Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гематогенный путь распространения C.trachomatis у пациентов с урогенитальным хламидиозом

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гематогенный путь распространения C.trachomatis у пациентов с урогенитальным хламидиозом"

На правах рукописи

Пашко Юлия Петровна

р 00460047У

Гематогенный путь распространения СЛгаскотай$ у пациентов с урогенитальным хламидиозом

03.02.03-микробиология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 АПР20Ю

Москва - 2010

004600479

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Зигангирова Наиля Ахатовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Бондаренко Виктор Михайлович

доктор медицинских наук Гасанова Тамара Анатольевна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Защита диссертации состоится «23» апреля 2010 года в 11 часов на заседании диссертационного совета НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул.Гамалеи, д.18.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан «22» марта 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

Актуальность

С.trachomatis - грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования. Этот патоген один из самых распространенных возбудителей бактериальных инфекций,

передаваемых половым путем (ИППП). По данным ВОЗ заболеваемость урогенитальным хламидиозом (УГХ) за период с 2000 по 2006 гг. в развитых странах имеет тенденцию к возрастанию. Например, в Швеции показатели заболеваемости выросли с 218 до 376 на 100 тысяч населения.

Эпидемиологическая ситуация в России неблагоприятная: в период с 2000 по 2006 г регистрируется более 90 случаев УГХ на 100 тысяч населения, что составляет около 20% в структуре всех ИППП.

Официальная статистика не отражает истинной ситуации о распространении УГХ, т.к. не полностью учитываются случаи хронического течения болезни, при этом хроническая хламидийная инфекция имеет не только урогенитальную локализацию, но поражает также другие органы [Шинский Г. Э. и др., 1999; Мавров И. И., 2002].

Эпидемиологическая значимость хронических форм хламидиозов была доказана еще в работах А.А.Шаткина (1985г). Хламидии не являются представителями нормальной микрофлоры человека. Их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, а отсутствие клинических симптомов заболевания определяет лишь временное равновесие, возникшее между паразитом и хозяином в условиях, ограничивающих, но не препятствующих размножению патогенного внутриклеточного микроорганизма. В этой связи, хроническая хламидийная инфекция является не менее опасной, чем ее манифестные формы и требует проведения лечебных и профилактических мероприятий.

Развитие хронических хламидиозов определяется в большей степени адаптационными свойствами патогена и образованием его персистирующих форм, обладающих весьма эффективными механизмами инактивации защитных факторов организма хозяина и использования регуляторных путей клетки - хозяина для развития инфекционного процесса. Патогенетическое значение персистирующих форм хламидий определяется, в первую очередь, тем, что они представляют собой форму длительного выживания патогена в макроорганизме с сохранением патогенного потенциала. В то же время, персистирующие формы хламидий сами ответственны за развитие тяжелых иммунопатологических состояний вследствие постоянной

активации клеток иммунной системы, поддержания воспаления, а также влияния на многие внутриклеточные процессы.

Хроническая урогенитальная хламидийная инфекция, вызывает весьма широкий спектр осложнений, связанных с диссеминацией C.trachomatis из первичного очага инфекции в отдаленные органы. Это ведет к развитию серьезных заболеваний как генитальной, так экстрагенитальной локализации, таких как: женское и мужское бесплодие, патология беременности, синдром Рейтера, офтальмохламидиоз, перигепатит, тазовый перитонит [Сафина О. Н., 2001; Молочков В. А., 2004; Peter N.,2004; Wollenhaupt J].

На данный момент достаточно хорошо изучены интраканаликулярный (восходящий), лимфогенный и интранатальный (при прохождении через родовые пути) пути распространения патогена. Экстрагенитальную патологию и внутриутробное инфицирование плода, обусловленные C.trachomatis, рассматривают как следствие диссеминации патогена гематогенным путем. Однако на сегодняшний день практически отсутствуют микробиологические исследования, доказывающие ключевую роль данного пути в развитии экстрагенитальных патологий хламидийной этиологии. В связи с этим, актуальным является детальное изучение механизмов распространения C.trachomatis гематогенным путем.

Отсутствие данных о возможности генерализации инфекционного процесса при урогенитальной хламидийной инфекции естественно ограничивает исследования по выявлению связи между C.trachomatis и хронической патологией различных органов. Однако в последние годы появилось много данных о том, что хронические инфекции, вызываемые внутриклеточными патогенами, лежат в основе ряда серьезных соматических патологий.

При хламидиозе отсутствуют специфические клинические симптомы, поэтому методы лабораторной диагностики имеют первостепенное значение. К настоящему времени проблема диагностики хронической формы хламидийной инфекции определяется несколькими факторами. Во-первых, персистирующие формы хламидий, ответственные за развитие хронических инфекций, с трудом выявляются с помощью классических микробиологических и иммунологических методов вследствие нарушения метаболизма и антигенной структуры. Во-вторых, при осложненных формах, связанных с восходящей и экстрагенитальной инфекцией, возбудитель мало доступен для анализа. При этом постановка диагноза урогенитального хламидиоза возможна только при

обнаружении С. trachomatis прямыми методами. В-третьих, иммунный ответ при хронической хламидийной инфекции подавлен, что ограничивает возможность использования вспомогательных методов серологической диагностики.

В связи с этим, разработка новых методов детекции возбудителя на основе понимания механизмов распространения С.trachomatis в организме при хроническом течении инфекции приобретает особую актуальность.

Цель работы: изучение гематогенного пути распространения Chlamydia trachomatis и механизма инфицирования печени, разработка метода диагностики хронических форм хламидиоза экстрагенитальной локализации.

Для достижения поставленной цели были определены основные

задачи:

1. Изучить возможность гематогенного пути распространения С.trachomatis как фактора генерализации инфекции при осложненных формах УГХ.

2. Разработать метод диагностики хронических хламидиозов на основе ПЦР-РВ с использованием сыворотки крови в качестве материала для исследования.

3. Определить диагностическое значение выявления С.trachomatis в сыворотке крови при сравнении со стандартными методами диагностики урогенитального хламидиоза.

4. Изучить тропизм C.trachomatis к гепатоцитам, механизмы адгезии и интернализации в условиях in vitro, охарактеризовать клеточный ответ на развитие инфекции.

5. Оценить последствия циркуляции C.trachomatis в сыворотке крови и возможность инфицирования печени у больных .

Научная новизна

- Впервые доказан гематогенный путь распространения C.trachomatis на основании культурального выделения инфекционных форм патогена в сыворотке крови больных с подтвержденным диагнозом УГХ. C.trachomatis, выделяемая из сыворотки крови, может быть определена как внеклеточная инфекционная форма персистирующих in vivo хламидий.

- Впервые обнаружено, что у пациентов с хроническими и осложненными формами заболеваний урогенитального тракта (УГТ) C.trachomatis в сыворотке крови обнаруживаются значительно чаще, чем в соскобном материале из органов УГТ.

- При моделировании инфекционного процесса на первичных гепатоцитах крыс и на перевиваемой линии клеток гепатокарциномы человека впервые был показан тропизм С.trachomatis к клеткам печени (гепатоцитам) и изучен механизм адгезии и интернапизации за счет связывания патогена с белком АроВ липопротеинов с последующим взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП. Было выявлено, что инфекция C.trachomatis в клетках гепатокарциномы приводила к зависимому от дозы инфекционного агента подавлению экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛПНП.

- Впервые показана возможность инфицирования клеток печени возбудителем урогенитального хламидиоза. При исследовании клинического материала от больных было выявлено, что циркулирующий в крови больных возбудитель - C.trachomatis в 55 % случаев может диссеминировать в печень.

Практическая значимость

Выявление C.trachomatis в сыворотке крови больных, особенно в случаях хронических и осложненных форм хламидиоза, имеет важное диагностическое значение, поскольку позволяет использовать принципиально новый подход прямого выявления возбудителя вне зависимости от локализации очага инфекции. Разработан метод прямого выявления хламидий с использованием сыворотки крови. Его основой является оптимизированная методика выделения ДНК патогена из сыворотки крови и детекция C.trachomatis с помощью разработанного метода количественного анализа содержания хламидий в клиническом материале с помощью ПЦР-РВ. Этот метод может быть использован для диагностики хронических и экстрагенитальных форм хламидийной инфекции.

Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Метод детекции ДНК Chlamydia trachomatis в сыворотке крови количественным методом ПЦР-РВ», утвержденных 25 февраля 20 Юг на совете по внедрению научных достижений в практуку НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (выписка из протокола №12).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Доказан гематогенный путь распространения C.trachomatis на основе выявления инфекционных внеклеточных форм возбудителя в сыворотке крови больных с УГХ.

2. Разработан метод диагностики хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови в качестве материала для анализа и детекцией ДНК C.trachomatis с помощью ПЦР-РВ.

3. Показана более высокая эффективность выделения ДНК хламидий из сыворотки крови у больных с хроническими заболеваниями урогенитального тракта, а так же с осложненными формами хламидиоза экстрагенитальной локализации в сравнении с результатами выявления ДНК патогена в соскобном материале из органов УГТ.

4. Показан тропизм хламидий к гепатоцитам и изучены механизмы адгезии и интернализации за счет связывания патогена с АроВ белком липопротеинов с последующим взаимодействием с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП.

5. Показана возможность инфицирования С.trachomatis тканей печени больных при циркуляции возбудителя в сыворотке крови.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней-2007» (Москва, 28 - 30 ноября, 2007), IV международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008).

Апробация диссертации состоялась на заседании Отдела Медицинской микробиологии НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 17 февраля 2010г.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 125 листах и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 21 рисунком. Список использованной литературы включает в себя 161 источник, из них 35 отечественных авторов и 126 зарубежных авторов.

Собственные исследования

Материалы и методы.

- В работе использовали лабораторный штамм С.trachomatis BU-434 биовара лимфогранулемы (LGV) серовар L2 (АТСС VR 902В).

Культуральное выделение C.trachomatis проводили на линии клеток McCoy по стандартным методам [С.Р.Бескина, А.А.Шаткин, 1979]. Идентификацию и количественную оценку содержания хламидий в инфицированных культурах осуществляли с использованием методов ПИФ с моноклональными антителами к ЛПС и белку МОМР, мечеными ФИТЦ (ООО «Ниармедик Плюс», Москва) и ПЦР-РВ с ДНК,

выделенной из культуры клеток. ДНК из культуры зараженных клеток или сыворотки выделяли из объема 200 мкл после предварительного концентрирования материала в объеме 1 мл путем центрифугирования при 13 ООО об/мин в течение 45 минут при t+4°C. Выделение проводили набором QIAamp DNA Blood Mini Extraction Kit (Qiagen, Inc).

