Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитального хламидиоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Латыпова, Мунира Фадисовна

Введение.5

Глава I. Обзор литературы.10

1.1. Биологические свойства и жизненный цикл

Chlamydia trachomatis. 10

1.2. Эпидемиология хламидийной инфекции.13

1.3. Основные методы лабораторной диагностики Chlamydia trachomatis:

1.3.1. Культуральныйметод.16

1.3.2. Методы иммунологического анализа.17

1.3.3 .Методы молекулярной диагностики. 21

1.3.4. Методы гибридизации нуклеиновых кислот.23

1.3.5. Методы амплификации нуклеиновых киедЬт. ?.26

1.3.6. ПЦР-анализ.32

1.3.7. Применение ПЦР-анализа в лабораторной диагностике. 38

Глава II. Собственные исследования. Материалы и методы.

2.1. Материалы исследования.

2.1.1.Общая характеристика клинического материала.

2.2. Методы исследования.44

2.2.1. Диагностика инфекции с помощью ПЦР-анализа.44

2.2.2. Метод прямой иммунофлуоресценции.

2.2.3. Метод обнаружения Chlamydia trachomatis в культуре клеток.

2.2.4. Методы статистической обработки

Глава III. Результаты исследований и их обсуждение. 53

3.1. Выбор оптимальной генетической мишени для диагностики Chlamydia trachomatis методом ПЦР.53

3.2. ПЦР-анализ как критерий излеченности.64

3.3. Выявление микробных ассоциаций, вызванных Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Herpes simplex virus 2 в урогенитальном тракте у мужчин и женщин методом ПЦР.71

3.4. Сравнительный анализ ПЦР, ПИФ и культуры клеток в диагностике урогенитального хламидиоза.79

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитального хламидиоза"

Урогенитальная хламидийная инфекция привлекает серьезное внимание не только практических врачей, но и ученых-исследователей. Несмотря на то, что фундаментально изучена биология и морфология возбудителя, разработаны чувствительные и специфичные методы диагностики, предлагаются новые антибактериальные препараты и схемы лечения, заболеваемость урогенитальным хламидиозом продолжает повсеместно увеличиваться [15, 2, 7]. Последствия невыявленной и непролеченной инфекции наносят экономический и демографический ущерб обществу и оцениваются большими суммами.

В России, по сравнению с другими странами, выявляемость хламидийной инфекции относительно низкая, т.к. диагностика урогенитальных контактных инфекций в практической сети здравоохранения недостаточно эффективна.

На выявление и учет хламидиоза влияет ряд факторов: отсутствие до недавнего времени обязательной регистрации, крайне низкий показатель обследования половых партнеров, недостаточная оснащенность лабораторной службы и уровень квалификации врачей-лаборантов [15]. Имеет значение недостаточная осведомленность населения о так называемых "новых" инфекциях, а также недоступность для части населения платных анализов.

На качество диагностики, по мнению Козловой В.И. и Пухнер А.Ф. [9], влияет особенность клиники хламидийной инфекции, течение которой чаще субъективно малосимптомное (40%) или бессимптомное (7%). Кроме того, хламидиоз нередко протекает в ассоциации с другими микроорганизмами различной природы (бактерии и вирусы), в результате чего возникают смешанные инфекции, которые имеют "стертое" клиническое течение и трудно диагностируются [11]. Хламидийная инфекция встречается также в персистентной или латентной формах, что существенно затрудняет диагностику урогенитального хламидиоза и требует комплексного применения методов лабораторной диагностики с учетом давности заболевания и наличия симптоматики.

Диагностика урогенитального хламидиоза в практической сети здравоохранения в основном производится иммунофлуоресцентным методом (прямая и непрямая иммунофлуоресценция). Однако, этот метод, по утверждению Евсеева Л.П. и ШайхаеваГ.О. [6], не обладает достаточной чувствительностью и субъективен. Наибольшей чувствительностью обладает биологический метод "посева" на культуре клеток (Мс Coy, L 924 и др.), с последующим выделением возбудителя, но он труднодоступен. В настоящее время все более широкое распространение получают методы диагностики ИППП, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) из-за быстроты выполнения исследования, высокой чувствительности и специфичности [69, 32, 103, 54, 68]. Но ПЦР, как и все другие методы диагностики, имеет свои достоинства и недостатки. Несмотря на то, что ПЦР как метод идентификации инфекционных агентов обладает наибольшей чувствительностью и специфичностью из всех доступных методов лабораторного анализа, по-прежнему возникают проблемы при его использовании в лабораторной практике. Звучит много нареканий по поводу ложноположительных результатов, отсутствие показаний для использования данных ПЦР-анализа в качестве критерия излеченности и корреляции результатов ПЦР-анализа с другими распространенными методами обнаружения урогенитального хламидиоза. Основными причинами подобных разночтений является выбор неадекватной мишени при создании диагностических тест-систем, возможность перекрестных реакций с антигенными детерминантами других микроорганизмов, как причина ложноположительных результатов, а низкая стабильность реагентов, в свою очередь, приводит к снижению чувствительности реакции и получению ложноотрицательных результатов. Вышеизложенное свидетельствует об актуальности дальнейшего углубленного изучения проблемы диагностики урогенитального хламидиоза с помощью ПЦР-анализа и других методов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Усовершенствование лабораторной диагностики хламидийной инфекции методом полимеразной цепной реакции, оценка роли и диагностических возможностей этого метода.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить чувствительность и специфичность диагностических тест-систем, предназначенных для детекции Chlamydia trachomatis и использующих различные генетические мишени (рибосомальные гены, гены плазмидной ДНК, уникальные хромосомные гены).

