Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis"

На правах рукописи

Кост Елена Андреевна

Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis.

03. 02. 03 - микробиология

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических наук

2 и MAP 20 и

Москва - 2014

005546152

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Зигангирова Наиля Ахатовна

доктор медицинских наук Диденко Любовь Васильевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бондаренко Виктор Михайлович

руководитель лаборатории генетики вирулентности бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

кандидат медицинских наук Жуховицкий Владимир Григорьевич

Заведующий клинико-диагностической лабораторией ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента Здравоохранения г. Москвы

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый Московский

государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России

Защита состоится «28» марта 2014 года в 11:00 на заседании диссертационного совета Д 208.13.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу г. Москва, ул. Гамалеи д.18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

Автореферат разослан «26» февраля 2014г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

Доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Актуальность

Хламидии относятся к грамотрицательным бактериям со сложным жизненным циклом и являются облигатными внутриклеточными паразитами. В семействе Chlamydiaceae, возбудителями заболеваний человека являются -Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, и Chlamydophila psittaci. [Everett et al. 1999]

В структуре бактериальных инфекционных заболеваний, передающихся половым путем (ИППП), хламидийная инфекция, вызываемая С.trachomatis, занимает первое место (приблизительно 100 млн новых случаев в год), при стабильной тенденции к увеличению числа вновь инфицированных (WHO CISID). Несвоевременная диагностика острых случаев урогенитального хламидиоза и, соответственно, отсутствие специфического лечения приводит к хронизации инфекционного процесса. Хронические урогенитальные хламидиозы рассматриваются как этиологический фактор синдрома Рейтера, воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин, простатитов, стриктуры уретры, орхоэпидемимитов у мужчин, что может приводить к развитию женского и мужского бесплодия, и являться фактором риска в развитии реактивных артритов, патологии беременности. [Dean D. 2009]. Помимо этого системное воспаление может приводить к развитию ожирения и диабета II типа. В настоящее время существующие методы профилактики и лечения урогенитальных хламидиозов не являются оптимальными. Применяемые для лечения этой инфекции антибиотики, как правило, не предотвращают развитие хронического инфекционного процесса и неэффективны при лечении последнего [Chang et al., 2008].

В связи с этим актуальной задачей является поиск новых препаратов, направленных на эрадикацию возбудителей хламидиозов.

В последнее время для разработки антибактериальных препаратов нового поколения применяется технология мишень-направленного поиска лекарственных средств [Гинцбург A.JL, и др. 2009, Kline et al., 2012]. Эта технология включает в себя следующие этапы:

- выбор в качестве мишеней для действия ингибиторов бактериальных белковых молекул или структур, ответственных за реализацию вирулентных свойств микроорганизма, с последующим поиском специфических ингибиторов с помощью специализированных компьютерных программ;

- применение методов органического синтеза для получения активных веществ или использование природных соединений;

- экспериментальное тестирование биологической активности в отношении возбудителя инфекционного процесса в модельных системах in vitro и in vivo;

- определение безопасности применения новых препаратов.

Одним из ключевых механизмов, определяющих развитие инфекционного процесса, является транслокация белковых факторов патогенности непосредственно в эукариотические клетки организма-хозяина. Система, обеспечивающая транспорт бактериальных белков в эукариотическую клетку посредством «молекулярного шприца», получила название система секреции III типа (ССТТ). [Зигангирова Н.А. и др., 2012] «Молекулярный шприц» формируется только у патогенных бактерий, с различными типами паразитизма

[Beeckman D.S et al., 2010, Бондаренко и др., 2002]. По данным ряда авторов ССТТ реализует комплекс процессов, подавляющих защитные механизмы эукариотических клеток по отношению к хламидиям, обеспечивая им возможность внутриклеточного размножения [Galán, Collmer 1999; Ghosh 2004]

В настоящее время известно несколько ингибиторов ССТТ, относящихся к различным классам низкомолекулярных соединений, которые были отобраны методами высокопроизводительного скрининга библиотек химических соединений [Wang D. et al., 2011, Slepenkin A. et al., 2011]. Общими недостатком этих соединений являются: плохая растворимость в органических растворителях и/или воде; токсичность в отношении клеточных культур млекопитающих (гибель до 60% клеток в присутствии специфической ингибирующей концентрации в 50мкМ). Наличие столь существенных недостатков ограничивает возможности их дальнейшей разработки для использования в качестве антибактериальных препаратов.

На основе технологии мишень-ориентированного поиска новых антихламидийных препаратов, разработанной в лаборатории хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, были получены новые ингибиторы ССТТ хламидий, относящиеся к классу тиогидразидов оксаминовых кислот. В предварительных исследованиях была выявлена ингибирующая активность в отношении хламидий. У полученных ингибиторов ССТТ имеется ряд преимуществ по сравнению с ранее синтезированными соединениями:

- минимальное повреждающее действие на эукариотические клетки в условиях in vitro-,

- хорошая растворимость в воде и органических растворителях;

- высокая стабильность.

Совокупность вышеперечисленных свойств полученных препаратов ингибиторов ССТТ хламидий определила целесообразность их дальнейшего детального изучения в условиях экспериментальной хламидийной инфекции. В связи с вышеизложенным была сформулирована цель настоящего исследования:

Изучить влияние нового ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis, в условиях in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие нового низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа на разные этапы жизненного цикла C.trachomatis в условиях in vitro.

2. Оценить влияние ингибитора на субмикроскопическую организацию элементарных, ретикулярных телец и персистирующих форм хламидий.

3. Охарактеризовать специфичность подавления ингибитором функциональной активности ССТТ C.trachomatis.

4. Провести анализ экспрессии генов, кодирующих структурные и эффекторные белки ССТТ C.trachomatis, при продуктивной и персистентной инфекции.

5. Изучить действие ингибитора ССТТ на жизнеспособность эукариотических клеток и некоторых представителей нормальной микрофлоры.

Научная новизна

Для представителя нового класса ингибиторов ССТТ, низкомолекулярного соединения, полученного на основе тиодиазинонов, впервые получена детальная микробиологическая, морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика действия ингибитора на развитие С.trachomatis в культуре клеток. Впервые получены характеристики зависимого от дозы препарата ингибирования внутриклеточного размножения возбудителя и показана его эффективность в отношении блокирования формирования инфекционных форм патогена. Показана специфичность действия соединения на транслокацию эффекторных белков хламидий и экспрессию генов, кодирующих структурные белки ССТТ.

Впервые продемонстрирована роль ССТТ хламидий на этапе первичного взаимодействия с клеткой - мишенью, обеспечивая проникновение хламидий в клетку. Показано, что на внутриклеточной стадии развития хламидий эффекторные белки ССТТ участвуют в трансформации мембраны фагосомы, в регуляции роста, деления и дифференциации в инфекционные элементарные тельца

Впервые показано, что при персистенции экспрессируются гены ССТТ, что указывает на участие этого секреторного аппарата в обеспечении жизнедеятельности персистирующих форм. Действие ингибитора приводило к снижению активности экспрессии генов, кодирующих структурные белки ССТТ при отсутствии действия на консервативные гены, что находится в полном соответствии с механизмом действия ингибитора. На модели персистентной инфекции было впервые продемонстрировано, что ингибиторы ССТТ вызывают дезорганизацию персистирующих форм и блокируют процесс их реверсии в типичные инфекционные формы, что, в конечном счете, прекращает развитие инфекционного процесса при его хроническом течении.

Практическая значимость

В рамках выполнения научной тематики ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, направленной на разработку новых антибактериальных препаратов, проведено изучение механизма действия и безопасности нового ингибитора ССТТ хламидий. Результаты проведенного исследования являются основой для разработки лекарственного препарата для лечения острых и хронических форм урогенитальных хламидиозов. Антихламидийное лекарственное средство на основе разрабатываемого ингибитора ССТТ будет иметь существенные преимущества по сравнению с применяемыми для терапии урогенитального хламидиоза антибиотиками. Это обусловлено тем, что ингибитор нетоксичен в отношении эукариотических клеток, не обладает повреждающим действием на бактерии нормальной микрофлоры человека и эффективен в отношении персистирующих форм хламидий.

Внедрение в практику

Результаты диссертационной работы Кост Е.А. в части разработки метода автоматизированного исследования препаратов культур клеток, инфицированных

хламидиями, внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г.Москвы, а так же в учебный процесс кафедры Биомедицинских технических систем МГТУ им. Н.Э. Баумана (имеются акты о внедрении).

Основные положения, выносимые на защиту

1.Новый полученный ингибитор ССТТ, низкомолекулярное соединение, блокирует процессы, связанные с транслокацией эффекторных белков C.trachomatis в цитоплазму хозяйской клетки, на этапе интернализации патогена и на стадии созревания и процессинга фагосомы. Блокирование этих этапов взаимодействия внутриклеточного патогена с эукариотической клеткой приводит к торможению развития хламидий и прекращению острого инфекционного процесса.

2. Специфичность действия полученного ингибитора показана при иммуногистохимическом выявлении секретируемых белков и при исследовании активности генов, кодирующих структурные белки ССТТ.

3.Электронно-микроскопическое исследование клеток показало ингибирование процесса интернализации хламидий в эукариотическую клетку при действии минимальной ингибирующей концентрации (МИК) ингибитора. Действие субингибирующих концентраций соединения вызывали остановку процессов деления ретикулярных телец и их редифференцировки в инфекционные элементарные тельца внутри включения.

4.Показано, что ССТТ C.trachomatis обеспечивает жизнеспособность и структурную целостность персистирующих форм, а также необходима для их реверсии в инфекционные формы хламидий, что делает ССТТ перспективной мишенью для лечения персистентной инфекции.

