Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе

Байракова, Александра Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе"

На правах рукописи

003482466

Байракова Александра Львовна

РОЛЬ КЛЕТОЧНЫХ ТОЬЬ-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В ФОРМИРОВАНИИ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ПРИ ХЛАМИДИОЗЕ

03.00.07 - микробиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

5 с: о п

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003482466

Работа выполнена в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Станислав Степанович Афанасьев

Владимир Андрианович Алёшкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Олег Витальевич Калюжин

Игорь Георгиевич Шемякин

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « {О » й.'С/ъХ' 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном Государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан

года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук / ■^^Я.ЛМ,^7 О.Ю.Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире (Хрянин А.А. с соавт., 2006; Серов В.Н. 1997; Рищук C.B. с соавт., 2005). Инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются традиционно значимыми на протяжении последних лет (Гомберг М.А. с соавт., 2006; Бакулев A.JI. с соавт., 2008). Урогенитальный хламидиоз (УГХ) занимает ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путём (ИППП). Возбудители хламидиоза - облигатные внутриклеточные паразиты - не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование Chlamydia trachomatis способно приводить к формированию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения (Егорова И.Е с соавт., 2003; Хаддин А.А., 2004; Порсохонова Д.Ф. с соавт., 2005). Клинические варианты течения хламидийной инфекции в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации, и эффективностью колонизационной резистентности слизистых (способность микрофлоры данного биотопа и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему от патогенной микрофлоры) (D. Van der Waaij, 1996; Клиническая лабораторная аналитика, 2003).

Ключевым звеном в распознавании макроорганизмом патогенов являются образраспознающие рецепторы врожденной иммунной системы - Toll-like рецепторы (TLR), составляющие основу мембранных комплексов и экспресси-рующиеся на всех клеточных элементах, участвующие в формировании резистентности (включая колонизационную резистентность слизистых) (Werling D. et al., 2003; Pioli P.A. et al., 2004; Богунович М.Д., 2005; Schnare M. et al., 2006; Ганковская О.Г. с соавт., 2008). TLR способны распознавать консервативные молекулярные структуры, распространенные среди микроорганизмов и отсутствующие у человека (Sandor F. et al., 2005; Janeway C.A. et al., 2002). Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с мембранными TLR, сопровождающейся активацией генов цитокинового каскада, ответственных за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов, что определяет блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфекционного агента из организма (Hertz C.J. et al., 2003; Claeys S. et al., 2003; Абатуров А.Э., 2006; Люк О'Нил, 2005).

Представляется актуальным изучение корреляции уровней экспрессии TLR на поверхности слизистых и иммунологических показателей в секретах урогенитального тракта (УГТ) женщин с различными вариантами клинического течения УГХ.

Цель исследования

Установление роли ТЬЯ-2 и ТЬГМ, микрофлоры, основных цитокинов и классов иммуноглобулинов в формировании колонизационной резистентности слизистых и в патогенезе урогенитального хламидиоза.

Задачи исследования

1. Изучение взаимосвязи между экспрессией генов ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 в со-скобном материале слизистых урогенитального тракта и проявлениями урогенитального хламидиоза у женщин.

2. Установление роли ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 в регуляции колонизационной резистентности влагалища, цервикального канала и уретры, стабилизирующей нор-мофлору и препятствующей инфицированию хламидиями и условно-патогенными микроорганизмами.

3. Оценка взаимозависимости уровней экспрессии генов ТЬК.-2 и ТЫ1-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и выраженностью ци-токинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией.

4. Исследование взаимосвязи уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 и ТЫ1-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и особенностей имму-ноглобулинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией.

Научная новизна

Впервые установлена определяющая роль ТЬЯ-2 и ТЫ1-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Уровни экспрессии генов ТЬК-2 и ТЬЯ-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. Нарушения в экспрессии генов приводят к хроническому течению урогенитального хламидиоза. Низкие уровни ТЫ1-2 и ТЬЯ-4 могут указывать на возможность начала хронизации инфекционного процесса. ТЬП слизистых урогенитального тракта через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни 51;>А и секреторного компонента (эс). Реакция эпителиальных поверхностей урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору зависит от экспрессии генов ТЬГ1-2 и ТЪЯ-4, что определяет колонизационную резистентность слизистых.

Практическая значимость

Разработаны и предложены лабораторные критерии диагностики урогенитального хламидиоза с установлением острой и хронической рецидивирующей формы заболевания, защищенные Патентом РФ «Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза» №2327995. Зарегистрирован 27.06.2008 г.

Апробированный при проведении исследований метод определения уровня экспрессии генов ТЬЯ ПЦР в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, может быть востребован при лабораторной верификации возбудителя при урогенитальном хламидиозе и явиться дополнительным критерием диагностической и прогно-

стической оценки течения урогенитального хламидиоза наряду с ИФА, уточняющим клинические формы и прогнозирующим исход заболевания. Метод воспроизводится в условиях стандартной клинической лаборатории.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования используются в научно-практической работе лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов ТЫ1-2 и ТЬЯ-4 при урогенитальном хлами-диозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются ТЬЫ-2 и ТЬЯ-4.

2. Передача активационных сигналов от ТЬЯ-2 и ТЫ1-4 на клетки урогенитального тракта может опосредоваться местной цитокиновой системой.

3. ТоП-подобные рецепторы слизистых урогенитального тракта могут определять местный иммуноглобулиновый статус.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции «Биотехнология» Учёного совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 2 от 14 мая 2009 г.

Результаты исследований доложены на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 14-18 апреля 2008 г.), IV международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербурского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокор-рекции» (Пенза, 2-3 октября 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009 г.), научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.).

Связь темы исследования с планом научной работы учреждения

Диссертационная работа А.Л. Байраковой выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Данное исследование представляет собой раздел темы НИР института «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при различных патологических состояниях».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 8 - в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации; 7 - в сборниках материалов конференций; один патент на изобретение РФ № 2327995 от 27.06.2008 г.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, гла-

вы результаты собственных исследований (состоит из четырёх подразделов), обсуждения полученных результатов и выводов. Список литературы включает 184 источника, из которых 102 опубликовано в отечественной и 82 в зарубежной литературе. Диссертация иллюстрирована 6 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Клинико-анамнестические и лабораторные данные 228 больных с УГХ позволили отобрать 100 пациенток согласно совпадению положительных результатов лабораторных данных по выявлению маркеров хламидийной инфекции в УГТ и наличия сходных антител в сыворотке крови. Учитывая, что наборы для определения IgM методом ИФА не обладают видовой специфичностью, стадию заболевания (острая или хроническая) и характер инфицирования (первичный или повторный) определяли согласно лабораторным данным по содержанию антител класса А и G в динамике (метод парных образцов). Сбор клини-ко-анамнестических данных и лабораторную трактовку результатов анализов проводили совместно с врачами-гинекологами Е.В. Фандеевой, A.B. Леоновой, З.А. Плиевой, к.м.н. Т.А. Скирдой на основании методических пособий для врачей по диагностике и лечению УГХ (Савичева A.M., 2002; Кудрявцева Л.В., 2001; Серов В.Н.,1999; Малышев H.A., 1999).

Содержание антител (Ат) в сыворотке крови позволило разделить выбранных пациенток на 4 группы. Группу I составила 41 пациентка. Положительные результаты ПИФ, ПЦР и культурального посева подтверждали наличие Ch. trachomatis в УГТ. В сыворотке крови данных больных определялись антитела класса G в титре 1:50-100. Повторный лабораторный анализ на наличие антител (через 2-3 недели) показал появление иммуноглобулинов класса А (1:50 и выше), что свидетельствовало о первичном инфицировании больных (Савичева A.M., 2002; Кудрявцева Л.В., 2001). Определяемые антитела позволили выявить острую стадию инфекционного заболевания. Пациентки также отрицали наличие ранее перенесенного хламидиоза. Группу Н составляли 29 пациенток, в клиническом материале которых также обнаруживались маркеры хламидий. В сыворотке крови данных больных определялись стойкие титры иммуноглобулинов А (1:100-1:200) и G (1:100-1:200), концентрация которых не изменялась на протяжении длительного периода. Анамнестические данные показали, что длительность заболевания составляла от 3 до 5 лет. Положительные результаты РИФ, культурального посева и ПЦР свидетельствовали о лабора-торно подтверждённом рецидиве УГХ. Схожесть клинических проявлений и наличие, по крайней мере, двух эпизодов обострения заболевания в течение предшествующих 12 месяцев также свидетельствовало о хроническом течении хламидийной инфекции. Рецидивы отмечались с частотой 1 раз в полгода. Все больные неоднократно получали антибактериальную терапию, однако не наблюдалось стойкого клинического и бактериологического положительного эффекта. В группу III вошли 30 пациенток, в анамнезе которых ранее диагностировался урогенитальный хламидиоз. Отсутствие антител класса А и низкие, не меняющиеся во времени титры IgG (1:50), указывали на давно перенесенную

хламидийную инфекцию. At IgG в титре 1:100-200 также свидетельствовало об остаточной серологии, на что указывало снижение титра антител в течение 12 месяцев. Маркёры хламидий в УГТ не выявлялись ни одним из использованных методов диагностики в течение одного года. В группу сравнения (IV, контрольная) включили 32 клинически здоровые женщины. Клинико-лабораторное обследование подтвердило отсутствие признаков хламидийной инфекций и ИППП, а также наличия гинекологической патологии.

Пациенткам 1 и 11 групп после постановки диагноза УГХ назначалась общепринятая антибактериальная терапия (азитромицин).

Возраст обследованных пациенток варьировал от 20 до 39 лет (средний возраст 28,1±5,6 года). По возрасту, общему соматическому статусу, репродуктивному состоянию, выраженности клинических проявлений, социальному положению и уровню образования пациентки всех групп были сопоставимы.

