Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика патогенности Enterococcus faecalis в условиях дисбаланса редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика патогенности Enterococcus faecalis в условиях дисбаланса редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом"

9 15-14/712

Красная Юлия Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОСТИ Е^ТЕКОСОССШ РАЕСАЬ^ В УСЛОВИЯХ ДИСБАЛАНСА РЕДОКС-СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ

03.02.03 - Микробиология 14.01.10 - Кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2015

Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии и на кафедре инфекционных и кожно-венерических заболеваний Федерального госу-дарсгвенного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Потатуркина-Нестерова

профессор Наталия Иосифовна

доктор медицинских наук, Нестеров Алексей Сергеевич

профессор

Официальные оппоненты:

Ворошилина Екатерина Сергеевна, доктор медицинских наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, доцент

Летяева Ольга Ивановна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра дерматовенерологии, профессор

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « ^Г 2015 года к1/У часов на засе-

дании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ЮжноУральский медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64) и на сайте www.chelsma.ni

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Шишкова Юлия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В последние годы проблема этиологической значимости условно-патогенных микроорганизмов, в том числе и энтерококков, в развитии инфекционных заболеваний становится все острее (Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий // Журнал микробиологии. 2004. №4.С.67-74.). Установлено, что представители рода Enterococcus занимают одну из лидирующих позиций в качестве причины нозокомиальных и оппортунистических инфекций. В 10-20% случаев энтерококки выделяют из гноя интраабдоминальных абсцессов, в 8-14% - случаях - при раневых нозокомиальных инфекциях (НКИ), в 30% случаев при постгемодиализной бактериемии и при инфекциях мочевыводящих путей (Валышева И.В. Генетическая характеристика вирулентного потенциала энтерококков кишечной микробиоты человека// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.2012. №4. С.44- 48.). Среди аэробных грамположительных микроорганизмов энтерококки занимают первое место при хирургических инфекциях (Asghar А.Н. Frequency and antibiotic susceptibility of gram-positive bacteria in Makkah hospitals// Ann.Saudi.Med. 2011. V.31. №5. P.462-468.). В РФ энтерокковые инфекции приобрели характер серьезной медико-социальной проблемы. Масштабы этой патологии и огромный экономический ущерб еще не изучены и не осознаны в полном объеме (Вершинин А.Е. Генетическая идентификация как способ выявления патогенных и симбиотических штаммов энтерококков // Журнал микробиологии. 2008. №5. С.50-53.). Обнаружение у больного энтерококков часто ставит неразрешимые вопросы перед клиницистами в плане определения врачебной тактики (Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Симбиоти-ческие энтерококки и проблемы энтерококковой оппортунистической инфекции // Журнал микробиологии. 2008. №3. С. 14-27.).

Известно, что тяжесть течения энтерококковой инфекции, как и всех других, вызванных условно-патогенными возбудителями, зависит, с одной стороны, от наличия факторов патогенности у микроорганизма, с другой стороны, от состояния иммунного статуса макроорганизма (Долгушин И.И. Роль нейтрофилов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек // Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т. XVI, №1. С.20-22.). Выявлены различия в степени выраженности патогенных свойств возбудителя в моно - и микстинфекциях (Бухарин О.В. Роль доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2013. №6. С. 100-105.).

Согласно данным ВОЗ (2007) урогенитальный хламидиоз (УГХ) является одним из самых распространенных заболеваний, передаваемых половым путем. Ежегодно в мире регистрируется около 100 миллионов новых случаев хламидийной инфекции (Позняк A.JI, Сидорчук С.Н., Захаркин Ю.Ф. Терапия хронической трихомонадной инвазии у больных с микст-хламидийной мочеполовой инфекцией // Журнал инфектологии. 2009.Т.1. №4. С.60-65.). Для возбудителя урогенитального хламидиоза доказана этиологическая роль в развитии острых и хронических заболеваний различной локализации с большим спектром осложнений. Однако роль С. trachomatis в инфекционной па-

тологии человека еще не оценена в должной мере (Перепанова Т.С. Неослож-ненная инфекция мочевых путей // Consilium-medicum. 2003_№5.С. 1-4; Mayaud P. Approaches to the control of sexually transmitted infections in developing countries: old problems and modern challenges // Sexually Transmitted Infections. 2004. Vol.80. P. 174-182.).

Носительство хламидий приводит к развитию таких патологических состояний как аутоиммунные реакции, хромосомные аберрации, способствует возникновению смешанных хламидийно-вирусных и хламидийно-бактериальных инфекций (Серов В.Н., Баранов И.И. Лечение урогениталь-ных инфекций у женщин в современных условиях // РМЖ «Акушерство и гинекология». 2004. Т.12, №8. С.135-141.). Урогенитальный хламидиоз является одной из главных предотвратимых причин бесплодия, особенно среди женщин (Рудакова Е.Б., Семенченко С.И., Панова О.Ю. Инфекционная патология нижнего отдела половых путей женщины и бесплодие (обзор литературы) // Гинекология. 2004. Т.6. №3. С.132-136; Haggerty C.L. Epidemiology, pathogenesis and treatment of pelvic inflammatory disease // Expert Review of Anti-Infective Therapy. 2006. N4. Vol.2. P.235-247.).

Установлено, что урогенитальный хламидиоз характеризуется высоким удельным весом микст-инфекций (Введенская Э.В., Абайтова Н.Е. Распространенность специфических и неспецифических воспалительных заболеваний урогенитального тракта // Тезисы научных работ I Российского конгресса дерматовенерологов. СПб., 2003. Т.1. С.99.). Так, по данным В.А. Лебедева и А.И. Давыдова (Лебедев В.А., Давыдов А.И. Урогенитальный хламидиоз // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2012. №1(2). С.25-31) хламидийная моноинфекция наблюдается только у 2-20% пациентов. Показано, что важным кофактором развития патологического процесса в урогени-тальном тракте женщин является микробиота данного биотопа, в связи с чем при диагностике урогенитальных инфекций следует обращать внимание на наличие и персистентность сопутствующих условно- патогенных бактерий (Шварцкова Т.А., Цыганко Е.В. Частота встречаемости Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum в Екатеринбурге // Генодиагностика инфекционных болезней: сборник тезисов V Всероссийской научно - практической конференции. М., 2004. Т.2. С. 18-20.; Гончарова Н.Н. Особенности фетоплацентарного комплекса при беременности, осложненной хроническим урогенитальным хламидиозом: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.01 / Н.Н. Гончарова. Томск, 2006. 19 С.; Мотавкина Н.С. Бушуева Е.Н. Биоценоз условно-патогенных бактерий и возбудителей урогенитальных инфекций передающихся половым путем, в генезе гуморальных иммуноде-фицитов // Тихоокеанский медицинский журнал. 2006. №3. С.40-42.). В то же время данный вопрос при урогенитальном хламидиозе остается открытым.