5.Проведена характеристика безопасности разрабатываемого ингибитора для эукариотических клеток и представителей нормальной микрофлоры. Показана его низкая токсичность при концентрациях, эффективно блокирующих инфекционный процесс в культуре клеток и отсутствие бактерицидного действия

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на III Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 15-17 апреля 2010), 52ом международном Симпозиуме общества гистохимиков (Прага, 1-4 сентября

2010), Юом международном конгрессе по микроскопии (Урбино, 4-9 сентября

2011), XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, ЗОмая - 3 июня 2011), 7ом собрании европейского общества исследования хламидий (Амстердам, 1-6 июля 2012).

Апробация диссертации состоялась 8 ноября 2013 г. на совместном заседании отдела медицинской микробиологии и отдела бактериальных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 статьи в рекомендованных ВАК изданиях.

Личное участие автора

Основные результаты работы получены лично автором. Синтез ингибитора ССТТ осуществлялся в группе органического синтеза лаборатории хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России; разработка морфометрического автоматизированного метода учета изображений для количественной оценки показателей внутриклеточного размножения С.trachomatis проводилась совместно с сотрудниками кафедры биомедицинских технических систем МГТУ им. Н.Э.Баумана Артюховой О.А. и ктн Самородовым А.В.. Анализ активности ингибитора по отношению к бактериям представителям нормальной микрофлоры человека проводили совместно с лабораторией микробиологии латентных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 листах и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и практических рекомендаций. Работа содержит 10 таблиц и 67 рисунков. Список использованной литературы включает в себя 104 источника, из них 10 отечественных и 94 зарубежных авторов.

Собственные исследования

Материалы и методы.

- Материалы

В работе использовали лабораторный штамм C.trachomatis серовар L2 (АТСС VR 902В) и музейные культуры: Staphylococcus aureus АТСС 653SP, Enterococcus faccium АТСС 8482, Streptococcus pyogenes A (2 штамма - 30M и «Dochcz NY 5r>), Lactobacillus acidophilus LYO 50 DCU, Bifidumhacterium bifidum ATCC 791. Escherichia coli ATCC 25922; Proteus mirabilis АТСС 46, Candida albicans ATCC 885683; а так же клеточную линию McCoy (гибридная линия синовиальных клеток человека и мышиных фибробластов).

В исследовании использовался ингибитор ССТТ нового поколения под рабочим названием CL-55, который относится к классу низкомолекулярных гетероциклических соединений, тиадиазинонов - 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид.

Работа выполнена в лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и в лаборатории хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

- Методы оценки цитотоксичности препарата

Метод окрашивания метиленовъш синим. К суточному монослою клеток McCoy, выращенному в 96-луночном планшете, вносили разные дозы CL-55.

Клетки инкубировали в течение 48 часов в СО2 инкубаторе при 37°С. Далее проводили окрашивание метиленовым синим по стандартной методике. Учет результатов проводился спектрометрически при длине волны 540 нм на фотометре MuktiscanEX.

МТТ-тест. К клеткам McCoy, выращенным в 96-луночном культуральном планшете, вносили разные дозы ингибитора, далее культуру инкубировали 48 часов в атмосфере СО2 при 37°С. Окрашивание проводили в соответствие с инструкцией. (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma)

Калъцеиновый тест. Культуру клеток выращивали в 24-луночном культуральном планшете со стеклами. Методика проведения исследования соответствовала протоколу к коммерческому набору LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells (Invitrogen, США). Результаты оценивались при помощи флуоресцентной микроскопии.

- Культуральный метод

Для исследования была использована суточная культура фибробластов McCoy, выращенная на стеклах в 24-луночном планшете. Заражение клеток С. trachomatis проводили при множественности инфекции (МОИ) - 1 с центрифугированием в течение 1 часа при 1600 g при 30°С.

К опытной группе клеток добавляли ингибитор ССТТ - CL-55 в концентрациях 25, 50 и 75 мкМ одномоментно с внесением хламидий. Ингибитор разводили в DMF (N.N-диметилформамид) для приготовления исходного раствора с концентрацией 25 мМ.

- Иммуноцитохимическая детекция хламидий в монослое клеток

Через 48 часов роста из лунок отбирали надосадок, стекла промывали в 0,1

моль/л растворе ФСБ и высушивали. После этого клетки фиксировали ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. Выявление хламидий проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием видоспецифических моноклональных антител к белку МОМР, меченых ФИТЦ. Окрашивание проводили по стандартной методике [Zigangirova et al., 2012] Анализ образцов проводился с помощью светового микроскопа Axiostar plus (Zeiss, Germany) с флуоресцентной приставкой. Опыты проводились в трёх повторах, в тексте приведены наиболее характерные показатели.

- Иммуноцитохимическая детекция белков-эффекторов ССТТ хламидий в монослое клеток

Для проведения данных исследований клеточные культуры, инфицированные С. trachomatis, и контрольные выращивали на стеклах в 24-луночном планшете по стандартной методике. При анализе локализации белка IncA внесение ингибитора CL-55 в дозе 25мкМ осуществлялось через 8 ч.п.и., что соответствует времени начала транслокации эффекторного белка IncA на мембрану включения [Hackstadt et al., 1999]. Анализ проводился через 30 часов после инфицирования. Для анализа локализации белка 14-3-3(3 CL-55 вносили одномоментно с заражением и анализировали образцы через 30 ч.п.и.

Детекция белка IncA осуществлялась методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием кроличьей поликлональной сыворотки к белку IncA («Innovagen», Швеция) и вторичных антител, меченых ФИТЦ.

Детекция белка 14-3-3ß так же проводилась методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием поликлональных антител к белку 14-3-3ß (Santa-Cruz BioTechnology). Ядра фибробластов и бактериальная ДНК выявлялись с помощью ДНК-специфичного красителя DAPI (Invitrogen, USA). Все исследованные образцы так же окрашивались антителами к белку МОМР по описанной методике с целью выявления включений С.trachomatis.

- Автоматизированный метод учета изображений для количественной оценки показателей внутриклеточного размножения C.trachomatis

В рамках данной работы совместно с сотрудниками кафедры биомедицинских технических систем МГТУ им. Н.Э.Баумана была разработана морфометрическая программа автоматизированной обработки изображений. Специфически окрашенные препараты культур клеток фотографировали при одинаковом увеличении по 15 различных полей зрения с каждого образца, с помощью разработанной программы по полученным изображениям проводились измерения площади хламидийных включений и последующая статистическая обработка результатов (вычисление среднего значения и среднеквадратичного отклонения).

- Оценка действия ингибитора на представителей нормальной микрофлоры человека

Определение чувствительности представителей нормальной микрофлоры человека к действию ингибитора проводили согласно МУК 4.2.1890-04 (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам) и Руководству по проведению доклинических исследований под ред. Миронова А.Н. Ингибитор в концентрации 50мкМ добавляли к культурам тест-штаммов и культивировали 24 или 48 часов в соответствии с условиями культивирования каждого микроорганизма. Микробный рост оценивали по количеству выросших колоний на плотных питательных средах. Опыты проводили в трех повторах.

- Электронно-микроскопическое исследование образцов

Для анализа методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) проводили фиксацию клеток по методу Ito-Karnovsky [Ito S., Karnovsky M.J. 1969], обезвоживание и заливку в метакрилатную смолу LR White по стандартной методике [Newman G.R et al., 1982]. После этого были получены ультратоние срезы на ультратонкие срезы на LKB 3 (Reichert, Germany), которые впоследствии контрастировали по методу Рейнольдса [Reynolds E.S. 1963]. Анализ проводился с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ) Jeol 100В при ускоряющем напряжении 80kV. Съемку проводили в диапазоне от 5000 до 30 000 инструментального увеличения.

Для анализа методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) культуры клеток выращивали на стеклах, далее фиксировали 10% нейтральным формалином. После чего образцы монтировались на предметный столик микроскопа с помощью угольного скотча, напыляли слоем золота толщиной 5нм (SPI-MODULE Sputter Coater (SPI Supplies, USA)) и анализировали в двулучевом сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 30 kV.

- Выделение тотальной РНК из культуры клеток

Выделение РНК из культуры клеток проводили через 4, 8, 16 и 19 ч.п.и. с использованием реагента Trizol (Invitrogen) согласно инструкции. ДНК удаляли инкубированием с ДНК-азой (Ambion) при 37 °С в течение 20-30 минут. Фермент удаляли с помощью набора DNase Inactivation Reagent (Ambion). Определение концентрации РНК проводили на спектрофотометре NanoDrop ND-100 (ThermoFisher Scientific, Wilmington, USA).

- Реакция обратной транскрипции

Для реакции обратной транскрипции использовали 1 мкг выделенной РНК, кДНК синтезировали с помощью набора «High capacity cDNA Reverse Transcription Kit» (Applied Biosystems, США).

- ПЦР-РВ для анализа экспрессии генов Chlamydia trachomatis

В работе использовался прибор CFX 96 (BioRad, USA). Для обнаружения ДНК С.trachomatis в культуре клеток был использован «Набор реагентов для обнаружения ДНК возбудителя Chlamydia trachomatis методами ПЦР-РВ» (SYNTOL).

С помощью программ Primer3 и 01igo38 были определены праймеры и TaqMan зонды для выбранных генов. Полученные праймеры были проверены на специфичность в программе BLAST. При оптимизации ПЦР подбирали концентрации компонентов реакционной смеси и температурный режим амплификации, обеспечивающие максимальную чувствительность и специфичность обнаружения ДНК хламидий. ПЦР с полученной кДНК проводили с выбранными праймерами и зондами на следующие гены (табл.1).

