. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science, 1994, vol. 263(5148), pp. 802-805.

21. Clausen J.D., Christiansen G., Hoist H.U., Birkelund S. Chlamydia trachomatis utilizes the host cell microtubule network during early events of infection // Mol. Microbiol., 1997, vol. 25, pp. 441-449.

22. De Matteis M.A., Morrow J.S. Spectrin tethers and mesh in the biosynthetic pathway. // J. Cell Sci., 2000, vol. 113 ( Pt 13), pp. 2331-2343.

23. Douglas A.L., Hatch T.P. Mutagenesis of the P2 promoter of the major outer membrane protein gene of Chlamydia trachomatis. // J. Bacterid., 1996, vol. 178(19), pp.5573-5578.

24. Emre U., Sokolovskaya N., Roblin P.M., Schachter J., Hammerschlag M.R. Detection of anti-Chlamydia pneumoniae IgE in children with reactive airway disease // J. Infect. Dis., 1995, vol. 172(1) pp. 265-267.

25. Engel J.N., Ganem D. A polymerase chain reaction-based approach to cloning sigma factors from eubacteria and its application to the isolation of a sigma-70 homolog from Chlamydia trachomatis.// J. Bacterid., 1990, vol. 172(5), pp. 2447-2455.

26. Fahr M.J., Douglas A.L., Xia W., Hatch T.P. Characterization of late gene promoters of Chlamydia trachomatis. // J. Bacteriol. 1995, vol. 177(15), pp. 4252-4260.

27. Fantl W.J., Muslin A.J., Kikuchi A., Martin J.A., MacNicol A.M., Gross R.W., Williams L.T. Activation of Raf-1 by 14-3-3 proteins. //Nature. 1994, vol. 371(6498), pp.612-614.

28. Fawaz F.S., van Ooij C., Homola E., Mutka S.C., Engel J.N. Infection with Chlamydia trachomatis alters tyrosine phosphorylation and/or localization of several host cell proteins including cortactin // Infect. Immun., 1997, vol. 65, pp. 5301-5308.

29. Feilmeier B.J., Iseminger G., Schroeder D., Webber H., Phillips G.J. Green fluorescent protein functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli II J. Bacteriol., 2000, vol. 182(14), pp. 4068-4076.

30. Fields K.A., Fischer E.R., Hackstadt T. Inhibition of fusion of Chlamydia trachomatis inclusions at 32 degrees С correlates with restricted export of IncA // Infect. Immun., 20026, vol. 70(7), pp. 3816-3823.

31. Fields K.A., Hackstadt T. Evidence for the secretion of Chlamydia trachomatis CopN by a type III secretion mechanism Mol. Microbiol., 2000, vol. 38, pp. 1048-1060.

32. Fields K.A., Hackstadt T. The chlamydial inclusion: Escape from the Endocytic Pathway // Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 2002a, vol. 18, pp. 221-245

33. Fields K.A., Mead D.J., Dooley C.A. Hackstadt T. Chlamydia trachomatis type III secretion: evidence for a functional apparatus during early-cycle development// Mol. Microbiol., 2003, vol. 48 (3), pp. 671-683.

34. Fischer S.F., Vier J., Kirschnek S., Klos A., Hess S., Ying S., Hacker G. Chlamydia inhibit host cell apoptosis by degradation of proapoptotic BH3-only proteins // J. Exp. Med., 2004, vol. 200(7), pp. 905-916.

35. Friis R.R. Interaction of L cells and Chlamydia psittaci: entry of the parasite and host responses to its development // J. Bacterid., 1972, vol. 110, pp. 706721.

36. Fu H., Subramanian R.R., Masters S.C. 14-3-3 Proteins: Structure, Function and Regulation // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2000, vol. 40, 617-647.

37. Gelperin D., Weigle J., Nelson K., Roseboom R., Irie K., Matsumoto K., Lemmon S. 14-3-3 proteins: potential roles in vesicular transport and ras signalling in Saccharomyces cerevisiae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92, pp. 11539-11543.