В последние годы все больше исследователей наряду с классическими общепринятыми механизмами развития воспаления признают роль свободнора-дикальных кислородных и липидных процессов редокс-системы («redox-oxidation-reduction system» - окислительно-восстановительная система) в патогенезе многих заболеваний. Нарушение редокс-баланса приводит к возникновению окислительного стресса, ключевым событием которого является гиперпродукция активных форм кислорода (Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З.,

Зенков Н.К. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты/М.: «Слово», 2006. 556 С.). Изменение равновесия между процессами перекисно-го окисления липидов и антиоксидантной активности приводит к необратимым повреждениям молекул липидов, белков, нуклеиновых кислот и, в конечном счете, к гибели клеток (Жаворонок Т.В., Носырева О.Л., Помогаева А.П. Механизмы антиперекисной защиты и система глутатиона при острой иерсиниозной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. №2. С.28-32.; Padayatty S.J. Vitamin С as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention // Journal of the American College of Nutrition. 2003. Vol.22. P. 18-35.;Halliwell, B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease // Biochemistry. 2004. Vol.215. P.l-14.). При чрезмерной выраженности этого процесса возможно местное повреждение тканей и развитие системных эффектов (Жаворонок Т.В., Носырева О.Л., Помогаева А.П. Механизмы антиперекисной защиты и система глутатиона при острой иерсиниозной инфекции // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. №2. С.28-32.; Padayatty S J. Vitamin С as an Antioxidant: Evaluation of Its Role in Disease Prevention // Journal of the American College of Nutrition. 2003. Vol.22. P. 18-35.; Halliwell B. Oxygen toxiciti, oxygen radicals, transition metals and disease // Biochemistry. 2004. Vol.215. P.l-14.).

В литературе накоплено достаточно сведений о том, что образование свободных радикалов является одним из универсальных патогенетических механизмов при различных типах повреждения: воспалении, старении, канцерогенезе, химическом, лекарственном и радиоактивном повреждении тканей, атерогенезе, кислородной и озоновой токсичности (Журавлева Т.Д., Суплотов С.Н. Возрастные особенности свободнорадикапьного окисления липидов и антиоксидантной защиты в эритроцитах здоровых // Вопросы медицинской химии. 2003. №5. С.17-18.; Воскресенский С.К., Жутаев И.А. Антиоксидант-ная система, онтогенез и старение// Вопросы медицинской химии. - 2004. -№1. - С. 14-27.; Klebanoff S.J. Myeloperoxidase: role in neutrophil - mediated toxicity // Molecular Biology and Infectious Diseases. 2006. Vol.24. P.283-289.). Однако роль-редокс-системы в патогенезе урогенитального хламидиоза в условиях изменения патогенного потенциала микробного консорциума урогенитального тракта до сих пор остается мало изученной.

Исследователями, изучающими микробные сообщества, не в полной мере изучено изменение видового спектра и патогенности сопутствующей микро-биоты урогенитального тракта у больных урогенитальным хламидиозом и роль редокс-системы в этиопатогенезе урогенитального хламидиоза в условиях изменения патогенного потенциала микробного консорциума урогенитального тракта. Не установлена степень деструкции клеточных мембран и уровень регуляторных белков (R- белков) при урогенитальном хламидиозе.

Цель исследования

Изучить патогенность клинических изолятов Enterococcus faecalis и состояние редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом.

Задачи исследования

1. Дать характеристику клинико-лабораторных проявлений урогени-тального хламидиоза у женщин.

2. Выявить особенности видового состава и колонизационной резистентности микробиоты репродуктивного тракта женщин, больных урогени-тальным хламидиозом.

3. Определить частоту встречаемости генетических детерминант па-тогенности у штаммов Enterococcus faecalis, выделенных из репродуктивного тракта женщин, больных урогенитальным хламидиозом.

4. Провести сравнительное изучение редокс-системы, а также связанных с ней степени деструкции клеточных мембран и состояния иммунитета в группах больных урогенитальным хламидиозом при наличии и отсутствии в микробном консорциуме репродуктивного тракта Enterococcus faecalis с повышенным патогенным потенциалом.

Методология и методы исследования

В основу диссертационного материала положен принцип изучения и анализа фактического материала. Для достижения поставленной цели диссертации и решения задач исследования в работе использовали следующий комплекс методов: клинический, инструментальный, лабораторный, аналитический и статистический. Методики исследования, состоящие из нескольких этапов с использованием соответствующих методов исследования, подробно изложены во второй главе диссертации.

Степень достоверности, апробация результатов и личное участие автора

Достаточный массив фактических данных, избранный дизайн и методы исследования, адекватные сформулированным в работе целям и задачам, корректный и разносторонний статистический анализ обеспечили достоверность полученных результатов, сформулированных выводов, положений и рекомендаций.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научной работы ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», регистрационный номер 01201178149 «Механизмы развития инфекций, передаваемых половым путем при участии симбионтной микрофлоры».

Основные положения работы доложены на 47-й межрегиональной научно-практической конференции «Артериальная гипертония: ретроспектива и современность. Проблемы выживаемости в 21 веке» (г. Ульяновск, 2012), на VIII международной научно-практической конференции «Дни науки - 2012» (Чешская Республика, г. Прага), на Российской конференции с международным участием «Высшее сестринское образование в системе Российского здравоохранения» (г. Ульяновск, 2012), 48-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции медицинских работников (посвященная 70-летию образования Ульяновской области) «Наука и медицина XXI века: традиции, инновации, приоритеты» (Ульяновск, 2013), 49-й Межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Медицина и современность. Теория, практика, перспективы» (Ульяновск, 2014).

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны совместно с научными руководителями на основании целенаправленных исследований. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании больных и в лабораторных исследованиях. Лично проводил оценку клинического течения урогенитального хлами-диоза, а также результатов бактериологических и молекулярно-генетических исследований. Автором подробно исследованы активность редокс-системы, особенности микробиоценоза урогенитального тракта у больных УГХ, генетические детерминанты факторов патогенности клинических изолятов Е. faecalis. Автором самостоятельно сформирована база данных и проведено обобщение полученных результатов. Материал был обработан с помощью современных методов статистического анализа.

Положения, выносимые на защиту

1. У 61,5% пациенток урогенитальный хламидиоз, вызванный Chlamydia trachomatis, выявлен в виде моноинфекции, у 38,5% - в сочетании с возбудителями других инфекций, передающихся преимущественно половым путем. Воспалительные заболевания репродуктивного тракта женщин, вызванные С. trachomatis, в большинстве случаев (51,6% обследованных) протекают бессимптомно. Однако при объективном осмотре у большинства обследованных выявлены неспецифические клинические признаки воспалительного процесса - серозно-гнойные выделения (58,8%), гиперемия и отек слизистой оболочки наружного отверстия уретры (40,1%), отечность и гиперемия слизистой оболочки шейки матки 29,7%.

2. Урогенитальный хламидиоз у женщин сопровождается расширением видового спектра патогенных и условно-патогенных представителей микробного консорциума урогенитального тракта с доминированием условно - патогенного вида Enterococcus faecalis на фоне сокращения нормофлоры (Lactobacillus spp.) и повышением количественных показателей трудно- и не-культивируемых видов.