2. Усовершенствование ПЦР-анализа на основе выбора адекватной генетической мишени.

3. Исследовать возможность использования результатов ПЦР-анализа как критерия оценки эффективности терапии хламидийной инфекции.

4. Оценить значение ПЦР-анализа в диагностике И11П11. Выявить частоту встречаемости микробных ассоциаций, вызванных Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis., Ureaplasma urealyticum и Herpes simplex virus 2 в урогенитальном тракте у мужчин и женщин.

5. Определить диагностическую значимость ПЦР-анализа в сравнении с культуральной диагностикой и методом прямой иммунофлуоресценции для определения Chlamydia trachomatis.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведены клинико-лабораторные сравнительные исследования диагностических тест-систем отечественного производства, основанных на принципе полимеразной цепной реакции. Проведен сравнительный анализ трех генетических мишеней, а именно генов плазмидной ДНК, уникальных хромосомных генов (ген Kdo-трансферазы (gseA)) и рибосомальных генов. Гены рибосомальных РНК определены как адекватная генетическая мишень для детекции Chlamydia trachomatis в клинических образцах, обеспечивающая максимальную чувствительность и специфичность.

В работе впервые проведены исследования для определения роли результатов ПЦР-анализа, как критерия излеченности и рекомендованы сроки его использования.

Впервые методом ПЦР-анализа изучена частота ассоциаций возбудителей Ш11111 и проведены широкомасштабные исследования встречаемости смешанных инфекций в урогенитальном тракте мужчин и женщин, обусловленных Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Herpes simplex virus 2 .

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Определены диагностические возможности метода полимеразной цепной реакции с помощью усовершенствованной нами тест-системы для детекции Chlamydia trachomatis.

Установлена высокая чувствительность и специфичность ПЦР-анализа по сравнению с ПИФ и методом культуры клеток. Продемонстрирована возможность применения результатов ПЦР-анализа в качестве критерия излеченности пациентов с хламидийной инфекцией с помощью разработанной нами тест-системы с адекватной генетической мишенью к генам 16S rRNA.

Установлена возможность использования ПЦР-анализа для исследования микробных ассоциаций урогенитального тракта и диагностики смешанных инфекций.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Установлена диагностическая ценность тест-систем с различными генетическими мишенями к генам плазмидной ДНК, уникальным хромосомным генам (ген Kdoтрансферазы (gseA)) и рибосомальным генам для ПЦР - анализа при детекции Chlamydia trachomatis в материале от пациентов. В качестве оптимальной генетической мишени определены гены рибосомальных РНК.

2. Разработан алгоритм обследования пациентов с подозрением на хламидиоз, включая критерий излеченности, и даны соответствующие рекомендации.

3. Продемонстрирована возможность использования ПЦР-анализа для эпидемиологического скрининга хламидиоза и сочетанных заболеваний урогенитального тракта передающихся половым путем.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Латыпова, Мунира Фадисовна

ВЫВОДЫ

1. Сравнительное изучение различных генетических мишеней (плазмидная ДНК, гена 16S р-РНК и гена Kdo-трансферазы (gseA), кодирующего фермент, принимающий участие в синтезе одного из родоспецифических компонентов липополисахарида) показало, что ген 16S р-РНК обеспечивает достаточную специфичность и максимальную чувствительность при выявлении Chlamydia trachomatis.

2. Разработана диагностическая тест-система для определения Chlamydia trachomatis методом ПЦР с использованием праймеров, комплементарных генам 16S р-РНК.

3. Установлено, что ПЦР-анализ может служить лабораторным критерием излеченности хламидийной инфекции, т.к. в 95,9% случаев через 1 месяц после адекватной антибиотикотерапии наблюдается негативация результатов ПЦР-исследования.

4. При использовании ПЦР-анализа обнаружены наиболее часто встречаемые микробные ассоциации: Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis у 73 из 1000 обследованных мужчин (7,3%) и у 105 из 710 человек группы женщин (14,8%). Наиболее редко хламидийная инфекция встречается одновременно с герпесвирусной: у 23 человек из 1000 обследованных мужчин (2,3%) и 17 из 710 обследованных женщин (2,4%), что возможно обусловлено антагонистическими отношениями у данных ифекционных агентов.

5. Методом ПЦР хламидийная инфекция обнаружена у 280 из 1000 обследованных мужчин (28%) и у 282 из 710 женщин (39,7%). Суммируя полученные результаты лабораторного обследования среди 1710 человек, обратившихся в специализированную клинику ЦНИКВИ, занимающуюся инфекциями передаваемыми половым путем, средняя встречаемость Chlamydia trachomatis оказалась 33,85%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методы ДНК-анализа в последние годы становятся наиболее распространенным исследованием в диагностике инфекций передаваемых половым путем, т.к. открывают необычайно широкие перспективы.

