Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спонтанный и экспериментальный гепатит А низших обезьян Старого Света

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Спонтанный и экспериментальный гепатит А низших обезьян Старого Света"

' ъ .о

<ч На правах рукописи

№

КОРЗАЯ ЛИДИЯ ИВАНОВНА

СПОНТАННЫЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ГЕПАТИТ А НИЗШИХ ОБЕЗЬЯН СТАРОГО СВЕТА.

03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА -1999

Работа выполнена в Институте медицинской приматологии РАГ< (г. Сочи).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Б .А. Лапин

доктор медицинских наук, профессор, академик РНАН З.В. Шевцова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН Т.Г. Бектимнров.

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН В.В. Погодина

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН М.И. Михайлов

Ведущее научное учреждение: Институт полиомиелита и вирусньп энцефалитов РАМН.

Защита диссертации состоится ^^ ¡.и-Сущ ги^ ^999 г в . часов на заседании Специализированного Ученого Совета (Д.001.20.02) в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Вирусные гепатиты - одна из наиболее сложных и интересных медицинских проблем. Благодаря бурному прогрессу в изучении вирусных гепатитов за последние 30 лет, стало известно, что причиной их возникновения являются по крайней мере 7 различных вирусов вирусов, 2 из которых передаются энтеральным путем - гепатиты А и Е, а 5 - парентеральным - гепатиты В, С, D, G и GB-C (Львов Д.К., 1998; Bnkh J. et al., 1997; Miyakawa Y et al., 1997).

Гепатит А представляет серьезную проблему для здравоохранения, особенно в странах с низким социально-культурным уровнем и вызывает тревогу в связи с массовостью поражения. В Российской Федерации, гепатиту А принадлежит первое место в общей структуре инфекционных гепатитов, хотя и отмечается тенденция к его снижению (Шахгильдян И.В. и др., 1994; Оннпценко Г.Г., 1997).

В последние годы существенно поколеблен рад положений, касающихся вопросов патогенеза, клиники а эпидемиологии гепатита А. На фоне господствующих представлений о том, что ГА почти всегда является доброкачественным, остро протекающим заболеванием без тяжелых осложнений и хронизации имеются данные о существовании затяжных и рецидивирующих форм (Хохлов Д.М. и др., 1988; Куперштейн А.П., 1993; Jacobson I.M. et al., 1985; Sjogren M.H. et al., 1987; Van den Anker J.N. et al., 1987; Flehmig B. et al., 1990), о возможности появления среди детей в отдельные сезоны средне-тяжелых, тяжелых и даже злокачественных форм ГА, с проявлениями острой печеночной энцефалопатии, а также наклонностью к затяжной реконвалесценци (РеЙзис А.Р., 1997).

Обезьяны являются единственной экспериментальной моделью вирусных гепатитов. Поэтому только на них могут быть изучены эти многие другие неясные вопросы патогенеза и иммуногенеза ГА, такие как, например, прочность и продолжительность иммунитета к ГА, роль в нем клеточных факторов; длительность сохранения ВГА в организме, продолжительность его выделения в окружающую среду, сохранение в иммунном организме, возможность его внепеченочной локализации - важные для понимания как патогенеза, так и эпидемиологии инфекции.

Экспериментальная модель ГА на обезьянах необходима для проверки как уже полученных, так и разрабатываемых вакцин и других противовирусных препаратов. Исследования по проверке вакцин не должны ограничиваются только лишь изучением их вммуно-генности, т.е. антагельного ответа. Необходимо также изучение более важных для оценки вакцин протективных свойств, обеспечивающих невосприимчивость организма к повторному заражению патогенным штаммом, а также проверки их безопасности, т.е. остаточной вирулентности.

Существующие модели ГА на шимпанзе, тамаринах и панамских ночных обезьянах (J.L.Deiostag et al., 1975; F.Ddnhardt, 1976; Provost et al., 1977, J.W.Le Duc et al., 1983) внесли огромный вклад в изучение этой инфекции. Однако при их использовании исследователи встречаются с большими трудностями экономического и практического плана. Стоимость шимпанзе высока и для их использования в экспериментах требуется специальное разрешение. Игрунки также малодоступны: численность поголовья этих южноамериканских обезьян в природных условиях резко сократилась, а разведение их в питомниках - дело чрезвычайно трудное в связи с большими требованиями к условиям содержания. Наиболее перспективное направление - поиск подходящей модели для воспроизведения ГА на низших обезьянах Старого Света, которые более доступны и экономически выгодны.

К моменту начала наших исследований (1985 г.) попытки экспериментального воспроизведения ГА на более доступных низших обезьянах Старого Света с помощью штамма ВГА человека были безуспешными (F.Deinhardt, 1976; R.H.Purcell, J.L.Dienstag, 1978). Более того, среди ученых сложилось прочное мнение о тон, что естественное инфицирование низших обезьян Старого Света ВГА происходит бессимптомно и сопровождается лишь сероконверсией (R.H.Purcell et al., 1975; D.A.Peterson, 1979; J.W.Eichderg, S.S.Kalter, 1988; J.W.Le Duc et al., 1981; С.С.Савинская и др., 1983). Описан был лишь один случай спонтанного ГА у макака яванского, спровоцированный действием иммунодепрессашов (А. Г.Анджапаридзе и др., 1985).

Вместе с тем, длительный опыт изучения спонтанной патологии низших обезьян Старого Света, содержащихся в Сухумском питомнике, свидетельствовал о наличии у них поражений печени, весьма сходных по морфологической характеристике с вирусными

гепатитами человека. Частота этих гепатитов значительно возросла к середине 80-х. В 1985 году под руководством академика В.А. Лапина и профессора З.В. Шевцовой в НИИЭПиТ АМН СССР было начато целенаправленное комплексное исследование по изучению спонтанного и экспериментального ГА у нескольких видов низших обезьян Старого Света. Работа проводилась в течение 8 лет (1985-1992 г.г.) на базе лаборатории вирусных инфекций с участием сотрудников других подразделений - лаборатории патанатомни (д.м.н. Р.И. Крылова, вет. врач Е.Г. Белова) и зоотехнического отдела (к.м.н. З.Н. Джелиева). На первых этапах выполнение отдельных фрагментов работы осуществлялись в сотрудничестве с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского (д.м.н. Н.В. Дорошенко, профессор В.А. Ананьев, профессор В.М. Стаханова) и Институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (д.м.н. А.Г. Анджапаридзе, завлаб., профессор Балаян М.С.)

Данные, представленные в диссертации по изучению спонтанного и экспериментального ГА на низших обезьянах Старого Света, являются частью многолетнего исследования большого коллектива.

Радикальные успехи в борьбе с гепатитом А невозможны также без создания высокоспецифических средств профилактики и диагностики, основным компонентом для конструирования которых являются кулыуральные штаммы. За рубежом имеется несколько таких штаммов ВГА человека (CR-326, MS-1, SD11, НМ-175), используемых как для моделирования ГА на мармозетах, так и для производства вакцин и иммунодиагностических препаратов. В России для этих целей используется штамм HAS-15, полученный из-за рубежа (Ю.Ю. Кусов Ю.Ю н др., 1985), кроме того ведутся поиски новых высокопродуктивных отечественных штаммов ВГА (Фарашян В.Р. и соавт., 1989, 1991; Быченко А.Б. и соавт., 1992; Майданюк А.Г. и соавт., 1993, 1995). Одним из существенных недостатков уже используемых штаммов является отсутствие патогенностя для других видов обезьян, помимо мармозет, которые малодоступны и не могут быть использованы для моделирования ГА и испытания вакцин в широких масштабах.

Выделение от обезьян штаммов ВГА, имеющих тесное антигенное родство с ВГА-человека, открывает новые перспективы их практического использования, как в качестве реагентов для иммунодиагностических препаратов, так н штаммов-продуцентов для производства вакцин (Анджапаридзе А.Г. и соавт., 1986; Binn L.N. et al., 1984; Pnrcell R.H., 1991). Представляет также интерес изучение вопроса об

использовании низших обезьян Старого Света в качестве доноров для получения антн-ВГА содержащих сывороток с целью приготовления антительных компонентов иммунодиагностикумов.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования явилось изучение спонтанного и экспериментального ГА низших обезьян Старого Света в сравнительно видовом аспекте с помощью серологических и вирусологических методов, оценка адекватности разработанных биомоделей ГА на павианах гамадрилах и макаках резусах ГА человека и использование их для изучения патогенеза и иммуногенеза. Предметом исследования также явилось выделение и адаптация в культурам клеток ВГА от обезьян н человека, изучение их свойств и возможности практического применения.

В задачи исследования входило:

- сероэпизоотологическая характеристика спонтанного ГА низших обезьян Старого Света в сравнительно видовом аспекте;

- получение серологических и вирусологических доказательства этиологической роли ВГА при спонтанном гепатите обезьян, привезенных из мест естественного обитания и протекающим с биохимическими и морфологическими признаками;

- вьщеяение вативных иэолятов ВГА от обезьян со спонтанной инфекцией и изучение их свойств;

- адаптация к культурам клеток выделенных от низших обезьян и человека вативных штаммов ВГА, изучение их морфологических, антигенных и молекулярно-бнологнческих свойств, а также патогенности культуральных вариантов ВГА для обезьян и определение возможностей их практического использования;

- разработка экспериментальных моделей ГА на павианах гамадрилах и макаках с помощью штаммов ВГА, выделенных от обезьян, а на павианах - и с помощью штамма ВГА человека, оценка адекватности этих моделей ГА человека;

- использование экспериментальных моделей ГА обезьян для изучения характеристики первичной и повторной инфекции (показатели специфического гуморального иммунитета, длительность вирусовьзделения и вероятность существования затяжных и хронических форм).

- получение гипериммунных сывороток от инфицированных ГА обезьян и изучение возможности их практического использования.

Научная новизна работы.

Впервые получены не только серологические, но и вирусологические доказательства спонтанного ГА у макак резусов и павианов гамадрилов. Эти доказательства внесли ценный вклад в большое комплексное изучение спонтанного ГА обезьян этих видов, показав этиологическую роль ВГА в заболевании, протекающем с биохимическими и морфологическими изменениями, характерными для ГА.

Впервые проведен сравнительный эпизоотологический анализ вспышек ГА у разных видов обезьян Старого Света и установлены общие закономерности.

Экспериментально доказано, что среди указанных видов обезьян имеет место циркуляция штаммов ВГА, которые по своим морфологическим, антигенным и биологическим свойствам сходны как между собой, так и с ВГА человека

Впервые получены экспериментальные модели ГА на павианах гамадрилах с помощью штдомов от обезьян и человека. Проведенный сравнительный аналпз показал адекватность этих моделей разработанным ранее на макаках н зеленых мартышках, а также ГА человека.

Впервые показано, что экспериментальные модели ГА павианов гамадрилов можно использовать для изучения вопросов пато-и иммуногенеза ГА. При этом была показана возможность хронизации инфекции и персистенции вируса.

Впервые на модели спонтанного и экспериментального ГА обезьян были изучены специфические факторы гуморального иммунитета при первичной и повторной инфекции. Показана возможность неоднократной экспериментальной реянфекции ГА у обезьян, имеющих анти-ВГА, приобретенные в результате как естественной, так и экспериментальной инфекции, причем особый интерес представляют данные о том, что при отсутствии морфологических изменений, а в сыворотке -иммуноглобулинов класса М, наблюдается длительное выделение ВГА с фекалиями.

В целом, результаты работы имеют значение для понимания природы возвудителей ГА, а также некоторых вопросов паю- и иммуногенеза.

Практическая значимость работы.

1. Разработка моделей ГА на макаках и павианах гамадрилах с помощью полученных от них штаммов расширила спектр

- б

обезьян, которые могут быть использованы для моделирования этой инфекции. Использование штаммов ВГЛ, полученных от обезьян, предпочтительнее в плане их большей безопасности при работе по сравнению со штаммами ВГА человека.

2. Полученные модели спонтанного и экспериментального ГА павианов гамадрилов предлагаются использовать как для изучения нерешенных вопросов пато- н иммуногенеза инфекции, так и для оценки безопасности и эффективности разрабатываемых средств ее профилактики и лечения.

3. Модели ГА на низших обезьянах Старого Света более доступны и экономически выгодны, чем предшествующие аналоги на шимпанзе, игрунках и ночных обезьянах.

4. Кулыуральные штаммы ВГА обезьяньего происхождения и гипериммунные сыворотки к ним предлагаются в качестве антигенного и антительного компонентов соответственно при производстве иммуно-диагностических препаратов.

5. Выявленная персистенция ВГА с фекалиями при затяжном и хроническом течении процесса на обезьянах, а также длительное вирусовыделение при реинфекциях (при отсутствии в ряде случаев всех других лабораторных показателей), должны привлечь внимание клиницистов и особенно эпидемиологов в плане дополнительного изучения этого вопроса и, возможно, разработки дополнительных мер диагностики таких случаев ГА у человека.

6. Низшие обезьяны Старого Света могут служить эпизоотологи-ческой моделью ГА.

В результате проведенной работы были паспортизованы и депонированы в Государственную коллекцию вирусов 4 оригинальных авторских штамма ВГА:

1. Штамм ВГА от макак резусов - ВГА-МР, номер депонента ГКВ N835 от 28.06.1988 г.;

2. Штамм ВГА от павианов гамадрилов - ВГА-ПГ, номер депонента ГКВ N2256 от 12.10.90 г.;

3. Штамм ВГА человека - ВГА-ЧЗ, номер депонента ГКВ N833 от 28.06.1988 г.;

4. Штамм ВГА от зеленых мартышек - ВГА-ЗМ, номер депонента ГКВ N834 от 28.06.1988 г.

Штамм ВГА-ЧЗ защищен авторским свидетельством N 1547311 на изобретение "Штамм Viras hepatitis A hominis для моделирования

инфекции на макаках, изучения патогенеза, иммуногенеза и контроля вакцин" от 1.11.1989

Основные положения, выносимые на защиту.

1.Серологические и вирусологические данные свидетельствуют о том, что этиологическим агентом спонтанного заболевания низших обезьян Старого Света (макак резусов и павианов гамадрилов), протекающего с биохимическими и морфологическими признаками ГА, являются штаммы ВГА, по морфологическим, антигенным и биологическим свойствам сходные с ВГА человека.

2. Анализ вспышек ГА среди макак (резусы, бурые), павианов гамадрилов и зеленых мартышек свидетельствует о наличии общих эпизоотологических закономерностей.

3. Новые экспериментальные модели ГА на павианах гамадрилах и макаках резусах, полученные с помощью штаммов ВГА от обезьян и человека, не менее адекватны .ГА человека, чем имеющиеся аналоги и могут быть использованы для изучения вопросов пато- и иммуногенеза инфекции и проверки эффективности средств профилактики и лечения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии" (Сухуми, 1987); ХУ Конгрессе международного приматологического общества (Кн1а-ВаН, Индонезия, 1994.

В завершенном виде диссертационная работа была доложена и обсуждена на заседании ученого Совета Института медицинской приматологии РАМН (Сочи, 30 июня 1998).

По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), собственных исследований (б глав), обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 214 отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 27 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования явились низшие обезьяны Старого Света, относящиеся к отряду узконосых (Catarrbina), семейству мартышкообразных (Cercopithecidae): род макак (Macaca) - макаки резусы (М. mulatta), макаки яванские (М. fascicularis) и макаки бурые (М. arctoides); род павианов (Papio) - павианы гамадрилы (Р. hamadryas); род мартышек (Cercopithecus) - зеленые мартышки (С. aethiops). Всего в работе было использовано 633 обезьяны: 594 - при изучении спонтанного ГА и 39 - при воспроизведении экспериментальной инфекции.

С целью изучения инфицированности обезьян ВГА под наблюдением находилось 594 животных: 269 макак резусов в возрасте от 1 до 26 лет, из них родившихся в питомнике - 69 (2 группы), прибывших из Вьетнама - 210 (5 групп); 42 макака яванских, прибывших из Индонезии (1 группа); 40 макак бурых, родившихся в Тамышском филиале Сухумского питомника (1 группа); 193 павиана гамадрила в возрасте от 1 до 20 лет, содержащихся в Сухумском питомнике на различных участках, из них родившихся в питомнике - 141 (5 групп), привезенных из Эфиопии - 52 (2 группы); 46 зеленых мартышек из Кении (2 группы).

Одни группы обезьян (308 особей) были обследованы только серологически - однократно или в динамике, другие (286 особей) -комплексно - серологически и вирусологически, с привлечением биохимических и морфологических данных).

Всего для заражения было использовано 39 обезьян, из них: 18 макак резусов, 16 павианов гамадрилов и 5 макак яванских.

Для первичного заражения было использовано 16 серонег&тввных павианов гамадрилов (возраст от 0,5 до 2,5 лет) и 5 макак яванских (возраст от 9 до 13 месяцев), родившихся в Сухумском питомнике, а также 6 макак резусов, прибывших из Вьетнама и прошедших 2-х месячный карантин (возраст 5-10 лет). Эти обезьяны по данным предварительного комплексного обследования в течение 1,5 месяцев (серологическое, вирусологическое, биохимическое и морфологическое) не были инфицированы ВГА. После первичного заражения животных обследовали на протяжении 0,5-11,5 месяцев.

Для повторного заражения использовали 12 серопозитивных макак в возрасте 2-12 лег. Девять из этих обезьян, прибывшие из Вьетнама, ранее (1-2 года назад) были подвергнуты первичному экспериментальному заражению штаммами ВГА. Три макаки были рождены в

Сухумском питомнике и естественно инфицированы ВГА в различные сроки. После повторного заражения ВГА животных обследовали на протяжении 4-20 месяцев.

Штаммы ВГА для заражения обезьян: ВГА-МР и ВГА-ПГ, выделенные от макак резусов и павианов гамадрилов со спонтанной инфекцией и ВГА-ЧЗ - от больного человека, которые по антигенным и морфологическим свойствам не отличались от ВГА человека (Государственная коллекция вирусов - № 835, № 2256, и №833 - авт. свид. М 15473 от 01.11.89). Штаммы ВГА были использованы в виде различных его нзолятов (пативного материала или клеточного лизата).

Как после первичного, так и повторного заражения обезьян применялся следующий график сбора материалов для серологических и вирусологических исследований. В течение первых 2 мес. после заражения фекалии от животных собирали ежедневно, а сыворотку - 2 раза в над. В последующие сроки сбор фекалий осуществляли 3 раза в нед., а сыворотки - 1 раз. Параллельно производили сбор материалов для биохимических (сыворотки) и морфологических (биоптаты печени) исследований. Взятие биоптатов печени осуществлялось комп-лексерамн в течение первых 2-х месяцев - 2-4 раза в месяц, в последующем - 1-2 раза. Сыворотки крови получали путем венепункции после фиксирования животных.

Серологически было проверено 2450 образцов сывороток спонтанно инфицированных и экспериментально зараженных ВГА обезьян. Вирусологическому исследованию было подвергнуто 3810 проб фекалий и печени. Морфологически комплексерами были изучены органы 28 аутопсированных обезьян и 460 биоптатов печени, биохимически было исследовано 1887 проб сывороток.

Для заражения культур клеток было использовано 44 ВГА-содер-жащнх фекальных и печеночных изолята от 25 спонтанно заболевших обезьян Сухумского питомника, а также от 10 экспериментально зараженных этими изолятами обезьян. Кроме этого, в клеточных линиях был испытан изо ляг ВГА из фекалий больного человека с острым ГА и 4 изолята - от экспериментальных животных. Вирусологически было исследовано 2435 кулмуральных проб.

В работе были использованы перевиваемые культуры клеток почки зеленой мартышки (AGMK, 4647, Vero) и почки эмбриона макака резуса (FRhk-4). Клеточная линия AGMK была получена из Института микробиологии АН Латвийской ССР им. А. Кирхенштейна, культуры клеток 4647 и Vero - из музея культур клеток Института

вирусологии им. Д.И.Ивановского, РКЫс-4 - из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Для культивирования клеточных линий использовали готовые среды производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР: среду 199 и среду Игла, эмбриональную сыворотку и сыворотку крупного рогатого скота, Ь-глютамин и антибиотики (пенициллин и стрептомицин). Применялись ростовые и поддерживающие среды.

В работе были использованы иммуноферментные тест-системы для определения антигена ВГА и анти-ВГА суммарных, приготовленные ГМП "Препарат", Нижний Новгород. При определении анти-ВГА класса М - применялись диагностикумы "Диагногеп" Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (Москва) и "Диавект" -производства "Вектор", Новосибирск.

Были использованы внутривенный и плюральный пути заражения обезьян и следующие методы их обследования: вирусологические (иммуноферментный, иммуно-электрономикроскопический, выделение вируса в культурах клеток), серологический (иммуноферментный), молекулярно-биологический (детекция РНК ВГА методом дот-блот гибридизации).

Для более полной характеристики спонтанного и экспериментального ГА комлексерами были выполнены биохимические (определение активности сывороточной АлАТ), и морфологические (биопсия печени, аутопсия) методы исследования.

Для вирусологических исследований использовали материалы от обезьян в виде 10 % суспензий фекалий и 2 % суспензии печени, приготовленной на растворе Хенкса или фосфатносолевом буферном растворе с рН 7,2-7,4. Материалы очищали последовательным двукратным центрифугированием при 3-4000 об/мин. и 8-10000 об/мин. в течение 30 мин.

Содержащий ВГА материал вводили обезьянам в виде бактериологически стерильных 10 % суспензии фекалий, либо клеточного лизата комбинированно: 2,0 мл внутривенно и 2,0 мл перорально.

Правила и условия содержания вновь прибывших и экспериментальных обезьян. Наблюдение за вновь прибывшими из мест естественного обитания (Вьетнам, Эфиопия, Кения) обезьянами проводили в течение 5-13 месяцев после поступления их в питомник. Во время пребывания в карантине (не менее двух месяцев) обезьян содержали изолированно - в отдельных боксах в индивидуальных клетках стандартного типа (по 1-2 особи в каждой), строго соблюдая правила

инфекционного режима б соответствии с методическими рекомецда-цпями института. Индивидуальные металлические поддоны ежедневно очищали, мыли водой и подвергали дезинфекции.

Экспериментальных животных, зараженных различными штаммами ВГА, также содержали в отдельных боксах в индивидуальных клетках стандартного типа (по 1 особи в каждой) при строжайшем соблюдении санитарно-гигиенического и противоэпидемического режима, предотвращающего перекрестное заражение.

Ag ВГА в кулмуральных пробах и суспензиях фекалий, а также антн-ВГА суммарные в пробах сывороток обезьян определяли пммуно-ферментным анализом (ИФА) по методике W. Dtiermeyer et al., (1980) в твердой фазе с помощью коммерческих диагностикумов, согласно прилагаемым инструкциям. В качестве антигена использовали кулмуральный штамм HAS-15, в качестве антисыворотаи - иммуноглобулин, полученный из сыворотки реконвалесцента с высоким титром антн-ВГА (суммарных) или класса М. Результаты реакции учитывали на спектрофотометре "Uniskan" фирмы "Flow" с использованием фильтра с длиной волны 492 нм.

Вирусные частицы в исследуемых пробах обнаруживали с помощью иммунозлектронной микроскопии (ИЭМ) по ¿Tavelle C.R. et al., 1975. Использовали аттестированные сыворотки, содержащие анти-ВГА. Просмотр препаратов осуществляли в электронном микроскопе JEM-100В при инструментальном увеличении 5000Q-100000.

РНК ВГА определяли с помощью реакции молекулярной (дот-блот) гибридизации (РМГ). Вирусную РНК выделяли непосредственно из цитоплазмы инфицированных клеток путем лизнрования их равным объемом буфера, содержащего 0,28 М NaCl, 3 шМ MgClj, 3 мМ MgCl2, 20 mM трис-HCl, рН 8,6, 1% NP-40. После осаждения ядер, митохондрий и клеточного детрита из над осадочной жидкости и осветленной КЖ выделяли тотальную РНК традиционным детергентно-фенольным методом. В качестве зонда использовали олигонуклеотид CTCTTTATTATTTGAATT, комплементарный последовательности генома ВГА между 2271 и 2290 нуклеотндамн в пределах области VPj (IJnemeyer D.L. et al., 1985). 5'- конец пробы метали при помощи j-32p-AT<D и полинуклеотидкиназы в соответствии с рекомендациями изготовителя (НПО "Фермент", Вильнюс).

Культивирование клеточных линий. При культивировании AGMK и FRhk-4 применяли среду Игла с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, L-глютамина и антибиотиков (пенициллин и

стрептомицин по 100 ЕД/мл), при культивировании 4647 и Vero вместо эмбриональной сыворотки использовали 10% сыворотку крупного рогатого скота. Клетки выращивали по общепринятой методике при 37°С во флаконах площадью 72 см^ при использовании среды Игла с 10% эмбриональной сывороткой..

Заражение культур клеток ВГА. Для заражения использовали клетки в состоянии молодого монослоя (на 2-3 сутки после пересева) во флаконах различной площадью - от 25 до 72 см^. Вируссодер-жащий материал наносили на поверхность монослоя по 2,0 мл в разведении 1:5. Контакт вируса с клетками осуществляли в течение 2 часов при температуре 37° С. Инфицированные клетки инкубировали при 32°, 35° и 37° С в течение 7-30 суток в зависимости от используемой культуры. Смену поддерживающей среды (с 1% эмбриональной или сывороткой коров) проводили 1 раз в неделю. Культуральные пробы отбирали в виде клеточного лизата (КЛ), либо культуральной жидкости (КЖ). Для получения клеточного лизата клетки снимали со стекла при помощи 0,02% раствора Версена, затем ресуспеццировали в 2,5 мл раствора Хенкса и подвергали трехкратному замораживанию я оттаиванию. Такие материалы использовали для последующего заражения культур клеток и для определения ВГА.

Концентрация ВГА в культуральных пробах. Осаждение вируса сульфатом аммония производилась по методике Кусова Ю.Ю. с соавт. (1986). Осаждение вируса полнэтиленгликолем в присутствии хлорида натрия, а также осаждение вируса ультрацентрифугированием осуществлялось по общепринятой методике (Мейхи Б., 1985).

Активность АлАТ определяли микромегодом по Покровскому A.A. (1969) и выражали в микромолях субстрата в 1 литре сыворотки за 1 минуту (мкмоль/л/мин). Сыворотки для исследования готовили в течение 30 мин. При невозможности немедленного тестирования, сыворотки сохраняли в замороженном состоянии.

Пункционную биопсию печени осуществляли с помощью иглы Менгини с анестезией (кетамин-гидрохлорид). Для гистологического исследования материалы фиксировали в 10% нейтральном формалине. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином

Полученные результаты обработаны общепринятыми методами ста-. тистики (Ашмарин И.П., 1962, Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика спонтанного ГА обеаьян. Серологическое обследование нескольких видов низших обезьян Старого Света на наличие анти-ВГА суммарных и класса M показало различную степень их инфицированноста ВГА в естественных условиях. Среди родившихся в питомнике н прибывших из мест естественного обитания (обследование спустя 2 мес. пребывания в карантине) макак резусов и павианов гамадрилов были группы с высоким (73-95 %), средним (3358 %) и низким (2-19 X) содержанием ВГА-позитивных животных, кроме того, встречались группы, состоящие только из серонегативных обезьян (рис. 1). Инфицированность ВГА зеленых мартышек из Кении и макак яванских из Индонезии была высокой (86-100 %). Анти-ВГА класса M обнаруживались у привозных животных (2,4-78 %).

В результате проведенных исследований нами были получены серозпизоотологические данные, указывающие на то, что инфицирование обезьян ВГА в ряде случаев происходило до поступления в питомник (одной или нескольких особей), а дальнейшее распространение инфекции осуществлялось последовательно внутри партии с помощью фекально-оральной передачи. Это согласуется с результатами, полученными при эпизоотии ГА среди ночных обезьян (Le Duc et al., 1981). Однако мы также имеем данные, подтверждающие инфицирование обезьян и внутри питомника - в течение 2-х месячного карантина и даже 4-5 месяцев после прибытия их из мест естественного обитания, как это, например, произошло в одной из групп макак резусов из Вьетнама (рис. 2.) Ситуация была аналогична таковой в детских коллективах, когда, при отсутствии иммунной прослойки и попадании возбудителя, начиналась интенсивная циркуляция вируса, приводящая к 100 % инфицированию.

Среди некоторых групп павианов, родившихся в питомнике и находившихся в условиях изолированного содержания, инфицирование также произошло лишь спустя нескольких месяцев или лет (в возрасте 5-10 лет) н, как правило, являлось следствием их перемещения на новые участки. Анти-ВГА были обнаружены у 100 % животных одной из групп спустя 9 мес и у 33-65 % обезьян - в двух других группах спустя 4.5 года. Такая ситуация напоминает один из путей инфицирования ВГА в человеческой популяции, когда индивидуумы из благополучных по ГА регионов попадают в эндемичные.

Наряду с этим, отмечалась и другая картина, когда, например,

70 60 50 10 30

3 20

10 ■

Анти-ВГА в сыворотках макак резусов

II I И

аборигены

□ II 1дМ (■) ВII 1д М (+)

□ I 1д<3<-) < 1:20 ШПдО(+) >1:2000

□ 1|0О(+) 1:200-1:2000

□ 11вО(+) 1:20-1:200

^—'I—I—I-

ш

I II I II из Вьетнама

I'

I II

0

+-

Анти-ВГА в сыворотках павианов гамадрилов

50 г

и 40

н

о 30

гп 2

о 20

ч

и

* 10

—Ч- Ч1 'I—I' Ч1 —н—ч

о

I—

I II I II из Эфиопии

I II I II I II

аборигены

I И

I II

Рис.1. Серологические данные естественного инфицирования ' ВГА макак резусов и павианов гамадрилов.

0

о с о

5 Т

20 т

15 •

10 ••

5 ■■

□И М (-) аш£М(+) □ I <1:20 ■ I >1:2000 □I 1:200-1:2000 Ш 1:20-1:200

^—ч-ц цлтва(-,.ц|—ц_

I II I II 1 II I II

2 3.5 7.5 11 (мес)

Рис. 2. Анта-ВГА у новопривезенных макак резусов в различные сроки пребывания в питомнике.

I - анти-ВГА суммарные;

II - анги-ВГА класса М

среда макак резусов, также родившихся в питомнике и длительно содержавшихся изолированно в условиях вольерного содержания, доля иммунных особей была высокой и составляла 88,3 %. Анти-ВГА класса М при этом не обнаруживались, что свидетельствовало об отсутствии процесса "свежего" инфицирования. На примере этой группы обезьян (рис. 3), представленной всеми возрастными группами (от 11 месяцев до 26 лет), было показано, что процент серопозигивных животных значительно не отличался в каждой из трех возрастных групп (80-92 %). Вместе с тем, были выявлены различия в количественном уровне антител у макак резусов с возрастом. СГТ была наивысшей (1:870) в группе обезьян от 3-х до 5 лет, что в 3,5-4 раз превышала таковые в более старшей и младшей возрастных группах (1:260 и 1:217 соответственно). Это напоминает ситуацию в человеческой популяции, где максимальные титры также приходятся на определенный возраст, в частности, на 7-10 лет (Меньшикова М.Г., 1996).

5 £ Л

а н я и

и

и о

о

83 2 и

о\

100 904 80 706050403020100

1:20 □ 1:20-1:200 □ 1:200-1:2000 | >1:2000

детеныши и подростки (1-2 года)

3-4 года

половозрелые особи (> 5 лет)

Рис. 3. Титры анти-ВГА в сыворотках макак резусов,

родившихся в питомнике и длительно проживающих в условиях вольерного содержания.

Нам впервые удалось наблюдать естественную инфекцию I типичной для ГА форме у нескольких видов низших обезьян Старогс Света - макак (резусов, бурых) и павианов гамадрилов. Спонтанны! ГА у обезьян протекал с большой вариацией признаков - от одно* лишь сероконверсии, до полного комплекса специфических (выделе ние вируса с фекалиями, появление антОи-ВГА класса М и О) и неспе цифическнх (повышение активности АлАТ, морфологические измене ния в печени) лабораторных показателей ГА, как это наблюдалось ] макак резусов одной из партий, прибывших из Вьетнама (рис. 4).

При клиническом обследовании обезьян этой группы (93 особи в возрасте от 7 месяцев до 10 лет), у многих из них было отмечено нарушение общего состояния: адинамия, слабость, плохой аппетит, у некоторых жидкий стул. В течение 1-й недели погибли 9 животных, к концу 1-го месяца - 12. Всего за 5 месяцев погибли 23 обезьяны. У всех погибших при гистологическом исследовании обнаружены измене-

ния, характерные для острого гепатита, из них у 4 гепатит сочетался с морфологически выраженной и бактериологически подтвержденной дизентерией.

Через 1,5 мес. после поступления 34 % выборочно обследованных обезьян выделяли вирус с фекалиями (рис. 4). В этот период лишь 11-12 % из них были серопозитивными и имели анти-ВГА класса М, свидетельствующие о свежей инфекции. При исследовании через 3 мес ВГА с фекалиями был обнаружен еще у 13 % макак. Резко возросло число серопозитивных животных с суммарными антителами и класса М, которые составили 97 и 72 % соответственно. В дальнейшем анти-ВГА класса Б обнаруживались уже у всех животных. Следует отметить, что спустя 7 мес. в сыворотках 24 % обезьян еще можно было выявить анти-ВГА класса М.

I И >1 IY 1.5

R 61 ГУ 3.0

Ш 7.0

13.0

сроки после прибытия (нее)

Рис. 4. Результаты обследования партии макак резусов на наличие лабораторных признаков спонтанного ГА.

I - экстренна ВГА; II - суммарные анти-ВГА;

III - анти-ВГА класса М; IY - повышение уровня ферментов.

Специфические показатели ГА сочетались с неспецифическими. Так, повышенный уровень АлАТ был обнаружен у 29 % животных через 1,5 мес и у 42 % - через 3 мес. Кроме того, морфологические изменения в печени погибших обезьян были сходны с таковыми при тяжелых формах острых вирусных гепатитов человека.

Результаты исследования с несомненностью указывают на то, что у привезенных макак резусов имела место вспышка спонтанного ГА. Источник инфекции установить не удалось. Вместе с тем, можно утверждать, что обезьяны были инфицированы до поступления в питомник, о чем свидетельствует обнаружение ВГА в содержимом кишечника 3 макак, погибших на следующий день после прибытия, с морфологически выраженным острым гепатитом. Распространение инфекции внутри партии происходило последовательно в течение 5 мес. При этом, у одних обезьян признаки острого гепатита (выделение вируса, повышение активности АлАТ, морфологические изменения) выявлялись через 1,5 мес., у других - через 3 мес. Большинство обезьян переболели в первые 3 мес. Два последних морфологически и вирусологически подтвержденных случая заболевания были зарегестрированы спустя 4 и 5 мес. после прибытия обезьян. О постепенном развитии эпизоотологического процесса свидетельствуют и данные ■ серологического исследования. Полученные результаты показали также, что условия содержания обезьян в карантинном помещении, хотя и изолируют партию от основного стада, не препятствуют распространению внутри нее такой инфекции с фекально-оральным способом передачи, как ГА. Это согласуется с данными других авторов, которые также наблюдали инфицирование ночных обезьян ВГА во время карантина (Савинская С.С. и др., 1983; Lemon S.M., 1982). Выраженность проявлений описываемой спонтанной инфекции макак резусов, закончившейся в ряде случаев летально, мы склонны объяснить сниженной иммунореактивностью организма в период акклиматизационного стресса. Довольно высокая летальность обезьян во время вспышки была обусловлена не только острым гепатитом (6 случаев), но и присоединившимися к нему оппортунистическими инфекциями (15 случаев).

При сравнительном изучении и анализе естественного инфицирования ВГА разных видов обезьян (павианов гамадрилов и макак бурых, родившихся в Сухумском питомнике и обследованных в период их перемещения на другие участки, а также зеленых мартышек, прибывших в виварий Института полиомиелита и вирусных энцефалитов из Кении), мы выявили такие же закономерности

эпизоотологического процесса ГА, как и при описанной вспышке ГА у макак резусов, прибывших в питомник из Вьетнама. Распространение спонтанной инфекции ГА среди серогегативных обезьян происходило последовательно в течение 3-5 месяцев.

У павианов, длительное время находящихся в условиях лесного содержания, а затем перемещенных в Сухумский питомник, нам удалось наблюдать завершающие сроки инфицирования в течение 4-х месяцев. Об этом свидетельствовала 100 % серопозитивность обезьян к этому времени, но вместе с тем у двух животных еще обнаруживались анти-ВГА класса М в течение 1-го месяца. Кроме того, было выявлено выделение вируса с фекалиями и повышенный уровень АлАТ у двух обезьян по крайней мере в течение 4-х месяцев наблюдения, что свидетельствовало о затяжном течении инфекции. Это согласуется с данными Шевцовой З.В. и соавт. (1991,1992), которые также выявили длительную персистенцню ВГА при изучении естественной инфекции и у других видов обезьян - макак резусов и зеленых мартышек

Сравнительный анализ вирусологических исследований, проведенный нами при вспышках спонтанного ГА у 3-х видов обезьян (макаки резусы, павианы гамадрилы и зеленые мартышки), показал, что средний процент животных, в фекалиях которых был обнаружен ВГА почти не отличался и составил 25-28. Вместе с тем, процент таких животных варьировал (10-40 %) в зависимости от группы обезьян. Соотношение процентов низких, средних и высоких показателей ВГА в пробах отличалось незначительно в зависимости от вида обезьян и составило 69:24:7; 63:37:0; 58:39:3 у макак резусов, павианов и зеленых мартышек соответственно.

Методом ИЭМ в пробах фекалий и печени, содержащих ВГА были выявлены полные и пустые, размером 27 нм вирусные частицы, покрытые "венчиком" антител после взаимодействия с анти-ВГА сывороткой человека.

Таким образом, нами впервые получены серологические и вирусологические доказательства этиологической роли ВГА в спонтанном заболевании макак и павианов, протекающем с биохимическими и морфологическими признаками гепатита. Следует подчеркнуть особую ценность полученных вирусологических данных, поскольку без них биохимические и морфологические изменения свидетельствовали бы лишь о том, что у обезьян имеет место гепатит неизвестной этиологии, вызванный каким-то гепатотропным агентом. Эти данные внесли ценный вклад в комплексное исследование, так как позволили

утверждать, что наблюдавшийся спонтанный гепатит со смертельным исходом у макак резусов является гепатитом Л.

Представлялось важным провести оценку тяжести спонтанного ГА у обезьян по уровню активности печеночноклеточных ферментов, применяемой у человека: повышение нормативных показатели АлАТ в 5-10 раз - легкая форма, в 10-15 раз -1 средняя форма и 15-30 раз -тяжелая форма (Куперштейн А.П., 1993). С этих позиций его можно оценить как легкую форму, т.к. АлАТ не превышала нормативные показатели в 2,5-10 раз.

Впервые в литературе описаны морфологические изменения в печени обследуемых нами павианов гамадрилов и макак резусов Крыловой Р.И. (Шевцова З.В. и соавт, 1987; Корзая Л.И. и соавт., 1992): они были сходными с наблюдавшимися при гепатите А шимпанзе и ночных обезьян (Dienstag J.L., 1975; Keenan С.М.,1984). Гистологическая картина поражения печени была довольно однотипной: на фоне расстройства кровообращения в ввде гиперемии, стазов и иногда тромбозов наблюдались дистрофические и некробиотические изменения гепатоцитов. Печеночные клетки частично подвергались лизису, что нарушало целостность печеночных пластинок. В ряде случаев встречались группы клеток с типичной баллонной дистрофией с очень светлой цитоплазмой и глыбками слабоэозинофильного материала. Постоянно наблюдались очажки гибели гепатоцитов с лимфогистиоцитарной инфильтрацией. В области портальных трактов отмечалась умеренная лимфоидная инфильтрация.

В литературе обсуждается вопрос об эпидемиологических аспектах спонтанного ГА обезьян. Так, Mosley J.W. (1985) считает, что даже если ГА инфекция широко распространена среди обезьян в природе и в неволе, этот феномен имеет минимальное эпидемиологическое значение и не влияет значительно на ГА заболеваемость у человека. В течение 8 лег наблюдения за спонтанно инфицированными ВГА обезьянами нами не было зарегистрировано ни одного случая заболевания у обслуживающего персонала. Мы полагаем также, что штаммы ВГА, циркулирующие среди обезьян либо малопатогенны, либо апатогенны для людей, поэтому не представляют большой эпидемиологической опасности. Вместе с тем, отсутствие клинически выраженных случаев ГА у обслуживающего обезьян персонала, может быть связано с наличием у них антител к вирусу гепатита А.

Следует отметить, что проблемой спонтанного ГА низших обезьян Старого Света занимались параллельно и другие исследователи, которые внесли определенный вклад в изучение этого вопроса

(Анжапарцдзе А.Г. и др., 1985; 1987; Балаян М.С., 1989, 1992; Дорошенко Н.В. и др., 1988, 1989; Замятина H.A., 1990; Ломовская И.Б., 1990; Шевцова З.В., 1987-1992; Lankas G.R. et al., 1987; Slighter R.G. et al., 1988). Вопреки сложившемуся мнению, обезьяны этих видов оказались высоко восприимчивыми к ВГА. Исследования, проведенные нами, существенно дополняют литературные.

Характеристика штаммов ВГА от обезьян и человека.

Нами впервые были получены культуралыше штаммы ВГА от спонтанно инфицированных макак резусов - ВГА-МР, павианов гамадрилов - ВГА-ПГ, зеленых мартышек - ВГА-ЗМ, а также штамм ВГА-ЧЗ от больного человека, обладающий уникальным свойством -патогенностью для макак резусов в эксперименте. Показана способность этих штаммов реплицироваться в перевиваемых линиях клеток AGMK, 4647, Vero и FRhK-4. Наиболее пермиссивными оказались клетки AGMK и 4647 при 32®С. Размножение вируса происходило без цитопатического действия и обнаруживалось с помощью ИФА, ИЭМ и РМГ." Вирус выявлялся в клеточном лизате с помощью всех '3-х указанных выше методов, в культуральной жидкости - только при использовании РМГ. В клетках AGMK и 4647 продукция вируса наблюдалась со 2-6 пассажа (общий срок инкубации 18-58 суток) и в FRhK-4 - с 1-2 пассажа (срок инкубации 26-55 суток). Следует обратить внимание на трудность первичного выделения в клетках некоторых изолятов штаммов (ВГА-МР - в клетках AGMK и FRhK-4, а ВГА-ЗМ - в клетках FRhK-4) непосредственно от спонтанно инфицированных обезьян, тогда как предварительные пассажи вируса на обезьянах делали его изоляцию более успешной (штамм ВГА-МР в клетках AGMK). В клетках AGMK наблюдалась волнообразная продукция ВГА-антигена в течение 12-18 пассажей (срок наблюдения).

С помощью ИЭМ нами был охарактеризован популяционный состав ВГА, репродуцирующегося в клеточных линиях. В культуре AGMK были обнаружены в основном полные вирусные частицы, а на FRhK-4 - наряду с полными ВГА встречалось большое количество полупустых и пустых форм. Кусов Ю.Ю. и соавт. (1987) на примере культурального штамма ВГА человека (HAS-15) показали, что в культуре FRhK-4 на ранних сроках размножения ВГА (до 8 суток) формировались только полноценные (зрелые) вирионы; появление пустых (дефектных) частиц начиналось с 8-х суток и нарастало к 2228 дню. В наших исследованиях культивирование штаммов ВГА в

кулыуре ÀGMK продолжалось в среднем 7-12 суток, а на культуре FRhK-4 - 26-36 суток. Длительный интервал между пассажами вируса в культуре FRhK-4, по-видимому, и в нашем случае явился причиной" формирования большого числа дефектных частиц.

Штаммы ВГА, выделенные вами от обезьян - ВГА-МР, ВГА-ПГ и ВГА-ЗМ по своим морфологическим и антигенным свойствам не отличались между собой и от ВГА человека (ВГА-ЧЗ, выделенного нами от больного человека и штамма HAS-15, входящего в стандартные коммерческие тест-системы) при взаимодействии с поликло-нальнымн антителами (ИФА, ИЭМ), а также по одному из наиболее консервативных участков генома ВГА (последовательности между 2271 и 2290 нуклеотидами) в пределах области VPj (РМГ).

Следует отметать, что и другие исследователи (Lemon S.M. et al., 1982; Анджапаридзе А.Г. и др., 1985, 1987; Дорошенко Н.В. и др., 1987) выявили тесное антигенное родство изолятов ВГА, выделенных от Aotus trivirgatus, а также от низших обезьян Старого Света (яванские, бурые макаки, зеленые мартышки) с ВГА человека при стандартной постановке иммунологических реакций (ИФА, РИА ИЭМ) с использовании сывороток, содержащих поликлональные антитела к ВГА. Вместе с тем, при использовании набора монокло-нальных антител удалось дискриминировать антигенные детерминанты штаммов вируса, которые при использовании поликлональных антител неотличимы (Каретный Ю.В. и др., 1987). Более того, с помощью методов молекулярной генетики было показано, что ВГА изоляты от ночных обезьян и макак яванских отличались как друг от друга, так и от ВГА человека (Brown Е.А. et al., 1989). Секвенирование выделенных штаммов ВГА от обезьян Старого Света - Macaca fascicnlaris, M. rhesus, M. arctoides, Cercopithecus aethiops позволило выделить несколько генотипов (Balayan M.S., 1992; Andjaparidze A.G., 1993). Эти данные говорят в пользу сильватического цикла ВГА у обезьян н предполагают, что в природе может существовать несколько различных типов ВГА, каждый из которых соответствует отдельному виду обезьян (Balayan M.S., 1992),

Поэтому очень вероятно, что штаммы ВГА, выделенные нами от макак резусов, павианов гамадрилов и зеленых мартышек могут иметь известные генетические отличия, как это было показано для других штаммов ВГА, выделенных от обезьян (Lemon S.M., 1987, 1989; Балаян М.С., 1989; 1992; Nainon O.V. et al., 1991; Andjaparidze A.G., 1993).

После адаптации к культурам клеток штаммы сохраняли свою патогенность для обезьян: также как и исходные они вызывали развитие характерных для ГА человека признаков. В качестве примера приводятся данные по экспериментальному заражению 4-х макак резусов изолятом ВГА-ЧЗ (кулмуральным) от больного человека при использовании 3-х доз вируса, отличающихся друг от друга в 10 и 100 раз. Заражение двух серонегативных макак резусов штаммом ВГА-ЧЗ в дозе 10^ ТИД50/МЛ сопровождалось развитием комплекса лабораторных признаков, характерных для ГА и не отличающихся от таковых при заражения обезьян фекальными изолятами. Антиген ВГА обнаруживался в фекалиях периодически с 4- б по 27 сутки. Максимальное количество антигена (P/N 11,5 и 12,8) было отмечено на 15 и 18 дни. Наблюдалось достоверное повышение уровня АлАТ (2-3 раза) на 26-35 и 44-54 у первой обезьяны и на 35-42 сутки - у второй. Анти-ВГА суммарные обнаруживались у обоих животных с 12 суток (титр 1:40 и 1:80), а к 3 месяцам их титр был максимальным (1:2100 и 1:1450). Анги-ВГА класса М определялись первоначально одновременно с суммарными (1:1000) и выявлялись примерно в течение месяца. Гистологически первые признаки поражения печени были обнаружены на 26 сутки после заражения. Ранее всего отмечалась гипертрофия купферовских клеток и баллонная дистрофия гепатоцитов. Позже к этим изменениям присоединялась инфильтрация портальных трактов, а также внутрпдольковая лимфоцигарная инфильтрация. Картина соответствовала нетяжелому гепатиту. Морфологические изменения в биоптатах печени отмечались с 26 дня после заражения и продолжались по 62 день у первой обезьяны и 100 день -у второй. При заражении двух других обезьян меньшими дозами (в 10 и 100 раз соответственно) наблюдались те же лабораторные признаки ГА, но в более поздние сроки. Кроме того, их выраженность была меньше.

Штаммы ВГА-МР, ВГА-ПГ, ВГА-ЗМ от обезьян с естественной инфекцией и ВГА-ЧЗ - от больного человека, адаптированные к клеточной линии AGMK и охарактеризованные по основным свойствам, депонированы в Государственную коллекцию вирусов.

Литературные данные об изоляции в клеточных системах штаммов ВГА обезьяньего происхождения - единичны. Имеется только два сообщения о культивировании штаммов ВГА, выделенных при спонтанном ГА от других видов обезьян - ночных и макак яванских ( Binn L.N. et al., 1984; Анджапаридзе А.Г. и соавт., 1987).

Моделирование ГА на низших обезьянах Старого Света.

С помощью штаммов ВГА-МР на макаках яванских и резусах и с помощью штамма ВГА-ПГ и ВГА-МР на павианах гамадрилах впервые воспроизведен экспериментальный ГА с реизоляпией вируса, что подтверждает его этиологическую роль в развитии спонтанной инфекции. Кроме того, на павианах гамадрилах впервые воспроизведен экспериментальный ГА с помощью штамма ВГА-Ч от больного человека. Экспериментальная инфекция, как правило, протекала бессимптомно, но сопровождалась всеми характерными для ГА человека лабораторными признаками: повышение активности АлАТ, выделение вируса с фекалиями, выработка анти-ВГА классов М и О, морфологические изменения в печени.

Характеристика моделей ГА на павианах гамадрилах.

Получены и охарактеризованы экспериментальные модели ГА на павианах гамадрилах как с помощью штамма ВГА-ПГ, выделенного от обезьян этого же вида со спонтанной инфекцией, так и при использовании штамма ВГА-МР от другого вида обезьян - макак резусов, а также уникального штамма ВГА-ЧЗ от больного человека, обладающего патогенностью для макак резусов в эксперименте. У серонегативных животных, зараженных укачанными штаммами ВГА, наблюдалась инфекция со всеми характерными для ГА человека вирусологическими, серологическими, биохимическими и морфологическими признаками, однако продолжительность их варьировала. Вирус в фекалиях и повышение АлАТ регистрировались периодически с 3-26 до 24-135 суток, у четырех обезьян - и в более поздние сроки (до 163-238 суток). Иммуноглобулины класса М появлялись с 9-28 суток и исчезали на 35-60 сутки. Анти-ВГА суммарные первоначально обнаруживаясь параллельно с 1§М антителами, достигали максимума к 1,5-3 мес. (1:320 до 1:10000), затем наблюдалось их постепенное снижение. Через 6-8 месяцев после заражения их титр уменьшился в 25 раз и составил 1:120-1:2000. Характерные для острого гепатита морфологические изменения в печени были отмечены с 10-46 до 16130 суток.

Общая характеристика средней продолжительности выявления маркеров ГА у павианов, зараженных различными штаммами (табл. 3), позволяет сравнить между собой, а также оценить адекватность полученных экспериментальных моделей соответствующей инфекции у человека. Следует подчеркнуть, что один из основных маркеров - ¡¿М антитела, на обнаружении которых основан диагноз ГА у человека, был выявлен у всех экспериментальных животных в основном в

Таблица 1.

Характеристика продолжительности выявления маркеров ГА у павианов, зараженных различными штаммами ВГА.

Штаммы ВГА Количество животных Признаки инфекции (сутки)

Выделение ВГА с фекалиями Повышенный уровень АлАТ Анти-ВГА класса М Морфологические изменения в печени

ВГА-ПГ 8 42-107* 71,2 ± 7,0** 10-59 43,4 ± 8,0 13-36 24,9 ± 3,2 6-118 52,3 ± 18,0 1/8

ВГА-МР 2 53-60 56,6 ± 3,5 7-11 9,2 ± 2,0 38-49 43,5 ± 5,5 54-61 57,6 ± 3,5

ВГА-ЧЗ 4 72-206 163,4 ±36,6 53-97 73,8 ±8,6 27-45 35,5 ± 4,7 9-28 18,5 ± 9,5 2/4*"

Примечание:

* минимальные и максимальные сроки продолжительности выявления признака со дня обнаружения

** средняя продолжительность ± средняя ошибка (М геом.± т) *•* отсутствие признака у животных из общего их числа, взятых в опыт

течение 4-7 недель в титре 10^-кА У человека этот срок равен примерно 10 над. (Шахгильдян И.В. и др, 1994), хотя имеются данные и о более продолжительном нх выявления - до 4-6 месяцев (Sjogren М.А. et al., 1987; Flehmig В. et al.„ 1990). У большинства павианов внрусовыделение с фекалиями носило более длительный характер (в среднем 2-2,5 мес для нпаммов ВГА-МР н ВГА-ПГ и 5,5 мес для ВГА-ЧЗ) в сравнении с человеком, у которого, как привило, оно продолжается всего лишь 1-10 дней после повышения активности АлАТ, в единичных случаях - не более 30 суток (Шахгильдян И.В. и др., 1994). Онако имеется сообщение о выявлении ВГА в фекалиях с помощью реакции гибридизации в более поздние сроки - до 90 дней (Sjogren М.А. et al., 1987). Обращают на себя внимание более

кратковременные (16±9,5 суток) изменения в печени павианов, зараженных впаммом ВГА-ЧЗ, по сравнению с таковыми после заражения штаммами ВГА-ПГ и ВГА-МР (52,3±18,0 и 57,б±3,5 суток соответственно), а также отсутствие морфологических изменений у двух из четырех обезьян, зараженных этим же штаммом. Это свидетельствует о меньшей патогенности штамма ВГА-ЧЗ для павианов, что, вероятно, связано с 1-ым пассажем вируса и недостаточной его адаптацией на этом виде обезьян.

Для оценки течения ГА у человека

используется классификация, согласно которой, ведущим тестом для контроля за течением восстановительного процесса при ГА человека является активность АлАТ, адекватно отражающая синдром цитолиза. При нормально протекающей реконвалесценции нормализация активности фермента происходит к 30-45 дню; при затяжной реконвалесценции - от 45 до 90 дней; при затяжном гепатите - более 3-х месяцев от начала болезни, при хроническом - более б месяцев (Куперштейн А.П., 1993). Согласно такой оценке, у экспериментальных обезьян наблюдалось в основном острое течение ГА, при котором общая продолжительность болезни укладывалась во временные рамки (2-3 мес.) острого гепатита человека. Поскольку в течение почти всего этого срока у животных сохранялась неполная нормализация функция печени, которая подтверждалась наличием морфологических изменений в печени, либо повышенной активностью АлАТ, течение патологического процесса в этих случаях можно оценить как затянувшуюся реконвалесценцию. Как и у человека, у экспериментально зараженных павианов гамадрилов иногда наблюдалось затяжное течение ГА, которое характеризовалось стойкими биохимическими и морфологическими признаками активного гепатита длительностью свыше 3-х месяцев. Начальные проявления болезни при затяжном течении практически не отличались от таковых при остром гепатите. Однако в дальнейшем не наблюдалась нормализации активности печеночноклегочных ферментов. В раде случаев вслед за острым периодом наблюдалось понижение активности ферментов, но в дальнейшем их активность вновь повышалась (волнооборазное течение).

У двух обезьян, зараженных штаммом ВГА-ПГ, и у двух павианов, зараженных штаммом ВГА-ЧЗ, можно думать о вероятности хронического течения с рецидивом. Так например, у одной из обезьян, инфицированных ВГА-ПГ, острая фаза инфекции продолжалась с 2-го по 24-й день (рис. 5). Затем до 120-го дня наблюдалось лишь вирусовыделение. В течение последующих 2 мес никаких признаков

12 3 4

Рис. 5. Лабораторные показатели ГА у павиана гамадрила № 29729.

Здесь и на рис. б по осям ординат: 1 - активность АлТ (в мхмоль/л/мин), 2 - значения ВГА Ag P/N; 3 титры аши-ВГА класса М, 4 - тигры суммарных аняа-ВГА (обратные величины); по осям абсцисс: срок наблюдем (в днях), 5 - область повышенной активности АлАТ (заштрихованное поле), 6 - выделение ВГА с фекалиями (теми столбики), 7 - отсутствие морфологических изменений в печени (светлый треугольник), 8 - слабо выраженкь изменения в печени (наполовину окрашенный треугольник), 9 - выраженные морфологические изменения в печа (темный треугольник), 10 - гибель обезьяны.

инфекции выявлено не было, цотом они появлялись вновь. Следует особенно подчеркнуть обнаружение вируса в фекалиях со 177-х по 189-е сутки. Обезьяна погибла на 195-й день от интеркуррентного заболевания, и в печени били обнаружены признаки нетяжелого гепатита. Наличие суперинфекций исключалось на основании отсутствия стимуляции антнтелообразования во время рецидива. У другой обезьяны, зараженной этим же штаммом (рис. б), острая фаза инфекции продолжалась более длительно - с 23-х по 70-е сутки, с вирусовьщелением до 115 суток. Затем спустя 2,5 месяцев наблюдался возврат гиперферментемии (142, 163 сутки) и вирусовыделения (162192 сутки). Аналогичное течение инфекции было отмечено и у двух павианов, зараженных штаммом ВГА-ЧЗ. Повторная гиперфермен-темия и вирусовыделение были отмечены на 6-8-ом месяце.

Шевцовой З.В. с соавт. (1992) также удалось наблюдать различные формы хронического ГА (с рецидивами и без них) на экспериментальных моделях ГА макак резусов и зеленых мартышек, при их комплексном длительном обследовании в течение 2-х лет. У обезьян с хронизацией процесса вирус в фекалиях можно было обнаружить спустя 7-15, а иногда 20 мес после заражения.

Таким образом, и при использовании модели ГА на павианах гамадрилах получены данные, свидетельствующие о персистенции ВГА и о возможности существования затяжных и хронических форм ГА. Эти данные согласуются с начавшимся в последние годы пересмотром представлений о ГА как об острой, быстропроходящей инфекции. Появляется все больше сообщений о том, что она может принимать затяжное течение и протекать с 2-3 фазами и даже поздними рецидивами (Jakobson I.M. et al., 1985; Cobden I. and James O.F.W., 1986). Однако в этих работах отсутствует подтверждение этиологической роли ВГА. Поэтому исследователи оставляют открытым вопрос о том, что в случаях хро низании ГА не исключена возможность присоединения инфекции другими гепатотропными вирусами (Балаян М.С., Каретный Ю.В., 1987). Конечно, бесспорным доказательством наличия хронической формы ГА у павианов могло бы быть установление идентичности выделяемого при рецидиве вируса и ВГА, использованного для заражения, молекулярно-биологическими методами. Кроме того, для установления истинной хронизации процесса необходимо более длительный срок изучения этой инфекции.

Характеристика экспериментальных моделей ГА на макаках.

Результаты экспериментального заражения показали, что штамм ВГА-МР, выделенный от макак резусов, вызвал заболевание у всех

Л& 22214

20,0 г

10,0 Ь

£ Л

\ А / / \ / б Ч

1 1дЫ

Ь ю

Г 10

-103

-102

2000

200

I

м

20

Г*^г

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Рис. 6. Лабораторные показатели ГА у павиана гамадрила № 22214.

взятых в опыт обезьян (макак резусов и макак яванских). Инфекция протекала выражено, со всеми характерными для ГА признаками: повышение уровня АлАТ, экскреция вируса с фекалиями, а также его наличие в печени, сероконверсия с антителами класса в и М, морфологические изменения в печени, характерные для острого гепатита человека, (табл. 2). Следует подчеркнуть, что в печени погибшей и аутопсированных обезьян был обнаружен ВГА (биологически активные вирусные частицы и антиген). Особенно большое его количество было обнаружено на 12-18 сутки после заражения.

Таблица 2.

Лабораторные показатели ГА у макак яванских и резусов, зараженных штаммом ВГА-МР.

№№ обезьян (вид) Срок наблюдения Признаки инфекции (дни после заражения)

Выделение ВГА с фекалиями Подъем АлАТ Изменения в печени анти-ВГА ^м анти-ВГА (сумш£-вые)"

221611 (МР) 120 10-13,23-25, 78-79, 83-90, 96-98,110-111 18-20, 40 18-70 12-49 12-130 (30-7500)

221481 (МР) 120 12-14, 88-90, 108-116 14-112 20-60 18-44 18-130 (80-5300)

211201 (МЯ) 27" 7-16,19 8,22 27 с 15 15-27 (65-2000)

209971 (МЯ) 34" 6,9-10,14,17, 19-22 15,22,29,34 34 с 15 15-34 (80-5400)

210301 (МЯ) 35" 7-21,23,26, 31,33 15-35 35 с 15 15-35 (1204500)

712^ (МЯ) 12" 4-8 7 с 9 с 12 12(25)

936^ (МЯ) 18" 4-14 7,10,13,18 с 9 с 12 12-18 (40-300)

Примечание: - первичное заражение; 1 - 1-й пассаж;

гибель обезьяны; ** - аутопсия; *** - обратные величины титров

Используя для моделирования штамм ВГА-МР, нами было выявлено затяжное течение процесса у макак резусов с персистенцией вируса не менее 4-х месяцев.

Экспериментальный ГА не отличался от инфекции, воспроизведенной на макаках с помощью фекального изолята штамма ВГА от человека (Shevtsova Z.V. et al., 1988; Дорошенко Н.В., 1990). В литературе имеется сообщение о возможности воспроизведения экспериментального ГА на макаках бурых с помощью другого штамма от обезьян - ВГА ЯМ-55 (Анджапаридзе и др., 1987). Этот штамм был выделен от макаки яванской, у которой ГА был спровоцирован действием иммунодепрессантов. С его помощью заболевание развилось лишь у половины взятых в опыт животных, причем также с использованием иммунодепрессантов.

Моделирование ГА на обезьянах с помощью штаммов ВГА от человека. Возможность контроля и оценки эксперимента.

Особого внимания и обсуждения заслуживают данные по моделированию ГА на низших обезьянах Старого Света с помощью изолятов, полученных от больных людей (ВГА-Ч), в связи с опасениями некоторых исследователей присоединения спонтанной инфекции ГА, вызванной обезьяньим штаммом (Balayan M.S., 1992). Приоритетные исследования в этой области принадлежат Шевцовой З.В., Дорошенко Н.В., Лапину Б.А. и др., 1987, 1990, 1991), которые показали патогенность штамма ВГА-Ч для макак и зеленых мартышек. Полученные в нашей работе данные, подтверждают феномен чувствительности макак резусов к уникальному штамму ВГА-Ч, полученному Дорошенко Н.В. и др. от больного человека н изолированному нами в культуре клеток AGMK.

Нами также впервые была показана чувствительность к ВГА человека еще одного ввда низших обезьян Старого Света - павианов гамадрилов, как с помощью нативных материалов, так и его культуральных изолятов.

Не вызывает сомнения, что единственно бесспорным доказательством чувствительности макак резусов и павианов гамадрилов к ВГА человека, явилось бы установление идентичности выделяемого в процессе эксперимента вируса и ВГА, использованного для заражения, с помощью молекулярно-биологических методов.

Вместе с тем, достоверность экспериментального ГА, индуцированного нами штаммом человеческого происхождения (впрочем, как и штаммами от обезьян - ВГА-МР и ВГА-ПГ), подтверждается рядом косвенных, но достаточно убедительных факторов. Во-первых, эксперимент проводили в условиях строго контролируемого опыта, что сводит до минимума как возможность взятия в опыт заведомо инфицированных ВГА обезьян, так и вероятность присоединения

естественной (спонтанной) инфекции ГА, вызванной обезьяньим штаммом, а также предотвращает возможность перекрестного заражения. Во-вторых, наши многолетние исследования свидетельствуют о последовательном распространении спонтанной инфекции среди серонегативных особей в течение 3-5 мес с большой вариацией признаков от одной сероконверсии до полного комплекса всех лабораторных показателей. В наших экспериментах инфекция развилась у всех обезьян в течение 1 мес и, как правило, почти со всем набором специфических и неспецифических лабораторных признаков ГА. Поэтому трудно себе представить практически одномоментное заражение обезьяньим штаммом ВГА серонегативных обезьян трех различных групп, находящихся в разных боксах в индивидуальных клетках при строгом соблюдении санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий.

В результате экспериментов были выявлены почти все лабораторные признаки ГА, однако выраженность их варьировала. Так, например, при заражении макак резусов культуральным штаммом ВГА-ЧЗ наблюдалась зависимость сроков выявления лабораторных признаков от используемой дозы, что свидетельствует об отсутствии неконтролируемой спонтанной инфекции. Отличалась также выраженность морфологических изменений в печени павианов, зараженных штаммом ВГА-ЧЗ по сравнению с обезьяньими штаммами (ВГА-ПГ и ВГА-МР), взятыми в эксперимент.

Таким образом, все приведенные выше доводы свидетельствуют, о возможности моделирования ГА как с помощью ВГА человека, так и штаммов ВГА обезьяньего происхождения в условиях строго контролируемого эксперимента.

Изучение специфических показателей гуморального иммунитета и возможности повторной инфекции при ГА на модели ишак резусов.

Благодаря интенсивному изучению вирусных гепатитов, в последнее время был существенно поколеблен ряд положений, касающихся вопросов патогенеза, клиники и эпидемиологии гепатита А (ГА). Не является уже таким бесспорным и вопрос о пожизненном иммунитете после перенесенной инфекции в связи с появившимися сообщениями о возможности повторных заболеваний ГА, как у человека (Хохлов Д.М. и др., 1988; Jakobson I.M., 1985), так и в эксперименте на обезьянах (Замятина H.A. и др., 1990; Prevot S. et al., 1992). Для изучения этой проблемы была использована

разработанная нами модель ГА на макаках резусах, которая по своей адекватности не уступает предшествующим аналогам на других видах обезьян (Dienstag J.L. et al., 1975; Deinhardt F.A., 1976; Le Dnc J.W. et al., 1983).

Нами были изучены специфические показатели гуморального иммунитета при экспериментальном (первичном и повторном) инфицировании макак резусов штаммом ВГА-МР, выделенным от обезьян этого же вида, а также выяснение их устойчивости к повторному заражению. Была также проверена напряженность иммунитета, сформировавшегося у макак после заражения штаммом ВГА-ЧЗ, выделенным от больного человека.

Первичная инфекция ГА у макак характеризовалась довольно быстрым нарастанием анти-В ГА класса М (0.5-1 мес.), недолгим сроком их сохранения на этом уровне (0.5 мес.), затем резким снижением и исчезновением к концу 2-го мес. после заражения. В отличие от антител класса М титры суммарных анти-ВГА нарастали постепенно и достигали максимальных величин лишь к 3-4 мес., затем начинали медленно снижаться и примерно к 1-1,5 годам уменьшались в 4-10 раз, а затем на протяжении еще 1-2 лет (срок наблюдения) продолжали определяться в низких титрах. Антительный ответ при вторичной инфекции существенно отличался от наблюдающегося при первичной. Это прежде всего отсутствие образования антител класса М или продукция их в малых, неопределяемых количествах. При вторичной инфекции наблюдалось более быстрое нарастание суммарных анти-ВГА: они достигали максимальных величин в течение 0.5-1 мес., затем также быстро (1-3 мес.) снижались почти до первоначальных.

Результаты проведенных экспериментов указывают на отсутствие корреляции между величиной титра суммарных антител н устойчивостью к повторному заражению. Развитие реинфекции и ее выраженность зависели от дозы вторично введенного вируса. Так, у 12 серопозитнвных макак резусов, зараженных большими дозами ВГА-МР, был воспроизведен повторный ГА, который характеризовался либо только периодическим выделением вируса с фекалиями - в течение 1,5-2 мес. (Ю^ИДдд), либо вместе со значительным увеличением активности сывороточной АлАТ в течение 1,5-4 мес. (Ю^ИДзф), но без морфологических изменений в печени, свидетельствующих о меньшей тяжести инфекции. При реинфекции также наблюдался быстрый и выраженный подъем анти-ВГА класса G до титров 1:20000-1:74000, однако иммуноглобулины класса М

отсутствовали. Выделение вируса с фекалиями ори отсутствии главного специфического диагностического теста - IgM антител может иметь важное эпидемиологическое значение. Такую возможность нельзя исключить и в человеческой популяции. А это означает, что источником инфекции могут быть не только первично инфицированные, но и получившие вирус повторно. Они могут представлять потенциальную опасность для окружающих, так как остаются нераспознанными.

Аналогичные экспериментальные данные были получены на зеленых мартышках и макаках резусах, реинфшщрованных штаммами ВГА человеческого происхождения (Шевцова З.В. и др. 1995). Вместе с тем, например, у саймири обезьян (Saimirí Sciureus), дважды реинфшщрованных диким штаммом ВГА человека, был воспроизведен повторный ГА с поражением печени (вплоть до некроза), циклическим выделением ВГА антигена с фекалиями, но низкими значениями АлАТ (Prevot S. et al., 1992). Некоторыми исследователями был определен защитный уровень специфических гуморальных антител, предотвращающий от реннфекцни (Хохлов Д.М. и др., 1988; Замятина H.A. и др., 1990).

Изучение возможности применения обезьяньих субстратов -ВГА и гнпериммуниых сывороток в качестве реагентов для иммунологических препаратов.

Получение штаммов ВГА от обезьян, имеющих тесное антигенное родство с ВГА-человека, открывает новые перспективы их практического использования, в частности, в качестве реагентов для иммуно-диагностических препаратов.

Применение ВГА. Несмотря на невысокие иггры (1:4 - 1:8) культуральных ВГА-антигенов от обезьян (ВГА-МР, ВГА-ЗМ, ВГА-ПГ), полученные нами в клетках AGMK, по сравнением с контрольным (1:32), входящим в коммерческую тест-сисиему, была показана возможность их концентрации до уровней, которые считаются достаточными для использования в качестве компонента в серологических реакциях (P/N 18,1-44,6). Такой подход был предложен и другими исследователями при использовании в качестве антигена высоко адаптированного к культуре клеток прототипного штамма ВГА-Ч/ HAS-15 (Кусов Ю.Ю. и др., 1985), применяемого в настоящее время в ИФА в нашей стране.

Испытание культурального штамма ВГА от макак резусов (ВГА-МР) в качестве антигенного компонента иммунодвагностикума при

определении анти-ВГА в сыворотках более 200 обезьян (ИФА) показало нх высокую специфичность и сопоставимость с данными, полученными с эталонным штаммом ВГА человека (HAS-15).

В литературе имеются единичные сообщения о применении ВГА обезьяньего происхождения в качестве антигенного компонента в иммунологических реакциях, причем, в виде нативного материала. (Анджапаридзе А.Г. и соавт., 1986). Для этих целей был использован штамм ВГА ЯМ-55 от макаки яванской для получения печеночного вирусного антигена, который по антигенным свойствам был близок к ВГА человека. Антиген получали путем экспериментального заражения макак яванских и бурых. ВГА обезьяньего происхождения успешно применялся для выявления специфических антител в сыворотках крови больных ГА в ИФА.

Применение сывороток. Нами была показана принципиальная возможность использования ВГА-положительных сывороток от макак резусов в качестве антительного компонента иммунодиагностикумов для ИФА, как для сенсибилизации твердой фазы, так и для получения конъюгата, содержащего иммуноглобулины класса G, меченные пероксидазой хрена.

Способ получения гипериммунных в отношении ВГА сывороток от макак резусов заключался в повторном заражении ВГА серопо-зитивных макак (с любым исходным титром) штаммом ВГА-МР. Оптимальный срок для получения сывороток с наиболее высоким титром является период от 0,5 до 1,5, реже - 2, 3-х месяцев. Сыворотки при этом не содержали иммуноглобулины класс? М. Титры анти-ВГА в этих сыворотках составляли от 1:20000 до 1:74000.

Нашим данным есть литературное подтверждение (Chitambar S.D., et al., 1994) о получении и использовании гипериммунной сыворотки макак резусов для приготовления конъюгата для ИФА, который дал удовлетворительные результаты.

ВЫВОДЫ.

1. Серологическое обследование нескольких видов обезьян Старого Света показало различную степень их инфицировавности ВГА в естественных условиях: среди родившихся в питомнике и прибывших из мест естественного обитания обезьян были группы с высоким, средним и низким содержанием ВГА-позитивных животных, кроме того, встречались группы, состоящие только из серонегативных животных.

2. Серологическое обследование обезьян в динамике свидетельствуют о возможности их естественного инфицирования БГЛ как до поступления в питомник, так и после - спустя месяцы в даже годы, независимо от возраста.

3. Эпизоо то логический анализ спонтанного ГА низших обезьян Старого Света (макаки, павианы гамадрилы и зеленые мартышки) показал высокую чувствительность этих животных к ВГА при попадании возбудителя и отсутствии иммунной прослойки. При наличии в партии даже единичных инфицированных особей в течение 3-4 мес. происходит последовательное распространение инфекции на всех обезьян партии. Инфекция протекает, как правило, без внешних проявлений, но с лабораторными признаками, характерными для гепатита.

4. Получены серологические и вирусологические доказательства этиологической роли ВГА в спонтанном заболевании макак и павианов гамадрилов, протекающем с биохимическими и морфологическими признаками гепатита.

5. Из фекалий и печени спонтанно заболевших макак резусов и павианов гамадрилов получены фекальные изоляты ВГА. Показано, что по морфологическим, антигенным и биологическим свойствам они не отлитчимы друг от друга и от ВГА человека.

6. Штаммы ВГА от спонтанно инфицированных макак резусов -ВГА-МР, павианов гамадрилов - ВГА-ПГ, зеленых мартышек - ВГА-ЗМ и уникальный штамм ВГА-ЧЗ от больного человека, обладающего патогенностыо для макак и зеленых мартышек, были адаптированы к культурам клеток. Показана способность этих штаммов реплицироваться в перевиваемых линиях клеток AGMK, 4647, Vero и FRhK-4. Наиболее пермиссивными оказались клетки AGMK и 4647 при оптимальной температуре Срок инкубации зараженной культуры - 8-14 суток. Размножение вируса происходило без цитопатического действия и тестировалось с помощью ИФА, ИЭМ и РМГ.

7. Культуральные пггаммы ВГА по своим морфологическим и антигенным характеристикам, по одному из наиболее консервативных участков генома ВГА в пределах области VPj, а также биологическим свойствам (способность размножаться в культурах клеток и патогенность для обезьян) были сходны как между собой, так и с ВГА человека. Показана возможность их использования в качестве антигенного компонента в ИФА, а также для моделирования ГА на обезьянах.

8. Штаммы ВГА-МР - от макак резусов, ВГА-ПГ - от павианов гамадрилов, ВГА-ЗМ - от зеленых мартышек и ВГА-ЧЗ - от больного человека, адаптированные к клеточной линии АЭМК, депонированы в Государственную коллекцию вирусов.

9. С помощью штаммов ВГА-МР на макаках яванских и резусах и с помощью штаммов ВГА-ПГ и ВГА-МР на павианах гамадрилах воспроизведен экспериментальный ГА с реизоляцией вируса, что подтверждает его этиологическую роль в развитии спонтанной инфекции.

10. На моделях спонтанного и экспериментального ГА павианов гамадрилов и макак резусов прослежена динамика выделения вируса с фекалиями. Выявлена волнообразность и длительность вирусов ыде-ления. Прослежена динамика антителообразования - ]£М н 1дО.

11. На модели экспериментального ГА павианов гамадрилов показана способность перснстирующего вируса сохранять свою патоген-ность для обезьян, несмотря на присутствие в иммунном организме в течение 2-х мес.

12. На моделях макак резусов показана возможность развития повторного ГА. Получена его серологическая и вирусологическая характеристика. Повторная инфекция характеризовалась либо только периодическим выделением вируса с фекалиями (1,5-2 мес.), либо вместе со значительным увеличением активности АлАТ (1,5-4 мес.), но без морфологических изменений в печени. Наблюдался быстрый и выраженный подъем анти-ВГА класса Э до титров 1:20000-1:74000, однако иммуноглобулины класса М отсутствовали.

13. Изучены специфические показатели гуморального иммунитета при спонтанном и экспериментальном ГА, показаны их отличия при первичной и повторной инфекции.

14. Получены данные, свидетельствующие о возможности использования гипериммунных сывороток обезьян в качестве антительного компонента в ИФА.

15. Полученные данные позволяют сделать вывод об адекватности экспериментальных моделей ГА павианов гамадрилов л макак резусов ГА человека и предложить их использовать как для изучения нерешенных вопросов пато- и иммуногенеза инфекции, так и для оценки безопасности и эффективности разрабатываемых средств ее профилактики и лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Модели гепатита А человека предлагаются использовать в научно-практическом плане в следующих аспектах: - изучение неясных вопросов пато- и иммуногенеза;

- проверка иммуногенности, протективной активности и специфической безопасности вакцин;

- оценка эффективности применяемых схем лечения;

- изучение особенностей эпидемиологического процесса;

- использование гипериммунных сывороток обезьян и штаммов ВГА при производстве диагностических наборов в ИФА.

Для этих целей могут быть использованы депонированные в Государственную коллекцию вирусов 4 оригинальных авторских штамма ВГА.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Экспериментальный гепатит А у макак яванских, зараженных вирусом, выделенным от макак резусов. // В кн: Материалы Всесоюзной конференции. Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине. Сухуми, 1987, С. 91-93. (Корзая Л.И., Шевцова З.В., Лапин Б.А., Крылова Р.И., Джелиева З.Н., Белова Е.Г., Сажченко Л.А.)

2. Вспышки гепатита А у низших обезьян Старого Света. // Там же. - 1987. - С. 93-94. (Шевцова З.В., Лапин Б.А., Стаханова В.И., Крылова Р.И., Ломовская И.Б., Дорошенко Н.В., Заиров Г.К., Джелиева З.Н., Корзая Л.И.)

3. Признаки естественной инфекции гепатита А у макак бурых. // Вопр. вирусол. 1987. - №5. - С. 541-544. (Анджапаридзе А.Г., Шевцова З.В., Корзая Л.И., Каретный Ю.В., Балаян М.С., Лапин Б .А.)

4. Спонтанный гепатит А со смертельным исходом у макак резусов. // Вопр. вирусол. - 1987. - №6. : С. 686-690. (Шевцова З.В., Крылова Р.И., Белова Е.ГМ Корзая Л.И., Анджапаридзе А.Г.)

5. Вирусный гепатит А у низших обезьян Старого Света (возможность использования модели для испытания вакцин). // Бюллетень эксп. биол. и медицины. - 1988. - №1. С. 1619. (Лапин Б.А., Шевцова З.В., Крылова Р.И., Корзая Л.И.)

6. Spontaneous and experimental hepatitis A in Old World monkeys. // J.Med.Primatol. 1988. Vol.17. P.177-194. (Shevtsova Z.V., Lapin B.A., Doroshenko N.V., Krilova R.I.,

Korzaya L.I., Lomovskaya I.B., Dzhelieva Z.N., Zairov G.K., Stakhanova V.M., Belova E.G., Sazhchenko L.A.).

7. Эпизоотия гепатита А среди африканских зеленых мартышек, содержащихся в условиях вивария. // Вопр.вирусол., 1989. - МЬЗ. - С. 292-295. (Анджапаридзе А.Г., Каретный Ю.В., Корзая Л.И., Балаян М.С., Титова И.П., Замятина H.A.)

8. Штамм vims hepatitis A hominis для моделирования инфекции на макаках, изучения патогенеза, иммуногенеза и контроля вакцин. // Авторское свидетельство №1547311 от 01.11.89. (Шевцова З.В., Корзая Л.И., Дорошенко Н.В., Лапин Б.А., Крылова Р.И., Ломовская И.Б.

9. Вспышка гепатита А у привезенных макак резусов. // Вопр. вирусол. - 1989. - №3. - С. 346-351. (Шевцова З.В., Корзая Л.И., Ломовская И.Б., Дорошенко Н.В., Заиров Г.К., Стаханова В.И., Джелиева З.Н., Крылова Р.И., Белова Е.Г.)

10. Получение культуральных штаммов вируса гепатита А от человека н обезьян. // В кн.: Итоги науки и техники. Вирусология, том 22. Вирусные гепатиты. Матер, междун. симпозиума. Ростов 3-8 сентября. - 1990. - С. 13. (Корзая Л.И., Шевцова З.В.)

11. Моделирование гепатита А на макаках. // Вопр. вирусол. -1991. - №1. - С. 13-16. (Корзая Л.И., Шевцова З.В., Крылова Р.И., Джелиева З.Н., Быстрова Т.Н., Копнина Е.О., Алейник М.Д.)

12. Спонтанный и экспериментальный гепатит А павианов гамадрилов. // Вопр.вирусол. - 1992.- №4,- С.187-191. (Корзая Л.И., Шевцова З.В., Джелиева З.Н., Крылова Р.И., Белова Е.Г., Чалян В.Г.

13. Экспериментальные модели гепатита А на макаках с помощью штаммов вируса гепатита А человека и обезьян. / / Микробиол. журн., Киев. - 1994. том. 56(1). - С. 22-29. (Корзая Л.И., Эсванджия Н.Ч., Ломовская И.Б., Крылова Р.И., Шевцова З.В.)

14. Hepatitis A in Old World monkeys is the model of human hepatitis. // In: XYth Congress of the International Primatological Society, 3-8 august. - 1994. - Kuta-Bali, Indonezia (Abstracts). - P.289. (Korzaya L.I., Shevtsova Z.V., Lapin B.A.)

15. Экспериментальное изучение иммунитета к гепатиту А на обезьянах.// Журн. микробиол., эпвдеииол. и иммунобиол., 1995. - 4. - С. 78-81. (Шевцова З.В., Лапин Б.А., Ломовская И.Б., Эсванджия Н.Ч., Корзая Л.И., Крылова Р.И., Джелиева З.Н., Цыганок Н.М.)

16. Получение и характеристика культуральных штаммов вируса гепатита А от человека и обезьян. // Вопр.вирусол. - 1997. - >¿2. - С. 60-63. (Корзая Л.И., Шевцова З.В., Лапин Б.А., Дьяченко А.Г., Крылова Р.И.)

17. Характеристика экспериментальных моделей гепатита А на павианах гамадрилах. // Вопр. вирусол. - 1998. - №2. - С. 67-70. (Корзая Л.И., Лапин Б.А., Шевцова З.В., Крылова Р.И., Эсванджия Н.Ч.

18. Повторная инфекция при гепатите А у макак резусов в эксперименте. // Вопр. вирусол. - 1998. - № 4. - С. 158-163. (Корзая Л.И., Шевцова З.В., Лапин Б.А., Крылова Р.И., Джелиева З.Н.)

Соискатель: О^/Сс[> "л/ Л.И.Корзая