3. При урогенитальном хламидиозе происходит повышение уровня патогенности клинических изолятов Enterococcus faecalis, что проявляется достоверным увеличением числа особей с нуклеотидными последовательностями генов, детерминирующие экспрессию факторов патогенности: esp (адгезия, колонизация), cylmA (активация цитолизина) и asa (поверхностный бе-лок-адгезин).

4. При урогенитальном хламидиозе отмечается дисбаланс редокс-системы, проявляющийся повышением липопероксидации в тканях и повреждением клеточных мембран. Изменения в системе перекисное окисление липидов - антиоксидантная система сопровождается нарушением клеточного, гуморального, цитокинового звеньев иммунитета и системы фагоцитоза. Выявленные изменения способствуют реализации патогенного потенциала условно-патогенных представителей микробного консорциума урогенитального тракта, в частности Enterococcus faecalis и оказывают влияние на течение и исход заболевания.

Научная новизна работы

Впервые показано, что при урогенитальном хламидиозе происходит повышение уровня патогенности условно-патогенного представителя микрофлоры урогенитапьного тракта - Е. ГаесаПэ, что проявляется достоверным увеличением числа особей с нуклеотидными последовательностями генов еэр (адгезия, колонизация), ава (поверхностный белок-адгезин) и су!птА (активация цитолизина, бактериоциногенность), детерминирующими экспрессию факторов патогенности. У пациенток с урогенитальным хламидиозом выявлены основные направления изменений микробного консорциума, проявляющиеся в расширении видового спектра и частоты встречаемости патогенных и условно-патогенных видов (с доминированием условно-патогенного микросимбионта Е. ГаесаПв) на фоне сокращения нормофлоры урогениталь-ного тракта.

Впервые установлено, что в эритроцитах и плазме крови больных урогенитальным хламидиозом происходит активация свободнорадикальных процессов, сопровождающаяся снижением содержания антиокислительных факторов, способствующих высвобождению токсинов и медиаторов воспаления. Полученные результаты свидетельствуют о патогенетической роли дизрегу-ляции редокс-системы в деструкции клеточных мембран у больных УГХ, что подтверждается выявленной сильной положительной достоверной корреляционной взаимосвязью между уровнем МДА и Я-белков у обследованных больных, особенно при урогенитальном хламидиозе, характеризующимся повышением патогенности энтерококков (г=+0,82; р=0,031).

Получены новые данные об иммунологической перестройке у обследованных женщин при урогенитальном хламидиозе. Выявлен выраженный дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, а также цитоки-нового профиля, что способствует реализации патогенного потенциала условно-патогенного компонента микробного консорциума урогенитапьного тракта, в частности Е. ГаесаИв и хронизации воспалительного процесса.

Теоретическая и практическая значимость работы

В теоретическом плане результаты исследования показывают усиление патогенного потенциала Е. 1аесаПз у больных УГХ. Выявленный дисбаланс редокс-системы у пациенток с урогенитальным хламидиозом при выявлении энтерококков с высоким патогенным потенциалом в урогенитальном тракте сопровождается активацией деструкции мембран клеток. При этом развивается дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.

В практическом плане возможна оптимизация диагностики и повышения эффективности лечебных мероприятий при УГХ путем внедрения в работу лабораторий кожно-венерологических диспансеров бактериологического и молекулярно-генетического исследования материала из половых путей для обнаружения факторов патогенности с целью последующего назначения этиотропного лечения. Обнаруженный дисбаланс редокс-систем при УГХ позволяет использовать определение показателей перекисного окисления липи-дов и антиоксидантной защиты, а также Л-белков для характеристики степени тяжести заболевания, прогноза течения и оценки эффективности проводимого лечения.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработано и внедрено в практику комплексное клинико-лабораторное обследование больных УГХ, включающее изучение патогенного потенциала микрофлоры урогенитального тракта и активности редокс-системы для оценки тяжести и прогнозирования течения заболевания, а также эффективности лечения (Акт о внедрении от 12 сентября 2013 г., выдан ГУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер» г. Ульяновска).

Материалы работы используются в диагностической и лечебной работе ГУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер» г. Ульяновска (Акт о внедрении от 12 сентября 2013 г.) и внедрены в учебно-педагогический процесс преподавания дерматовенерологии и микробиологии студентов медицинского и педиатрического факультетов, а также клинических ординаторов и интернов факультета последипломного образования и научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» (Акт о внедрении от 01 октября 2013 г.).

Издана монография для врачей, интернов и ординаторов, студентов медицинских вузов «Роль редокс-системы в патогенезе урогенитального хлами-диоза» (г. Ульяновск: УлГУ, 2013). Изданы практические рекомендации для врачей, интернов и ординаторов, студентов медицинских вузов «Клинико-диагностическое значение редокс-системы при урогенитапьном хламидиозе у женщин» (г. Ульяновск: УлГУ, 2013).

Публикации

Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 научных работ общим объемом 8,78 печатных листов, в том числе 5 публикаций (5 статей) в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликованы 6 работ в материалах межрегиональных, всероссийских и международных конференций, 1 статья в международном журнале, 1 монография, изданы 1 практические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 164 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография содержит 273 источника, из них 199 отечественных и 74 иностранных. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 18 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Характеристика материала и методов исследования

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» в период 2010-2014 гг. На первом этапе был проведен скрининг 296 женщин, больных урогенитальным хламидиозом, находившихся на лечении в ГУЗ «Областной клинический кожно-венерологический диспансер» г. Ульяновска. Средний возраст обследованных составил 29,6±1,2 года. Из всех обследованных у 114 больных УГХ (38,5%) были обнаружены сопутствующие

возбудители урогенитальных инфекций. Такие пациентки были исключены из исследования. Критериями исключения из исследования являлись воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие, прием антибактериальных и гормональных препаратов.

В дальнейшие исследования были включены 182 (61,5%) пациентки с диагнозом «Хламидийная инфекция нижних отделов мочеполового тракта (А56.0)», которые составили основную группу обследованных (рисунок 1). Диагноз ставили в соответствии с Клиническими рекомендациями «Ведение больных инфекциями, передаваемыми половым путем, и урогенитальными инфекциями» (РОДВК, Москва, 2013).

На следующем этапе исследования у 78 (42,9%) пациенток, из 182 женщин основной группы, в репродуктивном тракте были выявлены Enterococcus faecalis (первая группа), у 104 пациенток (57,1%) энтерококки не были выявлены (вторая группа). Группу сравнения составили 52 практически здоровых женщины, репрезентативных по возрасту. Все обследования проводили с письменного согласия пациенток.

В работе использовали штаммы Enterococcus faecalis, выделенные у 78 обследованных пациенток с диагнозом «Хламидийная инфекция нижних отделов мочеполового тракта». Исследуемый материал из цервикального канала и заднего свода влагалища забирали стерильным одноразовым зондом фирмы «НПФ ЛАБдиагностика». Взятый материал в объеме 0,1 мл секрета переносили в пробирки с 0,9 мл транспортной среды и доставляли в лабораторию в течение часа с момента забора материала.