38. Grayston J.T., Aldous M.B., Easton A., Wang S.P., Kuo C.C., Campbell L.A., Altman J. Evidence that Chlamydia pneumoniae causes pneumonia and bronchitis // J. Infect Dis., 1993, vol. 168(5), pp. 1231-1235.

39. Grieshaber S. S., Grieshaber N. A., Hackstadt T. Chlamydia trachomatis utilizes host cell dynein to traffic to the microtubule-organizing center in a p50 dynamitin-independent process // J. Cell. Sci., 2003, vol. 116, pp. 37933802.

40. Grystone J.T. Infections caused by Chlamydia pneumoniae strain TWAR // Clin. Infect. Dis, 1992, vol. 15(5), pp. 757-761.

41. Gu L., Wenman W.M., Remacha M., Meuser R., Coffin J., Kaul R. Chlamydia trachomatis RNA polymerase alpha subunit: sequence and structural analysis. // J. Bacterid., 1995, vol. 177(9), pp. 2594-2601.

42. Hackstadt T. Redirection of host vesicle trafficking pathways by intracellular parasites // Traffic, 2000, vol. 1, pp. 93-99.

43. Hackstadt T. The diverse habitats of obligate intracellular parasites // Curr. Opin. Microbiol., 1998, vol.1, pp. 82-87.

44. Hackstadt Т., Fischer E.R., Scidmore M.A., Rockey D.D., Heinzen R.A. Origins and functions of the chlamydial inclusion // 1997, Trends Microbiol., vol. 5, pp. 288-293.

45. Hackstadt Т., M. Scidmore-Carlson A., Dooley C. A. Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein required for intracellular development // Mol. Biol. Cell., 1999a, 10(Suppl. S):182A.

46. Hackstadt Т., Scidmore-Carlson M.A., Shaw E.I., Fischer E.R. The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic fusion // Cell. Microbiol., 19996, vol. l,pp. 119-130.

47. Hahn D.L., Dodge R.W., Golubjatnicov R. Association of Chlamydia pneumoniae (strain TWAR) infection with wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma // JAMA, 1991, vol. 266(2), pp. 225-230.

48. Hambrock A., Loffler-Walz C, Quast U. Glibenclamide binding to sulphonylurea receptor subtypes: dependence on adenine nucleotides // Br. J. Pharmacol, 2002, vol. 136(7), pp. 995-1004.

49. Hanahan D.G. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol., 1983, vol. 166(4), pp. 557-580.

50. Hanson M.R., Kohler R.H. GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants // J. Exp. Bot, 2001, vol. 52(356), pp. 529-539.

51. Hatch T.P, Allan I, Pearce J.H. Structural and polypeptide differences between envelopes of infective and reproductive life cycle forms of Chlamydia spp // J. Bacterid., 1984, vol. 157, pp. 13-20.

52. Hatch T.P, Miceli M, Sublett J.E. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during the developmental cycle of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. // J Bacterid, 1986, vol. 165(2), pp. 379-385.

53. Heinzen R. A, Hackstadt T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecularweight compounds // Infect. Immun, 1997, vol. 65, pp. 1088-1094.

54. Heinzen R.A, Scidmore M.A, Rockey D.D, Hackstadt T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis // Infect. Immun,1996, vol. 64, pp. 796-809.

55. Hirokawa N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. // Science, 1998, vol. 279(5350), pp. 519-526.

56. Ho T.D, Starnbach M.N. The Salmonella enterica serovar typhimurium-encoded type III secretion systems can translocate Chlamydia trachomatis proteins into the cytosol of host cells // Infect. Immun, 2005, vol. 73(2), pp. 905-911.

57. Hsia R.C, Pannekoek Y, Ingerowski E, Bavoil P.M. Type III secretion genes identify a putative virulence locus of Chlamydia II Mol. Microbiol,1997, vol. 25, pp. 351-359.

58. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, vol. 62(2), pp. 379433.

59. Huh W.K., Falvo J.V., Gerke L.C., Carroll A.S., Howson R.W., Weissman J.S., O'Shea E.K. Global analysis of protein localization in budding yeast // Nature, 2003, vol. 425, pp. 686-691.

60. Ishihama A. Promoter selectivity of prokaryotic RNA polymerases. // Trends Genet., 1988 vol. 4(10), pp. 282-286.

61. Jarhede TK, Le Henaff M, Wieslander A. Expression of foreign genes and selection of promoter sequences in Acholeplasma laidlawii. Microbiology., 1995, vol. 141 ( Pt 9), pp. 2071-2079.

62. Jones D.H., Ley S., and Aitken A. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. // FEBS Microbiol. Lett., 1995, vol. 368, pp. 55-58.

63. Kalman S., Mitchell W., Marathe R., Lammel C., Fan J., Hyman R.W., Olinger L., Grimwood J., Davis R.W., Stephens R.S. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis II Nat. Genet., 1999, vol. 21(4), pp. 385-389.

64. Kauppi A.M., Nordfelth R., Uvell H., Wolf-Watz H., Elofsson M. Targeting bacterial virulence: inhibitors of type III secretion in Yersinia. // Chem. Biol. 2003, vol. 10(3) pp.241-249.

65. Knudsen K., A. S. Madsen, P. Mygind, G. Christiansen, S. Birkelund. Identification of two novel genes encoding 97- to 99-kilodalton outer membrane proteins of Chlamydia pneumoniae II Infect. Immun., 1999, vol. 67, pp. 375-383.

66. Lambden P.R., Everson J.S., Ward M.E., Clarke I.N. Sulfur-rich proteins of Chlamydia trachomatis: developmentally regulated transcription of polycistronic mRNA from tandem promoters. // Gene. 1990, vol. 87(1), pp. 105-112.

67. Laurila A.L., Von Hertzen L., Saikku P. Chlamydia pneumoniae and chronic lung diseases // Scand. J. Infect. Dis. Suppl., 1997, vol. 104, pp. 34-36.

68. Liu H.S., Jan M.S., Chou C.K., Chen P.H., Ke N.J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells? // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, vol. 260(3), pp. 712-717.

69. Liu, D, Bienkowska J., Petosa C., Collier R.J., Fu H., Liddington R. Crystal structure of the zeta isoform of the 14-3-3 protein. // Nature 1995, vol. 376, pp. 191-194.

70. Lloyd, S.A. Targeting exported substrates to the Yersinia TTSS: different functions for different signals? // Trends Microbiol. 2001, vol. 9, pp. 367-371

71. Lonetto M., Gribskov M., Gross CA. The sigma 70 family: sequence conservation and evolutionary relationships. // J. Bacterid., 1992 vol. 174(12), pp. 3843-3849.

72. Longbottom D., J. Findlay, E. Vretou, S. M. Dunbar. Immunoelectron microscopic localisation of the OMP90 family on the outer membrane surface of Chlamydiapsittaci IIFEMS Microbiol. Lett., 1998, vol. 164, pp. 111-117.

73. Longbottom D., Russell M., Jones G.E., Lainson F.A., Herring A.J. Identification of a multigene family coding for the 90 kDa proteins of the ovine abortion subtype of Chlamydia psittaci II FEMS Microbiol. Lett., 1996, vol. 142(2-3), pp. 277-281.

74. Majeed M., Kihlstrom E. Mobilization of F-actin and clatlirin during redistribution of Chlamydia trachomatis to an intracellular site in eucaryotic cells // Infect. Immun., 1991, vol. 59, pp. 4465-4472.

75. Manders E.M.M, Verbeek F.J. Aten J.A. Measurement of co-localization of object in dual-colour confocal images // J. Microscop., 1993, vol. 169, pp. 375-382.