Клинические лаборатории России не остались в стороне от этой тенденции и повсеместно используют один из его вариантов - полимеразную цепную реакцию, т.к. она обладает двумя важными достоинствами, которые делают ее применение весьма привлекательным: ПЦР позволяет проводить исследования, которые иными методами осуществить невозможно; даже в том случае, если проблема может быть решена традиционным путем, ПЦР позволяет решить поставленную задачу за несколько дней, а не за недели или месяцы. В последние годы накопилось много противоречивых результатов о диагностической значимости ПЦР при выявлении инфекционных агентов. В частности, звучит много нареканий на гипердиагностику при использовании этого метода или наоборот - на получение ложноотрицательных результатов. Нет полной ясности в использовании ПЦР при оценке эффективности проведенной терапии, отсутствуют четкие Г ориентиры при выборе тех или иных диагностических тест-систем.

ПЦР - сложный процесс. На его эффективность оказывает влияние множество факторов. Работа со сложными смесями ДНК и (или) с очень малыми количествами материала может потребовать оптимизации условий для достижения максимальной эффективности и специфичности ПЦР.

Сравнительный анализ, производимых в России диагностических тест-систем, основанных на принципе ПЦР показал, что все они обладают целым рядом существенных недостатков. В частности, низкое качество реагентов, что является причиной невоспроизводимости результатов, обусловленный инактивацией наиболее лабильных реагентов, входящих в состав диагностических тест-систем (праймеры, термофильная ДНК-полймераза). Вторая распространенная причина низкой чувствительности - это неадекватно выбранная генетическая мишень, что существенно ограничивает возможности ПЦР-анализа в лабораторной практике. Если первая причина носит чисто технологический характер и может быть исправлена самим производителем, то во втором случае необходимо проведение научных исследований, что и было сделано в настоящей работе. В качестве модели была использована хламидийная инфекция, как наиболее часто встречаемая в дермато-венерологической практике.

Обычно высокая чувствительность ПЦР-тест-систем достигается выбором в качестве мишени гена, имеющего несколько копий на бактериальный геном. Примером таких мишеней могут быть плазмидные гены, т.к. большинство плазмид мультикопийны. До недавнего времени считалось, что самыми чувствительными диагностическими системами для выявления Chlamydia trachomatis являются те, которые ориентированы на детекцию генов криптической плазмиды, поскольку каждая хламидийная клетка содержит 10-20 копий пЛазмидной ДНК. Однако выяснилось, что у некоторых клинических штаммов количество бесплазмидных изолятов Chlamydia trachomatis варьирует от 1-16%, что означает достаточно большую вероятность получения ложноотрицательных результатов, проверить которые в практической сети здравоохранения весьма проблематично.

Для достижения высокой чувствительности и специфичности в качестве мишени используют консервативные внутри вида фрагменты главных антигенов, негомологичные родственным генам других видов. Идеальной "мишенью", с этой точки зрения, оказался ген Kdo-трансферазы (gseA), кодирующий фермент, принимающий участие в синтезе одного из основных родоспецифических компонентов липополисахарида. Была синтезирована и проверена пара праймеров, фланкирующих фрагмент гена gseA. При оценке этой тест-системы на серийных разведениях была показана высокая специфичность, однако чувствительность (80 клеток на реакцию) была на наш взгляд недостаточной. Поэтому мы вернулись к мультикопийной матрице - к генам рибосомальных РНК. Нам удалось подобрать праймеры с незначительной 3'-концевой гомологией только одного из праймеров с некоторыми геновариантами Chlamydia pneumoniae или Chlamydia pecorum при негомологии второго праймера и практически полной гомологией со всеми геновариантами Chlamydia trachomatis. Была показана высокая чувствительность и специфичность данной тест-системы, которая достигала 40 клеток на реакцию. Таким образом, нами было определено, что для детекции Chlamydia trachomatis лучше использовать ПЦР-тест-системы с праймерами на рибосомные гены, так как они более чувствительны и не пропускают истинную инфекцию. После решения этой значимой и сложной задачи, мы перешли к практическому использованию ПЦР-анализа в лабораторной практике.

На сегодняшний день существует множество разногласий по поводу использования результатов ПЦР в качестве критерия излеченности с целью оценки эффективности проведенной терапии. Существуют предположения, что ПЦР определяет не только живой возбудитель, но и мертвые бактериальные клетки, образующиеся при воздействии антибиотика, что является причиной ложноположительных результатов даже после проведенной адекватной терапии. В наших исследованиях с помощью ПЦР-анализа мы проверили имеют ли эти, существующие предоложения, под собой научное обоснование. Выяснилось, что у 199 пациентов с диагнозом урогенитальный хламидиоз, через 4 недели после приема антибиотиков у 95,9% человек результаты в ПЦР полностью негативировались, несмотря на высокую чувствительность метода, что говорит о возможности его использования как -до, так и -после лечения.

Кроме того, в этой работе была сделана попытка определить порог негативации результатов в ПЦР-анализе от момента принятия антибиотиков. Среди 20 человек с диагнозом хламидиоз, полная негативация результатов в ПЦР наступила через 4 недели после окончания приема доксициклина по 100 мг х 2 раза в день, однако через 8 недель после терапии результат ПЦР-анализа стал позитвным у 5 человек , что было подтверждено с помощью культуры клеток. Вопросы такого характера требуют более детального и дополнительного рассмотрения. Таким образом, нами установлено, что сроки негативации хламидийной инфекции после адекватной терапии доксициклином (200 мг х 14 дней), соответствуют 1 месяцу.