Для получения чистых культур использовали Энтерококк агар (НПЦ, г. Оболенск) с последующим накоплением культуры на Columbia agar (Bio-Rad, Франция) с кровью и идентификацией на среде Diskinson Oxoid (Himedia, Индия). При выполнении ПЦР с целью выявления генетических детерминант патогенности энтерококков использовали штамм Enterococcus faecalis №111, полученный из музея культур Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург).

Дизайн исследования включал: характеристику клинико-лабораторных данных больных; выявление бактериального пейзажа репродуктивного тракта; оценку окислительно-антиоксидантной системы; характеристику иммунологического статуса; статистическу ю обработку полученных данных.

Всем больным для диагностики УГХ и сопутствующих урогенитальных инфекций проводили комплексное обследование, включавшее: клиническое (сбор анамнеза, клинико-визуальное исследование), инструментальное обследование (расширенная кольпоскопия); молекулярно-генетический анализ (PCR real-time), позволяющий типировать ДНК возбудителя заболевания и выявлять нуклеотидные последовательности генетических детерминант патогенности; а также бактериологические, серологические, биохимические, иммунологические и общеклинические исследования.

В исследуемом материале выявляли возбудителей и антитела к ним при помощи прямого ИФА и ПЦР в реальном времени (PCR real-time), с использованием диагностического комплекса «QIAGEN» (Rotor-Gene, Германия). С целью идентификации возбудителей сопутствующих ИППП применяли куль-туральный, серологические методы и PCR real-time.

Состояние вагинального микроценоза, количественную и качественную оценку его состава производили методом секторального посева, выражая степень колонизации в КОЕ/мл. Для количественной оценки трудно- и некульти-вируемых видов проводили PCR real-time с использованием амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-технология, Россия) и комплекта реагентов Фемоф-лор 16 (ООО «НПО ДНК-технология, Россия). Исследование позволяло определять общую бакмассу в пробе, нормофлору, облигатно-анаэробные микроорганизмы, дрожжеподобные грибы и микоплазмы.

Выявление нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности Е faecalis, esp (адгезия, колонизация), asa (поверхностный белок-адгезин) и cylmA (активация цитолизина) проводили при помощи PCR real-time. В качестве контроля использовали штамм Entero-coccus faecalis №111, полученный из музея культур Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (г. Оренбург). Выделение ДНК энтерококков проводили с использованием гуанидинтиоцианата (GuSCN). Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли с использованием пакета программ в Gene Runner Version 3.05 и Primer Blast (ресурсы GeneBank) (США). Праймеры энтерококков были синтезированы в «ООО Синтол» (Москва) (таблица 1).

Таблица 1 - Использованные в работе праймеры

№ п/п Гены патогенности Последовательность ДНК праймеров (5 ' to 3 ' ) Размер ампли-кона(н.п.)

1 esp (адгезия, колонизация) / TGGCTACTGCTAGTCCAGGACC 983

г GCG ТСАА G A CTTGCA TCGCCGA

2 cylmA (активация цитолизина) f ТС A GTCGGCGA TGGA ТА G A CG 623

г CGCTGCTAAA GCTGCGCTA Т

3 asa (поверхностный белок-адгезин) / CCA GCCAA СТА TGGCGGAA ТС 529

г CCTG TCGCAA G A TCGA CTG ТА

Активность редокс-системы определяли по уровню малонового диальдеги-да (МДА), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионредуктазы (ГР) и каталазы в плазме крови и гемолизате эритроцитарной массы. МДА изучали в тесте с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Активность СОД выявляли тестом с нит-росиним тетразолием (HCT). Об активности каталазы судили по интенсивности утилизации перекиси водорода и скорости снижения экстинкции при длине волны 260 нм, на которой перекись водорода имеет максимум светопо-глощения. Определение активности ГР проводили на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 340 нм против воды (Агарков A.A. Регуляция активности глутатионредуктазы из печени крысы при токсическом гепатите и действии гепатопротекторов: автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 / Агарков Александр Алексеевич. Воронеж, 2009. 24 С.).

Для характеристики катаболических процессов мембран клеток производили определение в периферической крови R-белка в РТГА между анти R-

сывороткой и эритроцитами человека (Родионова Г.Б., Герасименко В.В. Методы физиолого-биохимических исследований крови// Оренбург: Издательский центр ГНУ ВНИИМС, РАСХН, 2005. 148 С.). Для определения количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови применялся автоматический гематологический анализатор (СеН-Буп 3700). Мембранные маркеры субпопуляций лимфоцитов (СЭЗ+, СЭ4+, СБ8+, СЭ16+, С019+ лимфоциты) определяли с помощью моноклонапьных антилимфоцитарных антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции (Козинец Г.И. Клетки крови: современные технологии их. М.: «Триада-Фарм»,2002.451 С.). Для этого использовали диагностикумы ООО «Сорбент» для проточного цитометра (фитц-меченные моноклональные антитела).

Функциональную активность лейкоцитов определяли при помощи фагоцитарной реакции полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), РТМЛ, РБТЛ. Аффинность Т-лимфоцитов (Еа-РОК) оценивали методом спонтанного розет-кообразования с эритроцитами барана (Галактионов В.Г. М.: Издательский центр «Академия», 2004. 528 С.). Активность В-лимфоцитов определяли по концентрации ЦИК (Самойлова Р.С., Булычева Т.И. Иммунофенотипирование в диагностике хронических лимфоидных // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №11. С.35-39.), уровню сывороточных иммуноглобулинов (А, М, О); Е методом ИФА.

Количественное определение уровня цитокинов проводили методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «Цитокиновый контур» (г. Санкт-Петербург), «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). При изучении спонтанной и индуцированной способности лейкоцитов крови секретировать 1Ь-1а, 1Ь-1р, 1Ь-2.1Ь-4,11,-6,1Ь-8,11.-10, фактор некроза опухоли-а (ФНО-а), а- и у-IFN в качестве мутагена использовали ФГА, учет результатов проводили на анализаторе «УНИГШАН» АИФР-01 фирмы «ПИКОН» (Г.А. Зайцева и соавт., Цитокиновый статус доноров крови и ее // Фундаментальные исследования. 2011. №3. С.61-65.).

Для оценки полученных данных использовали описательные методы статистики, корреляционный анализ, параметрические и непараметрические методы (Медков В.М. Демография: серия «Учебники и учебные пособия» Ростов на Дону: Феникс, 2002. 448 С.). Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с определением 1:-критерия Стьюдента, с использованием пакета программ 81аиз1юа 6.0. Оценку достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводили с использованием непараметрического метода -определения критерия по Манну-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости р<0,05. Для оценки значимости малых по объему выборок применяли критерий Фишера. Для выявления связи между отдельными признаками использовали коэффициент корреляции (г).

Результаты исследований и их обсуждение

Из 182 обследованных женщин 51,6% (94 женщины) не предъявляли жалоб, характерных для воспалительных процессов в урогенитальном тракте (рисунок 1). Только 82 обследованные женщины (48,4%) отмечали незначительные субъективные симптомы, наиболее частыми из которых являлись:

чрезмерная влажность половых органов (76 обследованных), зуд и жжение в области урогенитального тракта (58 женщин), частые позывы к мочеиспусканию (42 пациентки), скудные слизистые выделения (39 женщин) и боли при мочеиспускании.

Рисунок 1 - Соотношение объективный и субъективных симптомов у обследованных

При объективном осмотре у 91,8% женщин (167 человек) были выявлены признаки воспаления в урогенитальном тракте, и только у 15 пациенток (8,2%) отсутствовали какие-либо изменения в нижних и верхних отделах мочеполовой системы. Из всех клинических проявлений урогенитального хла-мидиоза наиболее часто встречались серозно-гнойные выделения (58,8%), гиперемия и отек слизистой оболочки наружного отверстия уретры (40,1%), отечность и гиперемия слизистой оболочки шейки матки 29,7%.

Лабораторным критерием, подтверждающим наличие уретрита у женщин, являлось обнаружение 5 и более полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в поле зрения в мазках из уретры, 10 и более (ПМЯЛ) в цервикальном канале при просмотре более 5 полей зрения при увеличении микроскопа 10x1000 (Молочков В.А. Современный взгляд на патогенез и лечение персистирую-щей и хронической хламидийной урогенитальной инфекции// Российский журнал кожных и венерических болезней. 2008. №2. С.61-64.).

Проведенные исследования выявили существенные отличия интенсивности роста микробиоты урогенитального тракта у здоровых женщин и у пациенток с УГХ. Установлено, что более половины здоровых женщин имело скудную микробиоту и лишь три - обильную. Среди обследованных основной группы, напротив, почти половина пациенток имела обильную микробиоту.

Изучение микробиоценоза вагинального и цервикального биотопов больных УГХ выявило ее значительные изменения - снижение показателей частоты встречаемости и колонизационной плотности нормофлоры (Lactobacillus spp.) на фоне повышения указанных показателей у представителей условно-патогенной и патогенной микробиоты репродуктивного тракта (таблица 2).

Субъективные симптомы

Объективные симптомы

0% 20% 40% 60% 80% 100% В Наличие симптомов В Отсутствие симптомов

Таблица 2 - Показатели частоты встречаемости (ЧВ) и микробной обсеме-ненности (МО) урогенитального тракта при УГХ _

Виды микроорганизмов Влагалище Цервикальный канал

ЧВ (%) МО (LD5o/lg) ЧВ (%) МО (LD5o/lg)

Lactobacillus spp. 45,1±4,9* 3,9±1,11 37,4+7,8* 1,43±0,30*

Bifidobacterium spp. 7,1 ±2,6* 2,12±1,16* 1,41±0,20* 1,41±0,20*

Staphylococcus epidermidis 8,8+3,7* 5,16±2,12* 4,9±1,4* 3,52+1,25

Streptococcus agalactiae 10,4±4,1 4,39±1,22 6,0+3,1 2,25±1,35

Staphylococcus hominis 7,1±2,5* 2,68±2,11 6,0±2,0* 6,94±1,11*

Escherichiae coli 31,3 ±5,1* 4,95±1,86 15,4+3,8* 4,17±1,08

Enterococcus faecalis 49,5±6,1* 8,13±1,64* 31,9±6,6* 4,85±0,93*

Propionibacterium spp. 4,4±3,4* 1,25±0,23 1,6+0,6* 1,21±0,27

Corynebacterium spp. 9,3±2,3* 5,78±1,20* 4,9±2,2 3,95±0,81*

Candida spp. 26,4±5,9* 2,24±0,43* 10,4±3,7 1,67+1,21

Примечание: * - достоверность различия показателя по сравнению со здоровыми женщинами (р<0,05)

Наиболее часто встречающимся видом при дисбиотических нарушениях микробиоценоза влагалища, развивающихся при УГХ, являлся условно-патогенный вид Enterococcus faecalis. Установлено, что энтерококки обнаруживались почти в два раза чаще, чем у здоровых. Показатель микробной об-семененности Е. faecalis увеличивался во влагалище в 2,0 раза (8,13±1,64 lg КОЕ/мл и 4,08±1,12 lg КОЕ/мл соответственно, р<0,05), а в цервикальном канале - в 2,2 раза (4,85±0,931g КОЕ/мл и 2,17±0,68 lg КОЕ/мл соответственно, р<0,05).

Исследование биоценоза урогенитального тракта пациенток с УГХ (PCR real-time) на наличие трудно- и некультивируемых видов выявило увеличение показателей общей бактериальной массы и содержания факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных бактерий. Наиболее частыми представителями данной микрофлоры являлись Gardnerella vaginalis/ Prevotella bi-via/Porphyromonas spp.; Eubacterium spp.; Sneathia spp.l Leptotrichia spp.lFusobacterium spp.; Lachnobacterium spp J Clostridium spp.; Megasphaera sppJ Veilonella spp.l Dialister spp.; Atopobium vaginae.

С целью изучения патогенных свойств энтерококков, выделенных у женщин, проводили выявление генетических детерминант патогенности: esp (адгезия, колонизация), asa (поверхностный белок-адгезин) и су 1тА (активация цитолизина). Далее, используя набор указанных ранее праймеров, было проведено сравнительное определение нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенности энтерококков у больных УГХ (первая группа) и здоровых женщин. У штаммов Е. faecalis первой группы установлено статистически значимое увеличение количества особей, в генотипе которых локализованы указанные нуклеотидные последовательности (таблица 3).

Таблица 3 - Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей esp, asa и cylmA генов Е. faecalis _

Е./аесаГи, выделенные: Частота встречаемости генов (%)

esp asa cylmA

у больных УГХ (п=78) 61,1±5,3 * 39,5±6,4* 51,5±8,1*

у здоровых женщин (п=52) 31,6±4,8 15,8±2,3 26,3±3,4

Примечание: * - показатель достоверности различий частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей генов в первой и второй группах (р<0,05)

Определение активности редокс-системы показало, что у пациенток с УГХ происходило повышение уровня ферментов системы ПОЛ, наиболее выраженное у больных первой группы. Так, значения МДА достоверно возрастали по сравнению со здоровыми женщинами в эритроцитах (рисунок 2).

1 группа

2 группа

Здоровые

О 200 400 600 800 1000 1200 1400

* - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми (р!<0,05);

• - показатель достоверности между больными УГХ с энтерококками и без (р2<0,05)

Рисунок 2 — Уровень МДА в эритроцитах обследованных (мкмоль/л)

Важным элементом неферментативной подсистемы антиоксидантной защиты организма являются белки плазмы крови, из которых антиоксидантный эффект наиболее выражен у альбумина и |3-глобулинов (Куликова А.И. Методические аспекты оценки потенциальной способности липидов к перокис-лению по уровню ТБК-аьстивных продуктов сыворотки крови при стимуляции ионами железа // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. №5. С.8-10.). Установлено, что у пациенток с УГХ формировалась диспротеинемия с уменьшением содержания альбуминов, особенно выраженная при наличии энтерококков в урогенитальном тракте женщин - 59,6±6,1% (в группе сравнения 70,1±4,7%; р<0,05). Наблюдалось также незначительное повышение уровня (3-глобулинов (р>0,05) и статистически значимое увеличение а2-глобулинов до 14,2±2,1% (р<0,05), принимающих участие в окислении Ре2+ в РеЗ+, что свидетельствует об изменении процессов перекисного окисления липидов у больных УГХ, особенно при выявлении вирулентных энтерококков.

Далее проводили определение ферментативной подсистемы защиты, включающей супероксидцисмутазу (СОД), каталазу, глутатионпероксидазу (ГП), глутатионредуктазу (ГР) и др. Все они катализируют реакции, в результате которых токсичные свободные радикалы и перекиси превращаются в нетоксичные соединения (Куликова А.И. Методические аспекты оценки потенциальной способности липидов к перокислению по уровню ТБК-активных продуктов сыворотки крови при стимуляции ионами железа // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. №5. С.8-10.). Установлен дефицит СОД, являющейся одним из ключевых ферментов антирадикальной защиты. Снижение активности СОД в плазме крови и эритроцитах периферической крови у больных УГХ свидетельствует о декомпенсации антиоксидантных процессов в тканях. Напротив, активность фермента каталазы в плазме крови у больных первой группы превышал контрольные значения здоровых женщин в 7,8 раза, у пациенток второй группы - в 7,2 раза соответственно (р<0,01) (таблица 4).

Таблица 4 - Показатели уровней СОД и каталазы в эритроцитах и плазме крови больных УГХ__

Группы обследованных СОД (усл.ед/мг белка) Каталаза (ммоль/л)

эритроциты плазма крови эритроциты плазма крови

Первая 32,82±3,24* 1,39±0,14* 75,31±5,62* 0,186±0,12*

Вторая 34,43±3,65 1,41±0,16* 69,52±6,83 0,173±0,10*

Здоровые 41,37±4,19 1,89±0,23 57,32±2,31 0,024±0,005

Примечание: * - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми

Глутатионредуктаза катализирует реакции разложения перекиси водорода с помощью восстановленного глутатиона, защищая липиды мембран от окисления и тем самым препятствует развитию патологических состояний. Показатели активности ГР эритроцитов при УГХ были достоверно понижены по сравнению со значениями здоровых лиц: максимально - у пациенток первой группы (7,24±1,59 мкмоль/с-л; р<0,05), минимально - второй группы (7,87±1,62 мкмоль/с-л; р<0,05), у здоровых женщин данный показатель составил 13,10±1,41 мкмоль/с-л). Уровень ГР в плазме крови также имел тенденцию к снижению, наиболее выраженную у больных первой группы -1,20±0,19 мкмоль/с-л (р<0,05) (в группе сравнения - 1,38±0,16 мкмоль/с-л).

Повышение уровня ПОЛ и снижение АОС патогенетически связаны с развитием процессов деструкции рецепторного аппарата клеточных мембран (II-белки), которые вызывают нарушения метаболизма здоровых клеток в окружающих тканях. Нарастание содержания Я-белков в начале патологического процесса служит наиболее ранней манифестацией проявления воспаления. Проведенные исследования выявили повышение уровня Я-белков у больных УГХ, наиболее выраженное у пациенток первой группы (рисунок 3).

1Е

5 4 3 2 1 О

* - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми Рисунок 3 - Содержание К-белков в сыворотке крови больных УГХ Полученные результаты свидетельствуют о деструкции клеточных мембран как о патогенетическом звене дисрегуляции системы ПОЛ-АОС у больных УГХ, что подтверждается выявленной сильной положительной достоверной корреляционной взаимосвязью между уровнем МДА и Ш-белков у пациенток первой (г=+0.82; р=0,031) и второй групп (г=+0,79; р=0,026).

Имеются данные о выраженном влиянии К-белков на иммунную систему (Бабанина М.Ю. Динамика показателей свободнорадикального окисления и иммунного статуса у больных активным ревматизмом на фоне сердечной недостаточности под влиянием комплексного лечения с использованием энала-прила // Украинский ревматологический журнал. 2002. №2(8). С.48-52.). В связи с этим у больных УГХ было изучено состояние иммунитета. Выявлено достоверное снижение абсолютного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов, экспрессирующих СОЗ+, СЭ4+ рецепторы, также иммунорегу-ляторного индекса (ИРИ) и повышение СО 16+, наиболее выраженное у обследованных первой группы, по сравнению с результатами здоровых женщин (таблица 5).

Таблица 5 - Абсолютное содержание субпопуляций Т-лимфоцитов у женщин _с урогенитальным хламидиозом (х109/л)_

Показатели Группы

Первая (п=78) Вторая (п=104) Группа сравнения (п=52)

СОЗ+ 1,45±0,06* 1,56+0,08 1,81±0,08

СБ4+ 1,29+0.12* 1,36+0,12* 1,65±0,09

СБ8+ 0,67+0,10 0,69±0,09 0,73±0,07

СЭ16+ 0,29±0,09* 0,26±0,08 0,18±0,04

СЭ4/С08 (ИРИ) 1,92+0,05* 1,97+0,11 2,26±0,05

Примечание: * - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми

4,97*

1 группа

2 группа

Здоровые

Выявлена супрессия функциональной активности Т-лимфоцитов у пациенток с УГХ по сравнению со здоровыми женщинами. Показатели РТМЛ были понижены у пациенток обеих групп. Однако, статистическую значимость

различия данных показателей, по сравнению со здоровыми (47,59±7,95%), были выявлены только у первой группы (38,71±8,43%; р<0,05). Проведенные исследования выявили общую для всех пациенток с УГХ тенденцию снижения функциональной способности лимфоцитов периферической крови к трансформации в бласты, усиливающуюся при контаминации половых путей энтерококками. Показатели спонтанной (171,8±21,5 имп/мин; р<0,05) и индуцированной РБТЛ (4682,9+862,3 имп/мин; р<0,05) у лиц первой группы имели большие изменения, чем у второй (215,7±29,2 имп/мин и 5613,4±679,1 имп/мин соответственно).

Аффинность Т-лимфоцитов также была понижена у всех фракций Еа-РОК при УГХ, но статистической значимости по сравнению со здоровыми она достигала только у высокоаффинных Еа-РОК и в первой, и во второй группах обследованных (0,273±0.038; 0,281±0,032 соответственно; р<0,05).

Изучение гуморального иммунитета выявило статистически значимое повышение СО 19+ лимфоцитов в обеих группах обследованных, особенно в первой, по сравнению с группой здоровых лиц (0,653+0,049-109/л; 0,549+0,037- 109/л соответственно, р<0,05). Уровень сывороточных иммуноглобулинов А, М, О был снижен, наиболее выраженная супрессия наблюдались у показателей ^ О (10,08+1,54 г/л) и 1ц А (2,07+0,05 г/л) у обследованных первой группы (р<0,05). Показатели ^ М не претерпевали значительных изменений, однако, наблюдалась тенденция к его повышению (р>0,05).

Связывание антигена и антитела с образованием иммунного комплекса является одним из механизмов, направленных на элиминацию антигена из организма. Определение уровня ЦИК выявило его повышение у всех женщин с УГХ, наиболее выраженное при действии энтерококкового кофактора (217,6 у.е.; 198,4 у.е. соответственно, р<0,05).

Большое диагностическое и прогностическое значение имеет изучение ци-токинового профиля. У пациенток с УГХ отмечалось значимое повышение большинства провоспалительных цитокинов (1Ь-1р, 1Ь-2,1Ь-6,1Ь-8 и ЖО-а) с одновременным снижение содержания ¡ЫР-у, который продуцируется активированными Т-лимфоцитами и существенно усиливает активность а- и Д-интерферонов (таблица 6).

Таблица 6 - Содержание провоспалительных цитокинов у больных (пкг/мл)

Цитокины Группы

Первая Вторая Группа сравнения

1Ь-1Р 194,5+10,2*/' 142,7+12,1* 37,2+4,8

1Ь-2 156,4+8,4* 142,9+9,5* 19,3+3,5

1Ь-6 12,5+2,3* 10,9+2,8* 4,8+1,2

1Ь-8 77,4+6,1*/« 54,9+7,2* 15,7+3,3

РЫО-а 148,4+10,2*/' 112,1+9,6* 36,3+5,9

ЮТ-у 27,8+4,0* 32,3+4,6* 43,5+7,1

Примечание: * - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми (р|<0,05); • - показатель достоверности между больными УГХ с энтерококками и без (р2<0,05)

Изменение уровня цитокинов, обладающих противовоспалительным действием, у больных УГХ имел разнонаправленный характер - показатели 11-4 снижались в первой группе обследованных в 3,3 раза, II,-10, наоборот, повышались в 3,6 раза по сравнению со здоровыми (рисунок 4).

пюг/мл

80 60 40 20 0

* - показатель достоверности между больными УГХ и здоровыми (р]<0,05);

• - показатель достоверности между больными УГХ с энтерококками и без (Р2<0,05)

Рисунок 4 - Изменение уровня противовоспалительных цитокинов у больных УГХ

Далее у больных УГХ была проведена комплексная оценка функционального статуса нейтрофилов периферической крови. Изменения коснулись не только количественных, но и качественных показателей, отражающих поглотительную и киллинговую способность нейтрофилов. Выявлено сокращение количества нейтрофильных лейкоцитов с функциями фагоцитов. Так, фагоцитарный показатель у больных первой группы составил 47,2±4,4% (р1,2<0,05), второй - 53,9±3,8% (р2<0,05) (в группе сравнения - 69,4±4,1%). Фагоцитарное число, отражающее способность клеток к захвату возбудителей, было понижено в обеих группах, однако статистическую значимость изменения имели при сочетании УГХ с энтерококками (7,8 у.е.; р<0,05).

Определение индекса завершенности фагоцитоза (ИЗФ) выявило значительное снижение переваривающей функции фагоцитов. Если у больных УГХ второй группы ИЗФ был равен 0,91±0,06 (у здоровых женщин 1,19±0,08; р<0,05), то у первой группы этот показатель был еще более низким (0,87±0,07; р<0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования позволили сделать выводы, что у больных урогенитальным хламидиозом наблюдаются выраженные изменения редокс-системы, которые при отсутствии специфической клинической симптоматики, характерной для данного заболевания, имеют большое диагностическое значение. Проведенные собственные исследования по изучению

79,6*Л

1Ь-4 1Ь-10

0 1 группа В 2 группа О Здоровые

видового состава микрофлоры влагалища у женщин с урогенитальным хла-мидиозом показало, что при этом заболевании происходит значительное нарушение микроэкологической системы репродуктивного тракта, проявляющееся достоверным изменением видового состава микроорганизмов влагалищного и цервикального биотопов. У больных урогенитальным хламидио-зом в условиях изменения патогенного потенциала микробного консорциума урогенитального тракта отмечается расширение видового спектра микроорганизмов с превалированием высоковирулентных штаммов Е. faecalis. Установлено, что у энтерококков, выделенных из микробного консорциума урогенитального тракта, в котором присутствовали С. trachomatis происходило статистически значимое увеличение показателей частоты встречаемости генетических детерминант патогенности.

Выявленные изменения системы ПОЛ-АОС поддерживают хроническое течение урогенитальных инфекций и участвуют в патогенезе их обострений. Из этого следует, что биохимические показатели системы «оксиданты-антиоксиданты» являются маркером оценки риска развития, тяжести течения и прогноза урогенитального хламидиоза. Изменение количественных и/или функциональных показателей звеньев иммунной системы приводит к нарушению процесса элиминации возбудителей и, как следствие, определяет хронический характер течения урогенитального хламидиоза и развитие его осложнений. Кроме того, депрессия иммунной системы способствует реализации патогенных свойств условно-патогенных возбудителей, в частности, энтерококков.

Установленные данные стимулируют дальнейшее изучение патогенного потенциала энтерококков и их влияние на течение инфекционного процесса. Перспективой для дальнейшей разработки темы может явиться формирование модели повышения эффективности лечения, что позволит оптимизировать проводимую терапию.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что у 61,5% обследованных женщин с урогенитальным хламидиозом заболевание протекало в виде моноинфекции, у остальных обследованных урогенитальный хламидиоз сочетался с другими инфекциями, передаваемыми половым путем: урогенитальным герпесом (10,8% пациенток), урогенитальным микоплазмозом (7,8% больных) и папилломавирус-ной инфекцией (6,4% обследованных). У большинства обследованных выявлены клинические признаки воспалительного процесса - серозно- гнойные выделения (58,8%), гиперемия и отек слизистой оболочки наружного отверстия уретры (40,1%), отечность и гиперемия слизистой оболочки шейки матки 29,7%.

2. У 83,5% пациенток с урогенитальным хламидиозом выявлен дис-биоз репродуктивного тракта, проявляющийся в подавлении роста нормоф-лоры (Lactobacillus spp.) на фоне повышения показателей частоты встречаемости и плотности колонизации представителей условно-патогенной микрофлоры, с превалированием Enterococcus faecalis. У больных энтерококки обнаруживались во влагалище в 2,1 раза чаще, чем у здоровых женщин.

3. Сравнительное определение нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих экспрессию факторов патогенное™ Enterococcus faecalis у больных урогенитальным хламидиозом, выявило статистически значимое увеличение показателей их частоты встречаемости по сравнению со здоровыми: esp (адгезия, колонизация) до 61,1±5,3%, asa (поверхностный бе-лок-адгезин) до 39,5±6,4% и cylmA (активация цитолизина (бактериоцино-генность) до 51,5±8,1%.