Таблица 1. Последовательности ппаймеоов и зондов, выбранных для анализа экспрессии

Ген IlpaiiMepbi

16 SrRNA forward 5 '-GGC GTA TTT GGG CAT CCG AGT AAC G-3' reverse 5'-TCA AAT CCA GCG GGTATTAAC CGC CT-3' 5'-R6G-TGG CGG CCAATC TCT CAATCC GCC TAG A-BHQ2-3'

IcrE forward 5' - GAG GCT GTG TTG AGG TAG GT -3' reverse 5'- CGA TAA ATG CGG ATA ATG AGG AT-3' 5-FAM-AGG TAC TGG AGC ATG AGG AGG CGT A-RTQ1-3'

adtl forward 5'- GCG AAA GCT GTT GGG TGA -3' reverse 5'-GCT CTT TTC TTC GCA GTG CTC T-3' 5'-FAM- AAT ATG ACG GCA AGG GTA GAT CAC CAC AGG -RTQ1-3'

pmpF forward 5'-CAA GGT GGG AAA GGC GGA GC-3' reverse 5'-TCC CCA GGC AGC AGA GTT AT-3' 5 '-ROX CGG AGG AGC CAT TC A AAC AGC AC A AGG A RTQ2

отсВ forward 5'- CTG CAA CAG TAT GCG CTT GT-3' reverse 5* -CAC GCT GTC CAG AAG AAT GA-3' 5'-FAM CGGAAGA A AG AATCGCTTCC CC ACG BH1-3'

trpA forward 5'-CGG GAA TAA ATG GTG TGT GCG T-3' reverse 5'-TAA AGA CAT CCG TTC CGG CGT T-3' 5-ROX-ATC TTC CAG CAC CTT TAT CAC ACG GAG A-BHQ2-3'

euo forward 5'-TCC CCG ACG CTC TCC TTT CA-3' reverse 5'-CTC GTC AGG CTA TCT ATG TTG CT-3'

5'-ROX ATG GAC GCC ACT TGT CCC ACG GAA T RTQ2-3'

sctU forward 5'- TAA AAC AGC TCC CCA GAA TCA T -3' reverse 5'- GGT TGT CAA TGG GAT TGA ATT T-3' 5'- FAM-GGC AGG TAG CCA AAT CTC AA-BH1-3'

sctR forward 5'- ATTTGACTACGCAAGCCGTTAT-3' reverse 5'- CATAGCCACTCCTGTAGGGAAC -3' 5'- FAM-CCC ATG ATG AAA GCA GGA AT-BH1-3'

incA forward 5'- CTA CAG AAG AAA TGC GCA AAC TTT -3' reverse 5'- AAT GAT TGC TGG TTA TGC GCT AAT -3' 5'-FAM-CGG CGA ACT TCT TCT GCT AAT GGG GTT-BHQ1 -3'

Результаты исследований.

Характеристика нормального жизненного цикла C.trachomatis в культуре клеток фибробластов МсСоу

Взаимодействие хламидий с эукариотическими клетками и динамику морфологической трансформации возбудителя в течение жизненного цикла изучали при заражении клеток МсСоу методами световой и электронной микроскопии. При иммуногистохимическом анализе можно было обнаруживать мелкие включения, содержащие C.trachomatis уже через 2 ч.п.и. (Рис. 1А), которые увеличивались в размерах по мере роста (Рис. 1 Б, В) и к 72 ч.п.и. занимали большую часть цитоплазмы фибробласта (Рис. 1Г).

Внутри включения можно было видеть последовательную смену стадий жизненного цикла - образование включения, переход ЭТ в РТ (Рис. 2Б), деление РТ (Рис. 2В), и редифференцировку РТ в новое поколение ЭТ через переходные формы (Рис. 2Г).

Рис. 1 Клеточная культура МсСоу, инфицированная C.trachomatis. А - 2 ч.п.и. Б - 24 ч.п.и. В-48 ч.п.и. Г-72 ч.п.и.

Рис. 2 Разные формы C.trachomatis в течение жизненного цикла. А,Д - Элементарные тела. Б - Ретикулярное тело, В - Деление ретикулярного тела, Г - Переходная форма.

Наряду с этим были выявлены некоторые особенности развития хламидий внутри фагосом. В местах контакта РТ с мембраной фагосомы (Рис. ЗА), а также у

свободно расположенных РТ (Рис. ЗБ) наблюдали значительное увеличение периплазматического пространства. Деление РТ с увеличенным периплазматическим пространством характеризовалось как атипичное, так как деления клеточной стенки не происходило (Рис. ЗВ), а под цитоплазматической мембраной происходило разделение цитоплазмы и рибонуклеопротеидного комплекса, и одновременно наблюдалась фрагментация небольших участков цитоплазмы с формированием мелких плотных телец. (Рис. ЗГ,Д).

Рис.3 Особенности развития С.trachomatis внутри включения. А - Прикрепление к мембране включения и начало расширения периплазматического пространства. Б - РТ с расширенным периплазматическим пространством. В - Атипичное деление РТ без деления КС. Г - Начало фрагментации небольших участков цитоплазмы. Д - Мелкие частицы, отделившиеся от тела клетки C.trachomatis.

С помощью метода сканирующей электронной микроскопии провели сравнительную оценку структурной организации клеток фибробластов клеточной линии McCoy до и после инфицирования хламидиями.

Интактные фибробласты имели полигональную форму, гладкую поверхность, пространство между ними было заполнено межклеточным матриксом и коллагеновыми волокнами, пласт клеток формировал монослой (Рис. 4А,Б). При инфицировании фибробластов C.trachomatis происходило нарушение архитектоники клеточного пласта за счет роста клеток над поверхностью монослоя, поверхность клеток становилась бугристой и неровной (Рис. 4В), при этом резко уменьшалось количество коллагеновых волокон и происходила дезорганизация межклеточного матрикса (Рис. 4Г).

Рис. 4 Клеточная культура McCoy. А, Б - Неинфицированный слой фибробластов В, Г -Культура фибробластов, инфицированная C.trachomatis 24 ч.п.и.

- Оценка токсичности ингибитора ССТТ по отношению к эукариотическим клеткам (фибробластам)

Для изучения возможной токсичности исследуемого ингибитора были использованы 3 стандартных токсикологических теста in vitro, позволяющие оценивать действие химических соединений на пролиферацию клеток, метаболическую активность и целостность мембраны: окраска метиленовым синим, МТТ-тест, и кальцеиновый тест. Соединение CL-55 вносили в среду

культивирования клеток в разных концентрациях и через 48 часов инкубации с препаратом оценивали процент живых клеток. Результаты испытаний токсических свойств показали, что выбранный ингибитор характеризовался низкой токсичностью для эукариотических клеток по всем трем использованным тестам. При концентрации 50 мкМ гибель клеток не превышала 9-11% (Табл. 2).

Табл. 2. Результаты токсикологических тестов для ингибитора СЬ-55 (Процент живых/неповрежденных) клеток

Окраска метиленовым синим Кальцеиновый тест МТТ-тест

12.5мк М 25мкМ 50мк М 12,5мк М 25мк М 50мкМ 12,5мк М 25мк М 50мк М

100 98 91 100 96 90 98 95 89

Таким образом, по приведенным тестам 50% цитотоксическая концентрация (СС50) составила 175 мкМ, 147 мкМ и ПОмкМ для окрашивания метиленовым синим, кальцеинового теста и МТТ-теста, соответственно.

Характеристика биологического действия ингибитора на хламидийную инфекцию в условиях in vitro.

Подбор минимальной ингибирующей концентрации препарата CL-55 проводился эмпирически. Одномоментно с инфицированием фибробластов в инкубационную среду вносили ингибитор в концентрациях - 12,5, 25 и 50 мкМ. Монослой инфицированных клеток анализированы через 48 часов роста методами иммунофлуоресцентного анализа и трансмиссионной электронной микроскопии.

Рис. 5 Культура клеток, инфицированная С.trachomatis (А) и после обработки 12 (Б), 25 (В) и 50 мкМ (Г) соединения CL-55.

Было показано, что включения, содержащие С. trachomatis, в контрольных образцах (Рис. 5А) были в несколько раз больше включений в образцах, подвергшихся обработке соединением (Рис 5Б-Г). При внесении препарата CL-55 в дозе 12,5 мкМ процент инфицированных клеток уменьшался в 2 раза по сравнению с контролем. При дозе препарата CL-55 25 мкМ количество инфицированных клеток уменьшалось в 3 раза, ив 10 раз при внесении дозы 50 мкМ. Концентрация, вызывающая 50% подавление роста хламидий, составила 31,7 мкМ.

Для определения влияния ингибитора ССТТ на инфекционные свойства хламидий проводили высевы хламидий из опытных образцов, содержащих разные концентрации препарата, на интактные культуры фибробластов. Количество de novo инфицированных фибробластов было обратно

пропорционально концентрации ингибитора ССТТ, а при концентрации 50 мкМ детектировались единичные мелкие хламидийные включения.

Для объективизации полученных данных о характере воздействия препарата CL-55 на формирующиеся включения хламидий в фибробластах был разработан автоматизированный морфометрический метод анализа изображений включений с определением их площади. Вычисление средней площади включений для каждого из образцов стало возможным благодаря разработке метода сегментации изображений, который был разделен на 2 этапа - сегментация клеток и сегментация хламидийных включений. Под сегментацией изображений подразумевается процесс разделения цифрового изображения на несколько сегментов (множество пикселей, таьоке называемых суперпикселями). [Shapiro, Stockman 2001] Сегментацию изображений достигали путем их бинаризации по разработанным в ходе работы алгоритмам. Бинаризацией является перевод полноцветного изображения в монохромное, в дальнейшем на таком изображении можно проводить распознавание образов и соответственно измерение необходимых параметров.