Известно, что хламидии, обитая в урогенитальном тракте совместно с другими микроорганизмами различной природы (бактерии и вирусы), нередко вступают в микробные ассоциации, ответственные за возникновение смешанных инфекций, которые осложняют течение инфекционного процесса и усиливают сопротивляемость микроорганизмов к воздействию антибактериальных средств.

При обследовании до лечения 1000 мужчин и 710 женщин на Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyti cum и Herpes simplex virus 2, выяснилось, что хламидии как моноинфекция встречались только у 87 человек (8,7%) из 1000 и у 38 (5,4%) из 710. В остальных случаях они образовывали комплексы с вышеуказанными инфекциями, которые, на наш взгляд, представляют большой практический интерес. Наибольшая частота встречаемости Chlamydia trachomatis как у мужчин, так и у женщин, наблюдается в сочетании с микоплазменной и уреаплазменной инфекциями, из чего следует, что при подозрении на хламидийную инфекцию, необходимо учитывать высокую вероятность инфицирования пациента микоплазмами и уреаплазмами. Известно, что урогенитальные инфекции являются "проводниками" ВИЧ (вируса иммунодефицита человека), поэтому изучение устойчивых микробных ассоциаций может помочь в прогнозировании путей распространения этого вируса.

Еще одним из интересных моментов в наших исследованиях явилось обнаружение снижения частоты выявляемости возбудителей хламидиоза, микоплазмоза и уреаплазмоза с одновременным сочетанием вируса простого герпеса 2 типа (HSV 2). Вероятно, наблюдаются антагонистические отношения между возбудителями бактериальной и вирусных инфекций при смешанном инфицировании. Этот феномен требует дальнейшего изучения с помощью ПЦР-анализа, являющегося высокочувствительным методом, позволяющим с помощью одной методологии, в течение 6-8 часов, проводить детекцию нескольких возбудителей в одной пробе, на ранних стадиях заболевания, когда лечение наиболее эффективно.

В этой работе на большом фактическом материале проведено большое количество ПЦР - исследований и дана интерпретация полученных результатов, которые объяснены и обоснованы. Но какова же роль ПЦР-анализа в сравнительном аспекте с другими лабораторными методами, которые существуют и активно используются в настоящее время для диагностики хламидийной инфекции? Каждый метод имеет свои критерии чувствительности и специфичности, свои достоинства и недостатки, которые определяют процент выявляемости хламидийной инфекции в материале, полученном от инфицированных больных.

С целью оценки эффективности ПЦР-анализа и выработки алгоритма обследования пациентов на хламидиоз, мы провели параллельные исследования урогенитальных соскобов, полученных от женщин и мужчин с различными клиническими проявлениями и без них. Обследование проводилось тремя методами: ПЦР-анализом, с помощью обнаружения возбудителя в культуре клеток и методом прямой иммунофлуоресценции (ПИФ), поскольку они являются высокоинформативными и основаны на разных технологиях, не родственных друг другу. Эти три метода в наших исследованиях составили расширенный стандарт, с помощью которого мы более объективно подошли к оценке полученных результатов до лечения и их -интерпритации на основе анамнестических данных.

При суммировании результатов полученных в наших исследованиях получено, что в ПЦР выявляемость инфекции самая высокая 37%, в культуре клеток 31% и в ПИФ 26%. Результаты ПЦР и культуры клеток совпали в 78 % случаев; ПЦР и ПИФ - в 67%; культуры клеток и ПИФ в 78%; ПЦР, культуры клеток и ПИФ в 58%.

При интерпретации полученных данных, необходимо учитывать все факторы, влияющие на полученный результат: качество проведения анализа и тест-систем, использованных в работе, квалификацию персонала, материально-техническое обеспечение лабораторного исследования, адекватность забора материала, условия его хранения и транспортировки. В нашем случае, все соответствовало предъявляемым требованиям.

На основании полученных данных показано, что ПЦР-анализ с использованием высококачественных регулярно-контролируемых тест-систем, соответствующего оборудования и квалификации персонала, выполнения всех необходимых условий осуществления технологического процесса, не уступает классическому методу клеточных культур и является наиболее эффективным для лабораторного выявления Chlamydia trachomatis. Кроме того, с его помощью можно выявлять не только острые, но и латентные инфекции, а также проводить достоверные эпидемиологические и статистические исследования распространенности этого возбудителя, его совместной встречаемости с другими патогенами, сезонных колебаний и эффективности лечения. ПЦР может применяться как скрининшвый метод, что является очень удобным для выявления инфекции при бессимптомном течении заболевания, использоваться для изучения кинетики передачи Chlamydia trachomatis и быть полезным при обследовании в профилактических целях.

Однако, несмотря на все достоинства ПЦР-анализа, необходимо учитывать, что Российским производителям не всегда удается поддерживать высокое качество выпускаемых тест-систем, что отрицательно сказывается на качестве лабораторных исследований. В мировой практике с этой проблемой сталкиваются множество лабораторий и одним из способов обезопасить себя от некачественных реагентов и диагностических тест-систем - это систематическое проведение -внутри и -межлабораторных контрольных исследований. Для этих целей следует использовать стандартные панели образцов, содержащих заведомо известное количество инфекционных агентов (ДНК-мишеней).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Латыпова, Мунира Фадисовна, Москва

1. Адлер М.В. Контроль за заболеваниями, передаваемыми половым путем, в развивающихся странах//Заболевания, передаваемые половым путем. -М. -1997. -№2. -С.3-10.