Кпинико-лабораторные методы исследования

Сбор материала осуществлялся в первую фазу менструального цикла, в среднем на 11-13 день цикла.

Диагноз УГХ устанавливался на основании результатов стандартных клинико-инструментальных методов обследования (Савичева A.M., 2004; Воробьев A.A., 2004): исследования клинического мазка из Цк, соскобного материала световой микроскопией проб с последующей обработкой флуоресцентными моноклональными Ат к Ch. trachomatis и методом ПЦР, выделения хламидий на культуре клеток McCoy. Дополнительным критерием служил анализ уровней титров IgG-Ат, IgA-AT в сыворотке крови методом ИФА (medac Diag-nostika Gmbh, Германия). Обследование проводили на первой и третьей неделе после первичного обращения; повторные исследования проводились спустя один-два месяца после антибактериальной терапии. Критерием излечснности считали отсутствие маркеров Ch. trachomatis в УГТ.

Инфицированность возбудителями инфекции, передаваемых половым путём (ИППП): вирусом папилломы человека (ВПЧ), вирусом простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирусом (ЦМВ), микоплазмами, уреаплазмами, токсоплаз-мами, кандидами - устанавливалась общепринятыми методами ПЦР, а микоплазмами, уреаплазмами - дополнительно иммуноферментным (ИФА) методом. Инфицирование ВПГ, ВПЧ и ЦМВ подтверждали дважды.

Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ

Материалам для микроскопического исследования служили уретральные, вагинальные и цервикальные мазки (Приказ МЗ РФ № 415 от 20.08.2003; Приказ МЗ СССР № 936 от 12.07.1985; Савичева A.M., 2004) с последующей окраской по Романовскому-Гимзе для характеристики лейкоцитарной реакции и клеточного состава, а другой - по Граму - для характеристики микрофлоры.

Микробиологические исследования

Бактериологическое исследование отделяемого цервикального канала, уретры и влагалища проводили общепринятым методами в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 (Приложение 1 к приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1985г).

Молекулярно-геиетические методы определения экспрессии генов TLR-2 и

TLR-4

Материалом для исследования служили мазки-соскобы со слизистой соответствующих участков УГТ, содержащие элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма (F. Sandor et al., 2005). В день обследования у женщины забирали мазки-соскобы со слизистых влагалища (Вл), цервикального канала (Цк) и уретры (Ур) с помощью стерильного урогенитального зонда, позволяющие получить со слизистой слой поверхностных эпителиальных клеток. Согласно экспериментальным данным количество исследуемого материала при заборе урогенитальным зондом составляло - 0,2 г. Содержимое зондов тщательно суспендировали в забуференном физиологическом растворе в пробирках типа «Эппендорф» с последующим определением количества всех клеточных элементов с помощью слайд-планшета (Плива-Лахема, Чехия). Конечная концентрация клеток в образце составляла не более 1х 105 клеток в мл. Полученный материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО «Силекс», г. Санкт-Петербург) в соотношении объемов суспензии клеток к раствору, равному 1:5. Уровень экспрессии генов TLR определялся методом ПЦР в режиме реального времени (РВ), совмещенной с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров к TLR-2 (TLR2-F1 -CCTTCACTCAGGAGCAGCAAGC; TLR2 - RI-TGGAAACGGTGGCACAGGAC) и TLR-4 (TLR4-F6 GAAGGGGTGCCTCCATTTCAGC; TLR4-R6 TGCCTGAGCAGGGTCTTCTCCA). Уровни экспрессии мРНК TLR контролировали (стандартизировали) по гену GAPDH (GAPDH-F1 TGCMTCCTGCACCACCAACT; GAPDH-F2 - YGCCTGCTTCACCACCTTC) за счет сходной экспрессии этого гена среди тканей человеческого репродуктивного тракта. Из исследуемого материала выделяли тотальную РНК согласно протоколу к наборам для выделения тотальной РНК на магнитных частицах Si02 _ бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО «Силекс», г. Санкт-Петербург). Синтез первой цепи кДНК проводили согласно указаниям инструкции «Набора для синтеза первой цепи кДНК (базовый)» (ЗАО «Силекс», г. Санкт-Петербург). Амплификацию с последующим определением уровня экспрессии TLR проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR, USA) с помощью детектирующего амплификатора АМК-32 («Синтол», Россия) и специфических праймеров к TLR-2 и TLR-4 («Синтол», Россия). Праймеры для последовательностей к TLR-2, TLR-4 и были подобраны с помощью программы Vector NTI. Последовательности мРНК TLR-2, TLR-4 и GAPDH взяты в GenBank и синтезированы фирмой Синтол (Москва). Количество исследуемых кДНК в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР РВ на образцах серийных разведений очищенного ПЦР-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводилась с помощью отношений TLR2/GAPDH и TLR4/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОБ).

Иммунологические методы исследования

Забор ЦС проводили с помощью стерильного урологического зонда. Зонд немедленно погружали в пробирку типа «Эппендорф», содержащую 0,5 мл физиологического раствора. К каждому образцу после взвешивания добавляли равное весовое количество физиологического раствора, после чего смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут на шейкере. Образцы хранили при температуре минус 50°С не более трёх месяцев. Определение общего белка проводили согласно инструкции к «Набору по определению общего белка в моче ФС» («Диакон Диагностика», Москва).

Определение иммуноглобулинов в ЦС женщин

Иммунологическое исследование включало определение концентрации в ЦС IgG, IgM, IgA, slgA и свободного se методом РИД (Фримель X., 1987).

Определение цитокинов в ЦС женщин

Содержание в слизи Цк IL-ip, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-y, TNF-a, ГМ-КСФ цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на двух лучевом лазерном автоматизированном анализаторе («Bïo-plex Protein Assay System», Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 10-Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Статистическая обработка полученных данных

Математическую обработку полученных данных проводили в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стыодента, метода х.2, коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs >0,7 связь считали сильной; при 0,5<rs<0,7 связь являлась средней; при г5 <0,5 связь считали слабой; при г5=0 - линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Диагностическое и прогностическое значение оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при УГХ.

Учитывая этиопатогенетическую значимость Ch. trachomaîis в развитии инфекционного процесса, было проведено исследование тесноты (полноты) связи между уровнями экспрессии генов TLR-2, TLR-4 и степенью выраженности воспалительной реакции, в частности - количеством лейкоцитов (рис.1,2,3). При световой микроскопии мазков из «трех точек»: Цк, Вл и Ур пациентов выявлено обилие полиморфноядерных лейкоцитов: 42,8±6,2, 18,2±2,1, 32,4±4,6 лейкоцитов в поле зрения, соответственно. Причем уровень лейкоцитоза в Цк и Ур коррелировал с высоким уровнем TLR-2 - 57,00±9,95 ОЕ и 37,30±7,02 ОЕ, соответственно (г > 0,6). Средний уровень экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур пациентов I группы в 7-8 раз превышал показатели II группы. Средняя корреляционная зависимость (г >0,5) выявлена между уровнем экспрессии TLR-2 и количеством лейкоцитов во Вл: 37,72±2,40 ОЕ при 18,2±2,1 лейкоцитов в поле зрения.

Ур Цк Вл

Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и IV группами (р < 0,001), И, III группами (р < 0,01), II и IV (р < 0,01); в Ур - между I и IV группами (р < 0,001), II, III группами (р < 0,01); Вл - I и III, IV группами (р < 0,05).

Рис. 1. Содержание лейкоцитов в цервикальном канале (Цк), уретре (Ур) и влагалище (Вл) женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.

В 1 группе больных выявлена высокая, по сравнению с контролем, экспрессия генов ТЫ1-4, уровни которого в Цк, Ур и Вл составляли 34,80±1,72 ОЕ (корреляция с лейкоцитами слабая), 16,28±2,82 ОЕ (корреляция с лейкоцитами сильная) и 16,68±2,36 ОЕ (корреляция с лейкоцитами сильная), соответственно.

У пациенток группы II практически во всех случаях наблюдается снижение показателя воспаления - содержания лейкоцитов, по сравнению с группой I (рис. 1,2,3). Количество лейкоцитов в Цк, Ур составляло 14,8±1,4 и 6,7±1,4, соответственно. Средний уровень ТЪЯ-2 в Цк и Ур - 5,71±1,07 ОЕ и 3,45±1,46 ОЕ, соответственно. Воспалительная реакция соответствовала наличию 15,4±4,3 лейкоцитов в поле зрения. Анализ показателей экспрессии ТЪЯ-2 во Вл не выявил существенных отличий от показателей других групп: значение экспрессии ТЬЯ-2 и лейкоцитов равно 35,3±6,74 ОЕ и 12,5±1,94 клеток в поле зрения, соответственно. Невысокое содержание лейкоцитов (менее 15) в различных отделах УГТ пациентов 11 группы, наблюдавшееся в 87,2% случаев, свидетельствует о том, что при воспалении шейки матки/уретры более чем у половины женщин с хроническим течением хламидиоза наблюдается снижение лейкоцитарной реакции, связанное с низким уровнем экспрессии генов ТЫ1-2: максимальный уровень данного рецептора не превышал 16,3 ОЕ, и для группы в целом был равен 5,71±1,1 ОЕ. Максимальный уровень экспрессии генов ТЬЯ-4 не превышал 14,47 ОЕ; составлял для Цк, Ур и Вл 8,0±1,1, 2,0±0,83 и 14,37±1,96 ОЕ, соответственно. Выявленные однотипные изменения показателей уровня экспрессии ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 в соскобах из Цк и Ур пациенток с хронической формой хламидиоза указывают на развитие так называемого «феномена рецепторной депрессии», свидетельствующего о высоком риске хрониза-ции процесса и рецидива заболевания после проведенного лечения.