- Морфологическую характеристику выделенных форм проводили при использовании электронной микроскопии. Осадок сыворотки фиксировали по методу Ито-Карновски. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB 3 толщина срезов 200-3 00А0, помещали на никелевые сетки с формваровой подложкой. Срезы окрашивали по методу Рейнольдса и анализировали в электронном микроскопе JEM-100В.

- Для выделения ДНК из тканей образцы гомогенизировали в 1 мл раствора ФСБ. Из полученной суспензии в объеме 300 мкл выделяли ДНК набором QIAamp DNA Mini Extraction Kit согласно протоколу производителя.

- Анализ экспрессии генов С. trachomatis и инфицированных клеток проводили методом обратной транскрипции. Выделение РНК из культуры клеток проводили с использованием реагента Trizol (Invitrogen). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор «Reverse Transcription System» (Promega, США). Полученную кДНК анализировали в ПЦР при использовании выбранных праймеров к различным генам С. trachomatis и эукариотических клеток.

Для выявления видоспецифических иммуноглобулинов классов G/M/A использовали тест-систему «ХламиБест» производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Выявление антител проводили согласно прилагаемой инструкции.

- Культивирование C.trachomatis на клеточной линии HepG2 проводили в среде DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки и 2мМ глутамина в термостате (37 °С, 5% СОг). Заражение проводили в среде DMEM с добавлением 0,4% глюкозы без добавления фетальной сыворотки и циютогексимида и центрифугировали при 1500 об/мин в течение часа. Выявление хламидийных включений проводили методом ПИФ через 48 ч. п.и.

Цитометрическая оценка процента инфицированных хламидиями клеток HepG2. Монослой из лунок снимали 0.1 М раствором ФСБ, и после центрифугирования (3000 об/мин, 10 мин) и удаления надосадка проводили фиксацию 70% раствором этанола в течение 15 минут при комнатной температуре. После двукратной отмывки в ФСБ, клетки окрашивали моноклональными антителами к белку

МОМР. Подсчет процента инфицированных клеток проводился на проточном цитофлуориметре BD FACSCalibur с использованием программы CellQuest Pro.

Результаты исследований.

Выявление C.trachomatis в сыворотке крови больных.

Кулыпуралъное выделение С. trachomatis.

Для выявления C.trachomatis в сыворотке крови было выбрано 40 человек с установленным диагнозом УГХ.

C.trachomatis из образцов сыворотки крови выявляли с помощью метода «золотого стандарта» диагностики хламидий - культуральным методом. Результаты культивирования оценивали 2-мя методами: прямой иммунофлуоресценции (ПИФ) и ПЦР-РВ.

Методом ПИФ в 77,5% сывороток выявляли единичные внутриклеточные хламидийные включения, мелких и средних размеров, характерные для персистирующих форм (рис.1). При выделении ДНК из культуры клеток, методом ПЦР-РВ C.trachomatis была выявлена в 92,5%

а- атипичные хламидийные включения, выделямые из сыворотки крови, 72 часов п.и. б- типичные

хламидийные включения, C.trachomatis Bu-434, 48 часов п.и. Линейка 10 цт а б

Рис 1. Выделение C.trachomatis из сыворотки крови культуральным методом.

Видовая принадлежность, выделяемых из сыворотки крови C.trachomatis, была подтверждена:

- секвенированием ампликонов области 16S рРНК, показавшим 100% гомологию с референс штаммами

- положительными результатами амплификации с праймерами к различным областям генома C.trachomatis: генам отрА, отсВ, groEL.

Электронно-микроскопическая характеристика циркулирующих в

крови хламидий.

Для морфологической характеристики C.trachomatis, выделенной из сыворотки крови у исследуемой группы больных с подтвержденной хламидийной инфекцией, в лаборатории анатомии микроорганизмов

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН было проведено электронно-микроскопическое исследование осадков положительных в ПЦР сывороток. Во всех образцах были выявлены бактериальные клетки, имеющие характерную для элементарных телец хламидий структуру, а именно: двухслойную мембрану клеточной стенки и электронно-плотную цитоплазму. Размеры клеток колебались в диапазоне от 0,2 до 0,3 мкм (рис.2).

а- СЛгасИотаНБ Ь2/434/Ви -общий вид. Ув. 35 ООО б - СЛгаскотаШ Ь2/434/Ви . Ув.60 ООО

в - элементарные тельца, выявленные в сыворотке больного - общий вид. Ув. 32 ООО

г - элементарные тельца, выявленные в сыворотке больного. Ув. 60 ООО

Рис. 2. Электронная микрофотография ультратонкого среза препарата элементарных телец С. trachomatis L2/434/Bu и элементарных телец, выделенных из сыворотки крови больного.

Таким образом, метод электронной микроскопии подтвердил наличие в сыворотке крови больных с УГХ внеклеточной инфекционной формы хламидий- элементарных телец.

Культивирование изолятов С.trachomatis из сыворотки крови.

Изоляты С.trachomatis, выделенные из сыворотки, были культивируемыми, что было подтверждено при их пассировании на клеточной культуре. Включения, образующиеся на 1-ом и 2-ом пассажах, сохраняли измененную морфологию и плохо выявлялись при окрашивании препаратов анти-МОМР моноклональными антителами. При дальнейшем пассировании, в единичных случаях наблюдали более яркую флуоресценцию.

Применение количественного метода ПЦР показало, что в процессе культивирования образцов сывороток происходит увеличение

количества возбудителя на два порядка по сравнению с содержанием патогена в исходном образце(таблЛ). Таблица 1.

Сравнение количеств геном-эквивалентов (ГЭ) С.trachomatis, выявляемых при прямом выделении из сыворотки и после

культивирования в культуре клеток п ри использовании метода ПЦР-РВ.

Больной ГЭ С. trachomatis в 1 мл сыворотки крови ГЭ С .trachomatis, выделенные из культуры клеток, после заражения монослоя 1 мл сыворотки крови

2 2,54* 102 1,36*104

6 8,21 * 102 2,54*104

9 4,21*102 4,41*104

15 2,78*102 3,27*104

19 3,05*102 9,21*104

Анализ экспрессии генов, кодирующих белки наружной мембраны, у

клинических изолятов С. trachomatis методом ОТ-ПЦР.

Для изолятов С. trachomatis 1 пассажа через 48 час после инфицирования (п.и.) была выполнена качественная оценка экспрессии конститутивных генов (16 S rRNA и groEL), генов, кодирующих белки наружной мембраны, средней фазы жизненного цикла (ompl, omcA , pmpA, pmpB, pmpC, pmpD, pmpE) и позднего гена, кодирующего цистеин богатый белок ОтсВ. Оценку метаболической активности у выделяемых форм проводили в сравнении с лабораторным штаммом Ви-434 через 48 час п.и. и с персистирующими формами, индуцированными IFN-v, через 48 час п.и.

Выделенную РНК нормировали по 16S рРНК с помощью количественной системы ПЦР-РВ. При оценке экспрессии генов у референс штамма была выявлена активность всех анализирумых генов, за исключением гена pmpA, для которого характерно снижение экспрессии на 48 час п.и. У выделенных изолятов не выявляли экспрессию 2-х генов, кодирующих белки наружной мембраны (ртрА и ртрС), а также гена, детерминирующего синтез позднего белка ОтсВ, подавление экспрессии которого является маркером персистирующих форм. Экспрессия этого гена отсутствовала также у индуцированных действием IFN-y персистирующих форм (табл.2).

Таблица 2.

Анализ экспрессии генов С.trachomatis с помощью ОТ-ПЦР у клинических изолятов, полученных из сыворотки крови больных.

Ген Белок Экспрессия Экспрессия Экспрессия генов

генов у генов у У

типичных хламидий, персистирующих

форм выделенных из форм хламидий в

хламидий 48 ч сыворотки условиях in vitro

п.и. крови 48 ч п.и. 48 ч п.и.

16SrRNA - + + +

groEL HSP60 + + +

ompl МОМР + + +

чотсА ОМРЗ + + +

отсВ ОтсВ ■ + ■ - -

ртрА РтрА

ртрВ РтрВ + + +

ртрС РтрС -

pmpD PmpD + + +

ртрЕ РтрЕ + + +

Полученные данные свидетельствуют о метаболической активности выделяемых из сыворотки крови форм С.trachomatis. Кроме того, отсутствие экспрессии гена средней фазы (ртрС) и гена поздней фазы (iотсВ) может указывать на более медленный цикл развития таких изолятов по сравнению с референс штаммом, что характерно для атипичных персистирующих форм С. trachomatis.

Таким образом, впервые был доказан гематогенный путь распространения С. trachomatis на основании культурального выделения инфекционных форм патогена в сыворотке крови больных с диагнозом УГХ. Проведенная характеристика свидетельствует о том, что С.trachomatis, выделяемая из сыворотки крови, может быть определена как внеклеточная инфекционная форма персистирующих in vivo хламидий.

Исходя из полученных данных, наша гипотеза циркуляции С. trachomatis в крови сводится к следующему:

С. trachomatis из слизистой оболочки УГТ, вследствие нарушения проницаемости эндотелия сосудов, попадает в кровь и там захватывается моноцитами. Однако патоген не элиминируется клетками иммунной

системы, а переходит в персистирующее состояние и завершает свой жизненный цикл с формированием атипичных ЭТ и выходом их в сыворотку крови. Циркуляция инфекционных форм С.trachomatis в крови является условием генерализации инфекции и диссеминации патогена в органы и ткани, удаленные от первичного очага инфекции.

По итогам проведенной работы становится очевидной необходимость разработки метода диагностики хронических форм УГХ с использованием сыворотки крови в качестве материала для выделения возбудителя. Это особенно актуально в случае развития осложнений экстрагенитальной локализации, когда использование соскобного материала является неинформативным в силу перехода возбудителя в верхние отделы УГТ либо в органы, удаленные от первичного очага инфекции.

Разработка нового подхода к диагностике хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови.

Разработка тест-системы для выделения ДНК С. trachomatis. Для количественного анализа содержания хламидий в клиническом материале необходимо иметь чувствительный метод детекции ДНК патогена. Совместно с лабораторией генной инженерией патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи и ЗАО «Синтол» была разработана тест-система для проведения ПЦР-РВ, направленная на одновременное определение двух мишеней С.trachomatis в одной пробирке. Первая реакция позволяет обнаружить и определить количество специфического фрагмента I6S рРНК С.trachomatis, вторая -обнаружить фрагмент многокопийной критической плазмиды С. trachomatis. Разработанная тест-система позволяет также контролировать эффективность выделения ДНК на основании определения количества специфического фрагмента гена Ь-актина человека и исключить недостоверные результаты при использовании внутреннего положительного контроля (ВПК). Чувствительность разработанной тест-системы составила не менее 50 копий ДНК в пробе для последовательности 16S рРНК. Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови.

В ходе работы при сравнении нескольких методов выделения ДНК из клинического материала (экстракционный, сорбентный, на колонках), было выявлено, что минимальный объем сыворотки для детекции ДНК патогена должен составлять не менее 1 мл. В нашей

работе мы использовали набор QIAamp DNA Blood Mini Kit, предварительно концентрируя образец до 200 мкл.

Был проведен также сравнительный анализ эффективности выделения ДНК из модельных образцов с помощью системы EasyMag и отработанной ранее методики с использованием набора QIAamp DNA Blood Mini Kit. Было установлено, что система EasyMag минимизирует потери при выделении ДНК и обеспечивает наибольшую чувствительность детекции ДНК С.trachomatis.

Для сравнения эффективности выделения С.trachomatis из сыворотки крови и цельной крови (в случае присутствия патогена в клетках крови) у I больных с урогенитальным хламидиозом, параллельно из двух фракций крови было проведено выделение ДНК с помощью прибора EasyMag. Экстракцию нуклеиновых кислот проводили из 1 мл сыворотки крови и 1

С помощью количественного варианта ГТЦР-РВ, в сыворотке крови двух пациентов ДНК хламидий была выявлена в количестве 1,7*103 ГЭ/мл в первом образце и 1,2*102 ГЭ/мл - во втором. В цельной крови патоген не обнаруживался вследствие ингибирования хода ПЦР I веществами, содержащимися в выделенном материале, которые трудно удалить в ходе экстракции ДНК (рис.3). I

Таким образом, выделение ДНК возбудителя из сыворотки крови представляется более эффективным, чем выделение из образцов цельной крови.

Отработка метода выделения и детекции ДНК С.trachomatis в сыворотке крови на клиническом материале.

С целью проведения количественного анализа содержания ДНК С.trachomatis в сыворотке при сравнении с соскобным материалом из УГТ были проанализированы методом ПЦР образцы, полученные от группы пациентов (15 человек) с установленным диагнозом УГХ.

Из 15 исследуемых больных у всех в соскобе была детектирована ДНК C.trachomatis, и у 12 пациентов - в сыворотке крови. Было установлено, что в соскобном материале содержание ДНК составляло 6х102 - 5x106 ГЭ на образец, тогда как в сыворотке аналогичный показатель составил 2х102'103 ГЭ/мл.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у пациентов с диагнозом УГХ в 80% случаев возбудитель выявляется в сыворотке крови в количестве не более 103 ГЭ/мл.

Параллельное выявление С. trachomatis в соскобах и сыворотке крови

методом ПЦР у больных с различными формами урогениталъной и

экстрагенитальной патологии.

На следующем этапе работы оценивали распространение хронической хламидийной инфекции у больных с различными формами урогенитальной и экстрагенитальной патологии с помощью разработанного метода. У этих групп больных были исследованы соскобы из УГТ и сыворотка крови с помощью ПЦР-РВ, а также проведен анализ сыворотки крови на наличие специфических антител класса IgG к основному белку наружной мембраны (МОМР) C.trachomatis и к белку теплового шока БТШ 60.

Были выбраны следующие группы больных:

- 36 человек с хроническими заболеваниями урогенитального тракта и осложненными формами восходящей инфекции

- 33 человека с артрологической патологией

- 20 человек (контрольная группа) без жалоб на заболевания мочеполовой системы.

В группе больных с хроническими заболеваниями УГТ методом ПЦР-РВ ДНК C.trachomatis была обнаружена в 16,7% (6 человек) в соскобном материале и в 61,1% (22 человека) в сыворотке крови. У всех пациентов, положительных по соскобному материалу, ДНК C.trachomatis выявляли также в сыворотке. При выявлении специфических антител к МОМР C.trachomatis диагностически значимые титры антител класса IgG детектировались в 19,5%. Антитела к белку теплового шока 60 были выявлены у 13,8% пациентов (5 человек).

В группе с артрологической патологией в соскобе ДНК C.trachomatis была обнаружена в 30% случаев (11 человек), в то время как в сыворотке - в 63,5% (21 человек). При этом, у 9 человек, имеющих ДНК C.trachomatis в соскобе, патоген был также детектирован в сыворотке крови. В 30% случаев в сыворотке крови данной группы больных были определены диагностические титры антител класса IgG. У

одного пациента выявляли также антитела класса IgA. Антитела к БТШ60 не был выявлены ни у одного пациента.

В контрольной группе (20 человек) у пациентов в соскобе методом ПЦР-РВ ДНК С.trachomatis выявляли только в 5% случаев, а в сыворотке - в 10%._

ЕЗ ДНК С.trachomatis в сыворотке крови

Q ДНК C.trachomatis в соскобпом

материале ■ IgG

□ ДНК C.trachomatis в сыворотке крови

□ ДНК C.trachomatis в соскобпом материале

□ IgG

В ДНК C.trachomatis в сыворотке крови

В ДНК C.trachomatis в соскобпом материале

Группа с Группа с Контрольная хроническими артрологичсс группа заболеваниями кой патологией _УГТ_[

Рис 4. Выявление ДНК C.trachomatis у больных с различными формами

урогенитальной и экстрагениталъной патологией в сыворотке и

соскобе методом ПЦР-РВ и определение антител IgG к МОМР

С. trachomatis.

Таким образом, впервые было обнаружено, что у пациентов с хроническими и осложненными формами заболеваний УГТ и артрологической патологией ДНК хламидий обнаруживаются в сыворотке крови в 2-3,5 раза чаще, чем в соскобном материале. Это связано с тем, что возбудитель не всегда доступен для анализа в очаге инфекции. Тем самым, выявление ДНК C.trachomatis в сыворотке крови больных, особенно в случае осложненных и восходящих форм хламидиоза, имеет важное диагностическое значение. Применение данного, принципиально нового подхода позволяет выявлять возбудитель вне зависимости от локализации очага инфекции. Кроме того, применение количественного формата ПЦР дает возможность определять бактериальную нагрузку и проводить оценку эффективности антимикробной терапии.

Изучение тропизма C.trachomatis к гепатоцитам в условиях in vitro и выявление механизмов адгезии и интернализации в клетки-мишени.

Следующей задачей работы являлась оценка последствий системного распространения C.trachomatis в организме.

Взаимодействие инфекционных агентов с липопротеинами сыворотки приводит к образованию комплекса, который может взаимодействовать с рецепторами липопротеинов на мембране гепатоцитов, обусловливая проникновение патогена в печень. Такое взаимодействие было показано ранее для вируса гепатита С.

Изучение связывания С. trachomatis с липопротеинами низкой

плотности (ЛПНП)

Основываясь на этих данных, мы предположили вероятность аналогичного взаимодействия С. trachomatis, находящейся в крови, с липопротеинами сыворотки, что может способствовать диссеминации патогена в печень (совместная работа с группой отдела молекулярной генетики Техасского университета и CTL-Кембридж).

При изучении взаимодействия С.trachomatis с различными фракциями липопротеинов сыворотки крови с помощью метода иммуно-дот-блота было установлено, что ЭТ C.trachomatis специфически связываются как с неденатурированными, так и особенно эффективно с

денатурированными липопротеинами низкой и очень низкой плотности. Так как эти фракции содержат аполипопротеин АроВ 100, мы предполагаем, что ЭТ C.trachomatis специфически связываются с этим белком.

Изучение тропизма C.trachomatis к клеткам печени.

С целью изучения возможности инфицирования хламидиями клеток печени на первом этапе нами была проведена работа по исследованию тропизма хламидий к гепатоцитам в условиях in vitro.

При заражении первичных гепатоцитов крыс C.trachomatis к 48 часам п.и. формировались типичные внутриклеточные включения, характерные для позднего этапа жизненного цикла хламидий.

При заражении перевиваемой линии клеток гепатокарциномы HepG2 было показано, что при заражающей дозе 1:1 через 48 часов с начала эксперимента в 50% инфицированных клеток формировались типичные включения, при дозе 2:1 количество инфицированных клеток превышало 70% . При этом, к 72 часам патоген полностью завершал внутриклеточную стадию развития с высвобождением элементарных телец из разрушенных эукариотических клеток, что было подтверждено высевом лизатов клеток.

Оценку жизнеспособности культивируемых в клетках HepG2 хламидий проводили анализируя уровень синтеза мРНК методом ОТ-ПЦР. В качестве конститутивных маркеров экспрессии генов были выбраны 16S рРНК и ген, кодирующий белок Еио. Полученные данные

свидетельствуют об активном синтезе мРНК обоих маркеров, что является показателем жизнеспособности и метаболической активности патогена.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов выявили тропизм С.trachomatis к гепатоцитам и возможность эффективного размножения в них патогена с формированием ЭТ.

Доказательство липопротеин- опосредованного транспорта

С. trachomatis в гепатоциты в условиях in vitro.

Для доказательства липопротеин-опосредованного транспорта С. trachomatis в гепатоциты нами была проведена серия экспериментов в условиях in vitro.

В первой серии экспериментов ЭТ С.trachomatis инактивировали УФ, в результате чего нежизнеспособные ЭТ утрачивали способность к интернализации в клетки. Инактивированные ЭТ инкубировали с фракцией ЛПНП, а затем культивировали с первичными гепатоцитами крыс. Через 24 часа инкубации клетки окрашивали моноклональными антителами к ЛПС хламидий и анализировали с помощью конфокального микроскопа (рис.5).

а - ЭТ в

цитоплазме

гепатоцитов.

б - ЭТ на

мембране

гепатоцитов.

Рис,5. Анализ липопротеин-опосредованного транспорта С.trachomatis в гепатоциты спомощью конфокальной микроскопии.

Было показано, что обработанные ЛПНП инактивированные ЭТ С.trachomatis через 24 часа инкубации выявляются в цитоплазме гепатоцитов, что указывает на возможность их пассивной интернализации в результате связывания образовавшегося комплекса ЭТ-ЛПНП с рецепторами липопротеинов на поверхности гепатоцитов.

В другой серии экспериментов проводили заражение перевиваемой линии клеток гепатокарциномы HepG2 жизнеспособными ЭТ С.trachomatis после предварительной инкубации с ЛПНП. Уровень развития инфекции оценивали в сравнении с клетками, зараженными необработанными ЛПНП хламидиями, при использовании метода

количественного подсчета инфицированных клеток на основе проточной цитометрии.

Было показано, что после взаимодействия С.trachomatis с ЛПНП количество инфицированных клеток в популяции возрастало на 25-30%. Обработка клеток моноклональными антителами к рецепторам ЛПНП до заражения хламидиями резко снижала развитие внутриклеточной инфекции.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывают на возможность липопротеин-опосредованного транспорта хламидий в клетки печени.

Влияние инфекции на экспрессию генов эукариотических клеток.

Известно, что хламидии при инфицировании клеток влияют на многие эндогенные сигнальные пути клетки-хозяина.

Изучение влияния хламидийной инфекции на экспрессию ряда генов липидного обмена, а также участвующих в синтезе рецепторного аппарата гепатоцитов, проводили на модели клеток гепатокарциномы человека HepG2 при заражении хламидиями.

Среди исследуемых генов были:

гены основных липидогенных ферментов: 3-гидрокси-3 метил глутарил СоА редуктаза, З-гидрокси-Зметилглутарил СоА синтаза, сквален синтаза, синтаза жирных кислот

- гены LDL-рецепторов и белка LDL рецепторов.

Через 48 часов п.и. С.trachomatis не влияла ни на экспрессию основного housekeeping гена - 36В4, ни на экспрессию генов, кодирующих липидогенные ферменты (SS, HMG-CoA Red, HMG-CoA Synth). Однако было показано заметное снижение экспрессии гена рецептора ЛПНП, составляющее 24-44% от контрольных неинфицированных клеток. Снижение экспрессии гена имело зависимый от дозы инфекции характер. Экспрессия гена, кодирующего белок, ассоциированный с ЛПНП рецепторами, оставалась на исходном уровне.

Таким образом, в ходе исследования было выявлено, что инфекция С.trachomatis влияет на специфические функции клеток печени. Так, было показано, что С.trachomatis существенно снижает экспрессию гена рецепторов ЛПНП в гепатоцитах. Известно, что рецепторы ЛПНП клеток печени выполняют очень важную функцию, обеспечивая связывание и выведение ЛПНП из крови. Эти новые данные требуют дальнейшего изучения роли хламидийной инфекции в регуляции липидного обмена.

Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о способности С.trachomatis инфицировать и размножаться в клетках печени, что является принципиально новым, ранее не известным фактом. До настоящего времени в опытах in vitro была показана возможность размножения С.trachomatis в эпителиальных клетках, фибробластах, астроцитах [Dreses-Werringloer et al., 2006; Levitt et al.,1986], макрофагах и мышечных клетках, [Dumrese et al., 2005; Rodel et al., 2003; Yang et al., 2005]. Выявление других тканей, в которых может эффективно размножаться возбудитель урогенитального хламидиоза, существенно расширит спектр патологий, обусловленных С. trachomatis. Нами впервые был показан липопротеин-опосредованный транспорт С. trachomatis, обусловленный специфическим связыванием патогена с белком АроВ липопротеинов и последующим взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП.

Выявление C.trachomatis в ткапях печени.

Для изучения возможности инфицирования C.trachomatis тканей печени у пациентов были проведены исследования по одновременному выявлению возбудителя в сыворотке крови и биоптатах печени (совместно с Саратовским научно-исследовательским институтом кардиологии). Операционный материал печени был получен при проведении холецистэктомии у пациентов с заболеваниями желчного пузыря. Биоптаты тканей печени были взяты также от больных при проведении гистологического исследования биоптатов печени для диагностики цирроза печени или определения метастатических очагов в органе.

На первом этапе работы у данных больных методом ПЦР-РВ была исследована сыворотка крови на присутствие в ней ДНК C.trachomatis.

Всего было обследовано 87 пациентов.

В исследуемой группе методом ПЦР-РВ в сыворотке ДНК C.trachomatis выявлялась в 40 случаях из 87 (в 46% случаев).

Для изучения возможности инфицирования печени при генерализации инфекции, у больных методами ПЦР-РВ и ПИФ исследовались биоптаты печени.

В тканях печени с помощью ПЦР-РВ C.trachomatis была выявлена у 48 пациентов из 87 обследованных (в 55% случаев).

Для иммуногистохимического исследования срезов печени методом ПИФ были использованы родоспецифические моноклональные антитела к ЛПС и белку МОМР. Внутриклеточные хламидийные включения крупных и средних размеров выявлялись как в гепатоцитах, так и в

Купферовских клетках, что указывало на наличие инфекционного

а - срез № 1 печени больной А, окрашенный моноклональными антителами к ЛПС, меченными ФИТЦ б- срез №2 печени больной А, окрашенный моноклональными антителами к белку МОМР, меченными ФИТЦ. Линейка 10pm Рис.6. Иммуногистохимический анализ срезов печени. Одновременное выявление ДНК хламидий в сыворотке и биоптатах показало, что у 22 человек возбудитель определялся в обоих образцах. Таким образом, результаты анализа свидетельствуют о возможности инфицирования печени в 55% случаев С.trachomatis при циркуляции патогена в сыворотке крови.

Полученные результаты впервые свидетельствуют о возможности инфицирования С. trachomatis органов желудочно-кишечного тракта.

Выводы:

1. Впервые у больных с УГХ микробиологическим методом в сыворотке крови выявлена инфекционная форма С.trachomatis, что указывает на наличие гематогенного пути распространения возбудителя.

2. Разработан метод лабораторной диагностики хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови на основе модифицированной методики выделения и детекции ДНК С. trachomatis с помощью ПЦР-РВ.

3. Установлена высокая эффективность разработанного метода для выявления ДНК патогена в сыворотке крови при хроническом и экстрагенитальном течении хламидиоза по сравнению с существующим методом постановки диагноза на основе выявления патогена в нижних отделах мочеполовой системы.

4. Показан тропизм С. trachomatis к гепатоцитам и изучен новый механизм адгезии и интернализации за счет связывания патогена с

АроВ аполипопротеинами с последующим взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП.

5. Инфекция C.trachomatis в клетках гепатокарциномы приводит к зависимому от дозы инфекции подавлению экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛПНП, который выполняет функцию связывания и выведения ЛПНП из крови.

6. На клиническом материале показано, что C.trachomatis, циркулирующая в крови, выявляется в печени больных в 55 % случаев

Список опубликованных работ

1. Зигангирова Н.А, Петяев И.М., Пашко Ю.П, Моргунова Е.Ю., Капотина Л.Н., Диденко Л.В. и др. Генерализация инфекции у больных с урогенитальным хламидиозом // Клиническая микробиология и антимикробная терапия - М., 2007 9(4).- С.351-360

2. Пашко Ю.П. и др. Применение ПЦР в реальном времени для выявления легионелл в окружающей среде. //ЖМЭК- 2009.-№2. - С. 7580.

3. Пашко Ю.П., Зигангирова Н.А., Петяев И.М., , Капотина Л.Н., Моргунова Е.Ю., Колкова Н.И. , Диденко Л.В., Юдина Т.Н. Современные аспекты диагностики хронического хламидиоза, вызванного персистирующими формами хламидий. // ЖМЭИ - 2009 -№4- С. 89-93.

4. Bashmakov Y„ Zigangirova N.. Pashko Y., Kapotina L., Petyaev I. Chlamydia trachomatis growth inhibition and restoration of LDL-receptor level in HepG2 cells treated with mevastatin// Comparative Hepatology 2010, 9:3 doi:10.1186/1476-5926-9-3

5. Нестеренко Л. H., Аляпкина Ю.С., Пашко Ю. П., Кондратьева Е. В., Капина М. А., Балунец Д. В., Зигангирова Н. А., Романова Ю. М., Апт А. С. Течение хламидиоза легких у мышей инбредных линий, отличающихся по генетически детерминированной чувствительностью к туберкулёзу. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009 - (в печати).

6. Пашко Ю. П., Моргунова Е. Ю., Капотина Л. Н., Зигангирова Н. А. и др. Диагностика активной персистентной инфекции у больных с урогенитальным хламидиозом // Генодиагностика инфекционных болезней -2007: Сб. трудов. VI Всерос. Науч.-практ. Конф. Т. II. - М., 2007.-С.-181-183.

7. Пашко Ю.П., Моргунова Е.Ю., Чалык Н.Е., Зигангирова Н.А. Выявление С.trachomatis в сыворотке крови и биоптатах желчного пузыря и печени при острых и хронических холециститах // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями - Материалы IY международной конференции,- Спб.- 2-4 июня 2008г.- С. 68.

8. Аляпкина Ю.С., Пашко Ю.П., Варламов Д.А., Алексеев Я.И., Евстегнеева Ж.В., Щербо С.Н. Разработка и применение ПЦР в режиме реального времени для выявления герпесвирусов// Идеи Пастера в борьбе с инфекциями - Материалы IY международной конференции,-Спб.- 2-4 июня 2008г.- С.75

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Пашко, Юлия Петровна

Список сокращений

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Эпидемиология урогенитального хламидиоза.

2 Биологическая характеристика хламидий.

2.1 Развитие классификации.

2.2 Таксономия C.trachomatis.

2.3 Строение и жизнедеятельность хламидий.

2.4 Жизненный цикл C.trachomatis.

2.4.1 Ранний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий.

2.4.2 Средний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий.

2.4.3 Поздний этап внутриклеточной стадии жизненного цикла хламидий.

2.5 Строение клеточной оболочки и антигенные детерминанты хламидий.

2.6 Секретируемые факторы хламидий.

2.7 Чувствительность к антибиотикам.

2.8 Пути передачи хламидий.

3 Клинические проявления хламидийной инфекции.

3.1 Поражения нижнего отдела урогенитального тракта.

3.2 Восходящая хламидийная инфекция.

3.3 Внутриутробное инфицирование и патология беременности, обусловленные C.trachomatis.

3.4 Экстрагенитальная хламидийная инфекция.

4 Данные исследований о возможности гематогенного пути распространения C.trachomatis.

5 Персистенция хламидий.

6 Диагностика урогенитального хламидиоза.

III. МАТЕРИАЛЫ.

IV. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

V. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1 Глава 1.

Выявление C.trachomatis в сыворотке крови больных.

1.1. Микробиологическое выделение C.trachomatis.

1.2. Детекция ДНК C.trachomatis в культуре клеток, инфицированных образцами сывороток больных.

1.3. Электронно-микроскопическая характеристика циркулирующих в крови хламидий.

1.4. Иммуно цитохимическая детекция ретикулярных и элементарных тел в препаратах сыворотки крови больных.

1.5. Опсонизация внеклеточных форм хламидий в сыворотке.

1.6. Культивирование изолятов C.trachomatis из сыворотки крови.

2 Глава 2.

Разработка нового подхода к диагностике хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови.

2.1 Подбор наиболее эффективного метода выделения ДНК из сыворотки крови.

2.2 Отработка метода выделения и детекции C.trachomatis в сыворотке крови на клиническом материале.

2.3 Параллельное выявление C.trachomatis в соскобах и сыворотке крови методом ПЦРу больных с различными формами урогенитальной и экстрагениталыюй патологии.

3 Глава 3.

Изучение тропизма C.trachomatis кгепатоцитам в условиях in vitro.

3.1 Изучение связывания C.trachomatis сЛПНП.

3.2 Изучение тропизма C.trachomatis к клеткам печени.

3.3 Доказательство липопротеин- опосредованного транспорта C.trachomatis в гепатоциты в условиях in vitro.

3.4 Влияние инфекции на экспрессию генов эукариотических клеток.

4 Глава 4.

Выявление C.trachomatis в тканях печени.

VI. ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гематогенный путь распространения C.trachomatis у пациентов с урогенитальным хламидиозом"

АКТУАЛЬНОСТЬ

С. trachomatis - грамотрицательная бактерия с облигатным внутриклеточным типом паразитирования. Этот патоген - самый распространенный возбудитель бактериальных инфекций, передаваемых половым путем. Ежегодно в мире регистрируется около 90 млн. новых случаев урогенитального хламидиоза (УГХ). В США, например, ежегодно регистрируется около 5 миллионов новых случаев хламидиоза, в том числе у 250 тысяч новорожденных; в Европе — около 10 миллионов случаев [55]. По данным ВОЗ заболеваемость урогенитальным хламидиозом за период с 2000 по 2006 г. в развитых странах имеет тенденцию к возрастанию. Например, в Швеции заболеваемость выросла с 218 до 376 случаев на 100 тысяч населения.

Эпидемиологическая ситуация в России неблагоприятная: по данным 1ЩИИОИЗ Росздрава в период с 2000 по 2006 г регистрируется более 90 случаев УГХ на 100 тысяч населения, что составляет около 20% в структуре всех ШИШ.

Официальная статистика не отражает истинной ситуации о распространенности урогенитального хламидиоза, т.к. плохо учитываются случаи хронического и персистентного течения болезни, процент которых особенно в группах риска — активного сексуального возраста - весьма велик и может достигать 60-80% у женщин и до 40% у мужчин [33]. При этом персистентная хламидийная инфекция имеет не только урогенитальную локализацию, но также поражает другие органы.

Эпидемиологическая значимость персистентных форм хламидиозов была доказана еще в работах А.А.Шаткина [31]. Хламидии не являются представителями нормальной микрофлоры человека. Их обнаружение указывает на наличие инфекционного процесса, а отсутствие клинических симптомов заболевания определяет лишь временное равновесие, возникшее между паразитом и хозяином в условиях, ограничивающих, но не препятствующих размножению патогенного внутриклеточного микроорганизма [54, 146. В этой связи персистентная хламидийная инфекция является не менее опасной, чем ее манифестные формы и требует проведения лечебных и профилактических мероприятий. Наибольшую ответственность за распространение инфекции в настоящее время несут не выявленные, не лечащиеся или неправильно лечащиеся больные с острыми, подострыми или хроническими хламидийными воспалительными процессами.

Развитие хронических хламидиозов определяется в большей степени адаптационными свойствами патогена и образованием его персистирующих форм, обладающих весьма эффективными механизмами инактивации защитных факторов организма хозяина и использования регуляторных путей клетки -хозяина клетки для развития инфекционного процесса. Патогенетическое значение персистирующих форм хламидий определяется, с одной стороны, тем, что они представляют собой форму длительного выживания патогена в макроорганизме с сохранением патогенного потенциала, а с другой, тем, что они сами ответственны за развитие тяжелых иммунопатологических состояний вследствие постоянной активации клеток иммунной системы, поддержания воспаления, а также влияния на многие внутриклеточные процессы.

Хроническая инфекция, вызванная С. trachomatis, ведет к развитию весьма широкого спектра осложнений, связанных с диссеминацией С. trachomatis из первичного очага инфекции в удаленные органы [26]. Это ведет к развитию серьезных заболеваний как генитальной, так и экстрагенитальной локализации, таких как: женское и мужское бесплодие, патология беременности, синдром Рейтера, офтальмохламидиоз, перигепатит, тазовый перитонит [21, 123, 114]. На данный момент достаточно хорошо изучены интраканаликулярный (восходящий), лимфогенный и интранатальный (при прохождении через родовые пути) пути распространения. Экстрагенитальную патологию и внутриутробное инфицирование плода, обусловленные С. trachomatis, рассматривают как следствие диссеминации патогена гематогенным путем. Однако, на сегодняшний день практически отсутствуют микробиологические исследования, доказывающие ключевую роль данного пути в развитии экстрагенитальных патологий хламидийной этиологии. В связи с этим, актуальным является детальное изучение механизмов распространения С. trachomatis гематогенным путем.

Отсутствие данных о возможности генерализации инфекционного процесса при урогенитальной хламидийной инфекции естественно ограничивает исследования по выявлению связи между С.trachomatis и хроническими патологиями различных органов. Однако именно для внутриклеточных патогенов за последние годы появилось много данных о том, что вызываемые ими хронические инфекции лежат в основе ряда серьезных соматических патологий.

К настоящему времени проблема диагностики хронической хламидийной инфекции определяется несколькими факторами. Во-первых, персистирующие формы хламидий, ответственные за развитие хронических инфекций, плохо детектируются с помощью классических микробиологических и иммунологических тестов, вследствие нарушения их метаболизма и антигенной структуры [14]. Во-вторых, при осложненных формах, связанных с восходящей и экстрагенитальной инфекцией, возбудитель мало доступен для анализа. В-третьих, иммунный ответ при хронической хламидийной инфекции подавлен, что ограничивает возможность использования серологической диагностики. При этом постановка диагноза урогенитального хламидиоза возможна только при обнаружении С. trachomatis прямыми методами. В связи с этим, разработка новых методов детекции возбудителя на основе понимания механизмов распространения С.trachomatis в организме при хроническом течении инфекции приобретает особую актуальность.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Исследование гематогенного пути распространения Chlamydia trachomatis и механизма инфицирования печени, разработка метода диагностики хронических форм хламидиоза экстрагенитальной локализации.

ЗАДАЧИ: а) Изучить возможность гематогенного пути распространения C.trachomatis как фактора генерализации инфекции при осложненных формах УГХ. б) Разработать метод диагностики хронических хламидиозов на основе ПЦР-РВ с использованием сыворотки крови в качестве материала для исследования. в) Определить диагностическое значение выявления C.trachomatis в сыворотке крови при сравнении со стандартными методами диагностики урогенитального хламидиоза. г) Изучить тропизм C.trachomatis к гепатоцитам, механизмы адгезии и интернализации в условиях in vitro, охарактеризовать клеточный ответ на развитие инфекции. д) Оценить последствия циркуляции C.trachomatis в сыворотке крови и возможность инфицирования печени у больных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

- Впервые доказан гематогенный путь распространения C.trachomatis на основании культурального выделения инфекционных форм патогена в сыворотке крови больных с подтвержденным диагнозом УГХ. C.trachomatis, выделяемая из сыворотки крови, может быть определена как внеклеточная инфекционная форма персистирующих in vivo хламидий.

- Впервые обнаружено, что у пациентов с хроническими и осложненными формами заболеваний урогенитального тракта (УГТ) C.trachomatis в сыворотке крови обнаруживаются значительно чаще, чем в соскобном материале из органов УГТ.

- При моделировании инфекционного процесса на первичных гепатоцитах крыс и на перевиваемой линии клеток гепатокарциномы человека впервые был показан тропизм С. trachomatis к клеткам печени (гепатоцитам) и изучен механизм адгезии и интернализации за счет связывания патогена с белком АпоВ липопротеинов с последующим взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП. Было выявлено, что инфекция С. trachomatis в клетках гепатокарциномы приводила к зависимому от дозы инфекционного агента подавлению экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛПНП.

- Впервые показана возможность инфицирования клеток печени возбудителем урогенитального хламидиоза. При исследовании клинического материала от больных с острыми и хроническими холециститами в сыворотке крови и биоптатах печени и желчного пузыря была обнаружена С. trachomatis. Выявлено, что циркулирующие в крови больных хламидии в значительном проценте случаев могут диссеминировать в печень.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Выявление С. trachomatis в сыворотке крови больных, особенно в случаях хронических и осложненных форм хламидиоза, имеет важное диагностическое значение, поскольку позволяет использовать принципиально новый подход прямого выявления возбудителя вне зависимости от локализации очага инфекции. Разработан метод прямого выявления хламидий с использованием сыворотки крови. Его основой является оптимизированная методика выделения ДНК патогена из сыворотки крови и детекция С.trachomatis с помощью разработанного метода количественного анализа содержания хламидий в клиническом материале с помощью ПЦР-РВ. Этот метод может быть использован для диагностики хронических и экстрагенитальных форм хламидийной инфекции.

Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Метод детекции ДНК Chlamydia trachomatis в сыворотке крови количественным методом ПЦР-РВ», утвержденных 25 февраля 20 Юг на совете по внедрению научных достижений в практику НИИЭМ им,Н.Ф.Гамалеи РАМН (выписка из протокола №12).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пашко, Юлия Петровна

VI. ВЫВОДЫ:

1. Впервые у больных с УГХ микробиологическим методом в сыворотке крови выявлена инфекционная форма С. trachomatis, что указывает на наличие гематогенного пути распространения возбудителя.

2. Разработан метод лабораторной диагностики хронических хламидиозов с использованием сыворотки крови на основе модифицированной методики выделения и детекции ДНК С. trachomatis с помощью ПЦР-РВ.

3. Установлена высокая эффективность разработанного метода для выявления ДНК патогена в сыворотке крови при хроническом и экстрагенитальном течении хламидиоза по сравнению с существующим методом постановки диагноза на основе выявления патогена в нижних отделах мочеполовой системы.

4. Показан тропизм С.trachomatis к гепатоцитам и изучен новый механизм адгезии и интернализации за счет связывания патогена с апоВ аполипопротеинами с последующим взаимодействием данного комплекса с рецепторами гепатоцитов для ЛПНП.

5. Инфекция С. trachomatis в клетках гепатокарциномы приводит к зависимому от дозы инфекции подавлению экспрессии гена, кодирующего рецептор ЛПНП, который выполняет функцию связывания и выведения ЛПНП из крови.

