Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль хламидий в спонтанной инфекционной патологии обезьян

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль хламидий в спонтанной инфекционной патологии обезьян"

На правах рукописи

Слободенюк Владимир Владимирович

РОЛЬ ХЛАМИДИЙ В СПОНТАННОЙ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ОБЕЗЬЯН

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 7010

Москва-2010

004609088

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских На> Научно-исследовательском Институте Медицинской Приматологи Российской Академии Медицинских Наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионально! образования «Российский государственный медицинский университ« Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится ^су^сЛ 2010 г. в 10 часов на заседани

диссертационного совета Д 208.046/01 в Федеральном Государственно учреждении науки "Московский научно-исследовательский инстит) эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федерально службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и блaгoпoлyч^ человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН "Московски научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии ш Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прг потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан <«^>¿££<£<^2^010 года.

Этери Капитоновна Джикидзе

Станислав Степанович Афанасьев

Сергей Юрьевич Пчелинцев

Анатолий Сергеевич Быков

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

О.Ю. Борисов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными микроорганизмами семейства Chlamydiaceae, имеют широкое распространение и в нашей стране и за рубежом (Гранитов В.М., 2002; Дмитриев Г.А., 2003; Лобзин Ю.В. с соавт., 2003). Среди возбудителей хламидийных инфекций животных и человека особое значение для медицины представляют хламидии двух родов Chlamydia и Chlamydophila: вид Chlamydia trachomatis, вызывающий уро-генитальные заболевания, патологию беременности и родов, некоторые формы артрита, трахому, лимфогранулему венерум, патологию органов дыхания, офтальмию новорожденных, и вид Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR), являющийся возбудителем респираторных заболеваний, а также играющий роль в патологии сердечно-сосудистой системы и головного мозга (Гранитов В.М., 2002; Козлова В.И. с соавт., 2003; Anttila Т. et al., 2001; Gaydos С.А., 2001). В связи с чем, в настоящее время проводится детальное изучение жизненного цикла хламидий, фенотипических признаков, особенностей структуры генома штаммов хламидий, а также их филогенетической связи (Carlson J.H. et al., 2008; Fryer R.H. et al., 1997; Suchland R.J. et al. 2000). Востребованным становится использование обезьян, по своим характеристикам близким к организму человека, для экспериментального изучения хламидиоза. Известны работы по экспериментальному заражению обезьян хламидиями, выделенными от человека; доказана высокая восприимчивость данных животных к хламидиям (Mahony J. В. et al., 1993; Wesley С. Van Voorhis et al., 1997). Выявление особенностей течения, распространения хламидийной инфекции в популяции обезьян, роли Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в патологии урогенитально-го тракта и органов дыхания, унификация методов детекции и идентификации возбудителей, изучение фенотипических признаков, филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae штаммов хламидий, выделенных от обезьян, представляют собой научный интерес и могут служить теоретической и практической базой для понимания патогенеза клинических проявлений и совершенствования диагностики хламидийной инфекции у обезьян и человека.

Цель исследования

Определение роли Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в спонтанной инфекционной патологии обезьян и установление их филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae штаммов, вызывающих патологический процесс у обезьян.

Задачи исследования

1. Определить естественное распространение Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae у низших обезьян разных видов с патологией урогениталь-ного тракта, органов дыхания и органов зрения.

2. Разработать способ мультиплексной ПЦР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмид-ных штаммов вида Chlamydia trachomatis.

3. Выделить штаммы хламидий от обезьян и изучить их фенотипические особенности в культуре клеток.

4. Провести молекулярно-генетическое генотипирование штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от обезьян, методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа.

5. Провести молекулярно-генетическое исследование детерминант антибиоти-корезистентности методом ПЦР штаммов хламидий, выделенных от обезьян.

6. Провести молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий, выделенных от обезьян, для установления их филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae.

Научная новизна

Выявлено естественное инфицирование штаммами Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae низших обезьян разных видов с патологией органов репродуктивного тракта, органов дыхания и органов зрения.

Впервые разработан способ мультиплексной ПЦР диагностики хлами-дийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis.

Впервые изучены фенотипические особенности штаммов Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян при культивировании их в культуре клеток.

Методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа впервые выявлена принадлежность к генотипам штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от обезьян, что позволяет определить патогенетический потенциал течения хламидиоза.

Впервые проведено молекулярно-генетическое исследование детерминант антибиотикорезистентности штаммов Chi.pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, что позволяет конкретизировать схему лечения хламидиоза.

Впервые установлено филогенетическое положение штаммов Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, в семействе Chlamydiaceae, а также родство данных изолятов с подобными штаммами, выделенными от человека, в сопоставимости со штаммами, нуклеотидные последовательности которых представлены в электронной базе данных GenBank.

Практическая значимость

Предложены модифицированные лабораторные методы (цитологический, серологический, культуральный, молекулярно-генетический, биоинформационный анализ) для комплексной оценки инфекционного процесса при спонтанном хламидиозе обезьян. Спонтанная хламидийная инфекция низших обезьян может рассматриваться как лабораторная модель, перспективная для совершенствования верификации возбудителя, лечебных и профилактических схем лечения.

На разработаный способ мультиплексной ПЦР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis, получен Патент РФ «Способ

диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946, зарегистрирован 10.04.2010, и Патент РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945, зарегистрирован 10.04.2010.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследований и разработок внедрены в научных подразделениях Научно-исследовательского института медицинской приматологии Российской академии медицинских наук и используются в научной работе лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказана эпизоотологическая значимость хламидиозов в спонтанной инфекционной патологии низших обезьян.

2. Впервые выявлена связь генотипических и фенотипических свойств возбудителей хламидиозов с патогенетическими механизмами и особенностями клинического течения хламидийной инфекции у низших обезьян.

3. Установлено филогенетическое положение штаммов хламидий, выделенных от обезьян, в семействе Chlamydiaceae и подтверждено их родство со штаммами, выделенными от человека.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета НИИ Медицинской приматологии РАМН, протокол № 4 от 17 марта 2010 г.

Результаты исследований доложены на Научно-практической конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.); XV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008 г.); XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009 г.); XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010 г.); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.); II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29-31 марта 2010 г.), The 3rd Congress of European Microbiologists "Microbes and Man - interdependence and future challenges" (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2,2009).

Связь темы исследования с планом научной работы учреждения

Данное исследование представляет собой раздел темы НИР НИИ Медицинской приматологии РАМН «Изучение распространенности и критериев диагностики патологии мертворожденных и новорожденных обезьян, обусловленных хламидиями и микоплазмами». Per. № 0120.0 801826.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 - в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации; 1 - в периодическом издании; 8 - в сборниках материалов конференций; два патента на изобретение РФ № 2385945 от 10.04.2010 и № 2385946 от 10.04.2010.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы исследования, главы результаты собственных исследований (состоит из трех подразделов), обсуждения полученных результатов и выводов. Список литературы включает 192 источника, из которых 49 опубликовано в отечественной и 143 в зарубежной литературе. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Проведено клинико - лабораторное обследование 269 обезьян на базе Адлерского питомника обезьян НИИ Медицинской приматологии РАМН за период 2006-2009 гг. на установление возможности распространения хламидийной спонтанной инфекционной патологии.

Объектом исследования служили низшие обезьяны обоего пола, разного вида и возраста (от 0 дней до 27 лет): африканские обезьяны - павианы гамадрилы, павианы анубисы, зеленые мартышки, африканский макак магот; азиатские - макаки яванские, макаки резусы, макаки лапундеры; южноамериканская широконосая обезьяна - капуцин белоплечий. Обезьяны были разделены на группы: группу I составили 114 клинически здоровых обезьян (без клинических проявлений хламидийной патологии); группу II составили 48 больных животных с хламидийной патологией (УГТ, глаз) с выраженной клиникой течения заболевания (аборты, эндометриты, цервициты, у самцов - уретриты, конъюнктивиты и кератоконъюнктивиты, угнетённое состояние или повышенная возбудимость); группу III составили 45 больных животных с хламидийной патологией (УГТ и органов дыхания) без выраженной клиники заболевания (в анамнезе отмечались выкидыши, бесплодие, острые случаи клинических проявлений); группу IV составили 62 погибших взрослых животные и детеныши с различной хламидийной патологией. Все обезьяны принадлежат к 4-5 поколению, родившихся в питомнике, содержатся в вольерах и клетках с центральным отоплением и водоснабжением, получают сбалансированный корм.

Образцы клинического материала. Клиническим материалом от живых животных служили мазки-соскобы из цервикального канала и уретры у самок и уретры у самцов, с конъюнктивы глаза. Для выделения возбудителя в культуре клеток, соскобный материал помещали в транспортную среду (Метельская В.А. и др., 2008; Савичева A.M. и др., 2004). Для молекулярно-генетических исследований содержимое зондов тщательно суспендировали в забуференном физиологическом растворе. Для серологических исследований кровь брали венепункцией, натощак. Доставка материала осуществлялась в лабораторию в течение 1-2-х часов. Образцы цельной крови инкубировали 1 час при температуре

37 °С, затем центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Сыворотку переносили в отдельную пробирку и хранили при минус 20 °С не более двух недель. От погибших животных материалом исследования служили соскобы из УГТ, задней стенке глотки, паренхиматозные органы (легкое, печень, селезенка, почка), от детенышей использовали мазки-соскобы из задней стенки глотки, конъюнктивы глаз и паренхиматозные органы. Материал также помещался в транспортную среду (для исследования в культуре клеток) или в забуференный физиологический раствор в пробирки типа "Эппендорф" (для молекулярно-генетических исследований).

Штаммы микроорганизмов. В качестве положительных контрольных образцов выступали референс штаммы Chlamydophila pneumoniae - «В» и Chlamydia trachomatis - «Бурхан», полученные из Государственной Коллекции Вирусов (ГКВ) ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Штаммы Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae, полученные от обезьян сохранялись в жидком азоте для дальнейшего изучения свойств.

Используемые культуры клеток, среды. Забуференный физиологический раствор 10-кратный: 9 частей 1,5 М NaCI и 1 часть 1,5 М фосфатного буфера. 1,5 М NaCI: 87,7 г NaCI в 1 л раствора; 1,5 М фосфатный буфер: 29,6 мл раствора КН 2Р04 (90,73 г/л), 70,4 мл раствора Na2HP04 -2Н 20 (118,7 г/л), рН 7,27,4.

Сахарозо-фосфатный буфер: сахароза - 68,46 г, К2НР04 - 2,088 г, КН2Р04-1,088 г, дистиллированная вода- 1 литр; рН 7,0-7,2.

В качестве транспортной среды использовали сахарозо-фосфатный буфер, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицин 20 мкг/мл, ванкомицин 100 мкг/мл, амфотерицин В 2 мкг/мл (среда готовилась в лаборатории).

Среда для формирования монослоя культуры клеток: среда DMEM с глю-тамином и с 25 мМ HEPES, 10% эмбриональной телячьей сыворотки от общего объема, гентамицин 20 мкг/мл.

В качестве изолирующей среды хламидий в культуре клеток применялась среда DMEM с глютамином и с 25 мМ HEPES, 10% эмбриональной телячьей сыворотки от общего объема и 40% раствор глюкозы (1,25 мл на 100 мл среды), в качестве цитостатика использовали циклогексимид (2,0 мкг/мл).

В работе использовались 3 перевиваемые клеточные линии McCoy, Vero, Hela, полученные из музея культур клеток Института цитологии Российской Академии Наук (г. Санкт-Петербург).

Цитологический метод. Забранный материал из УГТ, задней стенки глотки, с конъюнктивы в виде мазков-соскобов, а также мазков-отпечатков органов от павших животных наносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали на воздухе и фиксировали не менее 15-ти минут в 96° этиловом спирте для последующей окраски и микроскопии. Окраску мазков проводили по Романов-скому-Гимзе и раствором Люголя, согласно общепринятой методике (Метель-ская В.А. и др., 2008; Савичева A.M. и др., 2004). Учет результатов осуществляли на световом микроскопе «Микмед 5» при увеличениях хЮО, х400, хЮОО. Проводили также окрашивание меченными моноклональными антителами

(тест-система CeLLabs, Австралия) для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в реакции ПИФ (для Ch. trachomatis) и НИФ (для Chi. pneumoniae). Учет результатов осуществляли на люминесцентном микроскопе «Micros» (Австрия) при увеличении хбОО. Хламидии в препаратах выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет.

Серологический метод. Выявление антител к Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae осуществляли в сыворотке крови обезьян методом ИФА. Образцы цельной крови инкубировали 1 час при температуре 37 °С, затем центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин. Сыворотку переносили в отдельную пробирку и хранили при минус 20 °С не более двух недель. IgM-AT, IgA-AT и IgG-AT к Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae определялись с использованием тест-систем производства НПО «Диагностические системы» (Н. Новгород) в соответствии с инструкциями по применению, прилагаемых производителем.

Культуральный метод. Соскобным материалом, полученным из УГТ, ино-кулировали суточную культуру клеток McCoy, выращенную на покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшет (Метельская В.А. и др., 2008; Савичева A.M. и др., 2004). Центрифугирование после инокуляции проводили при 1000 об/мин в течение 1 часа. Контроль развития хламидийной инфекции осуществляли путем микроскопирования клеток в инвертированном микроскопе «JIOMO» (Россия). Покровные стекла окрашивали по Романовско-му-Гимзе, раствором Люголя или меченными моноклональными антителами для выявления антигенов хламидий в реакции ПИФ и НИФ (тест-система CeLLabs, Австралия). Титрование хламидий осуществляли стандартным методом по цитопатическому действию (Павлович С.А. 2008).

Молекулярно-генетические методы. В работе использовали основной мо-лекулярно-генетический метод - ПЦР. Экстракцию ДНК проводили с помощью набора для выделения ДНК из мазков и соскобов «ДНК-сорб-АМ» (НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, регистрационное удостоверение №ФСР 2007/00183). Для ПЦР амплификации ДНК Ch. trachomatis использовали набор реагентов «АмплиСенс Chlamydia trachoma!is-EPh» (НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва, регистрационное удостоверение №ФСР 2007/00683). Анализ продуктов амплификации проводили разделением фрагментов ДНК в 2% агарозном геле. Все этапы выполнялись согласно инструкции производителя.

Для видовой мультиплексной детекции и идентификации CA. trachomatis и Chi. pneumoniae впервые применены подобранные оригинальные универсальные праймеры на фрагмент гена 16S рРНК: для Chlamydia trachomatis - Ctr: 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3', для Chlamydophila pneumoniae Cpn: 5'-CGGAATAACGACTTGAGTTG - 3', общий реверс праймер для обоих видов R: 5'-CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3'. Размер продукта амплифицируемого фрагмента гена 16S рРНК для Chi. pneumoniae - 440 пар нуклеотидов, для Ch. trachomatis - 334 пары нуклеотидов. Для детекции штаммов Ch. trachomatis, несущих плазмиду и свободных от нее, была впервые предложена следующая

оригинальная комбинация праймеров: Ctr. 5'-TGCCGGTATGTGGGCAACC-3' и R: 5'- CTCGTTTACCTGGGACGCAC-3' для амплификации фрагмента^ рРНК гена (334 пары нуклеотидов); PLf: 5'-TTCGAGGCGAGTAACGAAGA-3' и PLr: 5'-AAGCAACGCGCGCGATAGGT-3' для амплификации участка криптической плазмиды Ch. trachomatis (241 пара нуклеотидов).

Молекулярно-генетическое типирование штаммов Ch. trachomatis осуществляли методом ПЦР-ПДРФ (Koskela P. et al., 2000). Для ПДРФ-анализа наработанных в результате амплификации фрагментов использовали рестриктазы TaqI, Alul и PvuII. Расщепление ДНК проводили в буферах для рестрикции

Таблица 1. Предлагаемые оригинальные праймеры для генотипирования штаммов Chlamydia trachomatis.

Генотипы Олигонутслсотидные праймеры Размер прод\тста

Группа генотипов В (генотипы: В, Ва, О, Оа, Е, 11, 1.2, Ц») BGrl f 5'-GCTTAATCAATCTGGCTGTTGA-3' BGrl т 5'-TCCAGACTTGTGGATAGTAAAC-3' 191 п.н.

Гр>тта генотипов С (генотипы: А, С, Н, I, Jа, 1. К и ЬЗ) С Gr fS'-AACTAAGTGGGCTTATTAGGAAO' С Gr r 5-TCAAGTAGAGAGCTAGACCA-3' 107 п.н.

промежуточная группа (генотипы: Р, С, Оа) FI 5'-CTGGGATGGAACTGTATACA-3' RI 5'-TACAACTCAGGGTAGGTCAA-3' 274 п.н.

Генотип С Comp f 5'-AAGGAAGTGTGGGATCTGACG-3' Comp г 5'-AAATATACAATGATTAGCACC-3' 221 пн.

Генотип £ Eomp f 5'-AGACGGArACCGCCITATCTTG-3' Eomp г y-CTGGCTTGCCACTCAGGCTAAT-S' 265 H.H.

Генотип 1 Jomp f5'-ATATTTTGCCTAAGACTGCT-3' Jomp г 5'-TTTAGGGTTAGATAGAGAAT-3' 152 п.н.

Генотип Jaomp f 5'-TAGTGTCGGCGACGTAGCAG-3' Jaomp r 5'-TCCTAGATATTTAATGCCAT-3' 135 п.н.

Генотип Н Fh 5'-ATCTTCTGAGTATAATACAOC-3' Rh S'-ACGTTACGTTTAAATTGAGCA^' 177 п.н.

Генотип р Ff 5'-ACGAAACGTGCTGCAAATA-3' Rf5'- TAGCCAATCATTGTAAACA-3' 321 п.н.

Генотип О Domp f 5'-ATAATGAGAATCTAAAGACG-3' Domp г 5'-TAGAATGAGCATATTGGCAA-3' 174 п.н.

Генотип К Komp f 5'-TGTTCTTAACACAGCTTTGGA-3' Komp г J'-AGGTATAGATTGAGCGTATTGG-З' 150 п.н.

Генотип в Comp f 5'-AGAGTAGTCGCAGCGAAC-3' Gomp r 5'-ACTGTAACGGCGTATGTG-3' 146 п.н.

Генотип А Aomp f 5'-AATACAGTATTCTGGCTTAGAT-3' Aomp r 5'-TGACTGAATGCAGGGTTGGGA-3' 57 п,н.

Генотип В Bomp f 5'-AGTTCGAGAGTATCTTTGATGTT-3' Bomp г 5'-TCTGCGCTAGTTATCATTATCG-3' 75 п.н.

согласно инструкции для каждого фермента («Fermentas»). Данные ПДРФ-анализа в последующем сравнивали с результатами компьютерного анализа НП гена отрА штаммов Ch. trachomatis разных генотипов, представленных в NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Типирование штаммов Ch. trachomatis осуществляли также с помощью ПЦР, применяя специфические сконструированные оригинальные олигонукле-отидные праймеры, ориентированные к вариабельным участкам VS1-VS4 гена отрА Ch. trachomatis (табл. 1). Первоначально проводили амплификацию с использованием специфических праймеров к группам генотипов, далее с использованием специфических праймеров к определенному генотипу группы.

Анализ антибиотикорезистентности штаммов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae проводили с помощью ПЦР с использованием подобранных ориги-

нальных праймеров с целью выявления генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (егш): Tet-f: 5-AGYTTCCACCGAAYTCCTTTC-3' и Tet-r: : 5-ATACACCGAGCAGGGATTTC-3' (размер продукта амплификации 470 пар нуклеотидов); Erm-f: 5-AAGCCAYTGCGTCTGACATC-3' и Erm-r: 5'-TGGCGTGTTTCATTGCTTGA-3' (размер продукта амплификации 300 пар нуклеотидов).

Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании. Конструирование олигонуклеотидных праймеров проводили с применением биоинформационного анализа комплексом компьютерных программ: Vector NTI Advance 9.0 (PC) (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home.html), DNASTAR, BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/), и данные электронной базы NCBI Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/).

Установление филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae штаммов хламидий и построение филогенетических деревьев проводили в программе MEGA 4.1, методом Neighbor Joining (объединения ближайших соседей), модель p-distance с выполнением Bootstrap Test of Phylogeny (1000 повторов) и методом Maximum Parsimony (Tamura К. et al., 2007). Степень гомологии последовательностей исследуемых штаммов с разными видами хламидий, опубликованными в NCBI GenBank, проводили в программе BLAST. Оценку эволюционного расхождения между последовательностями и стандартную ошибку (s) проводили с применением программы MEGA 4.1.

Секвенирование штаммов хламидий. Исследовались штаммы хламидий, выделенные из ЦК обезьян (бесплазмидный вариант Ch. trachomatis-NPL, носитель плазмиды Ch. trachomaíis-PL), выделенный из легких обезьяны Chi. pneumoniae-PN, из ЦК женщины носитель плазмиды Ch. trachomatis-PL2, из ротоглотки человека Chi. pneumoniae-YNl. Референс штаммы Chi. pneumoniae-B и Ch. trachomatis-Ъущш (Ch. trachomatis-PL3).

Для амплификации срединного рибосомального участка генов 16S - 23S рРНК (включая домен I) и секвенирования в работе были использованы сконструированные олигонуклеотидные праймеры (Everett К. D. et al., 1997). Размер продуктов амплификации с праймерами 16SF2 и 23R, IGSIGF и 23R составляли 602 и 276 пар нуклеотидов соответственно.

Определение НП фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и набора реагентов для секвенирования BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США), согласно рекомендациям производителя.

Морфологический, культуральный, иммуноцитологический, молекуляр-но-генетические методы исследования проводились на лабораторной базе ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Молекулярно-генетическое типирование штаммов хламидий проводилось на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г.Оболенск, Московской области). Иммунологические методы определения специфических противохламидийных антител в сыворотке крови в динамике

(метод парных образцов) проводились на базе лаборатории инфекционной патологии НИИ Медицинской приматологии РАМН.

Статистическая обработка полученных данных.

Математическую обработку полученных данных проводили в рамках базовой статистики с использованием метода %2, среднего арифметического значения и стандартной ошибки (М±ш), коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs >0,7 связь считали сильной; при 0,5<rs<0,7 связь являлась средней; при rs <0,5 связь считали слабой; при rs=0 - линейная связь отсутствует), применяя пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Установление естественного инфицирования хламидиями обезьян. При исследовании обезьян I-III групп применялись все четыре метода: ПЦР, ИФА, КМ и ЦМ (с различными методами окраски). Обследование животных группы IV проведено тремя методами диагностики: ПЦР, КМ и ЦМ. При комплексном обследовании животных I группы не выявлено инфицирования Ch. trachomatis и Chi. pneumonia. В группе II из 48 обезьян 42 особи были с выраженными клиническими признаками заболевания. Ch. trachomatis выделена в культуре клеток у 48 особей. У 36 из них хламидиоз подтвержден одновременно тремя методами (ПЦР+ИФА+цитология), у 12 обезьян - двумя методами (ПЦР+ИФА). Таким образом, совпадение результатов КМ с другими методами составило: с ПЦР-100%, с ИФА- 100%, с цитологическими исследованиями-75%, совпадение результатов ПЦР с ИФА - 100%, с ЦМ - 75%; совпадение результатов ИФА с ЦМ - 75%. Процент выявляемое™ по КМ, ПЦР и ИФА составил 100%, по цитологии 75% (табл. 2, 3, рис.1). Коэффициент корреляции (г) между выраженной клиникой заболевания урогенитального тракта и результатами культурального исследования составил 1,0, ПЦР- 1,0, ИФА- 1,0, цитологического исследования- 0,74. В группе III у 25 животных в анамнезе выявлялись хронические заболевания УГТ, а у 20- хроническиие заболевания органов дыхания. При заболеваниях УГТ Ch. trachomatis выделена в КК у 12 обезьян с подтверждением только ПЦР. У 8 обезьян были положительные результаты по ПЦР и ИФА, у 5 животных положительный результат - только по ПЦР. Из 20 животных с заболеваниями органов дыхания у 19 приматов хламидиоз верифицировался только по ИФА, при отрицательных результатах других методов обследования, причем у 8 из них, специфические AT регистрировались к Ch. trachomatis, у 4 обезьян - одновременно к Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae и у 7 обезьян - AT только к Chi. pneumoniae. У одной обезьяны был положительный результат по ИФА к Chi. pneumoniae и Ch.trachomatis, а также положительная ПЦР и КМ к Ch. trachomatis из носоглотки. У данной группы животных Chi. pneumoniae не была верифицирована в КК и с помощью ПЦР. В результате анализа процента выявляемое™ хламидиозов примененными методами показано, что совпадение результатов КМ с ПЦР и ИФА составило 29%, с ЦМ совпадений не было; совпадение результатов ПЦР с ИФА - 18%, с ЦМ - 0%, совпадение результатов ИФА с ЦМ - 0%. Процент выявляемое™ по КМ составил

29%, по ПЦР- 58%, по ИФА- 62%, по цитологическому исследованию- 0% (табл. 2, рис.1). Коэффициент корреляции (г) между проявлениями

Таблица 2. Показатели лабораторных тестов при острой и хронической хлами-дийной инфекции у приматов (93 особи).

Группы Вид хламидии Выявляемость (%)

Культуральный метод ПЦР ИФА Цитология

Клиническая форма Количество приматов Всего Совпадение (%)

ПЦР ИФА Цитология

Острая 48 36 Ch.trachomatis 100 100 100 75 100 100 75

12 0 0

Хроническая 45 12 Ch.trachomatis 29 29 0 0 58 42 0

8 20

1* Ch.trachomatis Chi. pneumoniae

5 Ch.trachomatis 0 0 0 0

19 8 Ch.trachomatis 0 0 0 0 20

7 Chi. pneumoniae

4 Ch.trachomatis Chi pneumoniae

Примечания: *- у данной обезьяны Chlamydophilapneumoniae выявлялась только ИФА; Chlamydia trachomatis - ИФА, ПЦР, культуральный метод из носоглотки.

хронического течения инфекции и результатами КМ исследования составил 0,54, результатами ПЦР- 0,92, результатами ИФА- 0,65.

Таблица 3. Выраженность корреляционной связи показателей лабораторных методов с выраженностью течения хламидийной инфекции (93 особи)._

Группы Лабораторные методы обследования

Количество наблюдаемых Клиническая форма Культуральный метод ПЦР ИФА Цитология

48 Острая Сильная Сильная Сильная ^А-АТ -слабая; ^в-АТ - средняя; 1[>М-АТ - слабая Сильная

45 Хроническая Средняя Сильная Средняя 10А-АТ -отсутствует; ^в-АТ - отсутствует; 1^М-АТ - отсутствует Отсутствует

Примечания: при г5>0,7 связь считали сильной; при 0,5< г3 <0,7 связь являлась средней; при г5 <0,5 связь считали слабой; если г3=0 - линейная связь отсутствует.

Таким образом, у приматов при выраженной клинике хламидиоза наблюдается наиболее сильная корреляционная связь клинических симптомов с КМ, ПЦР и ИФА (г=1), умеренная с цитологическим методом исследования (г=0,74). При хроническом течении заболевания у приматов корреляционная связь признаков инфекции с КМ умеренная (г=0,54), с ПЦР сильная (г=0,92), с ИФА уме-

ренная (г=0,65), с цитологическим исследованием отсутствует (г=0). При диагностике хламидиоза с острым и хроническим течением инфекционного процесса в одинаковом проценте случаев выявлялись положительные результаты в КМ, ПЦР, ИФА и ЦМ.

100 100 100

Острый Хроническим хламвдиоз ыамндтн

Рис. 1. Частота (процент) выявляемое™ положительных показателей лабораторных методов диагностики хламидиоза у приматов.

При остром течении инфекционного процесса сильная корреляционная связь клиники выявляется с КМ, ПЦР, ИФА и ЦМ. При хроническом течении сильная связь выявляется с ПЦР (показатели совпадают с таковыми при остром процессе), средняя с КМ и ИФА (показатели ниже таковых при остром процессе), с ЦМ связи не было. Чем более выраженная клиническая картина течения хламидийной инфекции, тем чаще положительные результаты регистрируются в комбинации ИФА+ПЦР + КМ + ЦМ. При течении хламидийной инфекции без выраженной симптоматики наибольший процент положительных результатов даёт ПЦР и ИФА.

При обследовании павших животных группы IV установлено, что одновременной постановкой ПЦР и КМ возбудители хламидиозов верифицируются в 100% случаев. Из 13 обследованных павших взрослых животных с патологией органов дыхания у 4 (30,7%) обезьян из тканей легких была выделена Ch. trachomatis, причем у 2 (50%) из них выделена Ch. trachomatis в комплексе с Chi. pneumoniae, а у 3 (23%) животных обнаружен монопневмохламидиоз, обусловленный видом Chi. pneumoniae. Ch. trachomatis была верифицирована в плаценте у 3 (23%) самок при патологических родах. У 10 (7,7%) особей определяются Ch. trachomatis в предстательной железе, прямой кишке, в головном мозге (при менингите), что свидетельствует об организменном распространении инфекции клетками лимфоидной ткани из первичного очага поражения. Из 49 обследованных новорожденных и детенышей обезьян численность инфицированных составила 18 (36,7%) особей: мертворождение- 5 (28%), травма черепной коробки- 1 (5%), отек головного мозга- 1 (5%), пневмония- 3 (17%), пневмопатия-3 (17%), гипотрофия- 5 (28%). У 8 (44%) детенышей присутствует микст хла-мидийная инфекция (одновременно верифицируются Ch. trachomatis, и Chi. pneumonia), причем возбудители обнаруживаются не только в лёгких (пневмония, пневмопатия), но и в печени, селезенке, почках. У 8 (44%) детенышей ре-

гистрировалась монохламидийная инфекция, вызванная Ch. trachomatis и у 2 (11%) обезьян - видом Chi. pneumoniae, регистрирующийся во всех случаях преимущественно при патологии органов дыхания, в то время как Ch. trachomatis являлся причиной гипотрофии и мертворождения.

Детекция Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в органах различных систем у детенышей обезьян может свидетельствовать о системном инфицировании как при внутриутробном развитии в организме матери, так и при жизни, что подтверждает экспериментальные данные литературы по инфицированию животных хламидиями (Yang Z.-P., et al. 1993; 1995;1994). Таким образом, установлена естественная распространенность и роль хламидийной инфекции в спонтанной патологии УГТ, органов дыхания, зрения низших взрослых обезьян и роль в патологии и гибели детенышей.

2. Совершенствование методов верификации хламидий у обезьян. 2.1. Молекулярно-генетический анализ

Для видовой одновременной мультиплексной детекции и идентификации Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis впервые подобраны оригинальные, универсальные праймеры для диагностической тест-системы на фрагмент гена 16S рРНК. Для детекции штаммов Ch. trachomatis, несущих плазмиду и свободных от нее, была впервые предложена оригинальная комбинация праймеров, позволяющая осуществлять детекцию как свободных от плазмиды штаммов Ch. trachomatis, так и плазмидосодержащих штаммов, что повышает процент выявляемое™ возбудителя, исключая ложноотрицательные результаты при использовании коммерческих тест-систем.

Изучение диагностаческой эффективности разработанных тест-систем проводили на 21 штаммах Ch. trachomatis и 15 штаммах Chi. pneumoniae, верифицированных в мазках-соскобах, а также в КК McCoy общепринятыми способами. При видовой верификации 15 штаммов праймерами для видовой верификации только 5 штаммов были подтверждены как Chi. pneumoniae (рис. 2). Пять штаммов, полученных от обезьян, были верифицированы как смесь двух возбудителей Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, что указывало на микст-инфекцию. Пять штаммов были подтверждены как Ch. trachomatis, что говорит о наличии перекреста при выявлении хламидий меченными моноклональными антителами для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae. При ПЦР-детекции референс штаммов Chlamydophila pneumoniae - «В» и Chlamydia trachomatis ~ «Бурхан» неспецифических продуктов не наблюдалось, амплификация проходила только с наработкой специфических фрагментов. При верификации плаз-мид у 21 штаммов Ch. trachomatis установлено наличие носительства критической плазмиды у 10 (47,6%) штаммов. Остальные 11 (52,4%) штаммов были бесплазмидными (рис. 3). Штаммы Ch. trachomatis, полученные от обезьян с микст-пневмохламидиозом, также характеризовались как носители плазмиды. Это подтверждалось исследованиями с помощью коммерческого ПЦР-набора «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-EPh».

Бесплазмидные штаммы не детектаровались набором «АмплиСенс Chlamydia trachomatis-EPh» ввиду того, что основой данной системы являются

праймеры, ориентированные к участку ДНК криптической плазмиды, что подтверждается предлагаемым оригинальным набором по детекции бесплазмид-ных штаммов, повышая тем самым процент диагностики хламидиоза (х2=13,5; р<0,001).

Рис. 3. Детекция бесплазмидных и плазми-досодержащих штаммов Ch. trachomatis. Примечания: М - маркер длин фрагментов от 100 до 1000 пар нуклеотидов (размер 100 п.н. на рисунке не просматривается); 1, 2, 3, 5 - плазмидосодержащие штаммы Chlamydia trachomatis; 4, 6 - бесплазмидные штаммы Chlamydia trachomatis; Kl - - отрицательный контроль проведения реакции, К2+ - положительный контроль (референс штамм Chlamydia trachomatis -«Бурхан»),

Рис. 2. Мультиплексная детекция и идентификация штаммов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae.

Примечания: М - маркер длин фрагментов от 100 до 1000 пар нуклеотидов (размер 100 п.н. на рисунке не просматривается); 1, 2, 4 - смесь штаммов обоих видов Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae (микст - инфекция); 3, 5, 6 - штаммы Chlamydia trachomatis (моноинфекция); ); KF1 - положительный контроль (Chlamydophila pneumoniae - «В»); KF2 - положительный контроль (Chlamydia trachomatis - «Бурхан»); К- - отрицательный контроль.

Таким образом, созданные тест-системы мультиплексной ПЦР-детекции возбудителей хламидиозов обезьян позволяют одновременно верифицировать возбудителей у обезьян (в большем проценте случаев по сравнению с коммерческими ПЦР-тест-системами) и осуществлять дифференциацию хламидий, оценивать их вирулентность (определение носительства плазмиды). У приматов более чем в половине случаев (54%) обнаруживаются бесплазмидные штаммы Ch. trachomatis. Предлагаемые ПЦР-тест-системы могут применяться для прямой детекции Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis в образцах клинического материала и в КК.

2.2. Повышение диагностической значимости культурального метода.

Выделение хламидий в КК позволяет оценить жизнеспособность возбудителя, фенотипическую характеристику и вирулентность штаммов, охарактеризовать особенности роста хламидий с образованием множественных хлами-дийных включений, либо одного общего (характеризует экспрессию белка IncA, играющего роль в росте и развитии, Suchland R.J., et al., 2000), оценить метаболизм и уровень аккумуляции гликогена в хламидийных включениях Ch. trachomatis, напрямую связанных с носительством криптической плазмиды.

Для оптимизации алгоритма постановки, а также повышения информативности КМ культивирование проводилось с использованием трех клеточных линий McCoy, Vero, Heia. Сопоставляли среду Игла с солями Хэнкса и глутами-ном, среду RPMI-1640 с глутамином, среду DMEM с глутамином и с 25 мМ HEPES. При формировании монослоя использовали 24-луночные планшеты с покровными стеклами, пластиковые плоскодонные пробирки с покровными стеклами или стеклянные пенициллиновые флаконы с покровными стеклами.

С использованием КМ изучили 31 штамм хламидий, выделенных от обезьян (26 штаммов Ch. trachomatis и 5 штаммов Chi. pneumoniae). Идентификацию хламидий в КК проводили с помощью различных методов окраски (рис. 4, 5, 6).

' К S JK^I

Рис. 4. Окраска по Романовскому - Гимзе хламидийных включений в КК McCoy (В и С).

Примечания: хламидийные включения на фрагментах рис. 4 В и С отмечены стрелочками.

Рис. 5. Окраска раствором Люголя гликогена хламидийных включений Chlamydia trachomatis в КК McCoy.

Примечания: хламидийные включения в КК отмечены стрелочками.

Рис. 6. Окраска меченными моноклональны-ми антителами хламидийных включений в КК McCoy.

Примечания: хламидийные включения в КК отмечены стрелочкой.

При титровании хламидий за инфицирующий титр принимали наивысшее разведение, при котором в 50% клеток McCoy (или Vero, или Heia) выявлялся характерный цитопатический эффект с образованием хламидийных включений.

Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов при окраске различными методами, с целью повышения информативности КМ, применяли дополнительно разработанные мультиплексные ПЦР-тест-системы для видовой верификации Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, а также для верификации плазмид у штаммов Ch. trachomatis.

В культуре клеток McCoy штаммы хламидий вызывали изменения с образованием выраженных специфических включений, в то время как в культуре Vero и Heia цитопатический эффект был невыраженным или отсутствовал. Лучшей для культивирования оказалась среда DMEM с глутамином и HEPES вследствие содержания 25 мМоль HEPES и бикарбоната натрия, обеспечивающих более высокую буферную емкость для поддержания необходимого pH длительное время. Значимых различий при культивировании в разных емкостях выявлено не было. Подобран оптимальный режим центрифугирования (1000 об/мин в течение 1 часа), при котором повышается процент инфицирования культуры. Титры Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в зависимости от штамма колебались от 2,0 до 5,5 lg ТЦД50/мл.

Применение окраски по Романовскому-Гимзе выявило цитоплазматиче-ские включения в 24 (77,4%) случаях из 31. При окраске раствором Люголя детектировали 16 (61,5%) штаммов Ch. trachomatis из 26. У штаммов СМ. pneumoniae гликогенобразующая активность отсутствует. Идентификация хламидий меченными моноклональными антителами показала неоднозначный результат. При окраске штаммов хламидий наблюдалась перекрестная реакция монокло-нальных антител у 3 штаммов Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae. Применение системы видовой детекции и системы детекции плазмиды методом ПЦР помогло установить наличие перекрестной реакции, в результате применения моно-клональных антител, а также точно определить видовую принадлежность хламидий. Отмечено, что бесплазмидные варианты хламидий выявлялись в куль-

туре клеток в стабильно низких титрах - 2,0 - 3,4 lg ТЦД5о/мл, а плазмидные в титрах 3,4 - 5,5 lg ТЦД50/МЛ.

При культивировании штаммов Ch. trachomatis в КК McCoy и при окраске моноклональными антителами были выявлены множественные внутриклеточные хламидийные включения у 11 (42,3%) из 26 штаммов (рис. 7).

Рис. 7. Образование одного общего (А) и множественных (В) хламидийных внутриклеточных включений в КК McCoy.

Примечания: хламидийные внутриклеточные включения штаммов Chlamydia trachomatis в КК показаны стрелочками. Окраска произведена меченными моноклональными антителами.

При культивировании в КК у 15 штаммов Ch. trachomatis экспрессия гена incA на уровне белка была сохранена, на что указывало образование общего хламидийного включения в КК. Кроме того, у плазмидных вариантов хламидийные включения имели более крупный вид, по сравнению с бесплазмидны-ми. При детекции бесплазмидных штаммов в КК окраской по Романовскому -Гимзе и раствором Люголя результаты были отрицательными. Это связано, прежде всего, с функцией плазмиды - контролировать метаболизм и накопление гликогена в хламидийных включениях (рис. 8).

f

ß ^

Рис. 8. Накопление гликогена в хламидийных включениях плазмидных (А) и бесплазмидных (Б) штаммов Chlamydia trachomatis в КК McCoy.

Примечания: гликогеновые накопления в хламидийных внутриклеточных включениях штаммов хламидий Chlamydia trachomatis в КК показаны стрелочками.

Фенотипических различий при культивировании в КК штаммов Chi. pneumoniae выявлено не было.

Таким образом, детекция хламидий окраской по Романовскому-Гимзе не позволяет дифференцировать хламидии до вида. Отсутствие хламидийных включений при данной окраске не свидетельствует об отсутствии хламидий в КК. При применении меченных моноклональных антител при детекции и идентификации хламидий в КК наблюдается появление перекрестных реакций, что приводит к некорректной оценке результатов. Использование оригинальных разработанных ПЦР-тест-систем видовой детекции Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae и детекции плазмидных штаммов Ch. trachomatis в КК позволяет определить вид хламидий и исключить наличие ложноположительных и ложноот-рицательных результатов, которые имеют место при применении меченных моноклональных антител, окрасок по Романовскому-Гимзе или раствором Люголя. Оптимизация условий культивирования хламидий в КК и совершенствование системы их детекции в культуре повышает диагностическую значимость и информативность КМ.

2.3. Генотипирование штаммов Chlamydia trachomatis.

Генотипирование штаммов Ch. trachomatis осуществляли методом ПЦР-ПДРФ (Koskela Р. et al., 2000) и с помощью метода ПЦР, применяя специфические сконструированные олигонуклеотидные праймеры. Генетическое типиро-вание 26 штаммов Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, методом ПДРФ-ПЦР и дальнейший сравнительный анализ длин рестрикционных фрагментов ДНК, полученных в ходе реакции, с представленными в базе данных GeneBank, характерных каждому из известных генотипов, позволило сгруппировать штаммы хламидий в две группы: 1 группа - штаммы, наиболее близкие по ПДРФ - профилям к штаммам генотипа Е (42,3%); 2 группа - штаммы, наиболее близкие по ПДРФ - профилям к штаммам генотипа G (57,7%).

Генотипирование с использованием сконструированных олигонуклео-тидных праймеров в реакции ПЦР осуществлялось в два этапа без привлечения ферментативных реакций в присутствии рестриктаз. Первоначально проводили ПЦР с использованием праймеров, специфических к группам генотипов. Далее, при положительной ПЦР с праймерами одной из групп, проводили ПЦР с гено-типоспецифичными праймерами, тем самым определяя генотип штамма Ch. trachomatis. При генотипировании с помощью группоспецифичных праймеров установлено, что штаммы хламидий обезьян относятся к двум группам: группе В и промежуточной группе. Дальнейшее исследование установило, что все штаммы Ch. trachomatis относятся к двум основным генотипам: генотипу Е и генотипу G. Таким образом, результаты генотипирования с помощью ПДРФ -анализа и ПЦР с использованием сконструированных праймеров совпадают, что исключает необходимость применения рестрикционного анализа и сокращает дополнительные затраты на исследования.

Штаммы с генотипом Е, выделенные от обезьян, являются свободными от критической плазмиды, штаммы с генотипом G - носителями плазмиды. По фенотипическим признакам штаммы с данными генотипами различаются способностью аккумулировать гликоген в хламидийных включениях в КК (уровень и накопление гликогена в хламидийных включениях выше у плазмидных вариантов). Кроме того, культивирование штамма генотипа Е в культуре клеток характеризуется образованием множественных внутриклеточных хламидийных включений. Это свидетельствует об отсутствии у данного генотипа экспрессии гена incA, играющего роль в формировании мембраны хламидийных включений. Штаммы с генотипом Е были выделены от животных без проявления выраженных клинических признаков инфекции, но имеющих в анамнезе хронические заболевания урогенитального тракта, а штаммы с генотипом G были получены от обезьян с выраженными клиническими признаками заболевания урогенитального тракта. Кроме того, генотип G у обезьян играл роль в патологии органов зрения и органов дыхания, что не было характерно для генотипа Е. Следовательно, генотип Ch. trachomatis определяет выраженность инфекционного процесса и клинические проявления заболевания.

2.4. Выявление чувствительности к антибиотикам.

Анализ антибиотикорезистентности проводили у 26 штаммов Ch. trachomatis и у 5 штаммов Chi. pneumoniae с помощью ПЦР с целью выявления генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (егт). Из 26 штаммов Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, показано наличие tet - гена у 4 (15,4%). Три штамма с геном устойчивости относятся к генотипу Е и один к генотипу G. Присутствие егт - гена у штаммов Ch.trachomatis выявлено не было. У штаммов Chi. pneumoniae детерминанты устойчивости к тетрациклинам и макролидам не зафиксированы. Следовательно, отсутствие детерминант устойчивости к антибиотикам говорит о целесообразности включения антибиотиков тетрациклинов и макролидов в алгоритм терапии хламидийных инфекций у животных. Определение чувствительности к антибиотикам штаммов хламидий обезьян Ch.trachomatis и Chi. pneumoniae позволяет подобрать оптимальный алгоритм лечения.

3. Установление филогенетической топографии штаммов хламидий, выделенных от обезьян в семействе Chlamydlaceae.

Определение таксономической топографии хламидий проводилось по сравнительному анализу 16S и 23 S рРНК генов с соответствующими фрагментами геномов официально зарегистрированных и депонированных видов хламидий в электронных базах данных NCBI (США), EMBL (Великобритания), DDBJ (Япония). Для исследования были взяты два штамма хламидий от обезьян, один из которых являлся бесплазмидным вариантом (Ch. trachomatis-NPL), другой - носителем плазмиды {Ch. trachomatis-PL); один штамм Chi. pneumoniae-РЫ от обезьяны; штамм Ch. trachomatis-PL2, носитель плазмиды и штамм Chi. pneumoniae-PNl, вьщеленные от человека. Референс штаммы Chi. pneumoniae-«^?) и Ch. trachomatis-«Бурхан» (Ch. trachomatis-PL3).

Проведение сравнительного анализа гомологии и оценки эволюционного расхождения последовательностей 16S - 23S срединного рибосомального участка и домена I гена 23S рРНК разных видов хламидий с изучаемыми штаммами (табл. 4 и 5) выявило, что НП секвенированного фрагмента бесплазмидного штамма Ch. trachomatis-NPL имеет гомологию 99% и эволюционное расхождение между последовательностями от 0,672 до 0,690 (s=0,019) со штаммами Ch. trachomatis (A/Har-13, B/TW-5/OT, D/UW-3/CX), но наибольшую гомологию с Ch. trachomatis L2/434/BU (100%), расхождение между последовательностями равны 0 (s=0), что свидетельствует о полном сходстве последовательностей штамма NPL и L2/434/BU, несмотря на отсутствие плазмиды у штамма NPL. Это подтверждает ранее установленное сходство между штаммами как свободными от плазмиды, так и её носителями (Carlson J.H., et al. 2008). С остальными видами хламидий разность в гомологии штамма NPL составляет 15,92±7,04%, расхождение между последовательностями от 0,690 до 0,755 (s=0,018-0,019). Плазмидные штаммы Ch. trachomatis-PL, выделенный от обезьян, и Ch. trachomatis-?L2, выделенный от человека, гомологичны представителям Ch. trachomatis (плазмидные штаммы) на 98 - 99%, расхождение между последовательностями от 0,016 до 0,697 для штамма PL (s=0,005-0,019) и от 0,034 до

0,698 для штамма РЬ2 (5=0,008-0,019), с различием в гомологии по отношению к другим видам хламидийот 13,31±5,49% до 13,77±5,97%, соответственно.

Таблица 4. Результаты сравнительного анализа гомологии НП 16Б - 238 срединного рибосомального участка и домена I гена 23Б рРНК штаммов хламидий с аналогичными последовательностями других штаммов.

Штаммы хламидий из базы данных GenBank % гомологии исследуемых штаммов с известными штаммами хламидий из базы данных ЭепВапк

Ch.tracho matis-NPL Ch.tracho matis-PL Chl.pneum oniae PN Ch.tracho matis-PL2 Chl.pneum oniae-PN2 Chl.pneum oniae-B Ch.tracho matis-PL3

гмЛ Р" гмл p« гмл P" гмл P" гмл P" гмл P" гмл p*.

Chi. abortus ЕВА 78 22 83 17 90 10 83 17 95 5 90 10 83 17

Chi. psittaci 6BC 78 22 84 16 90 10 84 16 94 6 90 10 84 16

Chi. psittaci NJl 78 22 84 16 91 9 83 17 96 4 91 9 84 16

Chi. caviae GP1C 79 21 84 16 90 10 84 16 95 5 90 10 85 15

Chi. felis FP Baker 79 21 85 15 90 10 85 15 85 15 90 10 85 15

Chi. pneumoniae N16 82 18 79 21 98 2 82 18 98 2 98 2 82 18

Chi. pneumoniae TW-183 83 17 80 20 99 1 84 16 99 1 99 1 82 18

Chi. pecorum E58 80 20 82 18 90 10 82 18 97 3 90 10 82 18

Chi. pecorum IP A 80 20 82 18 90 10 82 18 97 3 90 10 82 18

Ch. trachomatis A/Harl3 99 1 99 1 82 18 99 1 94 6 82 18 100 0

Ch. trachomatis B/TW-S/OT 99 1 99 1 82 18 99 1 94 6 82 18 99 1

Ch. trachomatis D/UW-3/CX 99 1 99 1 83 17 99 1 94 6 83 17 99 1

Ch. trachomatis L2/434/BU 100 0 98 2 83 17 98 2 94 6 83 17 98 2

Ch. suis R22 94 6 95 5 84 16 95 5 94 6 84 16 95 5

Ch.suis S45 94 6 95 5 83 17 95 5 93 7 84 16 95 5

Ch. muridarum MoPn 94 6 94 6 83 17 94 6 94 6 83 17 95 5

Ch. muridarum SFPD 94 6 94 6 83 17 94 6 94 6 83 17 95 5

различие в гомологии (M±m)* 15,92 ±7,04 13,77 ±5,97 13,73 ±3,78 13,31 ±5,49 6,0 ±2,75 13,66 ±3,73 13,15 ±5,75

Примечания: гмл - % гомологии штаммов; р** - % различия в гомологии штаммов; *- различие в гомологии между исследуемыми штаммами и другими видами хламидий (М±т).

Последовательность штамма Ch. trachomatis - PL3 отлична от Ch. trachomatis (A/Har-13, B/TW-5/OT, D/UW-3/CX, L2/434/BU) на 1-2%, расхождение между последовательностями от 0,002 до 0,690 (s=0,002-0,019). С представителями других видов хламидий обоих родов Chlamydia и Chlamydophila различие в гомологии данного штамма составляет 13,15±5,75%, генетические дистанции между последовательностями от 0,426 до 0,691 (s=0,019-0,021).

Таблица 5. Оценка эволюционного расхождения между НП и стандартная ошибка оценки (s) срединного фрагмента генов 16S - 23S рРНК и области 23S рРНК сегмента I Chlamydia spp.

п/ н штамм PL3 PL PL2 NPL MoPn SFPD E58 R22 "uST1 4/BU S45 А/На-13 B/TW -5/ОТ D/UW 3/СХ ЕВА GPIC IPA N16 TW-183 68С PN2 NJ1 В PN FPBa her

1 PL3 0 009 0.007 0.0 to 0 020 ¿1

2 PL 0,052 0 ООО 0 019 0.020 0 01? 0 0 1

3 PL2 0,033 0,019 0.010 0 021 1 r I

4 NPL 0,690 0,697 0,698 0.019 1 о г 0 018

5 МоРп 0,579 0,583 0,578 0,709 г г С 1

6 SFPD 0,534 0,545 0,534 0,719 L0¿440_ 1 1 и ОМ 21 п 1 1

7 Е58 0,691 0,691 0,676 JWLJ 0,674 0.664 Г:Г". Я г 0 ÍM л 0 i i ¿

8 R22 0,459 _0j462 0,491 0,690 0,652 _0,486_j 0,698 и и L- ... .. -1 . ,2

9 L2/434/B и 0,690 0,697 0,698 0,000 0,709 0,719 0,743 0,690 ! 0019

10 S45 0,426 0,429 0,459 0,709 0,638 0,512 0,671 0,391 0,709 1

11 А/На-13 0,153 0,172 0,186 ГадтГ 0,550 0,555 0,697 0,445 0,672 0.422 !' * П i IV 1 1

12 B/TW-6ЮТ 0,002 0,017 0,034 0,691 0,579 0,534 0,691 0,460 0,691 0.428 0.155 0 002 „,..„ 1 ) 1 " 1

13 D/UW3/ СХ 0,003 0,016 _ода_) 0,690 0,578 _0J>36J 0,691 0,459 0,690 0,426 0,157 0,002 0 021 0.019 О.ОЮ 0.019 о ого 0 021 0.020 0 02! 0 020 0 019 0 021

14 ЕВА 0,491 0,488 0,503 0,709 0,653 0,540 0,660 0,505 0,709 0,531 0,516 0,490 0,491 0.020 Ü 020 L_OW0_ 0 020 0.021 0 21 о í" Г ~ т i /1

15 GPIC 0,691 0,690 0,700 0,755 0,681 0,648 0,653 0,684 0,755 0,674 ГадвТ 0,690 0,688 0,648 0.020 0 019 0 019 0,021 0 ' - г VI

16 1РА 0,691 0,691 0,676 0,743 0,674 L_W64_ 0,000 0,698 0,743 0,671 0,697 0,691 0,650 0,653 0 021 Од 121 ОиТО п 0ГИ9 - V O'-i

17 N16 0,674 0,671 0,676 0,707 0,660 0,707 JV50J 0,671 0,707 0,678 0,679 Пщ4~ 0,674 0,624 0,703 ^550^ г 010 0 021 0 "4 -4 - г

18 TW-183 0,672 0,669 0,674 0,719 0,650 0,690 0,545 0,667 0,719 0,690 Го,678 0,672 0,621 0,693 0,545 0,191 0.020 f" "" ' 2 < ''."

19 6ВС 0,526 0,529 0,538 0,734 0,662 0,557 0,688 0,512 0,734 0,526 0,514 0,526 0,528 0,503 0,560 0,688 0,481 0,638 0-Ч1

20 PN2 0,671 0,667 |_W72j 0,716 0,652 0,691 0,545 0,666 0,716 0,681 0,676 0,671 0,671 0,617 0,700 0,545 0,128 0,066 0,574 "21 - -

21 NJ1 0,528 0,531 0,540 0,734 UL®L 0,553 0,688 0,512 0,734 0,526 0,517 П)¿¡В JW2-LJ 0,507 0,562 0,688 0,474 0,633 0,009 0.569 "Г *

22 В LMTL 0,667 0,672 0,716 0,652 0,691 0,545 0,666 0,716 0,681 0,676 0,671 0,671 0,617 0,700 0,545 0,128 0,066 0,574 0,000 0.569 V Г21

23 PN 0,674 0,671 0,676 0,719 0,652 0,691 0,547 0,669 0,719 0,691 0,679 0,674 0,622 0,693 0,547 0,190 0,002 0,640 0,067 0,634 0,067 и и/о

24 FPBaker 0,522 0,528 0,538 0,733 0,666 0,550 0,700 0,507 0,733 0,526 0,514 0,522 0,524 0,509 0,564 ПдаГ 0,479 0,638 0,031 0,576 0,036 0,576 0,640

Примечания: Результаты основаны на попарном анализе последовательностей 24 штаммов. Расчеты проводились в программе MEGA 4.1, используя метод p-distance. Числа ниже диагонали показывают генетические дистанции между последовательностями участка. Стандартная ошибка оценки эволюционного расхождения (s) получена при использовании аналитических формул в программе MEGA 4.1 п показана выше диагонали.

При оценке эволюционного расхождения НП штаммов Ch. trachomatis между собой получены следующие результаты: PL/PL2 - 0,019 (s=0,006), PL/PL3 - 0,052 (s=0,009), PL/NPL - 0,697 (s=0,019), PL2/PL3 - 0,033 (s=0,007), NPL/PL3 - 0,690 (s=0,019), NPL/PL2 - 0,698 (s=0,019). Следовательно, штамм Ch. trachomatis - PL, выделенный от обезьян, носитель плазмиды, наиболее близок к штамму, выделенному от человека PL2. В то время как бесплазмид-ный штамм NPL более близок к референс штамму PL3.

Дополнительно оценена НП 16S - 23S срединного рибосомального участка и домена I гена 23 S рРНК плазмидных и бесплазмидных штаммов Ch. trachomatis в сравнении для уточнения выше описанных эволюционных расхождений нуклеотидных последовательностей между этими штаммами. При сравнении штаммов Ch. trachomatis-PL-генотип G и Ch. trachomatis-WL-генотип Е выявлено различие на участке размером 483 пары нуклеотидов. Аналогичная закономерность выявляется и при сравнении Ch. trachomatis-?L2-генотип G с Ch. trachomatis-NPL-генотип Е, где различие наблюдается на участке размером 197 пар нуклеотидов. При сравнении Ch. trachomatis-Vhl с Ch. trachomatis-?L выявлены единичные несовпадения (размер участка 462 пары нуклеотидов); оба штамма относятся к генотипу G.

Штаммы вида Chi. pneumoniae (PN, PN2 и В) имеют гомологию с представителем Chi. pneumoniae N16 и Chi. pneumoniae TW-183 на 98% и 99% соответственно. Эволюционное расхождение между последовательностями штаммов PN2 и В с TW-183 и N16 составляет от 0,066 до 0,128 (s=0,010-0,014); между штаммом PN и TW-183 составляет 0,002 (s=0,002) при гомологии 99%; между PN и N16 составляет 0,190 (s=0,016) при гомологии 98%. Таким образом, штаммы PN2, В и штамм PN по гомологии и эволюционному расхождению между НП близки к штамму Chi. pneumoniae TW -183. С представителями других видов штаммы PN2, В и PN имеют разность в гомологии: PN2 - 6,0±2,75%; В -13,66±3,73%; PN - 13,73±3,78%; эволюционное расхождение между НП от 0,545 до 0,719 (s=0,019-0,021). Оценивая эволюционное расхождение НП между штаммами Chi. pneumoniae (PN2 - штамм, выделенный от человека, PN -штамм, выделенный от обезьян, «В» - референс штамм), установили: PN2/ PN -0,067 (s=0,010); PN2/B - 0,0 (s=0); PN/B - 0,067 (s=0,010). Наиболее близкое родство имеют и находятся на одном эволюционном уровне штамм PN2 и референс штамм «В»; но незначительное расхождение со штаммом PN все же дает представление о довольно близком сходстве всех трех изучаемых штаммов Chi. pneumoniae (выделенных от обезьян и человека).

Для выявления филогенетического родства выделенных от обезьян штаммов с выделенными от человека построена дендрограмма (рис. 9). Бес-плазмидный штамм Ch. trachomatis-~NPL относится к виду Ch. trachomatis и входит в один общий кластер с Ch. trachomatis L2/434/BU, что соответствует приведенным выше данным по гомологии штаммов (100% гомология). Штаммы PL, PL2 и PL3 объединены в один общий кластер с Ch. trachomatis (B/TW-5/ОТ, D/UW-3/CX, А/Наг-13), но в разные кластеры с L2/434/BU, о чем свидетельствует эволюционное расхождение между последовательностями штаммов.

chlamydia trachomatls-PL Chlamydia trachomatis D/UW-3/CX 10GI Chlamydia trachomatis BHW-5/OT Chlamydia trachomatis - PL3

Chlamydia trachomatis-PL2 Chlamydia trachomatis A/Har-13

loo; Chlamydia trachomatia-NPL Chlamydia trachomatis L2M34/BU

"Chlamydia Chlamydia suis S45

s R22

Chlamydia muridarum W

Chlamydia muridarum SFPD — Chlamydophila abortus EBA

eel Chlamydophila psittaci 6BC Chlamydophila psittaci NJ1 - Chlamydophila talis FP Baker

- Chlamydophila cavlae GPIC looi Chlamydophila pecorum E58

1 Chlamydophila pecorum IPA

- Chtamydophlla pneumoniae N16 ji Chlarrrydophila pneumoniae 7W-ta3 ' Chlamydophila pneumoniae-PN

^(Chlamydophila pneksnoniae-PN2 ° Chlamydophila pneumoniae 4

Рис. 9. Дендрограмма, полученная в результате филогенетического анализа срединного фрагмента генов 16S - 23S рРНК и области 23S рРНК сегмента I штаммов хламидий. Изучаемые штаммы Chlamydophila pneumoniae (PN - обезьяний штамм, PN2 - человеческий штамм и В - референс штамм) и Chlamydia trachomatis (PL - плазмидный штамм, выделе-ленный от обезьян, PL2 - плазмидный штамм, выделенный от человека, PL3 - референс штамм и NPL- бесплазмидный штамм, выделенный от обезьян).

Штамм Chi. pneumoniae PN отнесен в один субкластер с Chi. pneumoniae TW-183, что говорит о том, что данный штамм относится к виду Chi. pneumoniae, в общий кластер с Chi. рпеитотае-?Ы2 и Chi. pneumoniae-B, которые в одном субкластере согласно эволюционному расхождению.

По результатам сравнительного анализа родства, эволюционного расхождения НП 16S - 23S срединного рибосомального участка и домена I 23S рРНК и определения филогенетического положения штаммов Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, впервые установлено родство данных изо-лятов с подобными штаммами, выделенными от человека, а также, со штаммами, НП которых представленны в электронной базе данных. Филогенетический анализ выделенных от обезьян штаммов Chi. trachomatis и Chi. pneumoniae позволил установить их место на филогенетическом дереве семейства Chlamydiaceae. Выявлено близкое эволюционное расположение изученных оригинальных видов Chlamydia и Chlamydophila с аналогичными видами из электронной базы данных. Впервые показаны различия НП 16S - 23S срединного рибосомального участка и домена I 23S рРНК плазмидосодержащих и бес-плазмидных штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян, относящихся к разным группам генотипов (группа В; промежуточная группа). Нарушение экспрессии хромосомного гена incA, ведущей к сбою цикла развития и жизнедеятельности хламидий, их вирулентности также можно связать с возможными изменениями в НП этого гена.

Выводы.

1. Установлена роль Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в развитии спонтанной инфекционной патологии низших обезьян.

2. Впервые разработанная мультиплексная ПЦР при диагностике хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, и мультиплексная ПЦР при детекции плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Ch. trachomatis позволяют одновременно не только верифицировать возбудителей хламидиозов обезьян, но и осуществлять дифференциацию хламидий, оценивать вирулентность штаммов.

3. Предложенные условия оптимизации культивирования хламидий и усовершенствование системы их детекции в культуре клеток повышают диагностическую значимость и информативность культурального метода исследования хламидиозов.

4. Штаммы Ch. trachomatis с генотипом Е выделены от животных без проявления клинических признаков инфекции, но имеющих в анамнезе хронические заболевания урогенитального тракта, а штаммы с генотипом G - от обезьян с выраженными клиническими признаками заболевания урогенитального тракта. Генотип G у обезьян вызывает патологию органов зрения и органов дыхания. Клиническое проявление инфекционного процесса напрямую зависит от гено-типических и фенотипических особенностей штаммов хламидий.

5. У штаммов Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, выявлены гены устойчивости к тетрациклинам, но не определяются гены устойчивости к макролидам. У штаммов Chi. pneumoniae детерминанты устойчивости к тетрациклинам и макролидам не зафиксированы, что позволяет оптимизировать схему лечения хламидиоза обезьян.

6.Установлено место на филогенетическом дереве семейства Chlamydiaceae штаммов Ch. trachomatis и Chi pneumoniae, выделенных от обезьян, их близкое эволюционное расположение с аналогичными видами, депонированными в электронной базе данных GenBank. Выявлено различие нуклеотидной последовательности 16S - 23S срединного рибосомального участка и домена I 23S рРНК плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека и обезьян.

Практические рекомендации

Предложенные модифицированные культуральный и молекулярно-генетические методы для верификации хламидий позволяют провести объективную оценку генотипических и фенотипических свойств хламидий, а также всесторонне оценивать выраженность инфекционного процесса и прогнозировать исход хламидийной инфекции у приматов.

Спонтанная хламидийная инфекция обезьян может быть использована как модель для изучения хламидиоза человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Слободенюк В.В. Выявляемость антител к Chlamydia trachomatis и СЫашу-dophila pneumoniae у клинически здоровых обезьян / В.В. Слободенюк, И.М. Аршба // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Материалы четвертой международной конференции. - СПб, 2008. - С.163.

2. Гречишникова О.Г. Лабораторная база диагностики хламидиоза / О.Г. Гре-чишникова, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, В.А. Метельская,

A.Л. Байракова, В.В. Слободенюк, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XV Росс. Нац. конгресса-М, 2008.-С.430-431.

3. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов выявления Chlamydia trachomatis у человека и обезьян / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк,

B.А. Алешкин, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, В.А. Метельская // Биологическая безопасность в современном мире. Материалы науч.-практ. конф. СМУиС - Оболенск, 2009. - С.114-117.

4. Гречишникова О.Г. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза у больных в зависимости от остроты клинических проявлений / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, Е.А. Воропаева, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова // Человек и лекарство: сборник материалов XVI Росс. Нац. конгресса - М, 2009. - С.76.

5. Гречишникова О.Г. Фенотипическая характеристика штаммов хлами-дий, выделенных от человека и обезьян культуральным методом / О.Г. Гречишникова, В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, В.Ф. Ликов, Б.А. Воропаева, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Н.Н. Полещук, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, Л.В. Рубанин, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский, З.Б. Квачева, И.В. Евсегнеева, А.В. Караулов // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2009 - № 3. - С.44-53.

6. Слободенюк В.В. ПЦР-детекция и идентификация возбудителей хлами-дийных инфекций человека и обезьян / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, Д.В. Кокушков, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, М.С. Афанасьев, О.В. Рубальский, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский, И.В. Евсегнеева, А.В. Караулов // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2009 - № 3. - С.54-62.

7. Слободенюк В.В. Генотипирование и анализ антибиотикорезистентности штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, В.А. Алешкин, О.Г. Гречишникова, С.С. Афанасьев, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, Е.А. Егорова, А.Л. Байракова // Иммунопатология, Аллергология, Инфектология. -2009 -X» 4. - С.74-81.

8. Слободенюк В.В. Сравнительная характеристика методов верификации Chlamydia trachomatis у человека и обезьян / В.В. Слободенюк, В.А. Алеш-

кин, С.С. Афанасьев, О.Г. Гречишникова, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, A.JI. Байракова, Е.А. Егорова, Б.А. Лапин, Э.К. Джи-кидзе, А.В. Караулов, Ю.В. Несвижский, Д.Л. Теплый, О.В. Рубальский, Е.О. Рубальский // Естественные науки. - 2009 - № 1 (26). -С.65-71.

9. Слободенюк В.В. Изучение генотипов и антибиотикорезистентности штам-ммов Chlamydia trachomatis, выделенных от человека и обезьян / В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, В.А. Алешкин, О.Г. Гречишникова, С.С. Афанасьев, Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Ю.В. Несвижский, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, И.А. Дятлов, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, А.В. Алешкин, В.А. Метельская, Е.А. Егорова, А.Л. Байракова // Человек и лекарство: сборник материалов XVII Росс. Нац. конгресса-М, 2010.-С.719.

10. Аршба И.М. Естественное распространение урогенитальных инфекций у обезьян в условиях неволи / И.М. Аршба, В.В. Слободенюк // Инфекционные болезни. Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2010. - Т. 8. - прилож. № 1. - С.17-18.

11. Слободенюк В.В. Анализ антибиотикорезистентности и генотипирование штаммов Chlamydia trachomatis в популяции обезьян и человека / В.В. Слободенюк, О.Г. Гречишникова, И.М. Аршба // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями. Материалы международной конференции. - СПб, 2010. - С. 129.

12. Гречишникова О.Г. Сравнительный анализ прямых методов лабораторной диагностики урогенитального хламидиоза / О.Г. Гречишникова, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.В. Слободенюк, А.В. Караулов, Ю.В. Несвижский, О.В. Рубальский, Е.А. Воропаева, М.С. Афанасьев, В.А. Метельская, АЛ. Байракова, Е.А. Егорова, Е.О. Рубальский // Астраханский медицинский журнал. - 2010 - Т. 5. - № 2. - С.80-86.

13. Karaulov Alexander. Identification of Phylogenetic Position in the Chlamydia-ceae Family for Chlamydia Strains Released fromMonkeys and Humans with Chlamydia! Pathology / Alexander Karaulov, Vladimar Aleshkin, Vladimir Slobode-nyuk, Olga Grechishnikova, Stanislav Afanasyev, Boris Lapin, Eteri Dzhikidze, Yu-riy Nesvizhsky, Elena Voropayeva, Maxim Afanasyev, Andrei Aleshkin, Valeria Metelskaya, Ekaterina Yegorova, and Alexandra Bayrakova // Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology. - Volume 2010, Article ID 130760,11 pages.

14. Slobodenuk V.V. The comparative estimation of diagnostic value of laboratory methods for urogenital chlamydiosis in humans and monkeys / V.V. Slobodenuk, V.A. Aleshkin, B.A. Lapin, A.V. Karaulov, S.S. Afanasiev, O.G. Grechishnikova, E.A. Voropaeva, E.K Jikidze, U.V. Nesvizskii, M.S. Afanasiev, V.A. Metelskaia, A.L. Birakova, E.A. Egorova II FEMS 2009, 3rd Congress of European Microbiologists. Gothenburg, Sweden, June 28-Juli 2,2009.

Патенты РФ на изобретение

1. Пат. № 2385945 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С.Афанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, В.А. Баннов, О.М. Кострова, A.B. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, H.A. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубаль-ский, Ю.Н. Урбан, А.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2008151548/13; за-явл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010.

2. Пат. № 2385946 Российская Федерация МПК С 12 Q 1/68. Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления / В.В. Слободенюк, В.А. Алешкин, С.С.Афанасьев, Б.А. Лапин, Е.А. Воропаева, В.А. Баннов, О.М. Кострова, A.B. Караулов, Э.К. Джикидзе, Н.В. Воложанцев, И.А. Дятлов, Э.А. Светоч, О.Г. Гречишникова, В.А. Метельская, А.Л. Байракова, М.С. Афанасьев, Е.А. Егорова, О.В. Рубальский, Д.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, Ю.Н. Урбан, А.Н. Куракова; заявитель и патентообладатель ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора.-№ 2008151550/13; заявл. 26.12.2008; зарег. во ФГУП «Роспатент» 10.04.2010.

Список сокращений

At - антитело.

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.

ИФА - иммуноферментный анализ.

КК - культура клеток.

КМ - культуральный метод.

ЛПС -липополисахарид.

ЛЦР - лигазная цепная реакция.

НИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции.

НП - нуклеотидная последовательность.

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

ПР - промежуточное тельце.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

РИФ - реакция прямой иммунофлуоресценции.

РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

РНК - рибонуклеиновая кислота.

рРНК - рибосомальная РНК.

РСК - реакция связывания комплемента.

РТ - ретикулярное тельце.

УГТ - урогенитальный тракт.

УГХ - урогенитальный хламидиоз.

ЦК - цервикальный канал.

ЦМ - цитологический метод.

ЭТ - элементарное тельце.

Ig - иммуноглобулин.

МОМР - (major outer membrane protein) - основной белок наружной мембраны. ORF - (open reading frame) - открытая рамка считывания.

Слободенюк Владимир Владимирович

РОЛЬ ХЛАМИДИЙ В СПОНТАННОЙ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ ОБЕЗЬЯН

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать: 16.08.10

Объем: 1,5 усл.печ.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 217 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского, 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слободенюк, Владимир Владимирович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Место хламидийной инфекции в инфекционной патологии животных и человека: Эпидемиологическая значимость хламидиоза животных как источника и резервуара возбудителя для человекам.

1.1.1. Роль хламидий в этиологии воспалительных заболеваний человекам.

1.1.2. Хламидиозы животных как возможный источник и резервуар ^возбудителя* хламидийной инфекции человека.18»

Г. 1.3: Восприимчивость животных к хламидиозу человека.

1.2. Методы лабораторной диагностики хламидиоза человека и животных.

1.2.1. Общепринятые методы диагностики хламидийной инфекции.

1.2.2. Достоинства и недостатки методов диагностики хламидиозов, их ограничения в применении.30>

1.2.3. Подходы к, совершенствованию методов диагностики; хламидийной инфекции1.

1.3. Филогенетическая характеристика хламидий.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Материалы исследования.

2.1.1. Характеристика обследованных,обезьян.

2.1.2. Образцы клинического материала.

2.1.3. Используемые культуры клеток, среды и реактивы.

2.1.4. Штаммьгмикроорганизмов.

2.2. Лабораторные методы исследования.

2.2.1. Верификация хламидий у обезьян.

2.2.1.1. Цитологический метод.

2.2.1.2. Серологический метод.

2.2.1.3. Культуральный метод.

2.2.1.4. Молекулярно-генетические методы.

2.2.2. Программное обеспечение в молекулярно-генетическом исследовании хламидий.

2.2.3. Секвенирование штаммов хламидий.

2.3. Статистическая обработка полученных данных.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Установление естественного инфицирования хламидиями обезьян с применением общепринятого в клинической практике комплекса лабораторных методов обследования.

3.2. Совершенствование методов верификации хламидий у обезьян.

3.2.1. Молекулярно-генетический анализ.

3.2.1.1. Комплексная одновременная детекция и идентификация Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis.

3.2.1.2. Повышение диагностической значимости культурального метода.

3.2.1.3. Генотипирование хламидий Chlamydia trachomatis.

3.2.1.4. Выявление чувствительности к антибиотикам.

3.3.Установление филогенетической топографии штаммов хламидий, выделенных от обезьян в семействе Chlamydiaceae.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль хламидий в спонтанной инфекционной патологии обезьян"

Инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными микроорганизмами семейства Chlamydiaceae, являются одной из актуальных задач современного здравоохранения, ввиду широкого распространения их во всем мире [14, 15, 19; 20, 24]. Среди группы возбудителей хламидийных инфекций животных и человека, известных под общим названием «хламидиозы», особое значение для-медицины .представляют хламидии двух родов Chlamydia и Chlamydophila, носящие антропонозный характер: вид Chlamydia- trachomatis, вызывающий различные урогенитальные заболевания (уретрит, цервицит, эндометрит, простатит, орхит и др.), патологию беременности»и родов, некоторые формы артрита, трахому, лимфогранулему венерум, патологию органов .дыхания, офтальмию новорожденных, и* вид Chlamydophila pneumoniae (биовар TWAR), являющийся респираторным-возбудителем, а также играющий роль в патологии сердечно - сосудистой системы и головного мозга (атеросклероз, ишемическая болезнь , сердца, инсульт, транзиторные нарушения кровообращения мозга, болезнь Альцгеймера) [14, 20, 51, 88, 103, 132; 174].

Взгляды ученых нацелены на более детальное изучение жизненного цикла хламидий, фенотипических признаков, особенностей структуры генома штаммов хламидий и их непосредственную связь между собой [65, 70, 84, 168]. В первую очередь это может помочь в разработке новых методов диагностики, лечения и профилактики, а также созданию препаратов бактерицидного действия, которые бы могли воздействовать губительно на все формы, цикла развития хламидий, и новых иммуномодулирующих препаратов, вакцин с целью наиболее эффективного лечения и профилактики хламидиоза. Для осуществления описанного выше необходимо применение оптимальной экспериментальной биологической модели. По эволюционному родству и принадлежности человека к отряду приматов использование обезьян для экспериментального изучения хламидий антропонозного характера является наиболее адекватным.

Известны работы, посвященные попыткам экспериментального заражения обезьян хламидиями, выделенными от человека с воспалительными заболеваниями органов малого таза, уретритами, цервицитами, эпидидимитами, в результате чего была доказана высокая восприимчивость данных животных к хламидиям [119, 184]. Однако прежде чем рассматривать обезьян как экспериментальную модель для изучения хламидийных инфекций, необходимо знать, имеют ли обезьяны свою собственную хламидийную патологию^ что/ может привести не только к ложным результатам экспериментального изучения хламидийных инфекций, но и существует опасность заражения* человека хлами-диозом от обезьян ввиду зооанропонозного характера возбудителей хламидий-ной.инфекции.

В'литературе практически нет данных отом, что обезьяны, имеют различного рода хламидийную патологию, за исключением исследований, начатых в последнее время [3]. Однако учитывая проведенные исследования распространения-» урогенитальных» инфекций при патологии беременности-и родов, можно заключить, что хламидиозы у обезьян изучены недостаточно. Выявление особенностей течения, распространения^ хламидийной инфекции в популяции-обезьян, роли Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в патологии урогенитального тракта и органов дыхания,, унификация-методов детекции и идентификации возбудителей, изучение фенотипических признаков; филогенетического положения в.семействе Chlamydiaceae штаммов-хламидий; выделенных от обезьян, представляют собой научный интерес и могут служить.теоретической» и практической базой для понимания патогенеза клинических проявлений и совершенствования диагностики хламидийной инфекции у обезьян и человека.

Цель исследования

Определение роли Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в спонтанной инфекционной патологии обезьян и установление их филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae штаммов, вызывающих патологический процесс у обезьян; Задачи исследования

1. Определить естественное распространение Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae у низших обезьян разных видов с патологией ;урогениталь-ного тракта, органов дыхания и органов зрения.

2. Разработать способ? мультиплексной5 ИЦР.** диагностики; хламидийнош инфекг ции обезьян, вызванной видом» Chlamydophila pneumoniae и, Chlamydia trachomatis^ ш способ мультиплексной! ПЦР диагностики плазмидных ш бесплазмид-г ных, штаммов вида Chlamydia trachomatis:

3t. Выделить штаммы хламидий от обезьян и изучить их фенотипические осо-бенностшв«культуре: клеток.:

4. Провести молекулярноггенетическое" генотипирование штаммов Chlamydia trachomatis; выделенныхот обезьящ методамшПЦРги<1ЩРЩДРФ-анализа:

5. Провести молекулярно-генетическое: исследование- детерминант1 антибиоти-корезистентности методом ПЦР штаммов хламидий, выделенных от обезьян.

6. Провести молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий, выделенных от обезьян, для установления их филогенетического положения в семействе Chlamydiaceae.

Научная новизна

Выявлено естественное инфицирование штаммами Ch. trachomatis ш Chi. pneumoniae низших обезьян разных видов» с патологией; органов репродуктивного тракта, органов дыхания и органов зрения.

Впервые разработан способ мультиплексной ПДР диагностики хлами-дийиой инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis,. и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis.

Впервые изучены фенотипические особенности штаммов,СМ. pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян при культивировании их в культуре клеток.

Методами ПЦР и ПЦР-ПДРФ-анализа впервые выявлена принадлежность к генотипам штаммов Chlamydia trachomatis, выделенных от обезьян, что позволяет определить патогенетический потенциал течения хламидиоза;

Впервые* проведено' молекулярно-генетическое исследование детерминант антибиотикорезистентности штаммов Chl.pneumoniae и Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, что позволяет конкретизировать схему лечения хламидиоза.

Впервые^ установлено филогенетическое' положение штаммов* Ghl. pneumoniae и Ch: trachomatis, выделенных от обезьян, в? семействе* Chlamydiaceae, а также родство ^данных изолятов с подобными, штаммами^ выделенными от человека, в сопоставимости со-штаммами; нуклеотидные последовательности которых представлены ^ электронной базе данных GenBank.

Практическая значимость

Предложен унифицированный* набор модифицированных лабораторных методов\ (цитологический, серологический, культуральный, молекулярно-генетический, биоинформационный анализ), комплексно оценивающий^ инфекционный процесс при спонтанном хламидиозе обезьян. Спонтанная хламидий-ная инфекция* низших обезьян может рассматриваться? как лабораторная модель, перспективная для совершенствования верификации возбудителя; лечебных и профилактических схем лечения.

Разработаны и предложены лабораторный способ мультиплексной ПЦР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis, защищенные Патентом на изобретение РФ «Способ диагностики хламидийной. инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946, зарегистрирован 10.04.2010, и Патентом на изобретение РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945, зарегистрирован 10.04.2010.

Внедрение результатов работы

Результаты исследований и разработок внедрены в научных подразделениях Научно - исследовательского института медицинской приматологии Российской академии медицинских наук и используются в научной работе лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

Положения, выносимые на защиту

1. Доказана эпизоотологическая значимость хламидиозов в спонтанной инфекционной патологии низших обезьян.

2. Впервые выявлена связь генотипических и фенотипических свойств возбудителей хламидиозов с патогенетическими механизмами и особенностями течения и проявления хламидийной инфекции у низших обезьян.

3. Установлено филогенетическое положение штаммов хламидий, выделенных от обезьян, в семействе Chlamydiaceae и подтверждено их родство со штаммами, выделенными от человека.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Слободенюк, Владимир Владимирович

Выводы

1. Установлена роль Ch. trachomatis и Chi. pneumoniae в развитии спонтанной инфекционной патологии низших обезьян.

2. Впервые разработанная мультиплексная ПЦР при диагностике хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chi. pneumoniae и Ch. trachomatis, и мультиплексная ПЦР при детекции плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Ch. trachomatis позволяют одновременно не только верифицировать возбудителей хламидиозов обезьян, но и осуществлять дифференциацию хламидий, оценивать вирулентность штаммов.

3. Предложенные условия оптимизации культивирования хламидий и усовершенствование системы их детекции в культуре клеток повышают диагностическую значимость и информативность культурального метода исследования хламидиозов.

4. Штаммы Ch. trachomatis с генотипом Е выделены от животных без проявления клинических признаков инфекции, но имеющих в анамнезе хронические; заболевания урогенитального тракта, а штаммы с генотипом G - от обезьян с выраженными клиническими признаками заболевания урогенитального тракта. Генотип G у обезьян вызывает патологию органов зрения и органов дыхания. Клиническое проявление инфекционного процесса напрямую зависит от гено-типических и фенотипических особенностей штаммов хламидий.

5. У штаммов Ch. trachomatis, выделенных от обезьян, выявлены гены устойчивости к тетрациклинам, но не определяются гены устойчивости к макролидам. У штаммов СМ. pneumoniae детерминанты устойчивости к тетрациклинам и макролидам не зафиксированы, что позволяет оптимизировать схему лечения хламидиоза обезьян.

6.Установлено место на филогенетическом дереве семейства Chlamydiaceae штаммов Ch. trachomatis и СМ. pneumoniae , выделенных от обезьян, их близкое эволюционное расположение с аналогичными видами, депонированными в электронной базе данных GenBank. Выявлено различие нуклеотидной последовательности 16S - 23 S срединного рибосомального участка и домена I 23 S рРНК плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов Ch. trachomatis, выделенных от человека и обезьян.

Практические рекомендации

Предложенные модифицированные культуральный и молекулярно-генетические методы для верификации хламидий позволяют провести объективную оценку генотипических и фенотипических свойств хламидий, а также всесторонне оценивать выраженность инфекционного процесса и прогнозировать исход хламидийной инфекции у приматов.

Спонтанная хламидийная инфекция обезьян может быть использована как модель для изучения хламидиоза человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слободенюк, Владимир Владимирович, Москва

1. Адаскевич В.П. Заболевания; передаваемые половым путем: 2-е изд., пе-рераб. и доп. Витебск., 1997. 310 с.

2. Адаскевич В.П. Инфекции, передоваемые половым путем: руководство для врачей. Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2004. - 416 с.

3. Аршба И.М. Распространение возбудителей урогенитальных инфекций у обезьян и их роль в патологии беременности и родов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Сочи; 2008.

4. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL, 1962. — 180 с.

5. Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. М., 2001. - 224 с.

6. Герасимова Н.М. Новая классификация хламидий и ее значение для практики //ИППП. -2001*. -№1. С. 14-18.

7. Глазкова JI.K., Акилов О.Е. Практические аспекты персистирующей" хламидийной инфекции // ИППП. 1999. - №4. - С. 29 - 34.

8. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с анг.-М., Практика. -1998.-459 с.

9. П.Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир., 2002. - 598 с.

10. Гнутов И.Н. Клиника и диагностика генерализованной формы хламидиоза зоонозной природы у людей: Автореф. дис. докт. мед. наук. — М., 1981.

11. Гомберг. М.А., Поздняков О.Л., Соловьев A.M. Урогенитальная хлами-дийная инфекция: лечить или не лечить? // Consilium medicum.-2006.-T. 8, №4.-С. 21-25.

12. Гранитов В.М. Хламидиозы.-М.: Медициская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА., 2002. 192 с.

13. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогениталь-ных инфекций. М.: Медицинская книга, Н.Новгород: Издательство НГМА., 2003.-336 с.

14. Дмитриев Г.А., Киселев В.И., Орлова О.Е. и др. Лабораторная-диагностика урогенитального хламидиоза. Пособие для врачей. М. — 1999. - 19 с.

15. Дмитриев Г.А., Глазко И.И. Диагностика инфекций, передаваемых половым путем. М.: «Издательство БИНОМ», 2007. 320 с.

16. Зимин А.Л. Разработка метода специфической детекции и видовой дифференциации возбудителей хламидиозов на основе структурного полиморфизма гена отр2: Автореф. дис. канд. биол. наук. Ml, 2003.

17. Коваленко Е.В., Новицкая С.А., Назарова И.Н. Особенности иммунного статуса больных хламидиозом // II Всеросс. Науч.-практ. конф. «Полиме-разная цепная реакция* в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» М, 1998. - С. 20 - 21.

18. Ксенз ИЯ:, Почерняев К.Ф., Курман А.Ф. Способ определения ДНК возбудителей «хламидийных инфекций в мультиплексной полимеразнош цепной реакции. Патент UA 11834 U, 16.01.2006.

19. Куляш Г.Ю. Персистирующая урогенитальная инфекция: возможности и нерешенные вопросы лабораторной и клинической диагностики // ИППП. — 2003. — № 3. С. 3 — 8.

20. Лобзин Ю.В:, Лященко Ю.И., Позняк A.JL. Хламидийные инфекции. Руководство для врачей. СПб.: ООО «Издательство Фолиант», 2003. - 400 с.

21. Маликова М:В: Проблема хламидиозов в современных, условиях // Инфекционные болезни. Тернополь. 1998. - № 2. - С. 35 — 39:

22. Метельская В.А., Алешкин В.А., Зверев В.В. и др. Современные методьг лабораторной диагностики хламидиозов//Журн. микробиол. 2008. - № 4. - С. 111-117.

23. Могилевец Т.Л. Клинико-иммунологическая характеристика урогени-тальной хламидийной инфекции у женщин: Автореф. дис. канд. мед. наук. Санкт-Петербург, 2002.

24. Молочков, В.А. Урогенитальный хламидиоз. М.: Бином, 2006. - 208 с.

25. Мортон Р.С. Урогенитальная инфекция: переоценка данных и гипотезы II ИППП. 2000. - № 2. - С. 4 -15.

26. Мусина Е. А., Шипицына Е. В., Савичева А. М., и др. Значение хламидийной инфекции в развитии заболеваний репродуктивной системы // Журнал акушерства и женских болезней. 2006. — № 5. С. 32 — 33'.

27. Нурушева С.М. Урогенитальная хламидииная инфекция у женщин (кли-нико-экспериментальные лабораторные: исследования): Автореф. дис. докт. мед. наук. М., 1996.

28. Павлович С.А. Микробиология с иммунологией и вирусологией. Учебн. пособие для Мед. ВУЗов. Изд. 2:-Минск: Высш: Школа. 2008:

29. Плютто A.M. Выявление хламидийной инфекции по косвенным цитологическим.признакам// Клиническая лабораторная диагностика. 1998. №

30. Позняк A.JL, Лобзин Ю.В., Сидорчук С.Н. и др. Хламидийные поражения дыхательных; путей: распространенность, диагностика^ клинические особенности // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2002. — № 5. — С. 46-53.

31. Покровский В.И., Гнутов И.Н. О генерализованной? форме хламидиоза. зоонозной природы у людей. -М., 1982.-С. 23 -25:

32. Рищук С.В;, Коспоченко Д.Ф. Способ диагностики манифестной; и латентной форм хронического урогенитального хламидиоза у мужчин: Патент RU 2222018 С1, 06.06.2002.

33. Семенов В.М. Клинико-эпидемиологическая характеристика хламидиозов // Рос. мед. журн. 2000. - № 1. - С. 48-52.

34. Сидоренко М.Г. Статистика. Учебное пособие. М.: Форум., 2007. - 160 с.

35. Скрипкина Ю.К., Кубанова А.А., Аковбян В.А., и др. Проблема диагностики и лечения урогенитального хламидиоза в России // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - Т. 41, № 2. - С. 5-8.

36. Шаткин А.А., Ильинский Ю.И., Покровский В.И., Гнутов И.Н. Хлами-диозы. Руководство по зоонозам. Л.: Медицина. - 1983. - С. 125-140.

37. Эйдельштейн И. А. Фундаментальные изменения в классификации хламидии и родственных им микроорганизмов, порядка Chlamydiales // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер. 1999. - Т. 1, № 1. - С. 5 - 11.

38. Эйдельштейн И.А., Эйдельштейн М.В., Нарезкина А.Д. Способ дифференциальной диагностики представителей семейства Chlamydiaceae. Патент RU 2245369 С1, 05.05.2003.

39. Эйдельштейн И.А., Эйдельштейн М.В., Нарезкина А.Д. Способ дифференциальной диагностики Chlamydia spp., Chlamydia pneumonia и возбудителей зоонозных хламидиозов. Патент RU 2241042 С1, 08.05.2003.

40. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований, 2-е изд., доп. СПб.: ВМедА., 2002. -266 с.

41. Amann R., Springer N., Schonhuber W., Ludwig W. at all. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. // Applied Environmental Microbiology. 1997. - Vol. 63. - P. 115 - 121.

42. Andersen P. Pathogenesis of lower respiratori tract infections due Chlamydia, Mycoplasma, Legionella and viruses // Thorax. 1998. - Vol. 53, N 4. - P. 302-307.

43. Anttila Т., Saikku P., Koskela P. et al. Serotypes of Chlamydia trachomatis and risk for development of cervical squamous cell carcinoma // JAMA. — 2001.-Vol. 285.- P. 47-51.

44. Azuma Y., Hirakawa H., Yamashita A., Cai T. at all. Genome sequence of the cat pathogen, Chlamydophila felis // DNA Research. 2006. - Vol. 13. - P. 15 -23.

45. Balin B.J., Gerard H.C., Arking E. J. et al. Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer's brain // Medical Microbiology and Immunology. 1998. - Vol. 187. - P. 23 - 42.

46. Bandea C.I., Kubota K., Brown T.M. et al. Typing of Chlamydia trachomatis strains from urine samples by amplification and sequencing the major outer membrane protein gene (ompl) // Sexually Transmitted Infections. 2001. -Vol. 77, N. 6.-P. 419-422.

47. Barwell C.F., Camb M.P. Laboratory infection of man with virus of enzootic abortion of ewes //Lancet. 1955. - Vol. 266, Issue 6905. - P. 1369 - 1370.

48. Bell T.A., Kuo C.-C., Wang S. P., and Grayston J. T. Experimental infection of baboons (Papio cynocephalus anubis) with Chlamydia pneumoniae strain 'TWAR' // Journal of Infection. 1989. - Vol. 19, Issue 1. - P. 47 - 49.

49. Birkelund S. and Stephens R.S. Construction of physical and genetic maps of Chlamydia trachomatis serovar L2 by pulsed-field gel electrophoresis // Journal of bacteriology. 1992. - Vol. 174, N. 9. - P. 2742 - 2747.

50. Birtles R. J., Rowbotham T. J., Storey C. et al. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae // Lancet. 1997. - Vol. 349, Issue 9056. - P. 891 -964.

51. Bodetti T.J., and Timms P. Detection of Chlamydia pneumoniae DNA and antigen in the circulating mononuclear cell fractions of Humans and Koalas // Infection and Immunity. 2000. - Vol. 68, N. 5. - P. 2744 - 2747.

52. Brenciani A., Bacciaglia A., Vecchi M. et al. Genetic Elements Carrying erm(B) in Streptococcus pyogenes and Association with tet{M) Tetracycline Resistance Gene // Antimicrobial agents and chemotherapy. — 2007. Vol. 51, N. 4.-P. 1209-1216.

53. Burton M.J., Holland M.J., Jeffries D. et al. Conjunctival chlamydial 16S ribo-somal RNA expression in trachoma: is chlamydial metabolic activity required for disease to develop? // Clinical Infectious Diseases. 2006. - Vol. 42, N. 4. -P. 463-470.

54. Bush R.M. and Everett K.D.E. Molecular evolution of the Chlamydiaceae // Int. journal of systematic and evolutionary microbiology. — 2001. Vol. 51, N. l.-P. 203-220.

55. Carlson J.H., Whitmire W.M., Crane D.D., Wicke L., Virtaneva K. The Chlamydia trachomatis Plasmid Is a Transcriptional Regulator of Chromosomal Genes and a Virulence Factor // Infection and Immunity. — 2008. Vol. 76, N. 6.-P. 2273-2283.

56. Carlson J.H., Porcella S.F., McClarty G., and Caldwell H.D. Comparative genomic analysis of Chlamydia trachomatis oculotropic and genitotropic strains // Infection and Immunity. 2005. Vol. 73, N. 10. - P. 6407 - 6418.

57. Chernesky M.A., Jang D., Lee H.H. et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis infections in men and women by testing first-void urine by ligase chain reaction // Journal of clinical microbiology. 1994. - Vol. 32, N. 11. - P. 2682 -2685.

58. Clarebout G. Real-time multiplex detection of three bacterial' species responsible for sexually-transmitted diseases. Patent WO 2007/137650 Al, 06.12.2007.

59. Crook Т., Bannister B. Acute transverse myelitis associated with Chlamydia pneumoniae infection // Journal of Infection-1992. —Vol. 2, N. 1. P.' 63 - 65:

60. Gomanducci M:, Ricci S:, Cevenini. R., Ratti G. Diversity of the Chlamydia"* trachomatis common plasmid in biovars with» different pathogenicity. // Plas-mid'. 1990! - N. 23. - P. 149 - 154.

61. Corsaro D;, Greub G. Pathogenic Potentialof NovelChlamydiae and'Diagnos-tic Approaches to Infections Due to. These Obligate Intracellular Bacteria// Clinical microbiology reviews. 2006. - Vol. 19, N. 2. - P: 283 - 297.

62. Cunningham Mi Compositions,.methods and kits for. determining the presence' of Chlamydophila1 pneumoniae in a test sample. Patent WO 2006/133385 A2, 14.1212006.

63. Dabiri H.f, Rezadehbashi M., Badami N. et al. Detection of Chlamydia pneumoniae in Atherosclerotic Plaques of Patients in «Tehran, Iran // Japanese journal! of infectious diseases. 2009: - Vol. 62, N. 3*. - P. 195 - 197.

64. Dugan J., Rockey D.D:, Jones L., Andersen A.A. Tetracycline Resistance in Chlamydia suis Mediated by Genomic Islands Inserted into the Chlamydial /wv-Like Gene // Antimicrobial agents and'chemotherapy. 2004: - Vol. 48, N. 10.-P. 3989 -3995'.

65. Edet E.E. The prevalence of Chlamydial trachomatis infection among gynaecological patients // British journal of clinical practice. 1993. - Vol. 47, NT. -P. 21-22.

66. Ellis R.W. Infection and coronary heart disease // Journal of medical microbiology. 1997. - Vol. 46. - P. 535 - 539.

67. Elnifro E.M., Cooper R. J., Klapper P.E. et al. Multiplex polymerase chain reaction for diagnosis of Viral and Chlamydial Keratoconjunctivitis // Investigative ophthalmology and visual science. 2000. - Vol. 41, N. 7. - P. 1818 — 1822.

68. Essig A., Rudolphi A., Heinemann M. et al. A Model of Genital Chlamydia trachomatis Infection Using Human Xenografts in Severe Combined Immuno-deficienc Mice // Infection and immunity. 1996. - Vol. 64, N. 6. - P. 2300 -2307.

69. Everett K. D., Bush R. M., Andersen A. A. Phylogenetic analysis of the codi-ny gene support the new Chlamydia taxonomy // 4 5th European Chlamydia Congress "Chlamydia 2000". Abstract book. - Helsinki. - 2000. - P. 5.

70. Everett K. D., Andersen A. A. The ribosomal intergenic spacer and domain I of the 23S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. // Int. journal of systematic bacteriology. 1997. - Vol. 47, N. 2. - P. 446 473.

71. Falck G., Heyman L., Gnarpe J. et al. Chlamydia pneumonia (TWAR): a common agent in acute bronchitis // Scandinavian journal of infectious diseases. 1994. - Vol. 26, N. 2. - P. 179 - 187.

72. Falck G., Engstrand I., Gnarpe J., Gnarpe H. Association of Chlamydia pneumoniae with otitis media in children // Scandinavian journal of infectious diseases. 1998. - Vol. 30, N. 4. - P. 377 - 380.

73. Farencena A., Comanducci M. Characterization of A New Isolate of Chlamydia trachomatis Which Lacks the Common Plasmid and Has Properties of Biovar trachoma // Infection and Immunity. 1997. - Vol. 65, N. 7. - P. 2965 -2969.

74. Fryer R.H., Schwobe E.P., Woods M.L., Rodgers G.M. Chlamydia species infect human vascular endothelial cells and induce procoagulant activity // Journal of investigative medicine. 1997. - Vol. 45, N. 4. - P. 168 - 174.

75. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants // Int. journal of systematic bacteriology. — 1992. Vol. 42, N 2. - P. 306 - 308.

76. Gaydos C.A. Chlamydia pneumonia and its proposed link to multiple sclerosis: To be or not to be? // Neurology. 2001. - Vol. 56, N. 1. - P. 1126 - 1127.

77. Girjes A.A., Hugall A.F., Timms P., and Lavin M.F. Two distinct forms of Chlamydia psittaci associated with disease and infertility in Phascolarctos cine-reus (Koala) // Infection and Immunity.-1988.-Vol. 56, N. 8. P. 1897 - 1900:

78. Girjes A. A., Hugall A., Graham D. M. et al. Comparison of type I and type II Chlamydia psittaci strains infecting koalas (Phascolarctos cinereus) II Veterinary microbiology. 1993. - Vol 37, N. 1. - P. 65 - 83.

79. Girjes A.A., Carrick F.N., and Lavin M.F. Lipopolysaccharide biosynthesis genes in koala type I Chlamydia:cloning and characterization // Research in microbiology. 1997. - Vol. 148. - P. 413 - 425.

80. Glassick Т., Giffard P., and- Timms P. Outer membrane protein 2' gene sequences indicate that Chlamydia pecorum and Chlamydia pneumoniae cause infections in koalas // Systematic and applied microbiology. 1996. - Vol. 19; N. l.-P. 457-464.

81. Grayston J. Т., Kuo C.-C., Campbell L. A., and Wang S. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR // Int. journal of systematic and evolutionary microbiology. 1989. - Vol. 39; N. 2. - P. 88 - 90:

82. Grayston J.T., Kuo C.-C., Wang S.-P., and Altman J. A new Chlamydia psit-taci strain; TWAR, isolated in acute respiratory tract infection // New Eng. journabof medicine. 1986: - Vol. 315, N. 3. - P. 161- 168.

83. Gullsby K, Storm M;, and Bondeson K. Simultaneous Detection:of Chlamydophila' pneumoniae andlMycoplasma pneumoniae by Use of Molecular Beacons in a Duplex Real-Time PGR // Journal"of clinical microbiology. 2008. -Vol-46,N. 2.-P. 727-731.

84. Hackstadt Т., Scidmore-Carlson M.A., Shaw E.I., and Fischer E.R. The Chlamydia trachomatis IncA-protein is required for homotypic vesicle fusion // Cellular. Microbiology. 1999. - Vol. 1, N. 2. - P. 119 - 130.

85. Hahn-D:?L., Dodge R.W. and'Golubjatnikov R. Association, of Chlamydia, pneumoniae (strain TWAR) infection^ with .wheezing, asthmatic bronchitis, and adult-onset asthma // JAMA. 1991. - Vol. 266, N. 2. - P:225 - 230.

86. Haidl S., Ivarsson S., Bjerre I., Persson, K. Guillain Barre syndrome after Chlamydia pneumoniae infection // New Eng. journal of medicine. — 1992. -Vol. 326.-P. 576-577.

87. Harland R: M. In situ hybridisation: an improved whole-mount method for Xenopus embryos // Methods in cell biology 1991. — Vol. 36, N. 1. — P. 685 -695.

88. Hartley J. C., Kaye S., Stevenson S., Bennett J. et al. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species // Clinical microbiology. — 2001. Vol. 39, N. 9. - P. 3072 - 3079.

89. Heick E. Skriver. Chlamydia pneumoniae associated ADEM (acute disseminated encephalomyelitis) // European Journal of Neurology. - 2000. - Vol. 7, N. 1. - P. 435-438.

90. Hogan R. J., Mathews S. A., Mukhopadhyay S. Chlamydial persistence: beyond the Biphasic Paradigm // Infection and immunity. 2004. - Vol. 72, N. 4.-P. 1843- 1855.

91. Holland S.M., Taylor H., Gaydos C.A. et al. Experimental infection with Chlamydophila pneumonia in nonhuman primates // Infection and immunity. 1990. - Vol. 58, N. 3. - P. 593 - 597.

92. Hyldig-Nielsen J.J., Godskesen M.A. PNA probes for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis. Patent US 6,169,169 Bl, 02.01.2001.

93. Inman R.D., Chiu B. Synoviocyte-packaged chlamydia*trachomatis induces a chronic aseptic arthritis // Journal of clinical investigation. — 1998. Vol. 102, N. 10.-P: 1776-1782.

94. Kahane S., Everett K. D. E., Kimmel N., Friedman M. G. Simkania negeven-sis strain Z: growth, antigenic and genome characteristics // Int. journal of systematic bacteriology. 1999. - Vol. 49, N. 1. - P. 815 - 820.

95. Klint Mi, Fuxelius H.-H., Goldkuhl R.R. et al. High-Resolution Genotyping of Chlamydia trachomatis Strains by Multilocus Sequence Analysis // Journal of clinical microbiology. 2007. - Vol. 45, N. 5. - P. 1410 - 1414.

96. Koskela P., Anttila Т., Bjorge T. et al. (Chlamydia trachomatis infection as a risk factor for invasive cervical cancer // Int. journabof cancer. 2000. - Vol. 85, N. Г.-Р:35-39.

97. Kuo C.-C., Jackson L.A., Gampbell L.A., and Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae (TWAR) // Clinical Microbiology Rev. 1995. - Vol. 8, № 4'. - P. 451-461.

98. Lampe M:F., Wilson C.B., Bevan M.J;, Starnbach M.N. Gammas interferon, production by cytotoxic T lymphocytes is required for resolution of Chlamy-dia trachomatis infection // Infection and immunity. 1998. - Vol. 66, N. 11. -P. 5457-5461.

99. Г15. bee H.H., Chernesky MIA'., xSchachter J. et al. Diagnosis of Chlamydia trachomatis genitourinary infection in women by ligase chain reaction assay of urine // Lancet. -1995. Vol. 345, Issue 8944. - P. 213 - 216.

100. Martin^ D.Hi, Koutsky L., Eschenbach D.A. et al. Prematurity and perinatal mortality inr pregnancies complicated by maternal Chlamydia trachomatis infections//JAMA-1982,-Vol. 247,N. 11. — P. 1585-1588.

101. Min-Chih Hsu, Pei-Yi" Tsai, Kow-Tong Chen, Lan-Hui Li. Genotyping of Chlamydia5 trachomatis from clinicalspecimens in Taiwan // Journal of medical microbiology. 2006. - Vol. 55, N. 3: - P. 301 - 308.

102. NortomR., Schepetiuk S., Кок T. Chlamydiaipneumoniae with endocarditis // Lancet. 1995: - Vol: 345, N. 8961. - P. 1376 - 1377.

103. Ossewaarde J. M., Rieffe M., Rozenberg Arska M. et al'. Development and clinical evaluation of a polymerase chain reaction test for detection of Chlamydia trachomatis // Journal of clinical microbiology. - 1992. - Vol. 30, N. 8. -P. 2122-2128.

104. Pal S., Hui W., Peterson E.M., de la Maza L.M. Factors influencing the induction of infertility in a mouse model of Chlamydia trachomatis ascending genital tract infection // Journal of medical microbiology. 1998: - Voh 47, N. 7. -P. 599-605.

105. Pannekoek Y., Arie-van der Endi, Eijk P.P. et al. Normal IncA Expression: and Fusogenicity of Inclusions in Chlamydia trachomatis Isolates with the incA I47T Mutation // Infection and immunity. 2001. - Vol. 69, N.7. - P. 4654-4656.

106. Patton D.L., and C.C. Kuo. Histopathology of Chlamydiatrachomatis salpingitis after primary and repeated- reinfections in the monkey subcutaneous, pocket model! // Journal of reproduction* and* fertility. 1989. - Vol. 85, N;l . -P. 647-656.

107. Patton D. L., Kuo C.C., Wang S.P. et al. Chlamydial infection in subcutaneous fimbrial transplants in cynomolgus and rhesus monkeys // Journal of infectious diseases. 1987. - Vol. 155, N. 1. - P. 229 - 235.

108. Patton D.L., Cosgrove Y.T., Kuo C.C., and Campbell bee Ann. Effects of Quinolone Analog CI-960 in a Monkey Model of Chlamydia trachomatis Salpingitis // Antimicrobial agents and chemotherapy. 1993. - Vol. 37, N. 1. -P. 8-13.

109. Patton D. L., Kuo C.-C., Wang S.-P., and Halbert S. A. Distal tubal obstruction induced by repeated Chlamydia trachomatis salpingeal infections in pig-tailed macaques // Journal of infectious diseases. 1987. - Vol. 155, N. 6. -P. 1292-1299.

110. Pedersen L.N., Kjaer H.O., Moller J. K. et al. High-resolution genotyping of Chlamydia trachomatis from recurrent urogenital infections // Journal of clinical microbiology. 2000. - Vol. 38, N. 8. - P. 3068 - 3071.

111. Peterson E.M., Markoff B.A., Schuchter J., de la Maza L.M. The 7, 5 kb plasmid present in Chlamydia trachomatis is not essential for the growth of this microorganism // Plasmid. 1990; - N. 23. - P. 144 - 148.

112. Poppert S., Essig A., Marre R. et al. Detection and Differentiation of Chlamy-diae by Fluorescence In Situ Hybridization // Applied and> environmental microbiology. 2002. - Vol. 68, N. 8. - P. 4081 - 4089.

113. Pudjiatmoko, Fukushi H., Ochiai Y., Yamaguchi Т., Hirai K. Phylogenetic analysis of the genus Chlamydia based1 on 16S rRNA gene sequences // Int. journal of systematic bacteriology. 1997. - Vol. 47, N. 2. - P. 425 - 431.

114. Read T. D., Brunham R. C., Shen C., at all. Genome sequences of Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39 // Nucleic acids research. 2000. - Vol. 28, N. 6. - P. 1397 - 1406.

115. Rodriguez P., Vekris A., Barbeyrac B: et al. Typing of Chlamydia trachomatis by restriction endonuclease analysis of the amplified major outer membrane protein gene // Journal of clinical microbiology. — 1991. Vol. 29, N: 6. - P. 1132-1136.

116. Ryan G., Abdella T.N., McNeeley S.G. et al. Chlamydiatrachomatis infection, in pregnancy and; effect of treatment on* pregnancy outcome // American journals obstetrics and,gynecology. 1990. - Vol: 1621 - P. 34 - 39:

117. Saikku P., Wang S. P:, Kleemola M. et ah An epidemic of mil& pneumonia due to an .unusual strain of Chlamydia psittaci II Journar of infectious diseases. 1985. - Vol: 151'. - P. 832 - 839:

118. Schifer H.G. Enteropathogenitat von Chlamydien // Deutsche medizinische Wochenschrift. 1994. Bd: 119, N. 117.-P. 1637- 1638.

119. Scidmore-Carlson M.A., Shaw Е.Г., Dooley C.A. et al. Identification and characterization of a Chlamydia trachomatis early operon encoding four novelun-clusion membrane proteins // Molecular microbiology. 1999. - Vol. 33- N. 4'.=-P. 753-765.

120. Schachter J., Ostler H.B., Meyer K. F. Human infection with the agent of feline pneumonitis //Lancet. 1969. - Vol. 1. - P. 1063 - 1065.

121. Schachter J., Stoner E., and Moncada J. Screening for chlamydial infections in women attending family planning clinics // Western journal of medicine. -1983.-Vol. 138.-P. 375-379.

122. Schachter J., Stamm W.E., Qiunn T.C. et al. Ligase chain reastion to detect Chlamydia trachomatis infection of the cervix // Journal of clinical microbiology. 1994. - Vol. 32, N.l 0. - P. 2540 - 2543.

123. Somani J., Bhullar V.B., Workowski K.A. et al. Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure // Journal of infectious diseases. -2000. Vol. 181, N. 4. - P. 1421 - 1427.

124. Stamp J.T., Me Ewen A.D., Watt J.A., Nisbet J. Enzootic abortion in ewes; transmission of the disease // Vet. record. 1950. - Vol: 62. - P. 251 - 254.

125. Stephens, R.S. Chlamydia. Intracellular Biology // Pathogenesis and Immunity. Washington: ASM Press. 1999. - 321P.

126. Storey C., Lusher M., Yates P., and Richmond S. Evidence for Chlamydia pneumoniae of non-human origin // Journal of general microbiology. 1993. — Vol. 39.-P. 2621-2626.

127. Stothard D.R., Williams J.A. Identification of a Chlamydia trachomatis Sero-var E Urogenital Isolate Which Lacks the Cryptic Plasmid // Infection and immunity. 1998. - Vol. 66, N. 12. - P. 6010 - 6013.

128. Stratton C.W., Mitchell W.M., Sriram S. Does Chlamydia pneumoniae play a role in pathogenesis of multiple sclerosis? // Journal of medical microbiology. 2000. - Vol. 49, N. 1. - P. 1 - 3.

129. Suchland R.J., Rockey D.D., Weeks S.K. et al. Development of Secondary Inclusions in Cells Infected by Chlamydia trachomatis // Infection and immunity. 2005. - Vol. 73, N. 7. - P. 3954 - 3962.

130. Suchland R.J., Rockey D.D., Bannantine J.P., Stamm W.E. Isolates of Chlamydia trachomatis Lack IncA, a Protein Localized to the Inclusion Membrane // Infection and immunity. 2000. - Vol. 68, N. 1. - P. 360 - 367.

131. Suchland R.J., Stamm W.E. Simplified microtiter cell culture method for rapid immunotyping of Chlamydia trachomatis // Journal of clinical microbiology. -1991.-Vol. 29, N. 7.-P. 1333-1338.

132. Sweet R. L., Landers D.V., Walker C., and Schachter J. Chlamydia trachomatis infection and pregnancy outcome // American journal of obstetrics and gynecology. 1987. - Vol. 156. - P. 824 - 833.

133. Sziller I., Babula O., Ujhazy A. et al. Chlamydia trachomatis infection, Fallopian tube damage and a mannose-binding lectin codon 54 gene polymorphism // Human Reproduction. 2007. - Vol. 22, N.7. - P. 1861 - 1865.

134. Tamura K., Dudley J., Nei M. and Kumar S. MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolutionary. 2007. - Vol. 24, N. 8. - P. 1596 - 1599.

135. Thom D. Lower respiratory tract infection with Chlamydia pneumonia // Archives of family medicine. 1994. - Vol. 3, N 9. - P. 828 - 832.

136. Thomas N.S., Lusher M., Storey C.C. and Clarke I.N. Plasmid diversity in Chlamydia II Microbiology. 1997. - Vol. 143. - P. 1847 - 1854.

137. Thomson N.R., Holden M.T., Carder C. et all. Chlamydia trachomatis: Genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates // Genome research.-2008.-Vol. 18, N. l.-P. 161-171.

138. Timms P. Novel diagnostic agents of chronic or persistent Chlamydial diseases and uses thereof. Patent WO 02/14516 Al, 21.02.2002.

139. Tracey J. Bodetti, Timms P. Detection of Chlamydia pneumoniae DNA and Antigen in the Circulating Mononuclear Cell Fractions of Humans and Koalas // Infection and immunity. 2000. - Vol. 68, N. 5. - P. 2744 - 2747.

140. Trama J., Mordechai E., Adelson M.E. Methods and compositions for detecting serotypes of Chlamydia trachomatis capable of causing lymphogranuloma venereum. Patent US2007269810 (Al), 22.11.2007.

141. Vanrompay D., Hoang T. Q. Т., Liselotte De Vos. Specific-Pathogen-Free Pigs as an Animal Model for Studying Chlamydia trachomatis Genital Infection // Infection and immunity. 2005. - Vol. 73, N. 12. - P. 8317 - 8321.

142. Ward M.E. The immunobiology and immunopathology of Chlamydial infections // Acta path, et microb. Scandinavica. 1995. - Vol. 103. - P. 769 - 796.

143. Wills J.M., Watson G., Lusher M. et al. Characterisation of Chlamydia psittaci isolated from a horse // Vet. Microbiol. 1990. - Vol: 24. - P. 11 - 19.

144. Yang Z.-P., Kuo C.-C., and Grayston J. T. A mouse model of Chlamydia pneumoniae strain TWAR pneumonitis // Infection and5 immunity. 1993": — Vol. 6Г, N. 5. - P. 2037-2040.

145. Yang Z.-P., Kuo C.-C., and Grayston Ji T. Systemic dissemination, of Chlamydia pneumoniae following' intranasal inoculation' in1 mice // Journal- of infectious diseases. 1995. - Vol. 171. - P. 736-738.

146. Yang Z.-P:, Cummings P.K., Patton D.L., and KuorC.-C. UltrastructuraHung pathology of experimental Chlamydia pneumoniae pneumonitis in mice // Journal of infectious diseases. 1994: - Vol. 170: - P. 464M67.

147. Zelin J. M., Robinson A. J. et al. Chlamydial ,urethritis in heterosexual men attending a genitourinary medicine clinic: prevalence, symptoms condom usage and partner change // Int. J. STD AIDS. 1995. - Vol. 6. - P. 27 - 30.

148. Zhongyu Li, Ding- Chen, Youmin Zhong, et al. The Chlamydial Plasmid-Encoded Protein- pgp3 Is Secreted into the Cytosol of Chlamydia-Infected Cells // Infection and immunity. 2008. - Vol. 76, N. 8. - P. 3415-3428.