- 1 группа - П группа

Ур Цк Вл

Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и II, III и IV группами (р < 0,05), II и III, IV группами (р < 0,05); в Ур - между I и II группами (р < 0,001), I и III, IV группами (р<0,01), !! и III, IV группами (р < 0,05).

Рис. 2. Уровни экспрессии генов TLR-2 в цервикальном канале (Цк), уретре (Ур) и влагалище (Вл) женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.

ЩИ - Ш группа | | - IV группа

Ур ЦК Вп

Примечание: В Цк достоверные различия выявлены между I и II, III и IV группами (р < 0,05), II и III, IV группами (р < 0,05); в Ур - между I и II группами (р< 0,001), 1 и III, IV группами (р < 0,05), II и III, IV группами (р < 0,05).

Рис. 3. Уровни экспрессии генов TLR-4 в цервикальном канале (Цк), уретре (Ур) и влагалище (Вл) женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.

При оценке уровней экспрессии TLR-2 и лейкоцитарного ответа в различных отделах УГТ обследованных Ш и IV групп (рис, 1,2,3) выявлено незначительное повышение количества лейкоцитов в группе III по сравнению с контролем. Содержание лейкоцитов в Цк, Ур и Вл обследованных III группы составляло: 8,1±1,8, 5,2±1,9, 8,6±1,7 клеток в поле зрения, в IV группе - 4,0±1,52, 3,3±1,7 и 5,1±2,0, соответственно. Уровни экспрессии TLR-2 в Цк, Ур и Вл обследованных III группы были сопоставимыми с группой IV и составляли для Цк 17,02±2,1 ОЕ и 13,8±1,9 ОЕ, Ур 11,9±1,8 ОЕ и 7,8±1,03 ОЕ, Вл 36,82±3,56 ОЕ и 12,1±1,63 ОЕ, соответственно. В III и IV группах отмечено достоверное двухкратное уменьшение показателей уровня экспрессии TLR-4 в Цк и Ур по сравнению с показателями больных 1 группы.

У 32 пациенток из группы I, прошедших курс лечения, установлено достоверное снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк (24,10±2,90Е и 14,86±3,23 ОЕ, соответственно) и Ур (16,4,8±3,4 ОЕ и 11,25±3,64 ОЕ, соответственно) в 2 и более раз по отношению к исходному уровню. У 15,1% пациенток с высоким уровнем TLR-2 в Цк и Ур (62,4±6,7 ОЕ и 35,1±5,2 ОЕ) снижение уровня наблюдалось уже на первой неделе после начала базисной терапии (39,8±4,7 ОЕ и 24,6±3,6 ОЕ). Исследование TLR-4 в Цк и Ур также выявило понижение уровня с 36,8±3,7 ОЕ и 25,1±4,6 ОЕ до 29,8±4,6 и 22,1±2,64 ОЕ, соответственно. Также в Цк, Ур и Вл больных после лечения количество лейкоцитов заметно уменьшилось и соответствовало уровню нормы у

90,9% больных. Отрицательные результаты ПЦР, РИФ и культурального метода, снижение уровня IgG при отсутствии IgA также свидетельствовали об успешной терапии и полной эрадикации возбудителя. При этом у женщин без сопутствующей инфекционной патологии наблюдалось более быстрое снижение уровней экспрессии TLR-2 и TLR-4, значения которых к окончанию лечения (3-4 недели) соответствовали показателям женщин IV группы. У пациенток с низким уровнем TLR-2 в Цк после лечения отмечено снижение уровня TLR-2 с 18,21±3,63 ОЕ до 8,5±2,1 ОЕ, при этом уровень TLR-4 практически не менялся. Количество лейкоцитов также уменьшилось с 11,0±2,3 до 8,6±1,4 клеток в поле зрения.

Инфекционные агенты активизируют TLR УГТ, запускающих воспалительную реакцию. Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обусловливает хроническое течение УГХ. Уровни TLR-2 и TLR-4 могут служить диагностическими критериями УГХ, характеризовать выраженность инфекционного процесса. Выраженность воспалительной реакции обусловлена и активацией экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в эпителии слизистых УГТ, и дополнительной активации TLR-2 и TLR-4 лейкоцитов. Об эрадикации возбудителя можно судить по изменению уровня TLR-2 и TLR-4.

2. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями микробиоценоза УГТ при УГХ у женщин

У 17,1% I группы выявлена хламидийная моноинфекция, а у 82,9% (34 пациенток) - в сочетании с другими возбудителями ИППП: уреаплазмами, ми-коплазмами, ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, трихомонадами и токсоплазмами. У 34,1% верифицирована U. urealyticum. Выявлено одновременное доминирование двух биоваров U. urealyticum Parvo и Т-960, что значительно усугубляло течение УГХ. Микоплазмы выявлены у 24,3% пациенток. У 4,8% (2 пациенток) был диагностирован токсоплазмоз и трихомониаз. У 31,7% установлено наличие ВПЧ низкой онкогенности (типы 6 и 11), и у 9,8% человек ВПЧ с ЦМВ или сразу несколько типов ВПЧ (16, 18 и 35) с высокой онкогенной способностью (рис. 4, 5, 6). Наличие УПМ установлено в I группе в Цк у 61,0% пациенток (12 родов микроорганизмов), Ур - у 48,8% (7 родов микроорганизмов), во Вл - у 51,2% пациенток (11 родов микроорганизмов). Причем у большинства больных наблюдался сочетанный характер инфицирования возбудителями ИППП и УПМ (2-7-компонентные ассоциации патогенов). Исследования во II группе на наличие возбудителей ИППП и УПМ в Цк выявили у 37,9% больных хламидий-ную моноинфекцию, у остальных - сочетанный характер инфицирования различными бактериальными агентами (рис. 4, 5, 6). У 20,7% больных выявлена уреаплазма, у 10,3% больных - микоплазма, у 27,5% - ВПЧ. Частота инфицирования ВПГ составляла 3,4%. УПМ в Цк выявлялись у 37,9% больных (6 родов микроорганизмов), в Ур- у 62,1% больных (5 родов микроорганизмов) и во Вл - у 48,3%(5 родов микроорганизмов). При микст-инфекциях регистрировались 2-5-компонентные ассоциации инфекционных агентов. В III группе у 30,0% женщин из УГТ выделялись УПМ в Цк (5 родов микроорганизмов), из Ур - у 23,3%обследованных (4 рода микроорганизмов), из Вл - у 36,6% женщин (4 рода микроорганизмов). Из бактериальных патогенов наиболее часто

встречалась уреаплазма - у 13,3% человек, при этом у 9,4% пациенток уреа-плазмоз встречался как моноинфекция и сочетанное инфицирование уреа-микоплазмой у одной пациентки; ВПЧ определялся у 26,7% больных. Регистрировалось формирование 2-3 компонентных ассоциаций патогенов (рис. 4, 5, 6).

1 группа

II группа

ДЦ Уреаплазма Микоплазма ^ ВПЧ

ИШ чмв

И ВПГ

Трихомониаз | [ Токсоплазмоз

Примечание: Монохламидийная инфекция встречалась у 7 (17,1%) пациентов 1 группы и у 11 (37,9%) пациентов II группы.

Рис. 4. Возбудители ИППП при сочетанной хламидийной инфекции у пациентов I - II групп. Процент встречаемости.

КОЕ/ми .

I группа

II группа Шгруппа

| | IV фуппа

Примечание'. В Цк достоверные различия выявлены между I и III группами (р < 0,01), I и IV группами (р < 0,001), II и IV группами (р < 0,001), III и IV группами (р < 0,01); в Ур - между I и IV группами (р < 0,001), II и III группами (р < 0,01), II и IV группами (р < 0,001); во Вл - I и III группами (р < 0,001), I и IV группами (р< 0,001), II и Ш группами (р < 0,01), II и IV фуппами (р < 0,001), III и IV группами (р < 0,01).

Рис. 5. Процент выявления и количественное содержание условно-патогенной микрофлоры КОЕ/мл в биотопах женщин с хламидийной инфекцией и женщин из групп сравнения.

В IV группе ни одним из использованных способов (ПЦР, ИФА) не были выявлены ИППП. УПМ выявлялись (рис. 4, 5, 6) у двух пациенток в Цк (3 рода микроорганизмов), у трех пациенток - в Ур (3 рода микроорганизмов) и Вл (4 рода микроорганизмов), соответственно.

По частоте выявляемое™ УПМ (рис. 5, 6) в Цк достоверные различия выявлены между I и III группами (%2= 5,470, р < 0,01), 1 и IV группами (х2= 20,800, р < 0,001), II и IV группами (х2 = 7,310, р < 0,001), III и IV (х2=4,460, р < 0,01), а между I и II, II и III группами различия не достоверны. При этом имела место в I группе средняя корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и приближалась к средней между УПМ и TLR-4 и между TLR-2 и TLR-4; во II группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь; в III группе сильная корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и приближалась к средней между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь; в IV группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь. По частоте выявляемое™ УПМ в Ур достоверные различия выявлены между I и IV группами (х2 = 13,480, р < 0,001), II и III группами (х2= 6,670, р < 0,01), II и IV группами (х2= 19,050, р< 0,001), а между группами I и II, I и HI, III и IV различия не достоверны. При этом имела место в

I группе средняя обратная корреляционная связь между УПМ и TLR-2, между УПМ и TLR-4 и слабая пряма корреляционная связь между TLR-2 и TLR-4; во

II группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено; в III группе между УПМ и TLR-2, УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено; в IV группе между УПМ и TLR-2-средняя корреляционная связь, а между УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 корреляционной связи не выявлено. По частоте выявляемое™ УПМ во Вл достоверные различия выявлены между I и III группами (х2 = 13,240, р < 0,001), I и IV группами (х2 = 27,010, р<0,001), II и III группами (х2= 4,940, р <0,01), II и IV группами (х2= 20,530, р < 0,001), III и IV группами (х2 = 5,120, р < 0,01), а между группами I и II различия не достоверны. В I группе по сравнению с IV группой дополнительно выявлена достоверно высокая инфицированность Candida spp (х2 = 3,889, р < 0,05), Streptococcus spp (у-гемолитический) -1 и IV группами Х2= 3,913, р<0,05, Enterococcus spp (%2= 20,557, р<0,001), Esherichia coli (Х2= 13,550, р<0,001), Klebsiella spp (х2= 8,460, р<0,001), Enterobacter spp (Х2 — 5,132, р < 0,01). При этом имела место в I группе слабая корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и средняя между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4; во II группе между УПМ и TLR-2 слабая, между УПМ и TLR-4, TLR-2 и TLR-4 приближалась к средней корреляционной связи;, в III группе средняя корреляционная связь между УПМ и TLR-2 и между УПМ и TLR-4, между TLR-2 и TLR-4- слабая корреляционная связь; в IV группе между УПМ и TLR-2, между УПМ и TLR-4 - сильная, между TLR-2 и TLR-4 - средняя корреляционная связь.