6. На клиническом материале показано, что С. trachomatis, циркулирующая в крови, выявляется в печени больных в 55 % случаев.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Пашко, Юлия Петровна, Москва

1. Айламазян Э. К. Акушерство. Учебник для медицинских вузов/ Э. К. Айламазян -Издательство: СПб СОТИС. Год: 1995. Страниц: 224 с.

2. Аковбян В. А. Характеристика эпидемиологических закономерностей, определяющих распространение заболеваний, передаваемых половым путем, в России / В.А. Аковбян // Вест, дерматол. и венерол. 1998. № 1. С. 4-6.

3. Битти B.JI. Персистенция хламидий: от клеточных культур до патогенеза хламидийной инфекции / Битти B.JI. // ЗППП. 1995. № 6. С. 3-18.

4. Бойко Э. В. Офтальмохламидиоз у лиц молодого возраста: этиология, патогенез, клинические формы, диагностика / Э. В. Бойко, A. JI. Позняк, В. С. Агеев //Вестник офтальмологи.- 2008.- №1.-С.50-53.

5. Буданов П.В. Сравнительная эффективность лечения акушерских и перинатальных осложнений хламидиоз / П.В. Буданов, П.А. Асланова, М.В. Буданова //Журнал «Трудный пациент» / Архив / №8-2008 .

6. Васильев М.М. Хламидийная инфекция. Проблема антибиотикорезистентности / М.М. Васильев // Вест, дерматол. и венерол. 2003. № 3. С. 18-21.

7. Глазкова JI.K. Заболевания, передаваемые половым путем / JI.K. Глазкова, Н.М. Герасимова // М 1996;4:9 12.

8. Гуртовой Б.Л. Внутриутробные бактериальные и вирусные инфекции плода и новорожденного/ Б.Л. Гуртовой и др.// Акуш. и гинек. -1994.-№ 4.-С. 20-26.

9. Инфекции, передаваемые половым путем. Клиника, диагностика, лечение / Под ред. В. А. Молочкова и др.. М.: Медицина, 2006.

10. Ковалев Ю. Н. Болезнь Рейтера/ Ю. Н. Ковалев, В. А. Молочков, М. С. Петрова // М.: Гэотар-медицина, 2006.

11. Ковалев Ю.Н. Болезнь Рейтера / Ю.Н. Ковалев, И.И. Ильин // Вариант-книга, Челябинск, 1993; С.3738.

12. Козлова В.И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий/ В.И. Козлова, А.Ф. Пухнер // М 1995;37 38; 174 - 224.

13. Коробейникова Э.А. К вопросу о частоте и клинических особенностях урогенитального хламидиоза/ Коробейникова Э.А. и др. //Труды ИГМИ 1995;33:166- 168.

14. Кричевская Г. И. Значение Chlamydia trachomatis в этиопатогенезе передних увеитов / Г. И. Кричевская// Вестник офтальмологии. — 2008. — N4. —С. 48-51.

15. Куляш Г.Ю. Персистирующая урогенитальная хламидийная инфекция: возможности и нерешенные вопросы лабораторной и клинической диагностики // ИППП. 2003. № 3. С. 3-8.

16. Лебедев В. А. Урогенитальный хламидиоз / В.А.Лебедев,

17. A.И.Давыдов // Вопр. гинекол., акуш. и перинатол.- 2002.-Т. 1.-№.2.-С. 25-31.

18. Липова Е.В. Урогенитальный хламидиоз: современные клинико-лабораторные подходы / Е.В. Липова // Вест, дерматол. и венерол. 2002. № 5. С. 46-48.

19. Мавров Г. И. Обнаружение ДНК Chlamydia trachomatis в моноцитах периферической крови при болезни Рейтера/ Г. И.Мавров и др. // Журн. дерматологии, венерологии. 2003. - № 1 (19). — С. 54-57.

20. Мавров Г.И. Chlamydia trachomatis в просвете капилляров маточных труб: возможность гематогенного распространения инфекции / Г.И. Мавров// Журн. АМН Укршни, 1996; 4: 704711.

21. Мерзляков В.А. Опыт массового обследования беременных на хламидиоз. Тезисы Российской научно-практ. конференции дерматовенерологов/В.А. Мерзляков, Э.А. Коробейникова//M 1997; 184 185.

22. Мол очков В. А. Хронический уретрогенный простатит. М.: Медицина, 1998. 304 с.

23. Прилепская В.Н. Урогенитальный хламидиоз/ В.Н. Прилепская, П.Р. Абакарова //Гинекология 2004.-Т.6.-№.1.- С. 10-14.

24. Прохоренков В. И. О классификации урогенитального хламидиоза /

25. B. И. Прохоренков // ИППП. 2002. № 2. С. 3-6.

26. Савичева А. М. Генитальный хламидиоз: исходы беременности и проявление инфекции у доношенных новорожденных Актуальные микробиологические и клинические проблемы хламидийных инфекций / А. М. Савичева, М. А. Башмакова// Науч. труды, М., 1990. С. 52-55.

27. Савичева A.M. Урогенитальный хламидиоз у женщин и его последствия/ A.M. Савичева, М.А. Башмакова // Н.-Новгород. 1998;

28. Сафина О.Н. Урогенитальный хламидиоз и хронический простатит // Сиб. журн. дерматол. и венерол. 2003. № 4. С. 62-63.

29. Сидорова И.С. Внутриутробная инфекция. Ведение беременности, родов и послеродового периода / И.С. Сидорова , И.О.Макаров , Н.А.Матвиенко М: МЕДпресс-информ, 2008 г.

30. Тиктинский О.Л. Роль заболеваний передающихся половым путем в бесплодном браке / О.Л. Тиктинский, В.В. Михайличенко, С.Н. Калинина // Урол и нефрол 1997; 1:37 39.

31. Хрянин A.A. Лечение урогенитального хламидиоза // Вест, дерматол. и венерол. 1998. № 4. С. 46-47.

32. Хусаинов Х.А. Клинико-эпидемиологические особенности урогенитальной хламидийной инфекции в детской гинекологической практике/ Х.А. Хусаинов и др. // Тез. докл. Второго междисциплинарного симпозиума

33. Новое в дерматовенерологии, андрологии, гинекологии: наука и практика". М., 1997; 32 с.

34. Шаткин A.A. Персистентная хламидийная инфекция в культуре клеток./ A.A. Шаткин, В. Л Попов, и др.// Вест. АМН СССР. 1985. № 3. С. 51-54.

35. Шаткин A.A. Урогенитальные хламидиозы /A.A. Шаткин., И.И. Мавров // Здоров'я, Кшв, 1983; 200 с.

36. Шинский Г. Э. Эпидемиологические аспекты хламидийной инфекции / Г. Э Шинский // Вест, дерматол. и венерол. 1999. № 1. С. 11-13.

37. Шипицына Е.В. Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам in vitro: методологические аспекты и клиническое значение/ Е.В. Шипицына и др.// ЬСМАХ 2004; Том 6, N 2: 105-210.

38. Юцковский А. Д. К проблеме урогенитальных инфекций у беременных/ А.Д. Юцковский // Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2002.-№ 6.-С. 67-70.

39. Adler М. W. Sexually Transmitted diseases control in developing countries / M. W. Adler // Genitourin. Med. 1996. Vol. 72. No. 2. P. 83-88.

40. Albrecht Marco. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome/ Marco Albrecht et al.//Nucleic Acids Res. 2010 January; 38(3): 868-877.

41. Bardin T. Antibiotic treatment of venereal disease and Reiter's syndrome in a Greenland population/ T. Bardin et al.// Arthritis Rheum. 1992 Feb;35(2):190-194.

42. Barlow RE. The prevalence of Chlamydia trachomatis in fresh tissue specimens from patients with ectopic pregnancy or tubal factor infertility as determined by PCR and in-situ hybridisation/ RE.Barlowet al.// J Med Microbiol. 2001 Oct;50(10):902-8.

43. Barry СЕ. He 1-mediated effects on DNA structure: a potential regulator of chlamydial development/ CE. Barry, TJ. Brickman, T. Hackstadt // Mol Microbiol. 1993 Jul;9(2):273-283.

44. Battle T.J. Evaluation of laboratory testing methods for Chlamydia trachomatis infection in the era of nucleic acid amplification / T.J. Battle et al.// J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 2924-2927.

45. Bavoil P. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis / P. Bavoil , A. Ohlin , J. Schachter // Infect Immun. 1984 May ;44(2):479-85.

46. Beatty, W. L. Immunoelectron-microscopic quantitation of differential levels of chlamydial proteins in a cell culture model of persistent Chlamydia trachomatis infection / W. L. Beatty, R. P. Morrison, G. I. Byrne// Infect. Immun. 1994; 62:4059-4062.

47. Beatty, W. L. Tryptophan depletion as a mechanism of gamma interferon-mediated chlamydial persistence/ W. L. Beatty et al.// Infect. Immun. 1994; 62:3705-3711.

48. Bell TA. Risk of perinatal transmission of Chlamydia trachomatis by mode of delivery/ TA. Bell et al.// J Infect. 1994;29 (2): 165 -169

49. Belland, R.J. Transcriptome analysis of chlamydial growth during IFN-y-mediated persistence and reactivation / R.J. Belland et al.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2003; 100:15971-15976.

50. Bellang R. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of C.trachomatis. / R.Bellang, G.Zong. // PNAS 2003, 100.

51. Beutler A.M. In sito hybridization for detection of inapparent infection with Chlamydia trachomatis in synovial tissue of patient with Reiter's syndrome / A.M. Beutler et al.//Am. J. Med. Sei., 1995; 310: 206213.

52. Brunham R.C. Chlamydia trachomatis antigens: role in immunity and pathogenesis/ R.C. Brunham and R.W. Peeling// Infect. Agents. Dis. 3 (1994), pp. 218-233.

53. Bulut Y. Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88-dependent pathway/ Y. Bulut et al.//J Immunol. 2002 Feb 1; 168(3): 1435-40.

54. Byrne, G. I. Lymphokine-mediated inhibition of Chlamydia replication in mouse fibroblasts is neutralized by anti-gamma interferon immunoglobulin/ G. I. Byrne, D. A. Krueger// Infect. Immun. 1983; 68:1457-1464.

55. Carabeo, R.A. Chlamydia trachomatis induces remodeling of the actin cytoskeleton during attachment and entry into HeLa cells / R.A Carabeo et al. // Infect Immun 2002; 70: 3793-3803.

56. Carolin M. Black. Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydia trachomatis infections/Carolin M. Black// Microbiol Rev 1997; 1: 160—184.

57. Cecil JA, Features of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infection in male army recruits/ JA Cecil, MR Howell, JJ Tawes //. J Infect Dis 2001;184:1216-1219.

58. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Chlamydia screening among sexually active young female enrollees of health plans—United States,.2009/MMWR. Apr 17;58(14):362-5.

59. Cheryl Villareal. Persistent Chlamydiae and chronic arthritis/ Villareal Cheryl et al.// Arthritis Res 2002, 4:5-9.

60. Clark, R. B. Ultrastructural analysis of the effects of erythromycin on the morphology and developmental cycle of Chlamydia trachomatis HAR-13/ R. B. Clark, P. F. Schatzki, H. P. Dalton // Arch. Microbiol. 1982; 133:278-282.

61. Clifton, D.R. Tyrosine phosphorylationof the chlamydial effector protein tarp is species specific and not required for recruitment of actin / D.R. Clifton // Infect Immun 2005; 73: 3860-3868.

62. Coles, A. M. Low-nutrient induction of abnormal chlamydial development: a novel component of chlamydial pathogenesis?/ A. M. Coles et al.// FEMS Microbiol. Lett. 1993; 106:193-200.

63. Darougar S. Prevalence of antichlamydial antibody in London blood donors / S. Darougar et al. //Brit.J.Vener.Dis.v 1980.v Vol.56.v P.404 v407.

64. Darville T. Chlamydia trachomatis infections in neonates and young children/ T. Darville // Semin Pediatr Infect Dis. 2005 Oct; 16(4):235-44.

65. David K. Trafficking of chlamydial antigens to the endoplasmic reticulum of infected epithelial cells/ K. David et al.//Microbes Infect. 2008; 10(14-15): 1494-1503.

66. Deiman B. Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) / B. Deiman, P. van Aarle, P. Sillekens // Mol. Biotech. 2002. Vol. 20. P. 163-179.

67. Di Bartolomeo S. Incidence of Chlamydia trachomatis and other potential pathogens in neonatal conjunctivitis/ S.Di Bartolomeo et al.// Int J Infect Dis. 2001;5 (3): 139-143

68. Domeika M. Use of PCR for the detection of genital Chlamydia trachomatis infection on self-obtained mailed vaginal samples/ M. Domeika , O. Drulyte// Acta Obstet Gynecol Scand. 2000 Jul;79(7):570-5.

69. Donders GG. The association between Chlamydia cervicitis, chorioamnionitis and neonatal complications / GG. Donders et al.//Arch Gynecol Obstet. 1991; 249(2):79-85.

70. Dreses-Werringloer, U. Persistence of Chlamydia trachomatis is induced by ciprofloxacin and ofloxacin in vitro / U. Dreses-Werringloer et al.//Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44:3288-3297.

71. Dwyer R.St.C. Chlamydial infection.Results of micro immunofluorescence tests for the detection of type specific antibody in certain chlamydial infections \l R.St.C.Dwyer et al. //Brit. J.Vener.Dis.vl972.v Vol.48.v P.452.

72. Ennis DG. Selective inhibition of RecA functions by the Hcl nucleoid condensation protein from Chlamydia trachomatis / DG. Ennis, R. Woodgate, M. Shi // FEMS Microbiol Lett. 2000 Jan 15;182(2):279-83.

73. Esther Monor. Fate of C.trachomatis in human monocytes and monocyte-derived macrophages / Esther Monor, Israel Sarov// Inf. Immunnity, oct 1986.p.90-95.

74. Everett K.D.E.Rapid detection of the Chlamydiaceae and other families in the order Chlamydiales: three PCR tests / K.D.E.Everett et al. //J.Clin.Microbiol.v 1999.v Vol.37.v P.575 v580.

75. Everett K.D.E.The ribosomal intergenic spacer and domain I of the 23 S rRNA gene are phylogenetic markers for Chlamydia spp. / K.D.E.Everett et al.//Int.J.Syst.Bacterial.vl997.v Vol.47.v P.461 v473.

76. Fehlner-Gardiner, C. Molecular basis defining human Chlamydia trachomatis tissue tropism: a possible role for tryptophan synthase/ C. FehlnerGardiner et al.// J. Biol. Chem. 2002; 277:26893-26903.

77. Fields K. Evidence for the secretion of Chlamydia trachomatis CopN by a type III secretion mechanism/ K.A. Fields, T. Hackstadt// Mol. Microbiol. 38 (2000), pp. 1048-1060.

78. Fox J.G. Antigenic specificity and morphologic characteristics of Chlamydia trachomatis, strain SFPD, isolated from hamsters with proliferative ileitis / J.G.Fox et al.//Lab. Anim.Sci.vl993.v Vol.43.v P.405 v410.

79. Garrett A.J. Some properties of the polysaccharide from cell cultures infected with TRIG agent (Chlamydia tra chomatis) / A.J. Garrett //J.Gen.Microbiol.v1975.v Vol.90.v P. 133 vl39.

80. Gaston JS. Identification of 2 Chlamydia trachomatis antigens recognized by synovial fluid T cells from patients with Chlamydia induced reactive arthritis/ JS. Gaston et al.// J Rheumatol. 1996 Jan;23(l): 130-136.

81. Gérard H.C. Chlamydia trachomatis genes whose products are related to energy metabolism are expressed differentially in active vs. persistent infection / H.C. Gérard et al. //Microbes Infect. 2002; 4:13-22.

82. Gerard H.C. Differential expression of three Chlamydia trachomatis hsp60-encoding genes in active vs. persistent/ H.C. Gerard// Microb. Pathog. 2004 Jan;36(l):35-9.

83. Gerard H.C. Viability and gene expression in Chlamydia trachomatis during persistent infection of cultured human monocytes / Gerard H.C., et al.// Med. Microbiol. Immunol, 1998; 187: 15Ö120.

84. Gibson M. Patterns of adnexal inflammatori damage: Chlamydia, the intrauterine device, and history of pelvic inflammatory disease/ M. Gibson, D. Gump, B. Hall // Fertil. a. Steril-1984.-p.47-51.

85. Giles DK. Ultrastructural analysis of chlamydial antigen-containing vesicles everting from the Chlamydia trachomatis inclusion/ DK. Giles et al.// Microbes Infect. 2006;8:1579-1591.

86. Givner L.B. Chlamydia trachomatis infection in infant delivered by cesarean section/ L.B. Givner, M.B. Renneis, Shin-Wen-Huang.// Pediatrics.- 1981. v.63 ,N3 .-p.420-421.

87. Guifeng Sun. Structural and Functional Analyses of the Major Outer Membrane Protein of Chlamydia trachomatis/ Sun Guifeng et al.//J Bacteriol. 2007 September; 189(17): 6222-6235.

88. Hackstadt T. Chlamydia trachomatis developmentally regulated protein is homologous to eukaryotic histone Hl/ T. Hackstadt, W. Baehr, and Y. Ying// Proc. Natl. Acad. Sei. United States 1991; 88:3937-3941.

89. Hackstadt T. The Chlamydia trachomatis IncA protein is required for homotypic vesicle fusion / T. Hackstadt et al.// Cell. Microbiol. 1 (1999), pp. 119— 130.

90. Hammer M. Chlamydial rRNA in the joints of patients with Chlamydia-induced arthritis and undifferentiated arthritis/ M. Hammer et al.// Clin Exp Rheumatol. 1992 Jan-Feb;10(l):63-66.

91. Hammerschlag MR. Chlamydial infections/ MR. Hammerschlag // J Pediatr. 1989; 114 (5):727 -734.

92. Harkness A.N. Reiter's disease / A.N. Harkness //Nongonococcal urethritis. Edinburgh: E.&S.Livingstone LTD, 1950; P.99145.

93. Harper, A. Chlamydial development is adversely affected by minor changes in amino acid supply, blood plasma amino acid levels, and glucose deprivation / A. Harper et al. //Infect. Immun.2000; 68:1457-1464.

94. Heine H. Endotoxic activity and chemical structure of lipopolysaccharides from Chlamydia trachomatis serotypes E and L2 and Chlamydophila psittaci/ H. Heine et al.// 6BC, Eur. J. Biochem. 270 (2003), pp. 440450.

95. Heuer, D. Expression and translocation of chlamydial protease during acute and persistent infection of the epithelial HEp-2 cells with Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae / D. Heuer et al.// Cell. Microbiol. 2003; 5:315-322.

96. Higuchi R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences/ R. Higuchi et al.// Biotechnology (N Y). 1992 Apr; 10(4):413-7.

97. Hogan RJ, Mathews SA, Mukhopadhyay S, Summersgill JT, Timms P. Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm. Infect Immun. 2004;72:1843-1855.

98. Hybiske, K. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia/ K.Hybiske, R.S. Stephens // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2007;104: 1143011435

99. Iliffe-Lee, E. R. Regulation of carbon metabolism in Chlamydia trachomatis / E. R. Iliffe-Lee, G. McClarty //Mol. Microbiol. 2000; 38:20-30.

100. Ito S. Proteolytic Microdissection of smooth-surfaced vesicles of liver microsomes / S. Ito, M. J. Karnovsky //Cell Biol. 1969; 39: N 1: 168-169.

101. Jeffrey F. Genital Chlamydial Infections/ F.Jeffrey et al.// NEJM, 2003,15 c.

102. Jewett TJ. Chlamydial TARP is a bacterial nucleator of actin / TJ.Jewett et al. //Proc Natl Acad Sei USA. 2006 Oct 17; 103(42): 15599-604.

103. K.W. Beagley. Chlamydia trachomatis infection: incidence, health costs and prospects for vaccine development / K.W. Beagley and P. Timms // J. Reprod. Immunol. 48 (2000), pp. 47-68.

104. Kaul R. The chlamydial EUO gene encodes a histone Hl-specific protease/R. Kaul et al.//J Bacteriol. 1997 September; 179(18): 5928-5934.

105. Kaul R. The chlamydial EUO gene encodes a histone Hl-specific protease /R. Kaul et al.// J Bacteriol. 1997 Sep; 179(18):5928-34.

106. Keat A. Chlamydia trachomatis and reactive arthritis: the missing link/ A. Keat et al. // Lancet. 1987 Jan 10;l(8524):72-74.

107. Kinnunen A. Chlamydial heat shock protein 60-specific T cells in inflamed salpingeal tissue/ A. Kinnunen et al.// Fertil. Steril. 77 (2002), pp. 162-166.

108. Koehler, L. Ultrastructural and molecular analyses of the persistence of Chlamydia trachomatis (serovar K) in human monocytes/ L. Koehler et al.// Microb. Pathog. 1997; 22:133-142.

109. Kol A. Chlamydial heat shock protein 60 localizes in human atheroma and regulates macrophage tumor necrosis factor- and matrix metalloperoteinase expression/ A. Kol et al.// Circulation 1998; 98:300-307.

110. Lee, C. K. Factors affecting the rate at which a trachoma strain of Chlamydia trachomatis establishes persistent infections in mouse fibroblasts (McCoy cells) / C. K. Lee // Infect. Immun. 1981; 33:954-957.

111. Lefevre J. C. Tetracycline-resistant Chlamydia trachomatis in Toulouse, France / J. C. Lefevre, J. P. Lepargneur, D. Guion// Pathol. Biol. 1997. Vol. 45. P. 376-378.

112. Leng Y. Abelson-interactor-1 promotes WAVE2 membrane translocation and Abelson-mediated tyrosine phosphorylation required for WAVE2 activation / Y. Leng et al.// Proc Natl Acad Sei USA. 2005;102:1098-1103.

113. Levitt D. Selective infection of astrocytes by Chlamydia trachomatis in primary mixed neuron-glial cell cultures / D. Levitt, R. Danen, P. Levitt //Infect Immun. 1986 Dec;54(3):913-6.

114. Lichtenwalner A.B. Heat shock protein 60 is the major antigen which stimulates delayed-type hypersensitivity reaction in the macaque model of Chlamydia trachomatis salpingitis/A.B. Lichtenwalner et al.// Infect. Immun. 72 (2004), pp. 1159-1161.

115. Mardh PA. Influence of infection with Chlamydia trachomatis on pregnancy outcome, infant health and life-long sequelae in infected offspring / PA Mardh // Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2002;16:847-864.

116. Monor Esther. Fate of C.trachomatis in human monocytes and monocyte-derived macrophages/ Esther Monor, Israel Sarov// Inf. Immunnity, oct 1986.p.90-95

117. Moulder J. W. Interaction of chlamydiae and host cells in vitro / J. W. Moulder//Microbiol. Rev. vl991. 55:143-190.

118. Moulder J.W. Genus Chlamydia / J.W.Moulder et al. //Bergey-s Manual of Systematic Bacteriology.v 1984.V Vol.l.v P.729 v739.

119. Moulder, J.W. Persistent infection of mouse fibroblasts (L cells) with Chlamydia psittaci: evidence for a ciyptic chlamydial form./ J. W.Moulder, N. J. Levy, L. P. Schulman// Infect. Immun. 1980; 30:874-883.

120. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed chain reaction / K.B. Mullis, FA. Faloona // Method Enzymol. 1987, 155, 335.

121. Murthy, A. K. Chlamydial Protease-Like Activity Factor Induces Protective Immunity against Genital Chlamydial Infection in Transgenic Mice That Express the Human HLA-DR4 Allele/ A. K. Murthy et al.// Infect. Immun. 2006; 74: 6722-6729.

122. Newhall, W. J. Biosynthesis and disulfide cross-linking of outer membrane components during the growth cycle of Chlamydia trachomatis/ W. J. Newhall//Infect. Immun. 1987;55:162-168.

123. Newman G. R. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope / G. R. Newman, B. Jasani, E. D. Williams // Histochem. J. 1983; 15: N.6.: 543-545.

124. Paavonen J. Chlamydia trachomatis: impact on human reproduction / J Paavonen, Eggert-Kruse W // Hum Reprod Update 1999;5:433-447.

125. Pedersen, L.B. Interaction of the Chlamydia trachomatis histone HI-like protein (Hcl) with DNA and RNA causes repression of transcription and translation in vitro/ L.B.Pedersen, S. Birkelund, G. Christiansen// Mol Microbiol 1994; 11:1085±1098.

126. Perara, E. A developmentally regulated chlamydial gene with apparent homology to eukaryotic histone Hl/ E.Perara, D.Ganem, J.N.Engel, // Proc Natl Acad Sei USA 1992; 89: 2125±2129.

127. Peter N. Fitz-Hugh-Curtis syndrome:A diagnosis to consider in women with right upper quadrant pain / N. Peter // Cleveland Clinic Journal of Medicine -2004.-Vol.7.-№.3.-P.- 233-239.

128. Pickett MA. The plasmids of Chlamydia trachomatis and Chlamydophila pneumoniae (N16): accurate determination of copy number and the paradoxical effect of plasmid-curing agents / MA. Pickett et al.// Microbiology. 2005; 151:893-903.

129. Pirbhai M. The Secreted Protease Factor CPAF Is Responsible for Degrading Pro-apoptotic BH3-only Proteins in Chlamydia trachomatis-infected Cells/ M. Pirbhai et al.//J. Biol. Chem. 2006; 281: 31495-31501.

130. Rachel J. Penicillin Induced Persistence in Chlamydia trachomatis: High Quality Time Lapse Video Analysis of the Developmental Cycle/ J. Rachel et al.//PLoS One. 2009; 4(11): e7723.

131. Rahman MU. Molecular evidence for the presence of chlamydia in the synovium of patients with Reiter's syndrome/ MU. Rahman et al.// Arthritis Rheum. 1992 May;35(5):521-529.

132. Reynolds E.S J. The use of lead citrate at high pHnas an electron-opaque stain in electron microscopy/ E.S J. Reynolds //Cell Biol 1963; 17: N2: 208-212.

133. Ripa KT. Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximide-treated McCoy cells. / KT. Ripa, PA. Márdh // J Clin Microbiol 1977 Oct;6(4):328-31.

134. Robinson AJ. Modern diagnosis and management of genital Chlamydia trachomatis infection / AJ. Robinson, GL. Ridgway // Br J Hosp Med, 1996, 55: 38893

135. Ryan GM. Chlamydia trachomatis infection in pregnancy and effect of treatment on outcome/ GM. Ryan, JN. Abdella, SG. McNeeley // Amer J Obstet Gynecol 1990; 162:34-9

136. Sardinia, L. M. Developmental regulation of the cysteine-rich outermembrane proteins of murine Chlamydia trachomatis/ L. M.Sardinia, , E. Segal, D. Ganem//J. Gen. Microbiol. 1988; 134:997-1004.

137. Schachter J. Epidemiology of human chlamydial infections / J Schachter // Proc. 4th Meet. Eur. Soc. Chlamydia Res.: Abstracts, August 20-23, 2000. Helsinki, Finland, 2000. P. 163-166.

138. Schiller I. Polymerase chain reaction (PCR) detection of porcine Chlamydia trachomatis and ruminant Chlamydia psittaci serovar 1 DNA in formalin fixed intestinal specimens from swine/ I.Schiller et al. //J.Vet.Med.Ser.B. vl997.v Vol.44.v P. 185 vl91.

139. Schmitz E. TNF and PGE2 in human monocyte-derived macrophages infected with Chlamydia trachomatis/ E. Schmitz,E. Manor, I. Sarov// Mediators Inflamm. 1993; 2(5): 367-371.

140. Scidmore MA. 14-3-3beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG / MA. Scidmore et al. //Mol Microbiol. 2001 Mar;39(6):1638-50.

141. Seth-Smith Helena MB. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain / Helena MB Seth-Smith et al.//BMC Genomics. 2009; 10: 239.

142. Shalepo K. Diagnosis of Chlamydia trachomatis in Russia--in-house PCR assays may be effective but overall optimization and quality assurance are urgently needed / K. Shalepo et al.// APMIS. 2006 Jul-Aug;l 14(7-8):500-7.

143. Shemer, Y. Inhibition of growth of Chlamydia trachomatis by human gamma interferon/ Y. Shemer, I. Sarov // Infect. Immun. 1985; 48:592-596.

144. Somani, J. Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure/ J. Somani et al.// J. Infect. Dis. 2000; 181:1421-1427.

145. Stamm WE. Chlamydia trachomatis infections of the adult / WE Stamm // Sex Transm Dis. 3rd ed. New York: McGraw-Hill, 1999:407-22.

146. Stephens, R. S. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis/ R. S. Stephens et al. // Science 1998;282:754-759.

147. Stills H.F. A "new" Chlamydia sp.strain SFPD iso lated from transmissible proliferative ileitis in hamsters / H.F.Stills et al.// Microbiol.Ecol.Health.Dis.v 1991 .v Vol.4.v P.S 99.

148. Szeredi L. Intestinal Chlamydia in finishing pigs / L.Szeredi et al.// Vet.Pathol.v 1996.v Vol.33.v P.369 v374.

149. Tanzer RJ. Characterization of outer membrane proteins in Chlamydia trachomatis LGV serovar L2 /RJ. Tanzer, TP. Hatch// J Bacteriol. 2001 Apr; 183(8):2686-90.

150. Wang G. Infection of myocytes with chlamydiae /G. Wang et al.//Microbiology. 2002 Dec;148(Pt 12):3955-9.

151. Wang SA. Evaluation of antimicrobial resistance and treatment failures for Chlamydia trachomatis: a meeting report/ SA. Wang et al.// J Infect Dis. 2005; 191: 917-23.

152. Ward ME. An update on the immunology of chlamydial infection / ME. Ward // Abstracts of Proceedings of the 3rd Meeting of the European Society for Chlamydial Research. Vienna. Austria. 11-14 September 1996:58-62.

153. Wehrl W. From the inside out—processing of the Chlamydial autotransporter PmpD and its role in bacterial adhesion and activation of human host cells/ W. Wehrl. // Mol. Microbiol. 51 (2004), pp. 319-334.

154. Wiesenfeld H.C. Genital Infections and endometritis/ H.C. Wiesenfeld et al.// Obstet Gynecol, 2002, Sep; 100(3):456-63.

155. Wood, H. Regulation of tryptophan synthase gene expression in Chlamydia trachomatis / H. Wood et al.// Mol. Microbiol. 2003; 49:1347-1359.

156. Wyrick P. Chlamydia trachomatis antigens on the surface of infected human endometrial epithelial cells/ P. Wyrick et al.//Immun. Infect. Dis. 4 (1994), pp. 131-141.

157. Yang C.Y. Determination of the molecular mass of apolipoprotein B-100. A chemical approach/ C Y Yang et al.//Biochem J. 1986 November 1; 239(3): 777780.

158. Zhang JP. Mechanism of Chlamydia trachomatis attachment to eukaryotic host cells / JP Zhang, RS. Stephens // Cell. 1992;69:861-869.

159. Zimmerman T. Quantitative studies on fatty acid metabolism in isolated parenchymal cells from normal and cirrhotic livers in rats/ T. Zimmerman Franke H., Peuker M., Dargel R//J.Hepatol. 1992; 15, 10-16.

160. Zollinger M. Localization of nuclear subunits of cyclic AMP-dependent protein kinase by the immunocolloidal gold method/ M.Zollinger, M. Bendayan // J Cell Biol. 1982 Jan;30(l):81-85.