2. Глазкова Л.К., Герасимова Н.М. Современные аспекты лечения хламидийной инфекции// Заболевания передаваемые половым путем. М. -1996. -№4. -С.9-12.

3. Глухов А.И., Гордеев С.А., Аврамова Л.В., Киселев В.И., Северин Е.С. Детекция инфекционных агентов вирусной и бактериальной этиологии методом полимеразной цепной реакции// Клиническая лабораторная диагностика. -1996. -№1. -С.32-35.

4. Дмитриев Г. А., Киселев В .И., Орлова О .Е., Сидорович С.Ю., Брагина Е.Е., Коликова Т.Г., Вахнина Т.Е., Кисина В.И., Латыпова М.Ф. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза// Пособие для врачей. -Москва. -1999. -19С.

5. Евсеев Л.П., Шайхаев Г.О. ДНК-диагностика в урологической практике// Медицинская консультация. -1995. -№3. -С. 2-18.

6. Жданов А.В., Малинина Э.В., Файзуллин Л.З. и др. Выявление методом полимеразной цепной реакции при патологиях репродуктивной системы мужчин и женщин//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1996. -№5. -С.547-550.

7. Ильин И.И., Лысенко О.В. Вопросы эпидемиологии хламидиозов человека// Вестник дерматологии и венерологии. 1993. -№4. -С.32-36.

8. Каледин А.С., Слюсаренко А.Г., Городецкий С.И. Выделение и свойства ДНК-полимеразы из экстремально термофильной бактерии Thormus aquaticus YTV// Биохимия. -1980. -т. 45. - вып. 4. -С.644.

9. Козлова В.И., Пухнер А.Ф. В книге "Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий"// М. -1995. -С.37-38, 174-224.

10. Козлова В.И., Пухнер А.П. В книге "Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий"// М. -1995. -С.238-261.

11. Коробейникова Э.А. и др. К вопросу о частоте и клинических особенностях урогенитального хламидиоза// Труды ИГМИ. 1995. -№33. -С.166-168.

12. Ориел Дж.Д., Риджуэй Д.А. Хламидиоз// Пер. с англ. -М.: Мир, 1984. -180С.

13. Пресс-релиз.ВОЗ. 25.08.95. Заболевания, передаваемые половым путем. 333 млн. новых излечимых случаев в 1995г.// Заболевания передаваемые половым путем. -М. -1995. -№5. -С.81-82.

14. Скрипкин Ю.К. Кубанова А.А., Дмитриев Г.А., Киселев В.И. и др. Современные подходы к диагностике хламидиоза// Вестник дерматологии и венерологии. -1996. -№ 4. -С. 26-29.

15. Тихонова Л.И. О сотоянии заболеваемости болезнями передаваемыми половым путем и мерах по их предупреждению в России// Заболевания, передаваемые половым путем. М. - 1997. №4. -С.22-26.

16. Халилов Э.М., Говорун В.М., Бродский М.Ю. и др. Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления хламидийной, микоплазменной и уреаплазменной инфекций в акушерско-гинекологической практике// Информационное письмо. -М. -1995.

17. Akane A., Matsubara Н., Nakamyra S. et. al. Identification of the heme compound copy-rified with deoxyribonucleis acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction amplification// J. Forensic Sci. -1994. -№ 39. -P.362-372.

18. An Q., Liu J., 0,Brien W., et al. Comparison of characteristics of Q beta replicase-ampli-fied assay with competitive PCR assay for Chlamydia trachomatis// J. Clin. Microbiol. -1995,-Vol.33 -P.58-63.

19. Backman M, Ruden AKM, Ringertz О, Sandstrom E.G. Detection of Chlamydia trachomatis in urine from men with uretritis//Eur. J. Clin Microbiol Infect. Dis. -1993. -Vol.12. -P447-449.

20. Barnes R. C. Laboratory diagnosis of human chlamydial infections// Clin. Microbiol. Rev. -1989.-Vol.92.-P. 119-136.

21. Bass C.A., Jungking D.L., Silverman N.S., Bond J.M. Clinical evaluation of a new polymerase chain reaction assay for detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens//J. Clin. Microbiol. -1993. -V.31. -P.2648-2653.

22. Bauwens J.E., Clark A.M., Stamm W.E. Diagnosis of Chlamydia trachomatic endocervical infections by a commercial polymerase chain reaction assay// J. Clin. Microbiol. -1993. -Vol,31. -P.3023-3027.

23. Belunis C.J., Mdluli K.E., Raetz C.R., Nano F.E. A novel 3-deoxy-D-manno-octuloson-ic acid transferase from Chlamydia trachomatis required for expression of the genus-specific epitope//J. Biol. Chem. -1992. Vol.267. -P.8702-18707.

24. Berger R.E., Alexander E. R, Harnish J. P., Paulsen C. A., Monda G. D. et.al. Etiology and therapy of acute epididymitis:prospective study of 50 cases// J. Urol. -1979. -Vol. 121. -P.750-754.