76. Martoglio В., Dobberstein В. Signal sequences: more than just greasy peptides. // Trends Cell Biol., 1998, vol. 8(10), pp. 410-415.

77. Mathews S.A., Sriprakash K.S. The RNA polymerase of Chlamydia trachomatis has a flexible sequence requirement at the -10 and -35 boxes of its promoters. //J. Bacteriol., 1994, vol. 176(12), pp.3785-3789.

78. Melgosa M.P., Kuo C.C., Campbell L.A. Outer membrane complex proteins of Chlamydia pneumoniae // FEMS Microbiol. Lett., 1993, vol. 112, pp.199204.

79. Moran C.P. Jr., Lang N., LeGrice S.F., Lee G., Stephens M., Sonenshein A.L., Pero J., Losick R. Nucleotide sequences that signal the initiation of transcription and translation in Bacillus subtilis. // Mol. Gen. Genet., 1982, vol. 186(3), pp. 339-346.

80. Newhall W.J.V., Jones R.B. Disulfidelinked oligomers of the major outer membrane protein of chlamydiae // J. Bacteriol., 1983, vol. 154, pp. 9981001.

81. Nicholson T.L., Olinger L., Chong K., Schoolnik G., Stephens R.S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis И J. Bacterid., 2003, vol. 185(10), pp. 3179-3189.

82. Nordfelth R., Kauppi A.M., Norberg H.A., Wolf-Watz H., Elofsson M. Small-molecule inhibitors specifically targeting type III secretion. // Infect. Immun. 2005, vol. 73(5), pp. 3104-3114.

83. Peeleng R.W., Brunham R.C. Chlamydiae as pathogens: new species and new issues // Emerg. Infect. Dis., 1996, vol. 2(4), pp. 307-319.

84. Pfeffer S.R. Transport-vesicle targeting: tethers before SNAREs. // Nat. Cell Biol., 1999, vol. 1(1), pp. E17-22.

85. Chlamydophila caviae (Chlamydia psittaci GPIC): examining the role of niche-specific genes in the evolution of the Chlamydiaceae II Nucleic. Acids. Res., 2003, vol. 31(8), pp. 2134-2147.

86. Rockey D.D., Heinzen R.A., Hackstadt T. Cloning and characterization of a Chlamydia psittaci gene coding for a protein localized in the inclusion membrane of infected cells //Mol. Microbiol., 1995, vol. 15, pp. 617-626.

87. Rockey D.D., Lenart J., Stephens R.S., 2000, Genome sequencing and our understanding of chlamydiae. Infect. Immun. 68(10): 5473-5479.

88. Rockey D.D., Marci A. Scidmore M. A., John P. Bannantine J. P., Wendy J. Brown W. J. Proteins in the chlamydial inclusion membrane // Microb. Infect., 2002a, vol. 4, pp. 333-340.

89. Rockey D.D., Viratyosin W., Bannantine J.P., Suchland R.J., Stamm W.E. Diversity within inc genes of clinical Chlamydia trachomatis variant isolates that occupy non-fusogenic inclusions // Microbiology, 20026, vol. 148, pp. 2497-2505.

90. Rosqvist R, Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz H. Functional conservation of the secretion and translocation machinery for virulence proteins of yersiniae, salmonellae and shigellae // EMBO J., 1995, vol. 14, pp. 4187-4195.

91. Ross W., Gosink K.K., Salomon J., Igarashi K., Zou C., Ishihama A., Severinov K., Gourse R.L. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. // Science., 1993, vol. 262(5138), pp. 1407-1413.

92. Rzomp K. A., Scholtes L. D., Briggs B. J., Whittaker G. R., Scidmore M. A. Rab GTPases are recruited to chlamydial inclusions in both a species-dependent and species-independent manner // Infect. Immun., 2003, vol. 71, pp. 5855-5870.

93. Rzomp K.A., Moorhead A.R., Scidmore M.A. The GTPase Rab4 interacts with Chlamydia trachomatis inclusion membrane protein CT229 // Infect. Immun., 2006, vol. 74(9), pp. 5362-5373.

94. Salcedo S.P, Holden D.W. Bacterial interactions with the eukaiyotic secretoiy pathway // Curr. Opin. Microbiol, 2005, vol. 8, pp. 92-98

95. Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989.

96. Scales S.J, Chen Y.A., Yoo B.Y, Patel S.M, Doung Y.C, Scheller R.H. SNAREs contribute to the specificity of membrane fusion. // Neuron, 2000, vol. 26(2), pp. 457-464.

97. Schaumburg C.S, Tan M. Mutational analysis of the Chlamydia trachomatis dnaK promoter defines the optimal -35 promoter element. Nucleic Acids Res, 2003, vol. 31(2), pp.551-555.

98. Schramm N, Wyrick P.B. Cytoskeletal requirements in Chlamydia trachomatis infection of host cells // Infect. Immun, 1995, vol. 63, pp. 324332.

99. Scidmore M. A, Hackstadt T. Mammalian 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG // Mol. Microbiol, 2001, vol. 39(6), pp.1638-1650.

100. Scidmore M.A., Fischer E.R., Hackstadt T. Restricted fusion of Chlamydia trachomatis vesicles with endocytic compartments during the initial stages of infection // Infect. Immun., 2003, vol. 71(2), pp. 973-984.

101. Scidmore-Carlson M. A., Shaw E. I., Dooley C.A., Fischer E. R., Hackstadt T. Identification and characterization of a Chlamydia trachomatis early operon encoding four novel inclusion membrane proteins // Mol. Microbiol., 1999, vol. 33(4), pp. 753-765.

102. Shaw E.I., Dooley C.A., Fischer E.R., Scidmore M.A., Fields K.A., Hackstadt T. Three temporal classes of gene expression during the Chlamydia trachomatis developmental cycle // Mol. Microbiol., 2000, vol. 37, pp. 913— 925.

103. Shor A., Kuo C.C., Patton D.L. Detection of Chlamydia pneumoniae in coronary arterial fatty streaks and atheromatous plaques // S. Afr. Med. J., 1992, vol. 82(3), pp. 158-161.

104. Sisko J.L., Spaeth K., Kumar Y., Valdivia R.H. Multifunctional analysis of Chlamydia -specific genes in a yeast expression system // Mol. Microbiol., 2006, vol. 60(1), pp. 51-66.

105. Slepenkin A., Motin V., de la Maza L. M., Peterson E. M. Interaction between components of the type III secretion system of Chlamydiaceae II J. Bacterid., 2005, vol. 187(2), pp. 473-479.

106. Stamnes M. Regulating the actin cytoskeleton during vesicular transport. // Curr. Opin. Cell Biol., 2002, vol. 14(4), pp. 428-433.

107. Subtil A., Blocker A., Dautry-Varsat A. Type III secretion system in Chlamydia species: identified members and candidates // Microbes Infect., 2000, vol. 2(4), pp. 367-369.

108. Subtil A., Parsot C., Dautry-Varsat A. Secretion of predicted Inc proteins of Chlamydia pneumoniae by a heterologous type III machinery // Mol. Microbiol., 2001, vol. 39(3), pp. 792-800.

109. Suchland R. J., Rockey D. D., Bannantine J. P. Stamm W. E. Isolates of Chlamydia trachomatis that occupy nonfusogenic inclusions lack IncA, a protein localized to the inclusion membrane // Infect. Immun., 2000, vol. 68, pp. 360-367.

110. Suchland R.J., Rockey D.D., Weeks S.K., Alzhanov D.T., Stamm W.E. Development of Secondary Inclusions in Cells Infected by Chlamydia trachomatis II Infect. Immun., 2005, vol. 73(7), pp. 3954-3962.

111. Tan M., Engel J.N. Identification of sequences necessary for transcription in vitro from the Chlamydia trachomatis rRNA PI promoter. // J. Bacteriol., 1996, vol. 178(23), pp.6975-6982.