Staphylococcus spp

Ур Цк Вл

I группа

ill фуппа

Ур Цк Вл IV группа

Рис. 6. Процент встречаемости микрофлоры в уретре (Ур), цервикальном канале (Цк) и влагалище у пациенток с хламидийной инфекцией и женщин групп сравнения.

По частоте выявляемое™ УПМ во II группе установлены различия показателей инфицированности между Вл и Ур (х2 = 4,150 при р < 0,01 и у?= 4,340 при р < 0,01); в остальных случаях (I и II группа) наблюдалась корреляционная зависимость выявления УПМ между Вл и Цк, Цк и Ур (г s>0,5).

Оценивалась взаимосвязь уровня экспрессии генов TLR и нормофлоры Вл. Обнаружено достоверное снижение (х2= 16,353, р <0,001) количества лак-тобацилл в I группе (выявлялись у 56,1% пациента) по сравнению с IV группой (100%) в пристеночной области (интенсивность колонизации 6,5±1,0 lg КОЕ/г и 7,5±1,5 lg КОЕ/r, соответственно), также достоверно различие по сравнению со II (х2= 4,272, р < 0,01), с III группами (х2= 6,200, р < 0,01). Бифидобактерии не выявлялись (достоверность различий по сравнению с III - х2= 9,790, р < 0,001 и IV - х2= 17,580. р <0,001 группами, а со И различия не достоверны). У 72,1% обследованных II группы имело место достоверное снижение (х2= 7,880, р < 0,01) количества лактобацилл до 6,2±1,0 lg КОЕ/г по сравнению с IV группой. Различия с группой III не достоверны. Бифидобактерии выявлялись у двух пациентов (3,5±1,0 lg КОЕ/г; различия достоверны по сравнению с III -Х2= 7,364, р<0,01 и IV группами х2= 7,600, р<0,001). Различия с группой III не достоверны. У пациенток III и IV групп во Вл у 87% (7,2±0,6 ig КОЕ/г) и 100% пациентов (7,5±1,5 lg КОЕ/г), соответственно, выявлены лактобациллы. Различия между III и IV группами не достоверны. У 26,6% обследованных III группы и у 50% пациентов IV группы бифидобактерии выделялись в количестве 5,2±0,7 lg КОЕ/г и 6,1±0,9 lg КОЕ/г, соответственно; различия между группами недостоверны.

Во Вл корреляционной связи между УПМ и нормофлорой в группах не выявлено. Обратная корреляционная зависимость между УПМ к и лактобацил-лами Вл (rs=-0,7) определялась только во II группе. Не установлено корреля-

ционной зависимости показателей уровней лактобацилл и бифидобактерий (нормофлора) с показателями уровней экспрессии генов ТЬЯ.

Пациентов I и II групп разбили на четыре этиологические подгруппы (рис. 7) согласно бактериологическому посеву и лабораторным исследованиям на наличие ИППП. К первой этиологической подгруппе отнесены пациентки, у которых отсутствовали любые ассоцианты (возбудители ИППП, УПМ).

Отсутствие возбудителей ИППП, присутствие как отдельных видов УПМ (> Ю3 КОЕ/мл), так и наличие их ассоциаций объединило пациентов во вторую этиологическую подгруппу. Третью этиологическую подгруппу представляли пациентки, у которых обнаруживались различные возбудители ИППП, но в различных отделах УГТ не определялись УПМ. В четвертую этиологическую подгруппу больных включены пациентки, у которых одновременно определялось как наличие возбудителей ИППП, так и УПМ (> 103 КОЕ/мл). У пациенток группы I с четвёртой этиологической подгруппой выявлены наиболее высокие показатели уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 в Цк и Ур (94,80±6,11 ОЕ и 30,7±4,5 ОЕ, соответственно), что связано с совокупным воздействием УПМ, ИППП и патологического процесса. Достоверно выше при р<0,05 чем у больных первой этиологической подгруппы (36,3±4,10Е и 28,0±3,90Е, соответственно).

Ch tratarais+ИГГП+УГМ

Ch. traflrm=fe + ЧТП+VTW

Ch tracfrjretis+tTm

I группа

24,12% "N^

ChtractarEtis+УШ ChtedTrnstis+vnTl

II группа

рис. 7. Соотношение moho- и микст-инфицирования пациенток с УГХ.

Сочетание пяти возбудителей инфекций (два биовара уреаплазм, мико-плазмы и вирусы) и УПМ способствовало максимальной активации экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур в I группе (96,8 ОЕ и 45,6 ОЕ, соответственно). Уровни экспрессии генов TLR-2 в Цк и Ур во второй этиологической подгруппе (67,9±14,20Е и 19,6±4,50Е, соответственно) и в третьей этиологической подгруппе (51,8±8,30Е и 20,81±3,60Е, соответственно) достоверно не отличались между собой, но были ниже чем в четвёртой этиологической подгруппе. Уровни экспрессии генов TLR-2 в Цк во второй и в третьей этиологических подгруппах достоверно превышали таковые первой этиологической подгруппы. Уровни экспрессии генов TLR-2 в Ур во второй и в третьей этиологических подгруппах достоверно не отличались от соответствующих уровней первой этиологической подгруппы. Уровень экспрессии гена TLR-2 в Цк и Ур у пациентов II группы с первой этиологической подгруппой составлял 7,2±1,9 ОЕ и 3,5±0,4 ОЕ, соответственно, со второй этиологической подгруппой-13,0±3,0 ОЕ

и б,2±4,3 ОЕ, соответственно, у пациентов третьей этиологической подгруппы-8,6±2,71 ОЕ и 5,9±2,6 ОЕ, соответственно, и у пациентов четвёртой этиологической подгруппы -10,6±4,4 ОЕ и 8,1±6,7 ОЕ, соответственно. Различия показателей между этиологическими подгруппами были не достоверны. Однако они достоверно различались по этиологическим подгруппам с соответствующими показателями пациенток группы I. Микробиоценоз влагалища не оказывал влияния на экспрессию генов TLR-2. Не выявлено достоверного влияния микрофлоры в Цк, Ур и Вл на экспрессию генов TLR-4.

Все пациенты были также разделены на группы в зависимости от преобладания грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов или количественного содержания одного из этих патогенов >106 КОЕ/мл во Вл. Сравнение уровней экспрессии генов TLR-2 в I, II, III и IV группах с качественной характеристикой микрофлоры не выявил достоверных отличий с учётом наличия грамположителыюй или грамотрицателыюй микрофлоры. Однако установлен более высокий уровень экспрессии TLR-4 при наличии грамотрицательных микроорганизмов. Экспрессия генов TLR-4 отражает активность воспалительного процесса. Следовательно, различные уровни активации рецепта ров TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выражено в ответ на УПМ и менее выражено при контакте с нормофлорой.

3. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цитоки-нового профиля УГТ при УГХ у женщин

Отмечена сильная положительная корреляционная связь уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4 и IL-8 с характером течения и топики заболевания. Уровни IL-8 в ЦС у больных группы I (3780,16±421,89 пкг/мг белка) достоверно (р < 0,01) выше показателей групп III (511,72±195,44 пкг/мг белка), IV(134,04±31,76 пкг/мг белка); с группой II (2781,62±676,33 пкг/мг белка) различия недостоверны. Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в группе I сильно коррелировали с высоким содержанием цитокина (г = 0,88 и г = 0,82, соответственно). При микст-хламидийной инфекции содержание IL-8 в ЦС составляло 3801,4±322,3 пкг/мг белка. У пациентов с моно хламидийной инфекцией концентрация ИЛ-8 составляла 2981,62±91,06 пкг/мг белка и была достоверно выше показателей группы IV (р < 0,01). но ниже по отношению к содержанию ИЛ-8 у больных группы I с микст-хламидийной инфекцией (р < 0,05). Показатели уровней IL-8 определялись продолжительностью заболевания. Наиболее значительное повышение уровня IL-8 в ЦС наблюдалась у пациентов впервые инфицированных, т.е. с ранним сроком заболевания. В группе II выявлено достоверное повышение уровней IL-8 в 3,8 раза по сравнению с таковыми пациентов группы IV. Показатели уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в группе II сильно коррелировали с содержанием цитокина (г = 0,71 и г = 0,69, соответственно). Не выявлено зависимости содержания IL-8 у пациентов с микст- или моно- инфекционной формой УГХ. В группах III и IV показатели уровней IL-8 достоверно не различались. В группе III установлена средняя корреляционная связь между 1L-8 и уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4

(г >0,61 и г = 0,52, соответственно) и слабая корреляционная связь в группе IV (г > 0,48 и г = 0,35, соответственно). Во II группе выявлена средняя корреляционная связь между IL-8 Цк и УПМ Цк (г > 0,53), IL-8 Цк и УПМ Вл (г > 0,67), а в III группе - только между IL-8 Цк и УПМ Вл (г >0,67). Корреляционных связей между IL-8 ЦС и нормофлорой Вл в сравниваемых группах не установлено. Следовательно, высокие уровни экспрессии TLR-2, TLR-4 и концентрации ИЛ-8 в секрете Цк у пациентов группы I можно расценивать как выраженную воспалительную реакцию организма, направленную на предупреждение распространения инфекции за пределы шейки матки.