25. Bleker O.P., Smalbraak D.J., and Shutte M.F. Bartolin,s abscess: the role of Chlamydia trachomatis //Genitourin. Med. -1990. -Vol.66. -P.24-25.

26. Cates W., and Wasserheit J. N. Genital chlamydial infections: epidemiology and reproductive sequelae//Am. J. Obstet. Gynecol. -1991. -Vol.164. -P.1771-1781.

27. Centers for Disease Control and Prevention. False-positive results with the use of chlamydial tests in the evaluation of suspected sexual abuse// Morbid. Mortal. Weekly Rep. -1991. -Vol.39. -P.932-935.

28. Centers for Disease Control and Prevention. Recomendations for the prevention and management of Chlamydia trachomatis infections// Morbid. Mortal. Weekly Rep. -1993. -Vol.42. -№.RR-12. -P. 1-39.

29. Chan E.L., Brandt K. and Horsman G. B. A 1-year evaluationof Syva Microtrak Chlamydia enzyme immynoassay with selective confirmation by direct fluorescent-antibody assay in a high-volume laboratory// J. Clin Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.2208-2211.

30. Chernesky M. A et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infections in men and women by testing first-void urine by ligase chain reaction. // J. Clin.Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.2682-2685.

31. Chernesky M.A. Nucleic acid tests for the diagnosis of sexually transmitted diseases// FEMS Immun. Med. Microb. -1999. -Vol.24. -P.437-446.

32. Chernesky M, Castriciano S, Sellors J, et al. Detection of Chlamydia trachomatisantigens in urine as an alternative to swabs and cultures// J. Infect. Dis. -1990. -Vol.161. -P.124-126.

33. Chernesky M.A., Lee H., Schachter J., et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis urethral infection in symptomatic and asymptomatic men by testing first-void urine in a ligase chain reaction assay// J. Infect. Dis. 1994. - V.170.-P.1308-1311.

34. Crowley Т., Milne D., Arumainayagam JT., Paul ID., Caul E.O. The laboratory diagnosis of male Chlamydia trachomatis infections-time for a change,?// J. Infect. -1992. -Vol. 25. -Suppl.l. -P.69-75.

35. Dunlop E.M., Goh B.T., Darougar S., and Woodland R. Triple culture tests for the diagnosis of Chlamydial infection of the female genital tract.// Sex. Transm. Dis. -1985. -№.12. -P. 68-71.

36. Ferris D.G., and Martin W. H. A comparison of three rapid chlamydial tests in pregnant and nonpregnant women// J. Fam. Pract. -1992. -Vol.34. -P.593-597.

37. Gaydos C.A., Jang D., Welsh L.E., et al. Abstract present at the tenth International meeting od the International Society for STD Research, Helsinki, Finland, August 29 September 1. -1993.

38. Grossman, J. H., Ш, M. E. Rivlin, and Morrison. Diagnosis of chlamydial infection in pregnant women using the Testpack Chlamydia diagnostic kit// Obstet. Gynecol. -1991. -Vol.77. -P.801-803.

39. Hammerschlag M.R. Sexually transmitted diseases in sexually abused children: medical and legal implications// Sex. Trans.Infect.- 1998. -V.74. -P. 167-174.

40. Hammerschlag M. R., Cummings C., Roblin P. M., Williams Т.Н., and Delke I. Efficacy of neonatal ocular prophylaxis for the prevention of chlamydial and gonococcal conjunctivitis// N. Engl. J. Med. -1989. -Vol. 320. -P.769-772.

41. Jaschek G., Gaydos C.A., Welsh L.E., Quinn T.C. Direct detection of Chlamydia trachomatis in urine specimens from symptomatic and asymptomatic men by using a rapid polymerase chain reaction assay.// J. Clin. Microbiol. 1993. -V31. -P.1209-1212.

42. Jensen I.P., Thorsen P., Moller B.R. Sensitivity of ligase chain reaction assay of urine from pregnant women for Chlamydia trachomatis// Lancet. -1997. -Vol.349. -P.329-330.

43. Johnston S. L., and Siegel C. Comparison of Bufalo Green Monkey Kidney cells and McCoy cells for the isolation of Chlamydia trachomatis in shell vial centrifugation culture// Diagn. Microbiol. Infect. Dis. -1992. -Vol.15. -P.355-357.

44. Kellogg J.A., Seiple J.W., and Hick M.E. Cross-reaction of clinical isolates of bacteria and yeasts with the chlamydiazyme tests for chlamydial antigen, before and after use of a blocking agent// Am. J. Clin. Pathol. -1992. -Vol.97. -P.309-312.

45. Kellog J.A., Seiple J.W. et al. Direct fluorescent-antibody conformation of chlamydial antigen below the detection threshold of the Chlamydiazyme enzyme-linked immunosorbent assay// J. Clin. Microbiol. -1990. -Vol. 31. -P. 1646-1647.

46. Krul K.G. Closing in on Chlamydia;/ CAP Today -1995. -№9. -P. 1-20.

47. Lan J., Ossewaarde J.M., Walboomers J.M.M., et al. Improved PCR sensitivity for direct genotyping of Chlsmydia trachomatis serovars by using a nested PCR// J. Clin. Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.528-530.

48. Lee H.H. et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis genitourinary infection in women by ligase chain reaction assay of urine// Lancet -1995. -Vol.345. -P.213-216.

49. Loeffelholz M.J., Lewinski C.A., Silver et al. Detection of Chlamydia trachomatis in endocervical specimens by polymerase chain reaction// J. Clin. Microbiol. 1994. -Vol.30. -P.2847-2851.

50. Maas M. and Dalhoff K. Comparison of sample preparation methods for detection of Chlamydia pneumoniae in bronchoalveolar lavage fluid by PCR// J.Clin.Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.2616-2619.

51. Mahony J.B., Luinstra K.E., Sellors J.W., Chernesky M.A. Comparison of plasmid- and chromosome- based polymerase chain reaction assays for detecting Chlamydia trachomatis nuc-feis acids// J.Clin.Microbiol. -1993. -Vol. 31. -P. 1753-1758.

52. Mahony J et al. Effect of swab type and storage temperature on the isolation of Chlamydia trachomatis from clinical specimens// J.Clin.Microbiol. -1985. -Vol. 22. -P.865-867.

53. Machony J., Chong S., Jang D., et al. Riole of confirmatory PCRs in determining performance of Chlamydia Amplicor PCR with endocervical specimens from women with a low prevalence of infection// J.Clin.Microbiol. -1998. Vol.36. -P.3122-3126.

54. Mahony J. В., Luinstra К. E., Sellors J. W, Pickard L., Chong S., Jang D., and Chernesky

55. M. A. Role of confirmatory PCRs in determining perfomance of Chlamydia Amplicor PCR with endocervical specimensfrom women with a low prevalence of infection// J. Clin. Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.2490-2493.

56. Mamat U., Lobau S., Persson K., Brade H. Nucleotide sequence variations within the lipopolysaccharide biosynthesis gene gse-A (Kdo transferase) among the Chlamydia trachomatis serovars// Microb. Pathog. -1994. -Vol.17. -P.87-97.

57. Moncada J., Schachter J., Bolan G., Engelman J. , Howard L. et al. Confirmatoryassay increases specificity of the Chlamydiazyme test for Chlamydia trachomatis infection of the cervix// J. Clin. Microbiol. -1990. -Vol.28. -P.1770-1773.

58. Morris R, Legault J., and Baker C. Prevalence of isolated urethral asymptomatic Chlamydia trachomatis infection in the absence of cervical infection of incarcerated adolescent girls// Sex. Transm. Dis. -1993. -Vol.20. -P. 198-200.

59. Morrisori E.A.B., Goldberg G.L., Kadish A.S., et al. Polymerase chain reaction detection of human papillomavirus: quantitation may improve clinical utility// J. Clin. Microbiol. -1992. Vol. 30. -P.2539-2543.

60. Mouton J.W.R., Verkooyen W.I., Meijden Т.Н., et al. Detection of Chlamydia trachomatis in male and female urine specimens by using the amplified Chlamydia trachomatis test// J.

61. Clin. Microbiol. -1997. -Vol.35. -P. 1369-1372.

62. Mullis K.B., and Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-cat-alyzed chain reaction// Methods Ensymol. -1987. -Vol.55. -P.335-350.

63. Mullis KB. The unussual origin of the polymerase chain reaction// Sci. Am. -1990. -№1. -P.36-43.

64. Paavonen J. and Vesterinen E. Chlamydia trachomatis in cervicitis and urethritis in women//Scand. J. Infect. Dis.-1982. -32(Suppi.).-P.45-54.

65. Pasternack R., Vuorinen P., Miettinen A. Evaluation of the Gen-Probe Chlamydia trachomatis trancription-mediated amplification assay with urine specimens from women// J. Clin. Microbiol. -1997. -Vol.36. -P.676-678.

66. Phillips R. S., HanfFP. A., Kauffman R.S., and Aronson M. D. Use of a direct fluorescent antibody test for detecting Chlamydia trachomatis cervical infection in women seeking routine gynecologic care//J. Infect. Dis.-1987.-Vol.156.-P.575-581.

67. Quinn T.C. Recent advances in diagnosis of sexually transmitted diseases// Sex. Trans. Diseases. -1994. -Vol.21. -P.19 -27.

68. Ridway G.L., Taylor-Robinson D. Current problems in microbiology: I Chlamydial infections: Which laboratory test?// J. Clin. Pathol. -1991. -Vol. 44. -P.l-5.

69. Roosendaal R, Walboomers J.M.M., Veltman OR., et al. Comparisson of diggerent primer sets for detection of Chlamydia trachomatis by the polymerase chain reaction// J. Med. Microbiol. -1993. -Vol. 38. -P.426-433.

70. Ryan G., Abdella T.N., McNeeley S.G., Baselski VS., and D. E. Drummond D. E. Chlamydia trachomatis infection in pregnancy and effect of treatment on pregnancy outcome// Am. J . Obstet. Gynecol.-1990. -Vol.162.-P.34-39.

71. Schachter J., Stamm W.E., Qiunn T.C., et al. Ligase chain reastion to detect Chlamydia trachomatis infection of the cervix// J. Clin. Microbiol.- 1994,- Vol.32. -P.2540-2543.

72. Schachter J., Stamm W.E., Chernesky M.A., et al. Nonculture test for genital tract chlamydial infection:What does the package insert mean, and will it mean the same thing tomorrow?// Sex. Transm. Dis. -1992. -Vol.19. -P.243-244.

