Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма; диагностические критерии дисбиозов для оценки состояния здоровья человека
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Роль микробиоценозов открытых полостей в формировании реактивности организма; диагностические критерии дисбиозов для оценки состояния здоровья человека"
На правах рукописи
ВОРОПАЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА
РОЛЬ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ОТКРЫТЫХ ПОЛОСТЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ РЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА; ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДИСБИОЗОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА
03.02.03 - микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
1 9 СЕН 2013
Москва-2013
005533218
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научные консультанты:
Афанасьев Станислав Степанович
доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Алешкин Владимир Андрианович
доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Официальные оппоненты: Шемякин Игорь Георгиевич
доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Калуцкий Павел Вячеславович
доктор медицинских наук, профессор, проректор по научной работе и инновациям, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России
Калюжин Олег Витальевич
доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (г. Москва)
Защита диссертации состоится <<г 2013 г. в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10.
Автореферат разослан
Ученый секретарь
диссертационного совета, доктор медицинских наук
Борисова Ольга Юрьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Микрофлора организма человека, является основой его микроэкологии и оказывает непосредственное влияние на жизнедеятельность, состояние здоровья и, как следствие, качество жизни. Микробиоценоз - динамическая микроэкологическая система, способствующая созданию более или менее однородных оптимальных условий для нормальной жизнедеятельности аутофлоры и выполняющая или регулирующая многочисленные функции макроорганизма.
Показатели состояния микробиоценозов отражают состояние реактивности макроорганизма - способности организма отвечать на воздействия внешней среды изменением своей жизнедеятельности, что обеспечивает его адаптацию к различным условиям обитания. Слизистые открытых полостей макроорганизма представляют собой единую систему. Их барьерная функция определяется состоянием колонизационной резистености (КР) - способностью микрофлоры и макроорганизма в кооперации защищать экосистему слизистых от патогенов (Иммунобиологические препараты, перспективы применения в инфекгологии, Г.Г. Онищенко, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова (ред.), 2002; Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В., 2007; Кочеро-вец В.И., Бунятян Н.Д., 2011).
Таким образом, КР является важной составляющей системы антиинфекционной резистености организма человека, которая определяется качественным и количественным составом биопленки, формируемой индигенной микрофлорой и/или патогенными микроорганизмами, а также факторами местной и организменной иммунной защиты. В настоящее время накоплено достаточно большое количество информации о роли качественных и количественных изменений микрофлоры открытых полостей организма человека в развитии инфекционно-воспалительных процессов и ряда соматических заболеваний.
Так, начало большинства бронхолегочных заболеваний связано с развитием патологических процессов в слизистой оболочке верхних дыхательных путей и ротоглотке, которая в норме задерживает и элиминирует около 70% поступающего извне инертного и агрессивного антигенного материала. Инициация любого инфекционно-воспалительного процесса зависит от соотношения уровней индигенных и условно-патогенных микроорганизмов, формирующих данный биотоп (Самсыгина Г.А., 2008; Е1 Ре§Ьа1у Я.Е. е1 а1., 2010).
Количественные и качественные нарушения в составе микробных симбионтов десневой жидкости, нарушения их взаимодействия с макроорганизмом обуславливают развитие пародонтита (Козлов Л.В. и др., 2008).
Возбудители урогенитального хламидиоза и уреаплазмоза - облигатные внутриклеточные паразиты, не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование ими способно приводить к различным осложнениям, оказывающим неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения. Их патогенный потенциал определяется концентрацией в организме, наличием или отсутствием определённых генов патогенности, состоянием микробиоценоза биотопа (лимитирующим фактором выступают условно-патогенные микроорганизмы и комменсалы, усиливающие патогенетический потенциал инфекционных агентов), ассоциацией с другими патогенными бактериями и вирусами, изменением физиологического и
3
иммунного статуса, соматическими заболеваниями (Фидров А.А. и др., 2006; Donatella etal., 2008).
При физиологическом течении беременности большое внимание уделяется нормальному микробиоценозу различных биотопов организма (влагалище, ротоглотка, кишечник). Различные экзогенные и эндогенные факторы вызывают изменение гомеостаза, развитие дисбактериозов, и, как следствие, нарушение нормального течения гестационного процесса (Шварцман Я.С., Хазенсон Л.Б., 1978; Кира Е. Ф., 2001; Тютюнник В.А., 2003).
Одним из самых насущных вопросов современной хирургии является перитонит, его классификация, оценка тяжести и лечение. При перитоните, как правило, выявляется полимикробный характер инфицирования. Оценка микробного пейзажа желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) позволяет выявить источник и характеризовать возбудителей при перитоните, судить об эффективности антибактериальной терапии (Войно-Ясенецкий В.Ф., 2006; Мороз В.В. и др., 2006). Каждый конкретный стационар характеризуется своим микробным пейзажем и госпитальными штаммами. Практически все нозокомиальные штаммы - представители микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека (Alberti С. et al., 2002) .
К сожалению, большинство микроэкологических исследований проводились без учета факторов местной и организменной резистентности. Вместе с тем, формирование КР слизистых оболочек, баланс воспалительно-противоспалительных реакций респираторного, урогенитального и желудочно-кишечного трактов определяется как индигенной микрофлорой, так и факторами местной иммунной защиты. Ключевым звеном КР является система врожденного иммунитета, в частности, TL-рецепторы мембранных комплексов, экспрессирующиеся в большинстве клеток организма человека. Антиинфекционная защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции при взаимодействии патогенов с TL-рецепторами и сопровождается активацией генов цитокинового каскада, ответственного за активацию фагоцитов и других иммунокомпетентных клеток, иммуноглобулинов (Ig), что, в свою очередь, определяет уровень мукозальной КР и, в дальнейшем, блокирование жизнедеятельности, дезинтеграцию и удаление инфекционного агента из организма (Spitzer J.H. et al., 2002; Liew F.Y. et al., 2005).
В связи с вышесказанным, представляется актуальным исследование взаимосвязи характеристик микробиоценозов и факторов врожденного и приобретенного иммунитета слизистых открытых полостей человека в норме и при инфекционной патологии.
Цель исследования - установление роли микробиоценозов респираторного, урогенитального и желудочно-кишечного трактов в формировании реактивности и антиинфекционной резистентности организма и оценка влияния дисбиотических нарушений на выраженность клинических проявлений инфекционно-воспалительных процессов при различных нозологических формах заболеваний.
Задачи исследования
1. Определить особенности формирования микробиоценоза слизистых дыхательных путей и факторов местного иммунитета у клинически здоровых детей и при респираторной патологии: острых респираторных вирусных инфекциях, тонзиллитах, ангинах, бронхитах, пневмониях.
2. Оценить качественный и количественный состав микрофлоры просветной и
4
пристеночной областей и показатели местного иммунитета биотопа урогениталь-ного тракта у клинически здоровых женщин репродуктивного возраста, и женщин, больных уреаплазменной и хламидийной инфекциями. Выявить влияние инфицированное™ хламидиями и уреаплазмами на восприимчивость макроорганизма к гетерологичным возбудителям инфекций.
3. Оценить антибиотикорезистентность как фактор патогенности внутриклеточных возбудителей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при уреаплазмозе, хламидиозе и распространённом гнойном перитоните в динамике при наблюдении пациентов.
4. Отработать подходы к оценке видовой и штаммовой вирулентности возбудителей уреаплазмоза, хламидиоза и гнойного перитонита по выявлению у них генетических детерминант патогенности и антибиотикорезистентности. Обосновать целесообразность применения комплексных фаговых препаратов при санации брюшной полости при перитонитах
5. Изучить состояние пристеночного и просветного микробиоценоза слизистых влагалища, ротоглотки, кишечника и факторов местного иммунитета как критериев состояния здоровья у клинически здоровых беременных и женщин при невынашивании беременности. Проанализировать взаимосвязь выраженности нарушений указанных микробиоценозов при данной патологии.
6. На основании проведенных комплексных исследований выявить патогенетический, диагностический и прогностический потенциалы микробиоценозов биотопов открытых полостей и их взаимосвязь с показателями местного иммунитета.
7. Разработать алгоритм оценки функционального состояния колонизационной резистентности слизистых респираторного, урогенитального и желудочно-кишечного тракта при инфекционно-воспалительных процессах различной локализации.
Научная новизна работы
Проведённые исследования позволяют представить микробиоценозы открытых полостей макроорганизма как динамические микроэкологические системы, формируемые микрофлорой (совокупностью типичных для определенного биологического вида и конкретного биотопа ассоциаций микроорганизмов), иммунологическими факторами антиинфекционной защиты макроорганизма и воздействием окружающей среды. Биотопы открытых полостей характеризуются единством и способностью к саморегуляции, являются интегральной частью организма хозяина и местного иммунитета, в частности. Колонизационная резистеность является показателем состояния микробиоценоза биотопа и местной антиинфекционной резистености.
При респираторных заболеваниях у детей родовой и видовой состав микроорганизмов, выделенных от больных, может служить дополнительным объективным критерием тяжести течения инфекционного процесса, а также позволяет дифференцированно судить об эффективности проводимой антибактериальной терапии и вносить необходимые коррекции в неё.
При остром и хроническом бронхитах у детей ведущими этиологическими факторами инфекционного процесса являются ассоциации вирусных и бактериальных патогенов и условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). При остром бронхите нарушения сдвигаются в сторону дисбиоза и выраженного воспалительного процесса, сопровождающимися высокими уровнями как индигенной микрофлоры, так и УПМ, что свидельсгвует о выраженной КР. При хроническом бронхите не резко
5
выраженное повышение перечисленных показателей свидетельствует о вяло текущем процессе. Обратная зависимость между показателями естественной и искусственной адгезий клеток буккального и назофаррингиального эпителиев свидетельствует о нарушении реакции рецепторов клеток эпителия на микроорганизмы и способствует преодолению микрофлорой колонизационного барьера. Взаимодействие TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 с микрофлорой биотопа определяет колонизационную резистеность слизистых. Подтверждено, что при респираторной патологии у детей TLR-2 и TLR-4 реагируют преимущественно на бактериальные патогены, a TLR-3 и TLR-8 - на вирусные. Установлена достоверная взаимосвязь TLR с факторами врождённого иммунитета лизоцимом, индексом естественной колонизации назофарингиального эпителия (ИЕКНЭ), slgA и sc. Уровни IgE независимы от показателей экспрессии генов TLR.
Выявлена способность микрофлоры десневой жидкости больных пародонтозом продуцировать протеиназы, обладающие неспецифической и специфической (по гидролизу исключительно IgAl человека) активностями.
Впервые комплексно оценена просветная и пристеночная микрофлора и показатели Ig секрета влагалища (Вл) клинически здоровых женщин и пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией. Выявлено резкое снижение КР, характеризующееся появлением и/или значительным увеличением в просветной и пристеночной областях ассоциаций условно-патогенных факультативно- (стрептококки, стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, кандида) - и облигатно-анаэробных микроорганизмов (пептострептококки, пептококки, гарднереллы, бактероиды, фузобактерии) и изменением показателей уровней Ig секрета Вл. Оценка содержания УПМ различной таксономической принадлежности в сопоставлении с уровнями Ig секретов позволяет оценивать степень дисбиотических нарушений микробиоценоза Вл. УПМ и грибы рода Candida обладают высокой резистентностью к антибактериальным и фунгицидным препаратам, изменяющейся в процессе лечения и отражающей его эффективность. При совместном применении иммуномодуляторов и антибактериальных препаратов повышается элиминирующий эффект последних на возбудителей и задерживается селекция антибиотикорезистентных культур в процессе лечения.
При урогенитальном хламидиозе (УГХ) патогены и УПМ, попадая на слизистые урогенитального тракта (УГТ), взаимодействуют с TLR и запускают воспалительную реакцию. Различные уровни активации TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Показатели уровней обсеменённости УПМ цервикального канала (Цк), уретры (Ур) и влагалища (Вл) прямо коррелируют с показателями уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. Повышение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений. Во Вл имеет место экспрессия генов TLR-2 и TLR-4 в ответ на УПМ, а в Цк и Ур - на УПМ и возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП). Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выраженно в ответ на патогены и УПМ и менее выражено - на нормофлору.
Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обуславливает хроническое течение УГХ. Однотипные изменения показателей экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 в Цк и Ур при хроническом УГХ указывают на "феномен рецепторной депрессии", сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакцией. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности УГХ и воспалительного процесса, а при выздоровлении их снижение свидетельствует об
эрадикации возбудителя. При остром УГХ выявление низких уровней TLR-2 и TLR-4 указывает на начало хронизации инфекционного процесса.
Впервые показано, что неотъемлемой частью патологических проявлений при урогенитальном хламидиозе и уреаплазе на организменном и местном уровнях является повышенная восприимчивость к гетерологичным бактериальным и вирусным патогенам.
При невынашивании беременности одновременное достоверное увеличение числа ассоциаций и интенсивности колонизации УПМ, снижение IgG, IgA, IgM, IgA, slgA и sc во влагалище (BJI), полости рта и кишечнике свидетельствует о риске невынашивания беременности и служит объективным критерием состояния реактивности организма и качества жизни пациенток, имеет диагностический и прогностический характер. Наличие тесной связи между микробиоценозами Вл, полости рта и кишечника служит обоснованием необходимости проведения комплексного исследования и своевременной коррекции выявленных нарушений, что может свести к минимуму вероятность невынашивания беременности. Инфекционный, гормональный или смешанный генез невынашивания беременности определяет выраженность изменений микробиоценозов Вл, полости рта и кишечника. Высокая частота и степень выраженности дисбиотических нарушений и наличие тесной связи между биотопами свидетельствует о системных микроэкологических изменениях в организме беременной.
Микробиологическая характеристика желудочно-кишечного тракта пациентов с гнойными перитонитами позволяет объективизировать оценку тяжести течения, стадии развития патологического процесса, оценку патогенетических свойств микроорганизмов по выраженности у них антибиотикорезистентности и их устойчивости к антисептическим препаратам. Выявлен пятилетний период четкой смены основного возбудителя нозокомиального инфицирования брюшной полости. Установлен 2-3-летний период в появлении устойчивых штаммов к антисептическим растворам, применяемым для этапных санаций брюшной полости. Степени антибиотикорезистетно-сти, фагорезистетности и устойчивости к антисептическим растворам выделенных штаммов при перитонитах - дополнительные критерии их патогенности. Отсутствует корреляция между антибиотико- и фагоустойчивостью. Впервые применённая при лечении перитонитов бактериофаготерапия исключает присоединение внугриболь-ничной флоры и обеспечивает элиминацию из перитониальной полости микроорганизмов, устойчивых к использованным ранее антибактериальным препаратам. Терапевтическая эффективность фагового препарата повышается при подборе фагов к конкретному микроорганизму, выделенному от конкретного пациента.
Нозокомиальные штаммы Е. coli, Acinetobacter и псевдомонадных бактерий от больных с перитонитом высеваются в титре 10б lg КОЕ/г, что косвенно свидетельствует о приобретении ими патогенных свойств. Нозокомиальные штаммы обладают генами, отвечающими за адгезию бактериальных клеток к тканям макроорганизма, обеспечивающими размножение, антибиотикорезистентность и повышающими пато-генность бактерий. Выявление островков патогенности (ОП), определяющих антибиотикорезистентность, в большинстве случаев совпадает с частотой выявления ан-тибиотикорезистености диско-диффузионным методом. Тем не менее, выявление ОП, определяющих антибиотикорезистентность, у 30% штаммов не совпадает с частотой выявления антибиотикорезистентности in vitro, что свидетельствует о многоплановых генетических механизмах, её определяющих.
Впервые предложена молекулярно-генетическая методология, включающая использование мультиплексных ПЦР-тест-систем в режиме реального времени для ве-
рификации Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, плазмидных и бесплазмидных штаммов Ch. trachomatis, а также генотипов Ch. trachomatis, что позволило выявить естественную системную хламидийную инфекцию у низших обезьян. Впервые выявлена зависимость выраженности патологического процесса и клинических проявлений от наличия и сочетания отдельных патогенетических факторов (плазмиды, функционального состояния гена IncA, принадлежности штамма хламидий к конкретному генотипу, одновременного инфицирования штаммами хламидий с разными генотипами).
Теоретическая значимость работы
Научно обоснована и подтверждена концепция о том, что взаимодействие микробиоценозов слизистых открытых полостей макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма и его антиинфекционную резистеность. Тем самым, достоверно подтверждена роль микроорганизмов в обучении защитных систем макроорганизма в онтогенезе. Изменение антиинфекционной резистентности к гете-рологичным патогенам на организменном и местном уровнях определяется набором факторов патогенности микроорганизмов, являющихся неотъемлемой патогенетической характеристикой возбудителей инфекций, обусловливающей, в конечном счёте, прогноз и исход заболевания.
Расширены представления о механизме формирования запуска инфекционного процесса, который является следствием взаимодействия микроорганизмов биотопов слизистых и возбудителей инфекционных заболеваний с TL-рецепторами, уровень экспрессии которых взаимосвязан с выраженностью показателей местного иммунитета (секреторных иммуноглобулинов и цитокинов).
Предложены теоретические основы и разработаны критерии комплексной оценки состояния микроэкологии и гуморального иммунитета слизистых открытых полостей человека в норме и при инфекционной патологии.
Представленный в диссертации метод комплексной оценки позволяет диагностировать степень микроэкологических нарушений, выявить этиологический фактор и прогнозировать тяжесть течения инфекционного процесса, проводить эффективные лечебно-профилактические мероприятия с целью элиминации возбудителей инфекции и восстановления микроэкологии и колонизационной резистености экосистем слизистых открытых полостей.
Практическая значимость работы
Впервые представлен алгоритм функционирования КР слизистых как интегральной составляющей местной антиинфекционной резистентности и мукозального иммунитета в целом. Предложенный запатентованный способ оценки КР слизистых можно рассматривать как метод оценки их мукозального иммунитета. Регистрация показателей уровней TLR, цитокинов и Ig слизистых имеет диагностическое и прогностическое значение, а также позволяет судить об эрадикации патогена.
Предложен универсальный молекулярно-генетический подход оценки патогенетических механизмов инфекционного процесса на организменном уровне и с учётом факторов патогенности возбудителя заболевания.
Впервые обоснованы принципы бактериофаготерапии перитонитов, отягощён-ных присоединением нозокомиальных микрорганизмов.
При бронхитах пятикратное повышение уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 и цитокинов IL-1(3, IL-8, INF-y, TNF-a свидетельствует об остром течении инфекционного процесса и хорошей местной антиинфекционной резистентности, а отсутствие повышения - о хроническом течении и нарушении местной антиинфекционной резистентности, что имеет диагностическое и прогностическое значение.
При УГХ выявление в соскобном материале из Ур уровней экспрессии генов TLR-2 более 14 ОЕ и TLR-4 более 10 ОЕ, а в соскобном материале из Цк TLR-2 более 19 ОЕ и TLR-4 более 14 ОЕ указывает на острый УГХ; выявление в соскобном материале из Ур уровней экспрессии генов TLR-2 не более 5 ОЕ и TLR-4 не более 5 ОЕ, а в соскобном материале из Цк TLR-2 не более 6 ОЕ и TLR-4 не более 9 ОЕ указывает на хронический УГХ или начало хронизации инфекционного процесса. Апробированный метод определения уровней экспрессии генов TLR с применением ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией, с использованием специфических прай-меров может быть востребован при лабораторной верификации возбудителя УГХ как дополнительный лабораторный тест, уточняющий клинические формы и прогнозирующий исход заболевания.
Внедрение в практику результатов исследования
Результаты проведенных исследований послужили основой для создания двух Новых медицинских технологий:
1. «Оценка микробиоценоза влагалища при акушерской и гинекологической патологии». Утверждена Минздравсоцразвитием: Разрешение на применение новой медицинской технологии. Серия АА. № 0001997. ФС № 2009/187 от 17.07.2009 г.
2. «Оптимизация методов лечения детей с вирусно-бактериальными инфекциями различной этиологии». Утверждена Минздравсоцразвитием: Разрешение на применение новой медицинской технологии. Серия АА. № 0000429. ФС № 2009/326 от 30.09.2009 г.
На основании проведенных исследований оформлено 14 патентов на изобретение:
1. Патент РФ «Способ оценки микробиоценоза влагалища» № 2249821 от 10.04.2005.
2. Патент РФ «Основа для выделения и культивирования микроорганизмов» № 2279469 от 10.07.2006 г.
3. Патент РФ «Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка»№2322506 от 20.04.2008г.
4. Патент РФ «Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза» № 2327995 от 27.06.2008 г.
5. Патент РФ «Способ профилактики нозокомиального перитонита» № 2333005 от 10.09.2008 г.
6. Патент РФ «Способ прогнозирования дестабилизации микробиоценоза организма млекопитающего» № 2377311 от 27.12.2009 г.
7. Патент РФ «Препарат, содержащий стафилококковый бактериофаг в качестве препарата для лечения кандидоза» № 2377006 от 27.12.2009 г.
8. Патент РФ «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946 от 10.04.2010 г. (награжден Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломами в номинации «100 лучших изобретений России»).
9. Патент РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» №
2385945 от 10.04.2010 г. (награжден Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломами в номинации «100 лучших изобретений России»).
10. Патент РФ «Способ диагностики угрозы прерывания беременности» № 2390022 от 20.05.2010 г.
11. Патент РФ «Способ установления неспецифического противоинфекционного действия иммуномодулирующего иммунобиологического препарата» № 2394559 от
20.07.2010 г.
12. Патент РФ «Способ оценки микробиоценоза полости матки у женщин с полипами эндометрия в постменопаузальном периоде» № 2430365 от 27.09.2011 г.
13. Патент РФ «Способ лечения полипов цервикального канала» № 2426537 от
20.08.2011 г.
14. Патент РФ «Способ генотипирования Chlamydia trachomatis» Ks 2443782 от
27.02.2012 г.
Материалы диссертационного исследования включены в учебные пособия и
пособия для врачей:
1. «Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях» (Астрахань-Москва, 2011, УМО-42 от 30.01.08), рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.
2. Учебное пособие «Клинико-лабораторная эффективность применения отечественного комбинированного пробиотика «Флорин Форте» в комплексном лечении детей с инфекционной респираторной патологией и при острых кишечных инфекциях» (Москва, 2010, утверждено деканом факультета усовершенствования врачей ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, профессором Б.В. Агафоновым, Протокол № 63 от 23.09.2010 г.).
3. Пособие для врачей «Роль инфекции в развитии патологии верхнего отдела дыхательных путей у детей» (Москва, 2010, утверждено проректором по учебной работе и международному сотрудничеству Российской медицинской академии последипломного образования член-корр. РАМН, профессором И.В. Поддубной, 06.06.2010 г.).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Изменения уровней микробиологических показателей, гуморальных факторов микробиоценозов и активности TLR слизистых открытых полостей отражают патогенетические механизмы инфекционных заболеваний и могут быть диагностическими и прогностическими критериями динамики течения инфекционно-воспалитсльных процессов различной локализации.
2. Выявление нарушений микроэкологии биотопов влагалища, кишечника и ротоглотки у беременных женщин, в том числе, с нарушением течения гестационного процесса, определяет необходимость проведения коррекции дисбиотических состояний.
3. Оценка показателей микробного пейзажа позволяет дифференцировать распространенный гнойный вторичный или послеоперационный перитонит, верифицировать возбудителей инфекции, корректировать и оценивать эффективность проводимой терапии, а также прогнозировать исход патологического процесса.
4. Показана возможность влияния патогенов на формирование повышенной чувствительности макроорганизма к гетерологичным возбудителям инфекционного процесса на местном и организменном уровне. Доказана связь генотипических и фе-нотипических свойств возбудителей с патогенетическими механизмами и особенностями клинического течения инфекционных заболеваний.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании Учёного совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Протокол № 3 от 21 марта 2013 г.
Материалы исследования и основные положения работы доложены на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.), на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007 г.), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.), IV международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербурского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008г.), Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2-3 октября 2008г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009г.), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопастность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009г.), The 3rd Congress of European Microbiologists «Microbes and Man - interdependence and future challenges» (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009), XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 86 печатных работ, в том числе 43 -в рецензируемых изданиях; 6 - в периодических изданиях; 15 - в сборниках материалов конференций; 3 книги в соавторстве; 2 новые медицинские технологии; 1 учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей, 2 пособия для врачей. Получены 14 патентов на изобретение РФ: № 2249821 от
10.04.2005, № 2327995 от 27.06.2008, № 2385945 от 10.04.2010, № 2385946 от 10.04.2010, № 2443782 от 27.02.2012, № 2390022 от 20.05.2010, № 2333005 от
10.09.2008, № 2394559 от 20.07.2010, № 2377311 от 27.12.2009, № 2377006 от
27.12.2009, № 2430365 от 27.09.2011, № 2426537 от 20.08.2011, № 2279469 от
10.07.2006, № 2322506 от 20.04.2008.
Объём и структура и диссертации
Диссертация изложена на 364 страницах печатного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 540 источников, в том числе 234 отечественных и 306 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 51 таблицей и 27 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований
Клинико-лабораторная характеристика обследованных пациентов.
Для решения поставленных задач в 2005-2012 году было проведено клинико-лабораторное обследование 1690 пациентов на базе Консультативно-диагностического центра ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Детской государственной клинической больницы им. Святого Владимира, кафедре инфекционных болезней ГБУЗ МО Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского Минздрава России, Истринской районной детской поликлинике (г. Истра, Московская обл.), кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, кафедры общей хирургии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Минздрава России.
Клинико-лабораторная характеристика детей с инфекционной патологией респираторного тракта.
Проведено исследование микрофлоры задней стенки глотки у 351 ребенка в возрасте от 2 месяцев до 15 лет: клинически здоровые дети - 98, острый тонзиллит (ангина) - 58, ОРВИ -128, пневмония - 20, ИМ с гнойно-воспалительным поражением ротоглотки - 47.
Обследовано 27 клинически здоровых детей в возрасте 3-14 лет и 66 детей с острыми и рецидивирующими заболеваниями респираторного тракта в возрасте 3-7 лет: 1 группа - контрольная (27 детей), 2 группа - больные с острым бронхитом (51 ребенок), 3 группа - больные с хроническим бронхитом (15 человек).
Клинико-лабораторная характеристика больных пародонтозом. Обследовано 7 больных пародонтозом в возрасте 35-55 лет. Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированной уреаплазменной инфекцией урогенитального тракта (УГТ) (50 пациенток). Обследованы 50 женщин в возрасте 18-36 лет, с установленной уреаплазменной моно- и микст-инфекцией. U. urealiticum выявлялась у всех больных в диагностическом титре более чем 104 КОЕ/мл. Контрольная группа (группа сравнения) включала 40 клинически здоровых женщин. Частыми жалобами у больных являлись выделения из половых путей, жжение и зуд в области Вл и вульвы, боли внизу живота. При исследовании в зеркалах у подавляющего большинства больных определялась гиперемия и отечность слизистой шейки матки, эктопия и контактная кровоточивость шейки матки. Основные клинические проявления: цистит в 4,0%, уретрит - в 12,0%, цервицит - в 44,8%, кольпит - в 2,0%, эрозия шейки матки - в 32,0%, сальпингоофорит - в 20,0% случаев.
Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированным или перенесенным урогенитальным хламидиозом (УГХ) УГТ (100 пациенток).
Обследованные 100 пациенток с подтвержденным или ранее перенесенным урогенитальным хламидиозом и 32 клинически здоровых женщины были разбиты на 4 группы. Группу I (острый хламидиоз) составила 41 пациентка. Положительные
результаты ПИФ, ПЦР и культурального метода (КМ) подтверждали наличие Ch. trachomatis в УГТ. В сыворотке крови больных методом ИФА определяли наличие специфических антител (Ат) иммуноглобулинов (Ig). IgG-Ат определяли в сыворотке крови больных I группы в титре 1:50-1:100. Повторный лабораторный анализ через 23 недели показал появление IgA-AT в титре 1:50 и выше, что свидетельствовало о первичном инфицировании больных и острой стадии инфекционного заболевания. Пациентки отрицали наличие ранее перенесенного хламидиоза. Группу II (хронический хламидиоз) составляли 29 пациенток. В сыворотке крови определяли стойкие титры IgA-AT (1:100-1:200) и IgG-Ат (1:100-1:200), концентрация которых не изменялась на протяжении длительного периода. Длительность заболевания составляла от 3 до 5 лет. Положительные результаты ПИФ, ПЦР и КМ свидетельствовали о подтверждённом рецидиве УГХ. Схожесть клинических проявлений и наличие двух эпизодов обострения заболевания в течение предшествующих 12 месяцев свидетельствовали о хроническом течении УГХ. Рецидивы отмечались с частотой 1 раз в полгода. Все больные неоднократно получали антибактериальную терапию без стойкого клинического и бактериологического положительного эффекта. В группу III (группа сравнения) вошли 30 пациенток, в анамнезе которых ранее диагностировался УГХ. Отсутствие IgA-AT или низкие, не меняющиеся во времени титры IgG-Ат (1:50), свидетельствовали о давно перенесённой хламидийной инфекции. У отдельных пациентов выявлялись IgG-Ат в титрах 1:100-200, уровни которых снижались в течение 12 месяцев. Маркёры хламидий в УГТ не выявлялись в течение одного года. В группу IV (контрольная, группа сравнения) включены 32 клинически здоровые женщины. Клинико-лабораторное обследование подтвердило отсутствие признаков хламидийной инфекции и ИППП, а также наличия гинекологической патологии. Дополнительно клинико-лабораторное обследование прошли 99 пациентов с подозрением на хламидиоз и 39 клинически здоровых пациентов. По возрасту, общему соматическому статусу, репродуктивному состоянию, выраженности клинических проявлений пациентки всех групп были сопоставимы. Частыми жалобами у больных являлись выделения из половых путей, жжение и зуд в области Вл и вульвы, боли внизу живота. У большей части больных выделения из Вл были обильными, различными по цвету и характеру и у большинства пациентов сопровождались зудом или дизурическими явлениями. При исследовании в зеркалах у подавляющего большинства больных определялась гиперемия и отечность слизистой шейки матки, эктопия и контактная кровоточивость. Основные клинические проявления: в группе I - цистит в 8,3%, уретрит - в 44,0%, цервицит - в 100,0%, кольпит - в 6,8%, эрозия шейки матки - в 20,8%, сальпингоофорит - в 12,5% случаев; в группе II - цистит в 7,7%, уретрит - в 0,0%, цервицит - в 100,0%, кольпит - в 38,5%, эрозия шейки матки - в 46,2%, сальпингоофорит - в 46,2% случаев; в группе III -цистит в 16,7%, уретрит - в 0,0%, цервицит - в 0,0%, кольпит - в 33,3%, эрозия шейки матки - в 66,7%, сальпингоофорит - в 50,0% случаев.
Клинико-лабораторная характеристика клинически здоровых женщин
контрольной группы (111 пациенток).
На момент обследования у 20,9% женщин были жалобы на выделения из половых путей, у 8,1% диагностирован кольпит, у 6,2% - цистит, у 6,0% - эрозия шейки матки. У 24,4% женщин выявлены УПМ (пептострептококки, стафилококки, энтерококки, кишечная палочка, грибы рода Candida) при отсутствии возбудителей ИППП.
Клинико-лабораторная характеристика беременных.
Проведено клинико-лабораторное обследование 448 беременных, из них 373 пациентки с невынашиванием беременности включены в основную группу и 75 беременных с физиологическим течением гестационного процесса - в контрольную группу.
Клинико-лабораторная характеристика пациентов с распространённым
гнойным перитонитом.
Обследован 431 пациент с распространенным гнойным перитонитом. В ретроспективное исследование включен 391 больной. Сроки обращения за медицинской помощью с момента возникновения заболевания до поступления в стационар - от 6 часов до 4 суток. Вторичный перитонит - 217 (55,5%) больных. Послеоперационный перитонит - 101 (25,8%) пациент. В проспективное исследование включено 40 пациентов, у которых в процессе лечения использовалась лапаростома (не менее 5 санаций). По возрастным характеристикам, срокам обращения за медицинской помощью, источникам перитонита группы не различались.
Клинико-лабораторная характеристика низших приматов с установленной спонтанной хламидийной инфекцией.
Проведено клинико-лабораторное обследование 269 обезьян на базе Адлерского питомника обезьян НИИ Медицинской приматологии РАМН на установление возможности распространения хламидийной спонтанной инфекционной патологии. Объектом исследования служили низшие обезьяны обоего пола, разного вида и возраста (от 0 дней до 27 лет): группу I составили 114 клинически здоровых обезьяны; группу II - 48 больных животных с хламидийной патологией УГТ, глаз, с выраженной клиникой течения заболевания (у самок - аборты, эндометриты, цервициты, у самцов -уретриты, конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты, угнетённое состояние или повышенная возбудимость); группу III - 45 больных животных с хламидийной патологией УГТ и органов дыхания без выраженной клиники заболевания (в анамнезе отмечались выкидыши, бесплодие, острые случаи клинических проявлений); группу IV - 62 погибших взрослых животных и детеныши с различной хламидийной патологией.
Клинико-лабораторные методы исследования.
Микробиологические, иммунологические и молекулярно-генетические исследования проводились на базе ФБУН МНИИЭМ им. Габричевского Роспотребнадзора.
Обследование женщин включало оценку характера субъективных симптомов, данных анамнеза, результатов общего объективного и специального гинекологического осмотров, дополнительных методов исследования. Гинекологическое обследование предусматривало осмотр и оценку наружных половых органов, слизистых оболочек Вл и шейки матки, характер выделений, проведение влагалищного и бимануального обследований, УЗИ-диагностику на аппарате Aloka SSD-280 (Япония). Сбор клинического материала осуществлялся в первую фазу менструального цикла, в среднем на 11-13 день цикла.
Диагноз УГХ устанавливался на основании результатов клинико-инструментальных методов обследования (Воробьев A.A., 2004; Савичева A.M. и др., 2004), исследования соскобного материала из Цк методом световой микроскопии, иммунофлюоресцентным методом с . использованием флуоресцентных моноклональных Ат к CA. trachomatis, методом ПЦР и выделения хламидий в культуре клеток (КК) McCoy. Дополнительным критерием служил анализ уровней
14
титров IgG-Ат, IgA-AT в сыворотке крови методом ИФА («Chlamydia trachomatis IgG, IgA- pELISA», «Medac», Германия). Обследовали на первой и третьей неделе после первичного обращения; повторные исследования проводились спустя один-два месяца после терапии. Критерием излеченности считали отсутствие маркеров Ch. trachomatis в УГТ.
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование женщин с установленной уреаплазменной моно- и микст-инфекцией. Выявление, определение титра и антибиотикочувствительности уреаплазм проводили с использованием тест-систем «Micoplasma DUO» («Bio-Rad», США). Диагноз подтверждён обнаружением возбудителя в титре более 104 КОЕ/мл.
Инфицированность возбудителями ИППП: ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, микоплазмами, уреаплазмами, токсоплазмами, кандида - устанавливалась общепринятыми методами ПЦР, а микоплазмами, уреаплазмами - дополнительно ИФА.
У всех обследованных детей проводили определение наличия JgM-Ат, JgG-Ат к Chi. pneumoniae с использованием тест-системы «Medac» (Германия), к М. pneumoniae - «Savyondiagnostics» (Израиль), к аденовирусу, к вирусам гриппа А и В, к респираторно-синцитиальному вирусу (PCB) «DRG» (Германия). Определение IgM-Ат и IgG-Ат к капсидному (VCA) антигену вируса Эпштейна-Барр и вирусу герпеса 1 типа проводили с использованием тест-систем «ВСМ Diagnostics» (США).
Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ. Материалом для микроскопического исследования служили мазки из Вл, Цк и Ур (Приказ МЗ РФ № 415 от 20.08.2003; Приказ МЗ СССР № 936 от 12.07.85 г.; Савичева A.M. и др., 2004) один - с последующей окраской по Романовскому-Гимзе для характеристики лейкоцитарной реакции и клеточного состава, другой - по Граму для характеристики микрофлоры. Материал забирали стерильными ватными тампонами и наносили на обезжиренные предметные стекла.
Оценка функционального потенциала мукозальной защиты. Для интегральной оценки эффективности функционального потенциала мукозальной защиты респираторного тракта у детей изучен ИЕКНЭ, основанный на количественном подсчете «оральных стрептококков», адгезированных на эпителиоцитах ребенка в естественных условиях (Маянский А.Н. и др., 1987). ИЕКНЭ выражается в абсолютных числах.
Микробиологические исследования. Для количественного
микробиологического анализа ротоглотки исследуемый материал забирали с ЗСГ или с миндалин стерильным тампоном-зондом. Для исследования содержимого пародонтального кармана и десневой жидкости использовали метод количественного забора материала микропипетками. Материал с поверхности заднего свода Вл собирали до мануального исследования после введения зеркал. Для оценки состояния просветной флоры забор материала производился стерильным ватным тампоном, а для оценки состояния пристеночной флоры - с помощью уро-генитальных зондов, позволяющих получить со слизистой слой поверхностных эпителиальных клеток. Материал помещали в коллекторы с транспортной средой «Amies», содержащей фармакологический активированный уголь, для доставки в лабораторию. Из Цк и Ур забирали мазки-соскобы с помощью урогенитальных зондов. Количество исследуемого материала при заборе тампоном составляло 0,5 г, урогенитальным зондом - 0,2 г. Бактериологическое исследование отделяемого ЗСГ, десневого кармана, Цк, Ур и Вл проводили общепринятыми методами (Зверев В.В. и др., 2011; Приложение 1 к приказу МЗ СССР № 535 от 22.04.1989 г.).
Оценка выраженности нарушений микробиоценоза Вл и Цк проводилась в соответствии с предложенной нами и утверждённой Минздравсоцразвитием новой медицинской технологией (табл. 1) (Зверев В.В. и др., 2011): нормоценоз Вл определяется при наличии на поверхности эпителиоцитов менее 25 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, при количестве лейкоцитов менее 10 в поле зрения, при отсутствии ключевых клеток (I степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 6-8 lg КОЕ/г лактобацилл, при содержании в соскобном материале 7-10 lg КОЕ/г лактобацилл, при отсутствии в отделяемом и в соскобном материале условно-патогенной факультативно-анаэробной и облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA 0 мкг/мл, sIgA<10 мкг/мл, IgM 0 мкг/мл, sc<10 мкг/мл; промежуточный тип микробиоценоза Вл при наличии на поверхности эпителиоцитов 25-50 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, единичными
грамположительными кокками и неотрицательными палочками, при количестве лейкоцитов 10-20 в поле зрения, при отсутствии ключевых клеток (II степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 4-5 lg КОЕ/г лактобацилл, 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 5-6 lg КОЕ/г лактобацилл, 1-2 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA<10 мкг/мл, slgA 11-15 мкг/мл, IgM<10 мкг/мл, sc 10-25 мкг/мл; дисбиоз Вл при наличии на поверхности эпителиоцитов 50-100 бактериальных клеток, представленных грамположительными палочками, грамположительными кокками и грамотрицательными палочками, при количестве лейкоцитов 20-40 в поле зрения, при наличии ключевых клеток менее 5 в поле зрения (III степень чистоты мазка), при содержании в отделяемом 1-3 lg КОЕ/г лактобацилл, 5-7 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной микрофлоры и 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 3-4 lg КОЕ/г лактобацилл, 3-4 lg КОЕ/г условно-патогенной факультативно-анаэробной микрофлоры и 5-7 lg КОЕ/г условно-патогенной облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA IIIS мкг/мл, slgA 16-30 мкг/мл, IgM 11-20 мкг/мл, sc 26-50 мкг/мл; бактериальный вагинит при наличии на поверхности эпителиоцитов не менее 100 бактериальных клеток, представленных единичными грамположительными палочками и обильной грамотрицательной и грамположительной палочковой и кокковой флорой, при количестве лейкоцитов не менее 40 в поле зрения, при количестве ключевых клеток не менее 5 в поле зрения (IV степень чистоты мазка), при отсутствии в отделяемом лактобацилл, при содержании в отделяемом 5-6 lg КОЕ/г монокультуры условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и/или при содержании в соскобном материале 1-3 lg КОЕ/г лактобацилл, 6-8 lg КОЕ/г монокультуры условно-патогенной факультативно-анаэробной или облигатно-анаэробной микрофлоры и при концентрации в смыве IgA>15 мкг/мл, sIgA>30 мкг/мл, IgM>20 мкг/мл, sc>50 мкг/мл.
Показатели Степень нарушения микробиотопа влагалища
Нормоценоз Промежуточ-'ньш тип Дисбиоз Бактериальный вагинит
Степень чистоты мазка I II III IV
Морфология мазка:
обсемененность эпителиоцитов <25 25-50 50-100 >100
лейкоциты <10 10-20 20-40 >40
ключевые клетки 0 0 <5 >5
Микрофлора, КОЕ/г
лакгобациллы 6-8/8-10 4-5/5-6 1-3/3,5±0,4 0/1-3
бифидобактерии 3-4/5-6 0/0 0/0 0/0
условно-патогенная
факультативные анаэробы 1-2/2-3 3-4/1-2 5-7/3-4 5-6/6-8
облигатные анаэробы 1-2/34 1-2/3-4 3-4/5-7 5-6/6-8
Иммуноглобулины, мкг/мл
1ЕМ 0 <10 11-20 >20
ДО <10 11-15 16-20 >20
0 <10 11-15 >15
<10 11-15 16-30 >30
БС <10 10-25 26-50 >50
Примечания: в числителе - показатели просветной микрофлоры, а в знаменателе - пристеночной.
Изменения микробиоценоза Цк (табл. 2): нормоценоз микробиоценоза Цк определяется при количестве лейкоцитов <4 в поле зрения, при содержании в соскобном материале 1-2 ^ КОЕ/г УПМ и при концентрации в смыве 1§(3<8 мкг/г белка, в1£А<7 мкг/г белка, бс<8 мкг/г белка; промежуточный тип микробиоценоза Цк определяется при количестве лейкоцитов 8-10 в поле зрения, при содержании в соскобном материале 2-3 ^ КОЕ/г УПМ и при концентрации в смыве 10-13 мкг/г белка, э^А 11-14 мкг/г белка, ее 13-19 мкг/г белка; дисбиоз микробиоценоза Цк определяется при количестве лейкоцитов 14-40 в поле зрения, при содержании в соскобном материале 3-4 ^ КОЕ/г УПМ и при концентрации в смыве ^С 30-40 мкг/г белка, б^А 20-30 мкг/г белка, бс 30-40 мкг/г белка; бактериальный вагинит микробиоценоза Цк определяется при количестве лейкоцитов >40 в поле зрения, при содержании в соскобном материале >4 1§ КОЕ/г УПМ и при концентрации в смыве >40 мкг/г белка, э^А >30 мкг/г белка, ее >40 мкг/г белка.
Таблица 2. Микроэкологические типы микробиотопа цервикального канала
Показатели Степень нарушения микробиотопа цервикального канала
Нормоценоз Промежуточный тип Дисбиоз Бактериальный цервицит
Морфология мазка:
Лейкоциты <4 8-10 14-40 >40
Условно-патогенная микрофлора, ^ КОЕ/г
УПМ 1-2 2-3 3-4 >4
Иммуноглобулины, мкг/г белка
ДО <8 10-13 30-40 >40
<7 11-14 20-30 >30
ее <8 13-19 3040 >40
Оценка выраженности нарушений микробиоценоза ротоглотки
проводилась в соответствии с предложенной нами методикой (табл. 3) (Зверев В.В. и др., 2011): нормоценоз, характеризующийся отсутствием микроэкологических нарушений, присутствием индигенной микрофлоры: Streptococcus spp. в количестве 5-6 lg КОЕ/г, Neisseria spp. - 4-6 lg КОЕ/г при концентрации в слюне IgA < 20 мкг/мл, slgA < 20 мкг/мл, IgM 0 мкг/мл, IgG < 50 мкг/мл, sc < 50 мкг/мл; промежуточный тип (I степень диебиотичееких нарушений), характеризующийся нарастанием нормофлоры (Streptococcus spp. - до 6-7 lg КОЕ/г, Neisseria spp. - 6-7 lg КОЕ/г) и появлением УПМ в количестве до 3-4 lg КОЕ/г при концентрации в слюне IgA 2050 мкг/мл, slgA 20-50 мкг/мл, IgM < 10 мкг/мл, IgG 50-100 мкг/мл, sc 50-100 мкг/мл; дисбиоз (II степень диебиотичееких нарушений) ротоглотки, при котором наблюдается повышение количества нормофлоры (Streptococcus spp.- 6-7 lg КОЕ/г, Neisseria spp.- 6-7 lg КОЕ/г), повышение уровня факультативно-анаэробной УПМ до 4-5 lg КОЕ/мл, появление вирулентных вариантов УПМ, характеризующихся выраженными факторами патогенности, при концентрации в слюне IgA 50-100 мкг/мл, slgA 50-100 мкг/мл, IgM 10-30 мкг/мл, IgG 100-200 мкг/мл, sc 100-200 мкг/мл; выраженный воспалительный процесс (III степень диебиотичееких нарушений), характеризующийся значительным повышением содержания Streptococcus spp. - 7-8 lg КОЕ/г, Neisseria spp. - 7-8 lg КОЕ/г, УПМ и количества вирулентных микроорганизмов до 6-8 lg КОЕ/мл при концентрации в слюне IgA > 100 мкг/мл, slgA > 100 мкг/мл, IgM > 30 мкг/мл, IgG > 200 мкг/мл, sc > 200 мкг/мл.
Таблица 3. Микроэкологические типы микробиотопа ротоглотки
Показатели Степень нарушения микробиотопа ротоглотки
Нормоценоз Промежуточный тип Дисбиоз Выраженный воспалительный процесс
Микрофлора
Нормофлора, угнетение* -/- +/+ ++/++ +++/+++
Нормофлора (а, у-гемолкгические стрептококки, непатогенные нейссерии), lg КОЕ/г 4-6 6-7 6-7 7-8
Условно-патогенные аэробы / факультативные анаэробы. Ig КОЕ/г 0/0 3-4/3-4 4-5/4-5 6-8/6-8
Иммуноглобулины, мкг/мл
IgG <50 50-100 100-200 >200
IgM 0 < 10 10-30 >30
IgA <20 20-50 50-100 > 100
slgA <20 20-50 50-100 >100
sc <50 50-100 100-200 >200
Примечания: * - в числителе - показатели микрофлоры слизистой ротоглотки, в знаменателе -слюны;«-» - отсутствие признака;«+»- интенсивность признака.
Оценка выраженности нарушений микробиоценоза кишечника проводилась в соответствии с предложенной нами методикой (табл. 4) (Зверев В.В. и др., 2011): нормоценоз: содержание кишечной палочки > 8 ^ КОЕ/г, лактобацилл > 7 ^ КОЕ/г, бифидобакгерий > 9 ^ КОЕ/г, отсутствие УПМ при содержании в копрофильтратах ^А < 10 мкг/мл, в^А < 10 мкг/мл, ^М 0 мкг/мл, ДО < 10 мкг/мл, бс < 10 мкг/мл; I степень дисбактериоза кишечника характеризуется повышенным или пониженным содержанием кишечной палочки (> или < 8 ^ КОЕ/г), снижением содержания лактобацилл (<6 ^ КОЕ/г) и бифидобактерий (<9^ КОЕ/г) при содержании в
18
копрофильтратах ^А < 10 мкг/мл, б^А < 10 мкг/мл, ^М < 5 мкг/мл, 10-20
мкг/мл, ее < 10 мкг/мл; II степень дисбактериоза кишечника характеризуется сниженным содержанием кишечной палочки (< 8 ^ КОЕ/г), лактобацилл (< 6 ^ КОЕ/г) и бифидобактерий (< 81§ КОЕ/г), появлением УПМ в количестве > 4 ^ КОЕ/г, при содержании в копрофильтратах 1§А 10-20 мкг/мл, в^А 10-20 мкг/мл, ^М 510 мкг/мл, 20-40 мкг/мл, ее 10-20 мкг/мл; III степень дисбактериоза кишечника характеризуется значительным снижением содержания кишечной палочки с неизмененными ферментативными свойствами (<6 ^ КОЕ/г), появлением слабоферментирующей и/или гемолизирующей кишечной палочки (>4 КОЕ/г), значительным содержанием лактозонегативных энтеробактерий, грамотрицательных неферментирующих бактерий, кокковой флоры (>6 КОЕ/г), резким снижением содержания лактобацилл и бифидобактерий <5 ^ КОЕ/г и <7 lg КОЕ/г, соответственно, при содержании в копрофильтратах ^А >20 мкг/мл, в^А >20 мкг/мл, ^М >10 мкг/мл, >40 мкг/мл, ее >20 мкг/мл.
Таблица 4. Микроэкологические типы микробиотопа кишечника
Показатели Степень нарушения микробиотопа кишечника
Нормоценоз | Первая степень | Вторая степень | Третья степень
Микрофлора, lg КОЕ/г
кишечная палочка >8 > или <8 <8 <6
слабо ферментирующая кишечная палочка 0 0 >3 >4
гемолизирующая кишечная палочка 0 0 >3 >4
лактобациллы >7 <6 <6 <5
бифидобактерии >9 <9 <8 <7
условно-патогенная: 0 0
факультативные анаэробы: >4 >6
облигатные анаэробы: >4 >6
Иммуноглобулины, мкг/мл
IgG <10 10-20 20-40 >40
IgM 0 <5 5-10 >10
IgA <10 <10 10-20 >20
slgA <10 <10 10-20 >20
sc <10 <10 10-20 >20
Штампы микроорганизмов.
В качестве положительных контрольных образцов возбудителей хламидиоза выступали референс штаммы Chi. pneumoniae - «В» и Ch. trachomatis - «Бурхан», полученные из Государственной Коллекции Вирусов (ГКВ) ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Штаммы Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae, полученные от пациентов, сохранялись в жидком азоте для дальнейшего изучения свойств.
Молекулярно-генетические методы исследования.
Определения экспрессии генов TLR-2, TLR-3, TLR-4 и TLR-8.
Исследования проводили по предложенной оригинальной методике (Байракова A.JI. и др., 2008). В день обследования у пациентов забирали мазки-соскобы со слизистых ЗСГ, Вл, Цк и Ур с помощью стерильного урогенитального зонда. Содержимое зондов тщательно суспендировали в забуференном физиологическом растворе в пробирках "Эппендорф" с последующим определением количества всех
клеточных элементов с помощью слайд-планшета (Плива-Лахема, Чехия). Конечная
концентрация клеток в образце составляла не менее 1><105 клеток в мл. Полученный
материал суспендировали в растворе EverFresh RNA (ЗАО "Силекс", г. Санкт-
Петербург) в соотношении объема суспензии клеток к раствору, равному 1:5. Уровень
экспрессии генов TLR определялся методом ПЦР в режиме реального времени (РВ),
совмещенной с обратной транскрипцией с использованием специфических праймеров
TLR2 -F - 5'-CCTTCACTCAGGAGCAGCAAGC-3';
TLR2- R-5-TGGAAACGGTGGCACAGGAC-3';
TLR4- F - 5'-GAAGGGGTGCCTCCATTTCAGC-3';
TLR4 -R- 5'-TGCCTGAGCAGGGTCTTCTCCA-3';
TLR8 - F -5 '-TAGTTTTCAGTGGC AATCGC-3';
TLR8- R- 5'-GAGACGAGGAAACTGCTGGA-3';
TLR3 - F- 5'-GGTCCC AGCCTTAC AGAGAA-3';
TLR3 - R- 5'-AGCCCGTGCAAAGAGTGAGA-3'.
Уровни экспрессии мРНК TLR стандартизировали по гену GAPTAH:
GAPDH-Fl-5'-TGCMTCCTGCACCACCAACT-3';
GAPDH-F2- S'-YGCCTGCTTCACCACCTTC -3'
за счет сходной экспрессии этого гена в тканях организма человека. Из исследуемого материала выделяли тотальную РНК согласно протоколу к наборам для выделения тотальной РНК на магнитных частицах Si02 - бесфенольное выделение для микроанализа (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург, Россия). Синтез первой цепи кДНК проводили согласно указаниям инструкции «Набора для синтеза первой цепи кДНК (базовый)» (ЗАО "Силекс", г. Санкт-Петербург, Россия). Амплификацию с последующим определением уровня экспрессии TLR проводили методом ПЦР с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (РВ) с помощью детектирующего амплификатора АМК-32 ("Синтол", Россия) и специфических праймеров к TLR-2, TLR-3, TLR-4 и TLR-8 ("Синтол", Россия). Последовательности мРНК TLR-2, TLR-3, TLR-4, TLR-8 и GAPDH получены из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) и синтезированы фирмой «Синтол» (Россия). Конструирование олигонуклеотидных праймеров к генам TLR-2, TLR-3, TLR-4 и TLR-8 проводили с применением биоинформационного анализа с использованием компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/). Количество исследуемых кДНК в образцах рассчитывали путем определения пороговых циклов ПЦР в РВ на образцах серийных разведений очищенного ПЦР-продукта в качестве матрицы. Нормализация количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе проводилась с помощью отношений TLR2/GAPDH, TLR3/GAPDH, TLR4/GAPDH и TLR8/GAPDH. Экспрессию генов TLR оценивали в относительных единицах (ОЕ).
ПЦР диагностика хламидийной инфекции.
Экстракцию DNA проводили с помощью набора для выделения ДНК из мазков-соскобов «ДНК-сорб-АМ» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва, регистрационное удостоверение № ФСР 2007/00183). Для ПЦР амплификации ДНК Ch. trachomatis использовали набор реагентов «АмплиСенс СЛ. trachomatis-EPh» (ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, регистрационное удостоверение № ФСР 2007/00683). Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле. Все этапы выполнялись согласно инструкции производителя.
Для видовой мультиплексной детекции и идентификации Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae впервые применены подобранные оригинальные универсальные праймеры на фрагмент гена 16S рРНК: для Ch. trachomatis - Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3', для Chi. pneumoniae Cpn: 5'-CGGAATAACGACTTGAGTTG-3', общий реверс праймер для обоих видов R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3'. Размер продукта амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для Chi. pneumoniae - 440 п. н., для Ch. trachomatis - 334 п. н. Для детекции штаммов Ch. trachomatis, несущих плазмиду и свободных от нее, была впервые предложена следующая оригинальная комбинация праймеров: Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' и R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3' для амплификации фрагмента^ рРНК гена (334 п. н.); PLf: 5'-TTCGAGGCGAGTAACGAAGA-3' и PLr: 5'-AAGCAACGCGCGCGATAGGT-3' для амплификации участка криптической плазмиды Ch. trachomatis (241 п. н.).
Молекулярно-генетическое типирование штаммов Ch. trachomatis осуществляли методом ПЦР-ПДРФ (Koskela Р. et al., 2000).
Таблица 5. Предлагаемые праймеры для генотипирования штаммов Chi, trachomatis
Генотипы Олигонуклеотидные праймеры Размер продукта
Группа генотипов В (генотипы: В, Ва, Б, Иа, Е, 1Л, 12, Ь2а) BGrl f 5'-GCTTAATCAATCTGGCTGTTGA-3' BGrl r 5'-TCCAGACTTGTGGATAGTAAAC-3' 191 п.н.
Группа генотипов С (генотипы: А, С,Н, I, Ь, I, КиЬЗ) CGr f 5'-AACTAAGTGGGCTT ATTAGGAA-3' CGr r 5'-TCAAGTAGAGAGCTAGACCA-3' 107 п.н.
промежуточная группа (генотипы: Р.О.Сда) FI 5'-CTGGGATGGAACTGTATACA-3' RI 5'-TACAACTCAGGGTAGGTCAA-3' 274 п.н.
Генотип С Comp f 5'-AAGGAAGTGTGGGATCTGACG-3' Comp r 5'-AAATATACAATGATTAGCACC-3' 221 п.н.
Генотип Е Eomp f 5'-AGACGGATACCGCCTTATCTTG-3' Eomp r 5'-CTGGCTTGCCACTCAGGCTAAT-3' 265 п.н.
Генотип ! Jomp f 5'-ATATTTTGCCTAAGACTGCT-3' Jomp r 5'-TTTAGGGTTAGATAGAGAAT-3' 152 п.н.
Генотип Да Jaomp f 5'-TAGTGTCGGCGACGTAGCAG-3' Jaomp r 5'-TCCTAGATATTTAATGCCAT-3' 135 п.н.
Генотип Н Fh 5'-ATCTTCTGAGTATAATACAGC-3' Rh 5'-ACGTTACGTTTAAATTGAGCA-3' 177 п.н.
Генотип И Ff 5'-ACGAAACGTGCTGCAAATA-3' Rf 5'- TAGCCAATCATTGTAAACA-3' 321 п.н.
Генотип Б Domp f 5'-ATAATGAGAATCTAAAGACG-3' Domp г 5'-TAGAATGAGCATATTGGCAA-3' 174 п.н.
Генотип К Komp f 5'-TGTTCTTAACACAGCTTTGGA-3' Komp r 5-AGGTATAGATTGAGCGTATTGG-3' 150 п.н.
Генотип О Gomp f 5'-AGAGTAGTCGCAGCGAAC-3' Gomp г 5'-ACTGTAACGGCGTATGTG-3' 146 п.н.
Генотип А Aomp f 5'-AATACAGTATTCTGGCTTAGAT-3' Aomp г 5'-TGACTGAATGCAGGGTTGGGA-3' 57 п.н.
Генотип В Bomp f 5'-AGTTCGAGAGTATCTTTGATGTT-3' Bomp г 5'-TCTGCGCTAGTTATCATTATCG-3' 75 п.н.
Для ПДРФ-анализа наработанных в результате амплификации фрагментов использовали рестриктазы TaqI, Alul и PvuII. Расщепление ДНК проводили в буферах для рестрикции согласно инструкции для каждого фермента («Fermentas»). Данные ПДРФ-анализа в последующем сравнивали с результатами компьютерного анализа НП гена отрА штаммов Ch. trachomatis разных генотипов, представленных в NCBI
21
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/). Молекулярно-генетическое типиро-вание штаммов Ch. trachomatis с помощью ПЦР осуществляли с применением специфических сконструированных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, ориентированных к вариабельным участкам VS1-VS4 гена отрА Ch. trachomatis (табл. 5). Первоначально проводили амплификацию с использованием специфических праймеров к группам генотипов, далее с использованием специфических праймеров к определенному генотипу группы.
Анализ наличия генов антибиотикорезистентности штаммов Ch. trachomatis и Chi. pneu-moniae проводили с помощью ПЦР с использованием подобранных оригинальных праймеров с целью выявления генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (erm): Tet-f: S'-AGYTTCCACCGAAYTCCTTTC-T и Tet-r. 5'-ATACACCGAGCAGGGATTTC-3' (размер продукта амплификации 470 п. н.); Erm-f: 5-AAGCCAYTGCGTCTGAC АТС-3' и Erm-r: 5'-TGGCGTGTTTCATTGCTTGA-3, (размер продукта амплификации 300 п. н.).
Программное обеспечение молекулярно-генетических исследований.
Конструирование олигонуклеотидных праймеров проводили с применением биоинформационного анализа с использованием комплекса компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), и данные электронной базы NCBI Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).
Цитологические методы исследований.
Полученный материал из Цк, Вл, Ур, ЗСГ в виде мазков-соскобов наносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали на воздухе и фиксировали не менее 15 минут в 96° этиловом спирте. Окраску мазков проводили по Романовскому-Гимзе и по Граму (раствором Люголя) (Савичева A.M. и др., 2004). Учет результатов осуществляли на световом микроскопе «Микмед 5» при увеличениях х 100,х400,х 1000. Проводили также окрашивание меченными моноклональными Ат (тест-система «CeLLabs», Австралия) для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в реакции ПИФ (для Ch. trachomatis) и НИФ (для Chi. pneumoniae). Учет результатов осуществляли на люминесцентном микроскопе «Micros» (Австрия) при увеличениихбОО. Хламидии в препаратах выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Мазки-соскобы также исследовали ПЦР-методом.
Серологические методы исследований.
Выявление Ат к Ch. trachomatis осуществляли в сыворотке крови человека и обезьян с помощью ИФА (Савичева A.M. и др., 2002; Бакулев А.Л. и др., 2008). Выявление IgA-AT и IgG-Ат к Ch. trachomatis проводилось на тест-системах «CA. tra-cfomató-IgA-pELISA», и «Ch. trachomatis-lgG-pEUSА» («Medac», Германия). Положительный результат - содержание IgA-AT >1:50, IgG-Ат >1:50. Выявление Ат к белку теплового шока (БТШ) проводилось с использованием ИФА для определения IgG-Ат к хламидийным БТШ 60 «cHSP60-IgG-ELISA» («Medac», Германия). Положительный результат - при содержании IgG-Ат >1:50.
Культуральный метод (диагностика хламидиоза).
Соскобным материалом из УГТ инокулировали суточную культуру клеток McCoy, выращенную на покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшет (Савичева A.M. и др., 2002; Савичева A.M. и др., 2004). Центрифугирование после инокуляции проводили при 1000 об/мин в течение 1 часа. Контроль развития хламидийной инфекции осуществляли путем микроскопирования клеток в инверти-
рованном микроскопе «JIOMO» (Россия). Покровные стекла окрашивали по Романовскому-Гимзе, раствором Люголя или меченными моноклональными Ат для вьивления антигенов хламидий в реакции ПИФ и НИФ («CeLLabs», Австралия). Титрование хламидий осуществляли стандартным методом по цитопатическому действию (Павлович С.А., 2008). Детекцию возбудителя в инфицированных клетках культуры проводили также с помощью ПЦР.
Иммунологические методы исследования.
У детей образцы смешанной не стимулированной слюны собирали в стерильные пластиковые пробирки. У здоровых детей все пробы собирали утром, строго натощак, не ранее, чем через 2 недели после окончания любого инфекционного процесса и не ранее, чем через 1 месяц после ревакцинации. У больных детей исследуемые образцы собирали при таких же условиях, но в самом начале заболевания.
Забор цервикального секрета (ЦС) проводили с помощью стерильного урологического зонда. Зонд немедленно погружали в пробирку типа «Эппендорф», содержащую 0,5 мл физиологического раствора. К каждому образцу после взвешивания добавляли равное весовое количество физиологического раствора, после чего смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут на шейкере. Образцы хранили при минус 50 °С не более трёх месяцев. Определение общего белка проводили согласно инструкции к «Набору по определению общего белка в моче ФС» ("Диакон Диагностика", г. Москва).
Смыв со стенок влагалища (Вл): 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина вливали во В л, оставляли на 10 минут, затем проводили аспирацию всей жидкости из Вл. Полученный секрет тщательно перемешивали и затем помещали в пробирки типа «Эппендорф». Образцы хранили при минус 50 °С.
Определение иммуноглобулинов в слюне, ЦС и смыве из Вл женщин. Иммунологическое исследование включало определение концентрации IgG, IgM, IgA, slgA и sc методом РИД (Зверев B.B. и др., 2011). Дополнительно у всех обследованных детей ■ проводили количественное определение содержания общего IgE в слюне с использованием набора реагентов «IgE общий-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). При выведении референсных значений содержания IgE у клинически здоровых детей из исследования исключались пациенты, у которых было выявлено повышенное содержание IgE в сыворотке.
Определение неспецифической протеолитической и специфической IgAI-протеазной активности микроорганизмов, выделенных от больных пародонтозом. Наличие общих и специфических протеаз определяли в образцах культуральной жидкости, очищенных от бактерий и твердых примесей центрифугированием с последующей фильтрацией. Протеолитическую активность образцов определяли с помощью двух иммуноферментных тест-систем: по способности расщеплять IgG человека и по способности расщеплять IgAl человека (Козлов Л.В. и др., 2008).
Определение цитокинов в слюне и ЦС женщин.
Содержание IL-lß, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-y, TNF-a, ГМ-КСФ оценивали методом проточной флюориметрии на двух лучевом лазерном автоматизированном анализаторе («Bio-plex Protein Assay System», «Bio-Rad», США) с использованием коммерческих тест-систем «10-Р1ех» (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл).
Количественное определение содержания альбумина и общего белка в слюне.
Содержание альбумина определяли с помощью набора реагентов «Альбумин». Количественное определение содержания общего белка в слюне проводили с использованием набора «Общий белок» («Diasys»,«Диакон»), Измерение проводили на фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нм.
Определение лизоцима в слюне.
Определяли фотометрическим методом с использованием Micrococcus lysodeik-ticus (Дорофейчук В.Г., 1968).
Исследование гормонального статуса.
Определение тестостерона, дегидроэпиан-дростерона, тиреотропного гормона, свободного тироксина проводили методом ИФА с использованием тест-систем
«DRG» (США).
Статистическая обработка полученных данных.
Математическую обработку полученных данных проводили с применением методов параметрической и непараметрической базовой статистики (Гланц С., 1998), с использованием критерия Стьюдента, метода %2, коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs >0,7 связь считали сильной; при 0,5<rs<0,7 связь являлась средней; при rs <0,5 связь считали слабой; при rs=0 - линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007. Результат считали достоверным при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Респираторная патология у детей. У здоровых детей облигатная микрофлора ротоглотки в основном была представлена а- и у-гемолитическими стрептококками (105-106 КОЕ/г) и непатогенными нейссериями (102-104 КОЕ/г), которые высевались у 100% обследованных; добавочную группу составляли стафилококки, коринебактерии и гемофилы, выделявшиеся в 26,9-46,2% случаев (Ю'-Ю4 КОЕ/мл); транзиторные микроорганизмы были представлены - Bacillus, грибами рода Candida, Micrococcus, синегнойной палочкой, энтеробактериями, выявлявшимися в 1,9-25,0% случаев (не выше Ю'-Ю2 КОЕ/г). При гнойном или катаральном воспалительном процессе в ротоглотке обнаружено угнетение облигатной ассоциации а-гемолитических стрептококков и нейссерий, образующих защитную биопленку. Дисбактериоз биотопа развивался в 75-100% случаев. При ангине и пневмонии выделялись монокультуры или ассоциации микроорганизмов, состоящие только из добавочных и/или транзиторных представителей, обнаруживались отрицательные посевы. Устойчивым компонентом облигатной ассоциации был стрептококк, отсутствие нейссерий либо снижение их количества наблюдалось значительно чаще. Установлено, что отсутствие а-гемолитических стрептококков и/или нейссерий, обнаружение нескольких видов или монокультур энтеробактерий, псевдомонад, неспорообразующих анаэробов, а также грибов рода Candida является признаком глубокого дисбиоза. Глубина дисбиотиче-ских нарушений в ротоглотке у детей, не имеющих признаков острой инфекции на момент обследования, коррелирует с частотой эпизодов ОРВИ в году, сроками и тяжестью последнего заболевания, а также с наличием хронической патологии^ЛОР-органов. Инициация инфекционного процесса респираторными вирусами способствовала преимущественной пролиферации грамотрицательных бактерий (особенно клеб-сиелл) - более 10" КОЕ/мл, а также их ассоциаций. Синегнойная палочка выделялась
24
только у часто болеющих детей (ЧБД) либо больных пневмонией. Лечение в стационаре способствовало нарастанию частоты обнаружения грамотрицательных микробов в 2-3 раза вне зависимости от этиологии инфекционного процесса.
Таблица 6. Факторы колонизационной резистентности слизистых верхних дыхательных путей при бронхите у детей.___
Факторы Острый бронхит, Хронический бронхит, Клинически здоровые,
51 пациент 15 пациентов 30 пациентов
Индигенная микрофлора, lg КОЕ/г (М+ш) и абс. число / % встречаемости
Streptococcus spp. 7,65±3,88 7,67±3,99 7,52±3,06
а-гемолитический 51/100% 15/100% 30/100%
Neisseria spp. 7,5б±3,24 7,13±3,35 7,52±4,01
51/100% 15/100% 30/100%
Условно-патогенные мик роорганизмы (УПМ), Ig КОЕ/г (М±т) и абс. число / % встречаемости
Е. coli 4,0±0 0 3,0±0
3/5,9% 0 2/7,4%
S.aureus 4,67±2,34 4,0±2,32 2,88±1,79
21/41,2% 1/6,7% 5/16,7%
Грибы рода Candida 4,53±2,26 4,5±1,18 3,4±1,21
27/53,0% 3/20,0% 7/22,2%
К. pneumoniae 4,67±2,17 5,0±0 2,5±0,1
7/13,7% 1/6,7% 1/3,7%
Enterobacter spp. 3,6±1,12 0 0
3/5,9% 0 0
Коагулазоотрицательные 4,5±1,5 3,0±0Д 0
стафилококки 2/3,9% 1/3,9% 0
Р. aeruginosa 2,67±U3 2,5±0,4 0
2/3,9% 1/3,9% 0
УПМ, Lg КОЕ/г 6,11±2,56 3,76 ±1,32 2,82 ±2,16
32/62,7% 9/60% 14/46,7%
Рецепторы врожденного иммунитета (М±т/медиана)
TLR-2 109,73±88,9/52,78 25,44±19,68/25,17 18,95±7,5/15,13
TLR-4 147,8±156,83/66,11 44,08±66,84/11,43 31,7± 12,12/21,20
TLR-3 98,1±75,05/47,98 30,85±26,49/20,00 17,19±17,48/6,16
TLR-8 135,06±110,97/47,65 21,65±17,51/6,47 13,39±15,72/7,23
Цитокины, отреагировавшие повышением уровней
IL-lß, пкг/мг белка 154,76±123,15 24,77±18,88 3,29±3,06
IL-8, пкг/мг белка 236,97±198,98 214,21±130,71 25,20*24,93
INF-y, пкг/мг белка 42,85±29,67 15,11±10,47 10,47±8,90
TNF-a, пкг/мг белка 42,85±29,67 15,11±10,47 10,47±8,90
GM-CSF, пкг/мг белка 5,34±3,85 3,08±2,25 0,98±0,83
Иммуноглобулины
мкг /мг общего белка 8,6±3,0 5,17±2,77 3,4±1,3
мкг/мг общего белка 0,92±0,73 3,19±4,38 0
1&А, мкг /мг общего белка 0,58±1,0 0 0
б^А, мкг /мг общего белка 29,05± 12,25 13,52±10,73 6,01 ±1,62
ГйЕ, МЕ/мл 0,78±0,15 0,86±0,17 0,47±0,06
5с, мкг/мг общего белка 35,22± 11,44 35,15±13,24 17,5±3,88
Дополнительные факторы
ИЕКНЭ, балл 98,7±39,5 104,2 ±43,4 32,0±9,5
Активность лизоцима, % 24,8± 11,8 34,6±2,8 50,0±9,0
Альбумин, г/л 7,1±1,6 4,2±2,0 6,0±2,0
Общий белок, г/л 11,2±3,0 6,9±3,0 9,8±3,3
Примечания: ИЕКНЕ - индекс естественной колонизации назофарингеального эпителия.
Пролиферация грибов рода Candida, особенно в количествах более 102 КОЕ/мл, была характерна для больных инфекционным мононуклеозом, пневмонией, часто бо-
25
леющих детей (ЧБД), особенно младших возрастных групп, активировалась на фоне антибактериальной терапии и расценивалась как неблагоприятный фактор (отсутствовала у здоровых детей из группы эпизодически болеющих). Стафилококки, в том числе S. aureus, на слизистой ротоглотки с равной частотой встречались у здоровых и больных детей (за исключением пациентов с пневмонией, у которых они обнаруживались достоверно реже). Достоверно чаще S. aureus высевался при гнойно-воспалительном процессе в ротоглотке у детей с массивными наложениями на миндалинах или сопутствующими гнойными очагами инфекции. Назначение антибактериальной терапии не снижало частоту выделения и среднюю обсемененность S. aureus после лечения и его обнаружение на слизистой ротоглотки не должно рассматриваться как однозначное показание к лечению при отсутствии клинических признаков болезни либо при инфекционном процессе, если одновременно присутствуют облигат-ные бактерии. Значение следует придавать обнаружению монокультуры стафилококка, особенно S. aureus, при наличии гнойно-воспалительного процесса в ротоглотке.
У детей с ОРВИ, получавших Кипферон®, после лечения в 3 раза снизилась частота высева S. aureus. Не отмечено угнетения облигатных микроорганизмов. В 2 раза реже регистрировалась транзиторная микрофлора. В группе сравнения (не получавшей Кипферон®) в динамике лечения возросло число несвойственных для данного биотопа микроорганизмов, в том числе выявлялись ранее отсутствовавшие гемолизи-рующая Е. coli и грибы рода Candida. У больных тонзиллитом после лечения в 6 раз уменьшилась частота высева S. aureus (от 20% до 3,3%, р<0,05), реже (6,6% против 24,2%, р<0,05), чем в контроле, обнаруживались грамотрицательные энтеробакгерии. У больных инфекционным мононуклеозом лечение Кипфероном® способствовало достоверному снижению числа детей с высоким уровнем (3-6) микробных ассоциан-тов на слизистой ротоглотки, элиминации S. aureus (от 53,3% до 23,1%), грибов рода Candida, р-гемолитического стрептококка группы А (от 20% до 0%).
Таким образом, при респираторных заболеваниях у детей родовой и видовой состав микроорганизмов, выделенных от больных, может служить дополнительным объективным критерием тяжести течения инфекционного процесса, а также позволяет дифференцированно судить об эффективности проводимой антибактериальной терапии и вносить необходимые коррекции.
При бронхитах у детей при анализе ассоциаций патогенных вирусных агентов выявлено, что частота инфицирования аденовирусами была достоверно выше при остром бронхите по сравнению с хроническим бронхитом и клинически здоровыми пациентами. Различия в обсемененности слизистой ЗСГ индигенными микроорганизмами в контрольной группе и больных бронхитами детей не достоверны как по количественному содержанию, так и по частоте встречаемости, однако, у больных детей они превышали показатели нормоценоза (табл. 6). Это свидетельствует о компенсированной форме дисбиотических нарушений в верхних дыхательных путях. Выявлены достоверные различия по частоте инфицирования S.aureus и грибами рода Candida при остром бронхите по сравнению с хроническим бронхитом и клинически здоровыми пациентами. Интенсивность колонизации задней стенки глотки УПМ достоверно выше при остром бронхите, а при хроническом бронхите изменения не достоверны по сравнению с клинически здоровыми пациентами. Выявление в слюне повышенных уровней общего IgE при остром и хроническом бронхитах указывает на активизацию и количественное повышение инфекционного компонента. У клинически здоровых детей нормоценоз регистрировался у 48,1% пациентов, промежуточный тип - у 44,4%, дисбиоз - у 7,4% пациентов, что достоверно отличалось от показателей при остром
26
бронхите: нормоценоз - у 21,6% пациентов при р<0,05, промежуточный тип - у 11,8% пациентов при р<0,01, дисбиоз - у 35,3% пациентов при р<0,05, выраженный воспалительный процесс - у 31,4%, пациентов при р<0,01; при хроническом бронхите нормоценоз - у 20,0% пациентов при р<0,05, промежуточный тип - у 20,0% пациентов при р<0,01, дисбиоз - у 33,3% пациентов при р<0,05, выраженный воспалительный процесс - у 26,7% пациентов при р<0,01; достоверных различий между острым и хроническим бронхитом не выявлено. Следовательно, при остром бронхите нарушения микробиоценоза слизистых сдвигаются в сторону дисбиоза и выраженного воспалительного процесса. Однако высокие уровни нормофлоры в сочетании с высокими уровнями Ig обеспечивают выраженную КР, что подтверждается и высокими показателями ИЕКНЭ. Всё вместе указывает на развитие компенсируемых вторичных им-мунодефицитов. Высокие уровни показателей IgG, IgM, slgA, sc, IgE и ИЕКНЭ свидетельствуют об остроте инфекционного процесса (при остром бронхите), а при хроническом бронхите не резко выраженное повышение перечисленных показателей свидетельствует о вяло текущем процессе. У клинически здоровых детей установлена зависимость между естественной адгезией «оральными» стрептококками и искусственной адгезией S. salivarius, S. aureus и К. pneumoniae к БЭ и к НЭ: при нормальной обсеме-ненности «оральными» стрептококками БЭ, обсемененность НЭ была также небольшой. У детей с бронхолегочными заболеваниями, чем меньше бактерий было адгези-ровано на БЭ, тем их больше было адгезировано на НЭ, то есть у больных детей существует обратная зависимость между показателями естественной и искусственной адгезии, что указывает на нарушение реакции рецепторов клеток эпителия на микроорганизмы и, как следствие, на способность микробов преодолевать колонизационный барьер. Известно, что грамположительные и грамотрицательные бактерии имеют разные адгезины, взаимодействующие с разными рецепторами эпителиальных клеток. Как правило, «оральные» стрептококки проявляют антагонистические свойства по отношению к К. pneumoniae или занимают экологическую нишу, препятствуя адгезии несвойственных биотопу ротоглотки микроорганизмов, или же меняют фенотипиче-ский профиль клеток (в том числе и их адгезивные свойства), которые они колонизируют (Бочков И.А., Семина Н.А., 1981). Высеваемость УПМ в титре 6 lg КОЕ/г и выше может свидетельствовать о приобретении ею фенотипических маркёров вирулентности. При остром и хроническом бронхитах взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются имму-ноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа определяет КР слизистых, характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация). TLR-2 и TLR-4 реагируют на бактериальные патогены, a TLR-3 и TLR-8 - на вирусные. Установлена достоверная взаимосвязь TLR с другими факторами врождённого иммунитета лизоцимом, ИЕКНЕ, slgA и sc. Уровни IgE независимы от TLR. Пятикратное повышение уровней экспрессии генов TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 и цито-кинов IL-ip, IL-8, INF-y, TNF-a свидетельствует о хорошей местной антиинфекционной резистентности, а отсутствие повышения указывает на её нарушение и хроническое течение заболевания (носит диагностический и прогностический характер). Гуморальные факторы КР синтезируются местно.
Пародонтоз. Проведено изучение микробного спектра десневой жидкости: из 24 микроорганизмов специфической IgAI-протеиназной активностью обладали 6 продуцентов, один не обладал протеолитической активностью, а остальные выделяли в
культуральную среду неспецифические протеиназы. У одного пациента после проведенного лечения и при отсутствии воспаления, ранее обнаруженные микроорганизмы, продуцирующие IgAI-протеазу, не были найдены. Способность продуцировать IgAl-протеазу обусловливает патогенность микроорганизмов.
Уреаплазмоз. У пациенток с выявленной уреаплазменной инфекцией подтверждён сочетанный характер инфицирования (микст-инфекция, моноинфекция имела место в 12,2% случаев) с выявлением 2-7-компонентных ассоциаций патогенных агентов. При уреаплазменной микст-инфекции нормоценоз не выявлен ни у одной пациентки, у 10% определялся промежуточный тип микробиоценоза Вл, у 44% -дисбиоз и у 46% - бактериальный вагинит. Содержание лактобацилл у больных достоверно ниже по сравнению с промежуточным типом при дисбиозе при р<0,05, вагините при р<0,01, а по сравнению с дисбиозом при вагините при р<0,05. Содержание УПМ достоверно выше по сравнению с промежуточным типом при дисбиозе (р<0,05) и бактериальном вагините (р<0,01), а по сравнению с дисбиозом при бактериальном вагините (р<0,05). Содержание факультативных анаэробов достоверно выше в просветной области (р<0,05), а облигатных анаэробов достоверно выше в пристеночной области (р<0,05).
В контрольной группе клинически здоровых женщин во Вл нормоценоз определялся у 70%, промежуточный тип и дисбиоз - у 20% и 10% обследованных, соответственно; содержание лактобацилл при промежуточном типе микробиоценоза при р<0,05 и дисбиозе при р<0,01 было достоверно ниже по сравнению с нормоценозом, а по сравнению с промежуточным типом при дисбиозе при р<0,05. Содержание УПМ достоверно выше по сравнению с нормоценозом при промежуточном типе (р<0,05) и дисбиозе (р<0,01), а по сравнению с промежуточным типом при дисбиозе (р<0,05). Содержание факультативных анаэробов достоверно выше в просветной области (р<0,05), а облигатных анаэробов достоверно выше в пристеночной области Вл (р<0,05).
При проведении сравнительного анализа у клинически здоровых женщин по сравнению с больными достоверно чаще выявлялся нормоценоз (х2=47,59; р<0,001), реже дисбиоз (х2=10,91; р<0,001) и вагинит (%2=22,36; р<0,001), промежуточный тип встречался одинаково часто. Дисбиотические нарушения биотопа Вл у больных с уреаплазмозом сопровождались доминированием факультативно-анаэробной флоры в просветной области или облигатно-анаэробной флоры в пристеночной области при общем снижении уровня лактобацилл по сравнению с нормоценозом. При сопоставлении больных уреаплазмозм с контрольной группой не выявлено существенных различий микробиологических характеристик просветной и пристеночной областей Вл при промежуточном типе микробиоценоза. УПМ была представлена стрептококками и пептострептококками, выделявшимися в небольших количествах, преимущественно, в монокультурах (свидетельствовало о их патогенетическом потенциале). При дисбиозе у больных определялся более широкий спектр и увеличивалось число ассоциантов УПМ (выявлялись 2-4-компонентные ассоциации факультативно- и облигатно-анаэробных микроорганизмов) по сравнению с контрольной группой. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из просветной и пристеночной области Вл штаммов факультативных анаэробов или облигатных анаэробов в титре 7 lg КОЕ/г. При бактериальном вагините у больных выявлялись 3-х и более компонентные ассоциации УПМ: энтеробактерии и энтерококки, стрептококки, стафилококки и грибы рода Candida, облигатно-анаэробные бактерии (преобладали факультативные
28
анаэробов в просветной области и облигатные анаэробы - в пристеночной области Вл). У клинически здоровых женщин и больных уреаплазмозом при нормоценозе и промежуточном типе дисбактериоза Вл не наблюдалось достоверной корреляционной зависимости между количеством УПМ просветной и пристеночной областей и показателями гуморального иммунитета. У больных с дисбиозом и бактериальным вагинитом наблюдалась корреляция содержания УПМ просветной и пристеночной локализации и уровней IgM, IgA и IgG, а также slgA и sc в секрете Вл (г >0,5). Наиболее эффективной оказалась терапия при включении в лечебную схему препарата «Кипферон» (24% элиминации возбудителей при стандартной схеме и 56% элиминации при включении препарата «Кипферон»), что подтвердило потенцирующее действие иммунобиологического препарата на антибактериальные препараты при совместном применении. После первого курса лечения нормоценоз был выявлен у 10 человек (2 - из I группы и 8 - из II группы; при р<0,05 и х2=4,41), промежуточный тип - у 10 человек (4 - из I группы и 6 - из II группы), дисбиоз - у 23 больных (15 - из I группы и 8 - из II группы; при р<0,05 и -/2=3,87), бактериальный вагинит - у 7 больных (4 - из I группы и 3 - из II группы). При 100% встречаемости в обеих группах, у больных II группы наблюдалось более высокое по сравнению с I группой (р<0,05) содержание лактобацилл как в просветной, так и в пристеночной областях Вл. Бифидобактерии, не выявлявшиеся у больных до лечения, верифицировались после лечения у 20% больных II группы и у 4% больных I группы. Следовательно, при отсутствии 100% излечиваемости после первого курса терапии, оценка дисбиоти-ческих нарушений во Вл позволила выявить положительную динамику у пациенток при излечении или стихании клинических проявлений: регистрация нормоценоза, повышение частоты регистрации промежуточного типа, и резкое снижение частоты выявления вагинита. Применение в составе комплексной терапии уреаплазмоза "Кипферон, суппозитории" обеспечивало более быстрое восстановление КР биотопа Вл, сопровождающееся восстановлением нормального соотношения автохтонных и аллохтонных микроорганизмов, выраженным снижением интенсивности воспалительного процесса (низкие уровни IgM, IgG по сравнению с контролем) и повышением уровней IgA и slgA в секрете Вл.
Обоснована необходимость и целесообразность одновременной оценки чувствительности патогенных и УПМ к антибактериальным и фунгицидным препаратам как дополнительного объективного критерия их патогенности, выраженности клинических проявлений и эффективности этиотропной медикаментозной терапии. Выявлена высокая чувствительность штаммов уреаплазм к доксициклину, миноциклину, тетрациклину, пристиномицину; к джозамицину, эритромицину и офлоксацину штаммы были умеренно устойчивы; к клиндамицину - в основном устойчивы. Изолированные от клинически здоровых женщин УПМ, устойчивые к 1-3 препаратам, выявлялись в 56,3% случаев, а от больных устойчивых к 1-2 антимикробным препаратам штаммов было в 2 раза меньше 21,7% (р<0,05). Напротив, полирезистентные культуры (устойчивые к 5 и более из 14 исследованных препаратов) выявлялись у больных с уреаплазмозом в 44,6% случаев, а у клинически здоровых женщин только в 12,3% случаев (р<0,05). Культуры УПМ от больных уреаплазмозом резистентны к доксициклину и фторхинолонам. .У штаммов грибов рода Candida от больных и в группе контроля не выявлено устойчивости к нистатину и амфотерицину. Из 24 штаммов грибов, изолированных от больных уреаплазмозом, 5 (20,8%) штаммов были устойчивы к клотримазолу, флюконазолу и кетоконазолу, 7 (29,2%) - к клотрима-золу и флюконазолу и 5 (20,8%) - к клотримазолу; 7 штаммов были чувствительны ко
29
всем 5-ти противогрибковым препаратам. При повторном исследовании после первого курса лечения 20 штаммов уреаплазм, 13 изолированных от больных I группы и 7 -от больных II группы, не выявлено культур чувствительных к джозамицину, клинда-мицину, эритромицину; к доксициклину, тетрациклину и офлоксацину выявлена устойчивость у 7,7% (1), 15,4% (2) и 38,5% (5) штаммов от больных I группы, и 14,3% - по 1 штамму от больных II группы, соответственно. Из 109 штаммов УПМ от больных после первого курса лечения достоверно увеличилось в 2 раза количество полирезистентных культур от больных I группы, по сравнению со II группой (особенно к применявшимся при лечении - клиндамицину, доксициклину, фторхинолонам и макролидам); также наиболее часто выделялись устойчивые к противогрибковым препаратам штаммы грибов рода Candida у больных I группы по сравнению со второй (р<0,05). Следовательно, применение иммуномодулятора способствовало более эффективной элиминации микроорганизмов антибактериальными препаратами, и замедляла селекцию антибиотикорезистентных культур в процессе лечения у больных II группы.
Хламидийная инфекция. При УГХ подтверждён сочетанный характер инфицирования. У 17,1% (7 пациенток) больных I группы выявлена хламидийная моноинфекция, а у 82,9% (34 пациенток) - в сочетании с другими возбудителями ИППП: уреаплазмами, микоплазмами, ВПЧ, ВПГ, ЦМВ, трихомонадами и токсоплазмами. Выявлено одновременное доминирование двух биоваров U. urealyti-сит Parvo и Т-960, что значительно усугубляло течение УГХ. У 31,7% установлено наличие ВПЧ низкой онкогенности (типы 6 и 11), и у 9,8% человек ВПЧ с ЦМВ или сразу несколько типов ВПЧ (16, 18 и 35) с высокой онкогенностью. Наличие УПМ установлено в I группе в Цк у 61,0% пациенток (12 родов микроорганизмов), Ур - у 48,8% (7 родов микроорганизмов), во Вл - у 51,2% пациенток (11 родов микроорганизмов). У большинства больных наблюдался сочетанный характер инфицирования возбудителями ИППП и УПМ (2-7-компонентные ассоциации патогенов). Во II группе в Цк выявили у 37,9% больных хламидийную моноинфекцию, у остальных - сочетанный характер инфицирования различными бактериальными агентами. УПМ в Цк выявлялись у 37,9% больных (6 родов микроорганизмов), в Ур - у 62,1% больных (5 родов микроорганизмов) и во Вл - у 48,3% (5 родов микроорганизмов). При микст-инфекциях регистрировались 2-5-компонентные ассоциации инфекционных агентов. В III группе у 30,0% женщин из УГТ выделялись УПМ в Цк (5 родов микроорганизмов), из Ур - у 23,3% обследованных (4 рода микроорганизмов), из Вл - у 36,6% женщин (4 рода микроорганизмов). Регистрировалось формирование 2-3 компонентных ассоциаций патогенов. В IV группе не выявлены ИППП. УПМ вьивлялись у двух пациенток в Цк (3 рода микроорганизмов), у трех пациенток - в Ур (3 рода микроорганизмов) и Вл (4 рода микроорганизмов).
УПМ во Вл при остром УГХ определялись в количестве 8,1±0,4 lg КОЕ/мл, при обострении хронического УГХ - 4,6±1,0 lg КОЕ/мл, у переболевших - 2,5±1,2 lg КОЕ/мл, у клинически здоровых пациентов - 2,74±0,94 lg КОЕ/мл. Уровни выявления УПМ при остром УГХ отличались (при р<0,05) от таковых других сравниваемых групп пациентов. По частоте выявляемое™ УПМ во Вл достоверные различия выявлены между I и II (р<0,01), I и III (р<0,001), I и IV (р<0,001), II и III (р<0,01), II и IV (р<0,001), III и IV группами (р<0,01), а между группами I и II различия не достоверны. Чем выраженнее патологический процесс, тем шире набор микроорганизмов и в более высоких титрах они высеваются. Косвенным свидетельством приоб-
зо
ретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из Вл штаммов облигатных анаэробов при остром УГХ в титре 7 ^ КОЕ/г, а при обострении хронического УГХ в титре 5 ^ КОЕ/г. В I группе у 43,9% пациенток выявлен бактериальный вагинит и у 56,1% - дисбиоз, во II группе у 27,5% пациенток - бактериальный вагинит и у 72,4% -дисбиоз, в III и IV группа у всех пациенток - нормоценоз. УПМ в Цк в группе I определялись в количестве 3,70±1,56 ^ КОЕ/мл, в группе II - 3,80±0,27 ^ КОЕ/мл, в группе III- 1,36±0,37 ^ КОЕ/мл, в группе IV - 1,94±0,73 ^ КОЕ/мл. По частоте выявляемое™ УПМ в Цк различия выявлены между I и III (р<0,01), I и IV (р<0,001), II и IV (р<0,001), III и IV (р<0,01) группами, а между I и II, II и III группами различия не достоверны. В I группе у 19,51% пациенток регистрировался бактериальный церви-цит и у 80,48% - дисбиоз, во II группе у 13,79% пациенток - бактериальный цервицит, у 51,7% - дисбиоз и у 34,48% - промежуточный тип, в III и IV группа у всех пациенток - нормоценоз. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из Цк штаммов облигатных анаэробов в титре 4 КОЕ/г. УПМ в Ур в группе I определялись в количестве 4,20±0,51 КОЕ/мл, в группе II - 2,3±0,5 ^ КОЕ/мл, в группе III - 2,50±0,83 ^ КОЕ/мл, в группе IV -1,32±0,37 КОЕ/мл. По частоте выявляемое™ УПМ в Ур достоверные различия выявлены между I и IV (р<0,001), II и III (р<0,01), II и IV группами (р<0,001), а между группами I и II, I и III, III и IV различия не достоверны. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из Ур штаммов факультативных анаэробов или облигатных анаэробов в титре 4 ^ КОЕ/г.
При УГХ показатели уровней обсеменённости УПМ Цк, Ур и Вл прямо коррелируют с показателями уровней экспрессии генов Т1Л-2 и Т1Л1-4. Повышение экспрессии генов ТП1-2 и Т1Л-4, как в Цк, так и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений, зависящей как от хламидий, так и от ассоциантов (возбудителей ИППП и УПМ). Во Вл имеет место экспрессия генов Т1Л1-2 и ТЬ1М в ответ на УПМ, а в Цк и Ур - на УПМ и возбудителей ИППП. Активация экспрессии генов ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 происходит более выраженно в ответ на УПМ и менее выраженно при контакте с нормофлорой. Впервые установлена определяющая роль Т1Л1-2 и ТЫ1-4 слизистых УГТ в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями и УПМ при УГХ. Уровни экспрессии генов ТЫ1-2 и Т1Л1-4 служат критериями оценки выраженности УГХ и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. Низкие уровни ТЫ1-2 и ТЫ1-4 указывают на возможность начала хронизации инфекционного процесса. Однотипные изменения показателей уровня экспрессии Т1Л1-2 и ТЬЯ-4 в Цк и Ур пациенток с хронической формой хламидиоза указывают на развитие "феномена рецепторной депрессии", сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакцией. Повышение уровня экспрессии мРНК ТЬЯ-2 и ТЬЯ-4 и активности локального синтеза цитокинов в ответ на хламидийную инфекцию способствует благоприятному исходу заболевания, а низкие уровни являются плохим прогностическим признаком. Следовательно, взаимодействие микробиоценозов слизистых УГТ женщин и макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма.
При УГХ, в особенности в составе сложного паразитоценоза, реактивность слизистых Цк страдает более выраженно, чем при других заболеваниях. Качественно-количественные изменения в уровнях цитокинов в равной степени определяют выраженность нарушений КР слизистых и их клинико-диагностическое значение при
различных вариантах течения заболевания. Снижение уровня одних цитокинов в слизи Цк и повышение содержания других может указывать на дисбаланс регуляторных процессов, ответственных за поддержание оптимального уровня антиинфекционной реактивности слизистых. При этом в ответе хозяина при УГХ слизистых оболочек урогенитального тракта TLR эпителиальных клеток играют ключевую роль: непосредственно сразу после инфицирования происходит выброс цитокинов, обусловленный регулированием экспрессии генов хозяина, ответственных за синтез цитокинов. Оценка уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 и количества цитокинов имеет диагностический и прогностический характер. Повышенная экспрессия генов TLR-2 и TLR-4 слизистых в сочетании с высокими уровнями цитокинов способствует реализации местной антиинфекционной резистентности и благоприятному исходу УГХ. TLR слизистых УГТ через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, slgA и sc и в совокупности с микрофлорой биотопа определяют КР слизистых.
При сопоставлении инфекционных процессов, вызванных хламидиями и уреаплазмами, выявлены более высокие показатели верификации кольпита, эрозии шейки матки и сальпингоофорита при обострении хронического хламидиоза и у переболевших хламидиозом по сравнению с острым уреаплазмозом, острым хламидиозом и клинически здоровыми пациентами. Выявлено достоверное угнетение выраженности воспалительной реакции слизистой УГТ женщин при остром и обострении хронического хламидиоза по сравнению с острым уреаплазмозом; хламидийная инфекция в сопоставлении с уреаплазменной инфекцией сопровождается наиболее выраженными нарушениями: снижением содержания лактобацилл на слизистых гениталий женщин, пониженной реакцией на УПМ. Следовательно, биологические особенности возбудителя инфекционного заболевания и УПМ слизистых определяют выраженность клинических проявлений, угнетение местной и общей устойчивости макроорганизма к гетерологичным бактериальным и вирусным инфекционным агентам.
Нарушение течения гестационного процесса на ранних сроках беременности. Наиболее частыми причинами невынашивания беременности являются урогени-тальные инфекции (УГИ) и условно-патогенная микрофлора (УПМ), определяющие нарушение КР микробиоценозов биотопов слизистых влагалища (Вл), цервикального канала (Цк), кишечника и полости рта, имеющих различия, обусловленные анатомическими и функциональными особенностями, но тесно связанных между собой в единую экосистему. Нормально протекающая беременность сопровождается снижением факультативной и увеличением индигенной микрофлоры, выявлением в небольшом количестве гарднерелл (в 13,4% случаев) и грибов рода Candida (в 10,7% случаев) в титре <103 lg КОЕ/г, характерными нарушениями микробиоценоза, КР и цитокинового баланса. Среди возбудителей УГИ у беременных с невынашиванием наиболее часто выявляли гарднереллы (в 40% случаев в 1-й группе и в 50% случаев во Н-й группе), уреаплазмы и грибы рода Candida (в 62,4% случаев и в 78,9% случаев в 1-й группе и 82,1% случаев и 89,3% случаев во И-й группе, соответственно) в клинически значимых титрах >104, их встречаемость достоверно выше (р<0,05) в группе II, что подтверждает их роль в генезе невынашивания. В группе I регистрировались ассоциации микроорганизмов у беременных в 63,8% случаев, в группе II - в 89,9% случаев. Во Вл у пациенток группы I в 55,9% случаев отмечено снижение частоты колонизации лактобациллами в пристеночной области (менее 6 lg КОЕ/г), а в просветной и пристеночной областях - достоверное (р<0,05) снижение частоты
встречаемости и степени колонизации бифидобактерий по сравнению с контрольной группой. Частота встречаемости бифидобактерий у пациенток группы I была достоверно, в 2 раза ниже, чем в группе контроля, при отсутствии у беременных группы II. Интенсивность колонизации бифидобактериями просветной и пристеночной областей Вл достигала в контрольной группе 5,0±0,5 lg КОЕ/г и 4,6±0,5 lg КОЕ/г, соответственно, а у беременных группы I - только 3,7±1,1 lg КОЕ/г и 3,5±1,1 lg КОЕ/г, соответственно (р<0,05). У здоровых небеременных женщин в 70-90% случаев выявляются лактобациллы и только в 12% - бифидобактерии; во время беременности бифидобактерии выявлялись значительно чаще: у 20 до 62% в количестве 10-10 lg КОЕ/г. В группе I в 72% случаев отмечено формирование 3-5-компонентных ассоциаций факультативных микроорганизмов, а в группе контроля - 3-компонентные ассоциации в 15% случаев. Интенсивность колонизации УПМ в просветной области составляла 4,5±1,0 lg КОЕ/г и во П-й группе - 5,2±0,5 lg КОЕ/г, а в пристеночной области - у беременных 1-й группы 6,7±0,9 lg КОЕ/г и во П-й группе - 5,5±0,5 lg КОЕ/г; у женщин контрольной группы - в просветной и пристеночной областях 3,3±0,5 lg КОЕ/г и 4,0±0,5 lg КОЕ/г, соответственно. У беременных группы I наиболее часто высевались грибы рода Candida, пептострептококки и энтерококки в 20,0-21,3% случаев из просветной области и в 20-24% случаев - из пристеночной области при интенсивности колонизации более 4,0 lg КОЕ/г. У пациенток группы II УПМ биотопа были представлены пептострептококами, коагулазонегативными стафилококками, S. aureus, Е. coli и грибами рода Candida, частота обнаружения которых (за исключением грибов) была выше (р<0,05), чем в группе контроля или в группе I, интенсивность колонизации более 5,0 lg КОЕ/г. В группе контроля спектр УПМ был меньше, но частота выявления грибов рода Candida, пептострептококков и энтерококков находилась на высоком уровне (15%-20%) как в просветной (3,5±0,4 -4,7±1,0 lg КОЕ/г), так и в пристеночной (4,7±1,0 - 5,0±0,5 lg КОЕ/г) областях. Часто высевались Е. coli (10% в просветной и в пристеночной области) и эпидермальный стафилококк (15% - в просветной и 10% т в пристеночной области) в концентрации 3,4±0,4 - 4,4±0,2 и 2,0±1,0 lg КОЕ/г, соответственно. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из Вл штаммов в титре 7,0 lg КОЕ/г. В группе контроля наблюдалось снижение всех классов lg по сравнению с клинически здоровыми небеременными женщинами (р<0,05); в секрете Вл выявлены более высокие уровни IgG, чем IgA, a slgA и sc не определялись. В секрете Вл у беременных основной группы имело место увеличение (р<0,05) всех классов lg (особенно IgA, slgA, sc) по сравнению с группой контроля. У беременных группы I нормальный биоценоз Вл наблюдался у 18,7%, промежуточный тип - у 16,0%, дисбиоз - у 32,0%, вагинит - у 33,3%; в группе II нормоценоз - у 0%, промежуточный тип - у 0%, дисбиоз - у 50%, вагинит - у 50%; в группе контроля - у 50%, 30%, 15% и 5%, соответственно.
Частота встречаемости а-гемолитического стрептококка в ротоглотке у беременных группы I в слюне - 93,3% (6,0±0,6 lg КОЕ/г), во П-й группе - в 100% случаев (8,4±0,2 lg КОЕ/г) и в контрольной группе - в 95,0% случаев (6,0±0,5 lg КОЕ/г); в пристеночной области - в 93,3% (6,7±0,5 lg КОЕ/г), 100% (7,9±0,4 lg КОЕ/г), 95,0% (7,0±0,2 lg КОЕ/г), соответственно. В основной группе выявлен более широкий спектр УПМ в просветной и пристеночной областях по сравнению с группой контроля. Одновременно у 45,3% обследованных наблюдалось формирование 3-5-компонентных ассоциаций УПМ, среди которых наиболее часто высевались грибы рода Candida, пептострептококки и золотистый стафилококк. В пристеночной области выявлялись
33
(3-гемолитический стрептококк, Е. coli, в пристеночной области и слюне - пептостреп-тококки (р<0,05); высевались эпидермальный стафилококк, пропионибактерии, акти-номицеты и клебсиеллы. В группе II, в отличие от пациенток группы I, чаще (р<0,05) встречались в клинически значимой концентрации St. aureus, р-гемолитический стрептококк, Е. coli и грибы рода Candida. Общий популяционный уровень УПМ в пристеночной области у беременных основной группы был ниже (р<0,05), чем в биотопе Вл. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из ротоглотки штаммов УПМ в титре 6,0 lg КОЕ/г. В контроле наблюдалось снижение всех классов Ig (включая доминирующие slgA и sc) слюны по сравнению со здоровыми небеременными женщинами (р<0,05), что обусловливало у 19,8% женщин развитие хронического тонзиллита. В группе I нормальный биоценоз полости рта наблюдался у 12,0%, промежуточный тип нарушений - у 32,0%, дисбиоз -у 33,3%, выраженный воспалительный процесс - у 22,7%; в группе II нормоценоз - у 0%, промежуточный тип - у 16,7%, дисбиоз - у 50,0%, выраженный воспалительный процесс - у 33,3%; в контрольной группе - у 40,0%, 25,0%, 20,0% и 15,0%, соответственно.
Микрофлора кишечника беременных основной группы характеризовалась снижением количества индигенной флоры. Е. coli с нормальными ферментативными свойствами выявлена у 76% (у каждой третьей пациентки 6 lg КОЕ/г), а в группе контроля - у 90% (у 85% женщин - более 8 lg КОЕ/г) беременных (р<0,05). Снижено по сравнению с группой контроля (р<0,05) содержание бифидобактерий и лактобацилл: в 1-й группе обнаруживаются в 76,0% и 74,7%, во II-й группе - в 73,1% и 69,2% и в группе контроля - в 90% и 90%, соответственно. У 77,3% беременных основной группы микробиоценоз кишечника был представлен 4-6-компонентными ассоциациями УПМ, а в группе контроля - в 30%. Частота встречаемости УПМ в основной группе выше (р<0,05), чем в контрольной группе, и составляла 13,7% (5,7±0,5 lg КОЕ/г), а в контроле - 8,2% (4,3±0,3 lg КОЕ/г). Выявлено расширение спектра микрофлоры в основной группе, по сравнению с группой контроля: увеличение частоты встречаемости и степени колонизации гемолизирующей Е. coli, энтерококками, клостридиями (р<0,05); кроме того, выявляли и редкие микроорганизмы такие, как актиномицеты и клебсиеллы, отсутствующие в кишечнике здоровых беременных. Косвенным свидетельством приобретения патогенных свойств УПМ может быть выделение из кишечника штаммов в титре 6,0 lg КОЕ/г. В группе контроля имелось снижение (р<0,05) всех классов Ig в копрофильтратах по сравнению со здоровыми небеременными женщинами. В копрофильтратах slgA (1,78±0,42мкг/мл) и sc (4,2±0,94 мкг/мл) были доминирующими. В основной группе достоверное снижение sc в копрофильтратах, по сравнению с группой контроля обусловливает в 20,6% случаев развитие синдрома раздраженной толстой кишки с преобладанием запоров. В группе I нормоценоз наблюдался в 16,0%, I степень нарушений - в 30,7%, II степень нарушений - в 28,0%, III степень нарушений - в 25,3% случаев; в группе II беременных нормоценоз - в 4,3%, I степень нарушений - в 16,7%, II степень нарушений - в 44,9%, III степень нарушений - в 34,1% случаев; в группе контроля - у 45,0%, 20,0%, 30,0% и 5,0%, соответственно.
Для определения особенностей состояния микробиоценоза различных биотопов у беременных в зависимости от генеза невынашивания в I триместре были сформированы 3 группы: 1-я группа 33 беременные с инфекционным генезом; 2-я группа - 27 беременных с гормональным генезом и 36 пациенток со смешанным генезом невынашивания беременности образовали 3-ю группу. Ведущими микроорганизмами Вл во всех группах являлись энтерококки, факультативно- и облигатно-анаэробные
стрептококки, Е. coli и грибы рода Candida. У беременных 3-й группы выявлены более выраженные дисбиотические нарушения Вл. В полости рта выявлена одинаковая частота встречаемости индигенной микрофлоры (а-гемолитические стрептококки и нейссерии) и УПМ (пептострептококки и золотистый стафилококк) у беременных всех групп. У беременных 1 группы выявляли и грибы рода Candida, а в группе 2 -энтеробактерии. В кишечнике в группах 1 и 3 выявлено значительное содержание УПМ: клостридий, энтерококков и облигатно-анаэробных стрептококков, гемолизи-рующей Е. coli, а также бактероидов и грибов рода Candida. В группе 2 - более низкая частота встречаемости нормофлоры и перечисленных выше УПМ; преобладали штаммы Е. coli с измененными ферментативными свойствами. Не выявлено отличий в показателях уровней Ig различных биотопов.
Изучение микробиоценозов Вл, кишечника и полости рта, включающее исследование гуморальных факторов KP, позволяет определить прогноз течения беременности и характер воспалительного процесса в биотопах. Выявлена зависимость показателей микробной флоры от генеза невынашивания. Выявлены равноценные микроэкологические изменения показателей дисбиоза биотопов Вл, полости рта и кишечника (у 32% обследованных 1-й группы, у 50% Н-й группы и у 30% - контрольной группы). У 1/3 беременных (30%) дисбиотические нарушения носили системный характер. Изменения микробиоценоза в обследованных биотопах характеризовались повышением числа ассоциаций факультативных УПМ на фоне дисбаланса основных групп Ig.
Перитонит. При вторичном перитоните возбудителем является автохтонная флора (обитатели ЖКТ), чувствительная к антибиотикам. В 77,0% случаев встречается ассоциации двух и более микроорганизмов, из них в 48% случаев - аэробно-анаэробная ассоциация. Степень обсемененности варьирует от 103 Ig КОЕ/г до 10 lg КОЕ/г. Если источником явилась толстая кишка, то в 84,7% случаев определялась аэробно-анаэробная ассоциация микроорганизмов; если источник - желудок или тонкая кишка, то такая ассоциация встречалась реже (24,7%), наравне с Е. coli определялись энтерококки, стрептококки, а из анаэробов - пептострептококки и пептококки. Степень обсемененности четко коррелировала с длительностью перитонита и общей тяжестью заболевания. Отмечена высокая чувствительность большинства из высеваемых штаммов микроорганизмов к «простым» антибиотикам, но при отсутствии положительной динамики в течение перитонита и условий для закрытия лапаростомы регистрировалось присоединение внутрибольничной флоры, устойчивой к подавляющему большинству имеющихся в арсенале антибиотиков.
При послеоперационном перитоните при 1-ой санации выделяемая флора в 38% случаев явилась внутрибольничной, в остальных представлена ассоциацией но-зокомиальных и автохтонных штаммов (34%) или автохтонными штаммами (28%) с низкой чувствительностью к антибактериальным препаратам. С 3-ей санации в основном высевалась нозокомиальная флора. У пациентов с вторичным и с послеоперационным перитонитом при неразрешении процесса к 5-ой и особенно 7-ой этапной санации брюшной полости различия в спектре возбудителей не выявлялись. За последние 16 лет отмечается четкая смена основного возбудителя нозокомиального инфицирования брюшной полости каждые 5 лет. При анализе 16-летнего периода применения различных антисептических растворов для этапных санаций брюшной полости выявлено, что при использовании одного антисептика более 2-3 лет количество этапных санаций прогрессивно увеличивалось из-за появления устойчивых к нему микроорганизмов. Необходимо использование не менее 6-7 литров антисептических
растворов и частые их замены. При 6 и более этапных санациях независимо от антибактериальной терапии происходит присоединение внутрибольничной флоры. Микробиологическая характеристика пациентов позволяет объективизировать оценку тяжести течения, конкретизировать стадию нозокомиального перитонита, а также оценку патогенетических свойств микроорганизмов по выраженности антибиотикорези-стентности и их устойчивости к антисептическим препаратам.
Из перитонеального экссудата и биопсийного материала пациентов (сальник, брюшина) было выделено 15 чистых культур 7 видов микроорганизмов, в 95,3% случаев вызывающих нозокомиальный перитонит и высоко устойчивых к антибиотикам: 2 штамма Pseudomonas aeruginosa и 1 штамм Acinetobacter baumannii - к 0,5% водному раствору хлоргексидина для санации брюшной полости, а один штамм Ps. aeruginosa и 2 штамма Enterococcus faecium - к гипохлориту натрия. Установлено, что Р. aeruginosa, Е. faecium, Е. coli, Е. bovis чувствительны к соответствующим бактериофагам: «Интести-бактериофаг жидкий раствор», «Бактериофаг синегнойный жидкий» и «Коли-протейный бактериофаг» в высокой степени; не выявлено чувствительности у Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus и Enterococcus faecalis. Степень фагорезистетности штаммов - дополнительный критерий их патогенности. Не установлено корреляции между антибиотикоустойчивостью и фагоустойчивостью. При использовании бактериофагов не отмечено присоединения внутрибольничной флоры, а микроорганизмы с отсутствием чувствительности к использованным ранее антибактериальным препаратам перестали высеваться. Развитие «нозокомиального» перитонита при многократных санациях брюшной полости на фоне проведения фаготерапии составило 30,7%, а без проведения фаготерапии - 100%. Один из компонентов комбинированного фагового препарата играет роль основного лечебного агента, а другие предотвращают смену возбудителя. Применение адаптированных к конкретному микроорганизму от конкретного пациента бактериофагов в лечении вторичного и нозокомиального гнойного перитонита повысило эффективность терапии и предотвращало летальный исход.
Нозокомиальные штаммы Е. coli высевались в титре 106 lg КОЕ/г. У них выявлена широкая палитра генов патогенности:///иЛ ген - в 89%, irp2 ген - в 67%, sfaA ген - в 56%, kps ген - в 44%, estla ген - в 44%, stxi ген - в 33%, stx2 ген - в 33%; «островки патогенности», определяющие антибиотикорезистентность - в разных сочетаниях в 56%. Сочетание «островков патогенности» irp2,fimA, sfaA и stxl встречается у 33% штаммов. Нозокомиальные штаммы рода Acinetobacter высевались в татре 10 lg КОЕ/г. Вьивлено меньшее, по сравнению со штаммами кишечной палочки число генов патогенности: у трёх штаммов из пяти - еаеА ген, у трёх штаммов из пяти - irp2 ген, у трёх штаммов из пяти - estla ген, у трёх штаммов из пяти - qnrA ген. Сочетание «островков патогенности» еаеА, irp2, estla ген (ST-IA/ST-P), qnrA ген встречается у 40% штаммов. Нозокомиальные штаммы псевдомонадных бактерий высевались в титре 106 lg КОЕ/г. Имеет место более частая выявляемость в штаммах двух и более «островков патогенности» по сравнению со штаммами К coli и Acinetobacter. Следовательно, для нозокомиальных штаммов Е. coli, Acinetobacter и Pseudomonas характерно наличие генов, отвечающих за адгезию бактериальной клетки на тканях макроорганизма, размножение, антибиотикорезистентность и повышающих патогенность бактерий. Выявление островков патогенности антибиотикорезистентности при определении устойчивости к фторхинолонам у 75% исследованных штаммов совпадало с результатами, полученными диско-диффузионным методом. В отношении бета-
лактамных антибиотиков процент совпадений генотипической и фенотипической устойчивости составлял 62,5%.
Тем не менее, выявление «островков патогенности», определяющих антибио-тикорезистентность, у 30% штаммов не совпадает с частотой выявления антибиоти-корезисгентности in vitro, диско-диффузионным методом, что свидетельствует о многоплановых генетических механизмах, её определяющих. Применение адаптированных бактериофагов в лечении вторичного и нозокомиального распространенного гнойного перитонита заметно повышает эффективность проводимой терапии и предотвращает летальный исход заболевания.
Применение низших обезьян как биологической модели для изучения хла-мидийной инфекции. Для видовой одновременной мультиплексной детекции и идентификации Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis впервые подобраны оригинальные, универсальные праймеры для диагностической тест-системы на фрагмент гена 16S рРНК. Впервые предложена оригинальная комбинация праймеров для детекции как бесплазмидных, так и плазмидосодержащих штаммов Ch. trachomatis, что повышает процент выявляемости возбудителя. При видовой верификации из 15 штаммов Chi. pneumoniae err обезьян праймерами для видовой верификации только 5 штаммов были подтверждены как Chi. pneumoniae; 5 штаммов были верифицированы как смесь двух возбудителей Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, что указывало на микст-инфекцию; 5 штаммов были подтверждены как Ch. trachomatis, что говорит о наличии перекреста при выявлении хламидий меченными моноклональными Ат для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae. При верификации плазмид у 21 штамма Ch. trachomatis от обезьян установлено её наличие у 10 (47,6%) штаммов (выделены от приматов с острым хламидиозом, с патологией глаз и органов дыхания). Остальные 11 (52,4%) штаммов были бесплазмидными (выделены от приматов с хроническим хламидиозом). Штаммы Ch. trachomatis, полученные от обезьян с микст-пневмохламидиозом, также характеризовались как носители плазмиды. Созданные тест-системы мультиплексной ПЦР-детекции возбудителей хламидиозов обезьян позволяют одновременно верифицировать Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis с разным патогенетическим потенциалом и оценивать их вирулентность (определение носи-тельства плазмиды). Впервые выявлено сочетание наличия плазмиды и высокой активности гена IncA (титр в культуре клеток 3,4-5,5 lg ТЦЦ50/мл - указывает на агрессивность штаммов и высокую патогенность), а её отсутствие - с низкой активностью гена IncA (титр в культуре клеток 2,0-3,4 lg ТЦД50/мл - указывает на отсутствие агрессивности у штаммов и низкую патогенность). С применением ПЦР определены участки генов антибиотикорезистентности штаммов хламидий: из 26 штаммов Ch. trachomatis наличие tet гена выявлено у 4 штаммов (15,4%): 3 относились к генотипу Е (бесплазмидные) и 1 - к генотипу G (плазмидосодержащий); егт ген не определялся. У 5 штаммов Chi pneumoniae детерминанты устойчивости к тетрациклинам и макролидам не зафиксированы. Одновременное применение нескольких взаимодополняющих методов (цитологического, серологического, культурального и молеку-лярно-генетического) обнаружения хламидий в клиническом материале позволяют выявить возбудителя и охарактеризовать штаммы с учетом их генотипических и фе-нотипических свойств.
В результате проведенных исследований и с учетом данных литературы разработан алгоритм функционирования колонизационной резистентности слизистых открытых полостей человека. Наличие тесной взаимосвязи TLR, запускающих цитоки-новый каскад, через который активизируются иммуноглобулиновое звено и воспали-
тельная реакция, с микрофлорой биотопа определяет КР слизистых (рис.1) и характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания: излечение или хронзацию. Колонизационная рези-стеность выступает как неотъемлемая часть мукозального иммунитета.
Рис 1. Алгоритм функционирования колонизационной резистености.
Выводы
1. Определены показатели нормоценоза и критерии оценки микроэкологических нарушений, включающие видовой и количественный состав микрофлоры и уровни основных классов иммуноглобулинов в секретах (IgG, IgM, IgA, slgA и sc), отражающие состояние колонизационной резистентности биотопов слизистых открытых полостей.
2. Смешанное бактериально-вирусное инфицирование при респираторной патологии сопровождается повышением уровней индигенной микрофлоры и условно-патогенных бактерий. Обнаружение нескольких видов или монокультур условно-патогенных микроорганизмов в титре 6,0 lg КОЕ/г и выше является признаком выраженного воспалительного процесса ротоглотки, обусловленного доминирующей условно-патогенной микрофлорой. Дисбиоз ротоглотки у детей без признаков острой инфекции на момент обследования является показанием к тщательному клиническому обследованию пациентов.
- 3. При бронхитах у детей определена взаимосвязь уровней экспрессии мРНК TLR-2, TLR-4, TLR-3, TLR-8 и инфекционной нагрузки. В результате активизируется местный цитокиновый каскад, запускающий иммуноглобулиновое звено и воспалительную реакцию в ротоглотке. Уровни IgE независимы от показателей экспрессии генов TLR. По сопоставлению естественной и экспериментальной колонизации эпителиальных клеток буккального и назофарингеального эпителиев тест-штаммами можно судить о степени нарушения колонизационной резистентности дыхательных путей.
4. При уреаплазменной и хламидийной инфекции в зависимости от выраженности инфекционного процесса (дисбиоз или бактериальный вагинит) снижаются уровни индигенной микрофлоры, увеличивается содержание условно-патогенных факультативно-анаэробных микроорганизмов в просветной области и облигатно-анаэробных микроорганизмов в пристеночной области. Высеваемость условно-патогенной микрофлоры в титре 7 lg КОЕ/г и выше во влагалище и 4 lg КОЕ/г и выше в цервикальном канале свидетельствует о её патогенности. При обострении хронического процесса патогенный потенциал микрофлоры реализуется при титре 5 lg КОЕ/г во влагалище и 4 lg КОЕ/г и выше в цервикальном канале.
5. При уреплазмозе колонизационная резистеность слизистых урогенитального тракта характеризовалась корреляционной зависимостью между содержанием индигенной и условно-патогенной микрофлоры и уровнями IgG, IgA, slgA, IgM и sc в отделяемом; при хламидиозе выявлена взаимосвязь уровней экспрессии мРНК генов TLR-2 и TLR-4 на слизистых урогенитально тракта с цитокинами, уровнями IgG, slgA и sc и микрофлорой биотопа, что определяло выраженность местной воспалительной реакции.
6. Установлено, что внутриклеточные патогены (хламидии, уреаплазмы) способны изменять антиинфекционную резистентность макроорганизма к гетерологичным возбудителям. Оценка антибиотикорезистентности и фагорезистентности как фактора патогенности уреаплазм, хламидий, возбудителей нозокомиальных инфекций и условно-патогенных бактерий при наблюдении пациентов в динамике при уреаплазмозе, хламидиозе и гнойных перитонитах носит диагностический и прогностический характер.
7. Впервые выявлено, что сочетание наличия плазмиды и высокой активности гена incA определяет вирулентность штаммов Ch. trachomatis. Для нозокомиальных
39
штаммов, полученных от больных с перитонитом, характерно наличие одного или нескольких генов, отвечающих за адгезию, размножение и антибиотикорезистентность бактерий.
8. При беременности, осложненной невынашиванием на ранних сроках, зарегистрирован повышенный уровень инфекционной нагрузки и достоверное снижение уровня основных классов иммуноглобулинов в биотопах влагалища, ротоглотки и кишечника, что свидетельствует о степени нарушения местной иммунологической резистентности.
9. Выявлены микроэкологические изменения равной степени тяжести одновременно в биотопах влагалища, полости рта и кишечника у 32% пациенток с сохраненной беременностью, у 50% - с прервавшейся беременностью и у 30% -клинически здоровых беременных, что свидетельствует о системном характере дисбиотических нарушений.
10. Впервые представлен алгоритм формирования и оценки функционального состояния колонизационной резистетности слизистых открытых полостей: TL-рецепторы слизистых реагируют на патогены, условно-патогенную микрофлору и нормофлору, через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни секреторных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA, slgA и sc), что в комплексе составляет колонизационную резистентность.
Практические рекомендации
1. При диагностике и установлении прогноза течения инфекционных заболеваний открытых полостей организма необходимо и целесообразно оценивать выраженность дисбиотических нарушений ротоглотки, кишечника, влагалища и церви-кального канала, а также колонизационную резистентность слизистых биотопов как интегральный показатель местной антиинфекционной резистентности и неотъемлемую часть мукозального иммунитета.
2. Для полноценной оценки инфекционных процессов необходимо одновременно учитывать динамику показателей устойчивости к антибиотикам и химиопрепара-там патогенов, индигенной и УПМ биотопов слизистых.
3. Общепринятый алгоритм верификации возбудителя хламидийной инфекции необходимо расширить за счёт включения предложенных оригинальных мультиплексных ПЦР-тест-систем на одномоментное дифференцирование Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae, одномоментное дифференцирование плазмидосодержащих и плазмидонегативных штаммов Ch. trachomatis, а также на генотипы Ch. trachomatis и выявление «островков патогенности», определяющих антибиотикорезистентность штаммов хламидий.
4. При распространенных гнойных перитонитах целесообразно применение препаратов бактериофагов, бактериофаги обеспечивают профилактическую защиту ре-инфицирования брюшной полости нозокомиальными штаммами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Филатова Н. Нормализация микрофлоры влагалища с помощью иммунологического препарата «Кипферон, суппозитории» / Филатова Н., Макаров И., Афанасьев С., Алёшкин В., Воропаева Е.А. // Врач. - 2003.-JV« 11.-С. 62-63.
2. Боровкова Е.И. Диагностические критерии определения риска внутриутробного инфицирования плода и угрозы прерывания беременности на ранних сроках / Боровкова Е.И., Воробьёв A.A., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Сидорова И.С., Афанасьев С.С., Селькова Е.П., Несвижский Ю.В., Матвеевская Н.С. // Эпидемиология, Вакцинопрофилакгика. Научно-практический журнал. - 2004. -№1 (14).- С. 45-50.
3. Алёшкин В.А. Становление пробиотикотерапии в России /Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В., Воробьёв A.A., Феклисова JI.B., Несвижский Ю.В., Амерханова A.M., Пожалостина JI.B., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Да-выдкин В.Ю., Лахтин В.М., Давыдкин И.Ю. // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2005. - № 12. - С. 3-13.
4. Воропаева Е.А. Микроэкология и показатели гуморального иммунитета влагалища женщин с неспецифическими воспалительными заболеваниями гениталий. /Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Кудрявцева М.В., Алёшкин В.А., Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Филатова Н.Г., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 3. - С. 6569.
5. Алёшкин В.А. Микробиология и иммунология дисбиозов респираторного и урогенитального трактов / Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Афанасьев М.С. // Аллергология и иммунология. - 2005. - Т. 6, № 3. - С. 354-355.
6. Афанасьев С.С. Влияние препаратов цитокинов на устойчивость бактерий к антибиотикам in vitro / Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Воробьёв A.A., Рубаль-ский О.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005. - № 3. - С. 95-97.
7. Воропаева Е.А. Применение Кипферона при лечении уреаплазмоза у женщин / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С., Калмыков A.A., Денисов А.К., Мигранова О.М. // Фарматека. - 2006. - № 10 - С. 48-53.
8. Алёшкин В.А. Чувствительность микрофлоры влагалища к антибиотикам при уреаплазмозе у женщин / Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С., Байракова А.Л. // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 2006. - С. 51.
9. Афанасьев С.С. Иммуноглобулины влагалища при уреаплазмозе у женщин / Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Панурина Р.Л. // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 2006. - С. 56-57.
10. Кудрявцева М.В. Лечение уреаплазмоза с применением иммуномодуляторов / Кудрявцева М.В., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С. // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М., 2006. - С. 184-185.
11. Воропаева Е.А. Микробиоценоз влагалища - критерий эффективности терапии / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С. //
Сборник материалов XIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - М, 2006. - С. 96.
12. Воропаева Е.А. Микробиологические и иммунологические характеристики дисбиотических нарушений биотопов слизистых оболочек респираторного и урогенитального трактов / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Воробьёв A.A., Матвеевская Н.С., Несвижский Ю.В., Афанасьев М.С., Кудрявцева М.В., Панурина РЛ. // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2006. -№ 1. - С. 3-5.
13. Воропаева Е.А. Новый иммунобиологический препарат «Кипферон, суппозитории» при лечении хронического уреаплазмоза у женщин / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кудрявцева М.В., Денисов А.К., Кондрашин Ю.И., Мигранова О.М. // Гинекология. - 2006. - Том 8, № 3. - С. 32-36.
14. Воропаева Е.А. Микробиологические и иммунологические критерии оценки эффективности лечения уреаплазмоза женщин / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Воробьев A.A., Кудрявцева М.В., Несвижский Ю.А., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Панурина РЛ. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007 - № 2. - С. 65-70.
15. Макаров О.В. Инфекции в акушерстве и гинекологии. Монография. / Макаров О.В., Алёшкин В.А., Савченко Т.Н., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Ганковская JI.B., Хашукоева А.З., Бахарева И.В., Каюкова С.И., Протопопова JI.O., Афанасьев М.С., Гиммельфарб Е.И., Новикова Л.И. // М., «МЕДпресс-информ». - 2007. - 464 с.
16. Алешкин В.А. Уровни иммуноглобулинового профиля влагалища как прогностический тест при уреаплазмозе у женщин / Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Панурина Р.Л. // Сборник материалов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 45.
17. Воропаева Е.А. Анализ лечения уреаплазмоза с применением иммуномодулято-ров в динамике / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Афанасьев М.С., Кудрявцева М.В. // Сборник материалов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 74.
18. Воропаева Е.А. Об эффективности лечения хронического уреаплазмоза у женщин с использованием нового иммунологического препарата Кипферон / Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кудрявцева М.В., Афанасьев М.С., Калмыков A.A., Денисов А.К., Кондрашин Ю.И. //Трудный пациент. - 2007. - Т. 5, № 1. - С. 28-33.
19. Афанасьев С.С. Перспективы применения нового отечественного иммунобиологического препарата «Кипферон, суппозитории» в лечении инфекционных заболеваний/Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Иванов С.Г., Феклисова Л.В., Рубальский О.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Калмыков A.A., Денисов А.К. // Трудный пациент. - 2007. - Т. 5, № 3. - С. 49-53.
20. Феклисова Л.В. Применение отечественного иммунобиологического препарата Кипферон®суппозитории в комплексной терпи детей, больных ангиной / Феклисова Л.В., Галкина Л.А., Казакова С.П., Репина И.Б., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С. // Педиатрия. - 2007. - Том 86, № 5. - С. 93-98.
21. Гостищев В.К. Третичный перитонит: возможности его профилактики / Гос-тнщев В.К., Станоевич У.С., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Шкроб Л.О., Матвиевская Н.С., Попов Д.В. // Хирургия. - 2007. - № 9. - С. 15-18.
22. Воропаева Е.А. Протеазная активность микрофлоры ротовой полости больных пародонтнтом / Воропаева Е.А., Байракова A.JL, Бичучер A.M., Дьяков B.JI., Козлов JI.B. // Биомедицинская химия. - 2008. - Том 54, Выпуск 6. - С. 706-712.
23. Воропаева Е.А. Микрофлора биотопов влагалища, ротоглотки и кишечника женщин с угрозой прерывания беременности на ранних сроках / Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Макаров О.В., Афанасьев С.С., Савченко Т.Н., Протопопова JI.A., Несвижский Ю.В., Байракова АЛ., Матвиевская Н.С., Егорова Е.А., Метельская В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев М.С., Панурина Р.Л., Хашукоева А.З. // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - № 2. - С. 6-12.
24. Байракова A.JI. Уровень экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как прогностический критерий излеченности при урогенитальном хламидиозе / Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Метельская В.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А. // Человек и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгресса. - М., 2008. - С. 387-388.
25. Гречишникова О.Г. Лабораторная база диагностики хламидиоза / Гречишникова О.Г., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Метельская В.А., Байракова А.Л., Слободенюк В.В., Афанасьев М.С., Егорова Е.А. // Человек и лекарство: сборник материалов XV Российского национального конгресса. - М., 2008. - С. 430431.
26. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как показатели динамики патогенетических изменений при урогенитальном хламидиозе / Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Метельская В.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А. // Идеи Пасгера в борьбе с инфекциями. Материалы четвертой международной конференции. - СПб, 2008. - С. 53.
27. Байракова АЛ. Роль и биологическое значение Толл-подобных рецепторов в антиинфекционной резистентности организма / Байракова АЛ., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Егорова Е.А., Метельская В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев М.С., Рубальский О.В. // Вестник Российской академии медицинских наук. -2008.-№ 1.-С. 45-54.
28. Караулов A.B. Прогностическая значимость экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин / Караулов A.B., Афанасьев М.С., Байракова A.JI., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кафарская Л.И., Шкопоров А.Н., Несвижский Ю.В., Леваков С.А. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2, № 2-3. - С. 178.
29. Алешкин В.А. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как критерий оценки эффективности алгоритмов терапии при хламидиозе / Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Караулов A.B., Байракова А.Л., Афанасьев С.С., Кафарская Л.И., Несвижский Ю.В., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Леваков С.А., Метельская В.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А., Слободенюк В.В., Фандеева Е.В. // Современные представления об иммунокоррекции. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Пенза, 2008. - С. 8-10.
30. Воропаева Е.А. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями микробиоценоза урогеннтального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин / Воропаева Е.А., Караулов A.B., Байракова А.Л., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Кафарская Л.И., Несвижский Ю.В., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Леваков С.А., Метельская В.А.,
Афанасьев М.С., Егорова Е.А., Слободенюк В.В., Фандеева Е.В. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2008 -№ 2. - С. 68-76.
31. Афанасьев С.С. Связь уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 с изменениями цнтокинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламиднозе у женщин / Афанасьев С.С., Байракова АЛ., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Караулов А.В., Кафарская Л.И., Несвижский Ю.В., Топтыгина А.П., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Леваков С.А., Кострова О.М., Метельская В.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А., Слободенюк В.В., Фандеева Е.В. // Естественные науки. - 2008 - № 4 (25). - С. 6273.
32. Метельская В.А. Современные методы лабораторной диагностики хламидио-зов / Метельская В.А., Алешкин В.А., Зверев В.В., Гречишникова О.Г., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Афанасьев М.С., Байракова АЛ., Егорова Е.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2008-№4.- С. 111-117.
33. Макаров О.В. Инфекции в акушерстве и гинекологии. - Монография, 2-е издание. / Макаров О.В., Алёшкин В.А., Савченко Т.Н., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Ган-ковская Л.В., Хашукоева А.З., Бахарева И.В., Каюкова С.И., Протопопова Л.О., Афанасьев М.С., Гиммельфарб Е.И., Новикова Л.И. // М., «МЕДпресс-информ». - 2009. -464 с.
34. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза у больных в зависимости от остроты клинических проявлений / Гречишникова О.Г., Слободенюк В.В., Воропаева Е.А., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Метельская В.А., Байракова А.Л., Афанасьев М.С., Егорова Е.А. // Человек и лекарство: сборник материалов XVI Росс. Нац. конгресса -М, 6-10 апр. 2009.-С. 76.
35. Гречишникова О.Г. Фенотипическая характеристика штаммов хламидий, выделенных от человека и обезьян культуральным методом / Гречишникова О.Г., Слободенюк В.В., Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Ликов В.Ф., Воропаева Е.А., Джикидзе Э.К., Несвижский Ю.В., Воложанцев Н.В., Полещук Н.Н., Светоч Э.А., Дятлов И.А., Афанасьев М.С., Рубальский О.В., Метельская В.А., Байракова АЛ., Рубанин Л.В., Егорова Е.А., Рубальский Е.О., Квачева З.Б., Евсегнеева И.В., Караулов А.В. II Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009 - № 3. - С. 44-53.
36. Слободенюк В.В. ПЦР-детекция и идентификация возбудителей хламидийных инфекций человека и обезьян / Слободенюк В.В., Алешкин В.А., Лапин Б.А., Афанасьев С.С., Кокушков Д.В., Гречишникова О.Г., Воропаева Е.А., Джикидзе Э.К., Несвижский Ю.В., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Дятлов И.А., Афанасьев М.С., Рубальский О.В., Метельская В.А., Байракова АЛ., Егорова Е.А., Рубальский Е.О., Евсегнеева И.В., Караулов А.В. II Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009 - № 3. - С. 54-62.
37. Слободенюк В.В. Генотипирование и анализ антибиотикорезистентности штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / Слободенюк В.В., Караулов А.В., Алешкин В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев С.С., Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Несвижский Ю.В., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Дятлов И.А., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Метельская В.А., Егорова Е.А., Байракова АЛ. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2009 - № 4. -С. 74-81.
38. Слободенюк В.В. Сравнительная характеристика методов верификации Chlamydia trachomatis у человека и обезьян / Слободенюк В.В., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., - Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Метельская В.А., Байракова А.Л., Егорова Е.А., Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Теплый Д.Л., Рубальский О.В., Рубальский Е.О. // Естественные науки. - 2009 - № 1 (26). - С. 65-71.
39. Байракова А.Л. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 как способ оценки формы и прогноза течения урогенитальной хламидийной инфекции у женщин / Байракова А.Л., Гречишникова О.Г., Алешкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Метельская В.А., Афанасьев М.С. // Биологическая безопасность в современном мире. Материалы науч.-практ. конф. 21-22 апреля 2009, ФГУН ГНЦ ПМБ - Оболенск, С. 98-100.
40. Афанасьев С.С. Молекулярные механизмы индукции врождённого иммунитета / Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Байракова АЛ., Воропаева Е.А., Несвижский Ю.В., Кафарская Л.И., Егорова Е.А., Афанасьев М.С., Метельская В.А., Гречишникова О.Г., Куракова А.А. // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2009. - № 4. - С. 42-49.
41. Алешкин В.А. Связь уровней МРНК TLR-2 и TLR-4 с изменениями иммуноглобулинового профиля урогенитального тракта при урогенитальном хламидиозе у женщин / Алешкин В.А., Караулов А.В., Байракова А.Л., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Кафарская Л.И., Несвижский Ю.В., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Афанасьев М.С., Гречишникова О.Г., Леваков С.А., Метельская В.А., Матвеевская Н.С., Панурина РЛ., Егорова Е.А., Слободенюк
B.В., Фандеева Е.В. // Иммунология. - 2009. - Т. 30, № 3. - С. 165-170.
42. Байракова А.Л. Экспрессия гена TLR-2 как показатель состояния локального иммунитета у женщин с урогенитальной хламидийной инфекцией / Байракова А.Л., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Фандеева Е.В., Афанасьев М.С., Гречишникова О.Г., Метельская В.А., Слободенюк В.В. // Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения: сборник материалов юбилейной Всероссийской науч.-практ. конференции. - Нижний-Новгород,- 2009. - С. 172-173.
43.Урбан Ю.Н. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения видового разнообразия бифидобактерий / Урбан Ю.Н., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С. // Гастроэнтерология. - Санкт-Петербург. - 2009. - № 4. - С. 40.
44. Топтыгина А.П. Особенности индукции местного иммунного ответа у больных урогенитальным хламидиозом / Топтыгина А.П., Афанасьев С.С., Байракова AJL, Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Кафарская Л.И., Афанасьев М.С., Фандеева Е.В. // Российский иммунологический журнал. - 2009. - Том 3(12), № 2. -
C. 171-176.
45. Слободенюк В.В. Изучение генотипов и антибиотикорезистентности штамммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / Слободенюк В.В., Караулов А.В., Алешкин В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев С.С., Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Несвижский Ю.В., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А., Дятлов И.А., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Алешкин А.В., Метельская В.А., Егорова Е.А., Байракова А.Л. // Человек и лекарство: сборник материалов XVII Росс. Нац. Конгресса, М, 12-16 апр.2010. - С. 719.
46. Гречишникова О.Г. Сравнительный анализ прямых методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза / Гречишникова О.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Слободенюк В.В., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Рубальский
О.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Метельская В.А., Байракова А.Л., Егорова Е.А., Рубальский Е.О. // Астраханский медицинский журнал. - 2010 - Т. 5., №
2.-С. 80-86.
47. Байракова АЛ. Уровни экспрессии TLR-2 и TLR-4 как прогностический критерий излеченности при хламидиозе / Байракова АЛ., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Караулов A.B., Кафарская Л.И., Несвижский Ю.В., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н., Гречишникова О.Г., Леваков С.А., Метельская В.А., Афанасьев М.С., Егорова Е.А., Слободенюк В.В., Фандеева Е.В. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2010. - № 4. - С. 35-42.
48. Афанасьев М.С. Роль врождённого иммунитета и микроорганизмов биотопов слизистых оболочек урогенитального тракта женщин в патогенезе хламидийной инфекции / Афанасьев М.С., Караулов A.B., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А. // Сеченовский Вестник. - 2010. - N° 2 (2). - С. 6469.
49. Слободенюк В.В. Спонтанный хламидиоз у обезьян как модель хламидийной инфекции / Слободенюк В.В., Каркищенко H.H., Афанасьев С.С., Лапин Б.А., Алёшкин В.А., Караулов A.B., Несвижский Ю.В., Пчелинцев С.Ю., Джикидзе
3.К., Афанасьев М.С., Воропаева Е.А. // Биомедицина. - 2010. - № 5. - С. 6-16.
50. Алёшкин В.А. Нарушение микробиоценозов у детей: многоцентровое исследование. Сообщение I. Микробиоценоз и дисбактериоз ротоглотки у детей / Алёшкин В .А., Галимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Караулов A.B., Рубальский О.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С. // Астраханский медицинский журнал. - 2010. -Т. 5. - № 3. - С. 9-13.
51. Метельская В.А. Колонизационная резистентность и иммунологическая реактивность слизистых ротоглотки у детей в норме и при бронхолёгочных заболеваниях / Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Караулов A.B., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Матвеевская Н.С., Панурина РЛ., Бичучер А.М., Гречишникова О.Г., Байракова АЛ., Урбан Ю.Н., Алёшкин A.B., Слободенюк В.В., Егорова Е.А. // Вестник Российской академии медицинских наук. -2010-№7.-С. 10-15.
52. Караулов A.B. Адгезия клетками назофаригеального и буккального эпителия индигенных и условно-патогенных микроорганизмов как показатель резистентности респираторного тракта детей с бронхитами и пневмониями / Караулов A.B., Метельская В.А., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Гречишникова О.Г., Несвижский Ю.В., Кок-ушков Д.В., Алёшкин A.B., Егорова Е.А., Урбан Ю.Н., Слободенюк В.В., Байракова АЛ. // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. - 2010. - № 3. - С. 37-46.
53. Феклисова Л.В. Оптимизация методов лечения детей с вирусно-бактериальными инфекциями различной этиологии / Феклисова Л.В., Мескина Е.Р., Галкина Л.А., Це-липанова Е.Е., Казакова С.П., Савицкая H.A., Караулов A.B., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Волохович Т.Т. // Новая медицинская технология. - М.-2010,- 15 с.
54. Карпова Е.П. Роль инфекции в развитии патологии верхнего отдела дыхательных путей у детей. / Карпова Е.П., Захарова И.Н., Солдатский Ю.Л., Афанасьев С.С., Тулупов Д.А., Воропаева Е.А., Вагина Е.А., Метельская В.А. // Пособие для врачей. -М.- 2010.-218 с.
55. Топтыгина А.П. Изменения в цитокиновом профиле сыворотки крови и слюны детей при остром и хроническом бронхите / Топтыгина А.П., Метельская В .А., Воропаева Е.А., Алёшкин В.А., Караулов A.B., Афанасьев С.С. // Российский иммунологический журнал. - 2011. -Том 5(14). - № 2. - С. 145-149.
56. Караулов A.A. Колонизационная резистентность слизистых цервикального канала как неотъемлемая составляющая местного иммунитета 1 Караулов A.A., Афанасьев М.С., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А. // Иммунология. - 2011. -Том 32, № 1. - С. 11-15.
57. Афанасьев М.С. Микробиотоп влагалища и его патогенетическая роль при уреаплазмозе и хламидиозе / Афанасьев М.С., Караулов A.B., Алёшкин В.А., Га-лимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Несвижский Ю.В., Рубальский Е.О., Егорова Е.А. II Астраханский медицинский журнал. - 2011 - Т. 6. - № 1. -С. 137-142.
58. Алёшкин В.А. Нарушение микробиоценозов у детей: многоцентровое исследование. Сообщение И. Микробиоценоз и дисбактериоз влагалища у девочек / Алёшкин В.А., Галимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Караулов A.B., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С. // Астраханский медицинский журнал. -2011 - Т. 6. - № 1. - С. 222-225.
59. Алёшкин В.А. Нарушение микробиоценоза у детей: многоцентровое исследование. Сообщение III. Микробиоценоз и дисбактериоз кишечника / Алёшкин
B.А., Галимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Караулов A.B., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Рубальский Е.О. // Астраханский медицинский журнал. - 2011. -Т. 6. - № 2. - С. 124-128.
60. Лахтин М.В. Поведение Candida tropicalis и Candida krusei в присутствии пробиотических лектинов / Лахтин М.В., Алёшкин В.А., Лахтин В.М., Афанасьев
C.С., Караулов A.B., Галимзянов Х.М., Несвижский Ю.В., Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Алёшкин A.B., Рубальский Е.О. //Астраханский медицинский журнал. - 2011.-Т. 6.-№ 3. - С. 97-101.
61. Караулов A.B. Установление генотипических и фенотипических свойств возбудителя и его филогенетического положемия в семействе Chlamydiaceae штаммов хламидий, выделенных от обезьян и человека с хламидийной патологией / Караулов A.B., Слободенюк В.В., Алёшкин В.А., Гречишникова О.Г., Афанасьев С.С., Джикидзе Э.К., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Алёшкин A.B., Метельская В.А., Егорова Е.А., Байракова АЛ. // Вестник Российской академии медицинских наук.-2011 -№ 7.-С. 16-21.
62. Макаров О.В. Микрофлора влагалища и цервикального канала у женщин с полипами шейки матки / Макаров О.В., Савченко Т.Н., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Мельнгиков A.B., Батиян Т.С. II Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2011. - № 4. - С. 43-47.
63. Зверев В.В. Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. / Зверев В.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Караулов A.B., Галимзянов Х.М., Макаров О.В., Богданова Е.А., Рубальский О.В., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Афанасьев Д.С., Савченко Т.Н., Метельская В.А., Рубальская Е.Е., Рубальский Е.О. // Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей. - Астрахань - Москва. - 2011. - 80 с.
64. Феклисова Л.В. Клинико-лабораторная эффективность применения отечественного комбинированного пробиотика «Флорин Форте» в комплексном лечении детей с
инфекционной респираторной патологией и при острых кишечных инфекциях. / Фек-лисова JI.B., Целипанова Е.Е., Мескина Е.Р., Галкина JI.A., Савицкая Н.А., Кирсанова С.П., Русанова Е.В., Троянский И.В., Воропаева Е.А., Пожалостина JI.B., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А. //Учебное пособие.- М.- 2011,- 36 с.
65. Караулов А.В. Хламидийная инфекция. Новые аспекты патогенеза, иммунологии, верификации и лечения инфекции у человека и приматов. / Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Лапин Б.А., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Слободенюк В.В., Алёшкин А.В., Байракова А.Л., Гречишникова О.Г., Дятлов И.А., Галимзянов Х.М., Евсегнеева И.В., Джикидзе Э.К., Рубальский О.В., Несвижский Ю.В., Миронов А.Ю., Фотиади О.Г., Кафарская Л.И., Кострова О.М., Топтыгина А.П., Матвеевская Н.С., Афанасьев Д.С., Рубальский Е.О., Светоч Э.А., Пчелинцев С.Ю., Логунов О.В., Новикова Л.И., Ликов В.Ф. // М,- 2012,- 256 с.
66. Лахтин М.В. Защита потенциальных антител человека от протеолиза секретами клинических штаммов кандид в присутствии лектинов пробиотических бактерий человека / Лахтин М.В., Козлов Л.В., Лахтин В.М., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Бичучер А.М., Панурина РЛ., Рубальский Е.О. // Астраханский медицинский журнал. -2012 - Т. 7, № 1. - С. 63-68.
67. Савченко Т.Н. Нарушение микробиоценоза влагалища как фактор невынашивания беременности / Савченко Т.Н., Макаров О.В., Алёшкин В.А., Афанасьев С.С., Воропаева Е.А., Мельников А.Н., Стрыгина В.А. // Научно-практический медицинский журнал Лечение и профилактика. - 2012.- № 1(2). -С. 39-43.
68. Караулов А.В. Показатели колонизационной резистентности слизистых ротоглотки как объективные критерии мукозального иммунитета при бронхитах у детей / Караулов А.В., Алёшкин В.А., Воропаева Е.А., Метельская В.А., Слободенюк В.В., Афанасьев М.С., Затевалов A.M., Топтыгина А.П., Афанасьев С.С., Несвижский Ю.В., Урбан Ю.Н., Рубальский Е.О., Матвеевская Н.С. // Иммунология. - 2012. - Том 33, № 5. - С. 255-259.
69. Воропаева Е.А. Оценка микробиоценоза влагалища при акушерской и гинекологической патологии / Воропаева Е.А., Караулов А.В., Афанасьев С.С., Алёшкин В.А., Макаров О.В., Несвижский Ю.В., Афанасьев М.С., Матвеевская Н.С., Савченко Т.Н., Рубальский О.В. // Новая медицинская технология.- Москва-Астрахань.- 2012,- 50 с.
70. Aleshkin V. A. Use of interferon for preventing microorganisms to acquire antibiotic resistance in ureaplasmosis treatment of women / Aleshkin V.A., Afanasiev S.S., Voropaeva E.A., Afanasiev M.S. // International J. on Immunorehabilitation. - 2006. - Vol. 8, № 1. - P. 46.
71. Slobodenuk V.V. The comparative estimation of diagnostic value of laboratory methods for urogenital chlamydiosis in humans and monkeys / Slobodenuk V.V., Aleshkin V.A., Lapin B.A., Karaulov A.V., Afanasiev S.S., Grechishnikova O.G., Voropaeva E.A., Jikidze E.K, Nesvizskii U.V., Afanasiev M.S., Metelskaia V.A., Birakova A.L., Egorova E.A. // FEMS 2009, 3rd Congress of European Microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28-Juli 2,2009.
72. Karaulov Alexander Identification of Phylogenetic Position in the Chlamydiaceae Family for Chlamydia Strains Released fromMonkeys and Humans with Chlamydial Pathology / Karaulov Alexander, Aleshkin Vladimir, Slobodenyuk Vladimir, Grechishnikova Olga, Afanasyev Stanislav, Lapin Boris, Dzhikidze Eteri, Nesvizhsky Yuriy, Voropayeva Elena, Afanasyev Maxim, Aleshkin Andrei, Metelskaya Valeria, Yegorova Ekaterina, Bayrakova
Alexandra. // Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology. - Volume 2010, Article ID 130760, 11 pages.
Патенты РФ на изобретение
1. Пат. № 2249821 Российская Федерация МПК G 01 N 33/48. Способ оценки микробиоценоза влагалища / Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин,
A.А. Воробьев, Ю.В. Несвижский, О.В. Рубальскнй, Н.Г. Филатова, М.В. Кудрявцева, М.С. Афанасьев, Н.С. Матвеевская; заявитель и патентообладатель ГУ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Минздрава РФ. - № 2004112817; заявл. 27.04.2004; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2005; Бюл. № 10.
2. Пат. № 2279469 Российская Федерация МПК C12N 1/10. Основа для выделения и культивирования микроорганизмов / А.А. Воробьёв, Ю.В. Несивжский,
B.А. Алёшкин, Е.А. Богданова, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, Е.В. Герасимова, Е.А. Воропаева, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин; заявители и патентообладатели А.А. Воробьёв, Ю.В. Несвижский, В.А. Алёшкин, Е.А. Богданова, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, Е.В. Герасимова, Е.А. Воропаева, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин. - № 2005109344/13; заявл. 01.04.2005; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.07.2006; Бюл. № 19.
3. Пат. № 2322506 Российская Федерация МПК C12Q 1/02. Способ определения защитного действия покрытия капсул для штамма Bifidobacterium adolescentis МС42 от содержимого желудка / В.А. Алёшкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, Э.К. Джикидзе, К.В. Симавонян, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, Е.А. Воропаева, О.В. Рубальский, Л.И. Холодилова, А.В. Мелихова, Л.И. Трофимова, Т.И. Кебу, АЛ. Байракова, В.А. Калашникова, М.С. Афанасьев, Т.П. Егорова; заявители и патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН. - № 2006142790/13; заявл. 05.12.2006; зарег. во ФГУП «Роспатент» 20.04.2008; Бюл. № И.
4. Пат. № 2327995 Российская Федерация МПК G 01N 33/569; С 12 Q 1/68. Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза /АЛ. Байракова, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Л.И. Кафарская, О.М. Кострова, Ю.В. Несвижский, О.В. Рубальский, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, А.Н. Шкопоров, Б.А. Ефимов, А.А. Куракова, Е.А. Егорова, К.В. Поздняков, М.С. Афанасьев, A.M. Затевалов, Е.В. Хохлова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. - № 2007123483; заявл. 25.06.2007; зарег. во ФГУП «Роспатент» 27.06.2008; Бюл. № 18.
5. Пат. № 2333005 Российская Федерация МПК А61К 35/76. Способ профилактики нозокомиального перитонита /В.А. Алёшкин, В.К. Гостшцев, С.С. Афанасьев, У.С. Станоевич, Е.А. Воропаева, О.В. Рубальский, Л.О. Шкроб, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, А.А. Куракова, Д.С. Афанасьев; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2006144767/14; заявл. 18.12.2006; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.09.2008; Бюл. № 25.
6. Пат. № 2377311 Российская Федерация МПК C12Q 1/18. Способ прогнозирования дестабилизации микробиоценоза организма млекопитающего /С.В. Грачёв, Ю.В. Несвижский, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, Е.А. Богданова, Е.А. Воропаева, Е.О. Рубальский, Е.В. Герасимова; заявители и патентообладатели ГОУВПО ММА им. Н.М. Сеченова Росздрава, ГОУВПО АГМА Рос-здрава, ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. - №
49
2008108191/13; заявл. 05.03.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 27.12.2009; Бюл. № 36.
7. Пат. № 2377006 Российская Федерация МПК А61К 35/76. Препарат, содержащий стафилококковый бактериофаг в качестве препарата для лечения кандидо-за / Ю.В. Несвижский, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, И.М. Макеева, Е.А. Богданова, Е.А. Воропаева, С.В. Грачёв, О.С. Аляутдина, Ю.Ф. Космачёв, Е.О. Рубальский; заявители и патентообладатели ГОУ ВПО ММА им. Н.М. Сеченова Росздрава, ГОУ ВПО АГМА Росздрава, ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. - № 2008118996/15; заявл. 15.05.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 27.12.2009; Бюл. № 36.
8. Пат. № 2385945 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.САфанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, В.А. Баннов, О.М. Кострова, А.В. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, AJI. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Ю.Н. Урбан,
A.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.- № 2008151548/13; заявл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010; Бюл. № 10.
9. Пат. № 2385946 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления /
B.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.САфанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, ВА. Баннов, О.М. Кострова, А.В. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Ю.Н. Урбан, А.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.- № 2008151550/13; заявл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010; Бюл. № 10.
10. Пат. № 2443782 Российская Федерация МПК С 12Q 1/04. Способ генотипиро-вания Chlamydia trachomatis / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С.Афанасьев, Б.А. Лапин, Х.М. Галимзянов, Е.А. Воропаева, Ю.В. Несвижский, А.В. Алёшкин, О.М. Кострова, А.В. Караулов, О.В. Рубальский, Э.К. Джикидзе, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, Д.С. Афанасьев, Ю.Н. Урбан, Е.О. Рубальский; заявители и патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГОУВПО АГМА Росздрава. -№ 2010132294/10; заявл. 03.08.2010; зарег. во ФГУП «Роспатент» 27.02.2012; Бюл. № 6.
11. Пат. № 2390022 Российская Федерация МПК G01N 33/48. Способ диагностики угрозы прерывания беременности /Т.Н. Савченко, О.В. Макаров, А.З. Хашу-коева, В.А. Алёшкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Л.О. Протопопова, Н.С. Матвеевская; заявитель и патентообладатель ГОУВПО РГМУ Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию.-№ 2007146816/15; завял. 19.12.2007; зарег. во ФГУП «Роспатент» 20.05.2010; Бюл. № 14.
12. Пат. № 2394559 Российская Федерация МПК А61К 31/165. Способ установления неспецифического противоинфекционного действия иммуномодулирующего иммунобиологического препарата / В.А. Алёшкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, Э.К. Джикидзе, К.В. Симавонян, О.В. Рубальский, Е.А. Воропаева, В.Ю. Давыд-
кин, И.Ю. Давыдкин, Л.И. Холодилова, A.B. Мелихова, Т.Н. Кебу, А.Л. Байрако-ва, М.С. Афанасьев, Т.П. Егорова, Е.О. Рубальский, Т.О. Голикова, Е.А. Егорова, A.A. Куракова; заявители и патентообладатели ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, ГУ НИИ МП РАМН, ГОУВПО АГМА Рос-здрава.- № 2008102621/14; заявл. 28.01.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 20.07.2010; Бюл. № 20.
13. Пат. № 2430365 Российская Федерация МПК G01N 33/48. Способ оценки микробиоценоза полости матки у женщин с полипами эндометрия в постменопа-узальном периоде / О.В. Макаров, Т.Н. Савченко, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, Н.С. Матвеевская, О.Г. Гречишникова, Т.С. Батиян; заявитель и патентообладатель ГОУВПО РГМУ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. - № 2010120937/15; заявл. 26.05.2010; зарег. Во ФГУП «Роспатент» 27.09.2011; Бюл. № 27.
14. Пат. № 2426537 Российской Федерации МПК А61К 31/375. Способ лечения полипов цервикального канала / Т.Н. Савченко, В.А. Алёшкин, С.С. Афанасьев, Е.А. Воропаева, C.B. Камоева, О.Г. Гречишникова, О.В. Макаров, A.B. Мельников; заявители и патентообладатели ГОУ ВПО РГМУ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. - №2010118991/15; завял. 13.05.2010; зарег. Во ФГУП «Роспатент» 20.08.2011; Бюл. № 23.
Ат - антитела
БП - биологическая плёнка БЭ - буккальный эпителий ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза ВИЧ - вирус иммунодефицита человека Вл - влагалище ВПГ - вирус простого герпеса ВПЧ - вирус папилломы человека ВУИ - внутриутробная инфекция ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЖКТ - желудочно-кишечный тракт ЗСГ - задняя стенка глотки ИЕКНЭ - естественная колонизация назофарингеального эпителия ИМ - инфекционный мононуклеоз ИППП - инфекции, передаваемые половым путем
ИФА - иммуноферментный анализ КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат
КК - культура клеток КМ - культуральный метод КОЕ - колониеобразующая единица КР - колонизационная резистентность КС - антитела - комплементсвязывающие антитела
ЛЦР - лигазная цепная реакция Нг - носоглотка НГУ - негонококковый уретрит НИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции НЭ - назофарингеальный эпителий ОП - островки патогенности ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции РАМР - консервативные молекулярные структуры
ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ПИФ - прямая иммунофлуоресценция ПР - промежуточное (переходное) тельце ПЦР - полимеразная цепная реакция РИД - радиальная иммунодиффузия по Манчини РИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции РНГА - реакция непрямой гемагглютинации
Список сокращений
РНК - рибонуклеиновая кислота рРНК - рибосомальная РНК PC - респираторно-синцитиальный вирус РТ - ретикулярные тельца РСК - реакция связывания комплемента УГИ - урогенитальная инфекция УГТ - урогенитальный тракт УГХ - урогенитальный хламидиоз УЗИ - ультразвуковое исследование УПМ - условно-патогенная микрофлора Ур - уретра
ХИВЗ - хронические инфекционно-воспалительные заболевания ЦС - цервикальный секрет Цк - цервикальный канал ЦМВ - цитомегаловирус ЦОЕ - цветообразующая единица ЧБД - часто болеющие дети ЭТ - элементарные тельца CD - клеточные рецепторы DC - дендритные клетки GM-CSF - гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор IFN - а - интерферон альфа IFN-у - интерферон гамма Ig - иммуноглобулин IgA - иммуноглобулин А IgG - иммуноглобулин G IgM - иммуноглобулин М IL - интерлейкин LPS - липополисахарид МОМР - (major outer membrane protein) -основной белок наружной мембраны NK - клетки - естественные киллеры ORF - (open reading frame) -открытая рамка считывания PRR - паттерн распознающие рецепторы se - свободный секреторный компонент slgA - секреторный иммуноглобулин А TLR (Toll-like receptor) - ТоН-подобные рецепторы
TNF-a - фактор некроза опухолей альфа
Подписано в печать: 09.08.2013 Тираж: 100 экз. Заказ №969 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Воропаева, Елена Александровна, Москва
ФЕДЕРАЛЬНОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГ™ им. Г.Н. ГАБРИЧЕВСКОГО» РОСПОТРЕБНАДЗОРА
Воропаева Елена Александровна
РОЛЬ МИКРОБИОЦЕНОЗОВ ОТКРЫТЫХ ПОЛОСТЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ РЕАКТИВНОСТИ ОРГАНИЗМА; ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДИСБИОЗОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА
03.02.03 - микробиология 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология
05201351620
На правах рукописи
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Афанасьев Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор В.А. Алёшкин
Москва 2013
Оглавление
Список сокращений........................................................................6
Введение.......................................................................................9
Глава 1. Обзор литературы...............................................................28
1.1.Микробиоценозы открытых полостей............................................28
1.1.1 .Общие положения.....................................................................28
1.1 ^.Колонизационная резистентность..................................................31
1.1.3.Биоплёнк а................................................................................37
1.1.4.Показатели состояния микробиоценозов - показатели
реактивности макроорганизма.............................................................41
1.1.5.Микробиоценоз кожи..................................................................46
1.1 .б.Микробиоценоз ротоглотки..........................................................48
1.1.7.Микробиоценоз кишечника............................................................51
1.1.8.Микробиоценоз влагалища и цервикального канала...........................65
1.1.9.Микробиоценоз уретры...............................................................81
1.2.3аболевания верхних дыхательных путей у детей............................83
1.3.Патогенетические особенности микрофлоры при пародонтитах...........86
1.4.Хламидиоз ы..............................................................................87
1.4.1 .Урогенитальный хламидиоз.........................................................87
1.4.2.Патогенетическая роль Chi. pneumoniae.........................................105
1.5.Этиологическая роль уреаплазм в возникновении и развитии воспалительных процессов гениталий..............................................108
1.6.Роль микробиоценозов влагалища, кишечника и ротоглотки при невынашивании беременности........................................................117
1.7.Патогенетическая роль микроорганизмов при перитонитах............119
1.8.Роль врождённого иммунитета в инфекционной патологии..............121
1.8.1 .Характеристика рецепторов врождённого иммунитета......................121
1.8.2.Видовая специфичность TLR......................................................126
1.8.3.Экспрессия TLR на клетках и в тканях человека..............................128
1.8.4.Активация TLR........................................................................132
1.8.5.Молекулярные механизмы взаимодействия Т1Л с клетками макроорганизма..............................................................................134
1.8.6.Роль ТЫ1 в патогенезе инфекционных заболеваний и инициации местной антиинфекционной резистентности..........................................139
Глава 2. Материалы и методы исследования.....................................145
2.1.Клинико-лабораторная характеристика обследованных пациентов... 145
2.1.1. Клинико-лабораторная характеристика детей с инфекционной патологией респираторного тракта..................................................................145
2.1.2. Клинико-лабораторная характеристика больных пародонтозом......145
2.1.3. Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированной уреаплазменной инфекцией урогенитального тракта.............................146
2.1.4. Клинико-лабораторная характеристика женщин с диагностированным или перенесенным урогенитальным хламидиозом (УГХ) урогенитального
тракта.........................................................................................147
2.1.5. Клинико-лабораторная характеристика клинически здоровых женщин контрольной группы.....................................................................149
2.1 .б.Клинико-лабораторная характеристика беременных.........................150
2.1.7.Клинико-лабораторная характеристика пациентов с распространённым гнойным перитонитом....................................................................150
2.1.8. Клинико-лабораторная характеристика низших приматов с установленной спонтанной хламидийной инфекцией.................................................151
2.2. Клинико-лабораторные методы исследования...............................151
2.2.1.Микроскопическое исследование мазков со слизистых УГТ................153
2.2.2.Оценка функционального потенциала мукозальной защиты...............153
2.2.3.Микробиологические исследования..............................................153
2.2.4.Молекулярно-генетические методы исследования............................160
2.2.5.Цитологический метод диагностики хламидийной инфекции..............164
2.2.6.Серологический метод диагностики хламидийной инфекции..............165
2.2.7.Культуральный метод (диагностика хламидиоза).............................165
2.2.8.Иммунологические методы исследования.......................................165
2.2.9.Количественное определение содержания альбумина и общего белка в
слюне..........................................................................................167
2.2.10.Определение активности лизоцима в слюне..................................167
2.2.11 .Гормональные исследования.....................................................167
2.2.12.Статистическая обработка полученных данных..............................167
Глава 3. Колонизационная резистентность слизистых открытых полостей как объективный показатель реактивности организма и интегральный показатель состояния их микробиоценозов...................168
3.1. Состояние микробиоценоза ротоглотки при респираторной патологии как индикатор инфекционной резистентности детей............168
3.2.Микробиоценоз ротоглотки при бронхитах у детей.........................173
3.3.Патогенетические особенности микробного пейзажа при пародонтите.................................................................................183
3.4.Микробиоценоз влагалища при уреаплазмозе................................184
3.4.1.Диагностическая значимость изменения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным и фунгицидным препаратам...........199
3.5.Микробиоценоз влагалища и цервикального канала при урогенитальной хламидийной инфекции...........................................201
3.5.1.Колонизационная резистентность слизистых цервикального канала
как интегрирующая составляющая местного иммунитета...........................213
3.6.Микробиотопы влагалища и цервикального канала и их патогенетическая роль при уреаплазмозе и хламидиозе........................220
3.7.Состояние микробиоценозов влагалища, ротоглотки и кишечника
при невынашивании беременности...................................................228
3.7.1.Микробиоценоз влагалища.........................................................228
3.7.2.Микробиоценоз ротоглотки.........................................................239
3.7.3 .Микробиоценоз кишечника.........................................................247
3.7.4.Особенности микроэкологии влагалища, полости рта и кишечника у беременных с инфекционным, гормональным и смешанным генезом невынашивания в ранние сроки гестации..............................................255
3.7.5.Индивидуальный анализ состояния, взаимосвязи и взаимозависимости микробиоценозов влагалища, полости рта и кишечника у беременных..........261
3.8.Микробиологическая характеристика распространенного гнойного перитонита...................................................................................262
3.8.1.Микробиологическая оценка эффективности бактериофаготерапии......269
3.8.2.Островки патогенности как дополнительный критерий оценки вирулентности штаммов микроорганизмов...........................................274
Глава 4.Связь генотипических и фенотипических свойств возбудителя с клиническими проявлениями при хламидиозе обезьян.....................279
4.1.Взаимодействие факторов патогенности хламидий плазмиды и
гена IncA.....................................................................................282
4.2. Выявление чувствительности к антибиотикам.............................285
4.3.Роль генотипирования штаммов C/r. trachomatis в
прогнозировании их патогенности...................................................286
Заключение..................................................................................288
Алгоритм функционирования колонизационной резистентности слизистых открытых полостей.........................................................325
Выводы........................................................................................326
Практические рекомендации...........................................................328
Список литературы.......................................................................329
Список сокращений
Ат - антитела
БП - биологическая плёнка
БЭ - буккальный эпителий
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
Вл - влагалище
ВПГ - вирус простого герпеса
ВПЧ - вирус папилломы человека
ВУИ - внутриутробная инфекция
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ - желудочно-кишечный тракт
ЗСГ - задняя стенка глотки
ИЕКНЭ - естественная колонизация
назофарингеального эпителия
ИМ - инфекционный мононуклеоз
ИППП - инфекции, передаваемые половым путем
ИФА - иммуноферментный анализ
КИП - комплексный иммуноглобулиновый препарат
КК - культура клеток
КМ - культуральный метод
КОЕ - колониеобразующая единица
КР - колонизационная резистентность
КС - антитела - комплементсвязывающие антитела
ЛЦР - лигазная цепная реакция
Нг - носоглотка
НГУ - негонококковый уретрит
НИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции
НЭ - назофарингеальный эпителий
ОП - островки патогенности
ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции
РАМР - консервативные молекулярные структуры
ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПИФ - прямая иммунофлуоресценция
ПР - промежуточное (переходное) тельце
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РИД - радиальная иммунодиффузия по Манчини
РИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции
РИГА - реакция непрямой гемагглютинации
РНК - рибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомальная РНК
РС - респираторно-синцитиальный вирус
ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза
РТ - ретикулярные тельца
РСК - реакция связывания комплемента
УГИ - урогенитальная инфекция
УГТ - урогенитальный тракт
УГХ - урогенитальный хламидиоз
УЗИ - ультразвуковое исследование
УПМ - условно-патогенная микрофлора
Ур - уретра
ХИВЗ - хронические инфекционно- воспалительные заболевания
ЦС - цервикальный секрет
Цк - цервикальный канал
ЦМВ - цитомегаловирус
ЦОЕ - цветообразующая единица
ЧБД - часто болеющие дети
ЭТ - элементарные тельца
СО - клеточные рецепторы
ОС - дендритные клетки
вМ-СБР - гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор
IFN - a - интерферон альфа IFN - у - интерферон гамма Ig - иммуноглобулин IgA - иммуноглобулин А IgG - иммуноглобулин G IgM - иммуноглобулин М IL - интерлейкин LPS - липополисахарид
МОМР - (major outer membrane protein) - основной белок наружной мембраны
NK - клетки - естественные киллеры
ORF - (open reading frame) - открытая рамка считывания
PRR - паттерн распознающие рецепторы
sc - свободный секреторный компонент
slgA - секреторный иммуноглобулин А
TLR (Toll-like receptor) - То11-подобные рецепторы
TNF-a - фактор некроза опухолей альфа
Введение
Актуальность проблемы
Человек и окружающая среда - это единая экологическая система, находящаяся в состоянии биологического равновесия между макро- и микроорганизмами. Микрофлора человека является основой его микроэкологии и оказывает непосредственное влияние на жизнедеятельность и состояние макроорганизма. Микробиоценоз - своеобразная динамическая микроэкологическая система, способствующая созданию более или менее однородных условий для нормальной жизнедеятельности аутофлоры и выполняющая или регулирующая многочисленные функции макроорганизма. Показатели состояния микробиоценозов отражают состояние реактивности макроорганизма - способность организма отвечать на воздействия внешней среды изменением своей жизнедеятельности, что обеспечивает его адаптацию к различным условиям обитания. Кожа, респираторный, урогенитальный (УГТ) и желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), конъюнктива глаза, слизистая ротовой полости, постоянно подвергающиеся воздействию разнообразных чужеродных веществ и микроорганизмов, выполняют собственную барьерную функцию. Слизистые открытых полостей макроорганизма представляют собой единую систему. Барьерная функция этих областей определяется состоянием колонизационной резистености (КР) - способность микрофлоры и макроорганизма в кооперации защищать экосистему слизистых от патогенных микроорганизмов. КР можно рассматривать как интегрирующую составляющую местного иммунитета. Представители микрофлоры присутствуют в биотопах организма в виде фиксированных к определенным рецепторам микроколоний, заключенных в биопленку, которая, как перчатка, покрывает кожу и слизистые открытых полостей и состоит, помимо микроорганизмов, из экзополисахаридов различного состава, а также муцина [36, 43, 98, 111, 224].
Здоровье детей является главной характеристикой здоровья населения. В настоящее время сохраняется высокая распространенность болезней органов дыхания среди детей дошкольного и школьного возраста. Начало большинства бронхолегочных заболеваний связано с развитием патологических процессов в
слизистой оболочке верхних дыхательных путей и ротоглотке, которая в норме задерживает и элиминирует около 70% поступающего извне инертного и агрессивного антигенного материала. Инициация любого инфекционно-воспалительного процесса начинается с прикрепления бактерий к поверхности восприимчивой ткани организма хозяина. Зависит от соотношения уровней индигенных микроорганизмов и условно-патогенной микрофлоры (УПМ), формирующих данный биотоп [89, 211,214, 302].
При формировании патологического десневого кармана (пародонтального кармана) при пародонтите резко возрастает концентрация микроорганизмов в десневой жидкости. Десневая жидкость представляет собой транссудат, который секретеруется в области десневого желобка и практически сразу смешивается с микрофлорой слизистой десны и ротовой жидкости. Концентрация бактерий у здорового человека в десневой жидкости составляет не более 100 тыс. клеток в мл, а при развитии гингивита или парадонтита составляет десятки и сотни миллионов. Количественные и качественные нарушения в составе симбионтов, нарушения их взаимодействия с макроорганизмом имеют решающее значение в возникновении и развитии пародонтита. Вирулентность бактерий в значительной степени определяется их ферментативными свойствами, в частности, протеазной активностью - фактор патогенности. Особое место занимают бактериальные ^А1-протеазы, расщепляющие секреторный и сывороточный 1§А1 (доминирующий подкласс 1§А человека). Количественное содержание ^А1-протеазы в десневой жидкости может являться критерием развития воспалительного процесса в пародонтальной области.
Масштабность распространения сексуально-трансмиссивных инфекций продолжает оставаться актуальной во всем мире. Инфекционно-воспалительные заболевания репродуктивной сферы, несмотря на достижения современной медицины, лидируют в структуре гинекологической заболеваемости и остаются традиционно значимыми на протяжении последних лет. Урогенитальный хламидиоз (УГХ) и уреаплазмоз занимают ведущее место в структуре инфекций передаваемых половым путем. Возбудители хламидиоза
и уреаплазмоза - облигатные внутриклеточные паразиты - не относятся к патогенам, представляющим особую опасность, но на фоне растущей урбанизации, ухудшения социально-демографической и экологической ситуации инфицирование ими способно приводить к формированию различных осложнений, оказывающих неблагоприятное влияние как на общее состояние здоровья, так и на репродуктивную функцию населения [18, 54, 69, 89, 317].
Клинические варианты течения хламидийной и уреаплазменной инфекций в наибольшей степени определяются выраженностью изменений, вызываемых возбудителем в месте своей локализации. Слизистые содержат элементы биотопа (эпителиальные клетки, лейкоциты), являющиеся элементами конституциональной рецепторной системы организма, и в комплексе с другими гуморальными и клеточными факторами мукозального иммунитета определяют эффективность КР слизистых макроорганизма [9, 98, 234, 276, 394].
Среди группы возбудителей хламидийных инфекций человека, известных под общим названием «хламидиозы», особое значение для медицины представляют хламидии двух родов Chlamydia и Chlamydophila, носящие антропонозный характер: вид Chlamydia trachomatis, вызывающий различные уро-генитальные заболевания (уретрит, цервицит, эндометрит, простатит, орхит и др.), патологию беременности и родов, некоторые формы артрита, трахому, лимфогранулему венерум, патологию органов дыхания, офтальмию новорожденных, и вид Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR), являющийся респираторным возбудителем, а также играющий роль в патологии сердечнососудистой системы и головного мозга [54, 89, 227, 284, 318, 338].
Ureaplasma urealyticum - один из ведущих этиологических агентов воспалительных заболеваний женской половой сферы, приводящих к выраженным нарушениям репродуктивной функции, цервицитам, эндометритам, сальпингоофоритам, хореоамнеонитам, неонатальным инфекциям и др. Уреаплазмы распространены среди клинически здоровых
женщин. Пусковым моментом уреаплазменной инфекции является колонизация возбудителем эпителиоцитов хозяина [69, 89, 231].
Патогенетический потенциал патогенных бактерий и вирусов, хламидий и уреаплазм определяется их концентрацией в организме, нали
-
Воропаева, Елена Александровна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2013
-
ВАК 03.02.03
- Особенности микробиоценоза основных биотопов организма человека в условиях Европейского Севера России
- Биологические особенности бифидобактерий и их взаимодействие с микросимбионтами кишечной микрофлоры человека
- Современная структура кишечного микробиоценоза у детского населения Иркутской области
- Микробиоценоз кожи детей, находившихся на лечении в условиях гнотобиологической изоляции
- Микробиологические особенности дисбиоза кишечника у жителей Крайнего Севера