У пациенток группы I (141,29±10,30 пкг/мг белка) установлено достоверно более высокое содержание TNF-a в ЦС, чем в группах II (25,63±7,75 пкг/мг белка), III (7,24±2,13 пкг/мг белка) и IV (2,63±1,30 пкг/мг белка). Регистрировалась средняя корреляционная связь уровня цитокина с показателями экспрессии генов TLR-2 (г = 0,69) и (г = 0,62). Выявлено, что показатели содержания TNF-a (163,82±17,13 пкг/мг белка) в ЦС у 9 больных группы I со сроком заболевания до 2 месяцев статистически достоверно (р < 0,05) выше средних показателей по группе I в целом, а также показателей группы IV (р < 0,01), что также коррелировало с клиническими проявлениями заболевания и высокими уровнями экспрессии генов TLR-2 (67,40±2,01 ОЕ) и TLR-4 (37,80±0,19 ОЕ). В группе II уровень TNF-a достоверно выше чем в группе III, в 9 раз превышал значения показателей в группе IV и обратно коррелировал с низким уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (г = -0,63 и г = -0,58, соответственно). У пациентов групп III и IV отмечались низкие значения TNF-a в ЦС, которые достоверно не различались между собой. Установлена слабая корреляционная связь между TLR-2, TLR-4 и уровнем TNF-a в ЦС пациенток групп III и IV.

У больных группы I (952,1±149,13 пкг/мг белка) выявлены достоверно высокие концентрации IL-6 по сравнению с группами II (154,82±73,20 пкг/мг белка), III (43,28±12,40 пкг/мг белка) и IV (5,31±2,79 пкг/мг белка). Установлена сильная корреляционная связь уровней IL-6 с уровнями экспрессии генов TLR-2 (г = 0,75) и TLR-4 (г = 0,72). У больных группы II показатель уровня IL-6 в ЦС достоверно выше такового в группе IV и не отличался от такового группы III. Установлена средняя корреляционная связь уровней IL-6 с уровнями экспрессии генов TLR-2 (г = 0,62) и TLR-4 (г = 0,61). В группе III уровень IL-6 был в 8 раз выше, чем в группе IV при практически равном уровне экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. В I группе выявлена средняя корреляционная связь между IL-6 Цк и УПМ Вл (г > 0,49), во II группе - между 1L-6 Цк и УПМ Цк (г = 0,49). Прослеживается определенная связь уровня продукции IL-6 с воспалительным процессом.

Показатели концентраций IL-4 ЦС в группе I (24,83±18,44 пкг/мг белка) достоверно выше показателей у пациенток групп III (6,2±1,56 IV пкг/мг белка) и IV (3,98±1,38 пкг/мг белка); с группой II различия недостоверны. Достоверной взаимосвязи между содержанием исследуемого цитокина при различных сочетаниях возбудителей с хламидийной инфекцией, с давностью заболевания, с уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 выявлено не было. Не установлено достоверной динамики показателей уровней экспрессии IL-4 в группах II и III по сравнению с группой IV.

У больных группы I наблюдался достоверно повышенный уровень IL-lß (1515,9±364,8 пкг/мг белка) по сравнению с пациентками групп II (117,64±69,45 пкг/мг белка), III (24,67±3,81 пкг/мг белка) и IV (2,18±1,69 пкг/мг белка). Показатели концентрации IL-lß сильно коррелировали с высоким уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (г = 0,78 и г = 0,79, соответственно). Установлена зависимость уровня продукции IL-lß от характера острого хламидийного процесса. В группе II в ЦС наблюдалась относительно невысокая концентрация IL-lß (достоверно отличалась от показателей пациенток групп III и IV, р < 0,05), коррелирующая со сниженным уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (г = 0,63 и г = 0,58, соответственно) и обусловливающая хронический, вялотекущий воспалительный процесс. Корреляционных связей между IL-lß Цк и УПМ Цк, IL-lß Цк и УПМ Вл, IL-lß Цк и нормофлорой Вл в сравниваемых группах не установлено. Активирование экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 хламидиями сопровождается наработкой IL-lß, который усиливает воспалительный ответ, стимулируя продукцию дополнительных цитокинов соседними неинфициро-ванными клетками.

Уровни INF-y в ЦС (415,66±159,90 пкг/мг белка) у больных группы I статистически значимо (р < 0,05) отличались от таковых у пациенток групп II (26,69±9,50 пкг/мг белка), III (4,47±1,61 пкг/мг белка) и IV (3,13±1,35 пкг/мг белка). Установлена средняя корреляционная связь уровней INF-y с уровнями экспрессии генов TLR-2 (г = 0,52) и TLR-4 (г = 0,48). В группе II уровни INF-y были достоверно выше таковых в группах III и IV. Определялась средняя корреляционная связь уровней INF-y с показателями экспрессии генов TLR-2 (г=48) и слабая с TLR-4 (R = 0,32). Содержание INF-y в группах III и IV было на низком уровне и статистически не различалось. Низкий уровень INF-y у пациентов группы IV слабо коррелировал с уровнем экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. В I группе выявлена корреляционная связь между INF-y Цк и УПМ Цк (г = 0,41), между INF-y Цк и УПМ Вл (г = 0,57). Корреляционные связи между INF-y Цк и лактобациллами Вл установлены во II группе (г -0,41).

Не выявлено зависимости и связи между уровнями экспрессии IL-9, ILIO, IL-12 и ГМ-КСФ в изучаемых группах с топикой и выраженностью течения хламидийной инфекции.

Качественно-количественные изменения в уровнях цитокинов могут в равной степени определять как характер иммунологических нарушений, так и их клинико-диагностическое значение при различных вариантах течения УГХ. Снижение уровня одних цитокинов в ЦС и повышение содержания других цитокинов у больных с УГХ может указывать на дисбаланс регуляторных процессов, ответственных за поддержание оптимального уровня клеточной активности. Наличие провоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-6, IL-8 и INF-y) в ЦС клинически здоровых женщин (без гинекологической патологии и генитальной инфекции) объясняется постоянным контактом с УПМ, поступающей извне, присутствием собственных отмирающих клеток в секрете Цк. Следовательно, цитокины Цк при УГХ определяют выраженность клинических и лабораторных проявлений, а также исход заболевания (излечение, хронизация).

4. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями имму-ноглобулинового профиля УГТ при УГХ у женщин.

У больных группы I средние значения экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в эпителии Цк были достоверно выше аналогичных показателей в группах II, III и IV (табл.1). Уровень белка в I группе ЦС характеризовался достоверно высокими значениями по сравнению с группами III и IV; по сравнению с группой II различий не было. Отличий в содержании белка у женщин группы IV и группы III выявлено не было. Иммунологические нарушения проявлялись в виде повышения относительного количества IgA, IgG, slgA и sc, появлением IgM и IgA, содержание которых в ЦС у пациентов группы I было достоверно выше показателей в группах III и IV, а содержимое slgA и sc в группе I было достоверно выше группы II. Совместное обнаружение IgM и IgA не было зарегистрировано ни у одного пациента. Выявлена достоверная слабая корреляционная связь между уровнем общего белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 г = 0,3 (р < 0,05). Показана достоверная слабая корреляционная зависимость между уровнем общего белка и slgA, sc (г = 0,35 и г = 0,39, соответственно), более высокая между уровнем общего белка и IgG (г = 0,42), средняя - между уровнем IgG и уровнями экспрессии генов TLR-4 (г = 0,49) и не выявлено прямой корреляционной связи между IgG и TLR-2 (г<0,10). Средняя корреляционная зависимость наблюдалась между TLR-2 и slgA (г = 0,48). Коэффициент корреляции между содержанием в Цк УПМ и уровнями экспрессии генов составлял для TLR-2 г = 0,49, а для TLR-4 г<0,10, УПМ и белком - г = 0,67, УПМ и IgG - г = 0,30, УПМ и slgA- г = 0,37, УПМ и sc- г = 0,47. Нарушение микробиоценоза Цк, сопровождалось снижением рН содержимого ЦС до 5,8 (норма 6,4-8,0), выраженным увеличением количества лейкоцитов. Высокие уровни экспрессии TLR-2, TLR-4, содержания лейкоцитов, белка и Ig у пациентов группы I можно расценивать как выраженную местную иммунологическую реакцию макроорганизма, отражающую остроту инфекционного процесса. В ЦС нарастание уровней IgG связано с местным синтезом и экссудацией, а выявление slgA и sc обусловлено их синтезом in situ.