112. Tan M., Gaal Т., Gourse R.L., Engel J.N. Mutational analysis of the Chlamydia trachomatis rRNA P1 promoter defines four regions important for transcription in vitro. // J. Bacteriol., 1998, vol. 180(9), pp.2359-2366.

113. Thorn D.H., Grayston J.T., Siskovick D.S., Wang S.P.,Weiss N.S., Daling J.R. Association of prior infection with Chlamydia pneumoniae and angiographically demonstrated coronary artery disease // JAMA, 1992, vol. 268(1), pp. 68-72.

114. Thorson J.A., Yu L.W., Hsu A.L., Shih N.Y., Graves P.R., Tanner J.W., Allen P.M., Piwnica-Worms H., Shaw A.S. 14-3-3 proteins are required formaintenance of Raf-1 phosphorylation and kinase activity. // Mol. Cell Biol. 1998, vol. 18(9), pp. 5229-5238.

115. Toh H., Miura K., Shirai M., Hattori M In silico Inference of Inclusion Membrane Protein Family in Obligate Intracellular Parasites Chlamydiae // DNA Research, 2003, vol. 10, pp. 9-17.

116. Verbeke P., Welter-Stahl L., Ying S., Hansen J., Hacker G., Darville Т., Ojcius D.M. Recruitment of BAD by the Chlamydia trachomatis vacuole correlates with host-cell survival. // PLoS Pathog., 2006, vol. (5):e45.

117. Waldo G.S., Standish B.M., Berendzen J., Terwilliger T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein // Nat. Biotechnol., 1999, vol. 17(7), pp. 691-695.

118. Ward M.E., Murray A. Control mechanisms governing the infectivity of Chlamydia trachomatis for HeLa cells: mechanisms of endocytosis // J. Gen. Microbiol., 1984, vol. 130, pp. 1765- 1780.

119. Wright C.S. Structural comparison of the two distinct sugar binding sites in wheat germ agglutinin isolectin II // J. Mol. Biol., 1984, vol. 178(1), pp. 91104.

120. Wylie J.L., Hatch G.M., McClarty G. Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis II J. Bacterid., 1997, vol. 179, pp. 7233-7242.

121. Wyrick P.B., Choong J., Davis C.H., Knight S.T., Royal M.O., Maslow A.S., Bagnell CR. Entry of Chlamydia trachomatis into polarized human epithelial cells // Infect. Immun., 1989, vol. 57, pp. 2378-2389.

122. Wyrick P.B., Intracellular survival by Chlamydia II Cell. Microbiol., 2000, vol. 2(4), pp. 275-282.

123. Xiao В., Smerdon S.J., Jones D.H., Dodson G.G., Soneji Y., Aitken A., Gamblin S.J. Structure of a 14-3-3 protein and implications for coordination of multiple signalling pathways. // Nature, 1995, vol. 376, pp.188-191.

124. Yang F., Moss L.G., Phillips Jr. The molecular structure of green fluorescent protein//Nat. Biotechnol., 1996, vol. 14, pp. 1246-1251.

125. Yang J., Winkler K., Yoshida M., Kornbluth S. Maintenance of G2 arrest in the Xenopus oocyte: a role for 14-3-3-mediated inhibition of Cdc25 nuclear import. // EMBO J., 1999, vol. 18(8), pp. 2174-83.

126. Zerial M., McBride H. Rab proteins as membrane organizers. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2001, vol. 2(2), pp. 107-117.

127. Zha J., Harada H., Yang E., Jockel J., Korsmeyer S.J. Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L) // Cell. 1996, vol. 87(4), pp. 619-628.

128. Zhong G., Fan P., Ji H., Dong F., Huang Y. Identification of a chlamydial protease-like activity factor responsible for the degradation of host transcription factors // J. Exp. Med., 2001, vol. 193, pp.935-942.