Благодаря разработанному методу, было показано достоверное снижение средней площади включений - для концентрации 50 мкМ в 4 раза, 25 мкМ - в 2,8 раза, 12.5 мкМ -в 1,2 раза по сравнению с контролем. (Рис. 6)

Рис. 6. Средняя площадь включений в зависимости от вносимой дозы ингибитора CL-55. 48 ч.п.и.

При электронно-микроскопическом исследовании в контрольных образцах инфицированных хламидиями фибробластов на сроке 48 часов инкубации, инфицированные клетки имели крупные включения, смещавшие цитоплазму и органеллы на периферию клетки. В фагосомах, в основном, выявлялись ЭТ (Рис. 7А).

При внесении препарата СЬ-55 в культуру клеток одномоментно с заражением хламидиями происходило уменьшение размеров и численности включений в фибробластах. (Рис. 7Б,В). Кроме этого в фагосомах определялись РТ, а не ЭТ, как в контрольных образцах.

Рис. 7. Культура клеток McCoy, инфицированная Chlamydia trachomatis (48 ч.п.и.) А -Контроль (ув. *4т). Б - После добавления 12,5 мкМ соединения (ув. *10т). В - После добавления 25 мкМ соединения (ув. *4т). Г - после добавления 50 мкМ соединения (ув. * Ют).

При внесении препарата в дозе 50 мкМ лишь единичные фибробласты были инфицированы хламидиями. Включения представляли собой небольшие вакуоли, содержащие единичные РТ атипичного строения, и ЭТ не выявлялись (Рис. 7Г).

Таким образом, было показано, что под влиянием ингибитора ССТТ происходят кардинальные нарушения в жизненном цикле хламидий. Препарат СЬ-55 оказывает негативное воздействие на проникновение ЭТ хламидий в фибробласты, тормозит деление РТ и переход РТ в ЭТ, что в свою очередь указывает на необходимость участия ССТТ на данных этапах ж.ц при продуктивной инфекции. Уменьшение размеров включений под действием ингибитора ССТТ отражает нарушение деления бактериальных клеток, а также может быть следствием специфического подавления функций ССТТ хламидий, т.к. известно, что секретируемые хламидиями белки перенаправляют транспорт питательных веществ внутрь включения увеличивая его объем [Веесктап, Уапготрау 2010].

Анализ специфической активности ингибитора в отношении ССТТ

С. trachomatis.

Для подтверждения специфической активности ингибитора в отношении ССТТ С. trachomatis был проведен иммунофлуоресцентный анализ распределения двух белков из семейства Inc, активных на ранней и средней стадии жизненного цикла. Белки IncG и IncA транслоцируются при помощи ССТТ и интегрируются в мембрану включения, модифицируя её свойства. [Scidmore-Carlson MA et al., 1999, Hackstadtetal., 1999]

-S

I

4

Q.

О

В в в

Рис. 8 Локализация белка 14-3-3ß в интактной культуре (А), в эукариотических клетках в условиях инфицирования Chlamydia trachomatis (Б) и при обработке инфицированной культуры ингибитором (В). Стрелки указывают на включения С.trachomatis.

Локализация белка 1псС оценивалась посредством выявления эукариотического белка 14-З-Зр, который привлекается белком ГпсС на мембрану включения, что можно было видеть на инфицированной культуре клеток (Рис. 8Б). В незараженной культуре белок 14-3-3(3 был дисперсно распределен в цитоплазме. (Рис. 8А) Было показано, что в присутствии 25 мкМ ингибитора не происходит концентрации белка 14-3-3(3 вокруг включения (Рис. 8В), что свидетельствует об отсутствии белка 1псО на мембране включения.

Для проведения анализа распределения белка 1псА клетки окрашивали методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфических антител к белку 1псА. Ингибитор ССТТ вносили через 8 часов после инфицирования, т.е на стадии начала траслокации белка 1псА в мембрану включения. После этого культивировали клетки еще 22 часа для лучшей визуализации хламидийных включений.

В контрольных препаратах наблюдали окрашенные хламидийные включения, по размерам соответствующие сроку инфекции, что говорит о мембранной локализации белка 1псА (Рис. 9А). В препаратах с концентрацией ингибитора ССТТ (25 мкМ) наблюдали отсутствие окрашивания белка 1псА. Просматривались неокрашенные вакуоли в цитоплазме инфицированных клеток (Рис. 9В), соответствующих хламидийным включениям.

а В

* ч 1

ё ш

«у •ч Ф •

Рисунок 9. Локализация белка IncA. А,Б - Контроль инфекции 30 ч.п.и. В,Г - Клетки после обработки CL-55 Стрелки указывают на включения С. trachomatis. А,В - Окрашивание антителами к IncA, Б,Г - Окрашивание антителами к МОМР.

На основании полученных данных можно заключить, что препарат CL-55 блокирует транслокацию эффекторных белков ССТТ на мембрану включения, что свидетельствует о специфичности его действия на данную систему секреции.

Оценка эффективности действия препарата СЬ-55 на СЛгаскотайъ на разных стадиях её жизненного цикла.

Стадии жизненного цикла хламидий соответствуют следующим временным промежуткам в эксперименте: 0 часов - адгезия и интернализация, в период от 2 до 8 часов происходит дифференцировка ЭТ в РТ, модификации мембраны включения, миграции включения в околоядерную область (при этом в точке 4 часа наиболее активно протекает синтез структурных компонентов РТ), 16-20 часов - поздние этапы модификации включения, рост и деление РТ, 24-32 часа -редифференцировка РТ в ЭТ, после 48 часов инкубации завершается цикл внутриклеточного развития хламидий и происходит выход вновь образованных ЭТ из клетки.

Воздействие ингибитора ССТТна стадию адгезии и интернализации

хламидий.

Для того чтобы проанализировать воздействие ингибитора ССТТ на стадии адгезии и интернализации был использован прием для разделения этапов адгезии и интернализации - температурный шифт (стадия адгезии проходила при +4°С, для перехода к стадии интернализации культуры переносили в +37°С). В этом опыте препарат СЬ-55 вносили на 30 мин на стадии адгезии и интернализации, далее отмывали и выращивали клетки 48 часов. В случае присутствия соединения в среде на стадии адгезии ЭТ, число инфицированных клеток снижалось всего на 10% по сравнению с контролем, а на стадии интернализации - на 49%.

На основании полученных данных можно утверждать, что ингибитор ССТТ практически не влияет на стадию адгезии ЭТ, и существенно тормозит процесс интернализации ЭТ. Следовательно, ССТТ не играет важной роли в осуществлении процесса адгезии, но необходима для нормального осуществления интернализации С. 1гас1ютаи$ в клетку.

Воздействие СЬ-55 на внутриклеточные этапы развития Слгаскотайз.

При внесении препарата на сроках 0, 2, 8 и 16 часов происходило существенное снижение числа инфицированных фибробластов на 95%, 48%, 38% и 40% соответственно.

При внесении ингибитора на сроке 4 часа - снижение количества инфицированных фибробластов составляло всего 12%. Примерно такие же показатели (около 12% снижение числа инфицированных фибробластов) были получены при внесении препарата СЬ-55 на поздних сроках внутриклеточного развития - 20, 24 и 32 ч.п.и. Рис. 10А. В этих экспериментах мы оценивали уровень инфекции по количеству инфицированных клеток в условиях действия ингибитора уже после интернализации. Снижение количества инфицированных клеток при сравнении с контролем при внесении ингибитора на сроках 2, 8 и 16 часов может свидетельствовать о подавлении ингибитором механизмов взаимодействия с клеткой хозяина, регулирующих выживание патогена в клетке, т.е. можно предполагать участие в этих механизмах ССТТ.

Был проведен анализ показателей средней площади включений у инфицированных фибробластов, что объективно отражало влияние ингибитора ССТТ на внутриклеточное развитие на разных этапах жизненного цикла. Было показано, что площадь включений существенно уменьшалась в образцах со сроками обработки ингибитором ССТТ в интервале от 2 до 16 часов и начинала увеличиваться, приближаясь к показателям контроля при внесении ингибитора только после 32 часов Рис.1 ОБ. Это указывало на подавление внутриклеточного развития под действием ингибитора вплоть до стадии формирования зрелых ЭТ.

Рис. 10. А Процент инфицированных клеток в культуре фибробластов в зависимости от времени внесения СЬ-55. Б. Средняя площадь включения в зависимости от времени внесения ингибитора СЬ-55.

Таким образом, ингибитор ССТТ эффективно подавлял ранний и средний этапы жизненного цикла хламидий, связанные с преобразование и ростом фагосомы, делением РТ, а также редифференцировкой РТ в ЭТ.

Нарушение структуры ССТТ под воздействием ингибитора.

Инфицированные хламидиями фибробласты клеточной линии McCoy, интактные и обработанные ингибитором ССТТ, были исследованы электронномикроскопическими методами (ТЭМ и СЭМ) на разных этапах жизненного цикла хламидий.

Прежде всего, следует отметить, что методом ТЭМ удалось визуализировать структуры, строение которых было сопоставимо с поверхностными «rosett-like» структурами ЭТ, описанными в литературе [Matsumoto А. 1982]. В контрольных образцах в месте контакта РТ с мембраной фагосомы были обнаружены структуры, состоящие из трех компонентов, в виде электронноплотных нитевидных образований разной толщины: первый компонент соединял наружную мембрану клеточной стенки (КС) РТ с мембраной фагосомы, второй находился внутри пространства между наружной мембраной КС и цитоплазматической мембраной, а третий был представлен уплотнениями под цитоплазматической мембраной бактериальной клетки. (Рис. 11).