У пациенток группы II регистрировалось достоверное снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в 2 и 2,5 раза, соответственно, относительно показателей группы I (табл.1), а также они достоверно ниже таковых в группе IV. Уровень белка в ЦС достоверно выше по сравнению с группами I, III и IV. Уровни лейкоцитов повышены относительно пациентов групп III и IV. Из 29 у 7 пациенток (длительное течение хронического УГХ с вовлечением в патологический процесс верхних отделов УГТ) регистрировался IgA. По сравнению с пациентами группы I также достоверно уменьшено содержание slgA, sc и лейкоцитов (р < 0,05). Однако они были достоверно выше, чем в группе IV. Содержание IgG достоверно увеличилось более чем в 1,3 раза по сравнению с группой I. Показатели slgA и sc сильно коррелировали с уровнями экспрессии генов TLR-2 (г = 0,77) и слабо с TLR-4 (г = 0,29). Выявлена средняя корреляционная зависимость между содержанием общего белка и IgG (г = 0,51), отсутствием корреляционной зависимости с slgA и sc. Установлена сильная корреляционная зависимость между содержанием IgG и TLR-2 (г = 0,48), IgG и УПМ (г = 0,73), слабая между IgG и TLR-4 (г = 0,32). Высокие уровни белка в ЦС и

IgG, наличие повышенной лейкоцитарной реакции в Цк указывают на хронический воспалительный процесс. В ЦС нарастание уровней IgG связано, в основном, с местным синтезом и в меньшей степени с экссудацией через слизистую сыворотки крови, а выявление slgA и sc обусловлено их пониженным местным синтезом. У пациенток группы III уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 статистически не отличались от показателей группы IV. Уровни IgG, slgA и sc в ЦС и лейкоцитов в Цк у пациенток группы III достоверно выше таковых группы IV (р < 0,05). Установлена корреляционная связь между содержанием общего белка и уровнями экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (г = 0,40), slgA (г = 0,49). После излечения от хламидийной инфекции регистрируются остаточные проявления нарушений местного иммунитета со стороны гуморальных факторов (синтезируются местно) и уровней лейкоцитов.

Таблица 1. Уровни иммуноглобулинов у больных с различными формами УГХ и клинически здоровых женщин.

Параметры иммунитета, (M±mN)

Обследованные группы Уровень достоверности различий показателей между группами, Р < 0,05

Показатели I (n=41) Острый УГХ II (n=29) Хронический УГХ 111 (n=30) Переболевшие УГХ IV (n=32) Практически здоровые, контроль

TLR-2 OE 57,00±9,95 5,71*1.07 18,67±2,39 17,02±2,10 11<1 и IV; 1>Н и III

TLR-4 34,80±1,72 8,01± 1,08 I3,50±0,93 13,8±1,9 I>II; IKIV

Лейкоциты 42,8±6,2 14,8±1,4 8,1 ±1,8 4,00±1,52 IV< I, II и III

УПМ, Lf> КОЕ/мл 3,70±1,56 3,80±0,27 1,36±0,37 1,94±0,37 I >111 и IV; 11>Ш и IV

Белок г на мл пробы 1,40±0,92 1,67±0,78 0,41 ±0,33 0,35±0,26 tl>I, III и IV

IgM* 31,01±4,07 0 0 0 0

IgG P3 X ? 32,41 ±4,41 4!,81±3,56 ll.30i2.47 6,67±1,25 I >111 и IV; Н>Ш и IV

IgA" — <u Ь «> 12,50±3,54 17,39±0,83 0 0 0

slgA i " 36,30±2,63 22,35±2,66 12,60*1,45 5,64±0,62 IV<I, 11 и III

sc 43,19±5,47 29,25±3,39 16,2±2,48 7,23±0,98 IV< I, II и III

Примечание: УГХ - урогенитальный хламидиоз; ОЕ- относительные единицы; УПМ- условно-патогенные микроорганизмы;* - встречался у 4 из 41 пациентов I группы; ** - 1§А встречался у 2 из 41 пациента I группы и 7 из 29 пациентов II группы.

При отсутствии УГХ у пациенток группы IV отмечаются низкие значения содержания ^ (табл. 1). Невысокие концентрации ^О в ЦС клинически здоровых женщин объясняются антигенной стимуляцией поступающими извне микроорганизмами. Показатели уровней экспрессии генов Т1Л-2 и TLR-4 также характеризовались низкими значениями. Установлена корреляционная связь между содержанием общего белка и уровнями экспрессии генов Т1Ж-2 и TLR-4 (г =>0,40), ДО (г »0,46).

Таким образом, при УГХ в УГТ взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета Т1^-2 и Т1^-4 (контролируют запуск цитокинового каскада мест-

ной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуног-лобулиновое звено и воспалительная реакция) с нормофлорой определяет колонизационную резистентность слизистых (рис. 8) и характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер. При выраженной острой или хронической воспалительной реакции в Цк уровень ^С определяется не только местным синтезом, но проникновением из крови за счёт повышения проницаемости слизистой Цк. Предлагаемый комплексный подход лабораторной диагностики УГХ позволит в каждом конкретном случае оценить состояние местной врождённой антиинфекционной резистентности эпителия слизистых УГТ, конкретизировать причины хронизации инфекционного процесса и обосновывает применение дополнительных диагностических и прогностических критериев при УГХ.

Рис. 8. Взаимодействие факторов, определяющих колонизационную резистентность

ВЫВОДЫ

1. Впервые установлено, что оценка уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 и ТЬК-4 в соскобном материале из цервикального канала и уретры больных урогени-тальной хламидийной инфекцией позволяет различить острую и хроническую форму течения хламидиоза, а также выявить начало хронизации инфекционного процесса.

2. При остром урогенитальном хламидиозе снижение уровней экспрессии генов ТЬЯ-2 и 'ГЫМ наряду с прямыми методами детекции возбудителя могут косвенно свидетельствовать об эрадикации хламидий.

3. Реакция ТЬИ. на условно-патогенную микрофлору и нормофлору определяет цитокиновый и иммуноглобулиновый профили и колонизационную резистентность слизистых урогенитального тракта.

4. При урогенитальном хламидиозе То11-подобные рецепторы запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни в^А и эс.

5. Цитокиновая система опосредует передачу активационных сигналов от ТЫ1 на клетки УГТ макроорганизма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Байракова A.JI. Уровень экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как прогностический критерий излеченности при урогенитальном хламидиозе / А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгресса.- М., 2008.С.387-388.

2. Гречишникова О.Г. Лабораторная база диагностики хламидиоза / О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, В.В. Слободенюк, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова И Человек и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгресса.- М„ 2008.С.430-431.

3. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как показатели динамики патогенетических изменений при урогенитальном хламидиозе / А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы четвертой международной конференции. - СПб, 2008. - С. 53.

4. Байракова А.Л. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма / А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Е.А. Егорова, В.А. Метельская, О.Г. Гречишникова, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский // Вести. РАМН. - 2008. - № 1. -С. 45-54.

5. Караулов A.B. Прогностическая значимость экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин / A.B. Караулов, М.С. Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, А.Н. Шкопоров, Ю.В. Несвижский, С.А. Леваков. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2. - № 2-3. -С.178.

6. Алешкин В.А. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как критерий оценки эффективности алгоритмов терапии при хламидиозе / В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, A.B. Караулов, А.Л., Байракова, С.С. Афанасьев, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Современные представления об иммунокоррекции. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Пенза, 2008. -С. 8-10.

7. Воропаева Е.А. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями.микробиоценоза урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин / Е.А. Воропаева, A.B. Караулов, А.Л. Байракова, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2008. - № 2. - С. 68-76.

8. Афанасьев С.С. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цитокинового профиля урогенитального тракта при уроге-нитальном хламидиозе у женщин / С.С. Афанасьев, АЛ. Байракова, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, A.B. Караулов, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, А.П. Топтыгина, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, Кострова О.М., В.А. Метельская, М. С. Афанасьев, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Естественные науки. - 2008. - № 4 (прил. N!25).-C. 57-63.

9. Метельская В.А. Современные методы лабораторной диагностики хламидиозов / В.А. Метельская, В.А. Алешкин, В.В. Зверев, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, М.С. Афанасьев, А.Л. Байракова, Е.А. Егорова // Журн. микробиол. - 2008 - № 4. -С. 111-117.

10. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как способ оценки формы и прогноза течения урогенитальной хламидийной инфекции у женщин / А.Л. Байракова, О.Г. Гречишникова, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, М.С. Афанасьев // Биологическая безопасность в современном мире. Материалы науч.-практ. конф. СМУиС. - Оболенск, 2009. - С. 98-100.

11. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза у больных в зависимости от остроты клинических проявлений / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, Е.А. Воропаева, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XVI Росс. Нац. конгресса - М, 2009. - С. 76.

12. Афанасьев С.С. Молекулярные механизмы индукции врождённого иммунитета / С.С. Афанасьев, В.А. Алёшкин, А.Л. Байракова, Е.А. Воропаева, Ю.В. Несвижский, Л.И. Кафарская, Е.А. Егорова, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, О.Г. Гречишникова, A.A. Куракова // Вестник РАМН. - 2009. - № 4. - С. 42-49.

13. Алешкин В.А. Связь уровней мРНК TLR-2 и TLR-4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогени-тальном хламидиозе у женщин /В.А. Алешкин, A.B. Караулов, А.Л. Байракова, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, Л.И. Кафарская, Ю.В. Несвижский, Б.А. Ефимов, А.Н. Шкопоров, М.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, С.А. Леваков, В.А. Метельская, Н.С. Матвеевская, Р.Л. Панурина, Е.А. Егорова, В.В. Слободенюк, Е.В. Фандеева // Иммунология. - 2009. - Т. 30 -№ 3. - С. 165-170.

14. Байракова А.Л. Экспрессия гена TLR-2 как показатель состояния локального иммунитета у женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией / А.Л. Байракова, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, Е.В. Фандеева, М.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, В.В. Слободенюк // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: сборник мате риалов юбилейной Всероссийской науч.-практ. конференции - Нижний-Новгород, 2009. - С. 172-173.

15. Топтыгина А.П. Особенности индукции местного иммунного ответа у больных урогенитальным хламидиозом / А.П. Топтыгнна, С.С. Афанасьев, АЛ. Байракова, Е.А. Воропаева, В.А. Алёшкин, М.С. Афанасьев, Е.В. Фандеева // Российский иммунологический журнал. -2009. - Т. 3 (12) - № 2,- С. 171-176.