4. У пациенток с урогенитальным хламидиозом выявлен дисбаланс редокс-системы, проявляющийся активацией механизмов свободнорадикаль-ного окисления (каталазы, малонового диальдегида) и дефицитом ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, глутатионредуктазы) в эритроцитах и в плазме крови, наиболее выраженный при обнаружении в репродуктивном тракте Enterococcus faecalis. Изменения редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом сопровождались активацией деструкции мембран, усиливающейся при выявлении энтерококков с высоким патогенным потенциалом, что подтверждалось положительной корреляционной взаимосвязью между уровнем малонового диальдегида и регуляторных белков при хламидиозе.

5. Показано, что у больных урогенитальным хламидиозом развивается дисбаланс клеточного и гуморального звеньев иммунной системы, достоверное сокращение количества нейтрофилов с функциями фагоцитов и разнонаправленное изменение уровней про- и противовоспалительных цитоки-нов. Выявленные изменения способствуют реализации патогенного потенциала условно-патогенных представителей микробного консорциума уроге-нитального тракта, в частности Enterococcus faecalis и оказывают влияние на течение и исход заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Высокая выявляемость микросимбионта Enterococcus faecalis при урогени-тальном хламидиозе свидетельствуют о необходимости определения генетических детерминант их патогенности, таких как esp, cylmA и asa, для оценки этиологической значимости энтерококков и прогнозирования течения заболевания.

В комплекс обследования пациентов с урогенитальным хламидиозом необходимо включать исследование редокс-системы и цитокинового статуса, анализ показателей которых будет способствовать оценке течения и исхода заболевания, обеспечивая возможность дополнительной эффективной диагностики и осуществление дифференцированного подхода при выборе тактики лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Егорова, Ю.В. Особенности иммунной системы женщин, больных урогенитальным хламидиозом / Ю.В. Егорова, A.C. Нестеров, H.A. Ильина, A.B. Нестерова // Вестник Чувашского государственного педагогического университета им. И.Я. Яковлева. - 2012. - № 4 (76). - С. 69-73. -(Серия «Естественные и технические науки»).

2. Егорова, Ю.В. Состояние системы «ПОЛ-антиоксиданты» у женщин с урогенитальным хламидиозом / Ю.В. Егорова, A.C. Нестеров, A.B. Нестерова // Материалы VI Российской науч.-практ. конф. с междунар. участием «Высшее сестринское образование в системе российского здравоохранения». -Ульяновск, 2012. - С. 92-94.

3. Магомедова, A.M. Состояние иммунной системы больных с хроническими инфекциями урогенитального тракта / A.M. Магомедова, Ю.В. Егорова, A.C. Нестеров, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Естественные и технические науки. - 2012. - № 2 (58). - С. 164-167.

4. Нестеров, A.C. Особенности свободнорадикальных процессов у больных урогенитальным хламидиозом / A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Материалы 47-й Межрегиональной науч.-практ. конф. медицинских работников «Артериальная гипертония: ретроспектива и современность. Проблемы выживаемости в 21 веке». - Ульяновск, 2012. - С.147-149.

5. Нестеров, A.C. Состояние иммунной системы у больных урогенитальным хламидиозом / A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Материалы 47-й Межрегиональной науч.-практ. конф. медицинских работников «Артериальная гипертония: ретроспектива и современность. Проблемы выживаемости в 21 веке». - Ульяновск, 2012. — С. 146-147.

6. Нестеров, A.C. Состояние свободнорадикальных процессов у больных с хроническими инфекциями урогенитального тракта / A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова, A.B. Нестерова, Е.А. Панова // Materialy VIII mezinarodni védecko-prakticka konference «Dny védy - 2012». Dil 68. Lekaístv. - Praha : Publishing House «Education and Science», 2012. - P. 7-9.

7. Егорова, Ю.В. Роль редокс-системы в патогенезе урогенитального хла-мидиоза : монография / A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Н.И. Кан, A.B. Нестерова. - Ульяновск : УлГУ, 2013. - 133 с.

8. Егорова, Ю.В. Оценка биохимических показателей окислительно-восстановительной системы у женщин с урогенитальным хламидиозом / A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова // Фундаментальные исследования. - 2013. -№ 12, Ч. 3. - С. 471-474.

9. Егорова, Ю.В. Особенности клинических проявлений урогенитального хламидиоза у женщин репродуктивного возраста / Ю.В. Егорова, М.А. Магомедов, A.C. Нестеров // Материалы 48-й межрегиональной науч.-практ. медицинской конф. медицинских работников «Наука и медицина XXI века: традиции, инновации, приоритеты». - Ульяновск, 2013. - С. 137-138.

10. Егорова, Ю.В. Основные показатели редокс-системы у женщин с урогенитальным хламидиозом / Ю.В. Егорова, A.C. Нестеров // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2013. —№ 8, Ч. 3. -С. 20-23.

11. Егорова, Ю.В. Клинико-диагностическое значение редокс-системы при урогенитальном хламидиозе у женщин / Ю.В. Егорова. - Ульяновск : УлГУ, 2013.-16 с.

12. Бурганова, Р.Ф. Молекулярно-генетическое выявление урогенитального хламидиоза у женщин / Р.Ф. Бурганова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, A.C. Нестеров, Ю.В. Егорова, A.B. Нестерова // Материалы 49-й Межрегиональ-

ной науч.-практ. медицинской конф. «Медицина и современность. Теория, практика, перспективы». - Ульяновск, 2014. - С. 193-195.

13. Егорова, Ю.В. Характеристика цервико-вагинальной микробиоты у женщин с урогенитальным хламидиозом [Электронный ресурс] / Ю.В. Егорова, А.С. Нестеров // Современные проблемы науки и образования. -2014. - № 6. - Режим доступа : http://www.science-education.ru/120-16737. (Дата обращения 14.09.2015).

14. Красная, Ю.В. Значение бактерий рода Enterococcus в жизнедеятельности человека [Электронный ресурс) / Ю.В. Красная, А.С. Нестеров, Н.И. Потатуркина-Нестерова // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 6. - Режим доступа : http://www.science-education.ru/120-16620. (Дата обращения 14.09.2015).

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ГР - глутатионредуктаза

Еа-РОК - эритроциты, антитела и розеткообразующая клетка

ИППП - инфекции, передающиеся преимущественно половым путем

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующие единицы

МДА - малоновый диальдегид

МИК - минимальная ингибирующая концентрация

МО - микробная обсемененность

НСТ - нитросиний тетразолий

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов

Редокс - (redox - oxidation-reduction system) окислительно-

восстановительная система

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

СОД - супероксиддисмутаза

СЦК - средний цитохимический коэффициент

ТБК - тиобарбитуровая кислота

УГХ - урогенитальный хламидиоз

ФГА - фитогемагглютинин

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЧВ - частота встречаемости

IL - интерлейкин

LD50 - 50% летальная доза (dosis letalis 50) PCR - полимеразная цепная реакция R-белки — регуляторные белки

1 5 - 1 0 571

На правах рукописи

Красная Юлия Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПАТОГЕННОСТИ ЕНТЕНОСОССив ЕАЕСАЫБ В УСЛОВИЯХ ДИСБАЛАНСА РЕДОКС-СИСТЕМЫ У ЖЕНЩИН С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ

03.02.03 - Микробиология

14.01.10 — Кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2015

2015672898

2015672898