73. Schachter J., Stoner E., and Moncada J. Screening for chlamydial infections in women attending family planning clinics//West. J. Med. -1983. -Vol.138. -P.375-379.

74. Schwebke J.R., Stamm W. E., and Handsfield H.H. Use of sequential enzyme immunoassay and direct fluorescent antibody tests for detection of Chlamydia trachomatis infections in women// J. Clin. Microbiol. -1990. -Vol.28. -P.2473-2476.

75. Sellors J.W., Mahony J.B., Jang D., et al. Comparisson of cervical, uretral, and urine specimens for the detection of Chlamydia trachomatis in women// J. Infect. Dis. -1991. -Vol. 164. -P.205-208.

76. Shah J.S, Liu, Smith, Popof S., Radclife G., W.J.O,Brien W.J., Serpe G., Olive D.M., and

77. King W. Novel, ultrasensitive. Q-beta replicaseamplified hybridization assay for detection of Chlamydia trachomatis//J. Clin. Microbiol. -1994. -Vol.32. -P.2718-2724.

78. Smith t.f., Brown S.D., and Weed L. A. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infections dy cell cultures and serology// Lab. Med. -1982. -Vol.13. -P.92-100.

79. Smith J. W., Rogers R.E., Katz B.P., Brickler J.F., Lineback P.L., B. VanderPol. and Jones R.B. Diagnosis of chlamydial infection in women attending antenatal and gynecologic clinics//J. Clin. Microbiol. -1987. -Vol. 25. -P.868-872.

80. Smith K.R., Ching S., Lee H., et al. Evaluation of ligase chain reaction for use with urine for identification of Neisseria gonorrhoeae in females attending a sexually transmitted disease clinic// J. Clin. Microbiol. -1995. -Vol.33. -P.455-457.

81. Svenson L-O., Mares I., Olsson S.E. Detection of Chlamydia trachomatis in urinary samples from women// Genitourin. Med. -1991. -Vol.67. -P.l 17-119.

82. Svensson. L., Westrom L., RipaK. Т., and P.-A. Mardh. Differences in come clinical and laboratory parameters in acute salpingitis related to culture and serologic findings// Am. J. Obstet. Gynecol. -1980. -Vol.138. -P.1017-1023.

83. Sweet R. L., Landers D.V., Walker C., and Schachter J. Chlamydia trachomatis infection and pregnancy outcome//Am. J. Obstet. Gynecol. -1987. -Vol.156. -P.824-833.

84. Tabrizi S.N., Lees M.I., Garland S.M. Comparison of polymerase chain reaction and culture techniques for detection of Chlamydia trachomatis// Mol. Cell Probes -1993. -Vol.7. -P.357-360.

85. Taylor-Robinson D., Thomas B.G. Laboratory techniques for thediagnosis of chlamydial infections// Genitourin Med. -1991. Vol.67. -P.256-266.

86. Thomas В., Gilchrist C., Taylor-Robinson D. Detection of Chlamydia tra chomatis by direct immynofluorescence improved by centrifugation of specimens// J. Clin. Micro-biol. Infect. Dis. -1991. -№10. -P.659-662.

87. Thomas B. J., MacLeod E. J., and Taylor-Robinson D. 1993. Evaluation of sensitivity of 10 diagnostic assays for Chlamydia trachomatis by use of a simple laboratory procedure// J. Clin. Pathol. -1993. -Vol. 46. -P.912-914.

88. Thomas B. J., MacLeod E. J., Horner P. J., and Taylor- Robinson D. Limited value of two widely used enzyme immunoassays for detection of Chlamydia trachomatis in women// Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. -1994. Vol.13. -P.651-655.

89. Thomas D.L., Quinn T.C. Serologic testing for sexually transmitted diseases// Inf. Dis. Clin. NA.-1993.-Vol.7.-P.793-824.

90. Van Doornum G.J., Buimer M., Prins M., et al. Detection of Chlamydia trchomtis infection in urine samples from men and women by ligase chain reaction// J. Clin. Microbiol. -1995. -Vol.33. P.2042-2047.

91. Vossler J.L., Forbes B. A., Adelson M.D. Evaluation of the polymerase chain reaction for the detection of human papillomavirus urine. // J. Med. Virol. 1995. - Vol.45. - P.354-360.

92. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little J.L, Nadeau J.G., and D. P. Malinowski D. P. Strand displacement amplification an isothermal, in vitro DNA amplification technique// Nucleic Acids Res. -1992. -Vol.20. -P. 1691-1696.

93. Weinstock H, Dean D., and Bolan G. Chlamydia trachomatis infections. Sexually transmitted diseases in the AIDS era// Part П. Infect. Dis. Clin. North Am. -1994. -Vol.8. -P.797-819.

94. Workowski K.A., Lampe M.F., Wong G., Watts M.B., and Stamm W. E. 1993. Long term eradication of Chlamydia trachomatis genital infection after antimicrobial therapy. Evidence against persistent infection// JAMA -1993. -Vol.270. -P.2071-2075.

95. World Health Organization. Global programme on AIDS. -1995. -78P.

96. Yang, В., Yolken R, and Viscidi R. Quantitative polymerase chain rection by monitoring enzymatic activity of DNA polymerase// Anal. Biochem. 1993. -Vol.208. P.110-116.