Патент РФ на изобретение Пат. № 2327995 Российская Федерация. Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза / АЛ. Байракова, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, СС.Афанасьев, Л.И. Кафарская, О.М, Кострова, Ю.В. Несвижский, О.В. Рубальский, О.Г.Гречишникова, В.А. Метельская, А.Н. Шкопоров, Б.А. Ефимов, A.A. Куракова, Е.А. Егорова, К.В. Поздняков, М.С. Афанасьев, А.М. Затевалов, Е.В. Хохлова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. - № 2007123483; заявл. 25.06.2007; опубл. 27.06.2008., Бюл. № 18. -3 с.

Список сокращений

At - антитела

ВПЧ - вирус папилломы человека

ВПГ - вирус простого герпеса

Вл - влагалище

ГМ-КСФ - гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор

ДК -дендритные клетки

ИФА - иммуноферментный анализ

ИППП - инфекции, передаваемые половым путём

ЛПС - липополисахарид

НК - нормальные клетки киллеры

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РИД - радиальная иммунодиффузия по Манчини

РИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции

РТ - ретикулярные тельца

Ур - уретра

УГТ - урогенитальный тракт

УГХ - урогенитальный хламидиоз

УПМ - условно-патогенная микрофлора

Цк - цервикальный канал

ЦС - цервикальный секрет

ЦМВ - цитомегаловирус

ЭТ - элементарные тельца

CD - клеточные рецепторы

Ig - иммуноглобулин

INF-a - интерферон альфа

INF-y - интерферон гамма

IL - интерлейкин

PRR - образраспознающие рецепторы

РАМР - консервативные молекулярные структуры

slgA - секреторный иммуноглобулин А

sc - секреторный компонент

TLR (Toll-like) -То11-подобные рецепторы

TNF-a - фактор некроза опухолей альфа

Байракова Александра Львовна

03.00.07 - микробиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Формат 60xS4'/,6. Бумага офсетная Рюография. Тираж 100 экз. Заказ № 321/09 от 16.10.09 г.

Отпечатано в ООО «Литера-Принт» Москва, ул. Прянишникова, д. 19а, стр. 4 Тел./факс: (495) 771-34-77 www.Iitera-print.nj E-mail: litera-print@yandex.ni

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Байракова, Александра Львовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 .Медицинское, эпидемиологическое и социальное значение урогенитальной хламидийной инфекции.

1.2.Этиологическая роль хламидий в возникновении и развитии воспалительных процессов женской половой сферы при УГХ.

1.3.Состояние местной антиинфекционной резистентности УГТ.

1.4.Роль То11-подобных рецепторов эпителия слизистых открытых полостей в развитии заболеваний.2.

1.4.1.Экспрессия TLR на клетках и в тканях человека.

1.4.2.Роль TLR в патогенезе инфекционных заболеваний и инициации местной антиинфекционной резистентности.

1.4.3.Количественная и функциональная оценка То11-подобных рецепторов.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1 .Характеристика пациентов.

2.2.Клинико-лабораторные методы исследования.

2.2.1 .Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ.

2.2.2 Микробиологические исследования.

2.2.3.Молекулярно-генетические методы определения экспрессии генов TLR-2 и TLR-4.

2.2.4.Иммунологические методы исследования.

2.2.4.1.Определение иммуноглобулинов в ЦС женщин.

2.2.4.2.0пределение цитокинов в ЦС женщин.

2.2.5.Статистическая обработка полученных данных.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1.Диагностическое и прогностическое значение оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при УГХ.

3.2.Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями микробиоценоза урогенитального тракта при УГХ у женщин.

3.3.Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цитокинового профиля урогенитального тракта при УГХ у женщин.

3.4.Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при

УГХ у женщин.

Глава 4. Обсуяадение полученных результатов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе"

Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире [65,86,98]. Инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются традиционно значимыми на протяжении последних лет [6,23]. Урогенитальный хламидиоз (УГХ) занимает ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путём (ИППП). Возбудители хламидиоза - обли-гатные внутриклеточные паразиты - не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование Chlamydia trachomatis способно приводить к формированию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения [30,70,97]. Клинические варианты течения хламидийной инфекции в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации, и эффективностью колонизационной резистентности слизистых (способность микрофлоры данного биотопа и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему от патогенной микрофлоры) [40,175].

Ключевым звеном в распознавании макроорганизмом патогенов являются образраспознающие рецепторы врожденной иммунной системы — Toll-like рецепторы (TLR), составляющие основу мембранных комплексов и экспресси-рующиеся на всех клеточных элементах, участвующие в формировании резистентности (включая колонизационную резистентность слизистых) [163,178,10,19,152]. TLR способны распознавать консервативные молекулярные структуры, распространенные среди микроорганизмов и отсутствующие у человека [134,159,160,161]. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов с мембранными TLR, сопровождающейся активацией генов цитокинового каскада, ответственных за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов, что определяет блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфекционного агента из организма [4,56,114,128]

Цель исследования

Установление роли TLR-2 и TLR-4, микрофлоры, основных цитокинов и классов иммуноглобулинов в формировании колонизационной резистентности слизистых и в патогенезе урогенитального хламидиоза. Задачи исследования

1. Изучение взаимосвязи между экспрессией генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и проявлениями урогенитального хламидиоза у женщин.

2. Установление роли TLR-2 и TLR-4 в регуляции колонизационной резистет-ности влагалища, цервикального канала и уретры, стабилизирующей нормоф-лору и препятствующей инфицированию хламидиями и условно-патогенными микроорганизмами.

3. Оценка взаимозависимости уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и выраженностью цитокинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией.

4. Исследование взаимосвязи уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале слизистых урогенитального тракта и особенностей имму-ноглобулинового профиля секрета цервикального канала женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией.

Научная новизна

Впервые установлена определяющая роль TLR-2 и TLR-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. Нарушения в экспрессии генов приводят к хроническому течению урогенитального хламидиоза. Низкие уровни TLR-2 и TLR-4 могут указывать на возможность начала хронизации инфекционного процесса. TLR слизистых урогенитального тракта через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, slgA и секреторного компонента (sc). Реакция эпителиальных поверхностей урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору зависит от экспрессии генов TLR-2 и TLR-4, что определяет колонизационную резистентность слизистых.

Практическая значимость

Апробированный при проведении исследований метод определения уровня экспрессии генов TLR ПЦР в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров, может быть востребован при лабораторной верификации возбудителя при урогенитальном хламидиозе и явится дополнительным критерием диагностической и прогностической оценки течения урогенитального хламидиоза наряду с ИФА, уточняющим клинические формы и прогнозирующим исход заболевания. Метод воспроизводится в условиях стандартной клинической лаборатории. Внедрение результатов работы

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются TLR-2 и TLR-4.

2. Передача активационных сигналов от TLR-2 и TLR-4 на клетки урогенитального тракта может опосредоваться местной цитокиновой системой.

3. То11-подобные рецепторы слизистых урогенитального тракта могут определять местный иммуноглобулиновый статус.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Байракова, Александра Львовна

Выводы

1. Впервые установлено, что оценка уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в соскобном материале из цервикального канала и уретры больных урогени-тальной хламидийной инфекцией позволяет различить острую и хроническую форму течения хламидиоза, а также выявить начало хронизации инфекционного процесса.

2. При остром урогенитальном хламидиозе снижение уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 наряду с прямыми методами детекции возбудителя могут косвенно свидетельствовать об эрадикации хламидий.

3. Реакция TLR на условно-патогенную микрофлору и нормофлору определяет цитокиновый и иммуноглобулиновый профили и колонизационную резистентность слизистых урогенитального тракта.

4. При урогенитальном хламидиозе То11-подобные рецепторы запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, slgA и sc.

5. Цитокиновая система опосредует передачу активационных сигналов от TLR на клетки УГТ макроорганизма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Байракова, Александра Львовна, Москва

1. Абелев Р.И. Основы иммунитета //Саровский образовательный журн.-1996.-№5.-С. 4-10.

2. Аковбян В.А. Азитромицин (сумамед), как препарат первого выбора при лечении урогенитального хламидиоза//ИППП.-2 002.-№ 1.-С. 20-40.

3. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.-JI.-1962.

4. Абатуров А.Э. Молекулярные механизмы неспецифической защиты респираторного тракта: распознавание патоген-ассоциированных молекулярных структур //Журн. здоровье ребенка.-2006.-Т. 2, № 2.-С. 14-18.

5. Бакулев A.JI., Слесаренко Н.А. О клинической классификации болезни Рейтера //Рос. журн. кож. и вен. болезней.-2002.-№ 2.-С. 66-68.

6. Бакулев A.JL, Василенко JI.B., Оркин В.Ф., Степанов С.А. Воспалительные заболевания гениталий инфекционной природы у женщин. Учебное пособие.-М., Изд. Дрофа.-2008.

7. Барычева Л.Ю., Орехов К.В., Голубева М.В. Показатели иммунного статуса и иммунопатологические синдромы у детей с врожденной хламидийной инфекцией //Иммунология.-2004-№ 6.-С. 361-364.

8. Баткаев Э.А., Рюмин Д.В. Этиотропная терапия урогенитального хламидиоза //Клин, дерматол. и венерол. -2003.-№ З.-С. 13-19.

9. Белькова Ю.А. Инфекции передающиеся половым путем, при беременности: влияние на ее исходю Возможности профилактики и леченияю //Фарматека: международный медицинский журнал.-2006.-№ 14.-С. 59-66.

10. Бутов Ю.С., Васенова В.Ю., Новик Ф.К., Аверкиев В.Г. Терапия больных урогенитальным хламидиозом с хроническим осложненным течением //Гинекология.-2005.-Т. 7, № 2.-С. 124-126.