Рисунок 11. Структура ССТТ при наблюдении в ТЭМ. Культура фибробластов McCoy, инфицированная С.trachomatis 24 ч.п.и А - Участок включения, содержащего С.trachomatis. Б - Место контакта РТ с мембраной включения. В - Проекции структур ССТТ в месте контакта показаны стрелками.

Под действием ингибитора ССТТ не происходило контакта РТ с мембраной включения. РТ имели участки повреждения КС, так же встречались и повреждения мембраны фагосомы (Рис. 12), что находится в соответствии с данными о нарушении транслокации белков семейства 1пс, описанными выше. Структур соответствующих «инжектосоме» ССТТ на поверхности РТ обнаружено не было.

Рис. 12. Отсутствие ССТТ при наблюдении в ТЭМ. Культура фибробластов McCoy, инфицированная С.trachomatis 24 ч.п.и в присутствии CL-55 (25 мкМ) А - Включение, содержащее С. trachomatis. Б - РТ

Изучение морфологических особенностей клеточного пласта в условиях инфицирования C.trachomatis и действия CL-55

Как было описано раннее инфицирование фибробластов C.trachomatis приводит к дезорганизации клеточного пласта и нарушению синтеза коллагена. При росте инфицированной клеточной культуры в присутствии препарата CL-55 в концентрации 50мкМ морфология клеточного пласта не менялась по сравнению с контролем (Рис. 13А,Б, Д,Е). На поверхности клеток, образцов, подвергшихся обработке ингибитором ССТТ, выявлялись адгезированные ЭТ C.trachomatis, которые не проникали внутрь фибробластов. Таким образом, ингибитор ССТТ блокирует проникновение C.trachomatis внутрь фибробластов, не нарушая архитектонику клеточного пласта и синтеза межклеточного вещества и коллагена.

Рис. 13 А, Б - Монослой фибробластов McCoy В,Г - Монослой фибробластов McCoy, инфицированный C.trachomatis 48 ч.п.и. Д,Е - Монослой фибробластов McCoy, инфицированный C.trachomatis 48 ч.п.и. в присутствии CL-55 (50 мкМ) Ж - ЭТ C.trachomatis

Действие CL-55 на персистентную инфекцию

Индукция персистентного состояния С. trachomatis осуществлялась согласно одной из общепринятых моделей индукции персистенции - рост инфицированных клеток в присутствии пенициллина. [Clark et al., 1982] Хламидийные включения уже через 24 часа после культивирования в присутствии пенициллина приобретали измененную морфологию. На этом сроке, а также через 48 часов включения были среднего размера, неоднородные по плотности (Рис. 14 Г,Д) При исследовании методом ТЭМ персистирующие формы представляли собой атипичные формы с явными признаками нарушения деления и дефектами клеточной стенки, которые контактировали с мембраной фагосомы (Рис. 14Е). При высеве таких образцов на чистые культуры клеток наблюдалось значительное подавление инфекционных свойств, что является характерным для персистирующих форм хламидий.

Рис. 14 Модель персистентиой инфекции. А, Б, В — культура клеток, инфицированная L2 (24 и 48 ч.п.и.). Г, Д, Е - культура клеток, инфицированная L2 в присутствии пенициллина (24 и 48 ч.п.и.).

Иммуногистохимический анализ показал, что белки- эффекторы ССТТ, IncG и IncA, локализовались на мембране включений, содержащих персистирующие формы, так же как и при острой инфекции. (Рис. 15). Эти данные свидетельствуют о функциональной активности ССТТ у персистирующих форм С. trachomatis.

Рис. 15 Локализация белка 14-3-3 в эукариотических клетках в условиях А - острой инфекции С.trachomatis и В - персистентиой. Локализация белка IncA на мембране включения в условиях Б - при острой инфекции C.trachomatis и Г - персистентной.

Действие полученного ингибитора ССТТ на персистентную инфекцию оценивали при внесении в культуру фибробластов, содержащих персистирующие

формы хламидий, препарата CL-55. При электронномикроскопическом исследовании наблюдали полный или частичный лизис цитоплазматических мембран и рибонуклеопротеидного комплекса персистирущих форм С. trachomatis. (Рис. 16).

Рис. 16 Персистирующие формы C.trachomatis в культуре клеток. А - 24 часа персистенции, В - 48 часов персистенции, Б - Действие CL-55 после 24 часов персистенции, Г - действие CL-55 после 48 часов персистенции

Таким образом, впервые было продемонстрировано, что ингибитор ССТТ вызывал тотальную дезорганизацию персистирующих форм хламидий.

Влияние CL-55 на процесс реверсии

Известно, что персистирующие формы хламидий способны восстанавливать типичную структуру и свойства после отмены действия индуктора персистенции, что мы и наблюдали на нашей модели. При замене среды на чистую (не содержащую пенициллин) через 24 часа происходило восстановление характерной структуры включений и значительное повышение инфицирующей способности.

При высеве персистирующих культур, обработанных CL-55,b условиях реверсии не происходило восстановления как нормальной структуры включений, так и инфицирующей способности C.trachomatis (Рис. 17).

Рисунок 17. Инфекционные свойства C.trachomatis персистирующих форм ( ), после отмены действия пенициллина (♦), при добавлении CL-55 на период реверсии (♦)

Таким образом, впервые было показано, что ингибитор ССТТ подавляет персистентную инфекцию в культуре клеток. Действие CL-55 приводило в полной дезорганизации персистирующих форм, а также блокировало процесс реверсии атипичных форм в инфекционные, что приводило к прекращению инфекционного процесса. Это в свою очередь дает основания заключить, что ССТТ C.trachomatis обеспечивает жизнеспособность и структурную целостность персистирующих форм, а также необходима для их реверсии в инфекционные формы хламидий.

Инфекционные свойства C.trachomatis после роста в присутсвии пенициллина

%

о ♦

ш 1.00Е+05

1.00Е+04

1.00Е+03

О 24 48 72

Действие CL-55 на экспрессию генов при внесении на разных стадиях жизненного цикла

Задачей этого раздела работы было изучение влияния выбранного ингибитора ССТТ на экспрессию ряда генов, кодирующих структурные, эффекторные и регуляторные белки ССТТ С. trachomatis. Для этого из монослоя инфицированных клеток выделяли РНК на нескольких временных точках, через 4, 8, 16 и 20 часов после инфицирования. Эти пробы служили контролями экспрессии анализируемых генов при нормальном жизненном цикле С. trachomatis. Для оценки влияния ингибитора на транскрипцию этих генов за 3 часа до каждой из выбранных временных точек вносили ингибитор ССТТ в концентрации 50 мкМ и инкубировали в течение 3-х часов. После этого из монослоя клеток также выделяли РНК. Обратную транскрипцию проводили с произвольным гексамерным праймером при использовании 1 мкг РНК в пробе. В полученной кДНК определяли количество копий 16S рРНК при использовании количественного варианта ПЦР в реальном времени. Все пробы нормировали по количеству 16S рРНК и проводили ПЦР с выбранными праймерами и зондами в формате TaqMan ПЦР. Для каждого эксперимента количества анализируемого гена и контрольного (16S рРНК) определяли по соответствующей стандартной кривой, получаемой на основе значения Ct. Нормализация рассчитывалась делением количества транскриптов анализируемого гена на количество транскриптов 16S рРНК.

В качестве 5-и контрольных генов были выбраны: конститутивные гены adtlu trpA; ранний ген еио; ген pmpF и ген, детерминирующий синтез белка CPAP, секретируемого в цитоплазму клетки без участия ССТТ

У большинства протеобактерий гены, кодирующие структурные белки ССТТ, расположены в пределах острова патогенности, размером до 200 тпн. У хламидий выявлена иная организация аналогичных генов. Эти гены, кодирующие структурные компоненты, специфические опероны и эффекторные белки, расположены по крайней мере в 4-х кластерах, распределенных в различных областях генома.

В качестве тестовых генов были выбраны гены, кодирующие белки ССТТ С.trachomatis, расположенные в разных кластерах — SctU и SctR. Белок LcrE вовлечен в регуляцию активности ССТТ. Он транслоцируется и может выявляться как в составе структуры «инжектосомы», так и в мембране фагосомы, являясь не только эффекторным, но и регуляторным белком ССТТ. Белок IncA C.trachomatis встраивается в мембрану хламидийной фагосомы. Он обеспечивает гомотипичное слияние отдельных хламидийных включений внутри клетки на ранних этапах жизненного цикла хламидий, а также формирует длинные фибры, отходящие от включения, в результате чего образуются вторичные включения в цитоплазме клетки на завершающей стадии жизненного цикла.

Уровень экспрессии конститутивного гена adtl и trpA практически не менялся при действии ингибитора на ранних и средних этапах жизненного цикла.

Для раннего гена еио в условиях действия ингибитора наблюдали увеличение экспрессии в 1,5 раза на ранних сроках, через 4 часа после инфицирования, и отсутствие различий на последующих сроках. Увеличение

активности этого гена может быть связано с тем, что белок Еио является регуляторным белком, активирующимся в условиях стрессовых воздействий.

Для позднего гена pmpF на все сроки наблюдения не происходило подавления его активности. При нормальном жизненном цикле ген, кодирующий протеазу CPAF - основной фактор патогенности хламидий, начинает активироваться чрез 14-16 часов после начала инфекции. Добавление ингибитора на этом сроке снижало экспрессию гена cpaf в 2,5 раза. Белок CPAF является аутотранспортером и секретируется в хозяйскую клетку без участия ССТТ. Однако наблюдаемое нами снижение активности этого гена при действии ингибитора ССТТ можно объяснить тем, что на средней стадии жизненного цикла (16-20 часов) ССТТ хламидий обеспечивает возможность получения необходимых питательных компонентов из хозяйской клетки, а следовательно размножения бактерий. Поэтому блокирование связи с клеткой хозяина может приводить к опросредованному подавлению многих функций патогена и, в том числе, продукции белкового фактора патогенности.

Для генов, кодирующих структурные белки ССТТ, sctR и sctU, для которых в контроле экспрессия начиналась после 16 часов, на этот срок и позднее наблюдали выраженное подавление активности этих генов в присутствии ингибитора. Это может указывать на специфическое ингибирующее действие изучаемого соединения на процессы de novo синтеза структурных белков ССТТ. Следует подчеркнуть, что эти гены расположены в различных кластерах, а следовательно экспрессируются в составе различных оперонов, но при этом имеют одинаковый профиль активности в условиях действия ингибитора.

Ген, кодирующий эффекторный белок ССТТ хламидий, LcrE, при нормальном жизненном цикле активируется в конце средней фазы и индуцирует открепление ретикулярных телец от мембраны фагосомы, что блокирует секрецию эффекторных белков ССТТ. Внесение ингибитора на 16 и 19 часов значительно снижало его активность. Эффекторный белок IncA имеет 2 пика активности — 8 и 20 часов. При внесениии ингибитора на 4 часу после заражения мы не наблюдали снижения его активности. Однако на последующих временных точках ингибитор оказывал подавляющее влияние на активность этого гена.

Табл.3 Влияние ингибитора CL-55 на уровень экспрессии генов C.trachomatis. Уровень

экспрессии относительно острой инфекции без добавления ингибитора.

Название гена Характеристика гена Функция белка Относительный уровень экспрессии на сроке активации конкретного гена

adtl Конститутивный АДФ/АТФ транслоказа 0,92 ± 0,05

trpA Конститутивный гриптофан синтаза 1,10 ±0,22

еио Ранней фазы ДНК связывающий белок 1,42 ±0,25

pmpF Поздней фазы белок клеточной стенки 0,91 ±0,17

cpaf Средней фазы основной фактор патогенности, протеаза 0,39 ±0,12

Структурные гены ССТТ

sctU Расположен в 1 кластере Белок-транспортер 0,07 ± 0,02

sctR Расположен во 2 кластере Белок-транспортер 0,13 ±0,07

Эффекторные гены ССТТ

IcrE Расположен в 1 кластере Регулятор контакт-зависимой секреции эффектроных белков 0,22 ± 0,09

incA Расположен в 4 кластере Обеспечивает гомотипичное слияние включений 0,48 ±0,11

Таким образом, проведенный анализ экспрессии ряда генов под действием ингибитора ССТТ показал, что:

1. Ингибитор не влияет на активность конститутивных генов и на экспрессию позднего гена на сроке его активации, что может свидетельствовать об избирательном действии выбранного ингибитора на работу генов.

2. Ингибитор значительно снижал экспрессию генов, кодирующих структурные белки «инжектосомы», в сроки соответствующие началу их активности.

3. Ингибитор оказывал негативное действие на активность генов, регуляторного и эффекторного белка ССТТ на средних и поздних стадиях жизненного цикла, что указывает на специфичность действия выбранного ингибитора в отношении ССТТ хламидий.

Уровень экспрессии генов в условиях индукции персистенции с помощью

пенициллина и добавления соединения 55.

С целью дальнейшего выяснения вопроса о функционировании ССТТ у персистирующих форм была проведена оценка уровня экспрессии структурных и эффекторных генов ССТТ у этих форм С. trachomatis, а также конститутивных генов.

Известно, что персистирующие формы характеризуются метаболической активностью, что мы и наблюдали для конститутивных генов, adt и trpA, которые экспрессировались на том же уровне, что при нормальном цикле развития на 24 часа инфицирования. В качестве тестовых генов поздней фазы анализировали экспрессию генов, кодирующих белки наружной мебраны, PmpF и ОтсВ. У персистирующих форм С.trachomatis экспрессия этих генов практически не выявлялась, что находится в соответствии с известными данными о подавлении синтеза поздних белков, а, следовательно, и ингибировании завершающего этапа жизненного цикла при персистенции.

Для проанализированных структурных генов ССТТ, sctU и sctR, наблюдали экспрессию у персистирующих форм через 24 часа, при этом уровень был снижен по сравнению с контролем. Для гена регуляторного белка LcrE была выявлена экспрессия у персистирующих форм через 24 часа после индукции персистенции. Для гена эффекторного белка IncA через 24 часа после индукции у персистирующих форм была выявлена экспрессия на том же уровне, что и у

типичных бактерий. Через 48 часов активность гена была несколько ниже. (Табл.4)

Таким образом, на модели персистентной инфекции in vitro впервые была показана активность генов, кодирующих структурные, регуляторный и эффекторный белок ССТТ С. trachomatis.

Для изучения влияния ингибитора ССТТ на экспрессию генов персистирующих форм соединение CL-55 вносили в концентрации 50 мкМ и инкубировали 24 часа.

Было показано, что внесение ингибитора снижало активность гена sctU примерно в 2 раза. При анализе экспрессии гена, кодирующего структурный белок SctR, а также регуляторный белок LcrE, было выявлено, что через 48 часов их активность значительно снижалась, что не позволило определить действие ингибитора на экспрессию этих генов. Для эффекторного белка IncA в условиях действия ингибитора экспрессия гена выявлялась на том же уровне, что и при персистенции. Для генов adtl, trpA и еио также было показано отсутствие подавления при действии ингибитора в течение 24 часов на персистентную инфекцию (Табл. 5)

Табл.4 Изменение экспрессии генов в Табл.5 Изменение экспрессии генов в

условиях персистентной инфекции, условиях действия ингибитора CL-55 на

индуцированной пенициллином через персистентную инфекцию. Уровень

24 часа. Уровень экспрессии экспрессии относительно персистентной

относительно остпой инАекпии. инфекции без внесения ингибитора.

Название гена Относительный уровень экспрессии генов у персистирующих форм

adtl 0,97± 0,18

trpA 0,88± 0,1

еио 0,53± 0,05

pmpF -

Структурные гены ССТТ

sctU 0,66± 0,01

sctR 0,3 6± 0,04

Эффекторные гены ССТТ

IcrE 0,91± 0,15

incA 0,9± 0,08

Название гена Относительный уровень экспрессии генов у персистирующих форм после действия ингибитора

adtl 1,11± 0,07

trpA 1,14± 0,12

еио 0,99± 0,11

pmpF -

Структурные гены ССТТ

set и 0,44± 0,02

sctR -

Эффекторные гены ССТТ

IcrE -

incA 0,94± 0,05

Таким образом, проведенный анализ экспрессии генов С. trachomatis в условиях разработанной модели персистенции in vitro показал следующее.Во-первых, у персистирующих форм, которые образуются под влиянием пенициллина, выявляется экспрессия генов, кодирующих белки ССТТ С. trachomatis. Среди них, структурные белки SctR и SctU, регуляторный белок LcrE и эффекторный белок IncA. Это указывает на то, что у персистирующих форм функционирует ССТТ, которая должна обеспечивать этим формам

хламидий выживание внутри клетки, также как и хламидиям при нормальном жизненном цикле. Во-вторых, изучаемый ингибитор ССТТ не влиял на активность генов, кодирующих конститутивные белки у персистирующих форм. В-третьих, ингибитор ССТТ подавлял экспрессию одного из проанализированных структурных белков ССТТ, SctU.

Оценка действия ингибитора на представителей нормальной микрофлоры человека.

С целью исследования влияния ингибитора на нормальную микрофлору человека, образцы культур тест-штаммов после роста в присутствии ингибитора и контрольные высевали на соответствующие питательные среды для определения КОЕ/мл. Среднее количество выросших колоний исследованных микроорганизмов практически не варьировало между контролем и опытом, что позволяет говорить о том, что ингибитор ССТТ не обладает бактерицидным действием в отношении представителей нормальной микрофлоры человека.

Выводы

1. Новый низкомолекулярный ингибитор ССТТ оказывал дозозависимое подавление внутриклеточного развития C.trachomatis в условиях in vitro, наблюдаемое на этапе интернализации хламидий, созревания включения и формирования нового поколения инфекционных форм. Ингибитор ССТТ не влиял на процессы адгезии и выхода элементарных телец из клетки. Концентрация, вызывающая 50% подавление роста хламидий, составила 31,7 мкМ.

2. Электронно-микроскопическое исследование показало снижение общего количества бактерий, обнаруживаемых в одном включении в эукариотической клетке в условиях действия субингибирующих концентраций ингибитора, что было вызвано нарушением процессов деления ретикулярных телец и их редифференцировки в инфекционные элементарные тельца. Под действием ингибитора ССТТ у ретикулярных телец выявлялись участки повреждения клеточной стенки, нарушался контакт с мембраной включения, а также встречались повреждения мембраны фагосомы.

3. На модели персистентной инфекции C.trachomatis было впервые продемонстрировано, что ингибитор ССТТ вызывал структурную дезорганизацию персистирующих форм и блокировал процесс их реверсии в типичные инфекционные формы.

4. Специфичность действия изучаемого соединения была показана на примере подавления секреции эффекторных белков ССТТ ранней и средней фазы жизненного цикла — IncG и IncA

5. Показана дифференциальная экспрессия ряда генов, кодирующих структурные и эффекторные белки ССТТ C.trachomatis, в зависимости от этапа жизненного цикла, как при продуктивной, так и персистентной инфекции. Добавление ингибитора в разные сроки, до начала активации каждого конкретного гена, приводит к значительному снижению активности генов, кодирующих

структурные белки ССТТ, а также частичное подавление активности генов эффекторных белков. При этом ингибитор не влиял на активность генов общего метаболизма.

6. Концентрация ингибитора ССТТ, вызывающая 50% гибель клеток, составила 175 мкМ, что в 3,5 раза больше эффективной антихламидийной концентрации, при которой сохранялась пролиферативная и метаболическая активность фибробластов, архитектоника клеточного пласта, синтез межклеточного вещества и коллагена, а также способность фагоцитировать хламидии.

7. Полученный ингибитор не влиял на жизнеспособность бактерий нормальной микрофлоры человека, представителей семейств Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus.

Список сокращений.

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ж.ц. - жизненный цикл

СС5о - 50% Cytotoxic Concentration

МОИ - множественность инфекции

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

КС - клеточная стенка

РТ - ретикулярное тело

ССТТ - система секреции третьего типа

ч.п.и - часов после инфицирования

ЭТ - элементарное тело

КОЕ - колониеобразуюшая единица

Список опубликованных работ.

1. Кост Е.А. Влияние стауроспорина на клеточную культуру фибробластов McCoy, инфицированную Chlamydia trachomatis. // Бюллетень северного государственного медицинского университета, в. XXIV 2010, с. 144-145.

2. Зигангирова Н.А., Нестеренко JI.H., Тиганова И.Г., Кост Е.А. Регуляториая роль системы секреции III типа грамотрицательных бактерий в развитии хронического инфекционного процесса. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012, № 3, с. 3-13.

з. Zigangirova NA, Zayakin ES, Kapotina LN, Kost EA, Didenko LV, Davydova DY, Rumyanceva JP, Gintsburg AL. // Development of Chlamydial Type III Secretion System Inhibitors for Suppression of Acute and Chronic Forms of Chlamydial Infection., Acta Naturae. 2012 Apr;4(2):87-97

4. Zigangirova N. A., Nesterenko L. N., Tiganova I. L., Kost E. A. The Role of the Type_III Secretion System of GramNegative Bacteria in the Regulation of Chronic Infections. // Molecular Genetics, Microbiology and Virology, 2012, Vol. 27, No. 3, pp. 91-102.

5. Kost E.A., Didenko L.V., Zigangirova N.A. The research of fibroblast McCoy cell culture, infected by Chlamydia trachomatis. // Advanced imaging techniques in biomedicine: from molecules to organisms: Materials of 52nd Symposium of the society for histochemistry, 2010. p. 93.

6. Кост. E.A., Диденко Л.В., Зигангирова H.A. Новые методические подходы в изучении культуры клеток с помощью растрового ионно-электронного микроскопа Quanta 200 3D // Материалы XXIII Российской конференции по электронной микроскопии, 2011, с. 247.

7. Kost E.A, Didenko L.V., Zigangirova N.A. The specific features of submicroscopic organization of Chlamydia trachomatis infected McCoy cells. // Proceedings of 10th Multinational Congress on Microscopy, 2011, p. 319.

8. Zigangirova N.A., Rumjantseva У.Р, Morgunova E.U, Kost E.A., Didenko L.V., Petyaev I. Hematogenous dissemination of C.trachomayis infection // Proceedings of 7th meeting of European society for Chlamydia research, 2012, p. 75-76

9. Артюхова O.A., Кост E.A., Самородов A.B., Диденко Л.В. Разработка алгоритма автоматизированного анализа изображений хламидий в культуре клеток. // V Всероссийская научно-практическая конференция «Цитоморфомстрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» 2012, стр. 10-11

10. Artyukhova O.A., Kost Е.А., Samorodov A.V., Didenko L.V. Automation of fluorescence microscopy analysis of Chlamydia in cell culture. // Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции «Наука и Образование в XXI веке» 2013, стр. 8-9

Типография LiteraA Подписано в печать 17.02.2014 г. Тираж 80 экз. Заказ № 999. г. Москва, ул. Цветной бульвар 32/3 Тел. (495) 785 92 72

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кост, Елена Андреевна, Москва

ФГБУ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

04201156386

Кост Елена Андреевна

Влияние ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis

03. 02. 03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Зигангирова Наиля Ахатовна, доктор медицинских наук Диденко Любовь Васильевна

Москва 2014

Оглавление

Введение.......................................................................................................4

Глава 1. Обзор Литературы..........................................................................8

1.1 Характеристика семейства Chlamydiaceae........................................................8

1.2 Патогенные для человека хламидии.............................................................11

1.3 Жизненный цикл Chlamydia trachomatis........................................................12

1.4 Персистирующие формы Chlamydia trachomatis..............................................14

1.5 Системы секреции бактерий......................................................................17

1.6 Система секреции III типа (ССТТ): строение и функции.................................22

1.7 Специфические ингибиторы ССТТ.............................................................31

Глава 2. Материалы и Методы.....................................................................35

2.1 Материалы..............................................................................................35

2.2. Методы...................................................................................................35

2.2.1 Методы оценки токсичности препаратов для эукариотических клеток..........35

2.2.2 Культуральный метод............................................................................36

2.2.3 Иммуноцитохимическая детекция хламидии в монослое клеток...................37

2.2.4 Иммуноцитохимическая детекция белков-эффекторов ССТТхламидий в монослое клеток..........................................................................................38

2.2.5 Автоматизированный метод учета изображений для количественной оценки показателей внутриклеточного размножения C.trachomatis.................................38

2.2.6 Оценка действия ингибитора на представителей нормальной микрофлоры человека......................................................................................................39

2.2.7 Электронно-микроскопическое исследование образцов.................................40

2.2.8 Выделение тотальной РНК из культуры клеток.........................................41

2.2.9 Реакция обратной транскрипции.............................................................41

2.2.10 ПЦР-РВ для анализа экспрессии генов Chlamydia trachomatis........................42

2.3 Дизайн исследования.................................................................................43

Глава 3. Результаты.....................................................................................46

3.1 Характеристика нормального жизненного цикла C.trachomatis в процессе взаимодействия с культурой клеток фибробластов McCoy....................................46

3.1.1 Основные этапы жизненного цикла...........................................................46

3.1.2 Особенности ультраструктурной организации форм C.trachomatis

на стадии их развития внутри фагосомы..........................................................48

3.1.3 Изучение морфологических особенностей клеточного пласта в условиях инфицирования C.trachomatis..........................................................................50

3.2 Характеристика препарата.........................................................................52

3.2.1 Отбор и синтез ингибитора ССТТ............................................................52

3.2.2 Изучение токсичности ингибитора для эукариотических клеток...................53

3.3 Характеристика биологического действия ингибитора системы секреции III типа (ССТТ) в условиях in vitro................................................................................54

3.3.1 Выбор эффективной концентрации ингибитора ССТТ, подавляющей внутриклеточное размножение C.trachomatis.....................................................54

I «и I j « I t« t t i V f-4

I ' > '' 11 I

' 1

3.3.2 Ультраструктурное изучение действия ингибитора ССТТ на внутриклеточный

цикл СЛгасНотайБ..........................................................................................61

3.3.3 Анализ специфической активности соединения в отношении системы секреции III типа......................................................................................................63

3.3.3.1 Анализ влияния ингибитора СЬ-55 на локализацию белка 14-З-Зр эукариотической клетки..............................................................................63

3.3.3.2 Оценка действия соединения на локализацию эффекторного белка 1псА в клетках.....................................................................................................65

3.4 Оценка эффективности действия препарата СЬ-55 на СЛгаскотайъ на разных стадиях ее жизненного цикла............................................................................67

3.4.1 Воздействие препарата СЬ-55 на стадию адгезии и интернализации хламидий.61

3.4.2 Воздействие СЬ-55 на внутриклеточные этапы развития СЛгаскотайв..........71

3.5 Нарушение структуры ССТТ под воздействием ингибитора..............................75

3.6 Изучение морфологических особенностей клеточного пласта в условиях инфицирования СЛгаскотайъ и действия СЬ-55..................................................................77

3.7 Действие СЬ-55 на персистентную инфекцию.................................................79

3.7.1 Получение персистентных форм СЛгасИотаНв экспериментальной модели......79

3.7.2 Изучение активности ССТТ у персистирующих форм...................................82

3.7.2.1. Анализ локализации белка 1псС при персистентной инфекции...................82

3.7.2.2 Анализ локализации белка 1псА при персистентной инфекции...................82

3.7.3 Действие 55 на персистентную инфекцию.................................................83

3.7.4 Влияние СЬ-55 на процесс реверсии............................................................86

3.8 Влияние ингибитора ССТТ на экспрессию генов СЛгаскотайъ...........................88

3.8.1 Действие СЬ-55 на экспрессию генов при внесении на разных стадиях жизненного цикла.........................................................................................88

3.8.2 Уровень экспрессии генов в условиях индукции персистенции с помощью пенициллина и добавления соединения 55..........................................................94

3.9 Оценка действия ингибитора на представителей аутохтонной микрофлоры человека.......................................................................................................99

Глава 4. Обсуждение результатов...............................................................100

4.1. Собственные данные об изменении жизненного цикла СЛгасЪотайъ под действием соединения...................................................................................................104

4.2. Специфичность действия..........................................................................108

4.3 Персистентная инфекция..........................................................................109

4.4.Изменение экспрессии генов под действием СЬ-55..........................................111

4.5 Изменение экспрессии генов под воздействием СЬ-55 у персистентных форм.....112

Выводы......................................................................................................114

Список литературы.....................................................................................116

Список сокращений

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ССТТ - система секреции третьего типа

ЛПС - липополисахарид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЭТ - элементарное тело

РТ - ретикулярное тело

МОМР - major outer membrane protein - главный белок наружной мембраны

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СС - система секреции

АТФ - аденозинтрифосфат

АГ - аппарат Гольджи

РНК - рибонуклеиновая кислота

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

МОИ - множественность инфекции

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат

ТРИТЦ - тетраметилродаминизотиоцианат

МУК - методическое указание

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ПП - периплазма

ДМФА - диметилформамид

ДМСО - диметилсульфоксид

CCso - 50% Cytotoxic Concentration - 50% Цитотоксическая концентрация ч.п.и - часов после инфицирования ж.ц. - жизненный цикл

Inc - inclusion membrane protein - белки мембраны включения

КС - клеточная стенка

КОЕ - колониеобразуюшая единица

Введение

Хламидии относятся к грамотрнцательным бактериям со сложным жизненным циклом и являются облигатными внутриклеточными паразитами. В семействе Chlamydiaceae, возбудителями заболеваний человека являются - Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, и Chlamydophila psittaci [41].

В структуре бактериальных инфекционных заболеваний, передающихся половым путем (ИППП), хламидийная инфекция, вызываемая С. trachomatis, занимает первое место (приблизительно 100 млн новых случаев в год), при стабильной тенденции к увеличению числа вновь инфицированных (WHO CISID). Несвоевременная диагностика острых случаев урогенитального хламидиоза и, соответственно, отсутствие специфического лечения приводит к хронизации инфекционного процесса. Хронические урогенитальные хламидиозы рассматриваются как этиологический фактор синдрома Рейтера, воспалительных заболеваний органов малого таза у женщин, простатитов, стриктуры уретры, орхоэпидемимитов у мужчин, что может приводить к развитию женского и мужского бесплодия, и являться фактором риска в развитии реактивных артритов, патологии беременности [35]. Помимо этого системное воспаление может приводить к развитию ожирения и диабета II типа. В настоящее время существующие методы профилактики и лечения урогенитальных хламидиозов не являются оптимальными. Применяемые для лечения этой инфекции антибиотики, как правило, не предотвращают развитие хронического инфекционного процесса и неэффективны при лечении последнего [30].

В связи с этим актуальной задачей является поиск новых препаратов, направленных на эрадикацию возбудителей хламидиозов.

В последнее время для разработки антибактериальных препаратов нового поколения применяется технология мишень-направленного поиска лекарственных средств [4],[66]. Эта технология включает в себя следующие этапы:

- выбор в качестве мишеней для действия ингибиторов бактериальных белковых молекул или структур, ответственных за реализацию вирулентных свойств микроорганизма, с последующим поиском специфических ингибиторов с помощью специализированных компьютерных программ;

применение методов органического синтеза для получения активных веществ или использование природных соединений;

- экспериментальное тестирование биологической активности в отношении возбудителя инфекционного процесса в модельных системах in vitro и in vivo;

- определение безопасности применения новых препаратов.

Одним из ключевых механизмов, определяющих развитие инфекционного процесса, является транслокация белковых факторов патогенности непосредственно в эукариотические клетки организма-хозяина. Система, обеспечивающая транспорт бактериальных белков в эукариотическую клетку посредством «молекулярного шприца», получила название система секреции III типа (ССТТ) [1] . «Молекулярный шприц» формируется только у патогенных бактерий, с различными типами паразитизма [18]. По данным ряда авторов ССТТ реализует комплекс процессов, подавляющих защитные механизмы эукариотических клеток по отношению к хламидиям, обеспечивая им возможность внутриклеточного размножения [48]

В настоящее время известно несколько ингибиторов ССТТ, относящихся к различным классам низкомолекулярных соединений, которые были отобраны методами высокопроизводительного скрининга библиотек химических соединений [101], [95]. Общими недостатком этих соединений являются: плохая растворимость в органических растворителях и/или воде; токсичность в отношении клеточных культур млекопитающих (гибель до 60% клеток в присутствии специфической ингибирующей концентрации в 50мкМ). Наличие столь существенных недостатков ограничивает возможности их дальнейшей разработки для использования в качестве антибактериальных препаратов.

На основе технологии мишень-ориентированного поиска новых антихламидийных препаратов, разработанной в лаборатории хламидиозов ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, были получены новые ингибиторы ССТТ хламидий, относящиеся к классу тиогидразидов оксаминовых кислот. В предварительных исследованиях была выявлена ингибирующая активность в отношении хламидий. У полученных ингибиторов ССТТ имеется ряд преимуществ по сравнению с ранее синтезированными соединениями:

- минимальное повреждающее действие на эукариотические клетки в условиях in vitro;

- хорошая растворимость в воде и органических растворителях;

- высокая стабильность.

Совокупность вышеперечисленных свойств полученных препаратов ингибиторов ССТТ хламидий определила целесообразность их дальнейшего детального изучения в условиях экспериментальной хламидийной инфекции.

В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - изучить влияние нового ингибитора системы секреции III типа на развитие экспериментальной инфекции, вызванной С trachomatis в условиях in vitro.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить действие нового низкомолекулярного ингибитора системы секреции III типа на разные этапы жизненного цикла C.trachomatis в условиях in vitro.

2. Оценить влияние ингибитора на субмикроскопическую организацию элементарных, ретикулярных телец и персистирующих форм хламидий.

3. Охарактеризовать специфичность подавления ингибитором функциональной активности ССТТ С. trachomatis.

4. Провести анализ экспрессии генов, кодирующих структурные и эффекторные белки ССТТ C.trachomatis, при продуктивной и персистентной инфекции.

5. Изучить действие ингибитора ССТТ на жизнеспособность эукариотических клеток и некоторых представителей нормальной микрофлоры человека.

Научная новизна

Для представителя нового класса ингибиторов ССТТ, низкомолекулярного соединения, полученного на основе тиодиазинонов, впервые получена детальная микробиологическая, морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика действия ингибитора на развитие C.trachomatis в культуре клеток. Впервые получены характеристики зависимого от дозы препарата ингибирования внутриклеточного размножения возбудителя и показана его эффективность в отношении блокирования формирования инфекционных форм патогена. Показана специфичность действия соединения на транслокацию эффекторных белков хламидий и экспрессию генов, кодирующих структурные белки ССТТ.

Впервые продемонстрирована роль ССТТ хламидий на этапе первичного взаимодействия с клеткой - мишенью, обеспечивая проникновение хламидий в клетку. Показано, что на внутриклеточной стадии развития хламидий эффекторные белки ССТТ участвуют в трансформации мембраны фагосомы, в регуляции роста, деления и дифференциации в инфекционные элементарные тельца

Впервые показано, что при персистенции экспрессируются гены ССТТ, что указывает на участие этого секреторного аппарата в обеспечении жизнедеятельности персистирующих форм. Действие ингибитора приводило к снижению активности экспрессии генов, кодирующих структурные белки ССТТ при отсутствии действия на консервативные гены, что находится в полном соответствии с механизмом действия ингибитора. На модели персистентной инфекции было впервые продемонстрировано, что ингибиторы ССТТ вызывают дезорганизацию персистирующих форм и блокируют процесс их реверсии в типичные инфекционные формы, что, в конечном счете, прекращает развитие инфекционного процесса при его хроническом течении.

Практическая значимость В рамках выполнения научной тематики ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, направленной на разработку новых антибактериальных препаратов,

проведено изучение механизма действия и безопасности нового ингибитора ССТТ хламидий. Результаты проведенного исследования являются основой для разработки лекарственного препарата для лечения острых и хронических форм урогенитальных хламидиозов. Антихламидийное лекарственное средство на основе разрабатываемого ингибитора ССТТ будет иметь существенные преимущества по сравнению с применяемыми для терапии урогенитального хламидиоза антибиотиками. Это обусловлено тем, что ингибитор нетоксичен в отношении эукариотических клеток, не обладает повреждающим действием на бактерии нормальной микрофлоры человека и эффективен в отношении персистирующих форм хламидий.

Результаты диссертационной работы Кост Е.А. в части разработки метода автоматизированного исследования препаратов культур клеток, инфицированных хламидиями, внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г.Москвы, а так же в учебный процесс кафедры Биомедицинских технических систем МГТУ им. Н.Э. Баумана (имеются акты о внедрении).

Глава 1. Обзор Литературы 1.1 Характеристика семейства Chlamydiaceae

Считается, что первыми исследователями хламидий, как возбудителя трахомы, были L. Halbersta и S. Prowazek в 1907, которые предложили первое название семейства Chlamydozoa (от греч. chlamys - мантия) для обозначения матрикса вокруг элементарных телец, наблюдаемых при окраске по Гимзе. Долгое время хламидии относили к вирусам, из-за их небольших размеров и неспособности поддерживать рост в искусственных питательных средах. Позже, в 1934 г., Bedson Meyer установил сходство в жизненных циклах возбудителей трахомы и пситтакоза. Таким образом, в семействе появился новый вид, который первоначально получил название Bedsonia, а впоследствии был переименован в Chlamydia psittaci. Название рода Chlamydia было присвоено в 1945 г. авторами Jones, Rake и Stearns.

В 1968 г. было предложено различать два вида в одном роде, а именно: С. trachomatis и C.psittaci. Согласно фе