11. Васильев М.М. Николаева Н.В. Хламидийная инфекция. Проблема антибио-тикорезистентности //Вест, дермат. и венер.-2003.-№ З.-С. 18-21.

12. Вард М.Е. Современные данные об иммунологии хламидийной инфекции //ЗППП.-1996.-№ 6.-С. 3-6.

13. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. Руководство для врачей. /Под ред. В.И. Козлова, А.Ф. Пухнер.-М.:Триада-Х.-2003.

14. Воробьев А.А. (ред.) Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии. -М., Мед. информ. Агенство.-2004.

15. Воропаева Е. А., Афанасьев С. С., Алешкин В. А. И др. Способ оценки микробиоценоза влагалища.- Патент РФ № 2249821. Зарегистрирован 10.04.2005.

16. Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А. и др. Микрофлора биотопов влагалища, ротоглотки и кишечника женщин с угрозой прерывания беременности на ранних сроках //Вестн. РАМН.-2008.-№ 2.-С. 6-12.

17. Ганковская О.А., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Роль То11-подобных рецепторов и дефензинов в противомикробной защите урогенитального тракта женщин//Журн. микробиол.-2008.-№ 1.-С. 46-50.

18. Герасимова Н.М., Скидан Н.И. Новая схема применения сумамеда в терапии генитальной хламидийной инфекции у мужщин //Сиб. журн. дерматол. и венерол.-2001.-№ 1.-С. 66.

19. Гизингер О.А., Долгушин И.И. Система провоспалительных цитокинов в цервикальном секрете у женщин с урогенитальным хламидиозом //Цитокины и воспаление.-2006.-Т. 5, № 4.-С. 13-16.

20. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с анг.-М., Практика.-1998.

21. Гомберг М.А., Поздняков О.Л., Соловьев A.M. Урогенитальная хламидийная инфекция: лечить или не лечить? //Consilium medicum.-2006.-T. 8, № 4.-С. 2125.

22. Гранитов В.М. Хламидиозы.-М.: Медициская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА.-2002.

23. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. Иллюстрированное руководство.-М.: Медицинская книга.-2007.

24. Долгушин И.И., Гизингер О.А., Телешева Л.Ф. Иммунологические и микробиологические аспекты действия низко-интенсивного лазера на факторы местного иммунитета репродуктивного тракта женщин с хламидийной инфекцией //Журн. микробиол.-2006.-№ 4.-С. 105-109.

25. Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза репродуктивного тракта женщин //Журн. микробиол.-2005.-№ 5.-С. 84-87.

26. Дубровская М.И., Мухина Ю.Г., Кафарская Л.И., Шумилов П.В. Современные представления о механизмах формирования иммунного ответа слизистой оболочки кишечника у детей раннего возраста //Журн. трудный пациент.-2006.-Т. 4, № 6.-С. 9-14.

27. Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемые половым путем.-М., Мед. лит-ра.-2003.

28. Иванов О.Л., Халдин А.А., Фадеев А.А., Изюмова И.М. К диагностике и терапии негонококковых уретритов авелоксом //Рос. журн. кож. и вен. болезней. -2002.-№ 6.-С. 65-67.

29. Иммунобиологические препараты, перспективы применения в инфектоло-гии. Г.Г. Онищенко, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова (ред.).-М., ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ.-2002.

30. Иммунологические методы. Г. Фримеля (ред.).-М.-Медицина.-1987.

31. Интерфероновый статус, препараты интерферона в лечении и профилактике инфекционных заболеваний и реабилитация больных. С.С. Афанасьев, Г.Г. Онищенко, В.А. Алёшкин и др.(ред.).-М., Триада-Х.-2005.

32. Инфекции в акушерстве и гинекологии. Макаров О.В., Алёшкин В.А., Савченко Т.Н. (ред).-М., «МЕДпресс-информ».-2007.

33. Калинина Н.М., Сосюкин А.Е., Вологжанин Д.А. и др. Травма: воспаление и иммунитет //Цитокины и воспаление.- 2005.-Т. 4, № 1.-С. 28-35.

34. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета //Иммунология.-1995.-№ З.-С. 3044.

35. Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз.-Санкт-Петербург, ООО «Нева-Люкс».-2001.

36. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах. Том IV. /Под ред. В.В. Меныпикова.-М., Агат-Мед.-2003.

37. Клинышкова Т.В. Локальный синтез иммунорегуляторных цитокинов у женщин с бесплодием на фоне восходящей хламидийной инфекции //Клин, дерматол. и венерол.-2005.-№ 4.-С. 89-92.

38. Ковальчук Л.В. Врожденный и приобретенный иммунитет: клинические проблемы.-XIII российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Москва, 3-7 апреля 2006г. Лекции для практикующих врачей.-2006.-М.-С. 103121.

39. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. и др. Роль рецепторов врожденного иммунитета в развитии острого инфаркта миокарда //Журн. микро-биол.-2008.-№ 4.-С. 64-98.

40. Ковальчук JI.B., Хорева М.В., Варивода А.С. и др. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке Toll-подобных рецепторов человека //Иммунология.-2008.-Т. 29, № 4.-С. 223-227.

41. Коджаева М.Х., Подзолкова Н.М., Кулаков А.В. и др. Полиоксидоний в комплексной терапии рецидивирующих инфекций урогенитального тракта у женщин //Terra Medica nova. Медицинский журнал для врачей всех специально-стей.-2004.-Т. 4.-С. 14-18.

42. Краткая медицинская энциклопедия. Т. I. /Под. ред. В.И. Покровского.-М.: НПО «Медицинская энциклопедия», «Крон-Пресс».-1994.

43. Кудрявцева JI.B., Мисюрина О.Ю., Генерозов Э.В. и др. Клиника, диагностика и лечение хламидийной инфекции (пособие для врачей).-М.-2001.

44. Куляш Г.Ю. Персистирующая урогенитальная инфекция: возможности и нерешенные вопросы лабораторной и клинической диагностики //Ш11И 1.-2003 .-№ З.-С. 3-8.

45. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Новая иммунология- иммунология образрас-познающих рецепторов //Журн. известия РАН.-2006-Т. 33, № 5.-С. 517-529.

46. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Конфликт организма человека с его микрофлорой //Природа.-2007.-№ 7.-С. 1-8.

47. Лобзин Ю.В., Лященко Ю.И., Позняк А.Л. Хламидийные инфекции. Руководство для врачей.- СПб.: ООО «Издательство Фолиант».-2003.

48. Люк О'Нил. Врожденный иммунитет: система раннего оповещения //Журн. в мире науки.-2005.-№ 4.-С.32-39.

49. Мавров ГЛ., 4iHOB Г.П. Роль цитоюшв у патогенез! хламщюзу //Украшський журнал дерматологи, венерологи, косметологи.-2004.-№ 1.-С. 53-59.

50. Малова И.О. Современный взгляд на проблему урогенитального хламидиоза у девочек младшего возраста.-1-ый Сибирский конгресс акушеров-гине-кологов и дерматовенерологов. Материалы конгресса.-Новосибирск.-2006.-С. 34-37.

51. Малышев Н.А., Смагулов К.З., Леоньтева Н.И. Хламидиозы. Методические рекомендации (№13) для врачей-инфекционистов и врачей других специальностей. Москва 1999 г. 10с.

52. Майоров М.В. Урогенитальный хламидиоз в амбулаторной гинекологии //Журн. провизор.-2004.-№ 10.-С. 40-43.

53. Медведев Б.И., Казачкова Э.А., Казачков Е.Л. Особенности местного иммунитета при ассоциированных с хламидиями хронических воспалительных заболеваниях органов малого таза у женщин //Журн. микробиол.-2000.-№ 2.-С. 8992.

54. Метельская В.А., Алешкин В.А., Зверев В.В. и др. Современные методы лабораторной диагностики хламидиозов //Журн. микробиол.-2008.-№ 4.-С. 111117.63 .Методические рекомендации «Исследование иммуноглобулинов и других белков в секретах человека».-М.-1987.

55. Могилевец Т.Л. Клинико-иммунологическая характеристика урогенитальной хламидийной инфекции у женщин.-Автореф. дис. канд. мед. наук.-Санкт-Петербург.-2002.-23 с.

56. Молочков В.А., Зур Н.Н. Азитрал в комплексном лечении урогенитального хламидиоза у мужчин //Рос. журн. кож. и вен. болезней.-2004.-№ 5.-С. 53-55.

57. Молочков А.В. Место иммунотерапии в комплексном лечении хронической урогенитальной хламидийной инфекции //Журн. эффективная фармакотерапия в акушерстве и гинекологии.-2007.-№ 2.-С. 12-15.

58. Мортон Р.С., Мортон Р.С., Кингхорн Дж. Р. Урогеннитальная хламидийная инфекция: переоценка данных и гипотезы //И1И 111.-2000.- № 2.-С. 4-15.

59. Нагорнев В.А., Пигаревский В.П., Мальцева С.В. Шапероны и их роль в атеросклерозе //Вестн. РАМН.-2008.-№ 1.-С. 41-45.690 совершенствовании контроля за заболеваниями, передаваемыми половым путем. Методические рекомендации.-М.-1995.

60. Порсохонова Д.Ф., Курбанов Д.Д., Арифов С.С., Мусаходжаева Д.А. Клини-ко-иммунологическая характеристика урогенитальных и экстрагенитальных поражений при хламидийной и уреаплазменной инфекции //Цитокины и воспа-ление.-Т. 4, № 4.-2005.-С. 3-6.

61. Приказ МЗ РФ № 415 от 20.08.2003 г. «Гонококковая инфекция».

62. Приказ МЗ СССР № 936 от 12.07.85 г. «Об унификации лабораторных методов исследования в диагностике гонореи и трихомониаза».

Информация о работе

Байракова, Александра Львовна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы